专利汇可以提供重组人表皮生长因子、其制备方法和药物组合物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供工程菌株EE-8和用其制备重组人表皮生长因子的方法,包括:用大肠杆菌偏爱的密码子构建和克隆合成的hEGF基因;构建和克隆 碱 性 磷酸 酯酶启动基因和 信号 肽序列基因 片段 phoA-P+sig;构建表达质粒pAE-8;用表达质粒pAE-8转化宿主菌并筛选得到工程菌株EE-8;和将工程菌EE-8在控制无机磷含量的Lpi培养基中培养,诱导表达rhEGF。该方法能高效、稳定地分泌表达rhEGF。本发明还提供 治疗 消化道溃疡用的rhEGF药物组合物,能在胃内缓慢持续释放药物,发挥持久疗效。,下面是重组人表皮生长因子、其制备方法和药物组合物专利的具体信息内容。
1.重组人表皮生长因子的制备方法,包括以下步骤:
用大肠杆菌偏爱的密码子构建和克隆合成的hEGF基因;
构建和克隆碱性磷酸酯酶启动基因和信号肽序列基因片段phoA-P+sig;
构建表达质粒pAE-8;
用表达质粒pAE-8转化宿主菌并筛选得到工程菌株EE-8;
将工程菌EE-8在控制无机磷含量的Lpi培养基中或中试规模的培养基中培 养,诱导表达rhEGF;
其中所述控制无机磷含量的Lpi培养基的配方如下:
每50ml液体培养基中含:
氨苄青霉素钠最终浓度为100μg/ml
Polypepton 0.5g 酵母提取物 0.05g
1M Tris Cl,pH7.2, 2.5ml 葡萄糖 0.5g
MgSO4 7H2O 0.05g 饱和酚红 100μl;
所述中试规模的发酵培养基的配方如下:
Polypepton 2%、酵母提取物1%、无水硫酸镁0.05%、无水葡萄糖3% 及Na2HPO4·12H2O 0.06%,NaH2PO4·2H2O 0.04%重量/体积。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述的hEGF基因为:
5’AATTCCGACT CTGAATGCCC GCTGTCTCAC
GACGGTTACT GCCTACACGA TGGTGTTTGC
ATGTATATCG AAGCTCTGGA CAAATACGCG
TGCAACTGTG TTGTTGGTTA CATCGGTGAA
CGTTGCCAGT ACCGTGACCT GAAATGGTGG
GAACTGCGT 3’。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述宿主菌为碱性磷酸酯酶缺失的大 肠杆菌YK537,其基因特征为:F-leuB6 thi hsdR hsdM lacy rpsL20 galk2 ara-14 xyl-5 mtl-1 supE44 endl-phoA8 recA1。
4.如权利要求1所述的方法,进一步包括中试规模的发酵和分离纯化工 艺,工程菌种子液经扩大培养后按2%比例接种于100升发酵培养基,37℃发 酵18小时后进行高速离心、超滤浓缩和色谱分离。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,该工程菌株大肠杆菌 (Escherichia coli)EE-8保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心,保藏号为No.CGMCC 0287-1。
人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor),简称hEGF,又名β-尿抑 胃素(B-Urogastrone),是不带糖基、含有53个氨基酸的小蛋白,分子量约为6216 道尔顿。等电点为4.7。hEGF的N端为天冬酰胺(Asn),C端为精氨酸(Arg),hEGF 内含三对二硫键,以维持其生物活性所需稳定的蛋白构型。
S.Cohen和H.Gregorg于1975年同时从人尿中分离得到人表皮生长因子。 由于它具有抗胃酸分泌作用,故又称尿抑胃素。人体体液中如尿、血液、唾液、 泪液、精液、乳汁、胃液、髓液中均含有hEGF,其中尿、乳汁、精液中含量较高。 人体中的甲状腺、胰腺、唾液腺、空肠、十二指肠、肾等许多组织和腺体都含有 hEGF,其中,唾液腺、胰腺、肾和甲状腺内含量较高。
研究表明,hEGF是一个多功能的重要的细胞因子,它可刺激表皮和内皮细胞、 成纤维细胞生长,因而能促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合、加速移植的表皮生 长;hEGF也可促使角膜上皮细胞、实质细胞、内皮细胞的生长,因而可用于治疗 角膜外伤、角膜溃疡和化学试剂灼伤等,并可加速移植的角膜生长。
尽管早在1975年Cohen,S.,Carpentre,G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1975,72:1317)和Gregory,H.(Nature,1975,257:31)阐明了hEGF蛋白的一级 结构,然而,迟至1986年才由Chiron公司的研究人员阐明了hEGF的cDNA的核 苷酸序列(Graeme,I.B.et a1.,Nucleic Acids Res.,1986,14(21):8427)。
由于hEGF具有广泛的生物功能和治疗作用,因此,为了满足临床治疗的 需要,有必要开发能高效表达rhEGF的工程菌和规模生产rhEGF的方法以及 用rhEGF制备的药物。
本研究者应用自己合成的碱性磷酸酯酶启动子(phoA)、信号肽序列;自己设 计的密码子合成了hEGF基因,在多拷贝质粒中构建高效分泌表达质粒,在大肠杆 菌中得以高表达。在实验室研究中,在摇瓶中工程菌EE-8或EET-8分泌表达hEGF 可达~30mg/L,而15升发酵罐中分表达hEGF可达~60mg/L。150升发酵罐中, 分泌表达rhEGF达100毫克以上。
鉴于目前临床上常用的治疗消化性溃疡药物洛赛克(Omerazo1)和拜耳胃达喜 均有刺激胃粘膜分泌EGF功能,而hEGF除能抑制胃酸外,还可增加胃粘膜血流量, 增加胃粘膜细胞中RNA、DNA及蛋白质的合成,促进粘膜细胞生长,从而促进溃疡 愈合,提高溃疡愈合的质量,使愈合后的溃疡不易复发,因此,本发明在高效表 达rhEGF的基础上,进一步开发口服治疗消化道溃疡的rhEGF制剂。
因此,本发明的一个目的是提供能高效、稳定地表达rhEGF的工程菌。
本发明的另一个目的是提供能高效、稳定地制备rhEGF的方法。
本发明的另一个目的是提供治疗消化道溃疡用的药物组合物。
本发明所提供的工程菌株大肠杆菌(Escherichia coli)EE-8系于1996年 12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、 保藏号为No.0287-1的rhEGF表达菌株。
本发明的工程菌株EE-8由表达质粒pAE-8转化碱性磷酸酯酶缺失的大肠 杆菌YK537而得到。
本发明的制备重组人表皮生长因子的方法包括以下步骤:
用大肠杆菌偏爱的密码子构建和克隆合成的hEGF基因;
构建和克隆碱性磷酸酯酶启动基因phoA-P和信号肽序列sig;
将phoA-P和sig克隆至质粒pTZ18R,构建成表达质粒pAE-8;
用表达质粒pAE-8转化大肠杆菌YK537并筛选得到工程菌株EE-8;
将工程菌EE-8在控制无机磷含量Lpi培养基中培养,诱导表达rhEGF。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的重组人表皮生长因子和药学上可 接受的辅料。
下面对本发明作详细描述。
本发明涉及用重组DNA技术制备重组人表皮生长因子。具体涉及工程菌 株EE-8的构建及用所述工程菌株EE-8制备重组人表皮生长因子的方法。本 发明还涉及用重组人表皮生长因子制成的治疗消化道溃疡的药物组合物及其 药效学、毒理学和药代动力学研究。
一、工程菌株的构建:
1.表达质粒的构建:
1.1.合成的hEGF基因的构建和克隆
天然的hEGF由53个氨基酸组成,整个基因为159个碱基对(图1),设计 由6个合成片段组成。在基因的5’端加上EcoRI切点,在3’端加HindIII切 点和两个TAA终止码。本发明者在合成基因时考虑到如下几点:A,采用大肠 杆菌偏爱的密码子;B,片段内避免二级结构形成;C,片段间尽量避免重复 序列;D,采用分泌表达,hEGF基因无起始密码ATG,第一个密码是AAT(Asn), 与天然的hEGF相同(见图2A)。
第1、6片段先经磷酸化后,6个片段以等克分子混合,一起退火后连接 成hEGF全基因片段,用EcoRI和HindIII酶切多拷贝的pTZ18R质粒,然后重 组连接(见图3A)和转化JM103受体菌。经EcoRI、HindIII酶切和序列分析筛 选pEG-14重组质粒(见图4),所含合成hEGF基因与所设计的一致。
1.2.碱性磷酸酯酶启动基因和信号肽序列的构建和克隆
设计合成时,我们完全按照大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动基因phoA-P和信号 肽序列(sig)的天然序列phoA-P+sig序列。由8个合成片段组成。在phoA-P 的5’端加上PstI、BglII、XbaII等切点,以便于构建。在sig序列的3’端 加上EcoRI切点(见图2B)。
第1、8片段先经磷酸化后,8个片段以等克分子混合退火后连接,得到 phoA-P+sig的基因片段。用PstI、EcoRI酶切pTZ18R质粒后与连接的合成 片段重组连接,转化JM103菌。应用PstI、EcoRI酶切和序列分析筛选到pAP-2 重组质粒,与天然基因序列相同(见图3B)。
1.3.表达质粒pAE-8的构建
用PstI、EcoRI酶切pAP-2质粒得到phoA-P+sig片段,与EcoRI、Hind III酶切pEG-14得到的hEGF基因片段先经连接后,再与经PstI、HindIII酶 切的pTZ18R质粒相连接,转化JM103菌。通过PstI、HindIII酶切和序列分析 筛选到表达质粒pAE-8(见图5)。
1.3.1.目的基因的核苷酸序列
对pAE-8质粒上的合成hEGF目的基因,进行了核苷酸序列分析,测得的 核苷酸序列见图6,与合成时设计的hEGF序列相一致。hEGF基因159个核苷 酸,编码53个氨基酸。
1.3.2.表达质粒酶切图谱
构建的分泌表达质粒的pAE-8(见图5)的特点如下:
(1)应用的启动子是本发明者合成的大肠杆菌的碱性磷酸酯酶启动子 (phoA)和信号肽序列(sig)。
(2)为了便于克隆,在phoA启动子的5’端加上PstI等切点,在信号肽 后的3’端加上EcoRI切点共长约190bp。
(3)合成的人表皮生长因子(hEGF)基因,为159个核苷酸,在hEGF基因5’ 端加上EcoRI切点,3’端加上HindIII切点,共约165个核苷酸。
图7显示构建的分泌表达质粒pAE-8的酶切图谱。
其中,第一栏表示pAE-8经PstI、EcoRI酶切得到约190bp酶切片段, 含phoA启动子及信号肽序列。
第二栏表示pAE-8的分子量标记。
第三栏表示pAE-8经PstI、HindIII酶切得到约355bp片段,含phoA 启动子及信号肽序列及hEGF基因。
第四栏表示pAE-8经EcoRI、HindIII酶切得到约165bp片段,含hEGF 基因。
2.基因工程菌的构建和筛选
2.1.基因工程菌的构建
在宿主菌的选择中,采用碱性磷酸酯酶缺失的大肠杆菌YK537。YK537属 K12菌株,为革兰氏阴性菌。
宿主菌YK537的基因特征:
F-leuB6 thi hsdR hsdM lacy rpsL20 galk2 ara-14 xyl-5 mtl-1 supE44 endl-phoA8 recAl
宿主菌YK537的表型特征:碱性磷酸酯酶基因缺失,宿主菌不能表达碱 性磷酸酯酶。
用表达质粒pAE-8转化YK537得到表达菌株EE-8。
2.2 工程菌株的筛选
挑选若干转化菌落,接种至高磷培养基中生长过夜,次日离心后换低磷 培养基进行诱导。诱导后取1毫升菌液,经离心后所得菌体悬浮于含溶菌酶 的溶液中,冰浴放置后离心,取上清作电泳分析。选择分泌表达hEGF量最高 的EE-86菌株作为基因工程菌株(简称为EE-8)。
二.工程菌的培养和诱导表达:
通常国外学者如Oka等(Wakunaga公司),将工程菌于含高磷(640μM KH2PO4) 的类似M9培养基(简称TG-20)中生长过夜,在低磷(32μM KH2PO4)类M9培养 基(简称TG-1)诱导表达。在这样的培养和诱导条件,工程菌表达量较低(仅~ 2mg/L培养基)。
本发明者发现工程菌在含高磷的TG-20培养基中生长较慢,接种后培养24 小时,A660仅为1-1.15,诱导时在低磷培养基中rhEGF表达量亦较低,表达 量约为2mg/L培养基,产物主要被分泌至细菌周质中。经试验多种培养和诱导 条件,改变了培养基中营养组份,将工程菌在优化的控制无机磷含量Lpi培养 基中培养,使表达量得到提高。
在摇瓶培养中,在低磷Lpo培养基中,诱导表达的rhEGF可达约30mg/L 培养基。
在15升发酵罐培养中,培基中诱导表达的rhEGF含量可高达约60mg/L培 基,在150升发酵罐培养中,可分泌表达rhEGF约100mg/L培基以上。
三.中试规模的发酵和分离纯化
1.种子制备:
将甘油工程菌涂含氨苄青霉素(Ap)的平板,挑取单克隆接种于含Ap LB 培养基,37℃培养过夜,次日再接种一次扩大培养,作为上罐发酵用的种子。
2.发酵培养:
按2%的比例将种子液接种于100升培养基中,于37℃发酵约18小时后 放罐。
3.分离纯化
高速离心,收集发酵液上清进行超滤浓缩。再用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow柱、Q Sepharose Fast Flow柱和Superdex 30 prep grade柱进行色谱 分离。
上述中试生产工艺流程见图8。
四 人表皮生长因子的药物组合物
本发明的治疗消化道溃疡用的药物组合物,包含人表皮生长因子或其衍 生物和药学上可接受的辅料,其中所述人表皮生长因子或其衍生物的含量为 0.001-2000μg/ml或0.001-2000μg/g。
本发明的药物组合物可制成口服制剂和非胃肠道制剂。
口服制剂有:
固体剂型,如丸剂、颗粒剂、粉末剂或诸如片剂或胶囊剂等不连续单位;液 体剂型,它们为备用形式地构建的形式,如混合物、糖浆、悬浮液或乳液。制剂 另外可含有稀释剂、粉末剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、 螯合剂和/或其它药物添加剂。可使用水性或非水性赋形剂或它们的组合,需要时 可含有合适的甜味剂、调味剂或相似的物质。对于悬浮液或乳剂,可存在合适的 增稠剂、悬浮剂或乳化剂。药物制剂可有由基质或扩散控制系统提供的慢释、缓 释或控释的活性组份。
非胃肠道制剂:
对于非胃肠道给药,rhEGF可存在于水性或非水性赋形剂或其组合的无菌赋 形剂中。赋形剂的例子是水、油酸乙酯、油和聚醇的衍生物、二元醇和它们的衍 生物。它可含有可注射制剂里常用的添加剂,如稳定剂、增溶剂、pH改性剂、缓 冲剂、抗氧剂、助溶剂、络合剂、张力修饰剂等。一些合适的添加剂为诸如酒石 酸盐、柠檬酸盐或相似的缓冲剂、醇、氯化钠、右旋糖和高分子量液体聚合物。 另一种形式是供再构建的无菌粉末。
本发明药物组合物的一个优选实施方案是口服缓释胶囊剂。根据EGF药 代动力学实验的结果,口服EGF在胃中较为稳定,进入肠道后很快被降解,血 药浓度低。因此,口服EGF的作用主要发生在胃中。EGF在胃中停留的时间越 长,其促进溃疡愈合的效果也越好。本发明的口服缓释胶囊剂口服后进入胃 中,吸水膨胀,形成亲水凝胶,使药物缓慢释放,释放时间将持续4小时左 右。
本发明应用基因工程技术,成功地使人表皮生长因子(EGF)的制备从实验 室进入中试规模,最终得以大规模地生产,降低了成本,为临床应用治疗胃 溃疡提供了量的保证。本发明的rhEGF制备方法采用蛋白分泌表达,具有以下 优点:
(1)表达产物其N端不带Met(甲硫氨酸),与生物体中天然蛋白质的序列 相同。
(2)在大肠杆菌中,分泌的目的蛋白质具有较好的天然蛋白质的空间折叠 构象,因而具有较高生物活性。其简单过程如下:当带有信号肽的目的蛋白 肽链在核糖体上合成后,通过SecB等分子伴侣,由信号肽将合成的多肽链引 至内膜上,与膜上由SecA、SecY、SecE等因子组成的转位酶相结合,由转位 酶将新合成的多肽分子从胞内转送至内膜,通过内膜时,多肽链已被折叠成 一定构象,由质膜上的信号肽酶切去信号肽,SecD、SecF因子帮助肽链从内 膜上解离,并由质膜上的二硫键异构酶使肽链形成二硫键。整个过程使合成 的目的多肽链折叠成天然蛋白质的构象,因而具有较高的生物活性。
然而,体内表达产物,或可溶性,或包涵体形式,其N端多一个Met,与 天然蛋白质序列相异。表达形成的包涵体是一种多肽无规团聚,无生物活性, 必须经过较长复性、重折叠过程,使部分多肽链具有蛋白质构象。生物活性 的高低取决于复性的效率。
本发明的制剂采用对消化道粘膜粘蛋白具有特定粘附力的高分子材料如 卡波姆(Carbopol)等,使药物停留在消化道中特定的位置。并使rhEGF在胃内 能够缓慢持续释放,保持胃内始终有较高浓度的药物,从而更好地发挥疗效。
图1是hEGF的一级和二级结构。
图2A是合成的hEGF序列;图2B是合成的pho-P和sig的序列。
图3A显示合成的hEGF基因的构建和克隆;图3B显示合成的pho-P和sig 序列的构建和克隆。图中,E:EcoRI;H:HindHI;P:PstI。
图4是pEG重组质粒酶切图谱。图中,质粒经EcoR I+HindIII酶切;分 子量标记:pBR322+HinfI。
图5是表达质粒pAE-8的构建示意图。
图6是测得的合成hEGF目的基因核苷酸序列。
图7显示的是构建的分泌表达质粒pAE-8的酶切图谱。
图8是中试生产工艺流程。
图9是各EE-8菌的周质蛋白组份电泳图。
图10显示的是从传代菌抽提的质粒的酶切图。酶切:PstI+HindIII;分 子量标记:pBR322+HinfI。
图11显示工程菌EE-8在摇瓶培养条件下rhEGF表达量与诱导时间的关 系。图中,*:无机磷浓度(μg/ml);□:细菌A660值;○:周质空间中hEGF 含量(培养基μg/ml);△:培养基中hEGF含量(培养基μg/ml);×:细胞浆中 hEGF含量(培养基μg/ml)。
图12显示在发酵罐培养条件下rhEGF的表达。图中,*:培养基中hEGF 表达量(mg/L);□:葡萄糖含量(g/L);○:无机磷浓度(μg/ml);△:细菌 A650值。
图13是还原型SDS-PAGE凝胶扫描图谱。
图14是凝胶HPLC分析图谱。
图15是SDS-PAGE图谱。
图16是等电聚焦图谱。
图17是紫外特征吸收光谱。
图18是肽谱分析图谱。
图19是rhEGF治疗大鼠胃溃疡12天量效关系图。
图20是rhEGF治疗大鼠胃溃疡12天疗效图。
图21是幽门结扎胃溃疡模型溃疡指数量效关系图。
图22是幽门结扎胃溃疡模型溃疡指数图。
图23显示幽门结扎胃溃疡模型溃疡发生百分率%。
图24显示幽门结扎胃溃疡模型溃疡发生百分率%。
图25是乙醇损伤胃溃疡模型量效关系图。
图26是乙醇损伤胃溃疡模型溃疡指数图。
以下用实施例和实验例对本发明进行举例说明,它们旨在阐述本发明的 最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示,结合本领域的常识所做 的各种变更,均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1 工程菌的筛选
每次任挑20个转化菌落,接种至3ml高磷培养基中(内含50μg/ml氨苄 青霉素)生长过夜,次日离心后换低磷培养基诱导6小时。取1毫升菌液,经 离心后所得菌体悬浮于150微升含溶菌酶(1mg/ml),20%W/V蔗糖,30mmol/L Tris·Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA的溶液中,冰浴放置15分钟。离心后上清 为周质蛋白组份。取15微升电泳分析,电泳分离胶为15%聚丙烯酰胺凝胶, 电泳后用银染法染色。
图9是各EE-8菌的周质蛋白组份电泳图。从图9可见EE-86菌株分泌表 达hEGF量最高。选取此菌株为基因工程菌株(简称为EE-8)。
实施例2 表达质粒稳定性实验
A.溶液培养基接种传代
将菌种稀释1000倍接种于LB(Ap50,即氨苄青霉素50μg/ml培养基)培 养基中,37℃培养过夜,相当于10次细胞分裂。每天重复上述操作10次, 共得到10支菌种。每支菌种稀释一定倍数后涂布于LB平板上,37℃培养过 夜,共得到10块平板。每块平板各挑出100个单菌落点种到LB(Ap50)平板上, 37℃培养过夜,共得到10块平板,计算每块LB(Ap50)平板上长出的菌落数, 即可得相应的各代的质粒保存率。
表1、分裂不同代数的细胞中质粒的保存率 细胞分裂代数 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 重组质粒保存率(%) 100 100 100 100 100 100 100 100 99 100
表1的结果表明,细胞分裂100代后,重组质粒pAE-8未见丢失。
B.平板传代
将菌种接种于LB溶液培养基(Ap50),37℃培养过夜。取103细胞液涂布 于LB平板,37℃培养过夜。从平板挑取100单菌落接种至LB(Ap50)平板,37 ℃过夜,计长出菌落数。再从LB(Ap50)平板挑取单菌落。接种传代,操作如 前,传代十次计算质粒保存率,结果见表2。
表2平板传代不同代数的细胞中质粒保存率 平析传代数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 重组质粒保存率(%) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
从10代接种的LB(Ap50)平板上任挑一个菌落,制备成DNA,各取1μg DNA 用PstI和HindIII酶切后,作1%琼脂糖电泳,结果见图10。
图10是采用PstI+HindIII对从传代菌抽提的质粒进行酶切后的琼脂糖电 泳图谱。其中,第1和11栏为分子量标记pBR322+HinfI,第2-11栏分别 为从第1-10代传代菌抽提的质粒的电泳图。
实施例3 碱性磷酸酯酶活性测定
正常的大肠杆菌在周围环境无机磷缺乏时,会表达碱性磷酸酯酶,分泌 至外膜,水解含磷化合物,摄取无机磷,供细菌生长需要。而宿主菌YK537 表达碱性磷酸酯酶异常,我们应用试剂盒测定宿主菌的碱性磷酸酯酶活性, 以检测宿主菌的表型特征。
(1)原理:
对硝基苯磷酸(无色) 碱性磷酸酶对硝基苯酚(黄色)+磷酸
通过在405nm波长下检测对硝基苯酚的量来测定酶活性。
酶活性单位的定义:
1mM单位=每小时内每升被测样品释放1mM对硝基苯酚。
(2)试剂:
碱性磷酸酶测定试剂盒(上海丽珠东风技术有限公司)
对硝基苯酚(A.R.)
(3)菌体含碱性磷酸酯酶组份的制备:
①将工程菌用含氨苄的诱导培养基在摇瓶中37℃,200rpm培养20小时。
②将对照菌TG-1或宿主菌用不含氨苄的诱导培养基在摇瓶中37℃, 200rpm培养20小时。
③取40mL上述菌液,加1ml高渗液,振荡悬浮菌体,室温放置10分钟 后10,000rpm离心5分钟,弃去上清,加入0.6ml冰水悬浮菌体,冰浴10分 钟后10,000rpm离心10分钟,上清即为周质空间蛋白。
(4)测定方法:
①用蒸馏水配制3mM对硝基苯酚标准液。
②按试剂盒说明书配制底物溶液。
③取20μl待测样品、空白(蒸馏水)及对硝基苯酚标准液,加入980μl 底物溶液,37℃水浴1小时后加入10μl 8N NaOH溶液,在405nm处测得其吸 光度值D0,然后加入1滴浓盐酸,混合均匀后在405nm处测得其吸光度值Dc, 取D=D0-Dc进行计算。
④计算公式:
酶活性(mM)=(D-D空白)/(D-D标准)×3
测定结果 空白 3mM标准 EE-8 TG-1 OD600 / / 6.46 5.36 D值 0.177 1.279 0.168 0.234 酶活性(mM) / / 0 0.155 酶活性/OD600 / / 0 0.0290
实施例4 摇瓶培养
在含50ml培养基的250ml摇瓶中进行培养,培养和诱导都在37℃进行。 培养基的配方如下:
每50ml液体培养基中含(氨苄青霉素钠最终浓度为100μg/ml):
Polypepton 0.5g 酵母提取物 0.05g
1M Tris Cl(pH7.2) 2.5ml 葡萄糖 0.5g
MgSO4 7H2O 0.05g 饱和酚红 100μl
表3显示了各种不同培养和诱导条件下和rhEGF表达量。
表3、不同培养和诱导条件下工程菌EE-86的表达量 培养条件 诱导条件 总表达量*(mg/L培养基) TG-20 TG-1 2 TG-20 20%cassamino acid TG-1 2-3 LB TG-1 4-5 Lpi Lpo 30
*利用放射免疫测定试剂盒(Amersham公司产品)定量测定rhEGF表达产 物。
工程菌EE-86(简称为EE-8)表达产物rhEGF的分泌行为随着表达量的 提高而变化。当低表达时,表达的rhEGF主要由胞内被分泌至细菌周质中。 由于细菌周质空间较小,当高表达时,表达的rhEGF从周质进入培养基中。
(2)工程菌EE-8在Lpi培养基中的表达:实验中将EE-8甘油菌接 种至50ml类似LB的Lpi培养基37℃培养过夜。无机磷开始降低时计时为0, 我们将降低无机磷的培养基称Lpo。每隔2小时取样2ml,测A660,无机磷含 量及菌体内各组份的hEGF含量。菌体内各组份提取:菌体离心后的上清为培 养基组份,菌体悬浮在150微升溶菌酶(1mg/ml),20%W/V蔗糖,30mmol/L Tris.CL(pH8.0)1mmol/L EDTA溶液,冰浴放置15分钟,离心后上清为周质 蛋白组份。继后,用150微升0.1mol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液悬浮菌体。在 干冰中冰冻,在37℃融化,反复冰融3次裂解细菌,离心取上清为胞浆内的 可溶性蛋白组份。利用125I-hEGF放射免疫反应试剂盒(Amersham公司出口的 Epidermal growth factor,human,reagent pack for RIA)定量测定培养基、 细菌周质和胞浆可溶蛋白等组份中的rhEGF含量。
在上述培养和诱导条件下工程菌EE-8表达rhEGF量与诱导时间的关系 见图11。
工程菌在低磷Lpo培养基中可继续生长,生长至A660为4左右就慢慢停止 生长,当培养基中含磷量降至较低时工程菌开始诱导合成rhEGF,随着诱导时 间的增加表达量也随之增加。当诱导10小时后,表达量达最大值,一直可延 续至24小时。诱导4小时后菌内合成和加工后的成熟的rhEGF已开始分泌至 周质和培养基中,随着表达量的增加,胞内合成的rhEGF经周质“通道”至 培养基中,10小时后约有90%rhEGF由胞内分泌至培养基中。24小时后胞内 和周质的rhEGF含量很低,产物几乎全部被分泌至培养基中。
实施例5 发酵罐培养
发酵在B Braun 15L发酵罐中进行。将甘油菌接入50ml LB(Ap50)培基, 37℃培养过夜。将此菌液接种于发酵罐中。培基以LB基础,添加10g/L葡萄 糖。通气培养,pH控制在7.0,发酵温度37℃。发酵9小时后开始补料,1 升培基补料100ml。定时取样测定A660,定磷,测定培基中rhEGF含量,测定 表明发酵15-18小时,培基中rhEGF含量最高,可达约60mg/L培基。结果见 图12。
实施例6 工程菌表达稳定性试验
将平板传代菌株,传10代后,挑取菌落10ml LB(Ap50)培基,37℃培养 过夜,次日将培养液作为甘油菌。-70℃放置6个月后,接种至摇瓶培养和诱 导表达,表4表明传代后的工程菌的表达量仍可达约30ml/L培基(诱导10小 时)。这说明工程菌EE-8表达稳定。
表4、传代工程菌的表达稳定性
(1) 原代工程菌表达情况: 诱导时间 (小时) 细菌A660 磷酸盐 (μg/ml) 表达的hEGF(μg/ml) 培养基 周质 胞质 总量 0 0.90 20 0.00 0.00 0.00 0.00 2 2.44 10 0.00 0.00 0.00 0.00 4 3.08 2 2.00 1.40 2.00 5.40 6 3.72 2 8.40 1.40 3.00 12.80 8 3.85 3 15.00 0.90 10.30 26.20 10 4.49 3 26.70 0.56 3.20 30.46 24 4.77 2 29.04 0.00 0.07 29.11
(2)传代工程菌表达情况: 诱导时间 (小时) 细菌A660 磷酸盐 (μg/ml) 表达的hEGF(μg/ml) 培养基 周质 胞质 总量 0 1.04 22 0.00 0.00 0.00 0.00 2 2.87 10 0.00 0.00 0.00 0.00 4 3.55 2 0.00 0.15 2.00 2.15 6 3.79 2 6.00 0.30 3.30 9.60 8 4.00 1 10.00 0.45 12.00 22.45 10 4.40 1 23.40 0.15 5.50 29.05 24 4.56 1 26.30 0.00 0.70 27.00
实施例7 中试规模的发酵和分离纯化
1.发酵
采用分泌表达人表皮生长因子(hEGF)的重组工程菌E.coli EE-8(pAE-8) 作为菌种。
种子培养基:LB培养基
发酵培养基:
培养基配比表 培养基成份 配比%(w/v) 生产厂家 批号 Polypepton 2 日本制药株式会社 S328B 酵母提取物 1 OXOID 085-50687 无水硫酸镁 0.05 上海试剂四厂 970703 无水葡萄糖 3 上海来泽精细化学品厂 980218 Na2HPO4·12H2O 0.06 上海新华化工厂 980202 NaH2PO4·2H2O 0.04 上海新华化工厂 980202
将甘油工程菌涂含氨苄青霉素(Ap)的平板,挑取单克隆接种于含Ap LB 培养基,37℃培养过夜,次日再接种一次扩大培养,作为上罐发酵用的种子。
按2%的比例将种子液接种于100升培养基中,于37℃发酵约18小时后 放罐。表达量达约100毫克。
2.分离纯化
用高速GQ142型连续离心机离心,收集发酵液上清。在Millipore公 司的Pellicon超滤机上用Millipore MW 5,000的超滤膜(三张叠加)对发酵 液上清进行超滤浓缩。
在超滤液中加入固体硫酸铵至终浓度为10%(质量百分比),经过滤后, 上Phenyl Sepharose 6 Fast Flow柱,用磷酸缓冲液进行洗脱,收集含rhEGF 组份,用Tris·Cl(pH7.6)缓冲液稀释后上Q Sepharose Fast Flow柱,用NaCl梯度洗脱,收集含rhEGF组份,将液体体积浓缩后再上Superdex 30 prep grade 柱,收集rhEGF峰。
实施例8中试产品鉴定
(1)蛋白含量测定(采用HPLC凝胶色谱或lowry法定量):
A.HPLC定量:
HPLC仪:WATERS公司 EGF标准样品:rhEGF内标
HPLC凝胶柱:OHpakKB-803,WATERS公司
流动相:pH6.8,10mM PB 进样量:20μl
检测波长:280nm 流速: 1ml/min
方法:
a.配制标准EGF溶液,浓度依次为0.5μg/μl、1μg/μl、2μg/μl、 4μg/μl和8μg/μl。
b.将不同浓度的标准EGF溶液各取20μl走HPLC凝胶柱,得出EGF凝胶 色谱峰的积分面积,从EGF蛋白浓度与EGF凝胶色谱峰积分面积之间的关系 作出标准曲线。
c.将EGF未知浓度样品取适量稀释至曲线浓度范围,同样取20μl上柱, 从其色谱峰的积分面积对应标准曲线得出未知样品的蛋白浓度。
B.Lowry法定量:参照试剂盒说明对样品进行定量。
(2)纯度分析:
A.还原型SDS-PAGE凝胶扫描:
用15%分离胶,进行SDS-PAGE,rhEGF的上样量不少于5μg。电泳结束 后银染显色,用BIORAD公司的GS-670型扫描仪分析纯度。结果,三批rhEGF 样品的纯度均大于95%(见图13)。
B.凝胶HPLC分析:
仪器: Waters 600高压液相色谱仪
分析柱: TSK-GEL G 3000pw(7.5 I.D.×300mm)
溶液: 10mM pH6.8磷酸缓冲液
流速: 1ml/min
检测波长:280nm
上样量: 20μl
结果,三批rhEGF样品的纯度均大于95%(见图14)。
(3)分子量测定:
用15%分离胶,进行SDS-PAGE,电泳结束后银染显色,以经分子量标定 的rhEGF内标作对照。三批rhEGF样品与rhEGF内标电泳位置完全一致(见图 15)。
(4)等电点测定:
应用等电聚焦电泳法,在BioRad Mini IEF Cell进行。使用5%聚丙烯 酰胺凝胶和pH3~10的两性电解质,在100V电压下电泳15分钟,200V 15 分钟和450V 1小时,电泳结束后用考马斯亮蓝染色。结果表明,rhEGF样品 的等电点为pH4.7(见图16)。
(5)紫外特征吸收光谱的测定:
仪器为BECKMAN DU-600,以双蒸水为空白,在波长为200~300nm范围 内扫描,记录特征吸收峰的波长和吸收值(见图17)。
(6)N端15个氨基酸序列分析:
rhEGF样品在PE-ABI 491A型序列分析仪上进行N端氨基酸序列的分析。 是测得的N端序列为:
ASN-SER-ASP-SER-GLU-CYS-PRO-LEU-SER-HIS-ASP-CLY-TYR-CYS-LEU。
(7)肽谱分析:
酶解条件:样品溶于100mM pH8.3 NH4HCO3(1μg/μl),加入TPCK-胰蛋 白酶(样品∶酶=20∶1 w/w),于37℃保温过夜后进行HPLC分析。
仪器: HP 1090 HPLC仪
操作温度:40℃
分析柱: ABI RP-18(30×2.1mm I.D.)
溶液: 0.1%TFA(A)~0.08% TFA/ACN(B)
梯度: 0~45min,0~70%B
检测波长:220nm
流速: 0.2ml/min
上样量: 10μl
结果表明,rhEGF样品经完全酶解后出现4个峰,且不同批次之间结果完 全相同(见图18)。
(8)EGF含量测定(免疫活性测定):
用R&D SYSTEM公司ELISA试剂盒对人表皮生长因子的含量(免疫活性)进 行测定,具体操作方法参见试剂盒说明书。
结果计算:
所有吸光值均减去空白孔吸收值后用于计算。以系列标准品吸光值(A)的 对数值为纵坐标,EGF浓度(C)的对数值为横坐标,经回归后得到标准曲线:log C=a log A+b
样品的EGF浓度根据上述公式计算后再乘以稀释倍数即得到。
(9)生物活性测定:
采用促进Balb/c 3T3细胞增殖法进行测定,并用MTT染色。
A.供试样品的准备
手带无菌手套,在超净台中对每个批号的胶囊各取3粒,打开胶囊,将 内容物连同胶囊壳一起放入装有450ml检测培养液(GIBCO公司RPMI 1640培 养液添加0.4%FBS)的500ml血清瓶中(预先放入无菌搅拌子),盖上盖子 后放于磁力搅拌器在4℃环境中搅拌6小时,然后取样1ml于12,000rpm 离心10分钟,取上清,经无菌过滤,再预稀释至20ng/ml(取200μl滤液加 入800μl检测培养基中,混匀),然后进行生物活性的测定。
B.细胞培养和供试样品生物活性的测定
a.种板:收集对数生长期的Balb/c 3T3细胞,悬浮于完全培养
液中(GIBCO公司RPMI 1640培养液添加10%FBS),调整细胞浓度为 6.0×104/ml,接种子96孔板中,100μl/孔,37℃5%CO2培养过夜。
b.饥饿:吸去上清,加入检测培养液(GIBCO公司RPMI 1640培养液添加 0.4%FBS)100μl/孔,37℃5%CO2培养过夜。
c.加样:用检测培养液将rhEGF样品及国家参考品稀释至一系列稀释度, 再吸去96孔板上清,加入100μl/孔已稀释好的的rhEGF样品,每个稀释度 样品做2个重复,置37℃,5%CO2培箱内72小时。
d.显色:加入MTT溶液10μl/孔,37℃5%CO2培养4小时,吸 去80μl/孔上清,加入DMSO裂解液100μl/孔,室温 下放置30分钟后,测OD570值。
e.结果处理:在计算机上用SIGMAPLOT分析软件进行结果计 算,算出半效稀释度。
测定结果:
批号 980401 980702 981003
比活(1×106IU/mg) 1.12 1.14 1.28
(10)残余DNA含量测定:
测定方法:DNA探针杂交法
试剂盒:Boehringer公司Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
工程菌DNA制备:使用酚-氯仿抽提法,具体参照《分子克隆》中的方 法
样品处理:30μg样品,加入2μl 10×消化缓冲液(0.1M pH7.5 Tris·Cl;0.05M EDTA,0.2%SDS),蛋白酶K 1μl(1mg/ml),混匀,37℃ 消化4小时,置沸水浴中5分钟,置冰浴中待用。
杂交膜:Amersham公司的Hybond-N+膜
预杂交液:5×SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%SDS,10 %Blocking Reagent(试剂盒提供)。实验操作按Boehringer公司提供的方法 测定结果表明,30μg rhEGF样品中残余DNA含量低于50pg。
(11)残余氨苄青霉素含量测定:
测定菌种:对氨苄青霉素敏感的金黄色葡萄球菌9341a,由美国FDA提 供
培养基: 美国一号,由施贵宝公司提供
培养条件: 37℃,16~18小时
结果表明,三批rhEGF样品中均无残余氨苄青霉素。
(12)热原试验(鲎试剂法):
采用厦门鲎试剂厂的试剂盒,按说明书上所示方法进行测定。结果表明, 单位剂量样品的内毒素含量小于5EU。
中试产品鉴定结果见表5。
实施例9 处方筛选
按表6进行处方筛选。
表6 组别 1 2 3 4 5 rhEGF(μg) 15 15 15 15 15 糊精(mg) 70 65 63 60 55 羟丙基甲基纤维素(mg) 20 25 27 30 35 卡波姆(mg) 10 10 10 10 10 溶胀时间(小时) 3 4 4 5 5
选择溶胀时间为4~5小时的组2、3、4、5,进行释放度测定。释放度实 验结果见表7。
表7 平均溶出百分率 2 3 4 5 15min 46% 39% 29.4% 10% 30min 68% 46% 40.8% 16.5% 60min 75% 60% 56% 28.5% 120min 90% 76% 71% 43% 240min 103% 95% 90% 58.5%
根据各组份溶出度结果,选择组4配制胶囊制剂。
实施例10 胶囊制剂
1.制剂的处方(1000粒胶囊)
人重组表皮生长因子(rhEGF) 15mg
糊精 60g
羟丙基甲基纤维素 30g
卡波姆934P 10g
2.制备工艺
糊精、羟丙基甲基纤维素和卡波普均过100目筛。将处方量的人重组表皮生 长因子与上述辅料混合均匀,用80%乙醇溶液湿法制得颗粒,40℃低温真空干燥, 用30目筛整粒,测定含量,灌装胶囊。每粒胶囊含rhEGF15μg。
3.辅料的来源及质量标准
原辅料 来源 质量标准
重组人表皮生长因子 中科院上海生化所 按中国药品生物制品检定所
质量标准
糊精 上海葡萄糖厂 中国药典95版
羟丙基甲基纤维素 DOW公司 中国药典95版
卡波姆(934P) 美国Goodrich公司 中国药典95版
实施例11 成品的水份、微生物测定、胶囊含量均匀度和胶囊释放度测定
(1)水份:方法见《中国药典95版》附录VIII L。结果表明,三批rhEGF 制剂中减失重量均小于10.0%。
(2)微生物(霉菌、细菌、大肠杆菌)检定:
方法见《中国药典95版》附录XI J。结果表明三批rhEGF制剂均符合 药典要求。
(3)胶囊含量均匀度测定:
取rhEGF胶囊10粒,打开胶囊壳,将内容物分别置于容积为100m1的 容量瓶中,加含有0.1%牛血清白蛋白的盐酸溶液(每1000ml体积的双蒸水 中含有牛血清白蛋白1克和9ml浓盐酸)约60m1,室温手动振摇1小时, 使颗粒溶胀完全,静置待泡沫消去后,用上述溶液定容并混匀。每个样品取1ml 至1.5ml离心管中,12,000rpm离心5分钟,取上清液20μl,加试剂盒提 供的稀释液(1×RD5E)980μl,混匀后取20μl,再加稀释液(1×RD5E)780μl, 进行两级稀释,总的稀释倍数为2000倍,上述溶液混匀后作为供试样品直接 取200μl进行rhEGF含量测定。
制作rhEGF标准曲线后,根据log C=a log A+b方程计算后再乘以稀释 倍数2000即可得到供试样品的EGF浓度值,结果为XXX pg/ml,或XXX·10-3 ng/ml。结果见表5。
(4)胶囊释放度测定:
释放度测定参照中国药典95版附录XD的方法进行。
溶出介质为含0.1%牛血清白蛋白的盐酸溶液(每1000ml体积的双蒸水 中含有牛血清白蛋白1克和9ml浓盐酸),体积500ml,采用转篮法。取rhEGF 胶囊6粒,测定温度37℃,转篮转速100rpm。分别于0.25、1、4小时取样 0.5ml,12,000rpm离心5分钟,取上清液20μl,加试剂盒提供的稀释液(1 ×RD5E)280μl,混匀后取20μl,再加稀释液(1×RD5E)380μl,进行两级稀 释,总的稀释倍数为300倍,上述溶液混匀后作为供试样品直接取200μl进 行rhEGF含量测定。
供试样品的rhEGF浓度值根据标准曲线方程式计算后再乘以稀释倍数300 即可得到,结果为XXX pg/ml,或为XXX·10-3ng/ml,再除以30000pg/ml或 30ng/ml(胶囊中rhEGF完全释放后的浓度值)即为取样时间点的释放百分比 数值。结果见表5。
中试产品和成品鉴定结果见表5。
表5 中试产品和成品鉴定结果汇总
实施例12 口服重组人表皮生长因子(rhEGF)药效学研究
一.实验材料和方法
(一)实验材料
采用清洁级、封闭群SD大鼠,体重200-250g,随机分组,雌雄兼用,每 组6-9只,由西普尔BK实验动物有限公司提供(中英合资)进行药效学研究。
受试药品rhEGF、西米替丁、和硫糖铝均以0.9%氯化钠溶液配制,剂量 分别为:rhEGF5,10,15,30,60ug.kg-1;西米替丁2mmol.kg-1;硫糖铝100mg. 次。对照组为0.9%NaCl 1ml/次。
(二)实验方法
1.无水乙醇致胃溃疡模型
实验前三天给药,所有药物均用生理盐水稀释,空腹48小时后各鼠用无 水乙醇1ml/只灌胃,1小时后,处死大鼠,解剖取胃,1%甲醛溶液固定。沿 胃大弯侧剪开并展平,肉眼观察损伤情况,测量损伤长度,损伤程度以溃疡 指数表述并做病理组织切片行光镜检查。损伤指数计分标准:线状损伤,每mm 长度计1分,损伤宽度超过2mm者计分加倍,所有计分累加之和,作为每只 大鼠胃粘膜损伤的溃疡指数,各组间进行比较。
2.水浸应激型胃溃疡模型
实验前三天起喂药,禁食24小时后,将大鼠装入特制的小铁笼内,垂直 浸入23℃±0.5℃水中,浸入深度达动物剑突水平,24小时后取出,断颈处死 大鼠,打开腹腔,结扎胃贲门和幽门并向胃腔内注入1%的甲醛6ml,取出胃 浸入甲醛溶液内,30分钟后沿胃大弯剖开,计数腺胃部出现的溃疡指数,计 量方法同上,并作组间比较。
3.幽门结扎型胃溃疡模型
大鼠给药2天,禁食48小时,自由饮水,用乙醚将动物麻醉,打开腹腔 结扎幽门,术后6小时再次打开腹腔取胃液,术后18小时断颈处死,解剖取 胃,向胃腔内注入1%甲醛溶液,10min后,沿胃大弯剪开胃,计数前胃溃疡 发生面积,以其总和作为溃疡指数,然后根据溃疡指数进一步计算溃疡抑制 百分率,溃疡发生百分率。
4.乙酸烧灼型胃溃疡模型
实验前禁食24小时,自由饮水,在乙醚麻醉下打开腹腔,将内径5mm长 30mm的玻璃管垂直放置于胃体部浆膜面上,在管腔内加入冰乙酸0.2ml,1.5 分钟后用棉签蘸出冰乙酸,缝合手术切口,术后正常饮食,第二天随机设立 对照组与给药组,连续给药12天,解剖取出胃,并用甲醛固定,测量溃疡面 积,各组间进行比较。
5.阿司匹林(ASA)致胃溃疡模型
实验前给药和禁食48小时,自由饮水,实验当日灌服ASA(阿司匹林)50mg/ 只鼠,每1小时1次,连续3次,第4小时断颈处死,解剖取胃,沿胃大弯 剪开展平,肉眼观察损伤情况,计数腺胃部溃疡指数,各组间进行比较。
(三)胃液量、胃液酸度和胃蛋白酶的测定
1.胃液量、胃液酸度的测定:
收集幽门结扎后6小时的大鼠胃液,以1,000-2,000g离心5分钟,去除 食物残渣等胃内容物,以容量适宜的量筒准确称量胃液量。以酸度计测量胃 液的酸度。
2.游离盐酸及总酸度测定:
试剂
(1)0.1mol/L氢氧化钠溶液;
(2)游离盐酸指示剂:0.5%的对二甲基偶氮苯胺乙酸溶液;
(3)总酸指示剂:0.5%酚酞乙醇(95%)溶液。
方法
(1)量取胃液5ml,置于三角烧瓶中加等量蒸馏水,混合均匀。
(2)加入游离酸指示剂及总酸指示剂各2滴,混合胃液中,若含有盐酸 即呈樱红色。
(3)用滴定管滴加0.1mol/L的NaOH,边加边摇动烧瓶,至红色消失, 开始出现桔黄色为止。即为游离酸的终点,记下用去NaOH溶液的毫升数。
(4)继续滴加0.1mol/L NaOH至红色不再变深为止。即为总酸度的终点, 记下两次滴定用去NaOH溶液总量。
计算:
总分泌量=胃液量×酸度
3.胃蛋白酶活性测定:采用麦特(Mett)的毛细管法
胃蛋白酶的单位=平均值2×16
(四)统计学方法
实验数据采用SAS6.11版本的电脑软件包统计,以均数±标准差表示,并 作方差分析与Q检验、p值<0.05表示差异显著。
二.实验结果
(一)病理学改变
乙醇及水浸应激、幽门结扎及ASA模型,不用药对照组胃粘膜损伤明显,表 现为粘膜面出现广泛条索状充血、水肿、糜烂、出血,部分标本胃内容物为血性, 但无溃疡及穿孔,符合胃粘膜的急性损伤表现,而用rhEGF组的大鼠胃粘膜炎症 反应程度,随着剂量的增加,糜烂、出血减少。
乙酸烧灼胃溃疡模型喂药12天后处死,在乙酸烧灼的相应胃粘膜面出现 与玻管形状相符的慢型溃疡,其他部位粘膜完整。在溃疡形成处胃标本后壁 与肝脏或肠壁粘连,无穿孔现象。光镜学检查如以下照片所示。对照组及治 疗组均可见明显溃疡,有典型的胃溃疡组织学结构,表现为由白细胞和纤维 素组成的炎性渗出物,坏死组织、肉芽组织层和部分疤痕组织,但未见小血 管壁增厚、狭窄,溃疡边缘粘膜肌层与肌层粘连等现象,周围慢性炎症改变 不明显,对照组和EGF5ug.kg-1组渗出物和坏死组织较多,炎症明显,而随着 EGF量增加,治疗组更趋向愈合,表现肉芽组织和疤痕组织、炎性渗出物和坏 死组织少见。
(二)胃溃疡指数
1.乙酸烧灼胃溃疡模型
60只大鼠经24小时禁食后进行乙酸烧灼胃溃疡模型,术后48小时内死 亡5只,均为胃穿孔,不列入研究,其余第二天随机分组喂药,12天后剖腹 取胃计数溃疡面积结果见表8和图19-20。如图所示,与对照组相比,rhEGF10ug 以上组均有治疗效果,呈量一效关系。与西米替丁、硫糖铝组相比,rhEGF10ug 以上组均无显著差异,提示rhEGF疗效与西米替丁、硫糖铝相当。
表8 rhEGF治疗大鼠胃溃疡12天溃疡指数
组别 N X±S P
对照 7 26.00±10.17
西米替丁 6 11.08±8.44 <0.05
硫糖铝 7 14.04±6.65 <0.05
rhEGF5ug 7 18.21±7.51 >0.05
rhEGF10ug 7 13.89±4.79 <0.05
rhEGF15ug 7 11.71±5.45 <0.05
rhEGF30ug 7 9.43±5.06 <0.05
rhEFF60ug 7 7.64±3.61 <0.05
F=5.25 P=0.0002(组间差异显著)
P值为各治疗组与对照组比较
EGF各组与西米替丁组、硫糖铝组比较,差异不显著。
2.幽门结扎胃溃疡模型
55只大鼠用药3天禁食48小时后结扎幽门,术后6小时再次打开腹腔抽 取胃液测定胃酸度及胃蛋白酶活性,造模18小时后取胃计数溃疡指数,结果 如表9、图21-22所示,与对照组比较,rhEGF5ug.kg-1组效果不明显,10ug 以上组随着剂量增加,溃疡指数下降,rhEGF各组与西米替丁组比较,除了5ug 组有差异外,其他各组无统计学差异,溃疡抑制百分比和溃疡发生百分比率 见表9、图21-22。
表9 幽门结扎胃溃疡模型溃疡指数
组别 N X±S P
对照组 7 8.57±3.79
西米替丁 7 3.14±1.63 <0.05
rhEGF5ug 8 8.13±4.67 >0.05
rhEGF10ug 8 5.63±2.50 >0.05
rhEGF15ug 8 2.75±2.31 <0.05
rhEGF30ug 8 1.75±1.75 <0.05
rhEGF60ug 9 1.13±1.36 <0.05
F=7.29 P=0.0001(组间差异显著)
P为各治疗组与对照组比较
EGF各组与西米替丁组比较,除5ug组有差异外,其他各组均不显著。
表10幽门结扎模型溃疡抑制百分比和溃疡发生百分比
组别 溃疡抑制百分比% 溃疡发生百分比%
西米替丁 63.36 85.71
rhEGF5ug 5.13 100
rhEGF10ug 34.36 100
rhEGF15ug 67.91 75
rhEGF30ug 79.58 62.5
rhEGF60ug 91.13 50
3.无水乙醇致胃溃疡模型
大鼠48只,用药3天后胃内灌注无水乙醇1ml/只,1小时后处死大鼠, 解剖取胃,见不用药组胃粘膜损伤严重,2个鼠胃内充满血性液体。溃疡指数 如表4所示。与对照组相比,除rhEGF5ug组外,其余各组的溃疡指数均明显 降低。与西米替丁组相比差异不显著,提示rhEGF在胃抗乙醇损伤的方面疗 效与西米替丁相当。
表11 乙醇损伤胃溃疡模型溃疡指数
组别 N X±S P
对照 7 42.14±12.29
西米替丁 6 26.50±8.17 <0.05
rhEGF5ug 6 38.33±10.5 >0.05
rhEGF10ug 7 27.42±8.89 <0.05
rhEGF15ug 7 23.57±10.32 <0.05
rhEGF30ug 8 17.25±7.83 <0.05
rhEGF60ug 7 13.57±6.75 <0.05
F=8.47 P=0.0001(组间差异显著)
P值为各治疗组与对照组比较
EGF各组与西米替丁组比较差异不显著(P>0.05)
4.水浸应激胃溃疡模型
50只大鼠用药2天后装入特制铁笼内进行限制性冷水应激试验,24 小时内死亡6只,不列入研究。各组溃疡指数如表12所示,结果与前述模型 相似,rhEGF5ug组无明显疗效(P>0.05),其余各组与空白对照组比较差异显 著,而与西米替丁组相比差异不显著,提示rhEGF对胃粘膜抗应激损伤的保 护作用与西米替丁相当。
表12 水浸应激胃溃疡模型溃疡指数
组别 N X±S P
对照 7 35.85±5.49
西米替丁 6 21.67±7.09 <0.05
rhEGF5ug 6 32.33±6.62 >0.05
rhEGF10ug 6 28.83±6.43 >0.05
rhEGF15ug 6 24.83±9.81 <0.05
rhEGF30ug 6 18.67±5.99 <0.05
rhEGF60ug 7 12.28±7.99 <0.05
F=8.67 P=0.0001(组间差异显著)
P值为各治疗组与对照组比较
EGF各组与西米替丁组比较,差异不显著。
5.ASA致胃溃疡模型
49只大鼠,喂药、禁食48小时后,行ASA致胃粘膜损伤模型。结果如表 13所示,rhEGF10ug/kg/只组以上溃疡指数较对照组降低,与西米替丁组比较, 二者效果相当。
表13 ASA致胃溃疡模型溃疡指数
组别 N X±S P
对照 7 7.71±2.56
西米替丁 7 3.57±1.71 <0.05
rhEGF5ug 7 5.86±1.96 >0.05
rhEGF10ug 7 5.00±1.82 <0.05
rhEGF15ug 7 4.14±1.34 <0.05
rhEGF30ug 7 4.00±1.41 <0.05
rhEGF60ug 7 3.42±1.51 <0.05
F=3.27 P<0.05
三、大鼠胃液量、胃液酸度和胃蛋白酶
如表14所示,胃液量介于5.19-7.28之间,各组间无显著差异,胃 蛋白酶活性在4.07-4.39间,亦无统计学差异。表15为各组胃液的pH值, 与空白对照组相比,除西米替丁组升高有意义外,其余各组pH值虽有所升高, 但无显著差异。与西米替丁组比较,EGF5至30ug/kg/只,有显著差异,但 EGF60ug/kg/只无统计差异。提示大剂量的EGF有抑制胃酸分泌,升高胃液pH 的作用。但总酸、游离酸下降不显著。
表14大鼠胃幽门结扎6小时胃液量、胃蛋白酶活性
组别 N 胃液量(X±Sml) *胃蛋白酶(X±S)** P
对照组 7 7.28±1.78 4.25±0.65
西米替丁 8 6.20±2.33 4.58±1.08 >0.05
EGF5ug 8 8.19±2.91 4.39±0.24 >0.05
EGF10ug 8 6.95±3.09 4.31±1.00 >0.05
EGF15ug 8 7.25±1.56 4.22±0.60 >0.05
EGF30ug 8 6.06±3.51 4.07±0.62 >0.05
EGF60ug 8 6.87±2.46 4.36±1.05 >0.05
*F=0.56 P=0.7591
**F=0.30 P=0.9332
表15 大鼠胃液pH
组别 N X±S P1 P2
对照组 7 1.34±0.13
西米替丁 8 1.89±0.56 <0.05
EGF5ug 8 1.41±0.21 >0.05 <0.05
EGF10ug 8 1.30±0.09 >0.05 <0.05
EGF15ug 8 1.33±0.06 >0.05 <0.05
EGF30ug 8 1.48±0.28 >0.05 <0.05
EGF60ug 9 1.56±0.19 >0.05 >0.05
F=4.80 P=0.006
P1各治疗组与空白对照组比较
P2EGF各组与西米替丁组比较
表16 大鼠胃液总酸度、游离酸
组别 N 总酸度(X±S)*游离酸(X±S)** P1 P2
对照 7 4.89±0.87 3.06±0.29
西米替丁 8 3.91±1.82 2.48±1.20 >0.05
EGF5ug 8 4.22±1.04 3.05±0.82 >0.05 >0.05
EGF10ug 8 4.74±0.95 3.23±0.65 >0.05 >0.05
EGF15ug 8 4.73±0.41 3.10±0.24 >0.05 >0.05
EGF30ug 8 4.39±0.80 3.11±0.90 >0.05 >0.05
EGF60ug 9 4.00±0.71 2.98±0.42 >0.05 >0.05
*F=1.09 P=0.3817
**F=0.81 P=0.5654
P1各治疗组与空白对照组比较
P2EGF各组与西米替丁组比较
实施例13 口服重组人表皮生长因子(rhEGF)毒理学研究
1.大鼠口服重组人表皮生长因子急性毒性试验
健康成年SD大鼠(由BK公司提供)6~8周龄,体重150~200克,雌雄 各半,共20只。
大鼠禁食6小时后经口灌服用生理盐水新鲜配制的rhEGF溶液750μg/kg 体重,给药容量为1ml/100g体重。
在室温20±1℃,相对湿度65~70%下饲养观察14天。14天内,大鼠的 活动、饮食、体重增长均正常。未发现其它与药物相关的异常现象。
试验表明,大鼠口服rhEGF的LD50>750μg/kg体重,已达大鼠有效剂量的 50倍。
2.大鼠口服重组人表皮生长因子长期毒性试验
大鼠5~6周龄,体重80~90克,雌、雄各半,分笼饲养,每笼5只大鼠, 室温20~25℃,相对湿度50~70%,自然光照,商品颗粒饲料喂养,观察一周 后选择健康大鼠(如雌性须未怀孕)120只(雌、雄各半)随机分成低、中和高剂 量和对照4组。给药组份别经口灌服重组人表皮生长因子(rhEGF)剂量分别为 0、30、90和300μg/kg/天,(分别相当于临床剂量的30、90和300倍);对 照组给予等容量的蒸馏水。每周6次,连续给药26周,观察给药期及停药8 周恢复期大鼠的毒性反应及其恢复情况,在给药第13周、26周和停药恢复8 周时各处死1/3动物作血液学、血液生化指标、尿液和病理检查。
结果显示除雌性大鼠体重增长稍见降低外,未见其它与rhEGF明显有关 的毒性作用。
3.重组人表皮生长因子对恒河猴的长期毒性试验
恒河猴雌、雄各半,体重3.0~4.2公斤,每只动物分笼饲养, 室温20~25℃,相对湿度50~70%,用猴用颗粒饲料(上海市牛奶公司提 供)和苹果喂养,每日早晨和下午各喂一次,每次颗粒饲料100克和苹 果100克。适应环境2个月并进行血液学、血液生化、心电图等检查 二次后,从中挑选30只(雌、雄各15只)健康动物作为受试动物。
口服给药长期毒性试验采用24只恒河猴,按体重分层后随机分成 4组,每组雌、雄各3只。设低、中和高剂量和对照4个组,采用本发 明的口服制剂(每100mg中分别含rhEGF 64、128和640μg),给药组的 剂量分别为16、32和160μg/kg/天,对照组口服只含辅料不含rhEGF 的制剂,早上进食前口服,每日1次,共给药26周,停药后恢复期为 8周。进行一般观察、血液学、血液生化指标、尿液检查、心电图、眼底 骨髓检查。在给药13、26周和停药恢复期结束时各处死1/3动物(每 个剂量组雌、雄动物各1只)作病理检查。结果显示在上述剂量范围内 未见与rhEGF有关的毒性作用。
静脉给药长期毒性试验采用6只恒河猴随机分成低、中和高剂量3 组(rhEGF16、32和160μg/kg/天),每组雌、雄各1只,采用本发明制 剂去热原冻干品(每安瓿含rhEGF 1mg),用注射用生理盐水稀释至所需 浓度,静脉推注1ml/kg,每天一次。从口服给药对照组中选择雌、雄 各一只动物同时注射生理盐水作为对照组。给药期也为26周,进行一 般观察、血液学、血液生化指标、尿液、心电图、眼底和骨髓检查。在给 药13、26周和停药恢复期结束时各处死1只动物,进行病理检查。结 果显示,给药26周后32和160μg/kg/天剂量组动物见有胆管、胃腺、 膀胱等处上皮增生现象。其余均正常。
3.特殊毒理学研究
(1)致畸试验
SD孕大鼠在致畸敏感期(怀孕第6-15天),经口灌服30、90和 300ug/kg rhEGF连续十天,试验结果表明各剂量均未见胚胎、胚胎仔 毒性,也未见畸形胎仔出现。
(2)致突变试验(微核试验)
应用ICR小鼠,给药剂量分别为300ug/kg,150ug/kg,75ug/kg, 经口灌胃,服药24小时,杀死小鼠取股骨髓测细胞微核率,实验结果 表明为阴性。
(3)致肿瘤原性试验
采用T细胞免疫缺陷裸小鼠体内接种的方法观察EGF的致肿瘤性。 实验对接种人体肿瘤HeLa细胞后灌服80μg/kg/d EGF,连续po×7d, 与对照组相比观察3周未发现EGF有刺激肿瘤生长的作用。后将EGF 以400μg/kg(80μg/0.2ml/鼠)直接接种于裸小鼠腋皮下后3周和12 周,分别作肉眼观察尸体解剖,并作病理检查注射部位及淋巴结、肺、 肾、脾和肝等器官均未发现有肿瘤形成。结果表明EGF对荷肿瘤裸小 鼠或正常裸小鼠经上述试验均未发现有致肿瘤原性。
实施例14 重组人表皮生长因(rhEGF)药代动力学研究
1.静脉注射或口服重组人表皮生长因(rhEGF)在猕猴中的药代动力学研 究
用R&D system产ELISA药盒测定和研究了猕猴静脉注射和口服rhEGF 后的药代动力学。方法学确证表明rhEGF在浓度为0.76~781pg.mL-1范围内浓 度对数与吸光度对数成良好线性相关;最低检测量1.8pg.mL-1;批内精密度为 0~8.8%;批间精密度为2.9~24.2%;各批试验设各自标准曲线,计算未知样品 浓度;血清回收率范围为88.5~105.9%,回收率变异系数2.2~11.7%。方法学 基本达到药代动力学研究要求。猴血清内源性EGF为29.8±15.4pg.mL-1,落 在人血清内源性EGF正常值范围(0~622pg.mL-1)内[1]。口服10、40、160μg.kg-1 后血清rhEGF较药前明显增高,但浓度增高数值、峰浓度、达峰时间及曲线 下面积(AUC)都不随给药剂量增高而增高,剂量组间均无统计意义的差别,各 猴最高浓度(32.4~375.9pg.mL-1)仍在人正常值范围内。给药后6h浓度降 至药前水平。交叉设计自身比较口服10μg.kg-1后生物利用度为7.0±4.8%, 剂量校正后口服40μg.kg-1剂量组和160μg.kg-1剂量组的平均生物利用度分 别为0.73%和0.29%(P<0.05)。口服rhEGF 40μg.kg-1.d-1×7d后未见血 药浓度蓄积增高或降低。第1天和第7天药后相同时间点血药浓度及药代动 力学参数均无统计差别。以上结果表明猕猴经口服入rhEGF虽然有明显吸收, 但存在某种非线性饱和机制,使药物吸收量受到限制,吸收量个体差异性很 大,不随剂量增加而增高,吸收后达到的峰浓度仍落入人正常内源性EGF水 平范围内,在6小时后恢复给药前水平,连续服药无蓄积增高或降低。以上 特点提示体内可能存在某种自我反馈调节机制,使血清EGF维持在正常生理 需要水平,免受过高EGF水平的不良作用。
2.口服重组人表皮生长因子(rhEGF)在动物胃肠道中的吸收与代谢降解 变化及体内分布、排泄研究
选用wistar种大鼠,采用口服灌胃给药途径,分别用酶联免疫法和酸沉 法及放射性示踪法测定研究125I-EGF、EGF在大鼠体内分布、代谢、排泄及消 化道吸收与降解破坏规律。
(1)氯胺T法同位素标记制备了125I-EGF,经Sephadax 6-75分离纯化及 125I-EGF放射性活度及化学含量测定,得到了比活度为1.90μci/μg蛋白的 125I-EGF,反相高效液相层析法、SDS-PAGE电泳法及TCA酸沉法鉴定125I-EGF 放化纯度均大于96%,125I-EGF生物活性测定结果表明,进行放射性碘标记后 125I-EGF具有较好的生物活性。说明用氯胺-T法制备的125I-EGF满足药代动力 学研究要求。
(2)观察大鼠灌胃125I-EGF(40μg/kg,0.5ml/只大鼠 )后30min、1h、2h、 4h、8h不同时间全身各组织总放射性分布及TCA法可沉降放射性分布,每个 时间均为5只动物。结果表明,口服给药125I-EGF(40μg/kg),全身各组织总 放射性分布容量大大高于TCA法可沉降放射性分布容量,说明125I-EGF在消化 道吸收过程中绝大部分被各种蛋白酶及消化液代谢降解,EGF原型很难被直接 吸收进入体内。125I-EGF在组织器官中相对分布容量以胃内容物、胃壁、十二 指肠内容物、十二指肠壁、空肠内容物、空肠壁、回肠内容物、回肠壁等组 织器官分布最高, 其次是甲状腺、肾脏、肺、肝脏、胆囊、脾脏、心脏、肾 上腺、颌下腺、大肠壁、生殖腺、肌肉、脂肪等,其它组织器官分布相对较 少,尤其是以小脑、大脑、脊髓等神经组织内分布最少,提示125I-EGF可能较 难通过正常的血-脑屏障。
(3)选用放射性示踪TCA法、免疫学方法观察EGF及125I-EGF(40μg/kg)口 服后不同时间(3、15、30、60、120、240分钟)在大鼠胃、空肠、回 肠中的EGF原形药或大分子片段的吸收及降解破坏规律,测定大鼠胃肠道内 或者组织器官中125I-EGF或EGF的原型或有免疫活性部分的药物浓度。结果表 明,大鼠口服给药125I-EGF(40μg/kg)后,30分钟内EGF原型及有免疫活性 部分在胃内、胃粘膜及胃壁组织保持较高浓度,放射性示踪TCA法与免疫学 方法测得结果基本一致,说明30分钟内EGF在胃内比较稳定破坏较少,在口 服给药后2小时及4小时,放射性示踪TCA法测得的125I-EGF浓度仍较高,但 酶联免疫法测定的EGF具有免疫活性部分浓度则明显降低,HPLC法结果亦证 实在该时段EGF末段有小片断裂解,说明在胃液及各种蛋白酶作用下EGF原 型部分被破坏或失活。125I-EGF在空肠、空肠内容物、回肠、回肠内容物等组 织器官分布明显低于同一时间胃内容物、胃粘膜及胃壁组织原型EGF含量, 而且回肠及回肠内容物原型EGF含量明显低于空肠及空肠内容物,说明EGF 在胃内比较稳定,降解破坏较少,而在小肠吸收过程中绝大部分被各种蛋白 酶及消化液代谢降解,越是消化道下段EGF原型含量越低。
(4)大鼠口服125I-EGF(40μg/kg)后粪、尿和胆汁放射性排泄规律的观察, 包括0-8h、8-12h、12-24h、24-48h、48-72h等不同时间段的放射性排泄率 及累积总放射性排泄量。研究结果表明,给药后72小时内,大鼠粪尿中125I-EGF 放射性累积排泄总量占口服给药总放射量的80.10%,其中尿累积量约占总排 泄量近64.20%,而粪便中只占15.89%,在尿排泄中,大部分放射性在一天 内排出,如在24小时内排泄累积量占口服给药总放射量的56.20%。125I-EGF 放射性由胆汁排泄量较少,8小时累积排泄总量约占口服给药总放射量的 2.05%。TCA法测定结果表明,粪、尿中几乎测不到原型EGF,说明EGF在 小肠消化道吸收过程中绝大部分被各种蛋白酶及消化液代谢分解,极少量进 入体内的EGF也由肝脏等器官代谢破坏。由此可见,EGF口服给药的吸收及代 谢排泄均比较快,而排泄主要途径是尿液。
3.重组表皮生长因子(rhEGF)在原位结扎胃或肠段中的代谢降解变化和 吸收
用125I标记重组表皮生长因子(125I-rhEGF)结合反相高效液相(RHPLC)法研 究了rhEGF在大鼠原位结扎胃或肠中的代谢降解变化和吸收。RHPLC鉴定表明 125I-rhEGF在44%的乙腈浓度洗脱,放化纯度为96.3±0.4%。标记-rhEGF刺 激Balb/c3T3细胞增殖的生物活性与标记前多肽相近,EC50分别为29.7和31.5 ng.mL-1。大鼠原位结扎胃注入125I-rhEGF后3h内胃内容物总放射性无明显 变化,但RHPLC分析随时间延长出现标记-rhEGF放射主峰出现前后肩、呈双 峰形或不变,表明在40%乙腈洗脱处可能出现新组份,此外,17%和0%乙 腈洗脱处出现微量亲水性125I-标记降解物;胃系膜静脉血及全身静脉血总放 射性极低,RHPLC也检测到极微量标记原型药物。原位结扎肠注入125I-rhEGF后 5min肠内容物总放射性开始下降,6小时后降至20%,RHPLC分析结果表明: 肠内容物125I-rhEGF峰变小,17%和0%乙腈洗脱的亲水性标记-降解物峰相 对增高。肠内容物总放射性和125I-rhEGF放射性浓度呈指数下降,末端t1/2分 别为1.3±1.0h和1.8±0.6h,肠系膜静脉血及全身静脉血总放射性增高, RHPLC分析血中主要为水溶性125I标记降解物。
4.口服或灼伤外用重组人表皮生长因子(rhEGF)动物药代动力学研究
采用SD大鼠,人工制成幽门结扎与深、浅II°(大小面积)灼伤模型,给 予口服或外用rhEGF-I12515μg.kg-1、30μg.kg-1以及I125后,每隔15’、30’、 1h、2h、3h、4h、5h、6h抽血读取Cpm数,测定EGF,7h后处死大鼠取内脏 称量研碎读取Cpm数,并与生理胃肠模型数据作比较。
结果表明:生理胃肠下口服rhEGF-I125与单纯I125组,血中Cpm数升高, 内脏器官Cpm数从高到低分布排序一样,以胃为主。幽门结扎组血中Cpm数 也有升高,但不及生理胃肠模型。深、浅II°灼伤外用rhEGF表明,浅II° 吸收高于深II°,脏器Cpm读数排序以皮肤首位,胃占第二位,但上述实验 中,大鼠血中的EGF值都没有升高,提示rhEGF无论口服或外用,其作用均 以皮肤、粘膜面为主,很少以原型结构吸收入血,作用其他器官,因而临床 给予口服是安全的。
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