专利汇可以提供幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建及其产物的制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开一种幽 门 螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建及其产物的制备方法。该构建方法包括:从幽门螺杆菌中提取总DNA;用PCR方法从基因组DNA中扩增vacA基因的 片段 D;将vacA-D连接在载体pRSETA上;将载体pRSETA转化到大肠杆菌BL21DE3中,经培养获得工程菌。将工程菌 发酵 培养,经诱导、表达获得重组蛋白。该方法获得的重组蛋白-细胞 空泡 毒素A的D片段(VacA-D),有高度的 抗原 性,可为免疫学检测VacA阳性Hp感染的方法提供抗原,还可制成 疫苗 用于VacA阳性Hp感染的 预防 及 治疗 。,下面是幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建及其产物的制备方法专利的具体信息内容。
1、一种幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建,其特征在于:选取幽 门螺杆菌的DNA中的vacA基因的片段D,其核苷酸序列如下: CGCATCAATACCGTGCGTTTGGAAACTGGCACTAGGTCACTTTTCTCTGGGGGTGTTAAATTTAAAGG TGGCGAAAAATTGGTTATAGATGAGTTTTACTATAGCCCTTGGAATTATTTTGACGCTAGAAATATTA AAAATGTTGAAATCACCAATAAACTTGCTTTTGGACCTCAAGGAAGTCCTTGGGGCACATCAAAACTT ATGTTCAATAATCTAACCCTAGGTCAAAATGCGGTCATGGATTATAGCCAATTTTCAAATTTAACCAT TCAAGGGGATTTCATCAACAATCAAGGCACTATCAACTATCTGGTCCGAGGTGGGAAAGTGGCAACCT TAAGCGTAGGCAATGCAGCAGCTATGATGTTTAATAATGATATAGACAGCGCGACCGGATTTTACAAA CCGCTCATCAAGATTAACAGCGCTCAAGATCTCATTAAAAATACAGAACATGTTTTATTGAAAGCGAA AATCATTGGTTATGGTTAA
2、根据权利要1所述的幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建,其特 征在于:
1)从幽门螺杆菌中提取总DNA;
2)用PCR方法分别从基因组DNA中扩增vacA基因的片段D;
3)将vacA基因的片段D连接在表达载体pRSETA上;
4)将重组载体vacA-D-pRSETA转化到大肠杆菌BL21DE3中得工程菌。
3、根据权利要求1或2所述的幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建, 其特征于:上述用PCR方法从基因组DNA中扩增vacA基因的片段D,其设计 PCR引物,序列如下:
上游引物:5’GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3’
下游引物:5’GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3’
4、根据权利要求3所述的幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建,其 特征在于:上述vacA-D基因与表达载体pRSETA的连接如下:
1)PCR所采用两个引物是根据vacA的基因序列设计的;
2)vacA基因的片段D的5′端连在表达载体pRSETA的BamH I位点上,3′ 端连在表达载体pRSETA的Pst I位点上,从而构成重组表达载体vacA-D- pRSETA;
5、一种幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的表达产物的制备方法:
1)VacA-D抗原的化学诱导及表达;
2)VacA-D的分离及纯化;
3)VacA-D活性鉴定。
幽门螺杆菌细胞空泡毒素A(VacA)具有较高的抗原性;传统的幽门螺杆 菌(Hp)培养方法一般需5-7天,浪费时间,且从菌体中提取该蛋白的工艺烦 琐,回收率低,故采用基因重组技术制备该蛋白是获得抗原的重要途径。
本发明的目的是构建幽门螺杆菌vacA-D基因表达的工程菌及其产物的制 备方法。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案为:
幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的构建,其特殊之处在于:选取幽门 螺杆菌DNA中vacA基因5’-端片段D,其核苷酸序列如下: ATGGTGGATGCTCATACAGCTAATTTTAAAGGTATTGATACGGGTAATGGTG GTITCAACACCTTAGATTTTAGTGGCGTTACAGACAAAGTCGATATCAACA AGCTCATTACGGCTTCCACTAATGTGGCCGTTAAAAACTTCAACATTAATG AATTGATTGTTAAAACCAATGGGATAAGTGTGGGGGAATATACTCATTTTAG CGAAGATATAGGCAGTCAATCGCGCATCAATACCGTGCGTTTGGAAACTGG CACTAGGTCACTTTTCTCTGGGGGTGTTAAATTTAAAGGTGGCGAAAATT GGTTATAGATGAGTTTTACTATAGCCCTTGGAATTATTTTGACGCTAGAAATA TTAAAAATGTTGAAATCACCAATAAACTTGCTTTTGGACCTCAAGGAAGTC CTTGGGGCACATCAAAACTTATGTTCAATAATCTAACCCTAGGTCAAAATG CGGTCATGGATTATAGCCAATTTTCAAATTTAACCATTCAAGGGGATTTCAT CAACAATCAAGGCACTATCAACTATCTGGTCCGAGGTGGGAAAGTGGCAA CCTTAAGCGTAGGCAATGCAGCAGCTATGATGTTTAATAATGATATAGACAG CGCGACCGGATTTTACAAACCGCTCATCAAGATTAACAGCGCTCAAGATCT CATTAAAAATACAGAACATGTTTTATTGAAAGCGAAAATCATTGGTTATGGT TAA
上述幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌构建的步骤如下:
1)从幽门螺杆菌中提取总DNA;
2)用PCR方法分别从基因组DNA中扩增vacA基因的片段D;
3)将vacA基因的片段D连接在表达载体pRSETA上;
4)将重组载体vacA-D-pRSETA转化入大肠杆菌BL21DE3中得到工程菌。
上述用PCR方法从基因组DNA中扩增vacA基因的片段D,其PCR引物序 列设计如下:
D1:5’-GC GGA TCC ATG GTG GAT GCT CAT ACA GCT AA-3’
D2:5’-GC AAG CTT TTA ACC ATA ACC AAT GAT TTT CGC-3’
上述vacA-D基因与表达载体pRSETA的连接如下:
1)PCR所采用两个引物是根据vacA的基因序列设计的;
2)vacA基因的片段D的5′端连在表达载体pRSETA的BamH I位点上, 3′端连在表达载体pRSETA的Pst I位点上,从而构成重组表达载体vacA-D- pRSETA;一种幽门螺杆菌vacA-D基因表达工程菌的表达产物的制备方法如 下:
1)VacA-D抗原的化学诱导及表达;
2)VacA-D的分离及纯化;
3)VacA-D活性鉴定。
下面结合具体实施例;详细描述如下
一、制备模板:在Hp培养平板上挑取生长良好的菌落,提取Hp总DNA, 溶于100μL无菌水中,稀释5倍作为模板。
二、目的片段的扩增:PCR反应的总体积为25μL,其中含模板2μL,每 种引物各10pmol,2.5mmol/L dNTP混合物2μL,10×PCR Reaction buffer 2.5 μL,25mmol/L MgCl2 2.5μL,耐热DNA聚合酶0.75U,加H2O到25μL。PCR 扩增反应条件为94℃预变性2min;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延 伸3min,共循环40次。反应结束后在10g/L琼脂糖凝胶上检查扩增结果,电 泳缓冲液为0.5×TAE,溴化乙锭染色,并在紫外灯下切下目的条带。
三、PCR产物克隆:回收PCR产物,溶于40μL的NE溶液中。取0.5ml 的EP管2支,其中一支加入目的片段DNA20μL,另一支加入含有1μg pGEM-3Zf(-)的溶液,然后各加入10×Buffer 2.5μL,BamH I 1μL(12U),Pst I 1μL(15U),30℃温育2h之后37℃温育2h。反应结束后进行10g/L琼脂糖凝 胶电泳,同前切下目的条带。将含双酶切目的片段的琼脂糖凝胶与含双酶切 pGEM-3Zf(-)的凝胶按3∶1的比例放在同一1.5ml的EP管中,回收DNA溶 于30μL NE溶液中,向回收产物中加入4μL T4 DNA Ligase buffer,1μL T4 DNA Ligase,于12℃保温16h。将连接产物5μL转化JM109感受态细胞,同 时以水作空白对照,pGEM-3Zf(-)作阴性对照,在含有Amp(100mg/mL)的LB 平板上加入20μL 0.1mol/L IPTG和16μL 5%X-Gal做蓝白筛选,挑取白色克 隆,培养后提取质粒,同前双酶切鉴定重组质粒。
四、序列测定:选择经双酶切鉴定阳性的含重组vacA-D-pGEM-3Zf(-)的菌 株,测定vacA-D的序列。
五、表达载体的构建:将含重组质粒的细菌扩大培养,提取重组质粒,用 BamH I和Pst I双酶切后,获得909 bp大小的目的片段。将其与同样双酶切 处理的载体pRSETA连接,转化BL21DE3菌,获得重组表达载体vacA-D- pRSETA,并对其进行双酶切鉴定。
六、目的蛋白的诱导表达:挑取含有vacA-D-pRSETA的单个菌落,接种 于LB(含Amp 100mg/L)培养液中,在37℃振摇至A600=0.4。加入IPTG使 终浓度达0.5mmol/L,37℃振摇4h,离心收菌。
七、目的蛋白的表达形式和溶解性分析:经分级分离及12%SDS-PAG分 析,表达产物主要以包含体及可溶性蛋白两种形式存在。包含体占菌体蛋白43 %,可溶性蛋白占菌体蛋白1%。
八、Western blot分析:将诱导菌的全菌做SDS-PAGE,使凝胶靠近阴 极一侧,硝酸纤维素膜(NC膜)靠近阳极一侧,转移缓冲液为25mmol/L Tris- 192mmol/L Glycine-200ml/L甲醇,在100V条件下转移45min,使蛋白 从凝胶电转移至NC膜上。电转移结束后,取出NC膜,依次进行亮绿(1g/L 亮绿-100ml/L冰乙酸-500ml/L甲醇)染色和三蒸水冲洗终止染色,并用铅 笔在目的条带两端作标记。加封闭液(含100g/L脱脂奶粉和0.5mL/L Tween 20 的pH7.5 TBS)室温2h封闭非特异性结合位点后,用TBS洗涤液室温洗膜4 次,每次15min。然后依次加兔抗Vac A多抗(37℃作用1--1.5h,用TBS洗 涤液室温同上洗膜)和HRP标记的羊抗兔二抗(37℃作用1--2h,用TBS洗涤 液室温洗膜6次)。最后,将NC膜浸入DAB显色液中染色,以蒸馏水冲洗终止 反应。
九、目的蛋白纯化:
用Ni-NTA亲和层析纯化诱导菌的上清和包含体,获得的目的蛋白纯度高。
(1)样品制备:离心收集诱导菌,超声碎菌,离心收集沉淀和上清
(2)上清的纯化:将上清与Ni-NTA充分混匀装柱,用含咪唑的缓冲液洗 脱目的蛋白
(3)包含体的纯化:将沉淀用含8mol/L脲的缓冲液变性,离心收集上清, 将上清与Ni-NTA充分混匀装柱,用pH梯度洗脱目的蛋白。
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