:本发明涉及的单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE系由抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区单域VH、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成,分子量为26.2kD,其融合蛋白VH-LDP的基因编码序列和氨基酸组成如
序列表所示。
本项发明的技术方案包括以下步骤:1、抗IV型胶原酶抗体重链可变区单域VH基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因的克隆和重组表达质粒pET-VH-LDP的构建:重组质粒pKFv1027和pIJ1027GRGDS分别含有VH基因和LDP基因,由本实验室构建(本实验室可向公众提供并出具相关证明)。pGEM-T载体为美国Promega公司产品,大肠杆菌菌种E.coli.DH5α本实验室保存,大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)为本实验室保存的Invitrogen公司的产品。PCR引物由上海生工公司合成,分别引入相应酶切位点。
VH 5’端引物(PH1):5’GATACATATGCAGGTGAAGCTGCAGCAGTCT3’:NdeI VHVH3’端引物(PH2):
5’CATAGGATCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT3’BamHI spacer VHLDP 5’端引物(PLD1):GATAGGATCCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGT3’BamHI LDPLDP 3’端引物(PLD2):GTTACTCGAGGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG3’XhoI LDP以重组质粒pKFv1027为模板,PH1为5’端引物,PH2为3’端引物,进行PCR扩增,获得C末端带有一段编码GGGGS序列的spacer小肽的重链可变区单域抗体VH基因;同时以重组质粒pIJ1027GRGDS为模板,PLD1为5’端引物,PLD2为3’端引物,进行PCR扩增,获得LDP基因片段。PCR反应体系为:94℃预变性2分钟,然后94℃变性1分钟,58℃
退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行25个循环的扩增反应,最终一个循环后在72℃保温10分钟。
两种PCR产物利用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶回收
试剂盒纯化回收后,按Promega公司pGEM-T载体试剂盒提供的方法与pGEM-T载体相连,转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组克隆质粒,经上海生工公司测序确定序列正确后分别命名为pGEM-T-VH、pGEM-T-LDP。将质粒pGEM-T-LDP进行BamHI/XhoI双酶切,释放出的LDP基因片段亚克隆至pET-30a(+)载体,得到重组质粒pET-LDP。然后将pGEM-T-VH进行NdeI/BamHI双酶切,释放出的VH基因片段与进行同样双酶切的质粒pET-LDP连接,得到VH基因和LDP基因的融合基因重组表达质粒pET-VH-LDP,并进行酶切鉴定(图1)和序列测定。结果表明,融合基因重组表达质粒pET-VH-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致,融合蛋白的基因编码序列为732bp,由243个氨基酸组成,序列正确。
本发明在力达霉素辅基蛋白LDP基因3’端引入了XhoI酶切位点,恰好可以利用质粒pET-30a(+)多克隆位点3’端的6个连续组氨酸标签肽(His6-Tag)的密码子,使得表达蛋白的3’端融合有His6-Tag,便于纯化和鉴定。
2、融合蛋白VH-LDP在大肠杆菌BL21starTM(DE3)中的诱导表达:本发明使用的大肠杆菌表达菌株BL21starTM(DE3)为Invitrogen公司产品。以构建好的重组质粒pET-VH-LDP转化大肠杆菌BL21starTM(DE3),得到重组转化菌。挑取单克隆接种到含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中,37℃震荡过夜;次日按1∶50接种,37℃震荡培养至OD600为0.7,向培养物中加入终浓度为0.05mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),诱导培养3小时,按pET系统操作手册(Novagen,第九版)分别制备全细胞蛋白组分、培养液上清组分、细胞周质腔组分、可溶性
细胞质和不可溶性细胞质(包涵体)组分,然后在变性条件下进行15%聚丙烯酰胺凝胶
电泳分析外源蛋白表达情况。结果表明,经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白,表达量占全菌总蛋白的30%以上,且表达产物存在于细菌不可溶的包涵体中(图2)。
用Western blot检测方法对表达蛋白进行进一步确认,将电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转,条件为:恒
电流0.65mA/cm2,时间为1小时50分钟。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)与用封闭液2000倍稀释的一抗即抗His6-Tag单抗孵育,以辣根过
氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗,进行显色分析,结果表明,重组菌株表达的确为C-末端带有His6-Tag的重组融合蛋白VH-LDP(图2)。将表达VH-LDP融合蛋白的重组转化菌株命名为CAMS/HLDFP,已于2004年04月09日送交中国
专利局
指定的菌种保藏单位中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市海淀区中关村北一条13号保藏(保藏编号:CGMCC No.1130,分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli)。
3、融合蛋白VH-LDP的纯化和复性:采用Novagen公司的His·Bind纯化试剂盒于变性条件下纯化融合蛋白样品,按试剂盒
说明书进行操作。对包涵体蛋白样品和亲和层析柱进行预处理后,样品上柱,依次以10倍柱床体积的含6M尿素的结合缓冲液(5mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.9),6体积含6M尿素的洗涤缓冲液(60mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH 7.9)洗涤层析柱,最后以含6M尿素的洗脱缓冲液(100mM EDTA,0.5M NaCl,20mMTris-HCl pH 7.9)进行洗脱,收集洗脱组分获得纯化的融合蛋白VH-LDP(图3)。融合蛋白VH-LDP的理论分子量为25.4kD。
对纯化后的融合蛋白VH-LDP进行复性:将纯化后的样品用含6M尿素的洗脱缓冲液稀释至15μM,加入2-巯基
乙醇至终浓度为10mM,室温放置30分钟,然后将样品装入
透析袋,用至少50倍样品体积的复性液I(50mM Tris-HClpH 8.0,1mM EDTA,200mM NaCl,6M尿素)透析过夜。再用与复性液I同样组分但尿素浓度依次为3M、2M、1M、0.5M、0M的50倍体积的缓冲液进行分步透析,在尿素浓度为1M的阶段加入750μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。将最后一次透析所得样品用50倍体积
磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)透析,每12小时更换一次
透析液,共两次。以上透析操作均于4℃进行。将透析后的样品以10,000g,4℃离心30分钟,收集上清。将上清样品进行浓缩后得到活性融合蛋白VH-LDP,置于-20℃备用。
4、融合蛋白VH-LDP的免疫学活性:以酶联
免疫吸附分析方法(ELISA)进行测定。首先进行IV型胶原酶的包被或细胞的固定:将IV型胶原酶以PBS配制成10μg/ml的溶液,以100μl/井包被96孔板,然后置4℃过夜;将对数生长期的人肝癌Bel-7402细胞或人
口腔鳞癌KB细胞按2×104/井的
密度接种于96孔培养板,培养24小时后PBS洗3次,加4℃预冷的0.05%的戊二
醛固定15分钟。然后将包被好的IV型胶原酶板或固定好的细胞96孔板用PBS洗3次后,加入含1%
牛血清
白蛋白(BSA)的PBS 200μl/井,4℃封闭过夜。PBS洗3次后,加入倍比稀释的待测样品50μl/井,37℃温育2小时。再以含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)200μl/井洗板3次,加入1∶1500倍稀释的抗His6-Tag单克隆抗体50μl/井,37℃反应1小时。以PBST洗板3次,50μl/井加入1:2000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG,37℃反应1小时。最后以PBST洗板6次,100μl/井加入邻苯二胺(OPD)底物反应液,室温暗处反应10分钟。以2M
硫酸100μl/井终止反应,在酶标仪上测定490nm吸光值。结果表明,和单抗3G11的单链抗体3G11-scFv类似,融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶(图4)、人肝癌Bel-7402细胞(图5)、人口腔鳞癌KB细胞(图6)的免疫反应均呈阳性。
5、融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶活性的抑制作用:采用明胶酶谱法。取对数生长期的人
纤维肉瘤HT-1080细胞,按1×105/孔加于24孔培养板中,37℃,5%CO2培养24小时。然后吸弃培养液,加入1ml无血清RPMI 1640培养液轻轻冲洗2次。每孔加入120μl无血清RPMI 1640培养液和30μl样品,对照孔加入30μl PBS,继续培养24小时。吸取培养液,500g离心5分钟,取上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后,取出凝胶,用蒸馏
水漂洗3次。将凝胶放入100ml 2.5%的曲拉通X-100(TritonX-100)中,于摇床上低速摇动30分钟。然后以蒸馏水漂洗2次,换100ml新的2.5%的TritonX-100溶液,低速摇动30分钟。蒸馏水漂洗2次,加入100ml明胶酶缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.5,200mM NaCl,10mM CaCl2,1μM ZnCl2),37℃孵育16-18小时。考
马斯亮蓝R250
染色,乙酸∶甲醇∶水(10∶45∶45)脱色后观察负染明胶条带。结果表明,免疫融合蛋白VH-LDP对肿瘤细胞分泌的IV型胶原酶的活性有明显的抑制作用,能够使人纤维肉瘤HT-1080细胞分泌的92kD MMP-9和72kD MMP-2的IV型胶原酶负染条带明显减弱,并且呈浓度依赖性(图7)。
6、强化融合蛋白VH-LDP-AE的制备:取高活性LDM冻干品(本实验室制备保存并可向公众提供)10mg,加5ml冷甲醇振摇5分钟,-20℃放置1小时,中间振摇1次;在0℃,12000转/分钟离心20分钟,上清液含发色团,沉降物为肽链,重复提取2次。发色团甲醇液
蒸发浓缩,-70℃储存。发色团不稳定,实验需低温(4℃)、避光进行。然后取VH-LDP融合蛋白溶于PBS中,加入5倍分子量的发色团-甲醇溶液(体积比为50∶1),混合振摇,室温放置12小时。最后将
混合液进行PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱,Pharmacia产品)层析,经A280nm和A343nm紫外监测后收集强化融合蛋白VH-LDP-AE(图8)。VH-LDP-AE的理论分子量为26.2kD。
7、强化融合蛋白VH-LDP-AE对体外培养的肿瘤细胞的细胞毒作用:以噻唑蓝(MTT)法进行测定。取对数生长期的细胞消化、计数,3000/井铺于96孔板,在37℃含5%CO2的
培养箱中培养24小时后加入不同浓度的药物,每个药物浓度设3个平行孔。继续培养72小时,每孔加入50μl无血清RPMI 1640培养液溶解的MTT(2mg/ml),37℃继续培养4小时,轻轻吸去培养液,加入150μl二甲基亚砜(DMSO),室温下摇床振摇15分钟,酶标仪上测定560nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按公式:细胞存活率=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC50)值。强化融合蛋白VH-LDP-AE对HT-1080细胞、KB细胞、人巨细胞
肺癌PG细胞均由有强烈的杀伤作用,其IC50值均小于10-11M(表1)。
表1、VH-LDP-AE对肿瘤细胞的杀伤作用
8、强化融合蛋白VH-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22肿瘤模型的治疗作用:领取生长状态良好的体重为18-22克的昆明小鼠随机分组,每组10只。实验第0天,取小鼠肝癌22腹水,以生理盐水稀释成细胞数为7.5×106/ml,按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。实验第1天(24小时后)开始治疗,对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白VH-LDP-AE,0.05mg/kg的LDM,1mg/kg的丝裂霉素(MMC)。均为尾静脉注射,0.2ml/只。试验期间,每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b,并记录动物体重。以公式V=0.5ab2计算瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,并计算抑瘤率。
强化融合蛋白VH-LDP-AE的治疗结果表明,0.25mg/kg和0.125mg/kg两个剂量的VH-LDP-AE均能显著抑制或延迟小鼠移植性肿瘤H22的生长,并且表现出比0.05mg/kg耐受剂量游离力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用,显示VH-LDP-AE提高了力达霉素的治疗效果(图9)。在实验第14天的结果显示,两个剂量的VH-LDP-AE的抑瘤率分别为95.9%和88.1%,均显著强于LDM组的79.6%抑瘤率,而常用肿瘤化疗药丝裂霉素的抑瘤率仅为51.5%(表2)。在实验治疗期间,动物体重有所增加,一般状况良好,表明动物可耐受所给剂量。
表2、VH-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22的生长抑制作用
*与LDM相比,P<0.05,**与LDM相比P<0.01;Δ与空白对照相比P<0.05,ΔΔ与空白对照相比P<0.01.
9、VH-LDP-AE与抗肿瘤药物联用对肿瘤细胞的增殖抑制作用:用MTT法进行检测。取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞,用胰酶-EDTA进行消化后,按4000/井加入96井板,24小时后加入药物。首先加入不同浓度的羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶各20μl,8小时后加入不同浓度的VH-LDP-AE,然后继续在37℃、5%CO2孵箱中培养72小时。加入2mg/ml MTT 50μl,于37℃继续培养4小时。吸去上清,加入150μl二甲基亚砜,10分钟后于570nm处测定吸光度值。肿瘤药理中,药物相互作用用药物相互作用指数CDI进行评价,CDI值小于1表示存在协同作用,CDI值小于0.7表示存在非常显著的协同作用。1μM羟基喜树碱和3ng/ml强化融合蛋白VH-LDP-AE联用时,其CDI<0.7,说明二者能协同抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖(图10);5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE联合应用,其中10μM 5-氟尿嘧啶和3ng/ml强化融合蛋白对HT-29
细胞增殖的CDI<0.7,说明5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE联用存在明显的协同作用(图11)。单抗药物的应用常常与已知抗肿瘤药物联用,本结果表明,强化融合蛋白VH-LDP-AE与羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶联用存在明显的协同作用。
发明效果:本发明的优点与积极效果在于:应用基因重组和分子重建相结合的方法,制备了抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区单域抗体与抗肿瘤抗生素力达霉素的强化融合蛋白VH-LDP-AE,不仅保留了完整抗体对IV型胶原酶的结合和抑制活性,还具有强烈的肿瘤细胞杀伤活性,在体内实验中也显示了良好的抗肿瘤疗效。它是迄今为止已报道分子量最小的具强烈抗肿瘤作用的单域抗体融合蛋白,在肿瘤靶向免疫治疗药物的小型化方面达到一个新水平,具有良好的应用前景。
附图说明
:图1:重组表达质粒pET-VH-LDP的限制性内切酶分析其中:1-DNA分子量标准(DL15,000) 2-质粒pET-30a(+)3-重组质粒pET-VH-LDP 4-pET-30a(+)/NdeI+XhoI5-pET-VH-LDP/NdeI+XhoI 6-pET-VH-LDP/NdeI+BamHI7-pET-VH-LDP/BamHI+XhoI 8-DNA分子量标准(DL2,000)图2:融合蛋白VH-LDP表达产物的SDS-PAGE(左)和Western Blot(右)分析其中:1-低分子量蛋白标准2-BL21starTM(DE3)/pET-30a(+)菌株经IPTG诱导后的全菌蛋白3-重组菌株CAMS/HLDFP未经IPTG诱导的全菌蛋白4-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的全菌蛋白5-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的培养上清组分6-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的细胞周质腔组分7-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的可溶性细胞质组分8-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的不可溶包涵体组分图3:融合蛋白VH-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析其中:1-低分子量蛋白标准2-全菌蛋白样品3-上柱前样品4-不与亲和层析柱结合的杂蛋白5-6-经结合缓冲液洗涤下来的杂蛋白7-经洗涤缓冲液洗涤下来的杂蛋白8-9-经洗脱缓冲液洗脱下来的融合蛋白VH-LDP图4:融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶的免疫
反应性其中:○融和蛋白VH-LDP;▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv图5:融合蛋白VH-LDP对人肝癌Bel-7402细胞的免疫反应性其中:○融和蛋白VH-LDP;▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv图6:融合蛋白VH-LDP对人口腔鳞癌KB细胞的免疫反应性其中:○融和蛋白VH-LDP;▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv图7:融合蛋白VH-LDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞的明胶酶谱分析其中:1-PBS 2-25μM VH-LDP融合蛋白3-50μM VH-LDP融合蛋白 4-100μM VH-LDP融合蛋白5-20μM3G11-scFv
图8:强化融合蛋白VH-LDP-AE的制备其中:▲280nm光吸收值 ■343nm光吸收值图9:强化融合蛋白VH-LDP-AE对小鼠肝癌22生长的抑制作用其中:□对照组 ▲LDM组 △VH-LDP-AE 0.25mg/kg组×VH-LDP-AE 0.125mg/kg组 +丝裂霉素1mg/kg组图10:强化融合蛋白VH-LDP-AE和羟基喜树碱联用对HT-29细胞增殖作用的影响其中■羟基喜树碱●羟基喜树碱+VH-LDP-AE(1ng/ml)▲羟基喜树碱+VH-LDP-AE(3ng/ml)*CDI<0.9;**CDI<0.8;***CDI<0.7图11:强化融合蛋白VH-LDP-AE和5-氟尿嘧啶联用对HT-29细胞增殖作用的影响其中:■5-氟尿嘧啶●5-氟尿嘧啶+VH-LDP-AE(1ng/ml)*CDI<0.9;**CDI<0.8;***CDI<0.7
序列表<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE<160>2<210>1<211>732<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗IV型胶原酶重链可变区基因和力达霉素辅基蛋白基因的重组融合序列<400>1atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag 60ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag 120acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa 180tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc 240tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg 300gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360ggcggtggcg gatccgcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga 420cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag 480tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg 540gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg 600cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc 660ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac 720caccaccact ga 732<210>2<211>243<213>人工序列<212>PRT<220>
<223>抗IV型胶原酶重链可变区单域抗体和力达霉素辅基蛋白的融合序列
<400>2Met Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser20 25 30Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala115 120 125Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser130 135 140Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln145 150 155 160Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr165 170 175Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val180 185 190Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser195 200 205Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly210 215 220Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His225 230 235 240His His His