腺病毒介导的基因治疗
阅读：43发布：2020-05-12
专利汇可以提供腺病毒介导的基因治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种具有功能性胸苷激酶基因的腺病毒用于 治疗 脑 肿瘤 。，下面是腺病毒介导的基因治疗专利的具体信息内容。
发明领域
发明背景
恶性神经胶质瘤的治疗对于内科医生和科学家们仍是一种挑战。胸苷 激酶基因治疗(使用单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因)是最有 希望的治疗形式之一，试图改变恶性神经胶质瘤患者的存活。HSVtk基 因治疗是基于胸苷激酶催化9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(GCV)磷酸 化的能力。磷酸化的GCV起到一种有毒性的核苷酸类似物的作用，导致 目标细胞的死亡。这一现象通过旁观者效应进一步得到增强，其中邻近 的细胞即使没有获得转染仍被破坏。一般认为这种效应是由于转染细胞 有毒性的核苷酸类似物通过接点间隙释放到邻近的细胞。
逆转录病毒和腺病毒一直用于基因治疗的载体。两种载体都具有某些 优点和缺陷。脑肿瘤特别适合用逆转录病毒介导的基因转移，因为逆转 录病毒只感染增殖的细胞，而正常的、非分裂的脑组织保持完整。逆转 录病毒的基因转移效率相对较低，但通过使用逆转录病毒包装细胞而不 是孤立的病毒能提高逆转录病毒的基因转移效率。理论上能延长转导时 间并且转染细胞的数量增加。和逆转录病毒一起，转染的基因整合到目 标细胞的基因组中并且可获得长期的基因表达。
发明概述
本发明是基于如下的出人意料的发现：如果使用腺病毒作为载体将基 因转移到肿瘤细胞中能更有效地实现使用胸苷激酶基因疗法治疗脑肿 瘤。
根据本发明，腺病毒包含了编码胸苷激酶的基因，且包含其的药物对 治疗脑肿瘤有用。尤其在施用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或等效化合 物之后治疗肿瘤。
一般胸苷激酶基因得自单纯性疱疹病毒(HSVtk)。
腺病毒/胸苷激酶基因构建体比逆转录病毒基因转移显示了更多的优 点。
发明详述
本发明的构建体可用于治疗肿瘤。治疗可以包括步骤：
(i)施用包含编码胸苷激酶基因的腺病毒到肿瘤腔的壁中；并且
(ii)施用当磷酸化时形成细胞毒性化合物的化合物。
步骤(ii)中使用的化合物可以是9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或 其衍生物。可以使用这种方法治疗任何肿瘤，优选脑肿瘤，例如恶性神 经胶质瘤。步骤(i)中使用的组合物可以反复施用，优选40到80个单 独的应用。
用于本发明的组合物的配制优选不加蛋白质(不同于那些与腺病毒相 关的)。据信加入用以降低降解酶类对活性组合物之作用的白蛋白的那些 组合物是优选的。优选地，这种组合物包括作为稳定剂的甘油。
在本发明中，基于在此处提供的信息和通常的考虑(如施用途径，治 疗条件及其状态等)，本领域技术人员能确定应该给患者施用的活性产物 的量。
下面的实施例阐明了本发明。
实施例
在这个实施例中，比较了逆转录病毒包装细胞介导的和腺病毒介导的 HSVtk基因疗法治疗恶性神经胶质瘤的安全性和效能。在试验中，与lacZ 转染的对照组相比，逆转录病毒包装细胞的基因治疗不能提高恶性神经 胶质瘤患者的存活。在肿瘤切除和基因转移三个月后，当通过核磁共振 成像(MRI)评估时在所有的患者中都存在肿瘤的发展。但是，腺病毒 基因治疗明显改善了患者的结果。此外，七个用腺病毒治疗的患者中有 三个的核磁共振成像显示了肿瘤保持稳定。
逆转录病毒和逆转录病毒包装细胞系
如Poptani等，肿瘤基因治疗(Cancer Gene Ther.)5：101-109(1998) 所描述的那样制备一种PA317/tk包装细胞系。扼要地，将1.2kb HSV1- TK cDNA(McKnight，核酸研究(Nucleic Acid Res.)8：5949-5964(1980)) 亚克隆到pLXSN逆转录病毒质粒(Miller等，分子细胞生物学 (Mol.Cell.Biol.)，5：2985-3902(1986))上以产生pLTKSN质粒。 HSV1-TK的表达由5′莫洛尼氏鼠肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)来启 动。载体也包含一个内部SV40启动子以驱动新霉素抗性(NEO)基因。 使用磷酸钙沉淀法用pLTKSN质粒转染PA317细胞系。象在209F成纤 维细胞分析(Yla-Herttuala等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95：2692-2698 (1995))中确定的那样，PA317/3.0D5细胞系(PA317/tk)产生106个 cfu/ml逆转录病毒。注射前，扩增和用胰酶消化包装细胞并稀释到109个 细胞/10ml Optimen(Gibco BRL)。细胞显示不含支原体、其它微生物 污染物和野生型病毒。
含有β-半乳糖苷酶(lacZ)的BAG逆转录病毒在CRIP中产生。产 生6×105cfu/ml的滴度并且使用非浓缩的培养液上清(DMEM，0，5％ NCS，Gibco)。
腺病毒
在HSVtk腺病毒中，表达盒包括人巨细胞(hCMV)病毒增强子和 启动子元件-HSV1-TK cDNA-猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号被 亚克隆到pAdemogal质粒(Barr等，基因治疗(Gene Ther.)1：51-58 (1994))上，以产生pAdCMVTK质粒。用线性化的pAdCMVTK和 sub360腺病毒DNA(McClane等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)8： 739-746(1997))共转染239细胞(ATCC CRL1573)，并且通过同源重 组产生重组腺病毒，AdCMVTK。通过三轮的空斑分析和在每轮之后用 PCR证实在腺病毒基因组中TK表达盒的存在来纯化病毒克隆。在239 细胞中进行AdCMVTK的大规模制备，并且用CsCl梯度来纯化和浓缩 病毒裂解物，透析并贮存在-80℃。通过在239细胞中的空斑分析来确定 病毒滴度。使用限制酶消化和随后的Southern印迹分析来分析制备的腺 病毒TK表达盒的完整性。通过对HeLa(ATCC CCL-2)和A549(ATCC CC185)细胞的细胞病变分析证实没有能复制的野生型病毒的存在。同 样被检测的病毒制剂不含微生物污染物和脂多糖(鲎试验，Sigma)。
在LacZ中，使用同源重组方法将处于β-肌动蛋白启动子和CMV增 强子之下的腺病毒核靶定β-半乳糖苷酶cDNA克隆到E1缺失区的腺病毒 基因组中。用超速离心法浓缩腺病毒到滴度为3×1010pfu/ml。收集纯化 的病毒并用5mM的Hepes(pH7.8)透析并最终处于含有20％甘油的5mM 的Hepes(pH7.8)中。
患者
用HSVtk基因疗法治疗14个患者中的15个肿瘤。另外，在切除前 4-5天用对照的LacZ标记基因转染7个对照患者。所有患者的卡诺夫斯 基量表(Karnofsky)得分都超过70。患者的平均年龄是51岁(范围20-70 岁)。有13个病例肿瘤复发(59％)。所有的患者都接受了皮质类固醇和 抗癫痫的药物治疗并且从肿瘤开始就使用放疗。
手术和基因转移
所有患者都经受了穿颅术和肿瘤切除。在显微镜下尽可能切除彻底。 通过在手术时的冷冻切片来证实恶性神经胶质瘤的诊断。肿瘤切除后， 注射0.1-0.3ml量的HSVtk逆转录病毒包装细胞(109个细胞/10ml)或腺 病毒(3×1010pfu/10ml)到肿瘤腔的壁中，10mm深，每个患者注射30-70 次。GCV治疗(5mg/kg/天)通过锁骨下静脉由静脉内施用每天两次共14 天。在使用逆转录病毒或腺病毒的患者中分别在肿瘤切除和基因转移后14 天或5天开始药物治疗。经由定向地插到肿瘤中的导管将β-半乳糖苷酶基 因转移到7个对照组患者中。导管留在该位置直到用穿颅术切除了肿瘤。 连续三天注射基因转移载体(BAG逆转录病毒，滴度为6×105cfu，和腺 病毒，滴度为3×108到3×1010pfu)到肿瘤中，紧接着在两天后切除肿瘤。 有β-半乳糖苷酶标记基因的患者不用GCV治疗。所有的患者都根据标准 的临床实践使用放疗。
核磁共振成像
用HSVtk治疗的患者在术后第一天，在基因转移后的4、8和12周 和从那时以后的每两个月进行核磁共振成像。进行核磁共振成像在1.5T Magnetom Vision(Siemens)上进行，其中包括造影介质 (gadopentetatedimeglumine 0，1mmol/kg)后，T1-权重(weighted) (580/14/1＝重复时间/回声时间/aquicition)轴向的，冠状的和径向的顺 序；一种turbo-T2权重(5400/99/2)和FLAIR(流体减弱反向复原； TR＝9000，TE＝119，AC＝1))顺序。所有影像都是用5mm厚的连续切 片和256×256矩阵来获得。根据术后第一天的核磁共振成像，手术切除 被分级为：当去除超过肿瘤体积98％时为全部切除；当去除超过肿瘤体 积66％但少于98％时为次全部切除，和当去除少于肿瘤体积66％时为 部分切除。根据随后核磁共振成像，肿瘤状态被分级为：当即使存在最 轻微的肿瘤再生长征兆时为进行性的，当肿瘤状态保持不变时为稳定性 的，和当肿瘤体积减小时为消退性的。
血、尿和组织样本分析
除了在GCV药物治疗期间每两天进行白血球差示计数测量外，在基 因转移前，在术后的第一天和在住院治疗期间的每周用常规的方法分析 血和尿样本。在基因转移前和转移后两周测量抗病毒抗体。在基因转移 前和基因转移第3、5、7和21天后进行血浆和尿样本的PCR和野生型 病毒分析。
用取自手术时的冷冻切片来进行组织学诊断并且随后使用苏木精-曙 红和GFAP(Boehringer)染色的石蜡切片来证实。通过Ki67(Dako) 染色来测量肿瘤的增殖活性。在切除后，通过如在Puumalainen等，人 类基因治疗，9：1769-1774(1998)中所描述的那样的X-gal染色来分析 LacZ转染的肿瘤。
神经心理学
为了确定认知功能和生活质量，在手术前和在治疗后每两个月进行神 经心理学测试。使用维氏记忆力表(Wechsler Memory Scale(WMS)) 来进行记忆力功能评估，其包含七个短期记忆能力的次级测试，与学习 相关的测试，延迟回忆，注意力和智力处理的灵活性。根据标准化的对 睡眠困难、疲劳、记忆功能、身体失调、心境、感官的和运动的功能、 紧张、活力、抑郁、刺激作用、低效率和不确定性的评估来测定生活质 量。LacZ转染的患者不进行神经心理学测试。
统计资料
用针对SPSS的Kruskal Wallis测试法对核磁共振成像结果进行统 计学分析。用针对SPSS的Fisher氏精确测试法对患者的结果进行分析。 用针对SPSS的Anova对实验室和神经心理学分析的统计资料进行评估。
结果
表1显示了基因治疗实验的结果。
所有的患者都进行了肿瘤切除治疗。给七个患者使用了逆转录病毒包 装细胞(PA317/tk)和给七个患者使用了腺病毒(Adv/tk)。一个患者(#) 接受了用PA317/tk细胞对两种不同肿瘤的反复治疗。六个这样的病例是 原发肿瘤，其余是经过了在前的手术(op)、放疗(rd)和化疗(ch)而 复发的。肿瘤位于太阳穴(temp)、枕部(occ)、额(front)，或壁(pariet) 叶。(sin)指左侧，(dx)指右侧。在基因治疗前和治疗后的两个星期测 量外周血的病毒抗体。诊断被证实在82％的患者中为成胶质细胞瘤(gb)， 两个患者有退行发育的星形细胞瘤(aa)，两个患者为退行发育的少突神 经胶质细胞瘤(ao)。通过ki67免疫组织化学染色来测量肿瘤的增殖活力。 通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)免疫染色证实肿瘤的一致性。在 几个月内测量了结果并且(*)指患者的死亡。根据存活而定，逆转录病 毒和腺病毒治疗的患者两者之间的差异通过Fisher氏精确测试是显著的 (p＜0.05)。在肿瘤切除和基因治疗后的术后第1或第2天进行第一次术 后核磁共振成像，并且在3个月后进行第二次术后核磁共振成像。如果 超过98％的肿瘤质量被切除，那么这一切除是完全的，如果切除在66-98％ 之间，则切除是次完全的，如果切除的肿瘤少于66％，则切除是部分的。 在随后的核磁共振成象中如果即使有最轻微的肿瘤再生长的征兆，那么 生长被评价为进行性的(prog)。根据核磁共振成像结果在进行性生长方面 逆转录病毒和腺病毒治疗的患者之间的差异是显著的。(p＜0.05)； Kruskal Wallis测试。NA＝没有测试。
使用逆转录病毒和腺病毒载体的基因转移在临床上是安全的，未产生 严重的副作用。但是，在两个接受腺病毒的患者中癫痫发作增加了，尽 管这两个患者之前都曾有过癫痫症状。一个患者因为双焦点额肿瘤切除 的并发症而具有部分可逆的轻偏瘫和失语症。她接受了结合肿瘤切除的 逆转录病毒包装细胞的基因治疗。两个患者在用室性切开的腺病毒介导 的基因转移后有发烧反应。体温升高到39.0℃，但这一反应是短期的和 可逆的，没有任何后遗症状。
在常规的实验室测量中未见主要的改变。只有一个患者在GCV治疗 期间有无症状的轻微的和可逆的白细胞减少。在7个Adv/tk治疗的患者 中有3个逆转录病毒抗体显著增加；两个还有发热反应。肝和肾的功能 没有明显的改变。用PCR和野生型病毒分析在血浆和尿样本中未检测到 有病毒的全身递送。用PCR分析取自一个患者的死后样本表明在基因转 移6个月后肿瘤和所有其它分析的组织都为阴性。
随后的核磁共振成像结果表明对逆转录病毒包装细胞基因治疗来说没 有或有非常有限的效果。所有的患者在肿瘤切除和基因治疗3个月后都 有进行性的疾病。对于腺病毒介导的基因治疗，在7个患者中有3个在 治疗三个月后核磁共振成像结果明显较好(p＜0.05)且病情稳定。
与LacZ治疗的对照组相比，逆转录病毒组的患者的存活没有显示任 何提高。逆转录病毒和腺病毒治疗的患者的结果之间差异显著(p＜0.05)。
患者 年龄/性 Dg 肿瘤位置 Ki67 GFAP 事先治疗 基因治疗 病毒ab 1.术后MRI 2.术后MRI 存活月数
数 别
1. 67/男 gb occ dx 20％ + - Retro/LacZ rubella NA NA 3*
2. 37/男 gb front sin 20％ + op+rad+ch Retro/LacZ - NA NA 10*
3. 63/女 gb temp dx 25％ + - Adv/LacZ - NA NA 7*
4. 44/女 ao front sin 25％ + op+rad Adv/LacZ - NA NA 5*
5. 45/男 gb temp sin 40％ + - Adv/LacZ - NA NA 12*
6. 32/男 ao front dx 14％ + op+rad+ch Adv/LacZ adeno64 NA NA 10*
7. 39/女 aa tcmp dx 15％ + op+rad Adv/LacZ - NA NA 11*
8. 36/男 gb temp sin 15％ + - PA317/tk - 部分 prog 13*
9.# 64/男 gb occs in 14％ + - PA317/tk - 次完全 prog -
10. 44/女 gb temp dx 15％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 7*
11.# 65/男 gb occ sin 14％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 8*
12. 45/女 gb temp dx 20％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 9*
13. 70/女 gb front sin，multif 25％ + - PA317/tk adeno64 次完全 prog 4*
14. 20/女 gb temp et pariet dx 30％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 7*
15. 56/男 gb temp et pariet dx 25％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 4*
16. 49/女 gb temp dx 10％ + op+rad Adv/tk adeno64 部分 prog 12*
17. 60/男 gb temp dx 20％ + - Adv/tk - 次完全 prog 10
18. 61/男 gb pariet sin 30％ + - Adv/tk adeno＞256 部分 prog 9
19. 39/男 aa front sin 40％ + op+rad Adv/tk adeno 128 部分 稳定 8*
20. 65/男 gb parieto-occ dx 20％ + - Adv/tk - 全部 稳定 8
21. 59/女 gb frontopatiet sin ＜1％ + op+rad Adv/tk - 次完全 稳定 7
22. 56/男 gb pariet sin 20％ + op+rad Adv/tk - 次完全 prog 6
逆转录病毒和腺病毒一直用于基因治疗的载体。两种载体都具有某些 优点和缺陷。脑肿瘤特别适合用逆转录病毒介导的基因转移，因为逆转 录病毒只感染增殖的细胞，而正常的、非分裂的脑组织保持完整。逆转 录病毒的基因转移效率相对较低，但通过使用逆转录病毒包装细胞而不 是孤立的病毒能提高逆转录病毒的基因转移效率。理论上能延长转导时 间并且转染细胞的数量增加。和逆转录病毒一起，转染的基因整合到目 标细胞的基因组中并且可获得长期的基因表达。
发明概述
本发明是基于如下的出人意料的发现：如果使用腺病毒作为载体将基 因转移到肿瘤细胞中能更有效地实现使用胸苷激酶基因疗法治疗脑肿 瘤。
根据本发明，腺病毒包含了编码胸苷激酶的基因，且包含其的药物对 治疗脑肿瘤有用。尤其在施用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或等效化合 物之后治疗肿瘤。
一般胸苷激酶基因得自单纯性疱疹病毒(HSVtk)。
腺病毒/胸苷激酶基因构建体比逆转录病毒基因转移显示了更多的优 点。
发明详述
本发明的构建体可用于治疗肿瘤。治疗可以包括步骤：
(i)施用包含编码胸苷激酶基因的腺病毒到肿瘤腔的壁中；并且
(ii)施用当磷酸化时形成细胞毒性化合物的化合物。
步骤(ii)中使用的化合物可以是9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或 其衍生物。可以使用这种方法治疗任何肿瘤，优选脑肿瘤，例如恶性神 经胶质瘤。步骤(i)中使用的组合物可以反复施用，优选40到80个单 独的应用。
用于本发明的组合物的配制优选不加蛋白质(不同于那些与腺病毒相 关的)。据信加入用以降低降解酶类对活性组合物之作用的白蛋白的那些 组合物是优选的。优选地，这种组合物包括作为稳定剂的甘油。
在本发明中，基于在此处提供的信息和通常的考虑(如施用途径，治 疗条件及其状态等)，本领域技术人员能确定应该给患者施用的活性产物 的量。
下面的实施例阐明了本发明。
实施例
在这个实施例中，比较了逆转录病毒包装细胞介导的和腺病毒介导的 HSVtk基因疗法治疗恶性神经胶质瘤的安全性和效能。在试验中，与lacZ 转染的对照组相比，逆转录病毒包装细胞的基因治疗不能提高恶性神经 胶质瘤患者的存活。在肿瘤切除和基因转移三个月后，当通过核磁共振 成像(MRI)评估时在所有的患者中都存在肿瘤的发展。但是，腺病毒 基因治疗明显改善了患者的结果。此外，七个用腺病毒治疗的患者中有 三个的核磁共振成像显示了肿瘤保持稳定。
逆转录病毒和逆转录病毒包装细胞系
如Poptani等，肿瘤基因治疗(Cancer Gene Ther.)5：101-109(1998) 所描述的那样制备一种PA317/tk包装细胞系。扼要地，将1.2kb HSV1- TK cDNA(McKnight，核酸研究(Nucleic Acid Res.)8：5949-5964(1980)) 亚克隆到pLXSN逆转录病毒质粒(Miller等，分子细胞生物学 (Mol.Cell.Biol.)，5：2985-3902(1986))上以产生pLTKSN质粒。 HSV1-TK的表达由5′莫洛尼氏鼠肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)来启 动。载体也包含一个内部SV40启动子以驱动新霉素抗性(NEO)基因。 使用磷酸钙沉淀法用pLTKSN质粒转染PA317细胞系。象在209F成纤 维细胞分析(Yla-Herttuala等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95：2692-2698 (1995))中确定的那样，PA317/3.0D5细胞系(PA317/tk)产生106个 cfu/ml逆转录病毒。注射前，扩增和用胰酶消化包装细胞并稀释到109个 细胞/10ml Optimen(Gibco BRL)。细胞显示不含支原体、其它微生物 污染物和野生型病毒。
含有β-半乳糖苷酶(lacZ)的BAG逆转录病毒在CRIP中产生。产 生6×105cfu/ml的滴度并且使用非浓缩的培养液上清(DMEM，0，5％ NCS，Gibco)。
腺病毒
在HSVtk腺病毒中，表达盒包括人巨细胞(hCMV)病毒增强子和 启动子元件-HSV1-TK cDNA-猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号被 亚克隆到pAdemogal质粒(Barr等，基因治疗(Gene Ther.)1：51-58 (1994))上，以产生pAdCMVTK质粒。用线性化的pAdCMVTK和 sub360腺病毒DNA(McClane等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)8： 739-746(1997))共转染239细胞(ATCC CRL1573)，并且通过同源重 组产生重组腺病毒，AdCMVTK。通过三轮的空斑分析和在每轮之后用 PCR证实在腺病毒基因组中TK表达盒的存在来纯化病毒克隆。在239 细胞中进行AdCMVTK的大规模制备，并且用CsCl梯度来纯化和浓缩 病毒裂解物，透析并贮存在-80℃。通过在239细胞中的空斑分析来确定 病毒滴度。使用限制酶消化和随后的Southern印迹分析来分析制备的腺 病毒TK表达盒的完整性。通过对HeLa(ATCC CCL-2)和A549(ATCC CC185)细胞的细胞病变分析证实没有能复制的野生型病毒的存在。同 样被检测的病毒制剂不含微生物污染物和脂多糖(鲎试验，Sigma)。
在LacZ中，使用同源重组方法将处于β-肌动蛋白启动子和CMV增 强子之下的腺病毒核靶定β-半乳糖苷酶cDNA克隆到E1缺失区的腺病毒 基因组中。用超速离心法浓缩腺病毒到滴度为3×1010pfu/ml。收集纯化 的病毒并用5mM的Hepes(pH7.8)透析并最终处于含有20％甘油的5mM 的Hepes(pH7.8)中。
患者
用HSVtk基因疗法治疗14个患者中的15个肿瘤。另外，在切除前 4-5天用对照的LacZ标记基因转染7个对照患者。所有患者的卡诺夫斯 基量表(Karnofsky)得分都超过70。患者的平均年龄是51岁(范围20-70 岁)。有13个病例肿瘤复发(59％)。所有的患者都接受了皮质类固醇和 抗癫痫的药物治疗并且从肿瘤开始就使用放疗。
手术和基因转移
所有患者都经受了穿颅术和肿瘤切除。在显微镜下尽可能切除彻底。 通过在手术时的冷冻切片来证实恶性神经胶质瘤的诊断。肿瘤切除后， 注射0.1-0.3ml量的HSVtk逆转录病毒包装细胞(109个细胞/10ml)或腺 病毒(3×1010pfu/10ml)到肿瘤腔的壁中，10mm深，每个患者注射30-70 次。GCV治疗(5mg/kg/天)通过锁骨下静脉由静脉内施用每天两次共14 天。在使用逆转录病毒或腺病毒的患者中分别在肿瘤切除和基因转移后14 天或5天开始药物治疗。经由定向地插到肿瘤中的导管将β-半乳糖苷酶基 因转移到7个对照组患者中。导管留在该位置直到用穿颅术切除了肿瘤。 连续三天注射基因转移载体(BAG逆转录病毒，滴度为6×105cfu，和腺 病毒，滴度为3×108到3×1010pfu)到肿瘤中，紧接着在两天后切除肿瘤。 有β-半乳糖苷酶标记基因的患者不用GCV治疗。所有的患者都根据标准 的临床实践使用放疗。
核磁共振成像
用HSVtk治疗的患者在术后第一天，在基因转移后的4、8和12周 和从那时以后的每两个月进行核磁共振成像。进行核磁共振成像在1.5T Magnetom Vision(Siemens)上进行，其中包括造影介质 (gadopentetatedimeglumine 0，1mmol/kg)后，T1-权重(weighted) (580/14/1＝重复时间/回声时间/aquicition)轴向的，冠状的和径向的顺 序；一种turbo-T2权重(5400/99/2)和FLAIR(流体减弱反向复原； TR＝9000，TE＝119，AC＝1))顺序。所有影像都是用5mm厚的连续切 片和256×256矩阵来获得。根据术后第一天的核磁共振成像，手术切除 被分级为：当去除超过肿瘤体积98％时为全部切除；当去除超过肿瘤体 积66％但少于98％时为次全部切除，和当去除少于肿瘤体积66％时为 部分切除。根据随后核磁共振成像，肿瘤状态被分级为：当即使存在最 轻微的肿瘤再生长征兆时为进行性的，当肿瘤状态保持不变时为稳定性 的，和当肿瘤体积减小时为消退性的。
血、尿和组织样本分析
除了在GCV药物治疗期间每两天进行白血球差示计数测量外，在基 因转移前，在术后的第一天和在住院治疗期间的每周用常规的方法分析 血和尿样本。在基因转移前和转移后两周测量抗病毒抗体。在基因转移 前和基因转移第3、5、7和21天后进行血浆和尿样本的PCR和野生型 病毒分析。
用取自手术时的冷冻切片来进行组织学诊断并且随后使用苏木精-曙 红和GFAP(Boehringer)染色的石蜡切片来证实。通过Ki67(Dako) 染色来测量肿瘤的增殖活性。在切除后，通过如在Puumalainen等，人 类基因治疗，9：1769-1774(1998)中所描述的那样的X-gal染色来分析 LacZ转染的肿瘤。
神经心理学
为了确定认知功能和生活质量，在手术前和在治疗后每两个月进行神 经心理学测试。使用维氏记忆力表(Wechsler Memory Scale(WMS)) 来进行记忆力功能评估，其包含七个短期记忆能力的次级测试，与学习 相关的测试，延迟回忆，注意力和智力处理的灵活性。根据标准化的对 睡眠困难、疲劳、记忆功能、身体失调、心境、感官的和运动的功能、 紧张、活力、抑郁、刺激作用、低效率和不确定性的评估来测定生活质 量。LacZ转染的患者不进行神经心理学测试。
统计资料
用针对SPSS的Kruskal Wallis测试法对核磁共振成像结果进行统 计学分析。用针对SPSS的Fisher氏精确测试法对患者的结果进行分析。 用针对SPSS的Anova对实验室和神经心理学分析的统计资料进行评估。
结果
表1显示了基因治疗实验的结果。
所有的患者都进行了肿瘤切除治疗。给七个患者使用了逆转录病毒包 装细胞(PA317/tk)和给七个患者使用了腺病毒(Adv/tk)。一个患者(#) 接受了用PA317/tk细胞对两种不同肿瘤的反复治疗。六个这样的病例是 原发肿瘤，其余是经过了在前的手术(op)、放疗(rd)和化疗(ch)而 复发的。肿瘤位于太阳穴(temp)、枕部(occ)、额(front)，或壁(pariet) 叶。(sin)指左侧，(dx)指右侧。在基因治疗前和治疗后的两个星期测 量外周血的病毒抗体。诊断被证实在82％的患者中为成胶质细胞瘤(gb)， 两个患者有退行发育的星形细胞瘤(aa)，两个患者为退行发育的少突神 经胶质细胞瘤(ao)。通过ki67免疫组织化学染色来测量肿瘤的增殖活力。 通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)免疫染色证实肿瘤的一致性。在 几个月内测量了结果并且(*)指患者的死亡。根据存活而定，逆转录病 毒和腺病毒治疗的患者两者之间的差异通过Fisher氏精确测试是显著的 (p＜0.05)。在肿瘤切除和基因治疗后的术后第1或第2天进行第一次术 后核磁共振成像，并且在3个月后进行第二次术后核磁共振成像。如果 超过98％的肿瘤质量被切除，那么这一切除是完全的，如果切除在66-98％ 之间，则切除是次完全的，如果切除的肿瘤少于66％，则切除是部分的。 在随后的核磁共振成象中如果即使有最轻微的肿瘤再生长的征兆，那么 生长被评价为进行性的(prog)。根据核磁共振成像结果在进行性生长方面 逆转录病毒和腺病毒治疗的患者之间的差异是显著的。(p＜0.05)； Kruskal Wallis测试。NA＝没有测试。
使用逆转录病毒和腺病毒载体的基因转移在临床上是安全的，未产生 严重的副作用。但是，在两个接受腺病毒的患者中癫痫发作增加了，尽 管这两个患者之前都曾有过癫痫症状。一个患者因为双焦点额肿瘤切除 的并发症而具有部分可逆的轻偏瘫和失语症。她接受了结合肿瘤切除的 逆转录病毒包装细胞的基因治疗。两个患者在用室性切开的腺病毒介导 的基因转移后有发烧反应。体温升高到39.0℃，但这一反应是短期的和 可逆的，没有任何后遗症状。
在常规的实验室测量中未见主要的改变。只有一个患者在GCV治疗 期间有无症状的轻微的和可逆的白细胞减少。在7个Adv/tk治疗的患者 中有3个逆转录病毒抗体显著增加；两个还有发热反应。肝和肾的功能 没有明显的改变。用PCR和野生型病毒分析在血浆和尿样本中未检测到 有病毒的全身递送。用PCR分析取自一个患者的死后样本表明在基因转 移6个月后肿瘤和所有其它分析的组织都为阴性。
随后的核磁共振成像结果表明对逆转录病毒包装细胞基因治疗来说没 有或有非常有限的效果。所有的患者在肿瘤切除和基因治疗3个月后都 有进行性的疾病。对于腺病毒介导的基因治疗，在7个患者中有3个在 治疗三个月后核磁共振成像结果明显较好(p＜0.05)且病情稳定。
与LacZ治疗的对照组相比，逆转录病毒组的患者的存活没有显示任 何提高。逆转录病毒和腺病毒治疗的患者的结果之间差异显著(p＜0.05)。
患者 年龄/性 Dg 肿瘤位置 Ki67 GFAP 事先治疗 基因治疗 病毒ab 1.术后MRI 2.术后MRI 存活月数
数 别
1. 67/男 gb occ dx 20％ + - Retro/LacZ rubella NA NA 3*
2. 37/男 gb front sin 20％ + op+rad+ch Retro/LacZ - NA NA 10*
3. 63/女 gb temp dx 25％ + - Adv/LacZ - NA NA 7*
4. 44/女 ao front sin 25％ + op+rad Adv/LacZ - NA NA 5*
5. 45/男 gb temp sin 40％ + - Adv/LacZ - NA NA 12*
6. 32/男 ao front dx 14％ + op+rad+ch Adv/LacZ adeno64 NA NA 10*
7. 39/女 aa tcmp dx 15％ + op+rad Adv/LacZ - NA NA 11*
8. 36/男 gb temp sin 15％ + - PA317/tk - 部分 prog 13*
9.# 64/男 gb occs in 14％ + - PA317/tk - 次完全 prog -
10. 44/女 gb temp dx 15％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 7*
11.# 65/男 gb occ sin 14％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 8*
12. 45/女 gb temp dx 20％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 9*
13. 70/女 gb front sin，multif 25％ + - PA317/tk adeno64 次完全 prog 4*
14. 20/女 gb temp et pariet dx 30％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 7*
15. 56/男 gb temp et pariet dx 25％ + op+rad PA317/tk - 次完全 prog 4*
16. 49/女 gb temp dx 10％ + op+rad Adv/tk adeno64 部分 prog 12*
17. 60/男 gb temp dx 20％ + - Adv/tk - 次完全 prog 10
18. 61/男 gb pariet sin 30％ + - Adv/tk adeno＞256 部分 prog 9
19. 39/男 aa front sin 40％ + op+rad Adv/tk adeno 128 部分 稳定 8*
20. 65/男 gb parieto-occ dx 20％ + - Adv/tk - 全部 稳定 8
21. 59/女 gb frontopatiet sin ＜1％ + op+rad Adv/tk - 次完全 稳定 7
22. 56/男 gb pariet sin 20％ + op+rad Adv/tk - 次完全 prog 6
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