本发明属于肿瘤分子生物学，疾病相关基因研究领域。具体涉及利用 定位候选克隆的方法从人类染色体肝癌高缺失区8p23克隆得到的新基因 LPTS，该基因在大部分(＞50％)的肝癌组织及肝癌细胞中表达缺失或表 达水平极低并具有抑癌功能，它的发现对于肝癌的早期诊断，了解肝癌的 发生、发展以获得对其的治疗和控制都会有一定的意义。

肝癌是一种世界范围内的恶性肿瘤，死亡率极高，尤其中国是肝癌的 高发病区。每年全世界新发现的恶性肿瘤病人约2635万例，而原发性肝 癌约26万例，占4％。每年世界范围内有25万人死于肝癌，我国占了其 中的40％(李绍白，《肝脏病学》，人民卫生出版社,1995)。乙型肝 炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感 染及食用含有黄曲霉毒素的水和食物等都是肝癌发病的主要因素。过量的 酒精摄入、肝硬化也可导致肝癌(Sell,S.,Liver Stem Cells,p186, R.G.Landes Company,1997)。目前，肝癌的主要治疗方法还是放、化疗及 手术切除。对于肝癌病人病情发现得越早，治愈的存活率就越高，因此在 分子水平上探寻肝癌相关基因的变异对于肝癌的早期诊断以提高肝癌病人 存活率都具有重要意义。抑癌基因是一类可以抑制细胞癌化及肿瘤生长的 基因，它的功能主要表现在对细胞生长和分化的调控。抑癌基因可以应用 于基因治疗，还可作为抗癌药物的靶位点，为肿瘤的治疗提供了新的有效 的方法。目前，除p53外，鉴定的与肝癌明确相关的基因几乎没有，因此 克隆新的肝癌相关抑癌基因，已成为肝癌研究的热点和难点。本发明所提 供的具有潜在抑癌活性的人类基因LPTS是一个国内外均未报道的新基 因。对它的作用机理的研究将有利于加深对肝癌发生途径的分子机制的了 解，并有望成为肝癌早期诊断的指标及应用于肝癌的基因治疗。

体细胞抑癌基因失活的最常见的表现是杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)。利用现在已精确定位的微卫星分子标记，在全基因 组范围内扫描，可以检测出LOH的高发区，也即抑癌基因的热点区域。 肝癌的LOH分析表明染色体臂8p23在肝癌病人的缺失率非常高，达到42 ％(Nagai,H.,et al,Oncogene,14:2927-2933,1997)，表明染色体臂8p23区域 内含有肝癌相关的肿瘤抑制因子。

定位候选克隆(positional candidate cloning)方法是一种克隆疾病易 感基因的有效方法。它是基于一个与疾病相关的染色体易感区域，从中获 取候选基因，进行功能筛选克隆疾病相关基因的有效方法(廖成等，生命 的化学，19卷第2期pp92-94)。

为此，本发明的目的是提供一种与肝癌相关的人类基因LPTS的cDNA 全序列，该基因定位于人第8号染色体8p23区段，与肝癌密切相关，可 应用于抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供一种肝癌相关的人类新基因LPTS。用逆转录多聚酶链反 应(RT-PCR)的方法检测它们在肝癌组织或肝癌细胞中的表达情况， 进一步用Northem杂交的方法检测该基因的组织分布，并利用反义核酸 技术对LPTS的功能进行了细胞体外实验。

本发明利用定位候选克隆的方法克隆了一个定位于人染色体肝癌高缺 失区8p23上的新基因LPTS。全序列测定该cDNA全长为1316bp(见SEQ ID NO.1)，包含有一个完整的蛋白编码框，编码了一个由174个氨基酸 组成的蛋白质(见SEQ ID NO.2)。同源性分析表明LPTS为一个人类新 基因。它在大于50％的肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或检测不到， 这个比例是相当高的，而在正常肝组织及正常肝cDNA文库中都可以检 测到特异的表达条带(图1)。这表明基因LPTS与肝癌有很高的相关性。

本发明进行了LPTS基因的组织分布分析。通过与8种正常人组织 mRNA的Northem杂交实验，表明LPTS的表达不具有明显的组织特异 性。在被检测的8种组织，包括心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏 及胰中都有表达，表达产物大小为1.4Kb。相比而言，在骨骼肌中的表达 最高，在脑、肺、胎盘中的表达最弱，在肝中的表达量居中(图2)。表 明该基因不但可以应用于肝癌，还可以应用于多种肿瘤组织，具有较广的 普遍性。

本发明还进行了体外细胞实验，检测LPTS基因对细胞的生长调控作 用，发现用LPTS基因的反义寡核苷酸可以刺激正常肝细胞L02(图3) 的生长。根据LPTS的核苷酸序列，设计了两种反义核苷酸(AntiS-1:SEQ ID NO.3；AntiS-2:SEQ ID NO.4)，分别加入细胞培养液中，发现在反义 寡核苷酸处理两天后细胞的生长速度加快，对正常肝细胞L02的作用尤 为明显，细胞量达到未用反义核酸处理的细胞量的两倍以上。表明LPTS 基因具有与细胞生长相关的负调控作用，即对细胞的非正常生长有抑制作 用，可应用于肝癌的早期诊断、肿瘤基因治疗及抑制包括肝癌在内的各种 肿瘤生长，具有潜在的应用价值。

本发明的优点：

1、提供了一个全新的人类肝癌相关基因LPTS。它在肝癌组织及肝 癌细胞中有较高的缺失比率，并调控细胞生长，是一个与肝癌高度相关、 具有抑癌活性的功能基因。

2、LPTS在肝癌中有高缺失比率。LPTS有望在肝癌的早期诊断中提 供一种指标，应用于肝癌诊断试剂盒，提高肝癌早期诊断的准确性，进而 提高肝癌病人治愈的可能性。

3、本发明发现LPTS的反义核酸有刺激细胞生长的作用，表明LPTS 参与细胞生长的负调控，具有抑癌活性，可以作为药物或作为抗癌药物的 靶序列等一系列临床应用，包括肝癌病人的早期诊断、基因治疗以及抑制 包括肝癌在内的各种肿瘤生长等应用。

4、LPTS在人各种正常组织中都有表达，且定位于癌变过程中活跃 的染色体8号染色体短臂。人染色体8p是一个在多种恶性肿瘤中都高缺 失的区域，包括乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌等， 揭示它具有广泛的与多种肿瘤相关的抑癌活性，可应用于各种肿瘤的基因 治疗。

具有在所述基因LPTS的编码框架中75％以上同源的核苷酸序列的 相关基因也属于本发明的保护范围。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范 围。

附图说明：

图1、RT-PCR检测LPTS基因在肝癌组织、细胞及正常肝组织中的 表达。

图中：1、λ/HindⅢ分子量标记；2、正常人肝cDNA文库；3、N1； 4、K1；5、K2；6、K3；7、K4；8、K5；9、K6；10、K7；11、K8；12、 HepG2；13、BEL-7402；14、SMMC-7721。其中K：表示肝癌样品；N： 表示正常肝样品；12～14为3种人肝癌细胞系。特异性扩增条带图中以 箭头S标出，以B-actin作为内参。

图2、以LPTS cDNA为探针，与人不同组织mRNA的Northern杂交。

图中：1、胰脏；2、肾脏；3、骨骼肌；4、肝；5、肺；6、胎盘；7、 脑；8、心脏。

图3、LPTS反义寡核苷酸处理正常肝细胞L02的生长曲线。

图中：横坐标为反义核苷酸处理后的天数；纵坐标为用MTT法检测 细胞数量的570nm吸光值。1、反义核苷酸AntiS-1处理；2、反义核苷酸 AntiS-2处理。

实施例1、LPTS全长基因克隆

从染色体8p23区域的分子定位标记序列，设计多聚酶链式反应 (Polymecase Chain Reaction,PCR)引物P1(5’- CTGCAGAGTTACGCACGTCCTGATTC-3’),P2:(5’- CTGAGAGCCACGATTGAGAACATT-3’；)。采用TRIZOL试剂盒 (GIBCOL/BRL公司)，按照说明书推荐的方法分离人正常肝组织总 RNA。在20μL逆转录反应体系中，加入1μg正常肝组织总RNA,1μL 热稳定逆转录酶(Gibcol公司产品)，dNTP，以寡聚(dT)20为引物。50℃ 1小时，85℃5分钟，再加入1μLRNase H,37℃放置20分钟切除RNA。 以逆转录反应得到的cDNA为模板，PCR扩增获得LPTS基因cDNA,PCR 反应条件为94℃2分钟预变性，循环反应为94℃30秒，55℃30秒，68℃ 90秒，共进行35个循环。PCR产物用低熔点凝胶回收纯化，克隆入T- 载体(Promega公司产品)中，方法参照《分子克隆·实验指南》(Sambrook, J.,Fritsh,E.F.,and Maniais,T.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。全序列测序(由TaKaRa公司，大连测定)， 该cDNA全长为1316bp(SEQIDNO.1)，包含了一个完整的蛋白编码区， 编码了一个由174个氨基酸组成的蛋白质(SEQID NO.2)。

实施例2、逆转录PCR检测LPTS在正常肝及肝癌组织样品中的表达

各肝癌组织及正常肝组织样品来自上海市东方肝胆医院，手术切除后 立即放入液氮中保存。采用TRIZOL试剂盒(GIBCOL/BRL公司)，按 照说明书推荐的方法制备组织样品总RNA。

用TaKaRa RNA PCR反应试剂盒(TaKaRa公司)从1μg总RNA中 逆转录出单链cDNA，按照说明书提供方法。将反转录得到的cDNA平均 分为两份，分别用基因特异引物(P3:5’- CTGAGAGCCACGATTGAGAACATT-3’；P4:5’- CTGAAGCCCAAAAAGAGGAGAGG-3’)和内参β-actin引物(β-actin1: 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’；β-actir2:5’- CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’)进行PCR扩增，反 应条件为：94℃2分钟，循环反应94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，35 个循环，72℃5分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(图1)。电泳 结果表明LPTS在正常肝中表达；在肝癌组织中4例表达，4例不表达， 缺失表达率为50％。

实施例3、LPTS在人正常组织中的表达分析

将固定有正常人的8种不同组织的poly(A)+RNA杂交膜(Multiple Tissue Northern Blot I,Clontech公司产品)放入杂交管中，加入5mL快速 杂交液(Clontech公司产品)，68℃预杂交30分钟，换5mL新鲜杂交液， 加入变性的32P随机标记的LPTS片段的探针(Random Primer DNA标记 试剂盒，TaKaRa公司)，68℃杂交1小时。杂交膜用洗涤缓冲液Ⅰ(0.3M NaCl,0.03M醋酸钠(PH7.0),0.05％十二烷基磺酸钠)于室温洗两次， 每次20分钟；然后用洗涤缓冲液Ⅱ(15mM NaCl,1.5mM醋酸钠(pH7.0), 0.1％十二烷基磺酸钠)于50℃洗两次，每次20分钟。然后，压片，-70 ℃放射自显影(图2)。实验结果表明LPTS基因在心脏、脑、胎盘、肺、 肝、骨骼肌、肾脏、胰脏中都有表达，表达产物大小为约1.4Kb。说明LPTS 基因不仅在正常肝脏组织中起作用，并且在其它组织中也有作用。

实施例4、LPTS基因抑制细胞生长的体外细胞实验

正常肝细胞L02用RPMI-1640培养液(GIBCOL/BRL公司产品)加 入10％胎牛血清(GIBCOL/BRL公司产品)，37℃,5％CO2培养。细胞 以1500个/每孔的接种量接种入96孔板中，37℃培养过夜，待细胞贴壁 后，换液并分别加入5μMl两种反义核苷酸(AntiS-1:SEQ ID NO.3；AntiS- 2：SEQ ID NO.4)，每天换液并维持反义核苷酸的浓度为5μM，以不加 反义核苷酸的细胞作为对照。每孔重复五次。在反义核苷酸处理后，在不 同时间进行MTT检测。MTT(噻唑蓝,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5,-二苯基 四氮唑溴盐)检测是基于检测活细胞还原MTT为蓝色结晶物的能力，对 应与活细胞的数量。检测时，吸弃96孔板每孔的培养液，换入100μL新 鲜培养液，加入10μLMTT(5mg/mL),37℃放置4小时，吸弃80μL上 清，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝色结晶物，用酶联免疫检 测仪在570nm测定光吸收。以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细 胞生长曲线(图3)。体外细胞实验的结果表明转入反义核苷酸AntiS-2， 细胞生长有明显加快。由于反义核苷酸序列干扰了正常LPTS基因的表 达，因此LPTS基因可进一步应用于抑制肿瘤细胞的生长，作为基因治疗 的药物。

                         序列表 (1)一般信息    (Ⅰ)申请人：中国科学院上海生物化学研究所    (Ⅱ)发明名称：一种肝癌相关基因及其应用    (Ⅲ)序列数：4 (2)SEQ ID NO:1信息    (Ⅰ)序列特征：

  (A)长度：1316个碱基

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (Ⅱ)分子类型：cDNA    (Ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:1： ATT CGG CAC AGG CGT CCG CTG CAG TCC GCC GGC GAG GGA GTT ACG CAC GTC CTG ATT CTC   60 CTG GAG TCT CCA GCC CGC CCA GTG GCC GCA GTC ACC CAG GTC CAG AGG CGG CGG TAT CAC   120 AGG CTC TCC GAC ATG TCT ATG CTG GCT GAA CGT CGG CCG AAG CAG AAG TGG GCT GTG GAT   180

            Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg lys Gln Lys Trp Ala Val Asp

                              5                  10                  15 CCT CAG AAC ACT GCC TGG AGT AAT GAC GAT TCC AAG TTT GGC CAG CGG ATG CTA GAG AAG   240 Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys

         20                  25                  30                  35 ATG GGG TGG TCT AAA GGA AAG GGT TTA GGG GCT CAG GAG CAA GGA GCC ACA GAT CAT ATT   300 Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu Gln Gly Ala Thr Asp His Ile

         40                  45                  50                  55 AAA GTT CAA GTG AAA AAT AAC CAC CTG GGA CTC GGA GCT ACC ATC AAT AAT GAA GAC AAC   360 Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn

         60                  65                  70                  75 TGG ATT GCC CAT CAG GAT GAT TTT AAC CAG CTT CTG GCC GAA CTG AAC ACT TGC CAT GGG   420 Trp Ile Ala His Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly

         80                  85                  90                  95 CAG GAA ACC ACA GAT TCC TCG GAC AAG AAG GAA AAG AAA TCT TTT AGC CTT GAG GAA AAG   480 Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys

        100                 105                 110                 115 TCC AAA ATC TCC AAA AAC CGT GTT CAC TAT ATG AAA TTC ACA AAA GGG CGA TGC CAG TCC   540 Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Arg Cys Gln Ser

        120                 125                 130                 135 CTC CAC TCC AGA GGA GAA CGA AAC CAC GAC AAC CAG CGC CTT CAC CAT CCA GGA GTA CTT  600 Leu His Ser Arg Gly Glu Arg Asn His Asp Asn Gln Arg Leu His His Pro Gly Val Leu

        140                 145                 150                 155 TGC CAA GCG GAT GGC AGC ACT GAA GAA CAA GCC CCA GGT TCC AGT TCC AGG GTC TGA CAT   660 Cys Gln Ala Asp Gly Ser Thr Glu Glu Gln Ala Pro Gly Ser Ser Ser Arg Val  -      

        160                 165                 170 TTC TGA GAC GCA GGT GGA ACG TAA AAG GGG GAA GAA AAG AAA TAA AGA GGC CAC AGG TAA   720 AGA TGT GGA AAG TTA CCT CCA GCC TAA GGC CAA GAG GCA CAC GGA GGG AAA GCC CGA GAG   780 GGC CGA GGC CCA GGA GCG AGT GGC CAA GAA GAA GAG CGC GCC AGC AGA AGA GCA GCT CAG   840 AGG CCC CTG CTG GGA CCA GAG TTC CAA GGC CTC TGC TCA GGA TGC AGG GGA CCA TGT GCA   900 GCC GCC TGA GGG CCG GGA CTT CAC CCT GAA GCC CAA AAA GAG GAG AGG GAA GAA AAA GCT   960 GCA AAA ACC AGT AGA GAT AGC AGA GGA CGC TAC ACT AGA AGA AAC GCT AGT GAA AAA GAA   1020 GAA GAA GAA AGA TTC CAA ATG AAT CCT TCC CAG CCG GGG CCT TCC GAC CAC TCA GCT GTC   1080 AGG GCA CTG CGG GGG CAG ACA CCT CTG GCC TGA AGT CAC AGC AGA GTT CAC CCC AGA GCG   1140 CCT GGG CGC ATC TTG TGG CAT GCC CAT GGG CTG CCG AGT CCT GCC CTC TCG CCA CAT TTC   1200 CCC CAA GTT ACA TTC CCA GGA GGA CCT TTT TAA TGT TCT CAA TCG TGG CTC TCA GAC ACA   1260 AAT AAA TTT TTT TGT AAA CTC TGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA (3)SEQ ID NO:2信息    (Ⅰ)序列特征：

  (A)长度：174个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性    (Ⅱ)分子类型：蛋白质    (Ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:2： Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg lys Gln Lys Trp Ala Val Asp Pro Gln Asn Thr

              5                  10                  15                 20 Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser

             25                  30                  35                 40 Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln Glu Gln Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val

             45                  50                  55                 60 Lys Asn Asn His Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His

             65                  70                  75                 80 Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly Gln Glu Thr Thr

             85                  90                  95                 100 Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser

            105                 110                 115                 120 Lys Asn Arg val His Tyr Met Lys Phe Thr Lys Gly Arg Cys Gln Ser Leu His Ser Arg

            125                 130                 135                 140 Gly Glu Arg Asn His Asp Asn Gln Arg Leu His His Pro Gly Val Leu Cys Gln Ala Asp

            145                 150                 155                 160 Gly Ser Thr Glu Glu Gln Ala Pro Gly Ser Ser Ser Arg Val         174

            165                 170 (4)SEQ ID NO:3信息    (Ⅰ)序列特征：

  (A)长度：21个碱基

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性    (Ⅱ)分子类型：寡聚脱氧核苷酸    (Ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:3： 5′-GCTCC GAGTC CCAGG TGGTT A-3′ (5)SEQ ID NO:4信息    (Ⅰ)序列特征：

  (A)长度：24个碱基

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性    (Ⅱ)分子类型：寡聚脱氧核苷酸    (Ⅲ)序列描述：SEQ ID NO:4 5′-TTCTT GTCCG AGGAA TCTGT GGTT-3′