技术领域
[0001] 本
发明一般地涉及抗体检测领域，并且特别地涉及用于检测包含患者体液之样品中与肝癌相关之自身抗体的测定。
背景技术
[0002] 很多诊断、
预后和/或监测测定依赖于检测特定
疾病状态或疾病易感性的
生物标志物。这样的生物标志物通常是特定疾病特征性的或与疾病易感性相关的
蛋白质或多肽，并且通常用于检测癌症(包括肝癌)。
[0003] 肝癌并且尤其是
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界第六常见的癌症，而且其还是癌症死亡的第二常见原因。高死亡率由晚期诊断(通常是在转移之后)和已存在的肝疾病引起。晚期诊断是由于缺乏早期症状和用于诊断的影像学技术不是最佳的。
[0004] 血液甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)
水平的超声筛选和评估是目前最广泛使用的肝癌筛查工具。然而，其差的表现突显了用于肝癌的经改进早期检测/筛选测试的重大缺口。
[0005] 明显的是，有效筛查肝癌存在的临床上可用的测试由于其可使肝癌得到早期诊断而受到欢迎。此外，对体液样品(例如，血液样品)进行的诊断测试相对于其他技术而言快速且相对不具有侵入性，从而提高筛查参与率。早期疾病检测开辟了
副作用较不严重的更广泛范围的
治疗选择。中期肝癌的当前治疗途径涉及全肝移植，并且较早地鉴定患有早期疾病的患者将减轻器官捐献者登记簿上的负担。
[0006] 由于肝癌的比例在世界范围内提高，用于肝癌的经改进筛查测试在全世界将是有用的。目前，中国占所有HCC病例的约50％，而埃及也具有非常高的HCC比例。HCC在这些国家的高患病率被认为部分地是因为乙型
肝炎(hepatitis B)在中国的高发病率和丙型肝炎(hepatitis C)在埃及的高患病率。乙型肝炎和丙型肝炎以及肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease)、酒精性肝病、威尔逊病(Wilson’s disease)、遗传性血色素沉着病(hereditary hemochromatosis)、自身免疫性肝炎、证实的黄曲霉毒素暴露(documented aflatoxin exposure)、血吸虫病和糖尿病是肝癌的已知
风险因子。这些病症在世界范围内的患病率提高使得急需设计用于肝癌的快速且非侵入性的测试。
[0007] 近年来，越来越明显的是，抗体(并且特别是自身抗体)可用作疾病或疾病易感性的生物标志物。自身抗体是针对个体免疫系统识别为外来的
抗原的天然抗体，即使该抗原实际上来源于个体。其可作为循环游离自身抗体或以由与其靶蛋白结合之自身抗体组成的循环免疫复合物的形式存在于循环中。由“正常”细胞表达的野生型蛋白与由患病细胞或在患病过程期间产生的经改变蛋白质形式之间的差异在一些情况下可导致经改变蛋白质被个体的免疫系统识别为“非自身的”并因此在该个体中引发免疫应答。这可以是导致产生对经改变蛋白质具有免疫特异性的自身抗体的体液(即B细胞介导的)免疫应答。
[0008] 就自身抗体产生而言测量个体针对
肿瘤标志物蛋白之存在的免疫应答的测定提供直接测量或检测体液中的肿瘤标志物蛋白的替代方案。这样的测定实质上构成了肿瘤标志物蛋白之存在的间接检测。免疫应答的性质意味着，非常少量的循环肿瘤标志物蛋白可能以可引发自身抗体，并且依赖于检测针对肿瘤标志物蛋白的免疫应答的间接方法将因此比用于直接测量体液中肿瘤标志物蛋白水平的方法更灵敏。因此，基于自身抗体检测的测定方法在患病过程早期可具有特别的价值。
[0009] 本
发明人已出人意料地确定了先前未知与肝癌相关的四种肿瘤标志物抗原。通过检测针对这些肿瘤标志物抗原中任一种的自身抗体，任选地与一种或更多种另外的肿瘤标志物抗原组合，本发明人已设计了用于肝癌的有效且非侵入性的筛查方法，以及对应的
试剂盒。
发明内容
[0010] 本发明人已出人意料地确定，对以下肿瘤标志物蛋白中任一种具有免疫特异性的自身抗体指示肝癌的存在：基质金属肽酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、异体移
植物炎性因子1(allograft inflammatory factor 1，AIF1)、上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)和周期蛋白依赖性激酶
抑制剂1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B)。因此，对这些肿瘤标志物蛋白中任一种具有免疫特异性的自身抗体的检测可用于肝癌的诊断。
[0011] 根据本发明的第一方面，提供了检测包含来自
哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0012] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原
接触；以及[0013] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在。
[0014] 在该方面，所述对象优选地被怀疑患有肝癌。
[0015] 根据本发明的第二方面，提供了通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体来在所述哺乳动物对象中检测肝癌的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0016] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0017] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0018] 其中所述复合物的存在指示肝癌的存在。
[0019] 根据本发明的第三方面，提供了通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体来在所述哺乳动物对象中诊断和治疗肝癌的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0020] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；
[0021] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0022] (c)当检测到与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物时，诊断所述对象患有肝癌；以及
[0023] (d)向所诊断的对象施用肝癌治疗。
[0024] 根据本发明的第四方面，提供了预测针对抗肝癌治疗之响应的方法，所述方法包括检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0025] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；
[0026] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0027] (c)检测肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量；以及
[0028] (d)将肿瘤标志物抗原与自身抗体之间特异性结合的量与先前确立的结合量与可能的治疗结果之间的关系进行比较；
[0029] 其中当与对照相比时，特异性结合的量的改变预测患者将对抗肝癌治疗作出或不作出响应。
[0030] 在本发明的这一方面，所述抗肝癌治疗可选自
化学治疗、射频
消融术(radiofrequency ablation)、肝
切除术(liver resection)、肝移植、
疫苗接种、抗生长因子或
信号转导治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、经
导管动脉化学栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization)、经皮
乙醇注射、
微波消融术(microwave ablation)、索拉非尼施用和
放射性栓塞术(radioembolisation)。
[0031] 根据本发明的第五方面，提供了选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原在通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中对MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B具有免疫特异性的自身抗体来在所述哺乳动物对象中检测肝癌的方法中的用途，所述方法包括以下步骤：
[0032] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0033] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在，
[0034] 其中所述复合物的存在指示肝癌的存在。
[0035] 根据本发明的第六方面，提供了用于检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的自身抗体的试剂盒，其包含：
[0036] (a)选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原；和
[0037] (b)能够检测与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的试剂。
[0038] 根据本发明的第七方面，提供了在包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中确定患有肝癌之个体的抗体谱(antibody profile)的体外方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0039] a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EPCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0040] b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在，其中重复所述方法以建立抗体产生谱(profile of antibody production)。在本发明的所有方面，所述哺乳动物对象优选地是人。在文本中，术语“哺乳动物对象”和“对象”将可互换使用，是指为哺乳动物(优选人)对象。
[0041] 在本发明的所有方面，所述方法优选地在体外对包含从哺乳动物对象获得或制备的体液的受试样品进行。
[0042] 对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体可用作肝癌标志物的出人意料的发现已允许本发明人设计可用于对肝癌进行检测和诊断的用于检测此类自身抗体的方法。这样的检测可使用试剂盒来进行，并且这些方法和试剂盒形成本发明的核心。
附图说明
[0043] 图1.用于演示推导以下二次曲线参数(secondary curve parameter)的示意图：图1A＝斜率、截距、曲线下面积(Area under the Curve，AUC)和SlopeMax；图1B＝解离常数(Kd)。
[0044] 图2.自身抗体微量滴定板布局：图2A＝高通量测定(high-throughput assay，HTPA)布局；图2B＝滴定布局。
具体实施方式
[0045] 本发明一般地提供了用于检测对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体的
免疫测定方法。该免疫测定方法可用于检测或诊断肝癌。
[0046] 检测自身抗体的方法
[0047] 根据本发明的第一方面，提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0048] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0049] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在。
[0050] 本文中使用的术语“自身抗体”是
指针对个体的免疫系统识别为外来物(即便该抗原实际上起源于该个体)的天然抗体。通常来说，自身抗体包括针对由患病细胞或疾病过程期间产生的天然蛋白质之经改
变形式的抗体。蛋白质的经改变形式起源于个体，但可被个体的免疫系统视为“非自身(non-self)”，并因此以对该经改变蛋白质具有免疫特异性之自身抗体的形式在该个体中引起免疫应答。蛋白质的此类经改变形式可包括例如：具有经改变
氨基酸序列的突变体，任选伴随有二级、三级或四级结构，截短形式，拼接变体，经改变糖型等的改变。在另一些实施方案中，自身抗体可针对在疾病状态中过表达的蛋白质，或作为基因扩增或异常转录调节的结果。显著量的免疫系统细胞不常遇到的蛋白质的过表达可引发导致自身抗体产生的免疫应答。在另一些实施方案中，自身抗体可针对变成疾病状态中表达的蛋白质的
胎儿形式。如果通常只在发育早期阶段(在免疫系统发挥功能之前)表达的胎儿蛋白质成为以疾病状态表达，则在充分发育的人中以疾病状态表达的胎儿形式可被免疫系统识别为“外来物”，从而引发导致自身抗体产生的免疫应答。在又一些实施方案中，自身抗体可针对在疾病状态中于不同
位置表达的蛋白质。例如，蛋白质可在健康个体的内部位置处表达，但是在疾病状态下的表面暴露位置处表达，使得其暴露于循环，并因此暴露于疾病状态的免疫系统，但不暴露于健康个体的免疫系统。本文中，自身抗体所针对的蛋白质将被称为“肿瘤标志物蛋白”。
[0051] 在本发明的范围内，考虑可检测对MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B中的任一种具有免疫特异性的自身抗体。本发明还考虑对这些肿瘤标志物蛋白中的一种具有免疫特异性的自身抗体和对这些肿瘤标志物蛋白中的第二种具有免疫特异性的自身抗体的检测，任选地，与对这些肿瘤标志物蛋白中的第三种具有免疫特异性的自身抗体的检测，并且还任选地，对这些肿瘤标志物蛋白中的第四种具有免疫特异性的自身抗体的检测的组合。然而，本发明绝不限于该方面。当检测到对经鉴定的肿瘤标志物蛋白中的两种或三种具有免疫特异性的自身抗体时，考虑两种或三种肿瘤标志物蛋白的所有组合。
[0052] 在本发明的上下文中，所使用的术语“抗原”是指与受试样品中存在的自身抗体复合的免疫特异性试剂。抗原是包含能够与期望检测的靶自身抗体特异性相互作用的至少一种抗原决定簇或表位的物质，或与所述自身抗体的可变区或互补决定区特异性相互作用的任何捕获剂。抗原通常将是天然或合成的生物大分子，例如蛋白质或肽、多糖或核酸，并且可包括抗体或其
片段，例如抗独特型抗体(anti-idiotype antibody)。“肿瘤标志物抗原”是患有癌症(在本上下文中特别地是肝癌)的对象中升高的抗原。本文中，术语“肿瘤标志物抗原”与“抗原”将可互换使用。
[0053] 当提及待使用本发明的方法测试自身抗体之存在的材料时，本文中使用的术语“体液”尤其包括
血浆、血清、
全血、尿、汗、淋巴、
粪便、
脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、痰、
乳头抽吸液(nipple aspirate)、术后血清肿(post-operative seroma)、唾液、
羊水、泪和伤口引流液(wound drainage fluid)。如前述的，本发明的方法优选在体外对包含从受试对象中取出的体液的受试样品进行。所使用的体液类型可根据待测试的自身抗体的身份以及使用该测定的临床情况而变化。通常来说，优选进行对血清或血浆样品的测定。除了体液以外，受试样品还可包含例如稀释剂、
防腐剂、稳定剂、缓冲剂等的组分。
[0054] 在某些实施方案中，本发明的方法还可包括以下步骤：
[0055] (c)检测肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量，[0056] 其中自身抗体的存在或不存在是以所观察到的特异性结合的量与预定取舍值之间的比较为
基础。
[0057] 在该实施方案中，肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间的特异性结合的量可以是结合的相对量或结合的绝对量。
[0058] 在此，如果肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量高于或低于预定取舍值，则自身抗体可被认为是存在的。然而，通常地如果肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量高于预定取舍值，则自身抗体被认为是存在的。预定取舍值可通过在病例对照研究中对已知阴性样品(例如正常个体)进行对照测定来确定。基于临床、影像学和/或生物化学标准，“正常”个体将优选是不具有任何肝癌诊断的年龄匹
配对照。在某些实施方案中，已知的阴性样品可来源于良性肝病个体，即在肝癌高风险下但没有显示出任何肝癌证据的那些个体。优选地，正常个体不具有任何癌症的任何诊断。在此，可检测到肿瘤标志物抗原与来自正常患者的受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量并且进行平均以提供预定取舍值。在某些实施方案中，预定取舍值可通过选择给出最大的约登值(Youden’s value)的取舍值来确定(其保持大于90％的特异性)。
[0059] 本发明人出人意料地发现，对MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B中的任一种具有免疫特异性的自身抗体与肝癌相关。因此，在某些实施方案中，所述对象可被怀疑患有肝癌。考虑怀疑对象可患有肝癌的任何原因。
[0060] 在本发明的所有方面中，肝癌可以是肝细胞癌(HCC)。
[0061] 在某些实施方案中，可怀疑哺乳动物对象患有肝癌，因为其先前在肝癌筛查中已被检测呈阳性。在此考虑任何肝癌筛查。在某些实施方案中，所述对象先前可已被测试为对甲胎蛋白(AFP)呈阳性。通常来说，在从对象中采集的血液样品中检测到AFP水平，因此所述对象先前可在血液样品中已被测试为对AFP呈阳性。然而，考虑任何AFP检测技术。在一些作为替代的实施方案中，所述对象先前可已被检测对脱-γ羧基凝血酶原(DCP)或凝集素
反应性甲胎蛋白(AFP-L3)呈阳性。通常来说，在从对象中采集的血液样品中检测到DCP和AFP-L3水平并且所述对象可因此先前在血液样品中已被测试为对DCP或AFP-L3呈阳性。然而，考虑任何DCP或AFP-L3检测技术。
[0062] 在另一些实施方案中，可使用超声监测或任何其他影像学方法测试所述对象对肝癌呈阳性。
[0063] 在本发明的范围内，所述对象可在执行本发明的方法之前的任何点在肝癌筛查中已被测试为呈阳性。例如，肝癌筛查可在进行本发明的方法之前已经进行1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长。
[0064] 出于本发明的目的，正经历肝癌治疗或者先前经历过肝癌治疗的对象仍可被认为“怀疑患有肝癌”。本文中，肝癌的治疗可在任何时间进行，并且所述对象可以或可以不随后进行肝癌之存在的测试。
[0065] 所述对象由于肝癌已知风险因素的存在而被怀疑患有肝癌。在某些实施方案中，所述对象可患有肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、威尔逊病、遗传性血色素沉着病、自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、证实的黄曲霉毒素暴露、血吸虫病或糖尿病。考虑确定这些风险因素的任何方法，并且所述对象可以或可以不正经历或已经经历与风险因素相关的治疗。
[0066] 由于本发明人出人意料地确定对MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B具有免疫特异性的自身抗体与肝癌相关，对这些肿瘤标志物蛋白的任一种具有免疫特异性的自身抗体的受试样品的检测可用于检测肝癌的方法。在一个方面中，本发明因此提供了通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体来在哺乳动物对象中检测肝癌的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0067] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0068] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0069] 其中所述复合物的存在指示肝癌的存在。
[0070] 在其最广泛的一些方面中，本发明涉及用于检测对MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B中的任一种具有免疫特异性的自身抗体的方法，并且不限于肝癌的诊断或任何后续治疗。然而，在一个方面中，本发明提供了通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体来在哺乳动物对象中诊断和治疗肝癌的方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0071] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；
[0072] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0073] (c)当检测到与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物时，诊断所述对象患有肝癌；以及
[0074] (d)向所诊断的对象施用肝癌治疗。
[0075] 在该方面中，如上所述的，如果肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量高于或低于预定取舍值，则自身抗体可被认为是存在的。
[0076] 在本发明的范围中，在肝癌诊断之后的任何时间可以施用肝癌治疗。例如，在肝癌诊断之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长，可施用肝癌治疗。还考虑在治疗轮次之间任何间隔内肝癌治疗的多次施用。
[0077] 考虑不同于进行肝癌诊断之地理位置的地理位置处的肝癌治疗的施用。此外，不论诊断和治疗是在相同还是不同的地理位置处进行，肝癌治疗都可由与进行诊断之人不同的人来施用。
[0078] 在一个方面中，本发明的自身抗体检测方法可用于治疗分层(treatment stratification)，即确定特定患者或患者组是否或多或少地可能对特定抗肝癌治疗作出响应。例如，本发明的自身抗体检测方法可用于预测对象对抗肝癌治疗作出的响应。
[0079] 因此，本发明提供了预测对抗肝癌治疗作出响应的方法，所述方法包括检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的抗体，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0080] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；
[0081] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0082] (c)检测肿瘤标志物抗原与受试样品中存在的自身抗体之间特异性结合的量；以及
[0083] (d)将肿瘤标志物抗原与自身抗体之间特异性结合的量与先前确立的结合量与可能的治疗结果之间的关系进行比较；
[0084] 其中当与对照相比时，特异性结合的量的改变预测患者将对所述抗肝癌治疗作出或不作出响应。
[0085] 本文中，对照优选是来源于已知患有肝癌之对象的体液样品，并且已知对所测试的抗肝癌治疗不作出响应，即为非响应性对照。
[0086] 应注意，本发明绝不限于任何具体肝癌治疗。在某些实施方案中，肝癌治疗可选自化学治疗、
射频消融术、肝切除术、肝移植、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、经导管动脉化学栓塞术、经皮乙醇注射、微波消融术、索拉非尼施用和放射性栓塞术。
[0087] 本发明的上述方面通常将进行一次。然而，体外免疫测定不具有侵入性并且可根据认为建立患者中自身抗体产生谱的需要而经常地进行，不管是在肝癌发生之前如在筛查“处于风险中的”个体中，还是在整个疾病过程中。
[0088] 因此，本发明提供了在包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中确定患有肝癌之个体的抗体谱的体外方法，其中所述抗体是对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体，所述方法包括以下步骤：
[0089] a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EPCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0090] b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在，其中重复所述方法以建立抗体产生谱。
[0091] 两种或更多种肿瘤标志物抗原的组
[0092] 在本发明的某些实施方案中，所述方法可检测两种或更多种自身抗体。例如，所述方法可检测两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种、二十四种、二十五种、二十六种、二十七种、二十八种、二十九种、三十种、三十一种、三十二种、三十三种、三十四种、三十五种、三十六种、三十七种、三十八种或更多种自身抗体。根据本发明的核心，所述自身抗体中的一种对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性。
[0093] 在这些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0094] (a)使受试样品与两种或更多种肿瘤标志物抗原的组(panel)接触，所述组包含选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原以及对至少一种所述自身抗体具有免疫特异性的一种或更多种另外的肿瘤标志物抗原。
[0095] 这些方法可以在下文中称为“组测定”。这样的测定通常比检测单一肿瘤标志物抗原的自身抗体更灵敏，并且给出
频率要低得多的假阴性结果(参见WO 99/58978、WO 2004/044590和WO2006/126008，其内容通过引用并入本文)。
[0096] 一般认为，将通过检测多种自身抗体的存在来提高测定的灵敏度。因此，在一些实施方案中，本发明的方法考虑使用包含多种肿瘤标志物抗原的组，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种、二十四种、二十五种、二十六种、二十七种、二十八种、二十九种、三十种、三十一种、三十二种、三十三种、三十四种、三十五种、三十六种、三十七种、三十八种或更多种肿瘤标志物抗原。
[0097] 应注意，这种组实施方案可与本发明的所有方法一起使用，包括检测自身抗体的方法、检测肝癌的方法、诊断和治疗肝癌的方法、预测对抗肝癌治疗作出响应的方法以及确定抗体谱的方法。
[0098] 在某些实施方案中，所述组可包含作为不同抗原的两种或更多种肿瘤标志物抗原。本文中，术语“不同抗原”涵盖来源于不同蛋白质或多肽的抗原(例如，来源于由不同基因编码的不相关蛋白质的抗原)。
[0099] 本发明还考虑使用包含一种或更多种不同抗原的两种或更多种抗原变体的组的方法。本文中使用的术语“抗原变体”是指单一抗原(例如上文中所定义的单一蛋白质抗原)的等位基因或其他变体。抗原变体将一般地来源于单一基因，并且不同的抗原变体可在不同的群体成员或不同的疾病状态中表达。抗原变体可在氨基酸序列或翻译后修饰(例如糖基化、磷
酸化或乙酰化)方面不同。此外，术语“抗原变体”涵盖抗原突变，例如氨基酸替换、添加或缺失。通常来说，相对于野生型抗原，抗原变体将包含少于五种(例如，少于四种、少于三种、少于两种或一种)突变。
[0100] 在这种组实施方案中，“一种或更多种另外的肿瘤标志物抗原”优选除了对选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的自身抗体以外还对自身抗体具有免疫特异性，如下文进一步讨论的。然而，虽然本发明绝不限于该方面，但是本发明考虑对这四种肿瘤标志物蛋白中的一种具有免疫特异性的自身抗体和对这四种肿瘤标志物蛋白中的第二种具有免疫特异性的自身抗体的检测，任选地与对这四种肿瘤标志物蛋白中的第三种具有免疫特异性的自身抗体的检测组合且另外任选地与对这四种肿瘤标志物蛋白的第四种具有免疫特异性的自身抗体的检测组合。当检测到对经鉴定的肿瘤标志物蛋白的两种或三种具有免疫特异性的自身抗体时，考虑两种或三种肿瘤标志物蛋白的所有组合。两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可因此包含选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的两种、三种或四种肿瘤标志物抗原。在某个具体实施方案中，所述组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。在另一个具体实施方案中，所述组可由MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B组成。
[0101] 在一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含选自以下中的一种或更多种肿瘤标志物抗原：NY-ESO-1、
波形蛋白、HSPA4、转
铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、周期蛋白B1、AFP、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、雀乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。在这个实施方案中，所述组可包含所述肿瘤标志物抗原中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种、二十四种、二十五种、二十六种、二十七种、二十八种、二十九种、三十种、三十一种、三十二种、三十三种或三十四种。根据本发明，所述组还将包含MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B并且可包含这些肿瘤标志物抗原中的一种、两种、三种或四种。在其中这些肿瘤标志物抗原中的两种或三种被包含在所述组中的一些实施方案中，考虑这些抗原中的两种或三种的所有组合。在具体实施方案中，所述组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。
[0102] 在一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、NY-ESO-1、HSPA4、波形蛋白、HNRNP-L和转铁蛋白。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由MMP9、AIF1、EpCAM、NY-ESO-1、HSPA4、波形蛋白、HNRNP-和转铁蛋白组成。
[0103] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含AIF1、EpCAM、HSPA4和CPS1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由AIF1、EpCAM、HSPA4和CPS1组成。
[0104] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含EpCAM、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2、HSPA4和HNRNP-L。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由EpCAM、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2、HSPA4和HNRNP-L组成。
[0105] 在又一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、DDX3X、SALL4、MAGE A4、NY-ESO-1、CAGE、RalA和SOX2。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由MMP9、AIF1、EpCAM、DDX3X、SALL4、MAGE A4、NY-ESO-1、CAGE、RalA和SOX2组成。
[0106] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含EpCAM、CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X和NY-ESO-1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由EpCAM、CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X和NY-ESO-1组成。
[0107] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含AIF1、CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、HSPA4和转铁蛋白。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由AIF1、CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、HSPA4和转铁蛋白组成。
[0108] 在某些具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可根据对象的性别(即对象为雄性还是雌性)而不同。在这个实施方案中，当对象为雌性时，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含或由以下组成：AIF1、EpCAM、HSPA4和CPS1，或者AIF1、CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、HSPA4和转铁蛋白。此外，在这个实施方案中，当所述对象为雄性时，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含或由以下组成：EpCAM、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2、HSPA4和HNRNP-L，或者EpCAM、CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X和NY-ESO-1。
[0109] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL，、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。根据本发明，所述组还将包含MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B，并且可包含这些肿瘤标志物抗原中的一种、两种、三种或四种。在其中这些肿瘤标志物抗原中的两种或三种被包含在所述组中的一些实施方案中，考虑这些抗原中的两种或三种的所有组合。
[0110] 在一些具体实施方案中，所述组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。例如，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、CDKN1B、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8，、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。
[0111] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组由以下组成：MMP9、AIF1、EpCAM、CDKN1B、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。
[0112] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X和AIF1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X和AIF1组成。
[0113] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X、AIF1、SOX2和AFP。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X、AIF1 SOX2和AFP组成。
[0114] 另外的筛选步骤
[0115] 在本发明的某些实施方案中，本发明的方法还可包括筛选与肝癌相关的另外标志物。在这个实施方案中，考虑筛查已知与肝癌相关的任何标志物的任何方法。
[0116] 例如，所述方法还可包括检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的甲胎蛋白(AFP)、脱-γ羧基凝血酶原(DCP)或凝集素反应性甲胎蛋白(AFP-L3)。优选地，体液为血液。在其中所述方法还包括检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的甲胎蛋白(AFP)的一些实施方案中，体液优选为血液并且优选将200ng/ml的取舍值用于评估阳性。
[0117] 抗原滴定
[0118] 在WO2006/126008(其内容通过引用并入本文)中，可以确定，通过包括抗原滴定步骤，可以显著改善基于检测作为疾病生物标志物的自身抗体的测定的性能(并且更具体地临床效用和可靠性)。通过测试怀疑包含抵抗一系列不同量的抗原的自身抗体的样品并构建滴定曲线，可以可靠地鉴定真阳性筛选结果，而与样品中存在的自身抗体的绝对量无关。WO2006/126008的抗原滴定方法提供比在单个抗原浓度下测量自身抗体反应性更大的特异性和灵敏度，或者血清样品而不是抗原被滴定的方法。
[0119] 在某些实施方案中，本发明因此考虑其中肿瘤标志物抗原以多个不同的量提供的方法，并且其中所述方法包括以下步骤：
[0120] (a)使受试样品与多种不同量的肿瘤标志物抗原接触；
[0121] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0122] (c)检测肿瘤标志物抗原与自身抗体之间特异性结合的量；
[0123] (d)对于步骤(a)中使用的肿瘤标志物抗原的每种量，绘制或计算特异性结合的量相对于肿瘤标志物抗原的量的曲线；以及
[0124] (e)基于在使用的肿瘤标志物抗原的每种不同量下肿瘤标志物抗原与自身抗体之间特异性结合的量来确定自身抗体的存在或不存在。
[0125] 在实践中，不同量的肿瘤标志物抗原一般将通过改变所使用的肿瘤标志物抗原的浓度来提供。因此，术语“不同量”和“不同浓度”可互换使用。然而，在本发明的范围中，考虑改变肿瘤标志物抗原的量的任何方法。熟练的读者将理解，在本发明的方法中，可用于与靶自身抗体结合的抗原决定簇或表位的量对于建立滴定系列(即，一组以不同量提供的抗原)是重要的。在许多测定形式中，可用于结合的抗原决定簇或表位的量与存在的抗原分子的量直接相关。然而，在另一些实施方案中，例如某些固相测定系统，暴露的抗原决定簇或表位的量可与抗原的量不直接相关，但是可取决于其他因素，例如与固体表面的附着和构象呈现。在这些实施方案中，本文中提及的滴定系列中的“不同量的抗原”可被认为是指不同量的抗原决定簇或表位。在一些特定实施方案中，抗原量的变化可通过改变所测试样品所针对的抗原或表位
密度，或通过维持抗原或表位密度但是抗原被固定的表面积增大，或者通过这二者来实现。
[0126] 在这个实施方案中，“一组抗原”是指在本发明的方法中以不同量测试的单一抗原。
[0127] 在其中考虑多种抗原的一些实施方案中，如上所述，“一组不同的抗原”是指在本发明的方法中以不同量测试的单一抗原，其中每种抗原是来源于不同蛋白质或多肽的“不同抗原”(例如，来源于由不同基因编码的不相关蛋白质的抗原)。给定的微阵列可仅包含来源于不同蛋白质或多肽的不同抗原组，或者仅包含来源于单一蛋白质或多肽的不同肽表位的不同抗原的组，或者二者以任意比例的混合物。应注意，在本发明的任何实施方案中，不同量的单个组的抗原各自通常将包含仅一种抗原而不包含其混合物。
[0128] 一组抗原变体是指在本发明的方法中以不同量测试的单一抗原变体。
[0129] 在某些实施方案中，可以基于针对使用的所有肿瘤标志物抗原量的特异性结合量的集体值(collective value)来确定自身抗体的存在或不存在。在本发明的方法期间，对于每个不同测试的抗原(抗原决定簇或表位)量，测定自身抗体与抗原之间特异性结合的相对量或绝对量，并将其用于绘制或计算特异性结合的量(相对量或绝对量)相对于每种测试的抗原量的曲线。与测定中使用的抗原反应的自身抗体的受试样品中的存在基于在每种抗原量下所观察到的特异性结合的量并且通常由典型地为S-形形状(S-shaped)或S-形(sigmoidal)的剂量-响应曲线表示。因此，在某些实施方案中，自身抗体的存在或不存在通过筛选针对剂量响应曲线的存在的图(例如大致S形或sigmoidal曲线)来确定。如果对于测试的不同抗原量可检测到的结合中没有变化，那么可将其记为不存在可检测到的自身抗体量。
[0130] 在一个实施方案中，自身抗体的存在或不存在通过将自身抗体与抗原之间特异性结合的量与预定取舍值进行比较来确定。在此，对于滴定系列中使用的每种抗原量，绘制特异性结合的量相对于抗原量的曲线，并且在病例对照研究中，将已知阳性样品(例如，患有疾病的患者群体)中的
结合水平与已知阴性样品(例如，正常个体)中观察到的结合水平进行比较。选择滴定曲线上一个或更多个点处自身抗体结合的取舍值，以使灵敏度(没有假阴性)最大化同时保持高特异性(没有
假阳性)。只要对于滴定系列中使用的每个抗原量，特异性结合的量相对于抗原量的曲线是剂量响应曲线，如果对于滴定曲线上一个或更多个点确定的特异性结合的量高于预定取舍点值，则认为测量为阳性。在某些实施方案中，预定取舍值可通过选择给出最大约登值同时保持特异性大于90％的取舍值来确定。
[0131] 应注意，该抗原滴定实施方案可与本发明的所有方法一起使用，包括检测自身抗体的方法、检测肝癌的方法、诊断和治疗肝癌的方法、预测对抗肝癌治疗作出响应的方法以及确定抗体谱的方法。此外，抗原滴定可用于其中仅检测到单一自身抗体的一些实施方案中以及其中抗原的组用于检测多种自身抗体的一些实施方案中。
[0132] 双取舍
[0133] 通常认为，将通过测量针对多种抗原的自身抗体来提高测定的灵敏度。然而，这种提高的灵敏度通常与特异性的成比例下降相关，因此测定方法可限于其可使用的抗原数。在某些实施方案中，本方法可通过使用确定自身抗体与抗原之间特异性结合水平的抗原滴定方法和二次曲线参数的评估来解释特异性的降低，其中只有测试结果当与被分类为阳性的这些度量中的这两个的取舍点相比时被认为是阳性的。该方法在本文中将被称为“双取舍”方法并且在WO2015/193678(其内容通过引用并入本文)中完全地描述。
[0134] 在某些实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：
[0135] (d1)由步骤(c)中绘制或计算的曲线计算二次曲线参数；以及
[0136] (e)基于以下的组合来确定自身抗体的存在或不存在：
[0137] (i)步骤(b)中确定的自身抗体与肿瘤标志物抗原之间特异性结合的量；和[0138] (ii)步骤(d1)中确定的二次曲线参数。
[0139] 双取舍方法使用上述抗原滴定方法。在检测在滴定系列中使用的每种抗原量下的抗原/自身抗体结合的量并且对于滴定系列中使用的每种抗原量之后，绘制特异性结合的量相对于抗原的量的曲线，计算二次曲线参数。二次曲线参数由线性或对数回归曲线计算。本文中，二次曲线参数是提供曲线性质指示的任何计算值。例如，二次曲线参数可以是斜率、截距、AUC、SlopeMax或解离常数(Kd)。这些二次曲线参数示于图1中。
[0140] 斜率使用以下方程式计算：
[0141]
[0142] 其中b是斜率，x是指抗原浓度(nM)，并且y是指OD值(吸光度单位(AU))。
[0143] 对于每种样品，斜率可由线性或对数回归曲线计算，或者由线性和对数回归曲线二者计算。
[0144] 回归线的截距是当x＝0时y轴线的值。
[0145] 对于每种样品，截距可由线性或对数回归曲线计算，或者由线性和对数回归曲线二者计算。
[0146] AUC可使用总和梯形法则来计算，其可通过评估每组抗原浓度之间的定积分遵循以下公式来完成：
[0147]
[0148] 对于每对连续的抗原浓度，重复该计算，并将得到的值相加以得到AUC的总值。
[0149] 对于每种样品，曲线下面积(AUC)可由线性或对数回归曲线计算，或者由线性和对数回归曲线二者计算。
[0150] SlopeMax可使用与上面讨论的斜率相同的公式来计算。然而，为了确定每种样品的斜率的最大可能值，获得每对连续抗原浓度的斜率值，最大幅度的斜率值表示SlopeMax。
[0151] 对于每种样品，SlopeMax可由线性或对数回归曲线计算，或者由线性和对数回归曲线二者计算。
[0152] 解离常数(Kd)可通过将四参数逻辑斯谛曲线拟合至每组滴定点来计算并且使用公式F(x)＝((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D用
迭代求解方法给出最小渐近线(A)、斜率因子(B)、拐点(C)和最大渐近线(D)参数的值，由此使平方残差(squared residual)的总和最小化。该求解数据的拐点对应于抗原/自身抗体结合的Kd。
[0153] 在某些实施方案中，对于滴定系列中使用的每种抗原量，二次曲线参数可通过将逻辑斯谛曲线(例如4参数逻辑斯谛曲线)拟合至特异性结合的量相对于抗原量的曲线来确定。在这个实施方案中，二次曲线参数可以是最大渐近线、最小渐近线、Hill斜率(或斜率因子)或者拐点。
[0154] 4-参数逻辑斯谛(4PL)曲线是由以下公式定义的曲线：
[0155] F(x)＝((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D，
[0156] 其中A＝最小渐近线，B＝Hill斜率(或斜率因子)，C＝拐点并且D＝最大渐近线。
[0157] 为了确定该
实施例中的二次曲线参数，使用迭代求解函数计算每种样品和抗原的4PL曲线。在此，4个参数设置为接近每个预期值的值，具有以下限制：最小渐近线的值固定为0，Hill斜率的值限制为正值，并且拐点限制为最大值1000。
[0158] 然后可计算滴定曲线的每个点与4PL曲线上的相应点之差值(由公式F(x)＝((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D返回)，对差值进行平方并且对所有平方后的差值进行求和。
[0159] 然后调整用于4二次曲线参数的值，并且以迭代的方式重复计算平方平均值的总和，直到平方平均值的总和尽可能地接近零。迭代求解可使用Microsoft Excel的SOLVER函数来进行。
[0160] 一旦获得了二次曲线参数，就将其与抗原/自身抗体结合数据组合以确定自身抗体的存在或不存在。在此，将自身抗体与抗原之间特异性结合的量与如上所述的预定取舍值进行比较。
[0161] 二次曲线参数的取舍值使用已知的阳性样品(例如，由患有疾病的患者群组组成的病例-对照样品组中的组)和已知的阴性样品(例如，病例-对照研究中的正常个体群组)来确定。对于每个样品，对滴定系列中使用的每种抗原量绘制特异性结合的量相对于抗原量的曲线，并且将在已知的阳性样品(例如，患有疾病的患者)中观察到的二次曲线参数与在已知的阴性样品(例如，正常个体)中观察到的二次曲线参数比较。当与以上讨论的抗原/自身抗体结合的取舍值组合使用时，选择使特异性最大化的二次曲线参数的取舍值(没有假阳性)。
[0162] 在计算二次曲线参数的取舍值时，还确定正读数所要求的方向性，即是高于还是低于取舍值的值被认为是正的。正读数所要求的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
[0163] 如果测量结果既高于抗原/自身抗体结合的取舍值并且与二次曲线参数的取舍值相比又显示正读数所要求的方向性，则其被认为是最终阳性，即表示受试样品中自身抗体的存在。
[0164] 如在WO2015/193678(其内容通过引用并入本文)中进一步描述的，与仅基于受试样品中自身抗体之间特异性结合的量的作为替代的方法相比，在测定方法中包括二次曲线参数提高了免疫测定的特异性，提高了阳性预测值(Positive Predictive Value，PPV)。
[0165] 应理解，虽然本文中包括的双取舍法的描述集中在使用与抗原/自身抗体结合的量的测量结果组合的单个二次曲线参数组合，但是考虑使用多个二次曲线参数。因此，在某些实施方案中，本发明的方法使用二、、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个二次曲线参数。
[0166] 双取舍法在用于临床诊断、预后、预测和/或监测测定上是有利的，其中靶自身抗体存在的绝对量和在靶自身抗体不存在下观察到的结合水平可在患者之间变化巨大。如果这样的测定基于使用单一的受试抗原量/浓度的自身抗体结合检测，则由于测定方法的限制，包含一定量的自身抗体(其处于在整个群体中自身抗体量的正常生理范围的极低或极高端)的患者样品可被略去；自身抗体量低的样品可被评分为假阴性结果，而具有极高水平的那些可离开所选测定方法内的准确检测的范围。使用与二次曲线参数的计算组合的滴定法可解释这些自身抗体水平的差异和所观察到的结合水平的差异。
[0167] 应注意，该双取舍实施方案可与本发明的所有方法一起使用，包括检测自身抗体的方法、检测肝癌的方法、诊断和治疗肝癌的方法、预测对抗肝癌治疗的作出响应的方法以及确定抗体谱的方法。此外，双取舍法可用于其中只检测单一自身抗体的一些实施方案以及其中使用抗原组来检测多种自身抗体的一些实施方案。在这种组实施方案中，应注意，针对组内的每种抗原计算的二次曲线参数不一定相同。然而，在一些实施方案中，针对组内的每种抗原计算的二次曲线参数可相同。
[0168] 测定形式
[0169] 免疫测定(例如ELISA、放射免疫测定等)的一般特点是本领域技术人员公知的(参见Immunoassay，E.Diamandis and T.Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1996，其内容通过引用并入本文)。
[0170] 用于检测具有特定免疫特异性的自身抗体的免疫测定通常需要使用对相关自身抗体表现出特异性免疫反应性的试剂(抗原)。根据测定的形式，可将该抗原固定在固体支持物上。使受试样品与抗原接触，且如果样品中存在所需要的免疫特异性的自身抗体，则它们将与抗原发生免疫反应以形成抗原/自身抗体复合物，其可随后被检测或定量测量。
[0171] 本发明的方法可以以能够使被怀疑包含自身抗体的受试样品与抗原接触的任何合适的形式进行。
[0172] 方便地，如果需要的话，受试样品与抗原之间的接触可发生在允许平行测定不同抗原或不同抗原量的单独反应室(例如，微量滴定板的孔)中。在其中需要不同量抗原的一些实施方案中，可在整个微量滴定板的孔上通过从抗原原液制备系列稀释液将这些包被到微量滴定板的孔上。抗原原液可具有已知或未知的浓度。然后可将受试样品的等分试样添加至板的孔，使受试样品的体积和稀释度在每个孔中保持恒定。添加至微量滴定板的孔的抗原的绝对量可根据例如这样的因素而改变：靶自身抗体的性质、受试样品的性质、受试样品的稀释度等，如本领域技术人员会理解的。通常来说，将选择抗原的量和受试样品的稀释度以产生一定范围的信号强度，这些信号强度落入方法中的抗原/自身抗体结合检测所选择的读出的可接受的检测范围内。方便地，测试的抗原量可在1.6nM至160mM的范围内变化。
[0173] 在本发明的另一个实施方案中，可将抗原固定在固体支持物上的离散位置或反应位点处。在其中需要不同量的抗原的一些实施方案中，可将这些各自固定在固体支持物上的离散位置或反应位点处。然后可使整个支持物与受试样品接触，并且在每个离散位置或反应位点处分别地检测或测量自身抗体与抗原的结合。合适的固体支持物包括微阵列。当需要不同量的抗原时，可通过将不同量的特定抗原固定在阵列上的离散的可分辨的反应位点处来制备微阵列。在另一些实施方案中，固定化抗原分子的实际量可保持基本上恒定，但阵列上的位点或点的尺寸变化以改变可用结合表位的量，提供滴定系列的具有不同量的可用结合表位的位点或点。在这样的一些实施方案中，在制备滴定系列中，抗原上结合表位的二维表面浓度是重要的，而不是抗原的绝对量。用于制备和询问蛋白质/肽微阵列的技术通常是本领域中已知的。
[0174] 微阵列可用于平行地对单个样品进行不同特异性的自身抗体的多个测定。这可使用包含多种抗原或抗原组的阵列来完成。
[0175] 某些抗原可包含或来源于分离自天然来源的蛋白质或多肽，包括但不限于分离自患者组织或体液(例如，血浆、血清、全血、尿、汗、淋巴、粪便、脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、痰、乳头抽吸液、术后血清肿和伤口引流液)的蛋白质或多肽。在这样的一些实施方案中，抗原可包含基本上所有的天然蛋白，即基本上以其分离自天然来源的形式的蛋白质或其可包含天然蛋白的片段。为了在本发明的方法中作为抗原是有效的，任何这样的片段必须保留对使用其来测试的自身抗体的免疫反应性。合适的片段可例如通过经分离的蛋白质的化学或酶促切割来制备。
[0176] 在某些实施方案中，并且根据使用抗原的测定的确切性质，抗原可包括与一种或更多种另外的分子(其赋予蛋白质中天然不存在的一些期望特性)连接的天然蛋白或其片段。例如，蛋白质或片段可与显示标记物(revealing label)(例如
荧光标记物、有色标记物、发
光标记物、放射标记物或重金属(例如，胶体金))缀合。在另一些实施方案中，蛋白质或片段可表达为重组产生的融合蛋白。举例来说，融合蛋白可在N端或C端处包含有助于纯化经重组表达的抗原的标签肽。
[0177] 根据要使用抗原的测定的形式，可将抗原固定在固体支持物(例如芯片、
载玻片、微量滴定板的孔、珠、膜或纳米粒)上。固定化可通过非共价
吸附、共价连接或通过标签来实现。
[0178] 可使用任何合适的连接方式，只要这在显著程度上不有害地影响抗原与靶自身抗体发生免疫反应的能
力。
[0179] 本发明不限于固相测定，但还涵盖全部或部分地在液相中进行的测定，例如溶液相珠测定或竞争测定。
[0180] 在一个实施方案中，抗原可用有利于固定化的配体(例如生物素)标记。然后可以将抗原稀释至合适的滴定范围，并使其与溶液中患者样品中的自身抗体反应。然后可通过配体-受体相互作用(例如，生物素-链霉亲和素)将所得的免疫复合物固定在固体支持物上，并如下所述进行测定的剩余部分。
[0181] 为了便于生产用于本发明测定方法的生物素化抗原，编码全长抗原、其截短形式或其抗原片段的cDNA可表达为用蛋白质或多肽标签标记的融合蛋白，其可例如通过酶促反应与生物素辅助因子连接。
[0182] 用于生产重组生物素化抗原的载体可商购自许多来源。或者，生物素化抗原可通过生物素与表达和纯化后的抗原分子共价连接来生产。
[0183] 如上所述，根据本发明的用于检测自身抗体的免疫测定可基于本领域中已知的标准技术。在一个最优选实施方案中，免疫测定可以是ELISA。ELISA在本领域中通常是公知的。在典型的间接ELISA中，将对测试下的自身抗体具有特异性的抗原固定在固体表面(例如，标准微量滴定测定板的孔、或者微珠或微阵列的表面)上并且使包含待测试自身抗体之存在的体液的样品与固定化抗原接触。样品中存在的具有期望特异性的任何自身抗体会与固定化抗原结合。然后可使用任何合适的方法检测结合的抗原/自身抗体复合物。在一个优选实施方案中，使用经标记的抗人免疫球蛋白抗体二抗(其特异性识别一种或更多种类别的人免疫球蛋白共有的表位)来检测抗原/自身抗体复合物。通常来说，二抗将是抗IgG或抗IgM。二抗通常用可检测标志物(通常是酶标记物，例如过
氧化物酶或
碱性
磷酸酶)标记，允许通过添加产生可检测产物(例如有色产物、
化学发光产物或荧光产物)的酶的底物的定量检测。可以以等同效果使用本领域中已知的其他类型的可检测标签。
[0184] 本发明方法的应用
[0185] 本发明提供了选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原在通过检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中对MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B具有免疫特异性的自身抗体来在所述哺乳动物对象中检测肝癌的方法中的用途，所述方法包括以下步骤：
[0186] (a)使受试样品与选自MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原接触；以及[0187] (b)确定与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的存在或不存在；
[0188] 其中所述复合物的存在指示肝癌的存在。
[0189] 在本发明的该实施方案中，以上所讨论的与本发明的多种方法相关的所有限制被考虑与该用途有关。
[0190] 根据本发明的测定方法可用于多种不同的临床情况。特别地，所述方法可用于检测或诊断肝癌、评估诊断患有肝癌之患者的预后、预测对治疗的响应、监测患者中肝癌的进展、为了诊断肝癌之存在而筛查无症状人对象群、预测肝癌患者对抗肝癌治疗(例如，化学治疗、射频消融术、肝切除术、肝移植、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、经导管动脉化学栓塞术、经皮乙醇注射、微波消融术、索拉非尼施用和放射性栓塞术)的响应、监测肝癌患者对抗肝癌治疗(例如，化学治疗、射频消融术、肝切除术、肝移植、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、经导管动脉化学栓塞术、经皮乙醇注射、微波消融术、索拉非尼施用和放射性栓塞术)的响应、检测先前诊断患有肝癌的患者(其已经进行了抗肝癌治疗以降低肝癌存在的量)中的复发疾病、选择用于特定患者的抗肝癌治疗(例如，化学治疗、射频消融术、肝切除术、肝移植、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、经导管动脉化学栓塞术、经皮乙醇注射、微波消融术、索拉非尼施用和放射性栓塞术)、或在患有或怀疑患有肝癌的患者中确定抗体谱。
[0191] 试剂盒
[0192] 本发明涵盖适用于进行本发明方法中的任一种的试剂盒，其中试剂盒包含：
[0193] (a)一种或更多种肿瘤标志物抗原；和
[0194] (b)能够检测与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的试剂。
[0195] 本发明还包括用于检测包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品中的自身抗体的试剂盒，其包含：
[0196] (a)选自MMP9、AIF1 EpCAM和CDKN1B的肿瘤标志物抗原；
[0197] (b)能够检测与受试样品中存在的自身抗体结合的肿瘤标志物抗原的复合物的试剂。
[0198] 在某些实施方案中，试剂盒还可包含：
[0199] (c)用于使肿瘤标志物抗原与包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品接触的装置。
[0200] 用于使肿瘤标志物抗原与包含来自哺乳动物对象之体液的受试样品接触的装置的实例包括肿瘤标志物抗原在芯片、载玻片、微量滴定板的孔、珠、膜或纳米粒上的固定化。
[0201] 在一些实施方案中，试剂盒内的肿瘤标志物抗原可存在于两种或更多种肿瘤标志物抗原的组中。在该实施方案中，试剂盒可包含二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种、二十四种、二十五种、二十六种、二十七种、二十八种、二十九种、三十种、三十一种、三十二种、三十三种、三十四种、三十五种、三十六种、三十七种、三十八种或更多种的抗原。这些抗原可以是不同的抗原，其中不同的抗原是来源于不同蛋白质或多肽的抗原(例如，来源于由不同基因编码的不相关蛋白质的抗原)或来源于如上所限定的单一蛋白质或多肽的不同肽表位的抗原。
[0202] 在一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。在某个具体实施方案中，组可由MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B组成。
[0203] 在一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含选自以下的一种或更多种肿瘤标志物抗原：NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、雀乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。在该实施方案中，组可包含所记载的肿瘤标志物抗原中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种、二十四种、二十五种、二十六种、二十七种、二十八种、二十九种、三十种、三十一种、三十二种、三十三种或三十四种。根据本发明，组将还包含MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B，并且可包含这些肿瘤标志物抗原中的一种、两种、三种或四种。在其中组中包含这些肿瘤标志物抗原中的两种或三种的一些实施方案中，考虑这些抗原中的两种或三种的所有组合。在一些具体实施方案中，组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。
[0204] 在一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、NY-ESO-1、HSPA4、波形蛋白、HNRNP-L和转铁蛋白。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由MMP9、AIF1、EpCAM、NY-ESO-1、HSPA4、波形蛋白、HNRNP-L和转铁蛋白组成。
[0205] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含AIF1、EpCAM、HSPA4和CPS1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由AIF1、EpCAM、HSPA4和CPS1组成。
[0206] 在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含EpCAM、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2、HSPA4和HNRNP-L。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由EpCAM、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2、HSPA4和HNRNP-L组成。
[0207] 在又一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、DDX3X、SALL4、MAGE A4、NY-ESO-1、CAGE、RalA和SOX2。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由MMP9、AIF1、EpCAM、DDX3X、SALL4、MAGE A4、NY-ESO-1、CAGE、RalA和SOX2组成。
[0208] 在又一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含EpCAM、CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X和NY-ESO-1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由EpCAM、CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X和NY-ESO-1组成。
[0209] 在又一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含AIF1、CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、HSPA4和转铁蛋白。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由AIF1、CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、HSPA4和转铁蛋白组成。
[0210] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。根据本发明，组还将包含MMP9、AIF1、EpCAM或CDKN1B，并且可包含这些肿瘤标志物抗原中的一种、两种、三种或四种。在其中组中包含这些肿瘤标志物抗原中的两种或三种的一些实施方案中，考虑这些抗原中的两种或三种的所有组合。在一些具体实施方案中，组可包含MMP9、AIF1、EpCAM和CDKN1B。例如，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含MMP9、AIF1、EpCAM、CDKN1B、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1。或者，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由MMP9、AIF1、EpCAM、CDKN1B、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA4、转铁蛋白、HNRNP-L、HSPD1、HNRNP-A2、SALL4、周期蛋白B1、AFP、NPM1、YWHAZ、DDX3X、p62、CAGE、MAGE A4、RalA、GBU4-5、SOX2、AKR1B10、ApoA1、BCL2、CD44、CK18、CPS1、FUCA1、GLUL、HSPA2、IL-8、MDM2、PEBP1、催乳素、RGN、SPP1、SSX2和TGFB1组成。
[0211] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X和AIF1。在另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X和AIF1组成。
[0212] 在一个具体实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可包含CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RaIA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X、AIF1、SOX2和AFP。另一个实施方案中，两种或更多种肿瘤标志物抗原的组可由CAGE、NY-ESO-1、MMP9、转铁蛋白、MAGE A4、RalA、HSPA4、SALL4、周期蛋白B1、EpCAM、DDX3X、AIF1 SOX2和AFP组成。
[0213] 本发明的试剂盒可适用于检测肝癌。
[0214] 在某些实施方案中，试剂盒可用于检测肝癌。
[0215] 在本发明的试剂盒中，体液可选自血浆、血清、全血、尿、汗、淋巴、粪便、脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、痰、乳头抽吸液、术后血清肿、唾液、羊水、泪和伤口引流液。
[0216] 将参考以下非限制性实验实施例进一步理解本发明。
[0217] 实施例
[0218] 实施例1-用于测量肿瘤相关蛋白的自身抗体的一般方案
[0219] 按照与WO 99/58978(其内容通过引用并入本文)中所述的那些类似的方法，可通过重组表达制备肿瘤标志物抗原的样品。简而言之，将编码目标标志物抗原的cDNA克隆到经修饰以编码生物素标签和6x组氨酸标签的pET21载体(Invitrogen)中以有助于纯化所表达的蛋白质。使所得的克隆在BL21(DE3)大肠杆菌(E.coli)中生长，随后将细菌裂解。按照制造商的方案，通过镍螯合亲和柱(HiTrap，可商购自GE Healthcare)回收所表达的抗原。储存前，通过SDS-PAGE、Western印迹和蛋白质测定评估所表达的蛋白质的纯度、特异性和收率。
[0220] 通过用空pET21载体(即没有编码肿瘤相关抗原的cDNA)转化BL21(DE3)大肠杆菌产生阴性对
照蛋白VOL。所表达并经纯化的蛋白质包含在重组肿瘤相关抗原上发现的相同的His和生物素标签序列，并且允许校正与残余细菌污染物结合的非特异性自身抗体。
[0221] 许多标志物cDNA的GenBank登录号如下：
[0222] AFP：NM_001134.1
[0223] AIF1：NM_001623.3
[0224] AKR1B10：NM_020299.4.
[0225] APOA1：NM_000039.1.
[0226] BCL2：NM_000633.2
[0227] CAGE：NM_182699
[0228] CALR：NM_004343.3
[0229] CD44：NM_001001389
[0230] CDKN1B：NM_004064.4
[0231] CK18：NM_000224
[0232] CPS1：NM_001875.4
[0233] CCNB1：NM_031966.2
[0234] CYCLIN B1：NM_031966.2
[0235] DDX3X：NM_001356.3
[0236] EpCAM：NM_002354
[0237] FUCA1：NM_000147.4
[0238] GLUL：NM_001033044.2
[0239] HNRNP-A2：NM_002137.3
[0240] HNRNP-L：NM_001533.2
[0241] HSPA2：NM_021979.3.
[0242] HSPA4：NM_002154.3
[0243] HSPD1：NM_002156.4
[0244] IL8：NM_000584.3
[0245] MAGE A4：NM_001011548.1
[0246] MDM2：NM_002392.5
[0247] MMP9：NM_004994.2.
[0248] NPM1：NM_002520.6
[0249] NY-ESO-1：NM 001327
[0250] PEBP1：NM_002567.2
[0251] P62：NM_001007225.1
[0252] 催乳素：NM_000948.5
[0253] RalA：NM_005402.2
[0254] RGN：NM_004683.5
[0255] SALL4：NM_020436.3.
[0256] SOX2：NM_003106
[0257] SPP1：NM_001040058.1
[0258] SSX2：NM_175698.1
[0259] TGFB1：NM_000660.5
[0260] 转铁蛋白：NM_001063.3
[0261] 波形蛋白：NM_003380.3
[0262] YWHAZ：NM_001135699.1
[0263] 将抗原和VOL(阴性对照)在高
磷酸盐结合缓冲液中稀释至适当浓度，然后稀释以提供任两种单独的蛋白质浓度，如在高通量测定(high throughput assay，HTPA)形式中(图2A)；或半对数滴定范围，如在滴定测定形式中(图2B)。使用自动液体处理系统根据板布局将抗原稀释液以50μl/孔分配到Falcon微量滴定板的排中(图2A和图2B)。
覆盖板并在18至22℃下保存18至24小时。
[0264] 用猪皮明胶结合缓冲液(PSGBB，PBS+0.1％猪皮明胶+0.05％叠氮化钠)以200μl/孔封闭板1小时。将血清样品解冻，涡旋并在18至22℃下在PSGBB中以1/110稀释。将对板进行抽出并在卫生纸上拍干。使用自动液体处理仪器将每个经稀释的血清样品以50μl/孔分配到微量滴定板的所有孔中。覆盖板并在室温下摇动孵育1.5小时。
[0265] 洗涤步骤：使用自动洗板机将板在PBS+0.1％吐温20中洗涤三次，然后在卫生纸上拍干。
[0266] 将辣根过氧化物酶缀合的兔抗人免疫球蛋白(Dako，在PSGBB中1/5,000)以50μl/孔分配到微量滴定板的所有孔中。然后将板在室温下摇动孵育1小时。如上所述，洗涤板。
[0267] 将预制备的TMB底物以50μl/孔添加至各板，并在实验台上孵育15分钟。轻拍板以混合。使用标准分光光度计读板机在650nm处测定每个孔的光密度。
[0268] 实施例2-通过HTPA在肝细胞癌(HCC)中检测自身抗体
[0269] 以下数据从评估在使用HTPA形式的HCC检测中自身抗体测定的组的灵敏度和特异性的预备研究中获得。研究中包括的受试者的临床和人口统计状况在表1至4中给出。
[0270] 表1-实施例2中所述的研究中包括的患者的人口统计状况
[0271]
[0272]
[0273] 表2-HCC患者中存在的原发性肿瘤的尺寸
[0274] 可用患者的数量 平均值 最小值-最大值
原发性肿瘤尺寸(cm) 88 5.9 0.4-19
[0275] 表3-使用TNM分期的HCC患者的肿瘤分期
[0276]TNM分期 数目
1 35
2 21
3 21
4 2
N/A 20
[0277] TNM＝
恶性肿瘤分期系统的TNM分类；N/A＝不可得
[0278] 表4-良性肝病患者中存在的肝疾病。
[0279]良性背景 数目
丙型肝炎
病毒感染 67
乙型肝炎病毒感染 22
酒精性肝病 6
自身免疫性肝炎 2
血色素沉着病 1
原发性胆汁性肝硬化 1
总计 99
[0280] 根据实施例1中给出的方案使用表5中列出的抗原进行测定。通过选择给出最大约登值同时保持个体标志物特异性大于90％的取舍值确定测定取舍值。结果示于表5中，显然，大量的这些自身抗体标志物在患有HCC的患者中显示出比患有良性肝病的患者或健康对照更高的阳性水平，因此它们可具有区分HCC患者与没有恶性证据之患者的能力。
[0281] 此外，显然，与任何仅单一AAb相比，AAb组的测量提高了区分HCC患者与患有非癌性肝疾病之患者的能力。组1和组2(表6和表10)示出了如何可组合不同组的AAb以实现相似的性能同时优化某些特性以适应不同的临床需求。组1(表6)包含对所有患者可用的标志物。与组1相比，如组2中(表10)，通过性别优化组中包含的标志物提高了特异性，而灵敏度略有降低。这证明了建立适应不同临床需求的不同组的能力。表7和表11示出了每个组可检测患有1期和2期癌症的患者，这是导致HCC有效治疗的至关重要的早期诊断。
[0282] 表5-在每个组中个体AAb标志物的阳性
[0283]
[0284]
[0285] 组1-一般组
[0286] 组1是使用NRI(净重分类改进，Net Reclassification Improvement)形成的并且包含肿瘤标志物抗原EpCAM、AIF1和MMP9以及NY-ESO-1、HSPA4、波形蛋白、HNRNP-L和转铁蛋白，其中如果任一给出的AAb水平高于如实施例2中所述产生的其取舍值，则结果是阳性。表6和表7示出了在实施例2中所述的样品组中该组的性能。
[0287] 表6-组1的性能和组成
[0288]
[0289]
[0290] 表7-组1的按TNM分期的性能
[0291]分期 阳性 阴性 灵敏度
1 8 27 23
2 4 17 19
3 8 13 38
4 0 2 0
[0292] 组2-男性和女性的个体组
[0293] 组2是通过将实施例2中所述的样品组分成单独的性别组并对每个组进行单独的NRI而形成的。组2包含肿瘤标志物抗原EpCAM、AIF1和MMP9以及HSPA4、CPS1、NY-ESO-1、波形蛋白、HSPA2和HNRNP-L。如果患者是女性并且HSPA4、AIF1、EpCAM或CPS1中的任一种高于如实施例2中所述产生的取舍值，或者如果患者是男性并且NY-ESO-1、波形蛋白、EpCAM、HSPA2、HSPA4或HNRNP-L中的任一种高于如实施例2中所述产生的取舍值，则结果是阳性。表10和表11示出了在实施例2中所述的样品组中组2的性能。
[0294] 表8-组2a的性能和组成-女性
[0295]
[0296] 表9-组2b的性能和组成-男性
[0297]
[0298] 表10-组2的性能和组成-组合的
[0299]组2 灵敏度(％) 特异性(良性)(％) 特异性(正常)(％)
2a+2b 24.2 98 94.9
[0300] 表11-组2的按TNM分期的性能
[0301]分期 阳性 阴性 灵敏度(％)
1 6 29 17.1
2 4 17 19
3 6 15 28.6
4 0 2 0
[0302] 实施例3-通过HTPA测量的与自身抗体组合的AFP的另外测量
[0303] 使用可商购的ELISA(Aviva Systems Biology)针对实施例2中所述的样品组在血清样品中测量循环甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)。使用200ng/ml的常用取舍值以评估阳性。表12示出了将AFP添加至实施例2中所示组1和组2的结果。从这些结果，清楚的是，与AAb组组合的AFP的性能大于仅AFP或AAb组的性能。
[0304] 表12-仅AFP和当被添加至实施例2中所述的组时的性能
[0305]
[0306]
[0307] 实施例4-通过滴定测定在肝细胞癌(HCC)中检测自身抗体
[0308] 以下数据从在使用滴定板形式评估HCC检测中自身抗体测定组的灵敏度和特异性的研究中获得(图2B)。研究中包括的受试者的临床和人口统计状况在表13至表16中给出。
[0309] 表13-实施例2中所述的研究包括的患者的人口统计状况
[0310]人口统计因素 HCC患者 良性肝病患者 没有恶性证据的个体
数量 98 99 95
平均年龄 62.6 50.7 62.7
年龄范围 30-91 30-82 30-84
男性％ 69 69 68
[0311] 表14-HCC患者中存在的原发性肿瘤的尺寸
[0312] 可用患者数量 平均值 最小值-最大值
原发性肿瘤尺寸(cm) 86 6.02 0.4-19
[0313] 表15-使用TNM分期的HCC患者的肿瘤分期
[0314]TNM分期 数目
1 35
2 20
3 21
4 2
N/A 20
[0315] N/A＝不可得
[0316] 表16-良性肝病患者中存在的肝疾病
[0317]良性背景 数目
丙型肝炎病毒感染 58
乙型肝炎病毒感染 31
酒精性肝病 6
自身免疫性肝炎 2
血色素沉着病 1
原发性胆汁性肝硬化 1
总计 99
[0318] 根据实施例1中给出的方案使用表17中列出的抗原进行测定。通过选择给出最大约登值同时保持个体标志物特异性大于90％的取舍值确定测定取舍值。结果示于表17中，显然，这些自身抗体标志物中的一些在患有HCC的患者中显示比患有良性肝病的患者或健康对照更高的阳性水平，因此它们可具有区分HCC与没有恶性疾病证据之患者的能力。在实施例2中所示的研究中发现显示出癌症/正常差异的AAb继续显示出区分HCC患者与患有非癌性肝疾病之患者(良性)和健康对照(正常)的能力。此外，显然，与任何仅单一标志物相比，组的测量再次提高了区分HCC患者的能力。
[0319] 组3(表18)和组4(表22)示出了如何可组合不同组的标志物以实现相似的性能同时优化某些特性以适应不同的临床需求。组3包含可用于所有患者的标志物，而组4按照性别
指定了不同标志物，这提高了特异性同时保持灵敏度(表20和表21)。这证明了建立适应不同临床需求的不同组的能力。每个实施例组都可检测患有1期和2期癌症的患者，这对于早期诊断并因此有效治疗HCC是至关重要的(表19和表23)。
[0320] 表17-在每组中个体AAb标志物的阳性
[0321]
[0322]
[0323] 组3
[0324] 组3是使用NRI形成的并且包含肿瘤标志物抗原EpCAM、AIF1和MMP9以及DDX3X、SALL4、MAGE A4、NY-ESO-1、CAGE、RalA和SOX2，其中如果给出的AAb水平中的任一种高于如实施例4中所述产生的其取舍值，则结果是阳性。表18和表19示出了在实施例4中所述的样品组中该组的性能。
[0325] 表18-组3的性能和组成
[0326]
[0327] 表19-组3的按TNM分期的性能
[0328]分期 阳性 阴性 灵敏度(％)
1 10 25 28.6
2 8 12 40
3 8 13 38
4 1 1 100
[0329] 组4-男性和女性的个体组
[0330] 组4是通过将实施例2中所述的样品组分成单独的性别组并对每个组进行单独的NRI形成的。组4包含肿瘤标志物抗原EpCAM和AIF1以及CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X、NY-ESO-1、HSPD1、SALL4、HSPA4和转铁蛋白。如果患者是女性并且CAGE、HSPD1、SOX2、SALL4、AIF1、HSPA4或转铁蛋白中的任一种高于如实施例4中所述产生的取舍值，或者如果患者是男性并且CAGE、SOX2、RalA、MAGE A4、DDX3X、NY-ESO-1或EpCAM中的任一种高于如实施例4中所述产生的取舍值，则结果是阳性。表10和表11示出了在实施例4中所述的样品组中组4的性能。
[0331] 表20-组4a的性能和组成-男性
[0332]
[0333] 表21-组4b的性能和组成-女性
[0334]
[0335] 表22-组4的性能和组成-组合的
[0336] 灵敏度(％) 特异性(良性)(％) 特异性(正常)(％)
4a+4b 37 93.8 87.4
[0337] 表23-组4的按TNM分期的性能
[0338]分期 阳性 阴性 灵敏度(％)
1 12 23 34.3
2 7 13 35
3 7 14 30
4 1 1 50
[0339] 实施例5-通过滴定测定测量的与自身抗体组合的AFP的另外测量
[0340] 使用可商购的ELISA(Aviva Systems Biology)针对实施例4中所述的样品组在血清样品中测量循环甲胎蛋白(AFP)。使用200ng/ml的常用取舍值以评估阳性。表24示出了将AFP添加到实施例4中所示的组3和组4中的结果。从这些结果，清楚的是，与AAb组组合的AFP的性能大于仅AFP或AAb组的性能。
[0341] 表24-仅AFP和当被添加至实施例4中所述组时的性能
[0342]
[0343] 实施例6-EarlyCDT-Liver LDT的设计和开发的训练研究
[0344] 以下数据从评估在使用滴定板形式的HCC检测中自身抗体测定的组的灵敏度和特异性的研究中获得(图2B)。受试者的人口统计状况和良性群组的硬化状态在表25至表26中给出，与先前实施例中使用不同的群组。
[0345] 表25-实施例6中使用的患者群组的人口统计学状况
[0346]
[0347] 表26-良性群组患者的硬化状态
[0348]
[0349]
[0350] 根据实施例1中给出的方案使用表27中列出的抗原进行测定。通过使用将特异性限制为＞85％的蒙特卡洛直接搜索法(Monte Carlo direct search method)确定每个标志物的取舍值。结果示于表27中，显然，这些自身抗体标志物中的一些在患有HCC的患者中显示出比良性或正常群组中更高的阳性水平，因此它们具有区分HCC与没有恶性疾病证据之患者的能力。在实施例2中所示的研究中发现显示出癌症/正常差异的AAb继续显示出区分HCC患者与患有非癌性肝疾病之患者(良性)和健康对照(正常)的能力。此外，显然，与任何仅单一标志物相比，组的测量再次提高了区分HCC患者的能力。组可检测患有1期和2期癌症的患者(灵敏度为40-45％)，这对于早期诊断并因此有效治疗HCC的至关重要的(表28)。
[0351] 表27-在每组中个体AAb标志物的阳性
[0352]
[0353]
[0354] 表28-按HCC群组分期的AAb组的性能：按分期和所得灵敏度的患者数目(n)[0355]分期 n 阳性 灵敏度(％)
BCLC 0 1 0 0.0
BCLC A 30 12 40.0
BCLC B 71 32 45.1
BCLC C 28 19 67.9
BCLC D 8 5 62.5
未知 31 10 32.3
[0356] BCLC＝巴塞罗那临床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)
[0357] 分期系统
[0358] 使用可商购的ELISA(Monobind)对实施例6中所述的样品组在血清样品中测量循环甲胎蛋白(AFP)。在表29中使用200ng/ml的常用取舍值评估按分期分开的阳性。AFP抗原灵敏度随着该群组的分期而提高，早期疾病的灵敏度远低于晚期疾病。还值得注意的是，与该实施例的AAb组相比，AFP抗原对早期疾病的灵敏度低得多，然而晚期性能相似。
[0359] 表29-按HCC群组分期的AFP抗原的性能：按分期和所得灵敏度的患者数目(n)[0360]
[0361]
[0362] 通过将AFP抗原与AAb组结果组合(表30)可提高实施例6中的HCC群组的阳性和灵敏度，提高了早期和晚期疾病的灵敏度。从这些结果，清楚的是与AAb组组合的AFP的性能比仅AFP或AAb组的性能更大(表31)，将AAb组与AFP组合对特异性具有最小的影响。
[0363] 表30-按HCC群组分期的AAb组+AFP抗原的性能：按分期和所得灵敏度的患者数目(n)
[0364]分期 n 阳性 灵敏度(％)
BCLC 0 1 0 0.0
BCLC A 30 13 43.0
BCLC B 71 42 59.2
BCLC C 28 25 89.3
BCLC D 8 6 75.0
未知 31 11 35.5
[0365] 表31-仅AFP和当添加至实施例6中所述的AAb组时的性能
[0366]标记物组合 灵敏度 特异性(良性) 特异性(正常)
AAb组 46.2 87.0 86.4
AFP抗原 30.8 99.5 100.0
AAb组+AFP抗原 57.4 86.4 86.4
