作为骨质疏松症诊治靶标的MTUS1基因
阅读：6发布：2021-02-27
专利汇可以提供作为骨质疏松症诊治靶标的MTUS1基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种骨质疏松症诊治标志物，该诊治标志物是MTUS1基因及其表达产物。本发明通过 基因芯片 和蛋白免疫试验证明了相比正常人，MTUS1基因及其表达产物在骨质疏松症患者的血液和骨组织中表达降低，据此可以开发用于诊断骨质疏松症的产品，该产品能够检测MTUS1基因或其表达产物的表达 水 平。本发明体外实验证明MTUS1基因过表达可以促进成骨细胞的增殖，因此MTUS1基因及其表达产物又可以用于骨质疏松症 治疗 药物的开发。，下面是作为骨质疏松症诊治靶标的MTUS1基因专利的具体信息内容。
1.检测MTUS1基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测MTUS1基因表达以诊断骨质疏松症的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增MTUS1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增MTUS1基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与MTUS1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与MTUS1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；
其中，蛋白芯片包括与MTUS1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MTUS1基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增MTUS1基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5.一种诊断骨质疏松症的工具，其特征在于，所述工具包括检测MTUS1基因表达的试剂；所述试剂包括检测MTUS1基因mRNA的引物和/或探针、检测MTUS1蛋白的抗体。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测MTUS1基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。
7.MTUS1基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进MTUS1基因表达的试剂、促进MTUS1基因表达产物稳定性的试剂、促进MTUS1基因表达产物活性的试剂、促进MTUS1基因表达产物功能的试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进MTUS1基因表达的试剂包括含有MTUS1基因的试剂、携带MTUS1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有MTUS1蛋白质的试剂。
10.一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任一项所述的促进剂。
作为骨质疏松症诊治靶标的MTUS1基因
技术领域
背景技术
[0002] 骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
[0003] 流行病学资料显示，美国约8百万人患骨质疏松症，2千万人骨量减少，每年有150万患者由于骨质疏松引发骨折。绝经后白人妇女骨质疏松发病率为17％，黑人妇女发病率为6％。年龄大于50岁人群中，将近50％女性和25％男性存在骨质疏松性骨折的潜在风险。我国是老年人口绝对数数量最多的国家，《骨质疏松症防治中国白皮书》根据2006年全国性汉族人群抽样调查结果显示，估算全国50岁以上人群中，约有6944万人(男1534万，女5410万)患有骨质疏松症，有2.1亿人患低骨量，存在骨质疏松症风险，预计到2020年我国骨质疏松和低骨量患者将增加至2.8亿。
[0004] 目前诊断骨质疏松症主要依赖骨密度影像学检测方法，骨密度测定方法包括以下几种：X线光密度法、单光子吸收法、双光子吸收法、双能x线吸收法、定量计算机体层摄影、中子活化分析法、超声定量测量、磁共振测量、定量磁共振成像、高分辨率磁共振成像。上述方法主要的局限在于不能在骨质疏松症发生的早期给出可靠的判断。
[0005] 为了提高骨质疏松症的治疗有效率，降低患者和国家的经济负担，寻找一种用于骨质疏松症早期诊断的方法是亟待解决的问题。
发明内容
[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种MTUS1基因及其表达产物在制备诊断骨质疏松症的产品中的应用。
[0009] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MTUS1基因及其表达产物的表达水平以诊断骨质疏松症的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增MTUS1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增MTUS1基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与MTUS1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与MTUS1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MTUS1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MTUS1基因的核酸序列杂交的探针。
[0012] 本发明还提供了MTUS1基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知MTUS1基因的异常与骨质疏松症相关也属于MTUS1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0013] 本发明还提供了MTUS1基因及其表达产物在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
[0014] 进一步，所述药物包括：含有MTUS1基因的药物、携带MTUS1基因的载体或宿主细胞所形成的药物、MTUS1蛋白质药物、或其他能够促进MTUS1基因表达的药物。本发明的药物可以用于补充内源性的MTUS1蛋白的缺失或不足，通过提高MTUS1蛋白的表达，从而治疗因MTUS1蛋白缺乏导致的骨质疏松症。
[0015] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
[0016] 在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
[0017] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
[0018] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有MTUS1基因的药物或者含有MTUS1蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有MTUS1基因的药物或者含有MTUS1蛋白质的药物注入体内组织中。
[0019] 本发明的药物还可与其他治疗骨质疏松症的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
[0020] 本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的产品，所述产品可以是芯片、试剂盒或者高通量测序平台。所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MTUS1基因转录水平的针对MTUS1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MTUS1蛋白的特异性抗体。
[0021] 进一步，所述基因芯片可用于检测包括MTUS1基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括MTUS1蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。
[0022] 本发明提供的用于诊断骨质疏松症的试剂盒，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MTUS1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MTUS1蛋白的特异性抗体。
[0023] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测MTUS1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对MTUS1基因的引物和/或探针。根据MTUS1基因的核苷酸序列容易设计出可以用于检测MTUS1基因表达水平的引物和探针。
[0024] 与MTUS1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0025] 进一步，所述MTUS1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MTUS1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MTUS1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0026] 本发明还提供了一种用于治疗骨质疏松症的药物，所述药物包括但不限于：含有MTUS1基因的药物、携带MTUS1基因的载体或宿主细胞所形成的药物、MTUS1蛋白质药物、或其他能够促进MTUS1基因表达的药物。
[0027] 在本发明的上下文中，“MTUS1基因”包括MTUS1基因以及MTUS1基因的任何功能等同物的多核苷酸。MTUS1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中MTUS1基因(NC_000008.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
[0028] 优选地，MTUS1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
[0030] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0031] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
[0032] 在本发明的具体实施方案中，所述MTUS1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
[0033] 在本发明的上下文中，MTUS1基因表达产物包括MTUS1蛋白以及MTUS1蛋白的部分肽。所述MTUS1蛋白的部分肽含有与骨质疏松症相关的功能域。
[0034] “MTUS1蛋白”包括MTUS1蛋白以及MTUS1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括MTUS1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与MTUS1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0035] 优选地，MTUS1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0036] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0037] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0038] (3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0039] 在本发明的具体实施方案中，所述MTUS1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0040] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0041] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MTUS1蛋白的融合蛋白。对于与MTUS1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MTUS1蛋白的生物学活性即可。
[0042] 本发明的MTUS1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MTUS1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0043] 在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。
[0044] 在本发明的上下文中，“治疗骨质疏松症”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
[0045] 本发明的优点和有益效果：
[0046] 本发明首次发现了MTUS1基因表达与骨质疏松症相关，通过检测受试者血液或骨组织中MTUS1的表达，可以判断受试者是否患有骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0048] 图1显示利用基因芯片检测MTUS1基因在血液中的表达情况；
[0049] 图2显示利用基因芯片检测MTUS1基因在骨组织中的表达情况；
[0050] 图3显示利用Western blot检测MTUS1蛋白在骨组织中的表达情况；
[0051] 图4显示利用QPCR检测MTUS1基因过表达后mRNA水平的变化；
[0052] 图5显示利用Western blot检测MTUS1过表达后蛋白水平的变化。
[0053] 具体的实施方式
[0054] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0055] 实施例1 血液中与骨质疏松症相关的差异表达基因
[0056] 1、研究对象：
[0057] 骨质疏松组：随机抽取医院骨科收治的50例原发性骨质疏松症患者，男、女各5例，年龄最小50岁，最大75岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。
[0058] 正常组：选取年龄50-75岁的健康志愿者50例，男女各5例。
[0059] 两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。
[0060] 所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
[0061] 2、血液中总RNA的提取
[0062] (1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
[0063] (2)加入TRIzol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
[0064] (3)加入氯仿(氯仿：TRIzol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
[0065] (4)离心，12,000g 15min，4℃。
[0066] (5)小心吸取上清液，转移到新EP管中,加入异丙醇(异丙醇：TRIzol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
[0067] (6)离心，12,000g 10min，4℃。
[0068] (7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：TRIzol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
[0069] (8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即RNA略微出现透明时)，加入60μl DEPC水溶解沉淀。
[0070] 3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
[0071] NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，OD260/OD280为1.8-2.2。
[0072] 4、基因芯片杂交及扫描
[0073] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4 x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0076] 6、统计学处理
[0077] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
[0078] 7、结果
[0079] 结果显示(如图1所示)，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中MTUS1基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0080] 实施例2 骨组织中骨质疏松症相关的差异表达基因
[0081] 1、研究对象：
[0082] 随机选择即将进行髓关节置换术的患者，检测骨密度，选择骨质疏松症患者40例，正常骨密度对照组(为外伤骨折，检测无骨质疏松症)50例，年龄50-70岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况等情况。
[0083] 骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。
[0084] 骨质疏松症患者的排除标准：继发性骨质疏松症者。
[0085] 2、骨组织RNA的获取
[0086] 从髓关节置换术取下的人股骨头中，取硬质骨1g，迅速置于液氮中保存。在实验室使用Trizol一步法提取人骨组织中的总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
[0087] 3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
[0088] NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品：OD260/OD280为1.8-2.2。
[0089] 4、基因芯片杂交及扫描
[0090] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4 x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0091] 5、芯片数据处理与分析
[0092] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0093] 6、统计学处理
[0094] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
[0095] 7、结果
[0096] 结果显示(如图2所示)，与正常人相比，骨质疏松症患者骨组织中MTUS1基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0097] 实施例3 成骨细胞中MTUS1蛋白的差异表达
[0098] 1、研究对象同实施例2。
[0099] 2、人成骨细胞的取材和培养
[0100] 从髓关节置换术取下的人股骨头中取松质骨，剔除软组织，生理盐水反复冲洗骨3
质，冲洗液澄清后，用PBS液冲洗摇荡3遍，剪成1mm的碎片，采用酶消化法分离并纯化成骨细胞。将其接种于30ml的培养瓶中(培养瓶加入适量的DMEM-F12(1：1)培养基与10％胎牛血清)，置于37℃、5％的CO2恒温培养箱中培养。2d后换液并清除未贴壁的细胞，以后每
3d换液1次，倒置显微镜下观察。待原代细胞融合成单层后，用2.5g/L的胰酶消化、传代。
质，冲洗液澄清后，用PBS液冲洗摇荡3遍，剪成1mm的碎片，采用酶消化法分离并纯化成骨细胞。将其接种于30ml的培养瓶中(培养瓶加入适量的DMEM-F12(1：1)培养基与10％胎牛血清)，置于37℃、5％的CO2恒温培养箱中培养。2d后换液并清除未贴壁的细胞，以后每
3d换液1次，倒置显微镜下观察。待原代细胞融合成单层后，用2.5g/L的胰酶消化、传代。
[0101] 3、细胞总蛋白的提取
[0103] 4、Western blot检测
[0104] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
[0105] 5、数据处理
[0106] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将MTUS1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0107] 6、结果
[0108] 结果如图3所示，与正常人相比，骨质疏松症患者成骨细胞中MTUS1蛋白的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0109] 实施例4 MTUS1基因表达质粒构建
[0110] 1、MTUS1基因的过表达
[0111] 1.1 MTUS1基因表达载体的构建
[0112] 根据MTUS1基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-GACTGATGATAATTCAGATGA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物为5’-AAATGCTGGGGCTAGGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的MTUS1基因的编码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-MTUS1用于后续实验。
[0113] 按照实施例3的方法进行成骨细胞的体外培养，取对数生长期的成骨细胞按4
1×10/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，将细胞分为两个实验组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和MTUS1过表达组(转染pcDNA3.1-MTUS1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MTUS1的工作浓度均为0.5μg/ml。
1×10/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，将细胞分为两个实验组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和MTUS1过表达组(转染pcDNA3.1-MTUS1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MTUS1的工作浓度均为0.5μg/ml。
[0114] 2、利用QPCR实验检测MTUS1过表达后mRNA的水平
[0115] 2.1 提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0116] 2.2 逆转录
[0117] 用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
[0118] 2.3 QPCR
[0119] 采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增MTUS1基因的正向引物序列为5’-CCAATAGCGAACCACATT-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-TCATCATCAATAAGACAATAGGA-3’(SEQ ID NO.6)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物序列为
5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.8)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：
95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，
5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.8)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：
95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，
[0120] 2.4 统计学方法
[0121] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0122] 3、利用Western blot检测MTUS1过表达后蛋白的表达水平
[0123] 步骤同实施例3。
[0124] 4、结果
[0125] 结果如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MTUS1的细胞中MTUS1的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；如图5所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MTUS1的细胞中MTUS1的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0126] 实施例5 MTUS1基因的过表达对成骨细胞增殖能力的测定
[0127] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)试剂盒用于检测成骨细胞增殖的检测[0128] 1、步骤
[0129] 按照前面实施例的方法进行成骨细胞的培养和转染，细胞分为三个实验组：
[0130] 组1：正常骨密度组织来源的成骨细胞转染pcDNA3.1(正常+pcDNA3.1)；
[0131] 组2：骨质疏松患者的成骨细胞转染pcDNA3.1(骨质疏松+pcDNA3.1)；
[0132] 组3：骨质疏松患者的成骨细胞转染pcDNA3.1-MTUS1( 骨质疏松+pcDNA3.1-MTUS1)。
[0133] 转染24h后，以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，24h细胞贴壁后，分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
[0134] 2、统计学方法
[0135] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0136] 3、结果
[0137] 结果如表2所示，与正常骨密度人相比，骨质疏松患者的成骨细胞增殖缓慢，骨质疏松患者MTUS1基因过表达后，成骨细胞的增殖加快，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，MTUS1基因表达过表达能够加快骨质疏松患者成骨细胞的增殖。
[0138] 表2 成骨细胞OD值
[0139]实验组 OD值(光密度)
正常+pcDNA3.1 0.1704±0.003
骨质疏松+pcDNA3.1 0.0956±0.004
骨质疏松+pcDNA3.1-MTUS1 0.1529±0.003
正常+pcDNA3.1 0.1704±0.003
骨质疏松+pcDNA3.1 0.0956±0.004
骨质疏松+pcDNA3.1-MTUS1 0.1529±0.003
[0140] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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