BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用
阅读：618发布：2020-05-11
专利汇可以提供BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫 疫苗 生产中的应用。本发明公开的BHK-21细胞全悬浮培养生产新城疫疫苗的工艺包括以下步骤：(1)病毒株选育：鸡胚培养的新城疫疫苗种毒接种 单层 BHK-21细胞，加入病毒维持液培养，得到适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒，并进行系统鉴定；(2)悬浮细胞株的驯化与选育：适合新城疫病毒培养用全悬浮BHK21细胞的驯化和 基础 种子 的建立；(3)悬浮细胞扩大培养；(4)接毒和收毒：适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒接种及其毒液 收获 ；(5)增殖新城疫疫苗毒的毒价测定与配苗。本发明使得新城疫疫苗实现了由鸡胚向 哺乳动物 细胞大规模培养生产的转变，这不仅简化了新城疫疫苗的生产工艺，降低生产成本，还大大提高疫苗的产量和 质量 。，下面是BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用专利的具体信息内容。
1.BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用，如权利要求1所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒株的选育将新城疫病毒Mukteswar株及其它疫苗毒株经BHK-21细胞连续传代，获得的BHK-21细胞适应毒，命名为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)Mukteswar株/BHK-21，该毒株已于2014年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8889；
(2)悬浮细胞株的驯化与选育将适合新城疫病毒培养用BHK-21细胞进行全悬浮驯化选育，获得全悬浮的BHK-21/IVDC株，该细胞株已于2014年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9319；
(3)悬浮细胞扩大培养复苏BHK-21/IVDC株悬浮细胞，采用悬浮细胞培养瓶逐级放大
6
为5个500ml规格的悬浮培养瓶，待细胞浓度达到4×10 细胞/ml后，全部转移至美国NBS BioFlo 115型总体积14L的反应器，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH7.2，溶氧60％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测。
6
(4)接毒和收毒当BioFlo 115型反应器中活细胞密度不低于2.5×10 细胞/ml时，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒Mukteswar株/BHK-21，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH7.4，溶氧60％，，于接毒后
6
24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液即为抗原。
2.用于权利要求1制备抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。
3.用权利要求1或2所述的新城疫病毒抗原制备疫苗。
4.用权利要求1所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21细胞毒在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖，加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制备新城疫活疫苗。
5.用权利要求1所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21细胞毒在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖、灭活，加入佐剂制备新城疫灭活疫苗。
6.用于权利要求4或5所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。
7.权利要求3所述的的新城疫疫苗在预防新城疫中的应用。
BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 目前，国内禽用疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 三部 二〇一〇年版.中国农业出版社2011年)工艺实现。“鸡胚法”制取疫苗的技术由来已久，最初于20世纪50年代开发，虽然这种技术也不断进化来应对各种挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生产速度等方面。但在我国，在实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗的制备，若所用鸡胚来自普通鸡蛋，可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。与此同时，鸡胚中的母源抗体还会干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。
[0003] 悬浮BHK-21细胞已成功在口蹄疫疫苗生产中应用，不仅缩短了疫苗生产周期，降低劳动强度和生产成本，还减少批间差异提高了疫苗质量，悬浮BHK-21细胞在新城疫疫苗上的应用，有望终结新城疫疫苗的鸡胚时代。
发明内容
[0004] 本发明的目的是筛选和驯化一株适应BHK-21全悬浮细胞培养的新城疫病毒适应株用于鸡新城疫疫苗生产。
[0005] 本发明的技术方案
[0006] (1)病毒株的选育 将新城疫病毒Mukteswar株经BHK-21细胞连续传代，获得的BHK-21细胞适应毒，命名为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)Mukteswar株/BHK-21，该毒株已于2014年6月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8889。
[0007] (2)悬浮细胞株的驯化与选育 将适合新城疫病毒培养用BHK-21细胞进行全悬浮驯化和连续克隆纯化选育，获得全悬浮的幼金仓鼠肾细胞BHK-21/IVDC株，该细胞株已于2014年6月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9319。
[0008] (3)悬浮细胞扩大培养 复苏BHK-21/IVDC株悬浮细胞，采用悬浮细胞培养瓶逐级6
放大为5个500ml规格的悬浮培养瓶，待细胞浓度达到4×10 细胞/ml后，全部转移至美国NBS BioFlo 115型总体积14L的反应器，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养24h、
48h采样进行细胞计数和活力检测。
放大为5个500ml规格的悬浮培养瓶，待细胞浓度达到4×10 细胞/ml后，全部转移至美国NBS BioFlo 115型总体积14L的反应器，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养24h、
48h采样进行细胞计数和活力检测。
[0009] (4)接毒和收毒 当BioFlo 115型反应器中活细胞密度不低于2.5×106细胞/ml时，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒Mukteswar株/BHK-2，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧60％，，于接6
毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液即为抗原。
毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液即为抗原。
[0010] 2.用于制备抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。
[0011] 3.用以上所述的新城疫病毒抗原制备疫苗。
[0013] 5.用以上所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21细胞毒在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖、灭活，加入佐剂制备新城疫灭活疫苗。
[0014] 6.用于以上4或5所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。
[0015] 7.以上3所述的的新城疫疫苗在预防新城疫中的应用。
[0016] 本发明具体实施方式
[0017] 具体包括以下步骤
[0018] 1.病毒株的选育
[0019] (1)将鸡胚培养增殖的新城疫疫苗生产种毒接种生长良好的细胞单层的BHK-21细胞，加入维持液培养，得到适应BHK-21细胞的新城疫病毒疫苗生产用毒种；
[0020] 所述具体方法为：所述的将鸡胚培养的新城疫病毒疫苗生产毒株种毒接种单层BHK-21细胞，包括以(按培养基的体积比)0.5％～10％毒量接种单层BHK-21细胞，加入维持液后继续在37℃5％二氧化碳环境下培养至60％～100％细胞发生病变时收获毒液，获得的病毒液再以同样方法继续接种细胞，如此在BHK-21细胞中增殖5～20代获得适应BHK-21细胞的新城疫病毒疫苗生产毒株。
[0022] 具体方法为：所述的适应BHK-21细胞的新城疫病毒疫苗生产毒株毒种建立种子批，并进行下列鉴定：
[0023] 1)病毒含量测定 将适应BHK-21细胞的新城疫病毒疫苗生产毒株病毒液(以下-1 -9简称“病毒液”)用无血清DMEM营养液(Gibco产品)作10倍系列稀释，取10 ～10 共9个稀释度，每个稀释度各接种已长成良好单层的96孔板BHK-21细胞8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1小时后，补加含2％小牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～
96小时，记录细胞病变效应(CPE)情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量应
8.0
不低于10 TCID50。
96小时，记录细胞病变效应(CPE)情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量应
8.0
不低于10 TCID50。
[0024] 2)红细胞凝集价测定 将病毒液用PBS做2倍系列稀释(50μl病毒液+50μl PBS)，加入等量1％鸡红细胞，同时设红细胞对照。振荡混匀后，20～30℃孵育15～30分钟后检查结果，使50％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。病毒液对鸡红细胞凝集价应不低于1:256。
[0025] 3)鉴别检验 将病毒液用无血清DMEM营养液稀释为100TCID50/0.1ml，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，置室温中和1小时，接种已长成良好单层的BHK-21细胞培养瓶4瓶，每瓶接种2ml，37℃吸附1小时后弃去吸附液体，然后补加含2％小牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～96小时，记录CPE情况。同时设立正常细胞对照2瓶。样品接种瓶应4/4不出现CPE，正常细胞对照应正常。
[0026] 4)RT-PCR 根据NDV标准毒株基因序列设计合成一对引物，引物序列如下：P1：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′(序列1)；P2：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′(序列2)，预期扩增片段大小为359bp。采用TakaRa RNA提取试剂盒提取RNA，然后采用TakaRa一步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。反应体系为25μl：酶混合物1μl，2X buffer12.5μl，P1和P2引物(均为25μm)各1μl，RNA模板10μl。反应条件为：42℃60min，94℃5min；然后94℃40s，56℃1min，72℃1min，共35个循环，然后72℃10min；最后4℃保温。病毒液及NDV对照应出现359bp特异性条带，阴性对照应无条带。
[0027] 2.悬浮细胞株的驯化与选育
[0028] (1)全悬浮备选BHK-21细胞的筛选与克隆；具体方法为：
[0029] 1)利用含2～8％血清的培养基在36～38℃5％CO2单层贴壁培养BHK-21细胞,收集培养上清中贴壁能力弱或不贴壁的散在细胞；
[0030] 2)在36～38℃5％CO2条件下悬浮培养收集的细胞，悬浮培养的BHK-21细胞经100～1000r/min离心5～20min，收集离心上清，上清再经500～1000r/min离心5～20min，弃上清， 重悬细胞沉淀；
[0031] 3)细胞沉淀重悬后经培养基适当稀释，利用微量细胞板对收集的BHK-21细胞进行连续单克隆化培养，筛选出不贴壁生长的单细胞克隆株；
[0032] (2)全悬浮BHK-21细胞的放大和种子批建立；具体方法为：
[0033] 1)利用低血清或无血清培养基将BHK-21细胞克隆株用摇瓶悬浮培养放大，得到适应低血清或无血清全悬浮培养的BHK-21细胞；
[0034] 2)将全悬浮细胞经500～1000rpm离心5～20min，弃上清，取细胞沉淀，用细胞冻存液重悬为20～40万细胞/ml，分装后置液氮保存，建立细胞基础种子批。；
[0035] 3.疫苗制备
[0036] (1)悬浮细胞扩大培养
[0037] 悬浮BHK-21细胞复苏及逐级放大培养；具体方法为：
[0038] 1)取出液氮冻存的悬浮BHK-21细胞，置于40℃水浴中迅速溶解，接种含0.5～10％小牛血清的100ml培养基，于摇瓶中置37℃培养72h；
[0039] 2)将步骤1)培养得到的BHK-21细胞全部转移至500ml规格的悬浮培养瓶，补加培养基至500ml，于37℃搅拌培养72h；
[0040] 3)将步骤2)培养得到的BHK-21细胞按照1传5比例传到5个500ml规格的悬浮6
培养瓶瓶，于37℃搅拌培养至细胞浓度达到不低于4×10 细胞/ml；
培养瓶瓶，于37℃搅拌培养至细胞浓度达到不低于4×10 细胞/ml；
[0041] 4)将步骤3)培养得到的BHK-21细胞全部转移至美国NBS BioFlo 115型反应器(罐体总体积14L)，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测。
[0042] (2)接毒和收毒
[0043] 1)适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒接种及其毒液收获；具体方法为：将适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒种按培养液体积的1％比例接种BioFlo 115型反应器，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧6
60％于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液。
60％于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液。
[0044] 2)新城疫疫苗毒的毒价测定；具体方法为：新城疫毒液的毒价按常规方法测定HA效价和TCID50。
[0045] (3)疫苗配制 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程(二〇〇〇年版)新城疫常规活疫苗或者灭活疫苗方法进行制得成品,具体方法为：
[0046] 1)用以上所述的新城疫病毒抗原制备活疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖，加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制备新城疫活疫苗。
[0047] 2)用以上所述的新城疫病毒抗原制备灭活疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖、灭活，加入佐剂制备新城疫灭活疫苗。
[0048] 4.疫苗检验
[0049] 具体方法为：
[0050] (1)对于由上述方法制备的活疫苗，疫苗检验主要包括物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、安全检验和效力检验；
[0051] (2)对于由上述方法制备的灭活疫苗，疫苗检验主要包括物理性状、无菌检验、安全检验和效力检验。
[0052] 本发明涉及的微生物资源信息
[0053] 本发明涉及的细胞为：适合新城疫病毒培养用BHK-21全悬浮细胞，系申请人将已适应新城疫病毒培养的BHK-21细胞，经悬浮驯化和连续克隆纯化获得的一株BHK-21全悬浮细胞，命名为幼金仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell)BHK-21/IVDC株，该细胞株已于2014年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9319。
[0054] 本发明涉及的微生物为：新城疫病毒Mukteswar株/BHK-21，系申请人将Mukteswar株经BHK-21细胞连续传代，获得的BHK-21细胞适应毒，命名为新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Mukteswar株/BHK-21，该毒株已于2014年06月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8889。附图说明：
[0055] 图1悬浮培养的BHK21/IVDC株细胞
[0056] 图2 NDV Mukteswar株/BHK-21细胞适应毒株阳性病毒对照
[0057] 图3 NDV Roakin株/BHK-21细胞适应毒株阳性病毒对照
[0058] 图4 NDV Mukteswar株/BHK-21细胞适应毒株中和组
[0059] 图5 NDV Roakin株/BHK-21细胞适应毒株中和组
[0060] 图6 BHK-21细胞对照
[0061] 图7 NDV Mukteswar株/BHK-21细胞适应毒株IFA(200X)
[0062] 图8 NDV Roakin株/BHK-21细胞适应毒株IFA(200X)
[0063] 图9 BHK-21细胞对照IFA(200×)
[0064] 图10 RT-PCR结果图中：M：DNA Marker II；1：NDV Mukteswar株/BHK-21细胞适应毒株；2：NDV Roakin株/BHK-21细胞适应毒株；3：NDV Mukteswar株鸡胚毒；4：NDV Roakin株鸡胚毒；5：NDV LaSota株阳性对照；6：阴性对照
[0065] 本发明的积极意义
[0066] 本发明涉及BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用。
[0067] (1)本发明BHK-21细胞系代替鸡胚制造新城疫疫苗，不仅可以解决SPF鸡胚供应受限制约禽用疫苗生产的问题，还可解决禽源外源病原的污染问题，确保疫苗质量和安全性。
[0068] (2)本发明悬浮BHK-21细胞系代替鸡胚制造新城疫疫苗，使得新城疫疫苗生产的周期缩短，产量增加，质量稳定，效益显著。
[0069] (3)本发明提供的悬浮BHK-21细胞生产新城疫疫苗的工艺，减少了疫苗生产过程中人力物力的投入，降低了生产成本。实施例
[0070] 以下实施例为更好的说明本发明，不对本申请形成限定。
[0071] 实施例一
[0072] ——全悬浮培养BHK-21细胞的驯化
[0073] 1材料
[0074] 1.1细胞株：BHK-21细胞，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0075] 1.2培养基：DMEM、VP SFM AGT，均为Gibco公司产品。
[0076] 1.3牛血清：Hyclone公司产品。
[0077] 1.4仪器设备：离心机，Sigma 3-18K型；悬浮细胞培养瓶(100ml，500ml)，WHEATON产品；BioFlo 115型反应器，美国NBS公司。
[0078] 2方法
[0079] 2.1利用含1％～10％血清的DMEM培养基在35～38℃5％CO2单层贴壁培养BHK-21细胞,收集培养上清中贴壁能力弱或不贴壁的散在细胞；
[0080] 2.2在35～38℃5％CO2条件下悬浮培养收集的细胞，悬浮培养的BHK-21细胞经100～1000r/min离心5～10min，收集离心上清，上清再经100～1000r/min离心5～10min，弃上清，重悬细胞沉淀；
[0081] 2.3细胞沉淀重悬后经培养基稀释，利用细胞微量培养板对收集的BHK21细胞进行单克隆化培养，初步筛选不贴壁生长的细胞克隆株，将初筛选的细胞克隆株再单克隆化，直至筛选到不贴壁生长的单细胞克隆株；
[0082] 2.4利用低血清或无血清培养基(VP SFM AGT，Gibco产品)将BHK-21细胞克隆株用摇瓶悬浮培养放大至悬浮生物反应器(100ml悬浮细胞培养瓶、500ml悬浮细胞培养瓶、美国NBS BioFlo 115型反应器)培养，经过连续筛选和克隆，筛选到1株适应低血清或无血清全悬浮培养的BHK-21细胞，命名为BHK-21/IVDC株(见图1)。
[0083] 实施例二
[0084] ——悬浮培养BHK21细胞生产新城疫病毒Mukteswar株的方法
[0085] 1.材料
[0086] 1.1细胞株：BHK-21/IVDC株悬浮细胞，由中国兽医药品监察所驯化、选育。
[0087] 1.2NDV Mukteswar株和购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0088] 1.3培养基：VP SFM AGT，Gibco公司产品。
[0089] 1.4牛血清：Hyclone公司产品。
[0090] 1.5抗鸡新城疫病毒特异性血清，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0091] 1.6仪器设备：离心机，Sigma 3-18K型；悬浮细胞培养瓶(100ml，500ml)，WHEATON产品；BioFlo 115型反应器，美国NBS公司。
[0092] 2方法
[0093] 2.1细胞的准备
[0094] 2.1.1将鸡胚培养的新城疫疫苗生产毒种新城疫病毒Mukteswar株(中国兽医微生物保藏管理中心提供)接种单层BHK-21细胞，以0.5％～10％毒量接种单层BHK-21细胞，加入维持液培养至70％以上细胞发生病变时收获毒液，获得的毒液再以同样方法继续接种细胞，如此增殖5～20代获得适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒(见图2)。
[0095] 2.1.2取出液氮冻存的悬浮BHK-21细胞，置于40℃水浴中迅速溶解，接种含0.5％～10％小牛血清的100ml培养基，于摇瓶中置37℃培养72h；
[0096] (2.1.3将步骤(2.1.2)中培养得到的BHK-21细胞全部转移至500ml规格的悬浮培养瓶，补加培养基至500ml，于37℃搅拌培养72h；
[0097] 2.1.4将步骤(2.1.3)中培养得到的BHK-21细胞按照1传5比例传到5个500ml6
规格的悬浮培养瓶中，于37℃搅拌培养至细胞浓度不低于4×10 细胞/ml；
规格的悬浮培养瓶中，于37℃搅拌培养至细胞浓度不低于4×10 细胞/ml；
[0098] 2.1.5将步骤(2.1.4)中培养得到的BHK-21细胞全部转移至美国NBS BioFlo 115型反应器(罐体总体积14L)，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养36h、48h和72h采6
样进行细胞计数和活力检测。当细胞浓度≥2.5×10 细胞/ml时进行病毒接种，否则继续进行细胞培养至所需浓度。
样进行细胞计数和活力检测。当细胞浓度≥2.5×10 细胞/ml时进行病毒接种，否则继续进行细胞培养至所需浓度。
[0099] 按以上方法制备SY13001、SY13002和SY13003三批细胞，检测结果(见表1)。
[0100] 表1 反应器细胞计数与活力检测
[0101]
[0102] 2.2病毒的接种
[0103] 取100ml适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒种接入BioFlo 115型反应器的悬浮培养的细胞液中，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，，于接毒后24h起，每隔2h采6
样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10/ml后，收获培养的病毒液，取样进行HA效价测定和TCID50测定。
样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10/ml后，收获培养的病毒液，取样进行HA效价测定和TCID50测定。
[0104] 2.3病毒检测与鉴定
[0105] 2.3.1毒价测定
[0106] 将采集的3批病毒液样品SY13001、SY13002和SY13003分别进行HA效价和TCID50测定。
[0107] 2.3.1.1HA效价测定 将病毒液用PBS做2倍系列稀释(50μl病毒液+50μl PBS)，加入等量1％鸡红细胞，同时设红细胞对照。振荡混匀后，20～30℃孵育15～30分钟后检查结果，使50％红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点(见表2)。
[0108] 2.3.1.2TCID50测定 将病毒液用DMEM营养液作10倍系列稀释，取10-1～10-9共9个稀释度，每个稀释度各接种已长成良好单层的96孔板BHK-21细胞8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1小时后，补加含2％牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～96小时，记录细胞病变效应(CPE)情况，按Reed-Muench法计算TCID50(见表2)。
[0109] 表2 病毒HA效价测定结果
[0110]样品批号 HA效价测定结果 TCID50/ml
SY13001 1:256 108.0
SY13002 1:512 108.75
SY13003 1:512 109.0
SY13001 1:256 108.0
SY13002 1:512 108.75
SY13003 1:512 109.0
[0111] 2.3.2鉴别检验
[0112] 将病毒液用无血清DMEM营养液稀释为100TCID50/0.1ml，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)混合，置室温中和1小时，接种已长成良好单层的BHK-21细胞培养瓶4瓶，每瓶接种2ml，37℃吸附1小时后弃去吸附液体，然后补加含2％小牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～96小时，记录CPE情况(见表3)。同时设立正常细胞对照2瓶。样品接种瓶应4/4不出现CPE，正常细胞对照应正常(见图2、图3、图4、图5和图6)。
[0113] 表3 鉴别检验结果
[0114]
[0115] 2.3.3IFA荧光抗体染色 将(2)项中培养的病毒弃去培养液，每孔加入50μl预冷的80％冷丙酮，2～8℃作用30min，弃去丙酮，晾干；然后加入1∶800稀释的鸡抗新城疫病毒特异性血清(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，37℃作用1小时，用pH 7.2PBS洗涤3次；再加入1∶400稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG，37℃作用1小时，用pH 7.2 PBS洗涤3次，置倒置荧光显微镜下观察(见图7、图8和图9)。
[0116] 2.3.4RT-PCR
[0117] 根据NDV标准毒株基因序列设计合成一对引物，引物序列如下：P1：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′；P2：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′，预期扩增片段大小为359bp。采用TakaRa RNA提取试剂盒提取RNA，然后采用TakaRa一步法RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。反应体系(25μl)：酶混合物1μl，2×buffer12.5μl，P1和P2引物(均为25μm)各1μl，RNA模板10μl。反应条件为：42℃60min,94℃5min；然后94℃40s，
56℃1min，72℃1min，共35个循环，然后72℃10min；最后4℃保温。病毒液及NDV对照应出现359bp特异性条带，阴性对照应无条带(见图10)。
56℃1min，72℃1min，共35个循环，然后72℃10min；最后4℃保温。病毒液及NDV对照应出现359bp特异性条带，阴性对照应无条带(见图10)。
[0118] 实施例三
[0119] ——本悬浮培养BHK-21细胞生产新城疫病毒的方法与鸡胚培养/转瓶培养方法的比较
[0120] 1材料
[0121] 1.1新城疫病毒株 NDV Mukteswar株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。。
[0122] 1.2转瓶 规格为3升转瓶。
[0123] 1.3生物反应器 美国NBS BioFlo 115型反应器(罐体总体积14L)。
[0124] 1.4细胞培养液 与实例1相同。
[0125] 1.5细胞维持液 与实例1相同。
[0126] 1.6鸡胚 9～11日龄SPF鸡胚
[0127] 2方法
[0128] 2.1病毒在鸡胚中的培养 将毒种(NDVMukteswar株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)用灭菌生理盐水作适当稀释(如100倍)，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，选择接种后24～48小时内死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液，过滤后收集装于灭菌容器中，然后进行测定HA效价和ELD50测定。
[0129] 2.2病毒在转瓶中的培养 用M199细胞培养基在10个3升转瓶中培养鸡胚成纤6
维细胞。每个转瓶先装有灭菌的450ml细胞培养液。在无菌条件下，分别接种50ml 3×10细胞/ml鸡胚成纤维细胞细胞种子液。置37℃条件下培养，转速为8～12转/min。待鸡胚成纤维细胞长成良好单层时，弃去细胞培养液，按0.1％～1％接种新城疫病毒，并补加细胞维持液500ml，置37℃培养。当细胞病变达到75％以上出现圆缩、遮光率变强时收获病
50
毒，冻融三次后进行HA效价和TCID 测定。
维细胞。每个转瓶先装有灭菌的450ml细胞培养液。在无菌条件下，分别接种50ml 3×10细胞/ml鸡胚成纤维细胞细胞种子液。置37℃条件下培养，转速为8～12转/min。待鸡胚成纤维细胞长成良好单层时，弃去细胞培养液，按0.1％～1％接种新城疫病毒，并补加细胞维持液500ml，置37℃培养。当细胞病变达到75％以上出现圆缩、遮光率变强时收获病
50
毒，冻融三次后进行HA效价和TCID 测定。
[0130] 2.3病毒在悬浮培养BHK21细胞中的培养 如实例二进行病毒的悬浮培养。
[0131] 采用3种不同的方法进行NDV Mukteswar株的培养，分别进行HA效价和病毒含量测定(TCID50或ELD50)结果如下表4。
[0132] 表4 不同的方法进行新城疫病毒(Mukteswar株)的培养样品检测结果[0133]
[0134] 3结果分析
[0135] 3.1采用鸡胚制备新城疫抗原，每个鸡胚大约可制备10～13ml左右抗原，每毫升抗原成本大约为0.6～0.8元。但在大规模生产中，污染风险较大，一般污染率在20％～30％，容易使收获的抗原液含有细菌内毒素等毒性物质，使得成品接种靶动物(鸡)时容易副反应、毒性反应，影响鸡群生产性能，甚至引起死亡。另一方面，鸡胚培养往往需要建设足够面积的孵育设备，占地多，需要人工多，且病毒液收获后的废胚处理成本较高，且气味难闻。从制备的三批抗原看，HA效价结果较低。
[0136] 3.2采用鸡胚成纤维细胞制备新城疫抗原时，细胞培养阶段往往需加入较高浓度小牛血清(8％～10％)，待细胞长成单层后需弃去培养液，换用小牛血清浓度为2％～3％的培养基，不仅工艺繁琐，且人为地增加了生产成本。综合考虑，采用该工艺制备抗原成本总体成本为0.2～0.4元(/ml)。该培养工艺较鸡胚方法较少了污染几率，但由于鸡胚成纤维细胞作为原代细胞，不具有无限增殖的特性，因此在工厂化大规模生产时，细胞制作量比较大，不大利于工艺放大，且很难确保每个批次细胞的稳定性，进而影响抗原质量。从HA效价和病毒含量测定(ELD50)结果相当。
[0137] 3.3采用BHK21/IVDC株全悬浮培养工艺生产鸡新城疫抗原，自动化成都高，需要人员少，且可采用具有工业化应用价值的无血清或低血清(小于3％)培养基品种，每毫升抗原生产成本折合0.02～0.04元，抗原成本比较优势显著。另一方面，低血清或无血清培养基可大大减少血清中杂蛋白等热源物质，且减少了疫苗污染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的风险，使产品更具安全性。此外，BHK-21全悬浮培养工艺稳定，已广泛应用于世界各国及我国口 蹄疫疫苗的生产中，其实用性、可靠性和稳定性已得到充分验证。BHK-21属于传代细胞系，具有无限增殖的特性，且具备细胞生长速度快等特点，非常适合工业放大和规模化生产。不仅缩短了疫苗生产周期，降低劳动强度和生产成本，还减少批间差异提高了疫苗质量，悬浮BHK-21细胞在新城疫疫苗上的应用，有望终结新城疫疫苗的鸡胚时代。从三批制备的鸡新城疫抗原HA效价和病毒含量测定结果看，该培养工艺制备的新城疫抗原无论是HA效价还是TCID50测定结果均优于或不低于上述2种培养工艺，具有广阔的市场应用和推广前景。
[0138] 3.4从三种工艺的培养周期看，三种方式病毒培养时间相差不大，一般在24～48小时，无明显差异，但采用全悬浮培养的实际培养时间略短些，约24～36小时。
[0139] 实施例四
[0140] ——本实例说明采用BHK细胞悬浮技术进行新城疫灭活疫苗的制备方法[0141] 1毒种
[0142] 1.1制备本品用的毒株为Mukteswar株/BHK-21，效检用强毒为鸡新城疫北京株强毒，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应。
[0143] 1.2毒种标准
[0144] 1.2.1疫苗毒株应符合以下标准
[0145] 1.2.1.1毒力
[0146] 1.2.1.1.1鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD) 用灭菌生理盐水将新收-7 -8 -9获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10 、10 、10 3个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，上午8点每个稀释度接种5个鸡胚，每胚尿囊内注射0.1ml，做记号“A”。接种后剩余的病毒液放4℃保存，下午5点每个稀释度分别再接种剩余的5个鸡胚，做记号为“B”。接种后，每日上午8点，下午5点，A、B组各照蛋一次，记录每一个鸡胚的死亡时间，并测定每胚HA效价。观察7日后，将所有活胚冷却，测定每胚HA效价。上午和下午接种的鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量。然后计算最小致死量的平均死亡时间，应为40～55小时。
[0147] 1.2.1.1.2脑内接种致死指数(ICPI) 取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05ml(接种针头直径0.45mm，长5mm)。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。接种后，每日在相应接种时间观察，记录雏鸡情况，分正常(即活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起、但不包括只表现迟钝的鸡)、死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，按正常0分、发病1分、死亡2分的权值计算累计总分数。ICPI为累计总分除以累计正常、发病和死亡鸡的累计总数。ICPI应在 1.4～1.85范围内。
[0148] 1.2.1.1.3静脉接种致病指数(IVPI) 取6周龄SPF鸡10只，静脉接种10-1稀释的含毒尿囊液0.1ml，另取2只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病(鸡只卷缩在一起不愿运动，不愿采食或饮水，但无明显的翅、腿麻痹表现)、麻痹(翅、腿明显不协调，翅膀下垂)和死亡。观察10日，累计正常、发病、麻痹、死亡总数。按不同权值(正常为0、发病为1、麻痹为2、死亡为3)累计总分数。IVPI为累计总分除以正常、发病麻痹和死亡鸡只的累计总数。IVPI应小于或等于0.85。
[0149] 1.2.1.2病毒含量 将病毒液用无血清DMEM营养液作10倍系列稀释，取10-1～10-9共9个稀释度，每个稀释度各接种已长成良好单层的96孔板BHK-21细胞8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1小时后，补加含2％小牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养
48～96小时，记录细胞病变效应(CPE)情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒
8.0
含量应不低于10 TCID50。
48～96小时，记录细胞病变效应(CPE)情况，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒
8.0
含量应不低于10 TCID50。
[0150] 1.2.1.3红细胞凝集价 将病毒液用PBS做2倍系列稀释(50μl病毒液+50μl PBS)，加入等量1％鸡红细胞，同时设红细胞对照。振荡混匀后，20～30℃孵育15～30分钟后检查结果，使50％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。病毒液对鸡红细胞凝集价应不低于1:256。
[0151] 1.2.1.4安全性 毒种100倍稀释，肌肉注射2～8月龄SPF鸡4只，每只1ml，应无异常临床反应。
[0152] 1.2.1.5免疫原性 对2～8月龄SPF鸡的最小免疫量为10-6/ml。
[0153] 1.2.1.6纯净性 按现行《中国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，均应为阴性。
[0154] 1.2.1.7特异性 将病毒液用无血清DMEM营养液稀释为100TCID50/0.1ml，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，置室温中和1小时，接种已长成良好单层的BHK-21细胞培养瓶4瓶，每瓶接种2ml，37℃吸附1小时后弃去吸附液体，然后补加含2％小牛血清的DMEM营养液，置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～96小时，记录CPE情况。同时设立正常细胞对照2瓶。样品接种瓶应4/4不出现CPE，正常细胞对照应正常
[0155] 1.2.1.8基础种子代数 13～18代。
[0156] 1.2.2效检用强毒标准
[0157] 1.2.2.1对鸡最小致死量 用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射10-7或10-8稀释的病毒液1ml，14日内应全部死于新城疫。
[0158] 1.2.2.2对鸡胚半数致死量 将含毒尿囊液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，每个稀释 度各尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，记录接种后24～72小时死亡且胎儿有明显病痕的鸡胚，计算ELD50,每0.1ml病毒含量应7.0
≥10 ELD50。
≥10 ELD50。
[0159] 2疫苗制备
[0160] 2.1生产用毒种制备
[0161] 2.1.1毒种繁殖
[0162] 2.1.2毒种鉴定 按1.2.1.2、1.2.1.4和1.2.1.6项进行检验，应符合规定。
[0163] 2.1.3毒种保存 在-15℃以下，保存期为1年。
[0164] 2.1.4毒种继代 应不超过3代。
[0165] 2.2制苗用毒液的制备
[0166] 2.2.1取出液氮冻存的悬浮BHK-21细胞，置于40℃水浴中迅速溶解，接种含0.5-10％小牛血清的100ml培养基，于摇瓶中置37℃培养72h；
[0167] 2.2.2将步骤2.2.1培养得到的BHK-21细胞全部转移至500ml规格的悬浮培养瓶，补加培养基至500ml，于37℃搅拌培养72h；
[0168] 2.2.3将步骤2.2.2培养得到的BHK-21细胞按照1传5比例传到5个500ml规格的悬浮培养瓶瓶，于37℃搅拌培养72h；
[0169] 2.2.4将步骤2.2.3培养得到的BHK-21细胞全部转移至美国NBS BioFlo 115型反应器(罐体总体积14L)，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测。
[0170] 2.2.5取100ml适应BHK-21细胞的新城疫疫苗毒种接种BioFlo 115型反应器，参6
数设定不变，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液。放-15℃以下保存备用，保存时间不超过2个月。
数设定不变，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10 后，收获病毒液。放-15℃以下保存备用，保存时间不超过2个月。
[0171] 2.3灭活将上述细胞毒液取少量用于半成品检验，其余分别加入10％甲醛溶液(使其终浓度为0.1％)，边加边搅拌，使其充分混合，在37℃灭活16小时。期间搅拌3～4次。然后2～8℃保存，不超过1个月。
[0172] 2.4半成品检验
[0173] 2.4.1无菌检验 按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二一年版 三部.中国农业出版社，2011)进行无菌检验，应为阴性。
[0174] 2.4.2灭活检验 将灭活后的病毒液接种已长成良好单层的BHK-21细胞培养瓶2瓶，每瓶接种2ml，37℃吸附1小时后弃去吸附液体，然后补加含2％小牛血清的DMEM营养液， 置37℃5％二氧化碳培养箱培养48～96小时。如此盲传两代，均不应出现细胞病变。
[0175] 2.4.3病毒含量测定 将灭活前取出的每组病毒液，分别测定HA效价和TCID50，HA8.0
效价应不低于1：256，病毒含量应≥10 TCID50/ml，方可用于配苗。
效价应不低于1：256，病毒含量应≥10 TCID50/ml，方可用于配苗。
[0176] 2.5灭活疫苗的制备
[0177] 2.5.1佐剂 采用商品化油佐剂。
[0178] 2.5.2乳化 按1份水相+2份油相比例，采用胶体磨进行乳化，加完后再以10000r/min搅拌2～5分钟，在终止前加入1％硫柳汞，使其终浓度为0.01％。
[0179] 2.5.3分装 定量分装，加盖封闭。
[0180] 按以上本发明技术方案制备三批疫苗，批号为2013001、2013002和2013003新城疫灭活疫苗。
[0181] 2.6成品检验
[0182] 2.6.1物理性状
[0183] 外观 为淡粉红色略带粘滞性乳状液
[0184] 剂型 为油包水型油佐剂。
[0185] 稳定性 取疫苗10ml，3000r/min离心15min，析出水相均不高于0.5ml。
[0186] 黏度 均不超过200cP。
[0187] 采用本发明技术方案制备三批疫苗物理性状、无菌检验结果见表5.[0188] 表5 物理性状、无菌检验结果
[0189]
[0190] 2.6.2无菌检验 按现行《中国兽药典》进行无菌检验，均无菌生长判为阴性(结果见表5)。
[0191] 2.6.3安全检验 取2～8月龄健康易感鸡(HI抗体≤1：4)4只，每只肌肉注射注射疫苗1ml，观察14天，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身反应(结果见表6)。
[0192] 表6 疫苗安全检验结果
[0193]批号 检测结果 判定
2013001 鸡4/4安全 合格
2013002 鸡4/4安全 合格
2013003 鸡4/4安全 合格
2013001 鸡4/4安全 合格
2013002 鸡4/4安全 合格
2013003 鸡4/4安全 合格
[0194] 2.6.4效力检验 用1～2月龄健康易感鸡(HI抗体≤4)15只，其中10只皮下或5.0
肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作为对照，3～4周后，每只鸡肌肉注射10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护7只，具体检验结果见表
7。
肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作为对照，3～4周后，每只鸡肌肉注射10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护7只，具体检验结果见表
7。
[0195] 表7 疫苗效力检验结果
[0196]
[0197] 实施例五
[0198] ——采用BHK悬浮培养技术生产的新城疫灭活疫苗与商品化疫苗免疫效果的比较[0199] 1材料
[0200] 1.1疫苗
[0201] 1.1.1悬浮培养新城疫疫苗采用Mukteswar株/BHK-21，与实例二相同灭活疫苗(采用2013001、2013002、2013003批)及重新制备采用BHK21全悬浮工艺生产的活疫苗2013004、2013005批
[0202] 1.1.2商品化疫苗 A企业新城疫灭活疫苗(La Sota株，2013003批)、B企业鸡新城(La Sota株)、减蛋综合征二联灭活疫苗(仅检测新城疫部分)(20130516批)、C企业鸡新城疫活疫苗(La Sota株)。
[0203] 1.2试验动物1～2月龄SPF鸡55只(HI抗体≤4)；30～60日龄SPF鸡(HI抗体≤4)。
[0204] 2方法
[0205] 2.1效力检验
[0206] 2.1.1灭活疫苗免疫攻毒试验 用1～2月龄健康易感鸡(HI抗体≤4)15只，其中10只皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作为对照，3～4周后，每只鸡肌肉注射5.0
10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护7只(见表
8)。
10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护7只(见表
8)。
[0207] 2.1.2活疫苗免疫攻毒试验 用30～60日龄SPF鸡，10只各滴鼻接种疫苗0.014.0
羽份，另5只作为对照，接种14日后，每只鸡各肌肉注射10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护9只(见表8)。
羽份，另5只作为对照，接种14日后，每只鸡各肌肉注射10 ELD50鸡新城疫北京株强毒，观察14日，对照组应全部死亡，免疫组至少保护9只(见表8)。
[0208] 表8 BHK悬浮培养技术生产的新城疫疫苗与商品化疫苗免疫效果的比较结果[0209]
[0210] 3结果分析
[0211] 3.1从采用BHK-21全悬浮工艺制备了三批灭活疫苗的效力检验结果看，该三批疫苗免 疫鸡后攻击新城疫强毒均能达到《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版 三部.中国农业出版社，2011)鸡新城疫灭活疫苗效力检验标准要求，即免疫组至少7/10保护，对照组5/5死亡，说明采用该工艺制备新城疫灭活疫苗或活疫苗是完全可行的。但从临床保护效果看，其免疫保护效果尚不能完全达到使用鸡胚生产的商品化灭活疫苗。但本研究配制疫苗采用的BHK21悬浮细胞培养的新城疫病毒为原液，并未进行浓缩纯化处理，具有进一步改进的空间。此外，采用BHK21全悬浮工艺培养鸡新城疫病毒，具有无限增殖的特性，有助于产品的纯净性控制以及降低生产成本等潜在优势，非常适合工业放大和规模化生产。
[0212] 3.2从采用BHK-21全悬浮工艺制备了三批活疫苗的效力检验结果看，完全可以可达到《中国兽药典》新城疫活疫苗Mukteswar株(I系)效力检验的质量标准，使免疫鸡获得有效保护(9/10以上保护率)，与其它商品化鸡新城疫活疫苗免疫效果相当，说明采用BHK-21全悬浮工艺制备新城疫活疫苗是可行的。
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