基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗
阅读：982发布：2020-05-12
专利汇可以提供基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊 酵母 细胞的乙肝 治疗 疫苗 ，以重组汉逊酵母胞内表达的HBsAgVLP和和HBcAgVLP为 抗原 ，重组汉逊酵母表达的HBsAg的 氨 基酸序列中共含有19个CTL表位。重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列中共含有19个CTL表位，以热失活全重组汉逊酵母细胞为佐剂。热失活全重组汉逊酵母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)Dectin‑1受体的高效激动剂。HBV特异性CTL细胞，靶向感染HBV的 肝细胞 释放IFN‑γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了过程中损伤受HBV感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。，下面是基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗专利的具体信息内容。
1.基于表达HBsAg和HBcAg的全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，所述乙肝治疗疫苗包括HBsAg和HBcAg，其特征在于：所述重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述重组汉逊酵母表达HBcAg的DNA序列为SEQ ID NO：3所示，含有15-21个HBcAg特异性CTL表位；所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组汉逊酵母细胞内HBsAg表达量为每108细胞中含有6-10μg HBsAg，所述HBsAg共含有16-21个HBsAg特异性CTL表位；将热失活的所述全重组汉逊酵母细胞作为佐剂，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株为HS604-5，所述的重组汉逊酵母表达HBcAg的工程菌株为HBC-40-25，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株构建方法包括：
1)将构建的基于SEQ ID NO：1所示序列的质粒，电转化宿主细胞URA3-营养缺陷型汉逊酵母细胞株HU-11(CGMCC No.1218)，在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子；
2)挑选菌体生长速度快的菌落，应用半定量PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝数多的菌落，连续传代培养筛选20～400个世代；
3)经过步骤2)传代培养筛选多拷贝异源整合转化克隆株，采用甲醇诱导培养72小时后，放免分析测定转化株细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平；
4)将经过步骤3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株，采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数；
5)在步骤4)的检测结果基础上，选择30升发酵遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg菌株作为工程菌的原代菌株HS604-5；
所述重组汉逊酵母表达HBcAg的工程菌株HBC-40-25构建方法与重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株HS604-5构建方法相同，构建工程菌株HBC-40-25采用的质粒为构建的基于SEQ ID NO：3所示序列的质粒。
2.如权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9～12个形成二硫键，所述重组汉逊酵母表达的HBcAg为病毒样颗粒结构。
3.根据权利要求1所述乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。
4.根据权利要求1所述乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBcAg共含有如下19个CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIR DLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。
5.根据权利要求1所述乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为CGMCC No.1218，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：5所示。
6.根据权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型为注射液剂或冻干粉针剂。
7.根据权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型为预充式注射液剂。
8.根据权利要求1所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于还含有HBsAg原液、HBcAg原液和铝佐剂。
9.一种重组多形汉逊酵母菌，其特征在于所述的重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ ID NO:1所示DNA序列。
10.根据权利要求9所述的重组多形汉逊酵母菌，其特征在于在所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:1所示DNA序列。
11.一种重组多形汉逊酵母菌，其特征在于所述的重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ ID NO:3所示DNA序列。
12.根据权利要求11所述的重组多形汉逊酵母菌，其特征在于在所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:3所示DNA序列。
基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝
技术领域
[0001] 本发明属基因工程领域,涉及疫苗为热失活全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg和HBcAg治疗乙肝疫苗。
背景技术
[0002] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世界卫生组织(World Health Oganization,WHO)报道,全球60亿人口中，约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)。全球肝癌患者中，75％以上是由HBV所致。我国属HBV感染地方性流行区。我国卫生部于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。2001年12月国务院正式批准将乙型肝炎疫苗纳入儿童计划免疫,要求各省市自治区从2002年起,除收取少量手续费外,给所有新生儿免费接种乙型肝炎疫苗。按照2005年3月制订的计划免疫条例,自2005年6月1日起,所有新生儿乙型肝炎疫苗免疫完全免费。经过近15年的努力,我国一般人群,尤其是15岁以下儿童,乙型肝炎病毒感染率明显下降。据2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明,全人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率己由1992年9.75％降至7.18％,5岁以下儿童的乙型肝炎表面抗原携带率已由原来9.67％降至0.96％。据此推算,我国现有的慢性HBV感染者约9300万人,其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡30余万例,新发乙型肝炎病例50万-100万例。因此,本病是我国当前和今后相当长时期内危害人民健康、阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素,是一个严重的公共卫生问题,也是我国在建立以人为本的和谐社会过程中,需要优先解决的一个重大健康问题。我国人群HBV感染的流行率高,给国家带来了沉重的经济负担。据调查.我国每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和间接医疗费用约6800亿元。乙肝疫苗免疫预防与治疗是降低疾病负担最有效的方法。
[0003] 基因重组技术是现代生物技术的核心技术；也是规模化生产乙肝疫苗主要组份——病毒样颗粒乙肝表面抗原(HBsAg VLP)的唯一技术。本专利权人从1995年开始从事汉逊酵母重组乙肝疫苗研发工作。1998-2002年在大连高新生物制药有限公司，主持开发的汉逊酵母重组HBsAg adw2乙肝疫苗，HBsAg VLP抗原纯品(原液)产率为40mg/升；于2002年起经国家审批上市。2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公司协议开发的重组汉逊酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗。其HBsAg VLP抗原纯品(原液)产率为85mg/升以上；已于2015年申报国家新药审评，以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为CN104232661A。
[0004] 根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下：人感染HBV后,一般可分为免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。免疫耐受期的特点是HBV复制活跃,血清HBsAg和HBeAg阳性,HBV DNA滴度较高(＞105拷贝/ml),血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常,肝5
组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度＞10拷贝/ml,但一般低于免疫耐受期,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高,肝组织学有坏死炎症等表现。非活动或低(非)复制期表现为HBeAg阴性,抗-HBe阳性,HBV DNA检测不到(PCR)法或低于检测下限,水平正常,肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV,一般无免疫耐受期,一开始即为免疫清除期,表现为急性乙型肝炎,其中仅5％-10％发展成慢性。但其确切的发病机制仍不了解。
组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度＞10拷贝/ml,但一般低于免疫耐受期,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高,肝组织学有坏死炎症等表现。非活动或低(非)复制期表现为HBeAg阴性,抗-HBe阳性,HBV DNA检测不到(PCR)法或低于检测下限,水平正常,肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV,一般无免疫耐受期,一开始即为免疫清除期,表现为急性乙型肝炎,其中仅5％-10％发展成慢性。但其确切的发病机制仍不了解。
[0005] 抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治疗手段。目前抗乙型肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调节剂和针对HBV DNA多聚酶的核苷酸类似物两大类,虽有一定疗效,但尚不满意,多数患者不能被治愈。干扰素虽可使少数患者HBsAg消失或血清学转化,但费用较高,需要注射,且有一定副作用；核苷酸类似物则作用于HBV DNA聚合酶,只能抑制病毒复制,不能彻底清除HBV和cccDNA,且长期应用易导致病毒耐药变异。
[0006] 因此,为了彻底清除HBV和cccDNA，亟待开发新的更有效的HBV治疗乙肝疫苗。人体肝脏为一免疫耐受器官；肝脏移植免疫排斥反应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒(HBV)感染人的部位为肝脏；因此对HBV的免疫耐受为其主要特征。逆转HBV免疫耐受是开发慢性乙型肝炎患者(CHB)免疫治疗疫苗的立足点。HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部anti-HBV免疫应答不能有效清除病毒，导致持续感染；也体现在HBV持续存在，进而诱导全身性免疫系统对HBV无应答，如HBV耐受期病人对HBsAg疫苗无应答。这也是当前治疗性疫苗在CHB病人中难以成功的主要原因。肝脏诱导的免疫耐受及其逆转机制研究将为研制治疗乙肝疫苗提供了理论依据。
[0007] 2005年Bowen提出：肝内的免疫环境与诱导耐受性相关，但仍保持了维持对病原体有效反应的能力。这种二分法的机制尚不清楚。最近的数据表明，初始CD8+T(CTL)细胞活化在肝脏内发生，同时肝脏预先有炎症(即天然免疫活化)；则存活的CTLs增多，CTLs更有效，导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV；而在预先肝脏无炎症(即天然免疫未活化，如婴幼儿时)，则CTL功能受损和CTL半寿命短，导致肝脏对HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫诱导高效的主要激活HBV CTLs存在于肝脏外的淋巴结内，然后再进入肝脏，则也使存活的CTLs增多，CTLs更有效，也导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。这一关于两个部位的免疫机制为研制皮下、肌肉注射治疗乙肝疫苗，导致肝脏免疫应答、清除感染的HBV提供了理论依据。
[0008] 2014年美国Thomas H.King报道：“A Whole Recombinant Yeast-Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated,whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease-related antigens”；为一种由热失活、全重组酿酒酵母细胞-表达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研究开创了以胞内重组表达蛋白为抗原，以酿酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在此平台下已有编号为GS4774为乙型肝炎治疗性疫苗，其他表达的HBV抗原为一种作为融合蛋白的x-s-core抗原。这一酵母载体可以提供多种抗原进入MHC I类和II类抗原提呈途径，刺激强有力的CD4+和CD8+细胞反应，并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该酵母载体也不容易在体内被中和，因此适合于重复用药，使之获得长期的免疫压力，理想地清除慢性细胞内感染，如HCV和HBV。
[0009] 2010年Huang报道：啤酒酵母细胞壁纯化而得的β-葡聚糖颗粒(GPS)，其中具有1,3-D-glucan聚合物>85％，2％甲壳素，1％脂类和蛋白质，与其余的大部分是灰和水分。进行的体外T细胞增殖实验中，将卵清蛋白(OVA)复合至空心GPS壳内(GP-OVA)组成的疫苗，并采用游离OVA为对照抗原。GPS-OVA在从0.03到0.5μ克/毫升的浓度范围内，刺激OT-I或OT-II T细胞增殖；相反，游离OVA未能刺激OT-I或OT-II T细胞性增殖。为了实现GP-OVA相似的刺激效应，要求游离OVA浓度提高百倍至数百倍。这些结果表明：(1)病毒样颗粒GPS是Dectin-
1受体的高效激动剂；(2)病毒样颗粒GP-OVA传递的抗原与游离OVA抗原相比，能被DCs(树突细胞)更高效地处理和提呈。
1受体的高效激动剂；(2)病毒样颗粒GP-OVA传递的抗原与游离OVA抗原相比，能被DCs(树突细胞)更高效地处理和提呈。
[0010] 2003-2005年期间美国科学家报道了：乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果。控制疾病的机制是肝细胞核HBV池的共价闭合环状DNA(cccDNA)。由于产生IFN-γ的HBV特异性CD8+T，即CTL细胞，大量涌入肝内，靶向感染HBV的肝细胞；对cccDNA的清除、肝细胞感染HBV逆转都与肝脏CD8+T细胞产生的IFN-γ涌入等相关。集合这些结果表明，cccDNA的清除是一个由细胞免疫反应介导的两步的过程：第一步非细胞损伤地减少90％以上cccDNA分子池，从而消除HBV松弛的环状脱氧核糖核酸的前体。第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细胞，并触发免疫逆转。
[0011] 2014年中国科技大学博士曾筑天报道：通过水动力法建立了HBV持续携带小鼠来模拟HBV慢性感染者的免疫耐受状态，发现IL-12预处理与IL-12同HBsAg VLP疫苗共注射的联合治疗方式,称为基于IL-12的疫苗疗法,可以有效逆转HBV系统性免疫耐受,进而导致HBV清除。发现HBV小鼠经历过基于IL-12的疫苗疗法之后,淋巴结内滤泡样辅助T细胞(Tfh)以及生发中心B细胞(GC B)都发生显著扩增,与之相对应地,脾细胞中HBsAg特异性IgG生成细胞也显著增加,大部分小鼠在治疗后期血清中出现保护性抗体anti-HBs；此外,T细胞体外对HBsAg刺激的增殖能力在IL-12联合疫苗治疗之后也得到显著恢复。这些结果充分证实HBV耐受小鼠在IL-12联合治疗过程中,对外周HBsAg疫苗的应答得以恢复,从而提示HBV诱导的系统性免疫耐受已被逆转。基于现有技术文献可以得出提供一种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗成为现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
[0012] 为解决前述技术问题，提供一种具有更好疗效的乙肝治疗疫苗，本发明采用的技术方案为：
[0013] 提供一种基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，其特征在于：所述乙肝治疗疫苗以重组汉逊酵母细胞内表达的HBsAg及HBcAg为抗原；含有19个HBsAg特异性CTL表位和19个HBcAg特异性CTL表位；所述乙肝治疗疫苗以热灭全重组汉逊酵母细为佐剂。
[0014] 所述乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示；所述重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0015] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征是所述重组汉逊酵母表达HBcAg的DNA序列为SEQ ID NO：3所示；所述重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0016] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为病毒样颗粒结构，由HBsAg插入汉逊酵母类脂组成，所述HBsAg的14个半胱酸中有9～12个形成二硫键；所述重组汉逊酵母表达的HBcAg为病毒样颗粒结构。
[0017] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于的热失活重组汉逊酵母的热失活条件为：热失活温度52℃-56℃，热失活时间1小时-3小时。
[0018] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBsAg共含有如下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。
[0019] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述重组汉逊酵母表达的HBcAg共含有如下19个CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。
[0020] 所述的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述乙肝治疗疫苗的剂型选自预充式注射液剂、注射液剂或冻干粉针剂。
[0022] 本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌，所述的重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ ID NO:1所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:1所示DNA序列。
[0023] 本发明还提供了一种重组多形汉逊酵母菌一种重组汉逊酵母菌，所述的重组多形汉逊酵母菌中含有SEQ ID NO:3所示DNA序列。优选所述的重组多形汉逊酵母菌的基因组中整合有SEQ ID NO:3所示DNA序列。
[0024] 以上任一所述重组汉逊酵母的宿主多形汉逊酵母细胞株为HU-11，保藏编号为CGMCC No.1218，所述宿主多形汉逊酵母的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被破坏的DNA序列如SEQ ID NO：5所示。
[0025] 本发明提供的乙肝治疗疫苗，在一种每108细胞中含有6-10μg HBsAg的重组汉逊酵母菌基础上，可以在现有的作为佐剂的全重组汉逊酵母细胞的人体注射上限范围内，最大限度提高HBsAg的注射量，提高其扭转乙肝患者免疫耐受状态的效果。失活全重组汉逊酵母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)的Dectin-1受体的高效激动剂。HBsAg特异性CTL细胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN-γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。同时我们提供的重组汉逊酵母细胞表达的作为抗原的HBsAg中至少含有19个CTL表位，可以提高HBsAg的免疫原性和反应性。在优选的技术方案中的通过优选表达HBsAg的DNA序列(SEQ ID NO：1)，优选了21个CTL中的19个CTL表位，进一步提高了优选HBsAg的免疫原性和反应性。
[0026] 同时采用了能够产生HBcAg重组汉逊酵母热失活细胞与产生HBsAg的重组汉逊酵母的热失活细胞进行配伍，采用的HBcAg(高免疫反应活性)优选码基因与C2基因型、亚型双代表序列AF100309.1比较；缺失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸。根据冷冻电镜图像重建技术确定HBcAg颗粒结构；显示HBcAg二聚体各包含4条α螺旋,即每个HBcAg亚基通过两个长α螺旋形成二聚体界面；其中位于第51～78位氨基酸的长α螺旋,头尾被第50和79位保守的Pro所限制。深埋在二聚体内部，不存在CTL表位。α螺旋即所谓的3.6螺旋,其中每个氨基酸旋转100°，3.6个氨基酸旋转360°原来的51～78位共18个氨基酸形成旋转5周的α螺旋；缺失59-69位：ILCWGELMNLA共11个氨基酸后，剩余的7个氨基酸形成旋转2周的α螺旋。而另一个形成HBcAg二聚体界面的长α螺旋，即位于第82-110位的纽结状α螺旋,终止于第111位Gly没有任何改变。因此本专利基本未改变两个长α螺旋形成二聚体界面,上述缺失11个氨基酸的HBcAg在重组汉逊酵母细胞中仍能组装成病毒样颗粒(VLP)；仍保持其热稳定性。免疫反应检测结果表明：上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(HC-40-25，172个氨基酸)与全长氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(183个氨基酸)HC-43相比：前者免疫反应原性为后者的三倍以上。在优选了CTL表位、表达序列及重组汉逊酵母工程菌株的基础上，本发明还优选了重组汉逊酵母细胞的热失活工艺，保证了疫苗的疗效与安全性。
[0028] 图1为质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图；
[0029] 图2为pMPT-HBC质粒的物理图谱；
[0030] 图3为筛选得到工程菌株HS604-5的PCR扩增产物电泳照片；
[0031] 图4为重组汉逊酵母得到的重组HBsAg的纯品(原液)的电镜照片；
具体实施方式
[0033] 汉逊酵母胞内质粒pMPT-02的开发：
[0034] 汉逊酵母表达系统包括两个主要元件：
[0035] (1)启动外源基因高效表达的载体系统(质粒)；(2)具有特定筛选标记的宿主细胞。
[0036] 应用基因合成技术，将汉逊酵母MOX(甲醇氧化酶)启动子1.5kb、汉逊酵母MOX(甲醇氧化酶)终止子350bp、汉逊酵母自主复制序列HARS，1.0kb、和酿酒酵母脲嘧啶基因ScURA31.1kb；将以上5部分基因元件紧密相连后，再插入pBluescripⅡ质粒中，构建成穿梭质粒pMPT-02。为本申请人的非独占专有技术。
[0038] 利用同源序列介导的同源整合构建了乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的重组多形汉逊酵母菌株HU-11(CGMCC No.1218)。该菌株与目前国内外所用由诱变产生的营养缺陷型宿主菌株相比，具有遗传稳定性高，回复突变率低的特点；便于进行遗传转化和重组菌株的筛选，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重组菌株培养和外源蛋白的高效表达，具有较高的工业应用价值。汉逊酵母基因被破坏宿主菌HU11株URA3基因的DNA测序结果表明：基因被破坏结果导致第31位碱基后，插入GAAGT五个碱基。GAAGT五个碱基的插入产生移码突变。移码突变导致第11位后的254个密码子全部被置换。GAAGT五个碱基同时产生回复突变的概率极小，实验检测也证明宿主菌HU11株的回复突变率为零；这种-“0”回复突变率的宿主菌对转化筛选特别有利。应用上述基因敲除技术建立的URA3营养缺陷型宿主细胞株HU-11(CGMCC No.1218)本专利权人已申请的发明专利为CN1651570A。宿主汉逊酵母菌HU-11乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的DNA序列为SEQ ID NO：5。
[0039] 重组汉逊酵母HBsAg-adw2优选码基因设计：
[0040] 本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝表面抗原(HBsAg)的DNA序列基于HBsAg adw2亚型设计，如SEQ ID NO：1所示，所述HBsAg的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0041] 本发明提供的重组汉逊酵母表达乙肝核心抗原(HBcAg)的DNA序列如如SEQ ID NO：3所示，所述HBcAg的氨基酸序列为SEQ ID NO：4
[0042] 汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw和pMPT-HBC的构建：
[0043] 按照SEQ ID NO：1所示序列的合成核苷酸序列(以下简称HBsAg adw2基因)；并构建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌；测序正确后的质粒用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切产物切胶回收701bp的目的片段DNA。
[0044] 将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，切胶回收后所得到的载体DNA连接后得到汉逊酵母胞内型质粒pMPT-HBS-adw，将质粒pMPT-HBS-adw热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切结果表明均为阳性克隆。测序证明质粒pMPT-HBS-adw结果正确。
[0045] HBsAg adw2基因插入汉逊酵母表达系统胞内型质粒pMPT-02的多克隆位点:EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间。质粒pMPT-HBS-adw全长为7665bp。质粒pMPT-HBS-adw的构建过程示意图如图1所示。
[0046] 按照与构建质粒pMPT-HBS-adw同样的的方法，构建基于SEQ ID NO：3所示序列的质粒pMPT-HBC。pMPT-HBC质粒的物理图谱如图2所示。
[0047] 重组汉逊酵母HBsAg工程菌株和重组汉逊酵母HBcAg工程菌株的构建：
[0048] 为了构建重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)工程菌株，应用申请人开发的细胞电穿孔技术，经RC脉冲:幅度1500V,电容22μf,时间常数3-5ms电击1次，采用pMPT-HBS-adw质粒，转化已敲除URA3-基因的HU-11株(CGMCC No.1218)的汉逊酵母细胞。在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。经过对一千余株转化子单菌落进行如下三步筛选：
[0049] (1)转化子单菌落大、细胞生长快的克隆株为多拷贝的机率大。
[0050] (2)应用PCR技术对比HBsAg基因和单拷贝数MOX(甲醇氧化酶)基因的电泳条带亮度，半定量地确定HBsAg基因拷贝数。
[0051] (3)检测经甲醇诱导、摇瓶培养72小时的转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平。
[0052] 将PCR技术应用于转化子筛选为本申请的一项新创造；对确定外源基因HBsAg多拷贝、异源整合在汉逊酵母染色体中，而汉逊酵母染色体中MOX基因完整存在，未被破坏，都具有重要作用；它们体现了汉逊酵母表达系统独优势。为此设计了一对引物可同时扩增汉逊酵母染色体中MOX基因(单拷贝)和异源整合HBsAg外源基因(多拷贝)。通过比较扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中条带的亮度可大致判断HBsAg基因是否为多拷贝。此方法用于工程菌HBsAg基因多拷贝菌株的初步筛选。所扩增的HBsAg片段长度为800bp，扩增的MOX片段长度为2000bp。
[0053] 设计使用引物序列：primer forward：5‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3[0054] primer reverse：5‘-TACTGCTGCCAGTGCACGGTG-’3
[0055] PCR产物琼脂糖凝胶电泳：工程菌HBsAg基因扩增产物大小约800bp，汉逊酵母单拷贝基因MOX基因扩增产物大小约2000bp。最终筛选得到的重组汉逊酵母乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)工程菌株编号为HS604-5。
[0056] 采用质粒pMPT-HBC，以构建重组汉逊酵母HBsAg adw2亚型工程菌株同样的方法构建并筛选得到的工程菌株PCR扩增产物电泳照片如图3所示，图3中1为Marker。最终重组汉逊酵母HBcAg工程菌株编号为HBC-40-25。
[0057] 重组汉逊酵母HBsAg adw2亚型工程菌株发酵液胞内HBsAgVLP表达量的测定[0058] 以天坛生物提供的adw2亚型HBsAg乙肝表面抗原冻干标准品10μg用稀释液溶解对倍稀释成1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、0ng/mL(稀释液)共11个标准点，放免试剂盒检测HBsAg反应。
[0059] 重组汉逊酵母工程菌株进行中试规模发酵，发酵87小时取样10OD600nm1mL,玻璃珠破碎细胞(细胞破碎率为65％)后，样品稀释200倍与标准品同时参与放免试剂盒反应，由γ-计数器自动完成拟合曲线得出的HBsAg抗原表达量为126.9(ng/mL)。以此计算重组汉逊酵母胞内HBsAg抗原表达量为：
[0060] 126.96(ng/mL)×200÷10×4.0×107×65％/mL＝9.8μg/108细胞
[0061] 重组汉逊酵母HBsAg adw2亚型工程菌株发酵液得到的重组HBsAg的纯品(原液)的电镜照片如图4所示。结果显示重组HBsAg的高纯度、高浓度和病毒样颗粒(VLP)结构稳定。
[0062] 经同样方法测定重组汉逊酵母HBcAg工程菌株发酵液胞内HBcAgVLP的表达量，为8～12μg/108细胞。
[0063] 重组汉逊酵母HBcAg细胞内病毒样颗粒(VLP)的表达
[0064] 近代分子生物学的中心法则为：DNA-＞RNA-＞氨基酸一级序列-＞蛋白分子高级结构-＞蛋白分子功能；符号-＞表示：决定。
[0065] 不同基因型乙肝病毒核心抗原HBcAg蛋白分子由183或185个氨基酸残基组成一级序列，从而决定了HBcAg的二级结构、三级结构和四级结构。实验表明：不管是分离的乙肝病毒颗粒、还是感染细胞内、重组大肠杆菌及重组酵母菌分离的HBcAg均发现其可装配成大小两种颗粒：T＝3型由180个分子量21kD的相同蛋白质亚基即90个同型二聚体构成，直径为30nm，4表面有90个刺突；T＝4型由240分子量21kD的相同蛋白质亚基即120个同型二聚体构成，直径为34nm，表面有120个刺突。
[0066] 本专利HBC-40-25工程菌细胞破碎液粗提液的透射电镜照片明显可见HBcAg病毒样颗粒。上述缺失氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg工程菌株(HC-40-25，172个氨基酸)，与全长氨基酸的重组汉逊酵母HBcAg(183个氨基酸)的HBC-17等6个强阳性株相比(摇瓶培养甲醇诱导3天的1OD600nm.ml细胞，经玻璃珠破碎，1000倍稀释样品)，检测免疫反应原性(单位为NCU/mL)结果如下：
[0067]
[0068] HBC-40-25株的免疫反应原性为其它6个强阳性株的三倍以上。
[0069] 优化的热失活重组汉逊酵母HBsAg和HBcAg细胞条件
[0070] 为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件，应满足以下要求：(1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低；(2)保持全重组汉逊酵母细胞结构，酵母细胞内抗原不泄漏；(3)保持重组汉逊酵母细胞内表达HBsAg病毒样颗粒(VLP)和HBcAg病毒样颗粒(VLP)热稳定，使其抗原反应活性不下降。其中热失活重组汉逊酵母细胞内HBsAg和HBcAg病毒样颗粒(VLP)的热稳定性成为首次要解决的问题。为此设计了16组不同温度(50℃、52℃、54℃、56℃和58℃)，及不同时间(1h、2h和3h)的重组HBsAg和HBcAg汉逊酵母的热失活试验，并设20℃为对照组。通过检测：随着热失活温度、时间的昇高，导致细胞壁外层溶解度加大，细胞破碎率增加，胞内HBsAgVLP抗原反应性在52℃、1h出现倍增的峰值；而HBcAg抗原反应性在56℃、1h出现倍增的峰值。胞外HBsAg和HBcAg抗原反应性在热失活试验的全部温度与时间范围内均极低，表明胞内VLP未外泄，保持热失活重组汉逊酵母细胞完整。热失活细胞成活率在56℃、3h条件下已低至50,000之1。从而为优化热失活重组汉逊酵母细胞的条件提供了依据。
[0071] HBsAg及HBcAg特异性CTL T细胞非细胞损伤地触发免疫逆转
[0072] 乙肝病毒感染黑猩猩系列研究结果表明：HBsAg特异性CTL T细胞，靶向感染HBV的肝细胞释放IFN-γ；第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了这个过程中损毁受感染的肝细胞，并触发免疫逆转。依据CTL表位的实验综述、预测和专利发明等三篇文报道：HBV衣壳抗原(Pre-S1-Pre-S2-HBsAg)不重复CTL表位共23个。本申请的HBsAg氨基酸序列中共含有以下19个CTL表位：VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWV。本申请的HBcAg氨基酸序列中共含有以下19个CTL表位：SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTP。
[0073] 本发明提供的乙肝治疗疫苗产品优先为预充式注射液剂：
[0074] 实验证明常规分装重组乙肝疫苗(酵母)预充注射液剂，37℃放置45天的热稳定性实验表明疫苗的体外相对效力(RP)均符合要求,而常规分装乙肝疫苗在相同保存条件下RP均不符合要求。预充注射器分装的重组乙肝疫苗(酵母)可在短时间内脱离冷链运输、保存和使用。
[0075] 预充注射器1针1盒，使用方便、使用方法和要领易于掌握,为一次性注射器,不能重复使用。疫苗接种时不需另备注射器,可防止使用玻璃注射器消毒不彻底造成感染或传播传染病以及针头选择不当影响接种效果,避免一次性注射器被重复使用的危险。
[0076] 预充注射器分装的乙肝疫苗全程接种具有良好的综合费用效益比。
[0077] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0078] 实施例1
[0079] 基于所述SEQ ID NO：1构建的pMPT-HBS-adw质粒(即包含所述SEQ ID NO：1的表达载体)。质粒pMPT-HBS-adw的构建工作包含以下内容：
[0080] 按照我们设计的SEQ ID NO：1序列合成了HBsAg adw2基因；并构建成含HBsAg adw2基因质粒的甘油菌，将其命名为MC407B-16。
[0081] 测序正确后的MC407B-16号质粒用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切产物用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit(Code No.D301)切胶回收701bp的目的片段DNA称为Inset DNA6。
[0082] 将酶切鉴定正确的质粒pHMPT-02用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，切胶回收后所得到的载体DNA称为Vector DNA6。
[0083] 使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6022)中的Solution，将Inset DNA6与Vector DNA6连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，酶切结果表明：MC407A+B+C+D-77∽80均为阳性克隆。
[0084] 将MC407A+B+C+D-77号质粒分别用引物RV-M，M13-47，MC407P1，MC407P2，MC407P3，MC407P4，MC407P5，MC407P6，MC407P7，MC407P8，MC407P9，MC407BF11，MC407BR11测序，证明质粒pMPT-HBS-adw结果正确。
[0085] 以同样的方法，基于所述SEQ ID NO：3构建的pMPT-HBC质粒。
[0086] 实施例2
[0087] 重组汉逊酵母HBsAg工程菌株的构建。
[0088] 重组汉逊酵母乙型肝炎疫苗的转化与筛选图示说明：重组汉逊酵母的转化与筛选过程如图5所示：
[0089] 具体包括
[0090] 1)应用细胞电穿孔法，将pMPT-HBS-adw质粒，转化作为宿主细胞的URA3-营养缺陷型汉逊酵母细胞株HU-11(CGMCC No.1218)。采用选择培养基(MD液体培养基)平皿培养。在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子，转接MD液体培养基后连续传代培养，使adw2亚型HBsAg基因及相应调控组件多拷贝、外源整合入宿主汉逊酵母细胞染色体中。
[0091] 2)菌株筛选包括以下步骤
[0092] (1)选择尿嘧啶原养型转化子单菌落
[0093] 挑选菌体生长速度快的菌落，应用PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝数多的菌落，采用选择培养基对单菌落进行摇瓶培养，连续传代培养20～400个世代；
[0094] (2)筛选多拷贝异源整合转化克隆株，
[0095] 经过步骤(1)传代培养后，经甲醇诱导培养72小时后，采用/放射免疫分析(Radio immunoassay or radioimmunoassay，RIA)测定转化子细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平；
[0096] (3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株
[0097] 将经过步骤(2)筛选的克隆株，采用YPD完全培养基培养48小时后，转接选择培养基平皿克隆化培养，并采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数，以RIA检测HBsAg表达水平。
[0098] (4)在步骤(3)的检测结果基础上，选择遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg工程菌的原代菌株。
[0099] 按照同样的方法，构建并筛选重组汉逊酵母HBcAg工程菌株。
[0100] 实施例3、30升中试发酵(重组汉逊酵母HBcAg工程菌株和重组汉逊酵母HBsAg工程菌株采用相同的发酵工艺方法)
[0101] 主要工艺过程和操作要点：
[0103] 2)以1600ml种子培养基将一级种子转接入二级种子培养基中，均分6个1L摇瓶，31℃培20小时作为二级种子；
[0104] 3)将12L发酵培养基调pH至5.5加入30L发酵罐中，将二级种子接入后，30-31℃经甘油、甲醇两碳源，生长、去阻遏和诱导三时相，共培养85-96小时，在停止诱导2-3小时后收获细胞。将冷冻的细胞匀浆。
[0105] 操作要点：
[0106] (1)生长时相的补料操作要待溶氧有明显下降，基础培养基消耗时开始进行，并且随着基础培养基消耗量的增加逐步提高流加速度，待溶氧回升前2-3小时流加完毕。
[0107] (2)生长时相的后期要注意溶氧回升，记录溶氧最低值，溶氧回升至70-80％时开始流加，进入去阻遏时相。
[0108] (3)去阻遏时相后期，流加结束后，溶氧开始回升。溶氧回升至70-80％℅时开始流加甲醇诱导溶液，将甲醇浓度控制在3-5‰，由甲醇检测流加控制器控制流加速度。
[0109] 发酵结束前2-3小时停止甲醇流加，以减少细胞收获时甲醇残留。
[0110] 培养基
[0111] 1.氯化钙溶液的配制
[0112] 准确称量CaCl2 11.33g，放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。
[0113] 2.微量元素溶液的配制
[0114] 准确称量以下试剂：
[0115]
[0116] 将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至200ml。
[0117] 3.维生素溶液的配制
[0118] 准确称量以下试剂：
[0119] d-Biotin 6mg
[0120] Thiamin HCl 2000mg
[0121] 将生物素首先溶解在10ml的50％异丙醇中，待溶解后再加入Thiamin HCl，然后加适量去离子溶解后水定容至100ml。
[0122] 4.痕量元素溶液的配制
[0123] 准确称量以下试剂：
[0124]
[0125] 将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子溶解后水定容至50ml。
[0126] 以上四种溶液分别除菌过滤备用。
[0127] 5.种子盐溶液的配制
[0128] 准确称量以下试剂：
[0129]
[0130] 将称量后的试剂放入洗净的三角瓶中，加适量去离子水溶解后定容至1600ml。
[0131] 6.用2000ml三角瓶称取甘油27g，混合盐溶液360mL，加去离子水定容至1800ml,等量分装于两个2000ml三角瓶中，110℃、30分钟高压蒸汽灭菌。
[0132] 110℃、30分钟高压蒸汽灭菌空消500ml三角瓶2个，1000ml三角瓶6个，100ml和500ml量筒各一个。
[0133] 7.一级种子培养基在超净台中，无菌操作量取灭菌后的甘油水溶液各100ml，分别置于灭菌后的2个500ml三角瓶中，并分别加入：
[0134]
[0135] 将加入的溶液摇匀。
[0136] 8.二级种子培养基
[0137] 在超净台中以无菌操作技术取灭菌后的甘油水溶液1600ml置于灭菌后的2000ml三角瓶中，并分别加入：
[0138]
[0139] 9.发酵培养基
[0140] 准确称量以下试剂并溶解于2000ml去离子水中。
[0141]
[0142] 取一个500ml小烧杯称取520g甘油，加泡敌10ml在线灭菌，然后加：
[0143]
[0144] 10.补料培养基
[0145] 取一个1000ml三角瓶，量取87g NH4H2PO4、260g甘油，加去离子水500ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌。
[0146] 11.去阻遏溶液
[0147] 用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去离子水660ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入过滤除菌的盐溶液540ml。
[0148] 12.诱导溶液
[0149] 用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的补料管线，110℃、30分钟灭菌，冷却后无菌操作加入甲醇1600ml。
[0150] 实施例4
[0151] 纯化，HBsAg和HBcAg采用同样的纯化工艺，以HBsAg为例，工艺如下：
[0152] 将实施例3得到的重组汉逊酵母HBsAg工程菌株发酵液经收获细胞并洗涤细胞，纯化的详细步骤可参见参考文献：李津，孔艳.重组乙型肝炎疫苗生产工艺.见李津，俞詠霆，董德祥主编：生物制药设备和分离纯化技术.第1版.北京：化学工业出版社，2003：348-349.。其中可将上述收获的细胞经过匀浆器破碎，释放出HBsAg；以0.22μm微孔滤器过滤去除细胞碎片；再以300K超微滤器超滤去除小分子杂质；以硅胶吸附处理法提取HBsAg；最后以丁基琼脂糖疏水层析方法精制纯化。
[0153] 实施例5
[0154] 热失活重组汉逊酵母细胞最佳条件试验
[0155] 为了确定热失活重组汉逊酵母的最佳条件应满足以下要求：
[0156] (1)热失活重组汉逊酵母的成活率尽可降低；使之小于5％。
[0157] (2)保持完整的细胞结构；发挥多价位热失活重组汉逊酵母佐剂活性作用；
[0158] (3)保持重组汉逊酵母细胞内表达的病毒样颗粒(VLP)完整，使其抗原性不下降。
[0159] 以上三点是热失活重组汉逊酵表达HBsAg和HBcAg生产工艺主要条件；将为制定疫苗制造及检定规程提供依据。其中热失活重组汉逊酵母细胞内病毒样颗粒(VLP)的热稳定性成为首次要解决的问题。
[0160] (1)、优化条件的热失活重组汉逊酵母细胞制备。
[0161] 重组汉逊酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)细胞培养经发酵或摇瓶诱导培养结束后。细胞用离心法在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤三次，将沉淀的汉逊酵母悬浮在计算体积的PBS中。细胞使用OD600nm计数，PBS稀释为10OD600nm/毫升,每支试管2毫升；每试验组设破碎与不破碎2支试管；16个试验组共需制备32支细胞样品试管。
[0162] 放在设定温度水浴，经设定间时热失活重组汉逊酵母。
[0163] 热失活重组汉逊酵母应在加有氯霉素完全培养基琼脂皿于37℃培养3天；计数其成活率。
[0164] 热灭活汉逊酵母储存在4摄氏度以供进一步使用。
[0165] (2)、重组汉逊酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)细胞热灭活试验组设立：
[0166]
[0167]
[0168] 共16个试验组。热灭活后采用放免HBsAg试剂检测HBsAg抗原活性；1：100稀释和1：1000稀释，设复管。检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵母热失活的优化工艺条件。
[0169] (3)、重组汉逊酵母HBcAg工程菌细胞热灭活试验组设立
[0170]
[0171] 共16个试验组。热灭活后采用放免HBcAg试剂检测HBcAg抗原活性；1：100稀释和1：1000稀释，设复管。检测结果用于分析确定本项新乙肝疫苗汉逊酵母热失活的优化工艺条件。
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