本发明涉及用于淀粉状变性的诊断和治疗的方法和组合物，所述淀粉 状变性是一组与淀粉状蛋白相关的病症和异常，诸如阿尔茨海默病。

淀粉状变性不是单一的疾病实体，而是一群多种以蜡状的、淀粉样蛋 白(称之为淀粉状蛋白，它们积累在一个或一个以上的器官或身体系统中) 细胞外组织的沉积为特征的进行性疾病过程。随着淀粉状蛋白沉积物聚集， 它们开始干扰器官或身体系统的正常功能。至少存在15种不同类型的淀粉 状变性。主要形式是没有已知前例的原发性淀粉状变性，一些其它疾病之 后的继发性淀粉状变性，和遗传性淀淀粉状变性。

继发性淀粉状变性发生在慢性感染或炎性疾病，诸如结核病、称为家 族性地中海热的细菌感染、骨感染(骨髓炎)、类风湿性关节炎、小肠发炎(肉 芽肿性回肠炎)、霍奇金病和麻风病期间。

淀粉状蛋白沉积物包括淀粉状蛋白P(五边形)成分P、与正常血清淀粉 状蛋白P相关的糖蛋白(SAP)和结缔组织的复合碳水化合物硫酸盐化的糖 胺聚糖(GAG)。占淀粉状蛋白物质的90％的淀粉状蛋白原纤维(fibril)包 含数种不同类型蛋白中的一种。这些蛋白能够折叠为所谓的“β-折叠”片 状原纤维，这种独特的蛋白构型显示出对刚果红(Congo red)的结合部位， 导致了淀粉状蛋白的独特的着色性质。

许多老年疾病基于或与淀粉状蛋白样蛋白有关，并且部分地以促进疾 病发生和疾病进程的淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样物质的细胞外沉积的积累 为特征。这些疾病包括但不限于神经疾病，诸如阿尔茨海默病(AD)，包括 以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸如轻度认知损害 (MCI)，包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸如轻度 认知损害(MCI)、路易体痴呆(Lewy body dementia)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征。 其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病是进行性核上性麻痹、多发 性硬化、克-雅二氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病、HIV相关 痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年发病型糖尿病、 老年性心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤以及其它疾病，包括黄斑变性。

尽管这些疾病的发病机理可能是不同的，但它们的特征性沉积物经常 含有许多共同的分子成分。在显著程度上，这些可能归因于促进发炎途径 的局部活化从而导致活化的补体组分、急性期反应物、免疫调节剂及其它 发炎介质的同时沉积(McGeer等，1994)。

阿尔茨海默病(AD)是一种神经疾病，主要认为由淀粉状蛋白斑，即在 脑中蛋白质异常沉积的积累所引起的。在感染个体脑中发现的最常见的淀 粉状蛋白的类型主要包含Aβ原纤维。科学证据表明在斑块中β-淀粉状蛋 白的产生和累积的增加导致神经细胞死亡，这对AD的发展和进程有贡献。 在关键脑区域的神经细胞的损失又导致神经递质的减少和记忆的减损。主 要造成斑块聚集的蛋白质包括淀粉状蛋白前体蛋白(APP)和两种早老蛋白 (早老蛋白I和早老蛋白II)。通过酶β和γ分泌酶连续裂解淀粉状蛋白前体 蛋白(APP)(它们在大多数细胞中组成型表达和分解代谢)导致39至43个氨 基酸的Aβ肽的释放。APPs的降解可能会增加它们在斑块中聚集的倾向。 由于其C末端的两个极疏水的氨基酸残基，Aβ(1-42)片段尤其具有构建聚 集物的高倾向。因此认为Aβ(1-42)片段主要参与并造成AD中神经炎斑块 形成的起始，并因此具有高病理学潜力。因此需要能预防淀粉状蛋白斑的 形成并扩散在AD中现存的淀粉状蛋白斑的药剂。

AD的症状出现缓慢，第一个症状可能仅仅是轻度健忘。在这一阶段， 个体可能忘记新近的事件、活动、熟悉的人或东西的名称以及不能解决简 单的数学问题。随着疾病进展，症状能更容易地被注意到并且变得足够严 重从而导致患有AD的人们或他们的家人寻求医学帮助。AD的中期症状 包括忘记如何做诸如整理清洁的简单任务，以及说话、理解、阅读或书写 的问题逐渐显现。后期的AD患者可能变得焦虑或具攻击性，可能从家里 走失以及最终需要全面护理。

目前，唯一的明确诊断AD的方法是在个体死后的尸体解剖中鉴别脑 组织中的斑块和缠结。因此，当人仍活着的时候，医生只能作出“可能” 或“很可能”患有AD的诊断。应用目前的方法，内科医生利用数种诊断 “很可能”AD的工具可以至多在90％的时间准确地诊断AD。内科医师 询问人的一般健康、过去的医疗问题和此人完成日常活动的任何困难的历 史。记忆、问题求解、注意力、计算和语言的行为测试提供认知退化的有 关信息，医疗检验诸如血、尿或脊髓液的检验和脑部扫描可以提供一些其 它信息。

AD的管理由基于药物的和不基于药物的治疗组成。以改变疾病潜在 的过程(延缓或逆转进程)为目的的治疗目前大部分是不成功的。恢复神经 细胞的化学信使(神经递质)不足(缺陷)或功能障碍的药物，特别是胆碱酯酶 抑制剂(ChEI)(诸如他克林和卡巴拉汀(rivastigmine))已显示出可改善症 状。ChEI阻碍神经递质的酶降解，因此增加在脑中可用于传递神经信号的 化学信使的量。

对于某些在疾病早期和中期阶段的人们，药物他克林( Morris Plains，NJ)、多奈哌齐(Tokyo，JP)、卡巴拉汀 (East Hanover，NJ)或加兰他敏(New Brunswick， NJ)可以在有限的时间内帮助防止某些症状变得更严重。另一种药物美金刚 (New York，NY)已被核准治疗中等至严重的AD。也有药物 用于对付AD的精神病学表现。有些药物也可以帮助控制AD的行为症状， 诸如失眠、兴奋、恍惚、焦虑和抑郁。治疗这些症状通常使得患者更舒服 和使对于照顾者来说更容易照顾。不幸的是，尽管显著地治疗进展显示出 这一类药剂可靠地比安慰剂好，但是疾病仍继续发展，并且对精神功能的 平均作用仅为有限的。很多用于AD药物治疗的药物，例如，诸如ChEI， 也具有副作用，包括胃肠功能失调、肝脏毒性和体重减轻。

路易体痴呆(LBD)是可在年龄大于65岁的人中存在的神经变性疾病， 其通常引起认知(思维)损害的症状和反常的行为改变。症状可以包括认知 损害、神经征、睡眠紊乱、和自律失调(autonomic failure)。在大多数病例 中，认知损害是LBD所表现出的特征。患者具有经常发生的进行性加重的 神经错乱发作。认知能力的波动往往与注意力和机敏性的移动程度相关。 认知损害和思维的波动可在若干分钟、若干小时、或若干天期间变动。路 易体是自磷酸化的和非磷酸化的神经丝蛋白形成的；它们含有突触蛋白α- 突触核蛋白和遍在蛋白，其参与去除损伤的或异常的蛋白。除了路易体之 外，也可还存在路易神经突(Lewy neurites)，其中所述路易神经突是在 神经细胞的细胞突起中的包涵体。在患DLB的患者脑中可形成淀粉状蛋白 斑，但是与患有阿尔茨海默病的患者中所看到的数量相比倾向于较少。在 AD中的另一微病理学特征-神经原纤维缠结不是DLB的主要特征，但是 DLB除了存在淀粉状蛋白斑外还通常存在神经原纤维缠结。

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)表征为上运动神经元和下运动神经元变 性。在一些ALS患者中，可存在痴呆或失语症(ALS-D)。最常见的痴呆是 额颞痴呆(FTD)，并且这些病例中许多病例具有在齿状回的神经元以及额 叶和颞叶的浅层神经元中遍在蛋白阳性、tau阴性的内含物。

包涵体肌炎(IBM)是通常在年龄超过50岁的人中发现的丧失活动能力 的病，其中肌纤维发炎并开始萎缩-但其中脑不受侵袭并且患者保留他们 的智力。在患有该最常见的进行性肌肉疾病的老年人患者的肌细胞中发现 了两种参与淀粉状蛋白β蛋白产生的酶增加，其中淀粉状蛋白β也增加。

另外一种基于淀粉状蛋白样蛋白的聚集和沉积或与其相关的疾病是黄 斑变性。

黄斑变性是引起视网膜(在眼睛后部的像纸一样薄的组织，在此感光细 胞传送视觉信号至大脑)的中心区域即黄斑区变性的常见的疾病。通过黄斑 区处理产生清楚、明晰、“笔直向前”的视觉。损伤黄斑区导致盲点的产 生和模糊不清或视物变形。年龄相关性黄斑变性(AMD)在美国是引起视力 损伤的主要原因，并且对于65岁以上的人来说，其为高加索人中法定失明 的主要原因。大约有180万40岁及以上的美国人患有晚期AMD，以及其 它730万患有中等AMD的人具有视力丧失的真实的危险。政府估计到2020 年，将会有290万人患有晚期AMD。AMD患者常常惊讶和沮丧地发现对 这种盲症状的原因和治疗了解的是如此之少。

存在两种黄斑变性的形式：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。有百分之 八十五的黄斑变性患者诊断为干性形式，其中黄斑区的细胞缓慢地开始损 坏。尽管一只眼睛可能丧失视力而另外一只眼睛保持未受影响，但两只眼 睛通常都受到干性AMD的影响。视网膜下的黄色沉积物，即脉络膜小疣 是干性AMD的早期征兆。随着脉络膜小疣的数目和大小的增加，发展成 晚期干性AMD或湿性AMD的危险也增加。干性AMD可能在不转变为 疾病的湿性形式的情况下进一步发展并且导致视力的丧失；然而，早期的 干性AMD也有可能突然变为湿性形式。

尽管只占到病例的百分之十五，湿性形式导致了失明的百分之九十， 并且被认为是晚期的AMD(没有早期或中期阶段的湿性AMD)。湿性AMD 总是处于疾病的干性形式之后。当干性形式变得更严重，一些人在黄斑区 的后面开始有异常的血管生长。这些血管非常脆弱并且会泄漏液体和血液 (因此是“湿性”黄斑变性)，这导致了对黄斑区的快速损伤。

干性形式的AMD开始会常常引起轻度的视力模糊。特别是视力的中 心可能变得模糊不清，并且这一区域随着疾病的发展变得更大。如果只有 一只眼睛受到影响，则没有症状可以被注意到。在湿性AMD中，直线可 能看起来像波浪状，并且中心视力的丧失可能很快出现。

黄斑变性的诊断一般涉及扩张眼检查、视觉敏感度试验，以及用称之 为眼底检查的方法查看眼睛的后部以帮助诊断AMD，并且如果有湿性 AMD的嫌疑，则也可能进行荧光素血管造影术。如果干性AMD达到晚期 阶段，没有预防视力丧失的现行治疗。然而，抗氧化剂和锌的特定高剂量 配方可以延缓或预防中期AMD发展至晚期阶段。(哌加他尼钠 注射液)、激光光凝术和光动力学治疗可能可以控制黄斑区中的异常血管生 长和流血，这对有些患有湿性AMD的患者有用；然而，视力已经丧失的 则不能通过这些技术恢复。如果视力已经丧失，存在可以帮助提高生活质 量的低视力辅助器。

年龄相关性黄斑变性(AMD)的最早的征兆之一是称之为脉络膜小疣 的细胞外沉积物在视网膜色素上皮(RPE)基底层和布鲁赫膜(BM)之间的积 累。近来由Anderson等进行的研究已证实脉络膜小疣包含淀粉状蛋白β (Experimental Eye Research 78(2004)243-256)。

进行中的研究继续探索可能促进AMD的环境、遗传和饮食因素。也 正在探索新的治疗策略，包括视网膜细胞移植物、能够预防或减缓疾病发 展的药物、放射疗法、基因疗法、植入到视网膜的可帮助刺激视力的计算 机芯片、以及预防黄斑区下新血管生长的药剂。

开发新药物时，需要考虑的一个重要因素是对目标患者来说使用的容 易性。由于对患者的便利性，经口药物递送(特别是片剂、胶囊剂和软胶剂) 占所有消费剂型的70％。药物开发者认同患者更喜欢经口递送，而不是接 受注射或其它更具侵入性的药物给药方式。导致减少给药次数的间隔(即一 天一次或持续释放)的制剂也是优选的。以经口剂型给药抗生素的容易性导 致了治疗期间患者顺从性的增加。

所需的是预防或处理与淀粉状变性相关的并发症的有效方法和组合 物，所述淀粉状变性是一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包 括继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变性，包括但不限于神经疾病诸 如阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状 变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白 或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、 帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖 尿病、老年性心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变 性。具体而言，需要的是能消除疾病生理学表现，诸如消除与淀粉状蛋白 或淀粉状蛋白样肽的纤维的聚集相关的斑块形成的药剂。

对于人类阿尔茨海默病，据报道与弗氏完全或不完全佐剂混合的由接 种Aβ1-42引起的抗淀粉状蛋白抗体能够减少转基因小鼠的淀粉状蛋白的负 荷(Schenk等，1999)。将在脂质体中重构的四棕榈酰化Aβ1-16腹膜内接种到 NORBA转基因小鼠引起显著的抗淀粉状蛋白抗体滴度，据报道这一抗体 也能在体外和体内溶解淀粉状蛋白纤维和斑块(Nicolau等，2002)。

Bard等(2000)首先提出了溶解已出现的淀粉状蛋白斑和纤维的可能机 制，他们得出结论，即抗体调理斑块，斑块随后被小神经胶质细胞的巨噬 细胞毁坏。De Mattos等(2001)指出抗β-淀粉状蛋白的中心结构域的mAb 能够结合和完全隔离血浆淀粉状蛋白。他们认为循环系统中这些mAb的 存在改变了脑和血浆中的Aβ平衡，有利于外周的清除和分解代谢而不是 在脑内沉积。

用啮齿类动物抗体的长期的人类治疗可能导致抗球蛋白反应，这能在 施与后约8-12天检测到，并在约20-30天达到峰值。如果遭遇了该抗球蛋 白反应，必须在不超过约10天之后中断治疗，并且通常无法在之后的时间 重新治疗，因为这将导致二次抗球蛋白反应的快速开始。尽管啮齿类动物 抗体与人类抗体共享了相当大程度上的序列保守性，但是在啮齿类动物和 人类抗体之间存在许多序列差异，足以使啮齿类动物抗体在人类中成为免 疫原。

可以通过直接在人类中产生抗体或通过创造“人源化”(又称“重构 (reshaped)”抗体)来解决这一问题。人源化抗体具有这样的可变区氨基 酸序列，所述可变区氨基酸序列含有散布在人类或人类样构架序列中的啮 齿类动物衍生的CDR。由于人源化抗体的特异性是由啮齿类动物衍生的 CDR提供的，因此，基本上不经改变的应用它们的残基，仅允许不会显著 影响抗体对其靶抗原的亲和性和特异性的小的修饰。构架残基可以衍生自 任何灵长类动物，或尤其是衍生自任何人类可变区，或其组合，并且所得 到的设计好的可变区被认为是经重构的。

为最大可能地在重构抗体中保留亲和力，适当地选择构架区是重要的。 已知构架序列以CDR正确的空间方向容纳CDR，用于与抗原相互作用， 并且构架残基有时甚至参与抗原结合。为保留抗体对其抗原的亲和性，选 择与啮齿类动物构架序列最相似的人类构架序列是有利的。然后仍然可能 需要用啮齿类构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基 酸，以避免亲和性的丧失。通过计算机建模可辅助这一替换。

本发明提供包含高特异性和高效抗体、尤其是包括其片段在内的嵌合 抗体、更尤其是包括其片段在内的部分或完全的人源化抗体的新的方法和 组合物，所述抗体具有特异识别并结合至至一系列β-淀粉状蛋白抗原的特 异表位的能力，所述抗原可能以单体、二聚体、三聚体等；以聚合形式； 以聚集体、纤维、纤丝的形式；或以斑块的浓缩形式呈递给抗体。通过本 发明教导提供的抗体特别对治疗淀粉状变性有用，所述淀粉状变性是一组 与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性和年龄 相关性淀粉状变性，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、路易 体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕金森- 痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸如进 行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、 ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性、 内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变性；这些仅仅是其中的一些例子。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化 抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少一个独特 的结合部位，特别是至少两个独特的结合部位，以及更特别是至少三个独 特的结合部位，其中所述的一个、所述的至少两个和所述的至少三个结合 部位的每一个部位均包含主要参与抗体结合的至少一个氨基酸残基或至少 两个连续的氨基酸残基。

具体而言，根据本发明的嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化抗体或 人源化抗体片段结合β-淀粉状蛋白上的至少两个、特别是至少三个独特的 结合部位，其中三个独特的结合部位中的至少两个包含主要参与抗体结合 的至少两个连续的氨基酸残基，并且三个独特的结合部位中的至少一个包 含至少一个氨基酸残基。

所述的至少两个独特的结合部位在抗原上彼此密切接近地定位，被至 少一个不参与抗体结合或与所述的至少两个连续的氨基残基相比参与抗体 结合程度显著较小的至少一个氨基酸残基隔开和/或侧翼为所述氨基酸，从 而形成构象不连续的表位，其中所述独特的结合部位包含至少两个连续的 主要参与抗体结合的氨基酸残基。

所述的至少三个独特的结合部位在表位上彼此密切接近地定位，被至 少一个不参与抗体结合或与主要参与抗体结合的两个氨基残基相比参与抗 体结合程度显著较小的至少一个氨基酸残基隔开和/或侧翼为所述氨基酸， 从而形成构象不连续的表位，其中所述独特的结合部位分别包含主要参与 抗体结合的至少两个连续的氨基酸残基和至少一个氨基酸残基。

具体而言，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化抗体或人源化 抗体片段，它们识别并结合至至β-淀粉状蛋白上的至少一个独特的结合部 位，特别是至少两个独特的结合部位，更特别的是至少三个独特的结合部 位，其中所述的至少一个、或所述的至少两个独特的结合部位每一个包含 至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中代表第一结合部位 的至少两个连续的氨基酸残基是埋在以下核心序列(SEQ ID NO：9)中的 -Phe-Phe-：

Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，其中

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸 残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；并且其中所述的氨基酸残基 Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa6不参与抗体结合或与-Phe-Phe-结合部位相比参 与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中

Xaa3是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa4是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa5是Glu或Asp，但尤其是Glu；

Xaa6是Glu或Asp，但尤其是Asp。

具体而言，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化抗体或人源化 抗体片段，其识别并结合至至β-淀粉状蛋白上的至少一个独特的结合部位， 特别是至少两个独特的结合部位，更特别的是至少三个独特的结合部位， 其中所述的独特的结合部位分别包含主要参与抗体结合的至少一个和至少 两个连续的氨基酸残基，其中代表第一个结合部位的至少两个连续的氨基 酸残基是埋在以下核心序列中的-Phe-Phe-，且至少一个氨基酸残基是埋在 以下核心序列中的-His-：

-Xaa1-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Phe-Phe-Xaa7-Xaa8-Xaa9-

其中，

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；

Xaa3是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa7是选自Ala、Val、Leu和Ile的氨基酸残基；

Xaa8是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa9是选自Glu和Asp的氨基酸残基；且其中所述的氨基酸残基Xaa1、 Xaa3、Xaa6、Xaa7、Xaa8和Xaa9不参与抗体结合或与-His-和-Phe-Phe-结 合部位相比参与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中

Xaa3是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa4是Lys；

Xaa5是Leu；

Xaa6是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa7是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa8是Glu或Asp，但尤其是Glu；且

Xaa9是Asp或Glu，但尤其是Asp。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至至β-淀粉状蛋白上的至少 一个独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更特别地至少三 个独特的结合部位，其中所述的至少一个或所述的至少两个独特的结合部 位每一个包含至少两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中代表 第二个结合部位的至少两个连续的氨基酸残基是埋在以下核心序列(SEQ ID NO：10)中的-Lys-Leu-：

Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3，其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸 残基；且其中所述的氨基酸残基Xaa2、Xaa3不参与抗体结合或与-Lys-Leu- 结合部位相比参与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至至β-淀粉状蛋白上的至少 一个独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更特别地至少三 个独特的结合部位，其中所述的独特的结合部位分别包含主要参与抗体结 合的至少一个和至少两个连续的氨基酸残基，其中被至少一个不参与抗体 结合或与主要参与抗体结合的氨基酸残基相比参与抗体结合程度显著较小 的氨基酸残基隔开的至少一个和至少两个连续的氨基酸分别是埋在以下核 心序列中的-His-和-Lys-Leu-：

-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-

其中

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa7是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa8是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

并且其中所述的氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa6、Xaa7、Xaa8分别不 参与抗体结合或与-His-和-Lys-Leu-结合部位相比参与抗体结合程度较小 至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa3是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa4是Phe；

Xaa5是Phe；

Xaa6是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa7是Glu或Asp，但尤其是Glu；且

Xaa8是Asp或Glu，但尤其是Asp。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少两 个独特的结合部位，其中所述的至少两个独特的结合部位每一个包含至少 两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中该至少两个连续的氨基 酸被至少一个不参与抗体结合或与所述的连续的氨基酸残基相比参与抗体 结合程度显著较小的氨基酸残基隔开，其分别是埋在以下核心序列中的代 表第一个和第二个结合部位的-Phe-Phe-和-Lys-Leu-：

Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；并且其中所述的氨基酸残基 Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa6分别不参与抗体结合或与-Lys-Leu-和 -Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少一 个独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更特别地至少三个 独特的结合部位，其中所述的独特的结合部位分别包含主要参与抗体结合 的至少一个和至少两个连续的氨基酸残基，其中该至少一个和至少两个连 续的氨基酸被至少一个不参与抗体结合或与主要参与抗体结合的氨基酸残 基相比参与抗体结合程度显著较小的氨基酸残基隔开，其中所述氨基酸残 基分别是埋在以下核心序列中的-His-和-Phe-Phe-和-Lys-Leu-：

His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，其中

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；并且其中所述的氨基酸残基 Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa6分别不参与抗体结合或与-His-、-Lys-Leu- 和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa3是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa4是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa5是Glu或Asp，但尤其是Glu；且

Xaa6是Asp或Glu，但尤其是Asp。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少两 个独特的结合部位，其中所述的至少两个独特的结合部位每一个包含至少 两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其中该至少两个连续的氨基 酸被至少一个不参与抗体结合或与所述的连续的氨基酸残基相比参与抗体 结合程度显著较小的氨基酸残基隔开，其分别是埋在以下核心序列中的代 表第一个和第二个结合部位的-Phe-Phe-和-Lys-Leu-：

Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Val、Ala、Leu、Met、Phe、正亮氨酸和Ile的氨基酸残 基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu和Ile的氨基酸残基；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；并且其中所述的氨基酸残基 Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa6分别不参与抗体结合或与-Lys-Leu-和 -Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度较小至显著较小。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中

Xaa1是His或Arg，但尤其是His；

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa3是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa4是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa5是Glu或Asp，但尤其是Glu；且

Xaa6是Asp或Glu，但尤其是Asp。

在本发明的一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人 源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少两个 独特的结合部位，其中所述的至少两个独特的结合部位每一个包含至少两 个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基，其分别是-Phe-Phe-Ala-Glu -，特别是-Phe-Phe-Ala-，但尤其是-Phe-Phe-和-Lys-Leu-，并且其 中所述的至少两个独特的结合部位分别呈现出SEQ ID NO：7所示的氨基 酸序列-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-和SEQ ID NO：8所示的氨基酸 序列His-Gln-Lys-Leu-Val-。

在本发明的一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人 源化抗体或人源化抗体片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少一个 独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更特别地至少三个独 特的结合部位，其中所述的至少一个或所述的至少两个独特的结合部位分 别包含主要参与抗体结合的至少一个和至少两个连续的氨基酸残基，其分 别是-Phe-Phe-和-Lys-Leu-和-His-，其中所述的独特的结合部位分 别插入在氨基酸序列-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-，和氨基酸序列-His-Gln -Lys-Leu-Val-中。

在本发明另一个实施方案中，嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化抗 体或人源化抗体片段包含识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少两个独特的 结合部位的抗原识别和结合部位，其中所述的至少两个独特的结合部位每 一个包含分别在SEQ ID NO：7和8中给出的氨基酸序列中的至少两个连续 的氨基酸残基，其中所述的连续的氨基酸残基，特别地是-Phe-Phe-和 -Lys-Leu-主要参与结合β-淀粉状蛋白。

在本发明另一个特别的实施方案中，提供了根据本发明的抗体或其片 段，其结合β-淀粉状蛋白上的4个独特的结合部位，其中所述的4个独特 的结合部位包括2个每一个包含一个氨基酸残基的结合部位和2个每一个 包含两个连续的氨基酸残基的结合部位，所述残基主要参与抗体结合，其 中所述的4个独特的结合部位在β-淀粉状蛋白上彼此密切接近地定位，并 且所述4个结合部位分别被至少一个不参与抗体结合或参与结合但与4个 独特的结合部位的所述一个氨基酸残基和所述两个连续的氨基酸残基相比 参与抗体结合程度显著较小的氨基酸残基隔开，因此形成构象不连续的表 位。

具体而言，第一种两个连续的主要参与抗体结合的氨基酸残基是埋在 以下核心序列中的-Lys-Leu-，且第二种至少两个连续的氨基酸残基是埋在 以下核心序列中的-Phe-Phe-；第一种单氨基酸残基是埋在以下核心序列中 的-His-且第二种单氨基酸残基是埋在以下核心序列中的-Asp-：

-Xaa1-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Asp- Xaa6，其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基，但尤其是 His；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基，但尤其是Gln；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基，但尤其是Val。

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基，但尤其是Ala；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Glu；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基，但尤其是Val；并且其中所述的氨基酸残基Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、 Xaa5和Xaa6不参与抗体结合或参与结合但与-His-、-Asp-、-Lys-Leu-和 -Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度显著较小。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体或其片段，其结合 β-淀粉状蛋白上的4个独特的结合部位，其中所述的4个独特的结合部位 包括2个每一个包含一个氨基酸残基的结合部位和2个每一个包含两个连 续的氨基酸残基的结合部位，其中第一种两个连续的主要参与抗体结合的 氨基酸残基是埋在以下核心序列中的-Lys-Leu-，且第二种至少两个连续的 氨基酸残基是埋在以下核心序列中的-Phe-Phe-；第一种单氨基酸残基是埋 在以下核心序列中的-His-且第二种单氨基酸残基是埋在以下核心序列中 的-Asp-：

-Xaa1-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Asp- Xaa6，其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基，但尤其是 His；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基，但尤其是Gln；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基，但尤其是Val。

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基，但尤其是Ala；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Glu；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe和Ile的氨基酸残 基，但尤其是Val；并且其中所述的氨基酸残基Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、 Xaa5和Xaa6不参与抗体结合或参与结合但与-His-、-Asp-、-Lys-Leu-和 -Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度显著较小。

在本发明特定的实施方案中，如上文所定义的识别和结合部位形成了 位于β-淀粉状蛋白的12至24位氨基酸残基之间、特别地14至23位氨基 酸残基之间、更特别地14至20位氨基酸残基之间区域内的构象上不连续 的表位，其中每一包含至少2个氨基酸残基的至少两个独特的识别和结合 部位分别位于位置16和17以及位置19和20，并且其中包含至少1个氨 基酸残基的至少一个独特的识别和结合部位位于位置14，所述残基主要参 与β-淀粉状蛋白的结合且其中所述独特的识别和结合部位至少在一侧的 侧翼存在氨基酸残基，特别地是残基21和22，并且被位于位置15和18 的一个氨基酸残基隔开，所述氨基酸残基不直接参与抗原的结合，或至少 基本上更小的程度。

又在本发明的另一个实施方案中，所述的至少三个独特的识别和结合 部位在两侧均存在氨基酸残基，特别地是残基12和13、以及残基21和22， 并且被位于位置15和18的一个氨基酸残基隔开，所述氨基酸残基不直接 参与抗原的结合，或至少基本上更小的程度。

在特别的实施方案中，所述的主要参与β-淀粉状蛋白结合的连续氨基 酸残基，特别地在位置16和17的-Lys-Leu-和在位置19和20的-Phe-Phe-， 被嵌入到以下核心区域内：

  Val-   His-   His-   Gln-   Lys-   Leu-   Val-   Phe-   Phe-   Ala-   Glu-  Asp   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23

在另一个特别的实施方案中，所述的主要参与β-淀粉状蛋白结合的氨 基酸残基，特别地在位置16和17的-Lys-Leu-和在位置19和20的-Phe- Phe-，以及在位置14的-His-被嵌入到以下核心区域内：

  Val-   His-   His-   Gln-   Lys-   Leu-   Val-   Phe-   Phe-   Ala-   Glu-   Asp-   Val-   Gly-   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25

在本发明的另一个实施方案中，提供了人源化抗体或人源化抗体片段， 其分别在轻链可变区和重链可变区中包含插入在一个或多个人类或灵长类 动物衍生的构架区中的至少一个非人源CDR，特别地两个非人源CDR， 更特别地三个非人源CDR，并且任选地包含衍生自人类或灵长类动物源抗 体的恒定区，所述人源化抗体或人源化抗体片段能够在包含以下氨基酸序 列(SEQ ID NO：11)的表位处特异地识别并结合β-淀粉状蛋白，特别地β- 淀粉状蛋白单体肽，更特别地β-淀粉状蛋白聚合肽，甚至更特别地分离的 或作为β-淀粉状蛋白斑一部分的β-淀粉状蛋白纤维、原纤维或纤丝：

Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，

其中，

Xaa1是选自His、Asn、Gln的氨基酸残基，但尤其是His；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基，但尤其是Gln；

Xaa3是选自Val、Leu和Ile的氨基酸残基，但尤其是Val；

Xaa4是选自Ala和Val的氨基酸残基，但尤其是Ala；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Glu；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Asp。

又在本发明的另一个实施方案中，提供了人源化抗体或人源化抗体片 段，其分别在轻链可变区和重链可变区中包含插入在一个或多个人类或灵 长类动物衍生的构架区中的至少一个非人源CDR，特别地两个非人源 CDR，更特别地三个非人源CDR，并且任选地包含衍生自人类或灵长类动 物源抗体的恒定区，所述人源化抗体或人源化抗体片段能够在包含以下氨 基酸序列的表位处特异地识别并结合β-淀粉状蛋白，特别地β-淀粉状蛋 白单体肽，更特别地β-淀粉状蛋白聚合肽，甚至更特别地分离的或作为β -淀粉状蛋白斑一部分的β-淀粉状蛋白纤维、原纤维或纤丝：

His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6，

其中，

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基，但尤其是Gln；

Xaa3是选自Val、Leu和Ile的氨基酸残基，但尤其是Val；

Xaa4是选自Ala和Val的氨基酸残基，但尤其是Ala；

Xaa5是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Glu；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基，但尤其是Glu；并且其中所述 的氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5和Xaa6不参与抗体结合或与-His-、 -Lys-Leu-和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合程度显著较小。

在本发明特定的实施方案中，从供体抗体、特别地从鼠的供体抗体得 到非人源CDR，所述抗体是针对不包含所述的独特的结合部位的抗原片段 而产生的。在表位区域的变动可能至少部分地是由超分子抗原构建体的应 用引起的，该超分子抗原构建体包含与β-淀粉状蛋白肽、特别地与β-淀粉 状蛋白肽Aβ1-16氨基酸序列相对应的抗原肽，该抗原肽用亲水部分，例如， 诸如聚乙二醇(PEG)修饰，其中所述的亲水部分通过至少一个，特别地一 个或两个氨基酸，例如，诸如赖氨酸、谷氨酸和半胱氨酸或任何其它能够 作为亲水部分偶联到肽片段的连接装置的合适的氨基酸或氨基酸类似物， 而共价地连接到每个抗原肽的末端，如在下文中免疫方法中所描述的那样。 如本文所描述的那样，当利用PEG作为亲水部分时，游离PEG末端共价 地连接到磷脂酰乙醇胺或任何其它适合于作为锚定元件的化合物上，例如， 以将抗原性构建体嵌到脂质体的双分子层中。

具体而言，从下述鼠供体抗体获得非人源CDR，其中所述抗体展示出 根据布达佩斯条约于2005年12月1日以保藏号DSM ACC2750保藏在位 于德国布劳恩斯切魏格，38124布劳恩斯切魏格，马斯切尔奥德尔韦格1B 的“德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”中的ACI-01-Ab7C2(在本申请中也称 为“mC2”)的特征性特性。

在本发明的一个实施方案中，从鼠供体抗体ACI-01-Ab7C2(在本申请 中也称为“mC2”)获得非人源CDR，所述抗体根据布达佩斯条约于2005 年12月1日以保藏号DSM ACC2750保藏在位于德国布劳恩斯切魏格， 38124布劳恩斯切魏格，马斯切尔奥德尔韦格1B的“德意志微生物保藏 中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”中。

将脂质A用作免疫方案的一部分也能促进表位区域中的变动。

在特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包 含整合到人类或灵长类动物衍生的构架区中的至少一个具有选自以下序列 的氨基酸序列的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代 表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区 (LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4。

在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，其 中所述的人源化抗体包含整合到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的 至少一个具有选自以下序列的氨基酸序列的肽：代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3。

又在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段， 其中所述的人源化抗体包含整合到人类或灵长类动物衍生的轻链构架区中 的具有代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的 肽。

具体而言，本发明涉及轻链可变区(LCVR)，其包含整合到人类或灵长 类动物衍生的构架区中的至少一个具有代表轻链可变区(LCVR)CDR1的 SEQ ID NO：4的氨基酸序列的肽。

在另一个特定的实施方案中，本发明涉及重链可变区(HCVR)，其包 含整合到人类或灵长类动物衍生的构架区中的至少一个具有选自以下序列 的氨基酸序列的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代 表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3。

本发明还涉及人源化抗体或人源化抗体片段，其包含整合到人类或灵 长类动物衍生的构架区中的至少两个肽，所述的肽是不同的且展示出选自 以下序列的氨基酸序列：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、 代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区 (HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区(LCVR)CDR1的 SEQ ID NO：4、代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻 链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，其中相同的CDR不能在抗体中 出现两次。具体而言，如果存在的至少两个CDR都是轻链可变区(LCVR) 的CDR，则至少一个所述CDR必须是由SEQ ID NO：4代表的CDR1。

本发明还包括人源化抗体或人源化抗体片段，包含整合到人类或灵长 类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有选自以下序列的氨基酸序列的 肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3；但特别地是这样的人源化抗体或人源化抗体片段，其中相同的 CDR不能在该抗体中出现两次。

具体而言，本发明涉及重链可变区(HCVR)，其包含整合到人类或灵 长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有选自以下序列的氨基酸序列 的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3。

在其它实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包含 整合到人类或灵长类动物衍生的轻链构架区中的至少两个具有选自以下序 列的氨基酸序列的肽：代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、 代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区 (LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6。

具体而言，本发明涉及轻链可变区(LCVR)，其具有整合到人类或灵长 类动物衍生的轻链构架区中的至少两个具有选自以下序列的氨基酸序列的 肽：代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、代表轻链可变区 (LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，其中相同的CDR不能在该抗体中出现两次，具体而言，至少 一个所述CDR必须是由SEQ ID NO：4代表的CDR1。

本发明还涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包含整合到人类或灵长 类动物衍生的重链构架区中的具有以下氨基酸序列的肽：代表重链可变区 (HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，特别地以上面 所指出的顺序。

具体而言，本发明涉及重链可变区(HCVR)，其包含整合到人类或灵 长类动物衍生的重链构架区中的具有以下氨基酸序列的肽：代表重链可变 区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，特别地以上 面所指出的顺序。

本发明还包括人源化抗体或人源化抗体片段，其包含整合到人类或灵 长类动物衍生的轻链构架区中的具有以下氨基酸序列的肽：代表轻链可变 区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，特别地以上 面所指出的顺序。

具体而言，本发明涉及轻链可变区(LCVR)，包含整合到人类或灵长类 动物衍生的轻链构架区中的具有以下氨基酸序列的肽：代表轻链可变区 (LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，特别地以上面 所指出的顺序。

本发明还涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包含整合到人类或灵长 类动物衍生的构架区中的至少三个具有选自以下序列的氨基酸序列的肽： 代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、代表轻 链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区(LCVR)CDR3 的SEQ ID NO：6，但特别地是这样的人源化抗体或人源化抗体片段，其中 相同的CDR不能在该抗体中出现两次。

在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，所 述抗体包含整合到人类或灵长类动物衍生的构架区中的至少四个具有选自 以下序列的氨基酸序列的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变 区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区(LCVR)CDR1的 SEQ ID NO：4、代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻 链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，但特别地是这样的人源化抗体 或人源化抗体片段，其中相同的CDR不能在该抗体中出现两次。

在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包 含整合到人类或灵长类动物衍生的构架区中的至少五个具有选自以下序列 的氨基酸序列的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代 表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区 (HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区(LCVR)CDR1的 SEQ ID NO：4、代表轻链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻 链可变区(LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6，但特别地是这样的人源化抗体 或人源化抗体片段，其中相同的CDR不能在该抗体中出现两次。

在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体或人源化抗体片段，包 含整合到人类或灵长类动物衍生的构架区中的具有以下氨基酸序列的肽： 代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1、代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3，以及代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4、代表轻 链可变区(LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5和代表轻链可变区(LCVR)CDR3 的SEQ ID NO：6。

在特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、重链可变区(HCVR)、 或其片段，其中所述的人源化抗体、重链可变区(HCVR)或其片段至少包 含整合到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的具有代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2氨基酸序列的肽。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、重链可变区 (HCVR)、或其片段，其中所述的人源化抗体、重链可变区(HCVR)或其片 段至少包含整合到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的具有代表重链 可变区(HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3氨基酸序列的肽。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、重链可变区 (HCVR)、或其片段，所述的抗体、重链可变区(HCVR)或其片段包含整合 到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有以下氨基酸序列 的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1和代表重链可变区 (HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、重链可变区 (HCVR)、或其片段，所述的抗体、重链可变区(HCVR)或其片段包含整合 到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有以下氨基酸序列 的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR1的SEQ ID NO：1和代表重链可变区 (HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、重链可变区 (HCVR)、或其片段，所述的抗体、重链可变区(HCVR)或其片段包含整合 到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有以下氨基酸序列 的肽：代表重链可变区(HCVR)CDR2的SEQ ID NO：2和代表重链可变区 (HCVR)CDR3的SEQ ID NO：3。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、轻链可变区 (LCVR)、或其片段，所述的抗体、轻链可变区(LCVR)或其片段包含整合 到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有以下氨基酸序列 的肽：代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4和代表轻链可变区 (LCVR)CDR2的SEQ ID NO：5。

在另一特定的实施方案中，本发明涉及人源化抗体、轻链可变区 (LCVR)、或其片段，所述的抗体、轻链可变区(LCVR)或其片段包含整合 到人类或灵长类动物衍生的重链构架区中的至少两个具有以下氨基酸序列 的肽：代表轻链可变区(LCVR)CDR1的SEQ ID NO：4和代表轻链可变区 (LCVR)CDR3的SEQ ID NO：6。

本发明还包含人源化抗体或人源化抗体片段，其中小鼠C2抗体的重 链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的每一个均贡献了至少一个其 CDR区给人源化抗体的至少两个CDR区。所得到的人源化抗体或人源化 抗体片段因此可以包含：

-至少和代表CDR1(LCVR)的SEQ ID NO：4的氨基酸序列联合的代表 CDR1(HCVR)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

-至少和代表CDR1(LCVR)的SEQ ID NO：4的氨基酸序列联合的代表 CDR2(HCVR)的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

-至少和代表CDR1(LCVR)的SEQ ID NO：4的氨基酸序列联合的代表 CDR3(HCVR)的SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

-至少和代表CDR2(LCVR)的SEQ ID NO：5的氨基酸序列联合的代 表CDR1(HCVR)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

-至少和代表CDR2(LCVR)的SEQ ID NO：5的氨基酸序列联合的代 表CDR2(HCVR)的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

-至少和代表CDR3(LCVR)的SEQ ID NO：6的氨基酸序列联合的代 表CDR2(HCVR)的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

-至少和代表CDR3(LCVR)的SEQ ID NO：6的氨基酸序列联合的代 表CDR1(HCVR)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

-至少和代表CDR2(LCVR)的SEQ ID NO：5的氨基酸序列联合的代 表CDR3(HCVR)的SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

-至少和代表CDR3(LCVR)的SEQ ID NO：6的氨基酸序列联合的代 表CDR3(HCVR)的SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明涉及上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段， 或人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体包含人类或灵长类动物来源的 轻链和/或重链恒定区。

在另一个实施方案中，本发明涉及嵌合抗体或嵌合抗体片段，或人源 化抗体或人源化抗体片段，其中通过保守替换改变至少一个，特别地至少 一个但不超过5个、更特别地至少一个但不超过4个、甚至更特别地至少 一个但不超过3个、但尤其是至少一个但不超过2个如SEQ ID NO：1-6 给出的代表轻链和/或重链CDR区的氨基酸，以至于该抗体保留了其完全 的功能。

具体而言，本发明涉及嵌合抗体或嵌合抗体片段，或人源化抗体或人 源化抗体片段，其中在如SEQ ID NO：5给出的轻链可变区(LCVR)的 CDR2中，在Kabat位置50处的Lys被选自Arg、Gln和Glu的氨基酸残 基、特别地被Arg替换。

具体而言，本发明涉及轻链可变区(LCVR)，其中在如SEQ ID NO：5 给出的CDR2中，在Kabat位置50处的Lys被选自Arg、Gln和Glu的 氨基酸残基、特别地被Arg替换。

在另一实施方案中，本发明涉及嵌合抗体或嵌合抗体片段，或人源化 抗体或人源化抗体片段，其中在如SEQ ID NO：5给出的轻链可变区 (LCVR)的CDR2中，在Kabat位置53处的Ser被选自Asn和Thr的氨 基酸残基、特别地被Asn替换。

具体而言，本发明涉及轻链可变区(LCVR)，其中在如SEQ ID NO：5 给出的CDR2中，在Kabat位置53处的Ser被选自Asn和Thr的氨基酸 残基、特别地被Asn替换。

在本发明的一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段，或人 源化抗体或人源化抗体片段，其中重链可变区(HCVR)具有分别与SEQ ID NO：15和16给出的序列90％、特别地95％、更特别地98％同一的氨基酸 序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段，或 人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链可变区(LCVR)具有分别与SEQ ID NO：12和13给出的序列90％、特别地95％、更特别地98％同一的氨 基酸序列。

在本发明的再另一个实施方案中，提供了人源化抗体或人源化抗体片 段，其中重链可变区(HCVR)的至少两个、但尤其是三个CDR区具有与 SEQ ID NO：1-3给出的相应的CDR区90％、特别地95％、更特别地98％ 同一的氨基酸序列。

在本发明的其它实施方案中，提供了人源化抗体或人源化抗体片段， 其中轻链可变区(LCVR)的至少两个、但尤其是三个CDR区具有与SEQ ID NO：4-6给出的相应的CDR区90％、特别地95％、更特别地98％同一的 氨基酸序列。

又在另一个实施方案中，本发明涉及上文描述的根据本发明的嵌合抗 体或嵌合抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中重链可变区 (HCVR)具有分别与SEQ ID NO：15和16给出的序列90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

又在另一个实施方案中，本发明涉及上文描述的根据本发明的嵌合抗 体或嵌合抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链可变区 (LCVR)具有分别与SEQ ID NO：12和13给出的序列90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

又在另一个实施方案中，本发明涉及上文描述的根据本发明的嵌合抗 体或嵌合抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中重链可变区 (HCVR)的至少一个、特别地至少两个、但尤其是三个CDR区具有与SEQ ID NO：1-3给出的相应的CDR区90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

又在另一个实施方案中，本发明涉及上文描述的根据本发明的嵌合抗 体或嵌合抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链可变区 (LCVR)的至少一个、特别地至少两个、但尤其是三个CDR区具有与SEQ ID NO：4-6给出的相应的CDR区90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。

又在另一个实施方案中，本发明涉及上文描述的根据本发明的人源化 抗体，其中通过替换为来自鼠抗体ACI-01-Ab7C2的相应区域的氨基酸或 与之保守的替换来改变分别获自人类种系(human germline)VH和VK序 列的受体构架序列的至少一个氨基酸。

具体而言，本发明涉及重链可变区和分别包含该重链可变区的人源化 抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH序列的 受体构架序列中Kabat位置47处的Trp被选自Leu、正亮氨酸、Ile、Val、 Met、Ala和Phe的氨基酸、特别地被选自Leu和Ile的氨基酸、但尤其是 被Leu替换，诸如如SEQ ID NO：15所示。

本发明还分别涉及重链可变区和包含该重链可变区的人源化抗体，其 中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH序列的受体构架 序列中Kabat位置94处的Arg被选自Ser和Thr的氨基酸、但尤其是被 Ser替换，诸如如SEQ ID NO：15所示。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII 的VH序列的受体构架序列中Kabat位置47处的Trp被选自Leu、正亮 氨酸、Ile、Val、Met、Ala和Phe的氨基酸、特别地被选自Leu和Ile的 氨基酸、但尤其是被Ser替换，并且Kabat位置94处的Arg被选自Ser 和Thr的氨基酸、但尤其是被Ser替换，诸如如SEQ ID NO：15所示。

本发明还分别涉及轻链可变区和包含该轻链可变区的人源化抗体，其 中在获自人类种系轻链可变区KABAT亚组VkII的Vk序列的受体构架序 列中Kabat位置45处的Gln被选自Lys、Arg、Gln和Asn的氨基酸、特 别地被选自Lys和Arg的氨基酸、但尤其是被Lys替换。

本发明还分别涉及轻链可变区和包含该轻链可变区的人源化抗体，其 中在获自人类种系轻链可变区KABAT亚组VkII的Vk序列的受体构架序 列中Kabat位置87处的Tyr被选自Phe、Leu、Val、Ile和Ala的氨基酸、 特别地被选自Leu和Phe的氨基酸、但尤其是被Phe替换。

本发明还分别涉及轻链可变区和包含该轻链可变区的人源化抗体，其 中在获自小鼠单克隆抗体、特别地鼠抗体ACI-01-Ab7C2的CDR2区(诸如 如SEQ ID NO：12所示)的Kabat位置50处的Lys被选自Arg、Gln、His 和Asn的氨基酸、但尤其是被Arg替换。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及轻链可变区和包含该轻链可 变区的人源化抗体，其中在获自小鼠单克隆抗体、特别地鼠抗体 ACI-01-Ab7C2的CDR2区(诸如如SEQ ID NO：12所示)的Kabat位置53 处的Asn被选自Ala、Val、Leu、Ser和IIe的氨基酸、但尤其是被Ser替 换。

又在另一个实施方案中，本发明涉及人源化抗体，其中在获自人类种 系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH序列的受体构架序列中Kabat位 置47处的Trp被选自Leu、正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala和Phe的氨 基酸、特别地被选自Leu和Ile的氨基酸、但尤其是被Leu替换；并且在获 自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH序列的受体构架序列中 Kabat位置94的Arg被选自Ser和Thr的氨基酸、但尤其是被Ser替换， 诸如如SEQ ID NO：15所示；且在获自人类种系轻链可变区KABAT亚组 VkII的Vk序列的受体构架序列中Kabat位置87的Tyr被选自Phe、Leu、 Val、Ile和Ala的氨基酸、特别地被选自Leu和Phe的氨基酸、但尤其 是被Phe替换。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII 的VH序列的受体构架序列(如SEQ ID NO：15所示)中Kabat位置47 的Trp被Leu替换。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII 的VH序列的受体构架序列中Kabat位置94的Arg被Ser替换，诸如如 SEQ ID NO：15所示。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII 的VH序列的受体构架序列中Kabat位置47的Trp被Leu或Ile、但尤其 是被Leu替换；并且在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH 序列的受体构架序列中Kabat位置94的Arg被Ser替换，诸如如SEQ ID NO：15所示。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及轻链可变区和包含该轻链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系轻链可变区KABAT亚组VkII 的Vk序列的受体构架序列中Kabat位置87的Tyr被Phe替换。

又在另一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可 变区的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII 的VH序列的受体构架序列中Kabat位置47的Trp被选自Leu和Ile的氨 基酸、但尤其是被Leu替换；并且在获自人类种系重链可变区KABAT亚组 VHIII的VH序列的受体构架序列中Kabat位置94的Arg被Ser替换，诸 如如SEQ ID NO：15所示；并且在获自人类种系轻链可变区KABAT亚组 VkII的Vk序列的受体构架序列中Kabat位置87的Tyr被Phe替换。

在一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可变区 的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH 序列的受体构架序列中Kabat位置47的Trp被选自Leu、正亮氨酸、Ile、 Val、Met、Ala和Phe的氨基酸、特别地被Leu和Ile、但尤其是被Leu 替换；并且Kabat位置94的Arg被选自Ser和Thr的氨基酸、但尤其是被 Ser替换，诸如如SEQ ID NO：15所示；并且其中在获自小鼠单克隆抗体、 特别地鼠抗体ACI-01-Ab7C2的CDR2区Kabat位置50的Lys被选自Arg、 Gln、His和Asn的氨基酸、但尤其是被Arg替换。

在一个实施方案中，本发明分别涉及重链可变区和包含该重链可变区 的人源化抗体，其中在获自人类种系重链可变区KABAT亚组VHIII的VH 序列的受体构架序列中Kabat位置47的Trp被选自Leu、正亮氨酸、Ile、 Val、Met、Ala和Phe的氨基酸、特别地被Leu和Ile、但尤其是被Leu 替换；并且Kabat位置94的Arg被选自Ser和Thr的氨基酸、但尤其是被 Ser替换，诸如如SEQ ID NO：15所示；并且其中在获自小鼠单克隆抗体、 特别地鼠抗体ACI-01-Ab7C2的CDR2区Kabat位置53的Asn被选自Ala、 Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸、但尤其是被Ser替换。

在特定的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：12的轻链可变区。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：12的轻链 可变区的人源化抗体。

在特定的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：13所示的包括信号序 列的轻链可变区。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：13所示的 包括信号序列的完整的轻链可变区的人源化抗体。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包括SEQ ID NO：12的轻链 可变区和SEQ ID NO：14的轻链恒定区的人源化抗体。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包括SEQ ID NO：13的完整 的轻链可变区和SEQ ID NO：14的轻链恒定区的人源化抗体。

在特定的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：15的重链可变区。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：15的重链 可变区的人源化抗体。

在特定的实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：16所示的包括信号序 列的重链可变区。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：16所示的 包括信号序列的完整的重链可变区的人源化抗体。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：15的重链 可变区和SEQ ID NO：17的重链恒定区的人源化抗体。

在本发明的另一特定实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：16的重链 可变区和SEQ ID NO：17的重链恒定区的人源化抗体。

在一个实施方案中，如本文所描述的根据本发明的人源化抗体与具有 至少30个、特别地至少35个、更特别地至少38个、甚至更特别地至少 40个氨基酸残基的Aβ单体肽和/或包含多个所述Aβ单体单位的Aβ聚合 可溶性淀粉状蛋白肽，但尤其是与Aβ1-42单体肽和/或包含多个所述Aβ1-42 单体单位的Aβ聚合可溶性淀粉状蛋白肽共孵育，特别地以高达1∶1000、 特别地高达1∶500，更特别地高达1∶300，甚至更特别地高达1∶200的抗体 对Aβ1-42的摩尔浓度比，但尤其是1∶10至1∶100之间的摩尔浓度比共孵 育后，抑制了Aβ单体聚集成高分子的聚合原纤维。

具体而言，根据本发明的抗体和淀粉状蛋白单体肽和/或聚合可溶性淀 粉状蛋白肽的共孵育在28℃至40℃之间，特别地在32℃和38℃之间，更 特别地在37℃的温度进行24小时至60小时，特别地30小时至50小时， 更特别地48小时，但尤其是24小时。

在本发明特定的实施方案重，与淀粉状蛋白单体肽和/或聚合可溶性淀 粉状蛋白肽的共孵育在37℃的温度进行24小时。

具体而言，包括任何功能等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体， 特别是人源化抗体，结合Aβ1-42单体肽和/或包含多个所述Aβ1-42单体单位 的Aβ聚合可溶性淀粉状蛋白肽，并且在与Aβ1-42单体肽和/或包含多个所 述Aβ1-42单体单位的Aβ聚合可溶性淀粉状蛋白肽共孵育后，抑制了Aβ单 体和/或聚合体聚集成高分子的聚合原纤维。

在一个实施方案中，与在缓冲液中孵育的分别的淀粉状蛋白肽单体(对 照)相比较，在高达1∶1000的抗体对Aβ1-42的摩尔浓度比、特别地1∶10 至1∶100之间的摩尔浓度比、尤其是1∶10的摩尔浓度比时，包括任何功能 等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体，特别是人源化抗体，至少50 ％、特别地至少60％、特别地至少65％、更特别地至少75％、甚至特别 地至少80％、但尤其是85％-90％抑制Aβ单体和/或包含多个所述Aβ单 体单位的Aβ可溶性聚合体聚集成高分子的聚合原纤维。

在本发明特定的实施方案中，在1∶100的抗体对Aβ1-42的摩尔浓度比 时，包括任何功能等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体，特别是人 源化抗体，至少30％抑制Aβ单体和/或包含多个所述Aβ单体单位的Aβ 可溶性聚合体聚集成高分子的聚合原纤维。

在本发明另一特定的实施方案中，在1∶10的抗体对Aβ1-42的摩尔浓 度比时，包括任何功能等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体，特别 是人源化抗体，至少80％抑制Aβ单体和/或包括多个所述Aβ单体单位的 Aβ可溶性聚合体聚集成高分子的聚合原纤维。

根据本发明和如本文所描述的抗体与形成淀粉状蛋白的单体和/或聚 合肽，但特别是与淀粉状蛋白形式(1-42)的结合导致了对单体和/或聚合的 形成淀粉状蛋白的肽聚集成高分子原纤维或纤丝的抑制。通过对形成淀粉 状蛋白的单体和/或聚合肽聚集的抑制，根据本发明的抗体能够预防或减缓 淀粉状蛋白斑，特别是淀粉状蛋白形式(1-42)的形成，众所周知淀粉状蛋白 形式(1-42)通过二级构象的改变变得不可溶，并且是患病动物或人类脑中淀 粉状蛋白斑的主要部分。

根据本发明的抗体的聚集抑制潜力可以通过任何本领域所熟知的合适 的方法来测定，特别是通过密度梯度超速离心法，随后通过在预先形成梯 度上的SDS-PAGE沉降分析法和/或通过硫代黄素T(thioflavin，Th-T)荧光 测定法来测定。

在一个实施方案中，本发明涉及包括任何功能等效抗体或其功能部分 的如本文所描述的抗体，特别是人源化抗体，所述抗体在与由具有至少30 个、特别地至少35个、更特别地至少38个、甚至更特别地至少40个氨基 酸残基的Aβ单体肽，但尤其是Aβ1-42单体肽聚集形成的预形成高分子聚 合淀粉状蛋白原纤维或纤丝共孵育，特别地以1∶5至1∶1000之间、特别地 以1∶10至1∶500之间、更特别地以1∶10至1∶300之间、甚至更特别地以1∶10 至1∶100之间的摩尔浓度比共孵育后，能够使预形成的聚合的原纤维或纤 丝解聚至少20％，特别地至少30％，更特别地至少35％，甚至更特别地 至少40％，但尤其是至少50％或更高。

在本发明特定的实施方案中，通过密度梯度超速离心法，随之通过在 预先形成的梯度上的SDS-PAGE沉降分析法分别测定抗体的聚集抑制和 解聚潜力。

在本发明另一特定的实施方案中，通过硫代黄素T(Th-T)荧光测定法 来分别测定抗体的聚集抑制和解聚潜力。

在另一特定的实施方案中，根据本发明的抗体与淀粉状蛋白预形成的 高分子聚合淀粉状蛋白原纤维或纤丝在28℃至40℃之间的温度，特别地在 32℃和38℃之间，更特别地在37℃共孵育12小时至36小时，特别地18 小时至30小时，更特别地24小时。

具体而言，与预形成的高分子聚合淀粉状蛋白原纤维或纤丝在37℃的 温度共孵育24小时。

在本发明特定的实施方案中，于1∶100的抗体对Aβ1-42的摩尔浓度比 时，包括任何功能等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体，特别是人 源化抗体，能够使预形成的聚合原纤维或纤丝解聚至少24％。

在本发明另一特定的实施方案中，于1∶10的抗体对Aβ1-42的摩尔浓 度比时，包括任何功能等效抗体或其功能部分的根据本发明的抗体，特别 是人源化抗体，能够使预形成的聚合原纤维或纤丝解聚至少32％。

通过形成淀粉状蛋白的聚合原纤维或纤丝的解聚，根据本发明的抗体 能够预防或减缓淀粉状蛋白斑的形成，这能导致与疾病相关症状的缓解及 其进展的延缓或逆转。

因此，本发明另一个实施方案提供了如上文所描述的包括任何功能等 效抗体或其功能部分的抗体，特别是人源化抗体，所述抗体能够降低患有 导致脑中Aβ浓度增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，但尤其是 人类脑中Aβ的总量。

在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明和如上文所描述的人源 化抗体，所述抗体是双功能的，因为它表现出聚集抑制特性以及解聚特性 两者，特别是配以高度的构象敏感性。

具体而言，本发明涉及根据本发明和如上文所描述的嵌合抗体或嵌合 抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体与淀粉状蛋白单体 肽和/或聚合可溶性淀粉状蛋白肽，特别是β-淀粉状蛋白单体肽，例如，诸 如Aβ单体肽1-39、1-40、1-41或1-42，和/或包含多个所述Aβ单体单位 的聚合可溶性β-淀粉状蛋白肽，但尤其是Aβ1-42单体和/或包含多个所述 Aβ1-42单体单位的Aβ聚合可溶性淀粉状蛋白肽共孵育后，抑制了Aβ单体 聚集成高分子的聚合原纤维或纤丝，并且此外，在与由淀粉状蛋白单体肽， 特别是β-淀粉状蛋白单体肽，例如，诸如Aβ单体肽1-39、1-40、1-41或 1-42，但尤其是Aβ1-42单体肽的聚集形成的预形成高分子聚合淀粉状蛋白 原纤维或纤丝共孵育后，能够解聚预形成的聚合原纤维或纤丝。

另一方面，本发明涉及根据本发明和如上文所描述的嵌合抗体或嵌合 抗体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体能够引起β折叠构 象向α螺旋和/或无规则卷曲构象，但特别是无规则卷曲构象，甚至更特别 的是在分子内给定区域(尤其是在Aβ蛋白的Tyr 10和Val12环境中)的无 规则卷曲构象的转变，这导致了以β折叠为代价的无规则卷曲构象的增加， 以及预形成的高分子聚合淀粉状蛋白原纤维或纤丝的溶解的提高。具体而 言，当与在缓冲液中孵育的分别的预形成淀粉状蛋白聚合原纤维或纤丝(对 照)相比较，β折叠构象减少了至少30％，特别地至少35％，以及更特别 地至少40％及更多。

通过固态13C NMR光谱学，但具体而言，通过测定Aβ1-42肽中的Tyr 10和Val 12Cβ的构象的积分强度来测定抗体在引起二级结构转变中的潜 力。

在本发明的其它实施方案中，提供了根据本发明和如上文所描述的包 含至少一个轻链或其片段、或至少一个重链或其片段的嵌合抗体或嵌合抗 体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述抗体或片段以至少约 1×10-7M至至少约1×10-12M，特别地至少约1×10-8M至至少约1× 10-11M，更特别地至少约1×10-9M至至少约1×10-10M，甚至更特别地至 少约1×10-8M至至少约2×10-8M之间范围的KD的高结合亲和力与Aβ 单体结合，但优选地不显示出任何显著的与淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的 交叉反应性。

在本发明的另一实施方案中，提供了根据本发明和如上文所描述的包 含至少一个轻链或其片段、或至少一个重链或其片段的嵌合抗体或嵌合抗 体片段，或人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述抗体或片段以至少约 1×10-7M至至少约1×10-12M，特别地至少约1×10-8M至至少约1× 10-11M，更特别地至少约1×10-9M至至少约1×10-10M，甚至更特别地至 少约2×10-9M至至少约5×10-9M之间范围的KD的高结合亲和力与Aβ 纤维、原纤维或纤丝结合，但优选地不显示出任何显著的与淀粉状蛋白前 体蛋白(APP)的交叉反应性。

在另一实施方案中，根据本发明和如上文描述的抗体或其片段表现出 比与Aβ单体的结合亲和力高至少2倍，特别地至少4倍，特别地至少10 倍，特别地至少15倍，更特别地高至少20倍，但尤其是至少25倍的与Aβ 纤维、原纤维或纤丝的结合亲和力。

在另一实施方案中，提供了如上文所描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段， 或人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体基本上与哺乳动物、特别是人 类脑中的包括Aβ斑在内的聚集的Aβ结合，但优选地不显示出任何显著的 与淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的交叉反应性。

在本发明的另一方面，提供了如上文所描述的嵌合抗体或嵌合抗体片 段，或人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体基本上与哺乳动物、特别 是人类脑中的可溶的聚合淀粉状蛋白、特别是包括Aβ单体在内的淀粉状 蛋白β(Aβ)结合，但优选地不显示出任何显著的与淀粉状蛋白前体蛋白 (APP)的交叉反应性。

还提供了根据本发明和如上文所描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段，或 人源化抗体或人源化抗体片段，所述抗体显著地减少哺乳动物，特别是人 类脑中的Aβ斑块负荷。这可以通过以下方法达到：使抗体与斑块结合， 或通过诱导构象的转变和结合并稳定组织和/或体液、特别是脑中解聚的和 溶解的淀粉状蛋白形式，尤其是淀粉状蛋白β(Aβ)形式，从而通过使纤维 解聚为可溶的聚合或单体形式，从而改变淀粉状蛋白、特别是淀粉状蛋白 β(Aβ)之间的平衡，使不溶和聚集状态转变为其可溶形式。通过根据本发 明的抗体的活性，使得外周的清除和代谢是占优势的，而不是沉积于组织 和/或体液、特别是脑中。由此，不使抗体与斑块结合也能得到根据本发明 的抗体的有益效果。

通过这一稳定活性，根据本发明的抗体能够中和组织和/体液中聚合和 较少聚集的可溶淀粉状蛋白、特别是淀粉状蛋白β(Aβ)蛋白的毒性作用。 在本发明特定的实施方案中，根据本发明的抗体因此可以不一定需要结合 脑中聚集的淀粉状蛋白β即能达到其有益效果。

在本发明的其它方面，提供了根据本发明和如上文描述的人源化抗体 或人源化抗体片段，其包含掺入有至少一个、特别地至少两个以及更特别 地三个获自小鼠供体抗体、特别是获自小鼠抗体ACI-01-Ab7C2(在本申请 中称为“mC2”，且对于人源化C2抗体，称为“hC2”)的CDR区的至少 一个轻链或其片段、或至少一个重链或其片段，其中所述抗体或其片段具 有比小鼠供体抗体高至少5倍、特别地至少8倍、更特别地至少10倍、但 尤其是至少15倍的对Aβ抗原的亲和力，其中所述抗体ACI-01-Ab7C2于 2005年12月1日以保藏号DSM ACC2750保藏在位于德国布劳恩斯切魏 格，38124布劳恩斯切魏格，马斯切尔奥德尔韦格1B的“德意志微生物 保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”中。

在一个实施方案中，本发明的抗体可以是任何同种型和亚型(例如， IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2)的完整抗体(例 如，具有两个全长的轻链和两个全长的重链)；但尤其是IgG4同种型抗体； 备选地，在另一个实施方案中，其可以是完整抗体的抗原结合片段(例如， Fab、F(ab′)2和Fv)。

因此，本发明还涉及本文描述的抗体的抗原结合片段。在本发明的一 个实施方案中，该片段选自：Fab片段、Fab′片段、F(ab)2片段以及Fv片 段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物以及任一上述抗体和片段的表位 结合片段。

在另一个实施方案中，将本发明的抗体或抗原结合片段与聚乙二醇缀 合。在另一个实施方案中，对本发明抗体的恒定区进行修饰以相对于未修 饰的抗体减少至少一种恒定区介导的生物效应子功能。在另一个实施方案 中，本发明的抗体或抗原结合片段包含具有经改变的效应子功能的Fc区。

本发明还涉及包含编码根据本发明和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗 体片段、或人源化抗体或人源化抗体片段的核苷酸序列的核苷酸分子。

具体而言，本发明涉及包含编码如分别在SEQ ID NO：2和3中给出 的一段连续氨基酸分子(其代表重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)2 和3)的核苷酸序列、或其互补序列的核苷酸分子。

更具体地，本发明涉及包含编码如SEQ ID NO：4给出的代表轻链可 变区(LCVR)的互补决定区(CDR)1的一段连续氨基酸分子的核苷酸序列、 或其互补序列的核苷酸分子。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO：18和 SEQ ID NO：19给出的核苷酸序列、或其互补序列的核苷酸分子，其中所 述核苷酸分子分别编码重链可变区(HCVR)的CDR2和CDR3的氨基酸序 列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含如SEQ ID NO：20给出的 核苷酸序列、或其互补序列的核苷酸分子，其中所述核苷酸分子为编码轻 链可变区(LCVR)CDR1的核苷酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：21的核苷酸 序列、或其互补序列的核苷酸分子，其中所述核苷酸分子编码轻链可变区。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：22的核苷酸 序列、或其互补序列的核苷酸分子，其中所述核苷酸分子编码包括了信号 序列的完整的轻链可变区。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：22的编码轻 链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO：23的编码轻链恒定区的核苷酸序列 的核苷酸分子。本发明还包含所述核苷酸分子的互补链。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：24的编码重 链可变区的核苷酸序列的核苷酸分子。本发明还包含所述核苷酸分子的互 补链。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：25的编码包 括了信号序列的完整的重链可变区的核苷酸序列的核苷酸分子。本发明还 包含所述核苷酸分子的互补链。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：25的编码重 链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO：26的编码重链恒定区的核苷酸序列 的核苷酸分子。本发明还包含所述核苷酸分子的互补链。

本发明还包括分离的或作为较大核苷酸分子的一部分的下述核苷酸序 列，其中所述核苷酸序列杂交至上述本发明的编码抗体的核苷酸序列之一、 特别地杂交至其互补链。

具体而言，本发明涉及在常规杂交条件下，特别地在严格杂交条件下 杂交至在SEQ ID NO：18-26和29-32给出的任一核苷酸序列的核苷酸序 列，特别地杂交至其互补链的核苷酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含根据本发明和如上文提及 的核酸分子的表达载体。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含表达载体的细胞，其中所 述表达载体包含根据本发明和如上文提及的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含治疗有效量的根据本发明的抗 体，但特别是包括任何功能等效抗体或任何衍生物或其功能部分在内的根 据本发明和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人源化抗体或人源 化抗体片段的组合物；具体而言是这样的组合物，即其为任选地还包含可 药用载体的药物组合物。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的抗体。

本发明还包含混合物，所述混合物包含治疗有效量的抗体，特别是根 据本发明的单克隆抗体，但特别是包括任何功能等效抗体或任何衍生物或 其功能部分在内的根据本发明和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段、 或人源化抗体或人源化抗体片段，以及任选地其它生物活性物质和/或可药 用载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

具体而言，本发明涉及混合物，其中其它生物活性物质是在治疗淀粉 状变性中使用的化合物，所述淀粉状变性是一组与淀粉状蛋白或淀粉状蛋 白样蛋白，诸如参与阿尔茨海默病的Aβ蛋白相关的疾病和病症。

在本发明的另一个实施方案中，其它生物活性物质或化合物还可以是 可用于治疗由淀粉状蛋白β引起的淀粉状变性或可以用于治疗其它神经病 症的治疗剂。

其它生物活性物质或化合物可以通过与根据本发明的抗体相同或相似 的机理，或通过不相关的作用机理，或通过多种相关和/或不相关的作用机 理发挥它的生物学效果。

一般地，其它的生物活性化合物可以包括中子透射增强剂、精神病治 疗药物、乙酰胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻断剂、生物胺、苯并二氮类镇 静剂、乙酰胆碱合成、贮藏或释放增强剂、乙酰胆碱突触后受体激动剂、 单胺氧化酶-A或-B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾 体类抗炎药物、抗氧化剂和5-羟色胺能受体拮抗剂。

更具体地，本发明涉及混合物，其包含根据本发明的抗体、任选的可 药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂、以及至少一种选自以下的化合物：有效 抗氧化应激的化合物、抗细胞凋亡的化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制 剂诸如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1，3-丙二磺酸(1，3PDS)、 α-分泌酶活化剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、τ蛋白、神经递质、β折叠破坏剂、 淀粉状蛋白β清除/减少细胞内组分的引诱剂、包括焦谷氨酸化淀粉状蛋白 β3-42在内的N端截短淀粉状蛋白β的抑制剂、消炎分子、或胆碱酯酶抑 制剂(ChEI)(诸如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、和/或加兰他敏)、M1激 动剂和其它药物，包括任何淀粉状蛋白或τ修饰药物和营养补充剂、以及 营养补充剂。

本发明还涉及混合物，其中该化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEI)，特别 是这样的混合物，其中该化合物选自他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、加兰 他敏、烟酸和美金刚胺(memantine)。

在另外的实施方案中，根据本发明的混合物可以包含烟酸或美金刚胺、 根据本发明的抗体、以及任选的可药用载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

在本发明的另一个实施方案中，提供了混合物，其包含用于治疗包括 幻觉、妄想症、思维障碍(表现为显著的无条理、思维不中肯、言不及义) 以及古怪或紊乱的行为和快感缺乏、情感单调、冷淡、和不合群的阳性和 阴性精神病症状的“非典型的抗精神病药物”，例如，诸如氯氮平、齐拉 西酮、利哌利酮、阿立哌唑或奥氮平，以及抗体，特别是根据本发明的单 克隆抗体，但特别是根据本发明和如本文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段 或人源化抗体或人源化抗体片段，以及任选的可药用载体和/或稀释剂和/ 或赋形剂。

在本发明的特别的实施方案中，根据本发明和如上文描述的组合物和 混合物包含分别是治疗有效量的抗体和生物活性物质。

适合与根据本发明的抗体联合用于混合物中的其它化合物描述于WO 2004/058258(特别参见16和17页)，包括治疗性药物靶标(36-39页)、链烷 磺酸和烷醇硫酸(39-51页)、胆碱酯酶抑制剂(51-56页)、NMDA受体拮抗 剂(56-58页)、雌激素(58-59页)、非甾体抗炎药(60-61页)、抗氧化剂(61-62 页)、过氧化物酶体增殖物活化的受体(PPAR)激动剂(63-67页)、降胆固醇 剂(68-75页)、淀粉状蛋白抑制剂(75-77页)；淀粉状蛋白形成抑制剂(77-78 页)、金属螯合剂(78-79页)、精神抑制剂和抗抑郁剂(80-82页)、营养补充 物(83-89页)、增加脑中生物活性物质可利用性的化合物(参见89-93页)和 前体药物(93和94页)，该文献在此处引入作为参考。

在另一个实施方案中，本发明涉及混合物，其包含治疗有效量的抗体， 特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是根据本发明和如上文描述的嵌 合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗体或人源化抗体片段和/或生物活性物 质。

本发明还涉及抗体，特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是根据 本发明和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗体或人源化抗 体片段，和/或其功能部分，和/或包含所述抗体的药物组合物或混合物在制 备治疗或减轻淀粉状变性的效应的药物中的用途，所述淀粉状变性是一组 与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性和年龄 相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海 默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、 关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾 病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、 HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病、老年性 心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变性。

本发明还包括制备用于预防、治疗或减轻淀粉状变性的效应的方法中 的抗体，特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是根据本发明和如上文 描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗体或人源化抗体片段，和/或其 功能部分，和/或包含特别是治疗有效量的所述抗体和/或其功能部分的药物 组合物或混合物的方法，所述方法包括以可药用形式配制抗体，特别是根 据本发明的单克隆抗体，但特别是根据本发明的嵌合抗体或嵌合抗体片段 或人源化抗体或人源化抗体片段，其中所述淀粉状变性是一组与淀粉状蛋 白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉 状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、 路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕 金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸 如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关 痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉 状变性、内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变性。

本发明还包括预防、治疗或减轻淀粉状变性的效应的方法，所述淀粉 状变性是一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉 状变性和年龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病 诸如阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉 状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋 白或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、 帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖 尿病、老年性心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变 性，所述方法通过施与抗体和/或其功能部分，但特别是人源化抗体和/或其 功能部分，或包含此类抗体和/或其功能部分的组合物或混合物给受到此类 病症影响的动物或人类，包括施与治疗有效量的抗体。

提供治疗淀粉状变性的方法也是本发明的一个目的，所述淀粉状变性 是一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性 和年龄相关性淀粉状变性，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病 (AD)，特别是以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，所述方法通过给 动物、特别是哺乳动物或人类施与根据本发明和如本文描述的抗体，特别 是药物组合物。

在本发明特定的实施方案中，提供了通过给动物、特别是哺乳动物或 人类施与根据本发明和如上文描述的抗体、特别是药物组合物来保持或增 加认知记忆能力，但特别是恢复患有记忆障碍的动物、特别是哺乳动物或 人类的认知记忆能力的方法。

本发明的另一个目的是，提供应用了根据本发明和如上文所描述的抗 体的治疗组合物和制备此类组合物的方法，以及用于治疗淀粉状变性的方 法，所述淀粉状变性是一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包 括继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变性，包括但不限于神经疾病诸 如阿尔茨海默病(AD)，特别是以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症。

具体而言，本发明涉及导致患有以认知记忆能力丧失为特征的淀粉状 蛋白相关病症的动物、特别是哺乳动物或人类保持认知记忆能力的治疗。

本发明还涉及在患者中诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症的方法，包括 检测抗体或其活性片段对样本中或原位的淀粉状蛋白表位的免疫特异性结 合，所述方法包括以下步骤：

(a)使怀疑含有淀粉状蛋白的样本或特定身体部分或身体区域与抗 体，特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是根据本发明和如上文描述 的嵌合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗体或人源化抗体片段，和/或其功能 部分接触，所述抗体结合淀粉状蛋白的表位；

(b)允许抗体和/或其功能部分结合至淀粉状蛋白以形成免疫复合物；

(c)检测免疫复合物的形成；以及

(d)将免疫复合物的存在或不存在与样本或特定身体部分或区域中淀 粉状蛋白的存在或不存在相关联。

还包括确定组织和/或体液中产生淀粉状蛋白的斑块负荷的程度的方 法，包括：

(a)获得代表所研究的组织和/或体液的样本；

(b)用抗体，特别是根据本发明的单克隆抗体，但特别是根据本发明 和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗体或人源化抗体片 段，和/或其功能部分测试所述样本中淀粉状蛋白的存在；

(c)确定结合到蛋白的抗体的量；以及

(d)计算组织和/或体液中的斑块负荷。

具体而言，本发明涉及确定组织和/或体液中产生淀粉状蛋白的斑块负 荷的程度的方法，其中确定在步骤c)中的免疫复合物的形成，从而使免疫 复合物的存在或不存在与淀粉状蛋白的存在或不存在相关联。

在本发明的另一实施方案中，提供了用于检测和诊断淀粉状蛋白相关 疾病和病症的测试试剂盒，其包括抗体，特别是根据本发明的单克隆抗体， 但特别是根据本发明和如上文描述的嵌合抗体或嵌合抗体片段或人源化抗 体或人源化抗体片段，和/或其功能部分。

具体而言，本发明涉及用于检测和诊断淀粉状蛋白相关疾病和病症的 测试试剂盒，其包含容纳一种或多种根据本发明的抗体，和/或其功能部分 的容器，以及使用抗体用于结合淀粉状蛋白以形成免疫复合物，以及检测 免疫复合物的形成，从而使免疫复合物的存在或不存在与淀粉状蛋白存在 或不存在相关联的说明书。

另一方面，本发明提供了包含如SEQ ID NO：27所示可变区的抗体， 或其变体。在一个实施方案中，细胞系表达该抗体。

另一方面，本发明提供了包含如SEQ ID NO：29所示可变区的抗体基 因，或其变体。在一个实施方案中，细胞系表达该抗体。

另一方面，本发明提供了用于解聚预形成的β淀粉状蛋白纤维的方法， 包括使hC2抗体与预形成的β淀粉状蛋白纤维接触。

另一方面，本发明提供了根据前述权利要求任一项的人源化抗体其片 段，其中所述抗体或其片段使神经元免受Aβ诱导的变性。

另一方面，本发明提供了预防Aβ诱导的神经元变性的方法，包括用 有效量的根据本发明的人源化抗体或人源化抗体片段处理神经元。

另一方面，本发明提供了根据本说明书的人源化抗体或人源化抗体片 段在制备用于预防神经元在暴露于Aβ寡聚体后的变性的药物中的用途。

在本发明的另一实施方案中，提供了包括任何功能等效抗体或其功能 部分的抗体，特别是单克隆抗体，其识别淀粉状蛋白的天然构象，因为它 特异结合至淀粉状蛋白寡聚体和纤维，而不结合至未线性化的淀粉状蛋白 种类。

在本发明的一个进一步的实施方案中，提供了根据本发明的和如上文 描述的包括任何功能等效抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体， 其中所述抗体或片段以至少约1×10-6M至至少约1×10-8M，特别地至少 约1×10-6M至至少约1×10-7M，更特别地至少约1×10-7M至至少约1× 10-8M，甚至更特别地至少约1×10-7M至至少约4×10-7M的结合亲和力与 Aβ单体结合，但优选地不显示出任何显著的与淀粉状蛋白前体蛋白(APP) 的交叉反应性。

在本发明的另一实施方案中，提供了根据本发明的和如上文描述的包 括任何功能等效抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体，其中所述 抗体或片段以至少约1×10-7M至至少约1×10-9M，特别地至少约1× 10-7M至至少约1×10-8M，更特别地至少约1×10-8M至至少约1×10-9M， 甚至更特别地至少约1×10-8M至至少约5×10-8M的结合亲和力与Aβ纤 维、原纤维或纤丝结合，但优选地不显示出任何显著的与淀粉状蛋白前体 蛋白(APP)的交叉反应性。

在另一实施方案中，根据本发明的和如上文描述的包括任何功能等效 抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体，表现出比与Aβ单体的结合 亲和力高至少5倍，特别地至少10倍，更特别地高至少15倍的与Aβ纤维、 原纤维或纤丝的结合亲和力。

通过形成淀粉状蛋白的聚合原纤维或纤丝的解聚，根据本发明的抗体 能够预防或减缓淀粉状蛋白斑的形成，这能导致与疾病相关症状的缓解及 其进展的延缓或逆转。

因此，本发明的另一个实施方案提供了如上文所描述的包括任何功能 等效抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体，所述抗体能够降低患有 导致脑中Aβ浓度增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，但尤其是 人类脑中Aβ的总量。

在本发明的另一实施方案中，提供了如上文所描述的包括任何功能等 效抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体，所述抗体能够破坏斑块， 从而减少患有导致脑中斑块负荷增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动 物，但尤其是人类脑中的斑块负荷。包括任何功能等效抗体或其功能部分 的根据本发明的抗体减少了脑中的斑块负荷至少20％，特别地至少25％， 更特别地至少30％，甚至更特别地大于30％。

又在本发明的另一实施方案中，提供了如上文所描述的包括任何功能 等效抗体或其功能部分的抗体，特别是单克隆抗体，所述抗体能够溶解斑 块，导致患有导致脑中斑块负荷增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动 物，但尤其是人类脑中的斑块量减少。包括任何功能等效抗体或其功能部 分的根据本发明的抗体减少了脑中的斑块量至少10％，特别地至少15％， 更特别地至少20％。

应理解根据本发明的抗体能够表现出如上文所描述的一种、两种或多 种特定特性的不同组合。

特别地，提供了抗体或其片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至 少一个独特的结合部位，特别是至少两个独特的结合部位，其中所述的至 少一个或所述的至少两个独特的结合部位分别包含主要参与抗体结合的至 少一个氨基酸残基和至少两个连续的氨基酸残基，其中，在本发明的一个 特定的实施方案中，构成第一独特的结合部位的至少一个残基是Leu，且 构成第二独特的结合部位的至少两个连续的氨基酸残基是-Phe-Phe-，它们 埋在以下核心序列中：

-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Leu-Xaa4-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6-Xaa7

其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys、和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Lys、His、Asn、Gln和Arg的氨基酸残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸 残基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa7是选自Glu和Asp的氨基酸残基。

在另一方面，本发明涉及抗体或其片段，其识别并结合至β-淀粉状蛋 白上的至少一个独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更特 别地至少三个独特的结合部位，其中所述的一个或至少两个或至少三个独 特的结合部位每一包含主要参与抗体结合的至少一个、特别地至少两个连 续的氨基酸残基。

特别地，根据本发明的抗体或其片段结合至β-淀粉状蛋白上的至少两 个独特的结合部位，其中所述至少两个独特的结合部位每一包含主要参与 抗体结合的至少两个连续的氨基酸残基，其中所述至少两个独特的结合部 位彼此密切接近地定位在抗原上，且被不参与抗体结合的或者与所述至少 两个连续的氨基酸残基相比参与抗体结合程度显著较小的至少一个氨基酸 残基隔开，因此形成构象不连续的表位。

在本发明的另一实施方案中，提供了根据本发明的抗体或其片段，其 识别并结合至β-淀粉状蛋白上的至少一个独特的结合部位，特别地至少两 个独特的结合部位，更特别地至少三个独特的结合部位，其中所述独特的 结合部位分别包含主要参与抗体结合的至少一个氨基酸残基和至少两个连 续的氨基酸残基，其中被不参与抗体结合的或者与主要参与抗体结合的所 述氨基酸残基相比参与抗体结合程度显著较小的至少一个氨基酸残基隔开 的所述至少一个氨基酸和至少两个连续的氨基酸分别为-His-和-Lys-Leu-， 它们埋在以下核心序列中：

-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-，其中

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa3是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸 残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸 残基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸 残基；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa7是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa8是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

并且其中所述氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa6、Xaa7、Xaa8不参与抗 体结合或者与-His-和-Lys-Leu-结合部位相比参与抗体结合的程度显著较 小。

在另一实施方案中，提供了抗体或其片段，其识别并结合至β-淀粉状 蛋白上的至少一个独特的结合部位，特别地至少两个独特的结合部位，更 特别地至少三个独特的结合部位，其中所述独特的结合部位分别包含主要 参与抗体结合的至少一个氨基酸残基和至少两个连续的氨基酸残基，其中 代表第一结合部位的至少两个连续的氨基酸残基是-Phe-Phe-和至少一个 氨基酸残基是-His-，它们埋在以下核心序列中：

-Xaa1-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Phe-Phe-Xaa7-Xaa8-Xaa9-，

其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys、和Arg的氨基酸残基；

Xaa3是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自His、Asn、Gln、Lys、和Arg的氨基酸残基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Ala、Val、Leu、和Ile的氨基酸残基；

Xaa7是选自Ala、Val、Leu、和Ile的氨基酸残基；

Xaa8是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa9是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

并且其中所述氨基酸残基Xaa1、Xaa3、Xaa6、Xaa7、Xaa8、和Xaa9 不参与抗体结合或者与-His-和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合的程 度显著较小。

在本发明的一个特定的实施方案中，主要参与抗体结合的第一种至少 两个连续的氨基酸残基涉及-Lys-和-Leu-，且第二种至少两个连续的氨基酸 残基涉及-Phe-Phe-，它们埋在以下核心序列中：

-Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa4-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6-Xaa7-，

其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys、和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸残 基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

Xaa7是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

并且其中所述氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7不 参与抗体结合或者与-Lys-Leu和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合的 程度显著较小。

在本发明的另一实施方案中，提供了抗体或其片段，其中

Xaa1是His或Arg，但尤其是His；

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa4是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa5是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa6是Glu或Asp，但尤其是Glu；和

Xaa7是Asp或Glu，但尤其是Asp。

在本发明的一个进一步的实施方案中，根据本发明的抗体或其片段结 合至β-淀粉状蛋白上的至少三个独特的结合部位，其中所述至少三个独特 的结合部位分别包含至少一个氨基酸残基和至少两个连续的氨基酸残基， 所述残基是主要参与抗体结合的，其中所述至少三个独特的结合部位彼此 密切接近地定位在抗原上，且被不参与抗体结合的或者分别与所述至少一 个氨基酸残基和所述至少两个连续的氨基酸残基相比参与抗体结合程度显 著较小的至少一个氨基酸残基隔开，因此形成构象不连续的表位。

在本发明的一个特定的实施方案中，第一种主要参与抗体结合的至少 两个连续的氨基酸残基涉及-Lys-Leu-，且第二种至少两个连续的氨基酸残 基涉及-Phe-Phe-，第三种至少一个氨基酸残基涉及-His-，它们埋在以下核 心序列中：

-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa4-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6-Xaa7-，其中

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸残 基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基，

Xaa7是选自Glu和Asp的氨基酸残基，

并且其中所述氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7不 参与抗体结合或者与-His-、-Lys-Leu、和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体 结合的程度显著较小。

在本发明的另一实施方案中，提供了抗体或其片段，其中

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa4是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa5是Ala或Val，但尤其是Ala；

Xaa6是Glu或Asp，但尤其是Glu；和

Xaa7是Glu或Asp，但尤其是Asp；

在本发明的一个特定的实施方案中，第一种主要参与抗体结合的至少 两个连续的氨基酸残基涉及-Lys-Leu-，第二种至少两个连续的氨基酸残基 涉及-Phe-Phe-，且第三种至少一个氨基酸残基涉及-Asp-，它们埋在以下核 心序列中：

-Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa4-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6-Asp-，

其中

Xaa1是选自His、Asn、Gln、Lys、和Arg的氨基酸残基；

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸残 基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基，并且其中所述氨基酸残基 Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7不参与抗体结合或者与-Asp-、 -Lys-Leu、和-Phe-Phe-结合部位相比参与抗体结合的程度显著较小。

在本发明的另一实施方案中，提供了抗体或其片段，其中

Xaa1是His或Arg，但尤其是His；

Xaa2是Gln或Asn，但尤其是Gln；

Xaa4是Val或Leu，但尤其是Val；

Xaa5是Ala或Val，但尤其是Ala；和

Xaa6是Glu或Asp，但尤其是Glu。

在本发明的另一特定的实施方案中，提供了根据本发明的抗体或其片 段，其结合至β-淀粉状蛋白上的4个独特的结合部位，其中所述4个独特的 结合部位分别包含一个氨基酸残基和两个连续的氨基酸残基，所述残基是 主要参与抗体结合的，其中所述4个独特的结合部位彼此密切接近地定位在 抗原上，且被不参与抗体结合的或者分别与所述一个氨基酸残基和所述两 个连续的氨基酸残基相比参与抗体结合程度显著较小的至少一个氨基酸残 基隔开，因此形成构象不连续的表位。

特别地，第一种主要参与抗体结合的两个连续的氨基酸残基是 -Lys-Leu-，第二种至少两个连续的氨基酸残基是-Phe-Phe-，第一种单氨基 酸残基是-His-，且第二种单氨基酸残基是-Asp-，它们埋在以下核心序列中：

-His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa4-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6-Asp-，

其中

Xaa2是选自Asn和Gln的氨基酸残基；

Xaa4是选自Ala、Val、Leu、正亮氨酸、Met、Phe、和Ile的氨基酸残 基；

Xaa5是选自Ala、Val、Leu、Ser、和Ile的氨基酸残基；

Xaa6是选自Glu和Asp的氨基酸残基；

并且其中所述氨基酸残基Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7不 参与抗体结合或者与-His-、-Asp-、-Lys-Leu、和-Phe-Phe-结合部位相比参 与抗体结合的程度显著较小。

在本发明的一个特定的实施方案中，如上文所定义的识别和结合部位 形成了位于β-淀粉状蛋白的12至24位氨基酸残基之间、特别地14至23 位氨基酸残基之间、更特别地14至20位氨基酸残基之间区域内的构象上 不连续的表位，其中分别包含1个和2个氨基酸残基的三个独特的识别和 结合部位分别位于位置16、17；和位置19和20；和位置14，所述残基主 要参与β-淀粉状蛋白的结合，且其中所述三个独特的识别和结合部位分别 被位于位置15和18的一个氨基酸残基隔开，所述氨基酸不参与抗原的结 合，或至少以基本上较小的程度。

在一个特定的实施方案中，所述的主要参与β-淀粉状蛋白结合的连续 的氨基酸残基，特别地在位置16和17的-Lys-Leu-以及在位置19和20的 -Phe-Phe-被埋在以下核心区域中：

Val-  His-  His-  Gln-  Lys-  Leu-  Val-  Phe-  Phe-  Ala-  Glu-  Asp

12    13    14    15    16    17    18    19    20    21    22    23

在另一特定的实施方案中，所述的主要参与β-淀粉状蛋白结合的连续 的氨基酸残基，特别地在位置16的-Lys-，在位置17的-Leu-，和在位置19 和20的-Phe-Phe-，在位置14的-His-被埋在以下核心区域中：

Val-  His-  His-  Gln-  Lys-  Leu-  Val-  Phe-  Phe-  Ala-  Glu-  Asp

12    13    14    15    16    17    18    19    20    21    22    23

根据本发明的上述的单克隆抗体和/或其功能部分、和/或药物组合 物、或包含所述抗体的混合物的用于制备治疗或减轻由淀粉状蛋白或淀粉 状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症的药物的用途也是本发明的 一部分，其中所述由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的 疾病和病症包括一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的淀粉状变性，包括但不 限于继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但 不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、包括以认知记忆能力丧失为特征 的疾病或病症，例如，诸如轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合 征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及 其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、 多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性 侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状 变性，内分泌肿瘤以及其它疾病，包括黄斑变性。

在本发明的另一实施方案中，提供了使用根据本发明的抗体和/或其 功能部分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体用于制 备药物组合物的方法，其中所述药物组合物用于治疗或减轻由淀粉状蛋白 或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症的影响，所述由淀粉 状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症包括一组与淀 粉状蛋白斑的形成相关的淀粉状变性，包括但不限于继发性淀粉状变性和 年龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔 茨海默病(AD)、包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸 如轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉 状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋 白或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、 帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎 (IBM)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性，内分泌肿瘤以及其 它疾病，包括黄斑变性；所述方法包括将根据本发明的抗体制剂为可药用 形式。

抗体和/或其功能部分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或 功能等效抗体、和包含本发明的所述抗体的组合物和混合物可用于制备治 疗或减轻由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病 症的影响的药物，其中所述由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与 其相关的疾病和病症包括一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的淀粉状变性， 包括但不限于继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病， 包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、包括以认知记忆能力丧失 为特征的疾病或病症，例如，诸如轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆、唐 氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征； 以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻 痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎 缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀 粉状变性，内分泌肿瘤以及其它疾病，包括黄斑变性。

在本发明的一个进一步的实施方案中，提供了减少患有导致脑中斑块 负荷增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，但尤其是人类脑中的斑 块负荷的方法，包括向需要此种治疗的动物，特别是哺乳动物，更特别是 人施与治疗有效量的根据本发明的和如上文所描述的抗体和/或其功能部 分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体、或者包含所 述抗体的组合物或混合物。

特别地，斑块负荷减少了至少20％，特别地减少了至少25％，更特别 地减少了至少30％，甚至更特别地减少了多于30％。

在本发明的一个进一步的实施方案中，提供了减少患有导致脑中斑块 负荷增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，但尤其是人类脑中的斑 块量的方法，包括向需要此种治疗的动物，特别是哺乳动物，更特别是人 施与治疗有效量的根据本发明的和如上文所描述的抗体和/或其功能部 分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体、或者包含所 述抗体的组合物或混合物。

特别地，脑中的斑块量减少了至少10％，特别地减少了至少15％，更 特别地减少了多于15％。

又在本发明的另一实施方案中，提供了减少患有导致脑中可溶性Aβ 浓度增加的疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，但尤其是人类脑中的可 溶性Aβ总量的方法，包括向需要此种治疗的动物，特别是哺乳动物，更特 别是人施与治疗有效量的根据本发明的和如上文所描述的抗体和/或其功 能部分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体、或者包 含所述抗体的组合物或混合物。

本发明的一个目的是通过将根据本发明的抗体、但尤其是单克隆抗 体、或者包含此种抗体的组合物或混合物施与受此种疾病侵袭的动物或人 而提供了预防、治疗或减轻由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与 其相关的疾病和病症的影响的方法，其中所述由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白 样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症包括一组与淀粉状蛋白斑的形成相 关的淀粉状变性，包括但不限于继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变 性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、包括 以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸如轻度认知损害 (MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、 关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾 病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、 HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年发病 型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性，内分泌肿瘤以及其它疾病，包括黄斑 变性；所述方法包括向需要此种治疗的动物，特别是哺乳动物，更特别是 人施与治疗有效量的根据本发明的和如上文所描述的抗体和/或其功能部 分，但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体、或者包含所 述抗体的组合物或混合物。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了保持或增加患有记忆损害的 动物、特别是哺乳动物或人的认知记忆能力的方法，所述方法是通过向需 要此种治疗的动物、特别是哺乳动物或人施与根据本发明的抗体、但特别 是单克隆抗体、或者包含根据本发明的和如上文所描述的此种抗体的组合 物或混合物而实施的。

在本发明的另一实施方案中，提供了使用根据本发明的抗体和/或其 功能部分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体用于制 备药物组合物的方法，其中所述药物组合物用于治疗或减轻由淀粉状蛋白 或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症的影响，所述由淀粉 状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和病症包括一组与淀 粉状蛋白斑的形成相关的淀粉状变性，包括但不限于继发性淀粉状变性和 年龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔 茨海默病(AD)、包括以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸 如轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉 状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋 白或与其相关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、 帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎 (IBM)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性，内分泌肿瘤以及其 它疾病，包括黄斑变性。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了使用根据本发明的抗体和/ 或其功能部分、但尤其是单克隆抗体和/或其功能部分或功能等效抗体用 于制备保持或增加患有记忆损害的动物、特别是哺乳动物或人的认知记忆 能力的药物组合物的方法，所述方法是通过向动物、特别是哺乳动物或人 施与根据本发明的和如上文所描述的抗体、但特别是单克隆抗体、或者包 含此种抗体的组合物或混合物而实施的。

在阅读了以下所公开的实施方案的详细说明和所附权利要求后，本发 明的这些和其它目的、特征和优点将变得显而易见。

附图和序列简述

图1(实施例2)：嵌合抗体的小鼠轻链可变区表达盒

图2(实施例2)：嵌合抗体的小鼠重链可变区表达盒

图3(实施例5.2)：小鼠重链可变区与最接近的鼠种系序列的比较

图4(实施例8)：纯化的人源化C2抗体的活性

图5(实施例9)：与通过瞬时转染产生的嵌合抗体C2ChVHAF/ChVK 以及纯化的抗体相比较，通过瞬时表达与C2嵌合重链连接的C2修饰的 CDRL2构建体产生的抗体的结合活性。

图6(实施例11)：嵌合抗体AF和人源化抗体H4K1的免疫组织化学结 合测试法的结果

图7(实施例12)：mC2对淀粉状蛋白纤维的功能性

图8(实施例12)：在ELISA中人源化C2的结合亲和力

图9(实施例14)：mC2对不同类淀粉状蛋白的构象特异性结合。在该 图说明中的沉淀制备物指Aβ1-42纤维，上清制备物指淀粉状蛋白单体。

图10：与鼠序列和人类受体序列DPK15和Jκ1相比较的人源化C2 VK序列

图11：与鼠序列和人类受体序列DP54和JH6相比较的人源化C2VH 序列

图12：C2人源化抗体C2HuVK1的轻链可变区的完整DNA和蛋白序 列

图13：人源化C2抗体的轻链恒定区(人类Cκ)的完整DNA和蛋白序 列

图14：人源化C2抗体的重链恒定区(人类IgG4ser228-pro)的完整 DNA和蛋白序列

图15A-C(实施例15)：表位作图实验的结果

图16(实施例13)：聚集测试法实验的结果

图17(实施例13)：解聚测试法实验的结果

图18(实施例16)：用人源化抗体C2的神经保护实验的结果

图19：在蛋白质印迹和斑点印迹中mACI-01-Ab7C2单克隆抗体与淀 粉状蛋白种类的结合；

图20：通过透射电镜术显示的mACI-01-Ab7C2单克隆抗体与淀粉状 蛋白纤维的结合；

图21：在Th-T荧光测试法和U-13C Tyr10和Val12标记的β淀粉状 蛋白1-42肽的固态NMR  之间进行的头对头实验 (head-to-head-experiment)结果。

SEQ ID NO：1  C2HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR1)的氨基酸 序列

SEQ ID NO：2  C2HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR2)的氨基酸 序列

SEQ ID NO：3  C2HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR3)的氨基酸 序列

SEQ ID NO：4  C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR1)的氨基酸序列

SEQ ID NO：5  C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR2)的氨基酸序列

SEQ ID NO：6  C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR3)的氨基酸序列

SEQ ID NO：7  Aβ表位区2的氨基酸序列

SEQ ID NO：8  Aβ表位区1的氨基酸序列

SEQ ID NO：9  Aβ表位区2修饰的氨基酸序列

SEQ ID NO：10  Aβ表位区1修饰的氨基酸序列

SEQ ID NO：11  表位区修饰的完全的氨基酸序列

SEQ ID NO：12  C2HuVK 1人源化轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：13  C2人源化轻链的氨基酸序列

SEQ ID NO：14  人源化C2轻链恒定区的氨基酸序列

SEQ ID NO：15  C2HuVH AF 4人源化重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：16  C2人源化重链的氨基酸序列

SEQ ID NO：17  Igγ-4链C区修饰的氨基酸序列

SEQ ID NO：18  C2HuVH AF 4人源化重链可变区CDR2的核苷酸 序列

SEQ ID NO：19  C2HuVH AF 4人源化重链可变区CDR3的核苷酸 序列

SEQ ID NO：20  C2HuVK 1人源化轻链可变区CDR1的核苷酸序列

SEQ ID NO：21  C2HuVK 1人源化轻链可变区的核苷酸序列

SEQ ID NO：22  C2人源化轻链的核苷酸序列

SEQ ID NO：23  C2人源化轻链恒定区的核苷酸序列

SEQ ID NO：24  C2HuVH AF 4人源化重链可变区的核苷酸序列

SEQ ID NO：25  C2人源化重链的核苷酸序列

SEQ ID NO：26  C2人源化重链恒定区的核苷酸序列

SEQ ID NO：27  小鼠C2轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：28  小鼠C2重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO：29  小鼠C2轻链可变区的核苷酸序列

SEQ ID NO：30  小鼠C2轻链的核苷酸序列

SEQ ID NO：31  小鼠C2重链可变区的核苷酸序列

SEQ ID NO：32  小鼠C2重链的核苷酸序列

SEQ ID NO：33-40  在Aβ肽上的表位区的氨基酸序列变体

SEQ ID NO：41  小鼠C2轻链的氨基酸序列

SEQ ID NO：42  小鼠C2重链的氨基酸序列

SEQ ID NO：43  抗原性肽Aβ1-15

SEQ ID NO：44  抗原性肽Aβ1-16

SEQ ID NO：45  抗原性肽Aβ1-16(Δ14)

SEQ ID NO：46  抗原性肽Aβ22-35

SEQ ID NO：47  抗原性肽Aβ29-40

SEQ ID NO：48  抗原性肽Aβ1-17

定义

文中使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换，并定义为 由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。

除非上下文不合适，否则文中使用的术语“一”、“该”定义为“一 个或多个”并且包括复数。

句子“由淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白引起的或与其相关的疾病和 病症”包括但现不限于由单体、原纤维或聚合状态的淀粉状蛋白样蛋白， 或该三者任意组合的存在或活性引起的疾病和病症。此类疾病和病症包括 但不限于淀粉状变性、内分泌肿瘤和黄斑变性。

术语“淀粉状变性”是指一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病 症，包括但不限于继发性淀粉状变性和年龄相关性淀粉状变性，诸如以下 疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、包括以认知记忆能 力丧失为特征的疾病或病症，例如，诸如轻度认知损害(MCI)、路易体痴 呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆 综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸如进行性 核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、 ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、包涵体肌炎(IBM)、成年发病型糖尿病、老年 性心脏淀粉状变性，以及各种眼睛疾病，包括黄斑变性、脉络膜小疣相关 视神经病、和由于β淀粉状蛋白沉积的白内障。

文中使用的术语“检测”定义为用已知的技术(诸如免疫化学或组织学 方法)检测生物分子，以及指在研究中定性或定量检测生物分子的存在或浓 度。

“聚合的可溶淀粉状蛋白”是指多重聚集的淀粉状蛋白肽、或淀粉状 蛋白样肽、或修饰的或截短的淀粉状蛋白肽或淀粉状蛋白肽其它衍生物的 单体，其形成在哺乳动物或人类身体中、更特别地在脑中可溶的低聚或多 聚结构，但特别是指多重聚集的淀粉状蛋白β(Aβ)或修饰的或截短的淀粉 状蛋白β(Aβ)肽或其衍生物的单体，其在哺乳动物或人类身体中，更特别 地在脑中是可溶的。

“淀粉状蛋白β、Aβ或β-淀粉状蛋白”是本领域认可的术语，并且指 淀粉状蛋白β蛋白和肽、淀粉状蛋白β前体蛋白(APP)，以及其修饰物、 片段或任何功能等效物。具体而言，文中所使用的淀粉状蛋白β是指通过 APP的蛋白酶剪切产生的任何片段，但尤其是那些参与淀粉状变性病理学 或与之相关的片段，包括但不限于Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42 和Aβ1-43。

上面所提到的淀粉状蛋白β肽的结构和序列是本领域技术人员公知 的，并且生产所述肽或从脑和其它组织中提取它们的方法描述于，例如 Glenner和Wong，Biochem Biophys Res Comm129，885-890(1984)。此外， 淀粉状蛋白β肽也以多种形式商业可获得。

“分离的”意思是指生物分子没有至少一些与之天然存在的组分。

文中应用的术语“抗体”是本领域认可的术语，其指结合到已知抗原 的分子或分子的活性片段，特别是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免 疫学活性部分，即含有特异结合抗原的结合部位的分子。免疫球蛋白是包 含一个或多个基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、 以及大量免疫球蛋白可变区基因编码的多肽的蛋白。轻链可分为κ或λ。 重链可分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE。还已知了重链的亚类。例如，人类中的IgG重链可以是 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中的任一个。根据本发明的免疫球蛋白可 以是任何的类(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或亚类(IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的免疫球蛋白分子。

文中使用的关于抗体的“特异性结合”是指该抗体以比其与结构上不 同的抗原更高的亲和力与它的靶抗原结合。

已知典型的免疫球蛋白结构单位包含四聚体。每一个四聚体包括两个 相同的多肽链对，每一对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约 50-70kD)。每一个链的N端定义了约100至110个或更多个主要负责抗原 识别的氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻 链和重链。

抗体可以作为全长完整的抗体或作为许多已很好的描述了的通过用各 种肽酶或化学制品消化产生的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区 的二硫键下面消化抗体产生F(ab′)2，其为Fab的二聚体，所述Fab本身是 通过二硫键与VH-CH1结合的轻链。F(ab′)2可以在中性条件下被还原以破 坏铰链区中的二硫键，因此将F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基 本上是具有铰链区一部分的Fab片段(其它抗体片段的更详细的描述请参 见：基础免疫学(Fundamental Immunology)，W.E.Paul编辑，Raven Press， N.Y.(1993))。尽管各种抗体片段是根据完整抗体的消化来定义的，但本领 域技术人员能够理解，可以通过化学或通过利用重组DNA方法从头合成 任意的各种抗体片段。因此，文中使用的术语抗体还包括通过修饰完整抗 体或从头合成产生的抗体片段，或通过应用重组NDA方法得到抗体或片 段。

“抗体”在本发明的范围内意图包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合 抗体、单链抗体、双特异性抗体、猿源化(simianized)抗体、人抗体和人 源化抗体，以及其活性片段。结合已知抗原的分子的活性片段的实例包括 分开的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab′和F(ab′)2片段，包括Fab免 疫球蛋白表达文库的产物和上面提到的任何抗体和片段的表位结合片段。

这些活性片段可以通过多种技术从本发明的抗体中衍生。例如，可以 用酶，诸如胃蛋白酶切割单克隆抗体，然后经过HPLC凝胶过滤。然后可 以通过膜过滤法等收集和浓缩合适的含有Fab片段的级分。抗原活性片段 分离的其它常规用技术的描述可参见，例如Khaw，B.A.等，J.Nucl.Med. 23：1011-1019(1982)；Rousseaux等，Methods Enzymology，121：663-69， Academic Press，1986。

重组制备的抗体可以是常规的全长抗体、来自蛋白水解消化的已知活 性抗体片段、独特的活性抗体片段诸如Fv或单链Fv(scFv)、结构域缺失抗 体等。Fv抗体约50Kd大小且包含轻链和重链可变区。单链Fv(“scFv”) 多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以表达自包括编码VH和VL 的序列的核酸，所述序列是直接连接的，或通过编码肽的接头连接。参见 Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883。许多结构用于将 来自抗体V区域的天然聚集的但化学上分离的轻和重多肽链转化为scFv 分子，所述scFv分子将折叠为基本上与抗原结合部位的结构类似的三维结 构。例如，参见美国专利5,091,513、5,132,405和4,956,778号。

结合部位是指抗体分子的参与抗原结合的部分。抗原结合部位由重 (“H”)和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。抗体可变 区包含三个称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)的高度相异的片段， 其插入到称为“构架区”(FR)的更保守的侧翼片段之间。在抗体分子中， 轻链的三个高变区(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)和重链的三个高变区 (HCDR1、HCDR2和HCDR3)在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结 合表面或口袋。因此，抗原结合部位表示构成抗体CDR的氨基酸以及构 成结合部位口袋的任何构架残基。

可以应用本领域公知的方法确定在特定抗体中构成结合部位的氨基酸 残基的特性。例如，可以如最初由Kabat等定义的高变区那样鉴定抗体 CDR。(参见“免疫学感兴趣的蛋白质序列”(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”)，E.Kabat等，美国健康和人类服务部(U.S. Department of Health and Human Services)；Johnson，G和Wu，TT (2001)，Kabat数据库及其应用：未来指引(Kabat Database and its applications：future directions)，Nucleic Acids Research，29：205-206； http://immuno.bme.nwa.edu)。也可以如最初由Chothia和其它人描述的结 构上的环结构那样鉴定CDR的位置(参见Chothia和Lesk，J.Mol.Biol. 196，901(1987)、Chothia等，Nature 342，877(1989)和Tramontano等，J. Mol.Biol.215，175(1990))。其它方法包括“AbM定义”或Macallum等的 CDR的“接触定义”(“抗原-抗体相互作用：接触分析和结合部位拓朴图” (“Antibody-antigen interactions：contact analysis and binding site topography”)，J Mol Biol.1996年10月11日；262(5)：732-45)，所述“AbM 定义”是Kabat和Chothia之间的折衷方案，并且是应用Oxford分子AbM 抗体模建软件(现为Accelrys)衍生的。以下图表基于各种已知的定义鉴定 CDR。

环    Kabat       AbM        Chothia     接触

---   ------      -------    --------    ------

L1    L24--L34    L24--L34   L24--L34    L30--L36

L2    L50--L56    L50--L56   L50--L56    L46--L55

L3    L89--L97    L89--L97   L89--L97    L89--L96

H1    H31--H35B   H26--H35B  H26--H32.34 H30--H35B

Kabat编号方式

H1  H31--H35  H26--H35  H26--H32  H30--H35

Chothia编号方式

H2  H50--H65   H50--H58   H52--H56   H47--H58

H3  H95--H102  H95--H102  H95--H102  H93--H101

人们可以通过仅从序列而鉴定抗体中的CDR的总体指导如下：

LCDR1：

开始-约第24个残基。

前面的残基总是Cys。

后面的残基总是Trp。一般地，TRP之后是TYR-GLN，但也可能是 LEU-GLN、PHE-GLN或TYR-LEU。

长度是10至17个残基。

LCDR2：

开始-在L1终点之后的第16个残基。

前面的序列一般是ILE-TYR，但也可以是VAL-TYR、ILE-LYS或 ILE-PHE。

长度一般为7个残基。

LCDR3：

开始-一般是L2终点之后的第33个残基。

前面的残基是Cys。

后面的序列是PHE-GLY-X-GLY。

长度是7至11个残基。

HCDR1：

开始-在约第26个残基(CYS后4个残基)[Chothia/AbM定义]，Kabat 定义在5个残基以后开始。

前面的序列是CYS-X-X-X。

后面的残基是TRP，其后一般是VAL，但也可以是ILE或ALA。

在AbM定义下的长度是10至12个残基，而Chothia定义则不包括最 后的4个残基。

HCDR2

开始-在CDR-H1的Kabat/AbM定义的终点后第15个残基。

前面的序列一般是LEU-GLU-TRP-ILE-GLY(SEQ ID NO.1)，但许 多变形也是可能的。

后面的序列是： LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA。

在Kabat定义下的长度是16至19个残基(AbM定义为先7个残基终 止)。

HCDR3：

开始：在CDR-H2终点之后第33个残基(CYS后两个残基)。

前面的序列是CYS-X-X(一般为CYS-ALA-ARG)。

后面的序列是TRP-GLY-X-GLY。

长度是3至25个残基。

可以应用本领域公知的方法，诸如分子模建和X光晶体照相术确定特 定抗体中的在CDR之外，但仍然通过具有作为结合部位衬里部分的侧链 而构成结合部位一部分(即，其可被用于通过结合部位连接)的氨基酸残基 的特性。例如参见Riechmann等，(1988)Nature，332：；323-327。

嵌合抗体是这样的抗体，即其中该抗体的一个或多个区域来自一个动 物物种，且该抗体的一个或多个区域来自不同的动物物种。优选的嵌合抗 体是包括来自灵长类动物免疫球蛋白的区域的嵌合抗体。用于人类临床应 用的嵌合抗体通常被理解为具有来自非人类动物(例如啮齿类动物)的可变 区，且具有来自人类的恒定区。相反，人源化抗体利用来自非人类抗体的 CDR，其中所述非人类抗体具有多数或全部来自人类免疫球蛋白的构架 区，以及全部来自人类免疫球蛋白的恒定区。人类嵌合抗体通常被理解为 具有来自啮齿类动物的可变区。典型的人类嵌合抗体具有人类重链恒定区 和人类轻链恒定区，且具有来自啮齿类动物抗体的重链和轻链两者的可变 区。嵌合抗体可以包括某些对人类恒定区的天然氨基酸序列和天然的啮齿 类动物可变区序列的改变。可以通过本领域公知的方法制备嵌合和人源化 抗体，所述方法包括CDR嫁接方法(例如参见，美国专利5,843,708、 6,180,370、5,693,762、5,585,089、5,530,101号)、链改组策略(例如参见， 美国专利5,565,332号；Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998) 95：8910-8915)和分子模建策略(美国专利5,639,641号)等。

在双链抗体的情况下，文中使用的“人源化抗体”是其中至少一条链 被人源化的抗体。人源化抗体链具有这样的可变区，即其中一个或多个构 架区是人类的。单链的人源化抗体是其中所述链具有这样的可变区的抗体， 即在所述的可变区中一个或多个构架区是人类的。人源化抗体链或其片段 的可变区的非人类的部分衍生自非人类来源，特别是非人类抗体，一般为 啮齿类动物来源的抗体。非人类的对人源化抗体的贡献一般是以至少一个 散布在源自一个(或多个)人类免疫球蛋白的构架区中的CDR区的形式提供 的。此外，可以改变构架区支持残基以保留结合亲和力。

人源化抗体还可以包含恒定区(例如，在轻链的情况下，至少一个恒定 区或其部分，以及在重链的情况下，优选三个恒定区)。如果存在的话，人 源化抗体的恒定区一般是人类的。

获得“人源化抗体”的方法对于本领域技术人员是公知的(例如参见， Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)、Hodgson等， Bio/Technology，9：421(1991))。

“人源化抗体”也可以通过新颖的基因工程方法得到，其能在大型动 物，诸如兔子和小鼠中产生亲和力成熟的人样多克隆抗体。例如参见，美 国专利6,632,976号。

本文使用的术语恒定区(CR)是指免疫球蛋白的恒定区基因。恒定区基 因编码抗体分子的赋予效应子功能的部分。对于嵌合的人类抗体和人源化 抗体，一般地，非人类(例如，鼠)的恒定区被人类恒定区替换。作为对象 的嵌合的或人源化抗体的恒定区通常源自人类免疫球蛋白。重链恒定区可 以选自以下5种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，不同亚类(诸 如重链的IgG亚类)的重链负责不同的效应子功能，并且因此通过选择期望 的重链恒定区，可以制得具有期望效应子功能的抗体。在本发明范围内可 以使用的恒定区是γ1(IgG1)、特别是γ1(IgG1)同种型的Fc区域；γ3(IgG3) 和尤其是γ4(IgG4)。轻链恒定区可以是κ或λ型，优选κ型。在一个实施 方案中，轻链恒定区是人类κ恒定链(Heiter等(1980)Cell 22：197-207)，且 重恒定链是人类IgG4恒定链。

术语“单克隆抗体”也是本领域公认的，并且是指其为产生单克隆抗 体的细胞的产物的抗体。单克隆抗体一般通过将正常短命的产生抗体的B 细胞和快速生长的细胞诸如癌细胞(有时称为“永生”细胞)融合产生。所 产生的杂交细胞或杂交瘤快速增殖，产生生产抗体的克隆。

对于本发明的目的，应理解“单克隆抗体”也包含由还没有达到完全 单克隆性的母克隆生产的抗体。

“功能等效抗体”在本发明的范围内是指与上面提到的和在此描述的 抗体实质上共有至少一种主要的功能特性的抗体，所述功能特性包括：特 异结合β-淀粉状蛋白，特别是Aβ1-42蛋白，以及更特别的Aβ1-42蛋白的16-21 表位区域、体外的免疫反应性、抑制Aβ1-42单体聚集成高分子的聚合原纤 维和/或解聚预形成的Aβ1-42聚合原纤维、和/或β折叠的破坏特性、和当预 防性地或治疗性地施与时减轻淀粉状变性的效应，其中所述淀粉状变性是 一组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性和 年龄相关性淀粉状变性，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨海默病(AD)、 路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)、关岛帕 金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相关的疾病，诸 如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、帕金森氏病、HIV-相关 痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉 状变性、内分泌肿瘤，以及其它疾病，包括黄斑变性。抗体可以是任何类 的，诸如IgG、IgM或IgA等，或任何亚类的，诸如IgG1、IgG2a等以及 其它在上文提到或本领域公知的其它亚类，但特别是IgG4类。此外，抗 体可以通过任何方法生产，诸如噬菌体展示，或在任何生物或细胞系生产， 包括细菌、昆虫、哺乳动物或其它生产具有期望特性的抗体(诸如人源化抗 体)的细胞类型或细胞系。抗体也可以通过组合来自不同物种的Fab部分和 Fc区形成。

所使用的术语“杂交”指常规的杂交条件，优选地指在使用5xSSPE、 1％SDS、1x登哈特(Denhardts)溶液作为溶液和/或杂交温度在35℃至70 ℃之间、优选65℃的杂交条件。杂交后，洗涤优选地在35℃和70℃之间、 优选65℃的温度，首先用2xSSC、1％SDS和随后用0.2xSSC进行(关于 SSPE、SSC和登哈特溶液的定义参见上述引文中的Sambrook等)。例如 描述于上面Sambrook等中的严格杂交条件是特别优选的。如果如上面指 出的那样在65℃进行杂交和洗涤，则例如给出了特别优选的严格杂交条 件。非严格杂交条件，例如在45℃进行杂交和洗涤是较不优选的，以及在 35℃甚至更不优选。

两个序列之间的“同源性”通过序列同一性确定。如果两条待相互比 较的序列在长度上有区别，序列同一性优选的指与较长序列核苷酸残基相 同的较短序列的核苷酸残基百分数。序列同一性可以通过使用诸如Bestfit 程序(Wisconsin序列分析包，版本8，Unix，Genetics Computer Group， University Research Park，575Science Drive Madison，WI 53711)的计算机 程序照惯例测定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2(1981)，482-489的局部同源算法，目的是找出两个序列之间 具有最高序列同一性的部分。当使用Bestfit或其它的序列比对程序以确定 特定的序列是否与本发明的参考序列具有例如95％的序列同一性时，优选 的如此设置参数以使得序列同一性百分比是对于参考序列的全长计算并且 允许高达参考序列中核苷酸总数的5％的同源性缺口。当使用Bestfit时， 所谓的任选的参数优选地设在它们的预定(“缺省”)值。出现在给定序列 和以上所描述的本发明的序列之间的比较中的偏差可能由例如添加、缺失、 替换、插入或重组所导致。这类序列比较也可以优选的用程序“fasta20u66” (2.0u66版本，1998年9月，William R.Pearson和the University of Virginia； 也参见W.R.Pearson(1990)，Methods in Enzymology 183，63-98，所附的 实例和http://workbench.sdsc.edu/)。为此目的，可以使用“缺省”参数设 置。

根据本发明的抗体可以是免疫球蛋白或抗体，其被理解为具有它的每 一结合位点相同(如果是多价的话)，或备选地，可以是“双特异性抗体” 或“双功能抗体”。

“双特异性抗体”或“双功能抗体”是具有两个不同的重/轻链对和两 个不同的结合部位的人工杂化抗体。可以通过多种方法，包括杂交瘤融合 或Fab’片段的连接制备双特异抗体。例如参见，Songsivilai和Lachmann， Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148， 1547-1553(1992)。

术语“片段”是指包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基 的抗体或抗体链的部分或一段。可以通过化学或酶处理完整或完全的抗体 或抗体链获得片段。还可以通过重组方式获得片段。示范性片段包括Fab、 Fab’、F(ab’)2、Fabc和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”是指结合抗 原或与完整抗体(即与它们所源自的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结 合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。

通过重组DNA技术，或通过酶或化学切割完整的免疫球蛋白制备结合 片段。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。

“片段”还指包含另一多肽氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸残基、 至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连 续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸 残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少 70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的 氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残 基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少 200个连续的氨基酸残基、至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列的 肽或多肽。在特别的实施方案中，多肽片段保留了该多肽的至少一种功能。

术语“抗原”是指能结合抗体的实体或其片段。免疫原是指能在生物 体、特别是动物、更特别的是包括人类在内的哺乳动物中引发免疫反应的 抗原。术语抗原包括称为抗原决定簇或表位的区域，所述区域是指抗原的 一部分(其为接触的，或其在支持位于负责抗原性的抗原或抗原决定簇中的 接触中起着重要作用)。

如在本文中使用的术语“可溶的”指在水性溶液中部分或完全溶解。

也在本文中使用的术语“免疫原性的”指引起针对免疫原抗原的抗体、 T细胞和其它反应性免疫细胞的产生的物质。

当个体产生足够的抗所施与的本发明的免疫原性组合物的抗体、T细 胞和其它反应性免疫细胞的时候，发生免疫反应以缓解或减轻所要治疗的 病症。

文中使用的术语免疫原性是指当施与接受者时，抗原引起免疫反应(体 液或细胞免疫反应)的能力的计量。本发明涉及减少作为对象的人类嵌合或 人源化抗体免疫原性的方法。

减少免疫原性的人源化抗体是指展示出相对于亲本抗体(例如，鼠抗体) 的减少了免疫原性的人源化抗体。

基本上保留了亲本抗体的结合特性的人源化抗体是指保留了特异结合 被用以产生此种人源化抗体的亲本抗体识别的抗原的能力的抗体。优选地， 人源化抗体展示出和亲本抗体相同或基本相同的抗原结合亲和力和亲合 力。理想地，该抗体的亲和力不少于亲本抗体亲和力的10％，更优选不少 于亲本抗体的30％，以及更优选地，亲和力不少于亲本抗体的50％。用于 分析抗原结合亲和力的方法是本领域公知的，且包括半数最大结合测试法、 竞争测试法和斯卡查德分析。在本申请中描述了合适的抗原结合测试法。

“回复突变(back mutation)”是引入编码人源化抗体的核苷酸序列 中的突变，该突变产生与母本抗体(例如，供体抗体，例如鼠抗体)中的氨 基酸对应的氨基酸。在本发明抗体的人源化过程中，可以保留来自亲本抗 体中某些构架残基，以基本上保留亲本抗体的结合特性，而同时最小化所 得抗体的潜在的免疫原性。在本发明的一个实施方案中，亲本抗体是小鼠 抗体。例如，回复突变使人类构架残基改变为亲本鼠残基。可以回复突变 的构架残基的实例包括但不限于：规范残基(canonical residues)、界面填充 残基、与结合部位接近的稀有亲本残基、在“游标区(Vernier Zone)”(其 形成CDR位于其上的平台)(Foote和Winter，1992，J.Mol.Biol.224， 487-499)中的残基、以及接近于CDR H3的那些残基。

如本文所使用的“保守改变”是指与天然蛋白相比，分别是基本上在 构象上或抗原上是中性的、在突变体多肽的三级结构中产生最小的变化的、 或在突变多肽的抗原决定簇中产生最小的变化的改变。当提及本发明的抗 体和抗体片段时，保守改变的意思是不会使该抗体不能结合主题受体的氨 基酸替换。本领域普通技术人员将能够预测可以制造哪些氨基酸替换，同 时维持构象上和抗原上中性的高度可能性。例如在Berzofsky，(1985) Science 229：932-940和Bowie等(1990)Science 247：1306-1310中提供了此 类指导。应当考虑的影响维持构象上和抗原上中性的可能性的因素包括， 但不限于：(a)疏水氨基酸的替换较不可能影响抗原性，因为疏水残基更可 能位于蛋白的内部；(b)物理化学类似的氨基酸的替换较不可能影响构象， 因为替换的氨基酸残基结构上模拟天然氨基酸；(c)进化上保守的序列的改 变可能不利地影响构象，因为此类保守表明该氨基酸序列可能具有功能重 要性。本领域普通技术人员将能够应用公知的测试法评估蛋白质构象的改 变，所述测试法包括但不限于微量补体结合法(Wasserman等(1961)J. Immunol.87：290-295；Levine等(1967)Meth.Enzymol.11：928-936)和通过 应用构象依赖性的单克隆抗体的结合研究(Lewis等(1983)Biochem. 22：948-954)。

此外，术语“治疗有效量”指抗体的量，当其施与给人类或动物时， 在所述人类或动物中足以产生治疗效果。本领域技术人员按照常规方法能 很容易的确定治疗有效量。

本文所使用的术语“治疗”、“预防”是指因施与预防剂或治疗剂所 致的受试者疾病的一种或多种症状的复发或开始的预防。

人源化抗体的构建

通过参考以下包含于此的具体实施方案的详细描述，能更容易理解本 发明。尽管本发明根据其特定的实施方案的特定细节进行描述，但并不意 欲把这些细节当作是对本发明范围的限制。

本发明提供了包含高特异性和高效抗体的新的方法和组合物，所述抗 体具有特异性地识别并结合至来自β淀粉状蛋白抗原范围内的特异表位的 能力。通过本发明的教导得到的抗体尤其可用于治疗淀粉状变性，这是一 组与淀粉状蛋白斑的形成相关的疾病和病症，包括继发性淀粉状变性和年 龄相关性淀粉状变性，诸如以下疾病，包括但不限于神经疾病诸如阿尔茨 海默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰 型)、关岛帕金森-痴呆综合征；以及其它基于淀粉状蛋白样蛋白或与其相 关的疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅二氏病、遗传性脑 出血伴淀粉状变性荷兰型、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧 索硬化症)、成年发病型糖尿病、老年性心脏淀粉状变性、内分泌肿瘤，以 及其它疾病，包括黄斑变性，这些仅仅是列举。

可在本发明的范围内产生出根据本发明的完全的人源化或重构的可变 区，通过首先设计含有埋入到人类衍生的构架序列中的非人类、特别是啮 齿类动物衍生的CDR，但尤其是衍生自鼠抗体ACI-01-Ab7C2(在申请中称 为“mC2”，并根据布达佩斯条约于2005年12月1日以保藏号DSM ACC2750保藏在位于德国布劳恩斯切魏格，38124布劳恩斯切魏格，马斯 切尔奥德尔韦格1B的“德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”)的CDR的可变区 氨基酸序列。可以从根据本发明的抗体获得的非人类、特别是啮齿类动物 衍生的CDR提供了期望的特异性。因此，这些残基基本上未改变地包括 在重构的可变区的设计中。因此，应当将任何修饰限制为最小，且严密地 监视在抗体特异性和亲和力方面的改变。另一方面，理论上构架残基可以 衍生自任何的人类可变区。

为了产生显示出可接受的或甚至提高了的亲和力的重构抗体，应当选 择同样地适用于产生重构的可变区和适用于保留抗体亲和力的人类构架序 列。

为达到这一目的，开发了最佳适合策略(best-fit strategy)。因为已 知构架序列支撑CDR以它们正确的空间方向用于与抗原相互作用，并且 构架残基有时甚至能够参与抗原结合，这一策略以最小化可能负面影响抗 体三维结构的改变为目的，通过从与非人类、特别是啮齿类动物衍生的可 变区最同源或类似的人类可变区衍生用于抗体重构的人类构架序列。这还 将最大化亲和力将保留在重构抗体中的可能性。

在其最简单的水平，“最佳适合”策略包括将供体啮齿类动物V区域 与所有已知的人类V区氨基酸序列相比较，并然后选择最同源的以向人源 化过程提供受体构架区。事实上，有若干个其它需要考虑的因素，并且它 们可能影响受体构架区的最终选择。在任何实验工作之前，在这一考虑中 可以应用分子模建预测，以试图最大化所得到的重构抗体的亲和力。实际 上，模型的目的是预测最同源的人类构架的哪些关键残基(如果有的话)需 要如在啮齿类动物中那样保留，以在重构抗体中获得最佳亲和力。

在本发明的一个实施方案中，CDR可从小鼠单克隆抗体，特别是从在 共同未决申请EP 05 02 7092.5(2005年12月12提交)中描述的小鼠单克隆 抗体ACI-01-Ab7C2得到，所述申请的公开在此引入作为参考。

产生小鼠单克隆抗体ACI-01-Ab7C2(在本申请中称为“mC2”，且对 于人源化C2抗体，称为hC2)的杂交瘤细胞FP-12H3-C2于2005年12月 1日在共同未决申请EP05027092.5号中根据布达佩斯条约以保藏号DSM ACC2750保藏在位于德国布劳恩斯切魏格，38124布劳恩斯切魏格，马斯 切尔奥德尔韦格1B的“德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”中。

可以通过抗超分子抗原构建体来产生小鼠抗体，所述超分子抗原构建 体包含对应于β-淀粉状蛋白肽，特别是β-淀粉状蛋白肽Aβ1-15、Aβ1-16和 Aβ1-16(Δ14)氨基酸序列的抗原肽，所述抗原肽用疏水部分(例如，诸如棕榈酸) 或亲水部分(例如，诸如聚乙二醇(PEG))或两者的组合进行修饰，其中所述 疏水和亲水部分分别通过至少一个，特别是一个或两个氨基酸，例如，诸 如赖氨酸、谷氨酸和半胱氨酸或任何其它的能够用作将亲水和疏水部分偶 联到肽片段的连接结构的合适的氨基酸或氨基酸类似物而共价地连接到抗 原性肽的每一个末端。当使用PEG作为亲水部分时，游离的PEG末端共 价地连接到磷脂酰乙醇胺或任何其它适合于作为锚定元件的化合物上，例 如，以将抗原构建体埋在脂质体的双分子层中。

具体而言，可以通过抗超分子抗原构建体来产生小鼠抗体，所述超分 子抗原构建体包含对应于β-淀粉状蛋白肽Aβ1-16的氨基酸序列的抗原肽， 所述抗原肽用亲水部分(例如，诸如聚乙二醇(PEG))进行修饰，其中亲水部 分通过至少一个，特别是一个或两个氨基酸，例如，诸如赖氨酸、谷氨酸 和半胱氨酸或任何其它的能够用作将亲水和疏水部分偶联到肽片段的连接 结构的合适的氨基酸或氨基酸类似物而共价地连接到抗原性肽的每一个末 端。当使用PEG作为亲水部分时，游离的PEG末端共价地连接到磷脂酰 乙醇胺或任何其它适合于作为锚定元件的化合物上，例如，以将抗原构建 体埋在脂质体的双分子层中。

在本发明的一个实施方案中，提供了嵌合抗体或嵌合抗体片段、或人 源化抗体或人源化抗体片段，它们在可变区中包含嵌入在一个或多个人类 或灵长类动物来源的构架区中并与衍生自人类或灵长类动物来源抗体的恒 定区组合的至少一个非人类来源的CDR，所述嵌合抗体或嵌合抗体片段、 或人源化抗体或人源化抗体片段能够特异性地识别并结合β淀粉状蛋白单 体肽。

CDR含有最可能结合抗原的残基，并必须保留在重构抗体中。通过根 据Kabat等，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，美国政府印刷局(The United States Government Printing Office)，1991的序列定义CDR。当关键残基在很大 程度上决定CDR环的结构构象时，CDR落入标准类型(Chothia等，1989 Nature，342，877-883)。这些残基几乎总是保留在重构抗体中。

在制备根据本发明的人源化抗体的方法中，将C2重链和轻链可变区 (VH和VK)的氨基酸序列与NCBI及Kabat数据库中的啮齿类动物抗体VH 和VK序列相比较。

与C2VK最匹配的小鼠种系基因是bb1，基因座MMU231201，(Schable 等，1999)。比较显示两个氨基酸与这一种系序列不同，两个均位于CDRL1 内。可以发现具有类似但不同一的序列的成熟鼠抗体。若干个具有同一的 CDRL2和同一的CDRL3，但C2的CDRL1似乎是独特的。与人类种系 VK序列的比较显示来自亚组VKII的基因对于C2Vκ是最匹配的(Cox等， 1994)。因此可将C2Vκ归于KABAT亚组MuVKII序列。

可以选择DPK15和人类J区域HuJK1以向人源化VK提供受体构架序 列。

已经定义了在可变轻链和重链之间的界面处的残基(Chothia等，1985 J.Mol.Biol，186，651-663)。这些通常保留在重构抗体中。在VKII亚组中， 小鼠C2VK位置87的Phe很少在界面上，而在该界面上Tyr更常见，表 明这一构架残基可能对于抗体活性很重要。Tyr 87存在于人类种系和人源 化C2VK中。

因此，可以如此的设计人源化VK序列，以使得C2HuVK1由具有来 自DPK15和人类Jκ1的构架的小鼠C2VK CDR组成。在本发明特定的实 施方案中，可以在人类构架区位置45和/或87替换鼠残基。在可从小鼠单 克隆抗体，特别是鼠抗体ACI-01-Ab7C2得到的CDR2区域中，可以在 Kabat位置50和/或53进行氨基酸替换。残基45可能参与支持CDR的构 象。残基87位于VH和VK结构域的界面上。因此，这些残基对于维持抗 体结合可能是很关键的。

与C2VH AF最匹配的小鼠种系基因是VH7183，基因座AF 120466 (Langdon等，2000)。与人类种系VH序列的比较显示来自亚组VHIII的基 因与C2VH最匹配。可将C2VH AF归于KABAT亚组MuVHIIID。可选 择序列DP54和人类J区域HuJH6以向人源化VH提供受体构架序列。

比较显示在C2VH序列和人类受体种系序列DP54及JH6之间有九个 氨基酸不同，其大多位于CDRH2内。发现了具有同一或相似(一个残基 不同)的CDRH1或具有相似的CDRH2(一个残基不同)的成熟鼠抗体，但 是没有一个抗体具有与C2VH AF同一的全部三个CDR。C2抗体的 CDRH3极其短，仅仅由三个残基组成。然而，在数据库中发现了具有这 一长度的CDRH3的其它抗体。C2VH的残基47是Leu，而不是较常见的 Trp，且残基94是Ser而不是通常的Arg，表明这些构架残基可能对于抗 体活性是很重要的。

可以设计多种人源化VH序列。C2HuVH1由具有来自DP54的构架的 C2VH AF CDR和HuJH6组成。在本发明特定的实施方案中，可以在人类 构架区位置47或94或两者替换鼠残基。构架2中的残基47与CDR及 VK结构域两者接触。残基94可能参与支持CDR的构象。因此这些残基对 于维持抗体结合可能是很关键的。

可以设计不同的HCVR和LCVR区域，其包含可从供体抗体，例如 鼠抗体得到的、埋入到天然或经修饰的人类或灵长类动物来源的构架区中 的非人类CDR。修饰可以特别地涉及构架区中的一个或个氨基酸的交换， 所述交换是通过在分别的亚组中的这一位置更普遍发现的非人类残基，特 别是鼠残基，或通过具有与在分别的亚组中的这一位置更普遍发现的残基 类似的性质的残基进行的。

构架区的修饰，构架序列支撑CDR以它们正确的空间方向用于与抗原 相互作用，并且构架残基有时甚至可以参与抗原结合。在本发明的一个实 施方案中，进行测量以进一步改造所选择的人类构架序列以使得它们与啮 齿类动物构架序列最类似，以最大化亲和力将保留在重构抗体中的可能性。

因此，可以替换人类构架区中的鼠残基。具体而言，可以在人类重链 可变区(HCVR)构架区位置47或94或两者，以及人类轻链可变区(LCVR) 构架区位置45和/或87替换鼠残基。在可从小鼠单克隆抗体，特别是鼠抗 体ACI-01-Ab7C2得到的CDR2区域中，可在Kabat位置50和/或53进 行氨基酸替换。

可以通过在分别的亚组中的这一位置较普遍地发现的鼠残基交换在人 类构架区中上面所示位置中发现的残基。具体而言，在如SEQ ID NO：15 所示的人类或灵长类动物来源的重链可变区的构架区中Kabat位置47的 Trp可被Leu或被下述氨基酸残基替换，其中所述氨基酸残基具有类似的 性质并且该氨基酸的替换导致这样的改变，即所述改变基本上在构象上或 抗原性上中性的、产生在突变多肽的三级结构中的最小的变化、或产生在 抗原决定簇中最小的变化。具体而言，在如SEQ ID NO：15所示的人类或 灵长类动物来源的重链可变区的构架区中Kabat位置47的Trp还可被选 自正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala和Phe的氨基酸替换，特别地被Ile替 换。可以考虑构象上和抗原性上中性的备选保守替换。

在如SEQ ID NO：15所示的人类或灵长类动物来源的重链可变区的构 架区中Kabat位置94的Arg可被Ser或被下述氨基酸残基替换，其中所 述氨基酸残基具有类似的性质并且该氨基酸的替换导致这样的改变，即所 述改变基本上在构象上或抗原性上中性的、产生在突变多肽的三级结构中 的最小的变化、或产生在抗原决定簇中最小的变化。具体而言，在如SEQ ID NO：15所示的人类或灵长类动物来源的重链可变区的构架区中Kabat 位置94的Arg可备选地被Thr替换。

在本发明的另一个实施方案中，在人源化抗体中可以替换两个残基。

在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构 架区中Kabat位置45的Gln可被Lys或被下述氨基酸残基替换，其中所 述氨基酸残基具有类似的性质并且该氨基酸的替换导致这样的改变，即所 述改变基本上在构象上或抗原性上中性的、产生在突变多肽的三级结构中 的最小的变化、或产生在抗原决定簇中最小的变化。具体而言，在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构架区中Kabat 位置45的Gln可被选自Arg、Gln和Asn的氨基酸替换，特别地被Arg 替换。

在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构 架区中Kabat位置50的Leu可被Lys或被下述氨基酸残基替换，其中所 述氨基酸残基具有类似的性质并且该氨基酸的替换导致这样的改变，即所 述改变基本上在构象上或抗原性上中性的、产生在突变多肽的三级结构中 的最小的变化、或产生在抗原决定簇中最小的变化。具体而言，在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构架区中Kabat 位置50的Leu可被选自Arg、Gln和Asn的氨基酸替换，特别地被Arg 替换。

在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构 架区中Kabat位置53的Asn可被His和Gln，或被下述氨基酸残基替换， 其中所述氨基酸残基具有类似的性质并且该氨基酸的替换导致这样的改 变，即所述改变基本上在构象上或抗原性上中性的、产生在突变多肽的三 级结构中的最小的变化、或产生在抗原决定簇中最小的变化。具体而言， 在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构架区 中Kabat位置53的Asn可被选自Gln、His、Lys和Arg的氨基酸替换。

在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构 架区中Kabat位置87的Thr可被Phe或被下述氨基酸残基替换，其中所 述氨基酸残基具有类似的性质并且该氨基酸的替换导致这样的改变，即所 述改变基本上在构象上或抗原性上中性的、产生在突变多肽的三级结构中 的最小的变化、或产生在抗原决定簇中最小的变化。具体而言，在如SEQ ID NO：12所示的人类或灵长类动物来源的轻链可变区的构架区中Kabat 位置87的Tyr可被选自Leu、Val、Ile和Ala的氨基酸替换，特别地被 Leu替换。

然后可将这样得到的可变区与衍生自人类或灵长类动物来源抗体的恒 定区，特别地分别与人类IgG4或κ恒定区组合，其中所述可变区包含埋 入在一个或多个人类或灵长类动物衍生的构架区中的至少一个非人类来源 的CDR。可以例如通过将铰链区中位置228的丝氨酸改变为脯氨酸 (HuIgG4Ser-Pro)来修饰IgG4恒定区。这一突变稳定了链间的二硫键，并 且阻止了可能在天然人类IgG4制品中发生的半分子的形成。可以通过缺 失如SEQ ID NO：16所示的位置439上的末端Lys进一步修饰IgG4恒定 区。

可以通过本领域已知的方法，例如诸如重叠PCR重组，来构建经修饰 的可变区。可将嵌合抗体的表达盒C2ChVHAF和C2ChVK用作用于将构 架区诱变为所需序列的模板。合成包含待改变区域的诱变引物对的组。可 将所产生的人源化VH和VK表达盒克隆到本领域已知的合适的克隆载体 中，例如诸如pUC19。在确定了全部DNA序列对于每一个VH和VK都是 正确的之后，可将经修饰的重链和轻链V区域基因作为表达盒从克隆载体 中切除。然后可将它们转移到合适的表达载体中，所述表达载体诸如分别 包括人类IgG4Ser-Pro或κ恒定区的pSVgpt和pSVhyg。

表达载体

表达载体pSVgpt基于pSV2gpt(Mulligan和Berg，1980)，且包括用于 在细菌细胞中选择的氨苄青霉素抗性基因、用于在哺乳动物细胞中选择的 gpt基因、鼠重链免疫球蛋白增强子区域、编码恒定区基因的基因组序列和 SV40多聚A序列。将用于表达的重链可变区作为HindIII至BamHI片段 插入。

表达载体pSVhyg包括用于在细菌细胞中选择的氨苄青霉素抗性基因、 用于在哺乳动物细胞中选择的hyg基因、鼠重链免疫球蛋白增强子区域、 编码κ恒定区基因且包括κ增强子的基因组序列和SV40多聚A序列。将 用于表达的轻链可变区作为HindIII至BamHI片段插入。

然后确定DNA序列对于表达载体中的人源化VH和VK是正确的。

对于抗体生产，可将人源化重链和轻链表达载体导入本领域公知的合 适的生产细胞系中，例如诸如NS0细胞。可以通过共转染完成表达载体的 导入，其中所述共转染是通过电穿孔或任何其它本领域中可利用的合适的 转化技术完成的。然后可选择并放大产生抗体的细胞系，以及纯化人源化 抗体。然后可通过标准技术诸如SDS-PAGE分析纯化的抗体。

具有提高的亲和力、特异性和稳定性的抗体

可以轻微地修饰小鼠C2抗体的CDRL2序列(“KVSNRFS”)，而不 会不利地影响抗体活性。可以通过将位置50的K改变为R以及将位置53 的N改变为S进行保守突变。该两个备选的CDRL2序列因此分别是 “RVSNRFS”和“KVSSRFS”。没有其它改变掺入到鼠VK序列中，分 别作为C2VK-R和C2VK-S。

可以通过改变其糖基化特性或模式修饰上文描述的根据本发明的抗体 或其片段的亲和力、特异性和稳定性，以产生提高了的治疗价值。

为达到该在糖基化模式中的改变，可以改造宿主细胞，使得它们能够 表达修饰糖蛋白的糖基转移酶活性的优选的范围，其升高复合物N连接的 寡糖携带的二等分GIcNAc。此外，可以得到糖蛋白的经修饰的糖形式， 例如具有增强的Fc介导的细胞毒性的抗体，所述抗体包括完整抗体分子、 抗体片段、或包括与免疫球蛋白的Fc区域等价区域的融合蛋白。

获得具有经修饰的糖基化模式的抗体的方法是本领域普通技术人员公 知的，并且例如描述于EP 1071700、US2005272128、Ferrara等(2006)J Biol Chem 281(8)，5032-5036)、Ferrara等(2006)Biotechnology and Bioengineering 93(5)，851-861。

药物制备物和施与

根据本发明的抗体，但特别是根据本发明的单克隆抗体可以用公知的 技术制备为生理学上可接受的制剂，并且其可以包含可药用载体、稀释剂 和/或赋形剂。例如，根据本发明和在上文中描述的包括任何功能等效抗体 或其功能部分的抗体、特别是包括任何功能等效抗体或其功能部分的单克 隆抗与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂结合形成药物组合物。适宜的药学 载体、稀释剂和/或赋形剂是本领域公知的并且包含例如磷酸缓冲盐溶液、 水、乳液(诸如油/水乳液)、多种湿润剂、无菌溶液等。

根据本发明的药物组合物的配制可以根据本领域技术人员公知的标准 方法完成。

本发明的组合物可以以固体、液体或气溶胶的形式以合适的、药学有 效剂量施与受试者。固体组合物的实例包括片剂、乳膏以及可植入的剂量 单位。片剂可以经口施与。治疗乳膏可以局部施与。可植入的剂量单位可 以局部地例如在肿瘤部位施与；或可以经植入用于全身地释放治疗组合物， 例如经皮下植入。液体组合物的实例包括适合肌内、皮下、静脉内、动脉 内注射的制剂，以及用于局部或眼内施与的制剂。气溶胶制剂的实例包含 用于施与至肺的吸入制剂。

组合物可以通过标准的施与途径施与。一般来说，组合物可以通过局 部、经口、直肠、鼻、真皮内、腹膜内或非肠胃的(例如静脉内、皮下、肌 肉内)途径施与。此外，还可将组合物掺入到持续释放基质中，诸如生物可 降解的聚合物，将聚合物植入期望递送位置例如肿瘤部位附近。方法包括 单剂量的施与、以预定的时间间隔重复剂量施与、以及持续施与预定的一 段时间。

本文使用的持续释放基质是由通常可被酶或酸/碱水解或通过溶解而 可降解的聚合物这样的物质制造的基质。一旦植入到体内，基质受到酶和 体液的影响。期望的持续释放基质选择为生物相容性物质，诸如脂质体、 聚丙交酯(聚丙交酯酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共乙交酯(乳 酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐类、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸 软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、诸如苯丙氨酸、 酪氨酸、异亮氨酸的氨基酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮 和聚硅氧烷。优选的生物可降解基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯共 乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基质。

本领域技术人员公知组合物的剂量取决于多种因素，例如，诸如待治 疗的症状、所使用的特定组合物、以及其它临床因素(诸如患者的体重、尺 寸、性别和一般健康状况)、身体表面面积、待施与的特定的化合物或组合 物、同时施与的其它药物以及施与途径。

组合物可以和其它包含生物活性物质或化合物的组合物联合施与，特 别是选自下列的化合物的至少一种、以及本发明的抗体、以及任选的可药 用载体和/或稀释剂和/或赋形剂：抗氧化应激的化合物、抗细胞凋亡的化合 物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂诸如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺 酸(3APS)、1，3-丙二磺酸(1，3PDS)、α-分泌酶活化剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、 τ蛋白、神经递质、β折叠破坏剂、淀粉状蛋白β清除/减少细胞内组分的 引诱剂、包括焦谷氨酸化淀粉状蛋白β3-42在内的N端截短淀粉状蛋白β 的抑制剂、消炎分子、“非典型的抗精神病药物”(例如，诸如氯氮平、齐 拉西酮、利哌利酮、阿立哌唑或奥氮平)、或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)(诸如 他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、和/或加兰他敏)、M1激动剂和其它药物， 包括任何淀粉状蛋白或τ修饰药物、以及营养补充剂，诸如维生素B12、 半胱氨酸、乙酰胆碱前体、卵磷脂、胆碱、银杏、乙酰基-L-肉毒碱、艾地 苯醌、丙戊茶碱或黄嘌呤衍生物；以及疾病治疗方法。

蛋白质药学活性物质可以以每剂1ng至10mg之间的量存在。一般地， 施与方案可以是0.1μg至10mg之间范围的根据本发明的抗体、特别是 1.0μg至1.0mg的范围、更特别的1.0μg至100μg之间的范围，所有落入 这些范围的单个数值也是本发明的一部分。如果通过连续输注进行施与， 更适当的剂量可以是每小时每千克体重0.01μg至10mg单位之间的范围， 所有落入这些范围的单个数值也是本发明的一部分。

施与通常是非肠胃的，例如静脉内地施与。非肠胃施与的制品包括无 菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂包括但不限于丙二醇、 聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)、以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水 性溶液可以选自水、醇/水溶液、乳液或包括盐和缓冲介质的悬浮液。非肠 胃的载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏 液或不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补充物、电解质补充物(诸如基 于林格氏右旋糖的那些)以及其它物质。也可以存在防腐剂，例如，诸如抗 菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

药物组合物可以进一步包含蛋白质载体，例如，诸如血清白蛋白或免 疫球蛋白，特别是人类来源的。其它的生物活性物质也可以存在于发明的 药物组合物中，取决于它的目的用途。

当结合靶标位于脑中时，本发明的某些实施方式提供抗体或其活性片 段穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障渗透性的升高相关，由此 抗体或其活性片段能很容易地被导入脑中。当血脑屏障仍保持完整无缺时， 存在若干种本领域已知的用于将分子转运穿过它的方法，包括但不限于： 物理方法、基于脂质地方法、以及基于受体和通道的方法。

转运抗体或其活性片段穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于：完全 地规避血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。规避方法包括但不限于： 直接注射至脑中(例如参见，Papanastassiou等，Gene Therapy 9：398-406 (2002))和在脑中植入传送装置(例如参见，Gill等，Nature Med.9：589-595 (2003)、和Gliadel WafersTM，Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开 口的方法包括但不限于：超声(例如参见美国专利公开2002/0038086号)、 渗透压力(例如通过施与高渗甘露糖醇(Neuwelt，E.A.，血脑屏障的应用及 其操作(Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation)，，卷1 和2，Plenum Press，N.Y.(1989)))、例如通过缓激肽或透化剂A-7(例如美 国专利5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416号)的透化作用、以及 用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元 (例如参见美国专利公开2003/0083299号)。

转运抗体或其活性片段穿过血脑屏障的基于脂质体的方法包括但不限 于：将抗体或其活性片段封进与抗体结合片段偶联的脂质体内部，所述抗 体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(例如参见美国专利申请公 开20020025313号)、以及将抗体或其活性片段包被在低密度脂蛋白颗粒中 (例如参见美国专利申请公开20040204354号)或载脂蛋白E中(例如参见美 国专利申请公开20040131692号)。

转运抗体或其活性片段穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但 不限于：应用糖皮质激素阻滞物增加血脑屏障的渗透性(例如参见美国专利 申请公开2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533号)；活化钾通道(例 如参见美国专利申请公开2005/0089473号)、抑制ABC药物转运装置(例如 参见美国专利申请公开2003/0073713号)；用转铁蛋白包被抗体并调制活 化一个或多个转铁蛋白受体(例如参见美国专利申请公开2003/0129186 号)、以及阳离子化抗体(例如参见美国专利5,004,697号)。

检测/诊断

在本发明另外的实施方案中，提供了可用于检测和诊断淀粉状蛋白相 关疾病或病症的方法和试剂盒。这些方法包括通常用于检测或定量生物样 本中或原位条件下的物质的公知的免疫学方法。

淀粉状蛋白相关疾病或病症的诊断可以通过检测单克隆抗体或其活性 片段与样本或原位淀粉状蛋白表位的免疫特异结合来完成，其包括使怀疑 含有淀粉状蛋白的样本或特定身体部分或身体区域与结合淀粉状蛋白表位 的抗体接触，允许抗体结合至淀粉状蛋白以形成免疫复合物，检测免疫复 合物的形成，并将免疫复合物的存在或不存在与样本或特定身体部分或区 域中淀粉状蛋白的存在或不存在相关联，任选地将所述免疫复合物的量与 正常对照值比较，其中与正常对照值相比较，所述集聚物的量的增加指示 了所述患者患有淀粉状蛋白相关疾病或病症或者有发展为淀粉状蛋白相关 疾病或病症的危险。

通过检测单克隆抗体或其活性片段与样本中的或原位的淀粉状蛋白的 表位的免疫特异性结合可以实现监测用根据本发明的抗体或疫苗组合物治 疗后的患者中的微小残留病(minimal residual disease)，其包括使怀疑含有 淀粉状蛋白抗原的样本或特定身体部分或身体区域与结合淀粉状蛋白表位 的抗体接触，允许抗体结合至淀粉状蛋白抗原以形成免疫复合物，检测免 疫复合物的形成，并将免疫复合物的存在或不存在与样本或特定身体部分 或区域中淀粉状蛋白的存在或不存在相关联，任选地将所述免疫复合物的 量与正常对照值比较，其中与正常对照值相比较，所述集聚物的量的增加 指示了所述患者可能仍患有微小残留病。

通过检测单克隆抗体或其活性片段与样本中的或原位的淀粉状蛋白表 位的免疫特异性结合可以实现预测用根据本发明的疫苗组合物治疗的患者 的反应性，其包括使怀疑含有淀粉状蛋白抗原的样本或特定身体部分或身 体区域与结合淀粉状蛋白表位的抗体接触，允许抗体结合至淀粉状蛋白抗 原以形成免疫复合物，检测免疫复合物的形成，并将免疫复合物的存在或 不存在与样本或特定身体部分或区域中淀粉状蛋白的存在或不存在相关 联，任选地比较治疗开始前后所述免疫复合物的量，其中所述集聚物的量 的降低指示了所述患者对治疗具有高的反应潜力。

可以用于诊断淀粉状蛋白相关疾病或病症的生物样本是例如体液，诸 如血清、血浆、唾液、胃分泌液、黏液、脑脊髓液、淋巴液等；或从生物 体获得的组织或细胞样本，诸如神经、脑、心脏或血管组织。为检测在样 本中淀粉状蛋白的存在或不存在，可以使用任何本领域普通技术人员公知 的免疫测定法(参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory，New York 1988555-612))，例如，利用应 用了用于检测的第二试剂的间接检测方法的分析、ELISA和免疫沉淀法和 凝集测试法。例如Maertens和Stuyver的WO96/13590，Zrein等(1998)和 WO96/29605给出了这些测试法的详细描述。

对于原位诊断，可以利用领域公知的方法将抗体或其任何活性和功能 部分施与待诊断的生物，例如静脉内、鼻内、腹膜内、大脑内、动脉内注 射，从而根据本发明的抗体与淀粉状蛋白抗原上的表位区域之间可能发生 特异性结合。可以通过连接至抗体或其功能片段的标记物检测抗体/抗原复 合物。

用于诊断应用的免疫测定法通常依赖于标记的抗原、抗体或用于检测 的第二试剂。蛋白或试剂可以用本领域技术人员公知的化合物标记，包括 酶、放射性同位素、以及荧光、发光以及显色物质，包括有色粒子，诸如 胶体金和乳胶微球。在这些方法中，放射性标记几乎可以应用于所有类型 的测试并且具有最多的变化。在必须避免放射性或需要快速结果时，缀合 酶的标记特别有用。尽管荧光染料在使用中需要昂贵的设备，但荧光染料 提供了非常敏感的检测方法。用于这些检测的抗体包括单克隆抗体、多克 隆抗体和经亲和纯化的多克隆抗体。

备选地，可以通过与经标记的对免疫球蛋白具有亲和力的物质(诸如蛋 白A或蛋白G或第二抗体)的反应来间接地标记抗体。抗体可以与第二物 质缀合，并且用标记的对缀合到抗体的第二物质有亲和力的第三物质检测。 例如，抗体可以缀合生物素，以及用标记的亲和素或链亲和素检测抗体- 生物素缀合物。类似的，抗体可以缀合半抗原，以及用标记的抗半抗原抗 体检测抗体-半抗原缀合物。

本领域技术人员公知这些和其它可用于本发明的适合标记物。可以应 用本领域普通技术人员普遍公知的标准技术完成这些标记物与抗体或其片 段的结合。Kennedy，J.H.，等，1976(Clin.Chim.Acta 70：1-31)，和Schurs， A.H.W.M.等，1977(Clin.Chim Acta 81：1-40)描述了典型的技术。在后者 提到的偶联技术是戊二醛法、高碘酸盐法、双马来酰亚胺法以及其它方法， 所有的这些都在此引入作为参考。

当前的免疫测定法利用双抗体方法以检测分析物的存在，其中，抗体 通过与已用可检测的标记物标记的第二抗体反应被间接标记。第二抗体优 选的是与单克隆抗体来源动物的抗体结合的抗体。换句话说，如果单克隆 抗体是小鼠抗体，则标记的第二抗体是抗小鼠抗体。对于下面描述的测试 中使用的单克隆抗体，这种标记物优选地是抗体包被的珠，特别是磁珠。 对于将在此描述的免疫测定中应用的多克隆抗体，优选的标记物是可检测 的分子，诸如放射性的、荧光的、或电化学发光物质。

也可以在本发明的范围内应用备选的双抗体系统，由于它们适合于快 速测定分析物的存在，经常被称为快速格式系统(fast format systems)。该 系统需要抗体与分析物之间的高亲和力。根据本发明的一个实施方案，用 一对各自对淀粉状蛋白特异的抗体测定淀粉状蛋白的存在。所述的抗原对 中的一个在此被称为“检测抗体”，以及所述的抗原对中的另一个在此被 称为“俘获抗体”。本发明的单克隆抗体可以用做俘获或检测抗体。本发 明的单克隆抗体也可作为俘获和检测抗体一起用于单个分析。本发明的一 个实施方案因此应用双抗体夹心法以在生物流体样本中检测淀粉状蛋白。 在这一方法中，分析物(淀粉状蛋白)被夹在检测抗体和俘获抗体之间，俘 获抗体不可逆的固定在固体支持物上。检测抗体包含可检测的标记物，以 鉴定抗体-分析物夹心的存在并且因此鉴定分析物的存在。

示例性固相物质包括但不限于在放射免疫测定和酶免疫测定领域中公 知的微量滴定板、聚苯乙烯试管、磁性、塑料或玻璃小珠和玻片。用于将 抗体偶联到固相的方法也是本领域技术人员公知的。最近，多种多孔材料 诸如尼龙、硝化纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维和其它的多孔聚合物也已 被用做固体支持物。

本发明也涉及检测生物样本中淀粉状蛋白的诊断试剂盒，其包含上面 定义的组合物。此外，本发明涉及后面的诊断试剂盒，除了如上面定义的 组合物外，其还包括上面所定义的检测试剂。术语“诊断试剂盒”一般涉 及本领域公知的任何诊断试剂盒。更具体地说，后一术语指如在Zrein等 (1998)描述的诊断试剂盒。

本发明的另一个目的是提供用于检测和诊断淀粉状蛋白相关疾病和病 症的包含根据本发明的抗体的新免疫探针和测试试剂盒。对于免疫探针， 抗体直接或间接的与合适的报告分子(例如，酶或放射性核素)相连接。测 试试剂盒包含容纳一种或多种根据本发明的抗体的容器，以及使用抗体用 于结合淀粉状蛋白以形成免疫复合物及检测免疫复合物的形成从而使免疫 复合物的存在或不存在与淀粉状蛋白存在或不存在相关联的说明书。

实施例

材料

小鼠单克隆抗体ACI-01-Ab7C2(在本申请中称为“mC2”，以及对于 人源化C2抗体称为hC2)的开发和制备描述于2005年12月12日提交的共 同未决申请EP 05 02 7092.5，其全文在此引入作为参考。

产生小鼠单克隆抗体ACI-01-Ab7C2(在本申请中称为“mC2”，以及 对于人源化C2抗体，称为hC2)的杂交瘤细胞FP-12H3-C2于2005年12 月1日在共同未决申请EP05027092.5号中根据布达佩斯条约以保藏号 DSM ACC2750保藏在位于德国布劳恩斯切魏格，38124布劳恩斯切魏格， 马斯切尔奥德尔韦格1B的“德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)”中。

将杂交瘤细胞培养于补充有10％胎牛血清和抗生素(青霉素/链霉素)的 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。检查了所产生的抗体的同位型， 并且发现是小鼠IgG2b/κ，和期望的一样。

测试法

与淀粉状蛋白β结合的ELISA提供了C2抗体效力的可靠测量。阳性 对照抗体，鼠FP-12H3-C2(Genovac批号：AK379/01)，以及标准Chemicon 抗体1560(批号：0508008791)。

人类恒定区的选择

对于临床抗体候选者来说，免疫系统的募集是不期望的，对于重链， 所选择的人类恒定区是人类IgG4，对其进行修饰以将铰链区中位置228的 丝氨酸改变为脯氨酸(HuIgG4Ser-Pro)。这一突变稳定了链间的二硫键， 并且阻止了可能在天然人类IgG4制品中发生的半分子的形成。从生产细 胞系表达的抗体还将具有移除的末端赖氨酸。人类恒定区HuIgG4Ser-Pro 和人类κ的序列分别在SEQ ID NO：17和14中给出。

实施例1  抗体可变区的克隆和测序

应用Qiagen Rneasy微型试剂盒(目录号：74104)从3×106个杂交瘤细 胞(一个T175培养瓶)中制备总RNA。将RNA洗脱在50μL水中，并在1.2％ 琼脂糖凝胶上检查。保留来自细胞的条件培养基，并在抗体活性测试法中 将样本用于测试。

用小鼠IgG和κ恒定区引物应用逆转录酶制备VH和VK cDNA。应用 大量信号序列引物通过PCR扩增第一链cDNA。将扩增的DNA凝胶纯化 并克隆至载体T Easy(Promega)中。通过PCR针对期望大小的插 入片段对得到的VH和VK克隆进行筛选，并通过自动DNA测序确定所 选择的克隆的序列。参照其它抗体序列(Kabat EA等，1991)确定互补决定 区(CDR)在序列中的位置。在本申请中贯穿使用对于抗体可变区的Kabat 编号规则；因此残基编号可能与严格的线性编号不同。

mC2VK的DNA序列及推出的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：29和 27所示。四个克隆给出这一同一的生产序列。在许多克隆中也发现了由杂 交瘤融合配偶体产生的非生产性异常VK序列。

对于mC2VH，分离了两个不同的生产性序列。在总共29个克隆中发 现了mC2VH AF序列(参见SEQ ID NO：30)，在个别克隆中有14个单碱 基对改变。在总共8个克隆中发现了mC2VH B序列。它们中的五个代表 多数序列，而其它3个克隆是在其上的变体。有可能这些类似VH B序列 是作为PCR扩增的人工产物产生的。从C2杂交瘤细胞中也得到了非生产 性异常VH，并将其归因于有缺陷的V-D-J结合。

为确定哪一个是正确的活性mC2VH，用该两个不同的VH序列AF和 B与mC2Vk组合，制备了两个嵌合抗体，以测试正确的抗体活性。

实施例2  嵌合抗体基因的构建

以其最常见形式的人类嵌合抗体由与鼠(或其它非人类)可变区连接的 人类恒定区组成。嵌合抗体提供了非常有用的工具，首先用于确认已鉴定 的正确的可变区，其次在具有相同的效应子功能并利用相同的第二检测试 剂作为人源化或工程抗体的抗原结合测试法中用作对照抗体，以及还可用 于研究关于抗体特定靶标的人类恒定区的药物代谢动力学和其它特性。

构建了两个嵌合重链表达载体，其由与表达载体pSVgpt中的HuIgG4 (Ser-Pro)恒定区连接的mC2 VH AF或mC2 VH B可变区组成。该载体基于 pSV2gpt(Mulligan和Berg，1980)，且包括用于在细菌细胞中选择的氨苄青 霉素抗性基因、用于在哺乳动物细胞中选择的gpt基因、鼠重链免疫球蛋 白增强子区域、编码恒定区基因的基因组序列和SV40多聚A序列。将用 于表达的重链可变区作为HindIII至BamHI片段插入。

构建了嵌合轻链载体，其由与表达载体pSVhyg中的人类Cκ恒定区 的C2VK组成。pSVhyg(Hieter PA等，1980)包括用于在细菌细胞中选择 的氨苄青霉素抗性基因、用于在哺乳动物细胞中选择的hyg基因、鼠重链 免疫球蛋白增强子区域、编码κ恒定区基因且包括κ增强子的基因组序列 和SV40多聚A序列。将用于表达的轻链可变区作为HindIII至BamHI片 段插入。

应用载体VH-PCR1和VK-PCR1作为模板(Riechmann等，1988)，通 过添加包括前导信号肽、前导内含子和鼠免疫球蛋白启动子的5’侧翼序列， 以及包括剪接部位和内含子序列的3’侧翼序列，构建鼠C2VH和VK序列 的表达盒。确定嵌合表达载体中VH和VK的DNA序列是正确的。表达 盒中VH和VK基因的DNA和氨基酸序列如图1和2所示。

实施例3  嵌合抗体的表达

3.1在稳定细胞系中的表达

用于抗体表达的宿主细胞系是NS0，其为不产生免疫球蛋白的小鼠骨 髓瘤，获自欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，Porton UK(ECACC号85110503)。通过电穿孔将重链和轻 链表达载体共转染入NS0细胞。在补充有10％胎牛血清(FBS)、0.8μg/ml 霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中选 择表达gpt基因的克隆。通过用于人类IgG的ELISA筛选产生人类抗体的 转染的细胞克隆。放大分泌抗体的细胞系，以及选择产量最高的细胞并冷 冻于液氮中。在如上面那样的但仅含有5％FBS的培养基中放大对于每一 抗体的最佳生产细胞系。应用-A(Bioprocessing有限公司)纯化嵌 合抗体。通过对人类IgGκ抗体的ELISA确定浓度。还通过SDS-PAGE 分析抗体。

3.2嵌合抗体的瞬时表达

为加速不同嵌合抗体的测试，应用瞬时表达以快速生产小量的含有重 组抗体的细胞上清液用于测试。将mC2VH和VK表达盒转移至基于 pcDNA3.1(Invitrogen)的载体上用于瞬时表达。重链载体包括人类IgG恒 定区。轻链载体包括人类κ恒定区。根据生产商提供的方案利用 Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen目录号：11668)将mC2 VH AF和mC2 VH B两者与mC2VK转染至人类胚肾(HEK 298)细胞中。在转染3天后， 从细胞中收获条件培养基。通过用于人类IgGκ抗体的ELISA确定所产生 的抗体量。

实施例4：嵌合C2抗体的活性

4.1通过瞬时转染产生的嵌合C2抗体的活性

在结合淀粉状蛋白β的ELISA中测试两个不同嵌合抗体的来自瞬时转 染的条件培养基样本。结果清楚地表明C2VH AF是正确的序列。C2VH AF/C2VK嵌合抗体在测试中很好地结合，而C2VH B/C2VK完全没有显 示出任何结合。Chemicon 1560鼠对照抗体显示出良好的结合，但通过经 纯化的鼠C2抗体提供的结合很低。应当注意，对于具有小鼠恒定区的鼠 抗体和具有人类恒定区的嵌合抗体的比较，应用了不同的二抗，因此该结 果不是可以直接比较的。后面发现来自C2杂交瘤细胞的条件培养基在测 试法中给出了良好的结果。

4.2纯化的嵌合C2抗体的活性

如所描述的那样从稳定的NS0细胞中纯化两种不同的C2嵌合抗体， 并应用淀粉状蛋白βELISA进行测试。得到的结果与用瞬时表达的抗体得 到的结果一致。C2 ChVH AF/ChVK抗体在ELISA中结合良好，而C2 ChVH B/ChVK抗体完全不结合。

实施例5：人源化C2抗体基因的设计

将mC2VH和VK氨基酸序列与NCBI及Kabat数据库中的啮齿类动 物抗体VH和VK序列相比较。

5.1轻链可变区

与mC2VK最匹配的小鼠种系基因是bb1，基因座MMU231201 (Schable等，1999)。仅仅两个氨基酸与该种系序列不同，两个均位于CDRL1 内。发现了具有类似但不同一的序列的成熟鼠抗体。若干个具有同一的 CDRL2和同一的CDRL3，但mC2的CDRL1似乎是独特的。可将mC2 VK 归于KABAT亚组MuVKII。mC2VK的位置87是F而不是在该亚组中更 常见的Y，表明这一构架残基对于抗体活性可能是很重要的。与人类种系 VK序列的比较显示来自亚组VKII的基因对于C2Vκ是最匹配的(Cox等， 1994)。选择序列DPK15和人类J区域HuJK1以向人源化VK提供受体构 架序列。

设计了四个人源化VK序列。C2HuVK1由与来自DPK 15和人类JK1 的构架区一起的mC2VK CDR组成。在第2、3和4种形式中，在构架中 在位置45或87上或两者替换了鼠残基。残基45可能参与支持CDR的构 象。残基87位于VH和VK结构域的界面上。因此，这些残基可能对于维 持抗体结合是很关键的。位置和在轻链构架区中进行的改变如表6所示。 人源化序列与mC2VK序列以及与DPK15和人类JK1的比较。

5.2重链可变区

与mC2VH AF最密切匹配的小鼠种系基因是VH7183，基因座 AF120466(Langdon等，2000)。该比较如图3所示。九个氨基酸与这一种 系序列不同，大多数位于CDR2内。发现了具有同一或类似(一个残基不同) 的CDR1或具有类似CDR2(一个残基不同)的成熟鼠抗体，但是没有一个 抗体具有三个与mC2VH AF同一的CDR。mC2抗体的CDR3极其短，仅 由三个残基组成。然而，在数据库中发现了具有这一长度的CDR3的其它 抗体。可将mC2VH AF归于KABAT亚组MuVHIIID。mC2VH的残基47 是L而不是较常见的W，以及残基94是S而不是通常的R，表明这些构 架残基对于抗体活性可能是很重要的。与人类种系VH序列的比较显示来 自亚组VHIII的基因与mC2VH最匹配。选择了序列DP54和人类J区域 HuJH6以向人源化VH提供受体构架序列。

设计了四个人源化VH序列。C2HuVH1由与来自DP54和HuJH6的构 架一起的mC2VH AF CDR组成。在第2、3和4种形式中，在构架中在位 置47或94处或两者替换了鼠残基。构架2中的残基47与CDR及VK结 构域两者接触。残基94可能参与支持CDR的构象。因此，这些残基可能 对于维持抗体结合是关键的。

位置和在重链构架区中进行的改变如表7所示。

实施例6：人源化抗体基因的构建

通过重叠PCR重组方法构建修饰的可变区。将嵌合抗体C2ChVH AF 和C2ChVK的表达盒用作用于将构架区诱变为所需序列的模板。合成包 含待改变区域的诱变引物对的组。将所产生的人源化VH和VK表达盒克 隆到pUC19中，并确定全部DNA序列对于每一个VH和VK都是正确的。 将经修饰的重链和轻链V区域基因作为HindIII至BamHI的表达盒从 pUC19中切除。然后将它们转移到分别包括人类IgG4Ser-Pro或κ恒定区 的pSVgpt和pSVhyg中，作为嵌合抗体载体。确定表达载体中的人源化 VH和VK的DNA序列是正确的。

实施例7  人源化抗体的表达

7.1在稳定细胞系中的表达

至于嵌合抗体的表达，将人源化重链和轻链表达载体通过电穿孔共转 染至NS0细胞中。选择并放大产生抗体的细胞系，并且纯化人源化抗体， 确切地作为嵌合抗体。通过SDS-PAGE分析纯化的抗体。

7.2人源化抗体的瞬时表达

为加速不同人源化VH和VK构建体的测试，还将C2人源化VH和VK 表达盒转染至7.2节描述的用于瞬时表达的载体中。将所述四个人源化C2 VK构建体与嵌合C2VH构建体共转染至HEK293细胞。类似地，将四个 人源化C2VH构建体与嵌合C2VK构建体共转染至HEK293细胞。转染 三天后，从细胞中收获条件培养基。通过用于人类IgGκ抗体的ELISA确 定产生的抗体量。

实施例8：人源化C2抗体的活性

8.1通过瞬时转染产生的人源化C2抗体的活性

在淀粉状蛋白βELISA中测试来自瞬时转染的条件培养基样本。所得 到的结果清楚地表明当与嵌合C2κ链组合时，人源化VH构建体C2HuVH AF的第2和4种形式是有功能的，并且在测试法中与嵌合C2抗体是相当 的。相反，含有与嵌合C2κ链组合的C2HuVH AF的第1和3种形式的 抗体在测试法中完全没有显示出结合。这表明在位置94的鼠残基的替换对 于抗体活性是必需的。在ELISA中含有与四个人源化C2κ链组合的嵌合 C2重链的抗体全部都显示出良好的结合，其与嵌合抗体是相当的。

8.2纯化的人源化C2抗体的活性

如所描述的那样从稳定的NS0细胞系纯化包括两个人源化重链和四个 人源化轻链的所有组合的八个不同的人源化C2抗体，并使用淀粉状蛋白β ELISA测试(图4)。

所得到的结果清楚地表明在测试法中C2HuVH4抗体比C2HuVH2 抗体表现更好。在C2HuVH2抗体中，C2HuVH2/HuVK3显示出最佳的 结合活性，但与嵌合对照抗体C2ChVHAF/ChVK相比，其约降低了两倍。 与对照相比，C2HuVH2/HuVK2活性降低了四至五倍。包含与四个不同 的人源化轻链一起的C2HuVH4的抗体的活性是类似的。观察到最高活性 的是C2HuVH4/HuVK1，且四个抗体在测试法中都与对照嵌合抗体相接 近。

实施例9  对CDRL2的修饰

9.1设计具有修饰的CDR2的轻链

如上面提到的那样，许多抗体与C2抗体共有相同的CDRL2序列 (“KVSNRFS”)。决定测试是否可以轻微地修饰CDRL2而不会不利地影 响抗体活性。选择了两个保守替换：位置50的K替换为R，以及位置53 的N替换为S。因此，该两个备选的CDRL2序列是“RVSNRFS”和 “KVSSRFS”。将它们掺入没有其它改变的鼠VK序列中，分别作为mC2 VK-R和mC2VK-S。

9.2修饰的CDRL2抗体的瞬时表达

将具有在11.2.1节中描述的经修饰的CDRL2的两个C2轻链构建体克 隆至轻链载体，用于瞬时表达。每一个都与嵌合C2VH载体共转染至 HEK293细胞中。转染三天后从细胞收获条件培养基。通过用于人类IgGκ 抗体的ELISA确定所产生的抗体量。

9.3具有经修饰的CDRL2的C2抗体的活性

在淀粉状蛋白βELISA中测试来自具有和mC2VH组合的经修饰的 CDRL2的mC2VKS瞬时转染的条件培养基样本(图5)。VK-R和VK-S抗 体两者都与嵌合C2抗体相当，表明在测试法中，所选择的对CDRL2的各 修饰不会显著地影响抗体的活性。

实施例10  亲和力测定

为评估小鼠(ACI-01-Ab-7-C2)嵌合(AF)和人源化抗体(H4K1、H4K4) 的结合特异性和亲和力，应用淀粉状蛋白β1-42单体和纤维作为固定在 CM5芯片上的抗原进行BIACORE.RTM.分析。BIACORE.RTM.技术利 用在抗体结合至固定在层上的抗原后表面层上的折射率改变。通过从表面 折射的激光的表面等离子体共振(surface p1asmon resonance；SPR)检测结 合。信号动力学结合速率(on rate)和解离速率(off rate)的分析允许区分非特 异和特异相互作用。使用的抗体浓度在0.05μM至1.0μM的范围。

表1：小鼠(ACI-01-Ab-7-C2)嵌合(AF)和人源化抗体(H4K1、H4K4) 对淀粉状蛋白β1-42单体和纤维的结合特异性和亲和力

                   单体                          纤维

                   ka(l/Ms)kd(l/s)     KD        ka(l/Ms)kd(l/s)KD(M)

                                       (M)

小鼠ACI-01-Ab-7-C2 | 1.8E+04 | 2.7E-03  1.5E-07 | 2.4E+04 | 9.9E-04   4.1E-08

嵌合AF               4.7E+04   9.5E-04  2E-08     5.1E+04   3.3E-04   6.5E-09

人源化H4K1           5.0E+04   9.5E-04  1.9E-08   4.9E+04   2.3E-04   4.7E-09

人源化H4K4           2.5E+04   4.4E-04  1.8E-08   1.3E+05   3.0E-04   2.3E-09

实施例11  免疫组织化学结合测试法

11.1人类脑切片

在伦理学批准后从波恩的Universitatsklinik获得来自健康的、非痴呆 的前AD(pre-AD)及AD患者的脑。将脑在甲醛中固定，并使海马区脱 水，包埋于石蜡中，并用切片机切成5μm切片。将石蜡切片于RT下保藏， 直到使用。对于新鲜材料，用低温恒温器切成5μm低温切片，并将切片 保藏在-80℃，直到使用。

11.2免疫组织化学

通过将玻片浸泡于二甲苯中，随后浸泡于100％乙醇、90％乙醇和70％ 乙醇中而使石蜡切片脱石蜡和再水化。通过在水中的10％H2O2、10％甲醇 中孵育30分钟降低背景。通过将玻片在100％甲酸中孵育3分钟得到抗原 恢复。在Tris缓冲盐水(TBS，pH 7.5)中洗涤3次后，通过将玻片在TBS 中的10％BSA、0.25％Triton X-100中孵育2小时封闭非特异标记。在洗 涤(在TBS中3次)后，通过添加未标记的抗-人类IgG(Biomeda)并将玻片 在潮湿室中在RT下孵育过夜而进行内源抗体的封闭。在另外的3次洗涤 后，将人类抗淀粉状蛋白一级抗体加到玻片上，并在RT下孵育另一24小 时。洗涤后，往玻片加入碱性磷酸酶标记的二级抗人类IgG(Sigma)并在 RT下孵育2小时。洗涤后，用液体永久红(Dakocytomation)显影玻片，用 水洗涤，并风干，随后用永久封片介质(corbitbalsam)封片。

将冷冻切片在-80℃在甲醇中固定30分钟，并通过添加H2O2到冷甲 醇中至10％的终浓度并在RT下孵育30分钟而降低背景。在Tris缓冲盐 水(TBS，pH7.5)中洗涤3次后，通过如上面那样在TBS中的10％BSA、 0.25％Triton X-100中孵育2小时封闭非特异标记，并且进行如上面那样 的染色步骤。

用Leica DMLB显微镜检查切片，并用Leica DC500相机和Leica FireCaml.2.0软件拍照。

人类抗体A和C均标记了来自AD疾病患者的脑的斑块(图6)。弥散 和核心斑均被标记。此外，非痴呆的前AD患者中的弥散斑块也能够被A 和C抗体检测到。用两个抗体都标记了脑淀粉状蛋白血管疾病(CAA)中的 淀粉状蛋白，并且还检测到了可能与细胞内淀粉状蛋白相对应的神经元的 一些染色。在来自健康患者的对照脑中没有看到标记。可以在用甲酸预处 理的石蜡切片上检测到斑块，但在没有甲酸预处理的石蜡切片上以及在甲 醇中固定的冷冻切片上没有斑块被标记。人类抗体B没有在石蜡切片上检 测到斑块，并且小鼠抗体没有染色人类脑的石蜡或冷冻切片。

缩写

A＝结合的嵌合抗体AF(IgG4)(mC2Ch VHAF)

B＝非结合的嵌合抗体B(IgG4)(mC2VHB)

C＝结合的人源化抗体H4K1(IgG4)(HuVH4/HuVK1)

小鼠＝ACI-01-Ab-C2小鼠抗体(IgG2b)

实施例12：mC2对淀粉状蛋白纤维的功能性

12.1在结合mC2抗体后，Aβ1-42纤维的构象改变和解聚的引发

为评估抗体能够解聚预形成β淀粉状蛋白(Aβ1-42)纤维的机制，进行了 测量解聚的硫代黄素T(Th-T)荧光测试法和分析二级构象的U-13C酪氨酸 10和缬氨酸12标记的Aβ1-42肽的固态核磁共振(NMR)的并行比较(图 7A)。mC2抗体溶解了35.4％的预形成Aβ1-42纤维并同时诱导二级构象从 β折叠向无规则卷曲的转变。就无规则卷曲而言，β折叠构象总量的减少约 为35％，并因此与用荧光Th-T测试法测量的减少总量接近一致(图7B)。 这些数据表明mC2抗体的结合引发二级结构的转变，其可能引起β折叠的 平行分子间排列的不稳定，导致延伸的纤维断裂成较小的片段。

12.2  mC2抗体的构象依赖性结合亲和力

由于在科学文献中公知抗体-抗原结合能量的一部分可以用于抗原构 象的能量依赖性改变(Blond和Goldberg，1987)，因此进行C2抗体结合到 整个Aβ1-42蛋白与结合到9个氨基酸长的包含抗体的表位的较小肽的结合 亲和力的比较实验(图8)。为进行此比较，通过ELISA使用生物素化的覆 盖C2表位的全部氨基酸序列的肽(Mimotopes生产，购自ANAWA Trading SA)和生物素化的完整Aβ1-42肽(Bachem)分析了人源化抗体C2的亲和力。 根据制造商(Mimotopes)的说明书进行分析。如在图8和表2中说明的那样， 抗体与包含其特异表位(Aβ1-42序列的氨基酸13-21)的肽的结合亲和力比与 整个Aβ1-42蛋白的结合亲和力高36.0％。因此提示结合亲和力能量之差被 用于淀粉状蛋白二级构象的能量消耗性转变，以在对于抗体相互作用而言 更可接受的布局呈现抗原。这解释了为什么抗体对天然抗原(整个淀粉状蛋 白肽)的亲和力比对分离的亚单位的亲和力低。

表2

实施例13：抗淀粉状蛋白hC2对淀粉状蛋白β1-42肽聚集的影响

为评估人源化抗人类淀粉状蛋白β单克隆抗体hC2介导对淀粉状蛋 白β(Aβ)的抗聚集和解聚效果的能力，进行了硫代黄素T分光荧光测试法。

13.1聚集抑制测试法

将Aβ1-42冻干粉末在六氟异丙醇(HFIP)中重构至1mM。在室温下超 声处理肽溶液15分钟，搅拌过夜，将等分试样装入未硅化的微型离心管中。 然后在氩气流下蒸发HFIP。将得到的肽薄片真空干燥10分钟并储藏于-80 ℃，直到使用。

为测试抗体介导的对Aβ1-42聚集的抑制，将hC2抗体预稀释于PBS 中，并在未硅化的孵育管中制得含有如下成分的测试溶液：3.3或0.33μM 预稀释的抗体、10μM硫代黄素T、33μM Aβ1-42、和8.2％DMSO。因 此，抗体对Aβ1-42的最终摩尔比是1∶10和1∶100。还制备了合适的对照 溶液。然后将溶液在37℃孵育24小时，并在Perkin-Elmer FluoroCount 分光荧光计上在黑色384孔板(Perkin-Elmer)中以六个重复读出分光荧光 (相对荧光单位；RFU)。然后测量分光荧光并如下计算％解聚。

13.2解聚测试法

为测试抗体介导的预聚集的Aβ1-42的解聚，将如上面描述的那样制备 的低分子量Aβ1-42配制为在27％DMSO和1xPBS中的110μM溶液。 然后使该溶液在37℃聚集24小时，随后加入以下物质：3.3或0.33μM预 稀释的抗体、和10μM硫代黄素T。这导致了抗体对Aβ1-42的1∶10和1∶ 100的摩尔比。然后将该溶液在37℃再温育24小时。然后测量分光荧光并 如下计算％解聚。

13.3计算

根据如下等式将聚集抑制或解聚分别表达为平均％抑制或解聚±平均 值的标准误(SEM)：

％抑制＝{[(阳性对照的RFU-阴性对照的RFU)-(有Aβ1-42的样本 的RFU-没有Aβ1-42的样本的RFU)]/(阳性对照的RFU-阴性对照的 RFU)}×100％

13.4结果

13.4.1  Aβ1-42聚集的抑制

应用hC2抗体的Aβ1-42聚集的抑制如表3和图11所示。当抗体对 Aβ1-42的摩尔比是1∶100时，抑制平均为30％(2次独立实验)，而当摩尔 比是1∶10时，抑制是80％(2次独立实验，参见表3)。

表3：抗体对Aβ1-42的摩尔比是1∶100和1∶10时，hC2介导的Aβ1-42 聚集的抑制

13.4.2预聚集的Aβ1-42的解聚

应用hC2抗体对预聚集的Aβ1-42的解聚如表4和图12所示。当抗体 对Aβ1-42的摩尔比是1∶100时，解聚平均为24％，而当摩尔比是1∶10 时，解聚是32％(3次独立实验，参见表4)。

表4：抗体对Aβ1-42的摩尔比是1∶100和1∶10时，hC2介导的预聚 集Aβ1-42的解聚。

应用硫代黄素T测试法，可以证明抗Aβ人源化抗体hC2的双功能特 性，即抑制Aβ1-42聚集为致病的初原纤维构象(protofibrillar conformation)，并且此外还解聚预形成的Aβ1-42初原纤维(protofibrils)。 当抗体对Aβ1-42的摩尔比是1∶10时，hC2使Aβ1-42聚集抑制了80％。 在1∶10的摩尔比下，显示hC2解聚预聚集的Aβ1-42初原纤维的能力为 32％。

实施例14：mC2与不同类的淀粉状蛋白的构象特异性结合

为了评估mC2对不同阶段聚合的淀粉状蛋白，即对单体、聚合的可溶 淀粉状蛋白以及原纤维淀粉状蛋白的特异性，进行了包被有这些不同阶段 聚合的β淀粉状蛋白的ELISA(图9)。根据修改的(Klein，2002)公开的方法 制备单体，根据(Barghorn等，2005)制备可溶的聚合淀粉状蛋白β，且通 过将淀粉状蛋白(Bachem，瑞士)以在Tris/HCl(pH 7.4)中1μg/μl的终浓度 在37℃孵育5天，随后离心(10,000rpm，5分钟)来制备纤维。然后将淀粉 状蛋白聚合物以55μg/ml的终浓度包被在ELISA板上，并通过使用碱性磷 酸盐标记的抗小鼠IgG单克隆抗体(Jackson)进行结合亲和力ELISA。如表 5显示的那样，mC2抗体与可溶的聚合淀粉状蛋白β的结合亲和力比与纤 维的结合亲和力更高，并且与单体的结合亲和力最低。这些数据表明，抗 体的结合受到淀粉状蛋白表位和不同淀粉状蛋白聚集物的构象的影响。

表5  mC2对淀粉状蛋白单体、寡聚体和纤维的构象特异性结合

实施例15：AC免疫的单克隆抗体hC2的表位作图

通过ELISA使用三种不同的肽文库进行人源化单克隆抗体hC2的表 位作图。一个文库包含总共33个生物素化的覆盖Aβ1-42的完整氨基酸(aa) 序列(由Mimotopes制造，购自ANAWA Trading SA)的肽，第二个文库包 含生物素化的使用来自第一肽文库的肽12(Aβ的第12-20位氨基酸)并用丙 氨酸替代序列中每一个aa的肽(参见下表8)，以及第三个文库包含生物素 化的肽13、14或15(Aβ的第13-21、14-22或15-23位氨基酸)并在每种情 况下将最后的氨基酸替代为丙氨酸或将已经是丙氨酸的第21位氨基酸替 代为甘氨酸(参见下表9)。应用生物素化的完整Aβ1-42肽作为阳性对照 (Bachem)。根据制造商(Mimotopes)的说明进行表位作图。简单的说，将经 链亲和素包被的板(NUNC)在4℃用PBS中的0.1％BSA封闭过夜。用 PBS-0.05％吐温20洗涤后，用来自文库的不同肽在室温下包被板1小时， 肽在PBS中0.1％BSA、0.1％叠氮化纳中稀释至10μM终浓度。洗涤后， 将培养板与hC2抗体或非Aβ结合的嵌合IgG4抗体在室温下孵育1小时， 抗体在PBS中2％BSA、0.1％叠氮化纳中稀释至200ng/ml。再次洗涤板， 并用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG在室温下孵育1小时。在最终洗涤后， 将板与磷酸酶底物(pNPP)孵育并用ELISA板读取器在405nm读数。

显示人源化单克隆抗体hC2特异结合第一个肽文库的肽12、13、14、 15和16。这些肽分别包含Aβ1-42的12-20、13-21、14-22、15-23和16-24， 这提示表位位于Aβ的区域12-24。用丙氨酸替代的第二个文库用于测定结 合Aβ12-20(VHHQKLVFF)的关键氨基酸。当氨基酸16、17、19或20被 丙氨酸替代后，hC2抗体的结合完全丧失，表明这些氨基酸对于抗体与Aβ 的结合是绝对关键的。当第15和18位氨基酸被替代时，hC2抗体的结合 部分丧失。

当第14位氨基酸被替代为丙氨酸时，结合也几乎完全丧失，表明第 14位氨基酸对结合也是非常重要的。

最后，使用第三个文库以测定第21、21或23位氨基酸对表位的结合 是否是关键的。当第23位氨基酸被丙氨酸替代时，抗体与第15-23位氨基 酸的结合降低了，表明第23位氨基酸对结合也是重要的。当第21位氨基 酸被甘氨酸替代时，结合部分丧失，以及当第22位氨基酸被丙氨酸替代时， 结合轻微丧失。

实施例16：通过hC2抗体的神经保护

在体外测试法中评估了抗体hC2保护神经元免于Aβ寡聚体诱导的变 性的能力。分离了胚胎第16.5-17.5天小鼠皮质神经元，使之分开，并在体 外培养于N3-F12培养基中。总共培养细胞九天，在第3天以及在加入Aβ 寡聚体、或Aβ寡聚体及抗Aβ抗体hC2的那一天供给养分。在第5天(“4 天Aβ”)或第6天(“3天Aβ”)，仅用2μM Aβ寡聚体、或用2μM Aβ寡 聚体和50μg/mL抗Aβ抗体hC2的联合处理某些孔的细胞。

通过将Aβ1-42(rPeptide)溶解于HFIP中制备Aβ寡聚体，然后将Aβ 肽从那里分装为1mg/ml的10μl等分试样，并且然后在通风橱中蒸发30 分钟，并将肽薄膜储藏于-80℃，直到使用。使用时，将肽薄膜溶解于10μl DMSO中，然后溶解于78.6μl HAMS F12，然后将Aβ肽溶液在4℃孵育 24-48小时(25μM的Aβ终浓度)。

对于对照细胞，在第5天仅加入和Aβ-DMSO相同体积的DMSO-F12， 并将细胞再培养4天，不做任何其它处理。第9天，固定来自所有培养条 件的神经元，并用Tuj1(抗β-微管蛋白抗体)染色，随后用FITC标记的二 抗染色，以显现微管，并且因此一般地显现神经元进程。结果如图13所示。

培养9天后，未处理的小鼠胚胎皮质神经元显示出正常的形态(图13， 最左图)。用Aβ寡聚体处理细胞3天诱导轴突变性并导致轴突总数量的减 少(图13，较低中图)，并且这一影响在4天的处理后甚至更显著(图13，较 高中图)。相反，用Aβ寡聚体和抗Aβ抗体hC2联合处理的细胞看起来和 对照细胞类似(图13，上和下右图)。这些结果表明抗Aβ抗体hC2能够保 护胚胎小鼠皮质神经元免于Aβ寡聚体诱导的变性。

表6：位置和在人源化C2轻链构架区中进行的改变

  轻链位置   45   87   50   53   小鼠C2VK   K   F   K   N   人源化C2HuVK1   Q   Y   K   N   人源化C2HuVK2   Q   F   K   N   人源化C2HuVK3   K   Y   K   N   人源化C2HuVK4   K   F   K   N   人类种系dpk15   Q   Y   L   N   小鼠C2VK-R   R   小鼠C2VK-S   S

表7：位置和在人源化C2重链构架区中进行的改变

  重链位置   47   94   小鼠C2VHAF   L   S   人源化C2HuVHAF1   W   R   人源化C2HuVHAF2   W   S   人源化C2HuVHAF3   L   R   人源化C2HuVHAF4   L   S   人类种系DP-54   W   R

用轻链人源化C2HuVK1、C2HuVK2、C2HuVK3、C2HuVK4以及重链 C2HuVHAF4和C2HuVHAF2构建了总共8种不同的抗体。

表8：第二个文库所用肽的概述

用斜体和下划线标记了对于结合重要的氨基酸，并且用斜体和粗体标 记了对结合绝对关键的氨基酸。

表9：第三个文库所用肽的概述

用斜体和下划线标记了对于结合重要的氨基酸，并且用斜体和粗体标 记了对结合绝对关键的氨基酸。

实施例17：在蛋白质印迹和斑点印迹中AC免疫的单克隆抗体 mACI-01-Ab7C2与淀粉状蛋白种类的结合

为了确定小鼠抗体mACI-01-Ab7C2的结合是否取决于Aβ的天然构 象，进行了通过蛋白质印迹的结合至线性淀粉状蛋白或在斑点印迹上的结 合至天然淀粉状蛋白的比较(图2a和2b)。

通过在HFIP中溶解Aβ1-42肽并在氩下蒸发溶剂产生淀粉状蛋白单 体。将干燥的肽薄膜储存在-80℃直至使用。对于制备单体，将肽薄膜重悬 于DMSO中至浓度2.75μg/μl，并在PBS中稀释至1μg/μl。对于制备寡聚 体，将干燥的肽薄膜重悬于DMSO中至5mM，超声处理并添加PBS达到 400μM淀粉状蛋白，然后添加SDS至终浓度0.2％。在37℃孵育6小时后， 将淀粉状蛋白于水中稀释至终浓度100μM，并在37℃再孵育18小时。用 冰冷的33％甲醇、4％乙酸溶液在4℃沉淀淀粉状蛋白寡聚体1小时，16200g 旋转10分钟，并将沉淀重悬于5mM Na2H2PO4、35mM NaCl pH 7.4至终 浓度1μg/μl。对于制备纤维，将肽薄膜于Tris-HCl 50mM缓冲液中稀释至 淀粉状蛋白的浓度为1mg/ml，并在37℃孵育5天。将管于10000g旋转5 分钟，并将沉淀重悬于0.1M碳酸盐缓冲液pH 9.6中至1μg/μl。

将1或5μg单体、寡聚体或纤维于PBS和上样缓冲液中稀释，并上样于 12％SDS-PAGE，然后将凝胶转移至硝酸纤维素膜。备选地，将3或1μg或 100和10ng淀粉状蛋白种类于PBS中稀释并直接点在硝酸纤维素膜上，将膜 在室温干燥1小时。用酪蛋白溶液(Vector)封闭30分钟后，将膜用在酪蛋白 溶液中稀释至1μg/ml的mACI-01-Ab7C2或6E10(Chemicon)抗体孵育30分 钟。在酪蛋白溶液中洗3次后，将膜用在酪蛋白溶液中稀释的HRP标记的 山羊抗小鼠IgG(Dako Cytomation)室温孵育30分钟，洗3次并用DAB底物 (Dako Cytomation)显色。

如阳性对照抗体6E10那样，在斑点印迹测试法中，单克隆小鼠抗体 mACI-01-Ab7C2特异地结合单体、寡聚体和纤维。相反，通过蛋白质印迹， mACI-01-Ab7C2抗体不检测线性淀粉状蛋白种类，这与明显识别所有线性 肽的6E10抗体相反。该结果表明mACI-01-Ab7C2与淀粉状蛋白的结合依 赖于淀粉状蛋白的天然构象。

实施例18：mACI-01Ab7C2-Aβ1-42相互作用

使用表面等离子体共振研究了AC免疫的主要抗体mACI-01-Ab7 C2(mC2)与淀粉状蛋白肽Aβ1-42之间的相互作用。测定了小鼠抗体 mACI-01-Ab7C2与Aβ1-42的单体或纤维的结合。

全部SPR实验在Biacore X仪器(Biacore AB)上实施。用于固定的试剂 (EDC、NHS和乙醇胺)、传感器芯片CM5和SA以及运行缓冲液和样本缓冲 液HBS-EP购自Biacore AB。乙酸钠(10mM，pH 5.0)用作偶联缓冲液来增 加偶联产量。通过添加PBS缓冲液至Aβ1-42至终浓度3mg/ml并将小瓶置于 37℃7天而制备纤维状的Aβ1-42(BAchem)。将纤维状的Aβ1-42偶联至含有表 面结合的羧甲基葡聚糖基质的CM5传感器芯片。将生物素化的单体Aβ1- 42(Bachem)偶联至由羧甲基葡聚糖基质与共价连接的链亲和素组成的传感 器芯片SA。通常使用运行缓冲液系列稀释而测试4个或5个浓度的mAb。从 最低浓度开始进行注射，并且以流速30μL/分钟3分钟流过fc 1和2。流通池2 未被衍生化，并且从fc 1减去反应来校正仪器噪声和体折射(bulk refractive)变化。注射结束后，立即用运行缓冲液洗表面5分钟。为了从Aβ1 -42原纤维移去仍结合的抗体，通过注射10mM NaOH脉冲进行表面再生。 使用BIAevaluation 3.0，用针对数值积分和整体分析的算法进行动力学分 析。对于注射不同浓度的分析物获得的曲线进行叠加，并将基线调整为零。 对于曲线拟合，将所有数据同时拟合至1∶1均一复合物。

确定了小鼠mACI-01-Ab7C2抗体与淀粉状蛋白的结合相当强。如表2 中所示，小鼠抗体mACI-01-Ab7C2以平均结合常数(ka)3.8×10-4M/s，解 离常数(kd)1.1×10-3s-1，并因此以所得的平均KD 3.5×10-8M特异地结合 至固定化的Aβ1-42纤维。mACI-01-Ab7C2与Aβ单体的结合相似或稍快， 平均ka为1.6×10-4M/s，但解离较快，KD为2.5×10-7M。

表2

实施例19：mACI-01-Ab7C2单克隆抗体与淀粉状蛋白纤维的结合

为了分析抗体在预形成的纤维上的分子结合侧，进行了负相差透射电 镜术(TEM)(图3a和3b)。

根据文献4和5，将抗体mACI-01-Ab7C2与8nm胶体金偶联。对于淀 粉状蛋白1-42(Aβ1-42)纤维的共孵育，将6.65μM纤维与金标记的抗体以 1∶100的摩尔比室温孵育24小时。接下来，将5μl样本孵育在覆盖有钯/C膜 的新辉光放电Cu栅格(网眼200)上45秒，用水洗3次并用2％新鲜稀释的和过 滤的乙酸双氧铀洗1次。将样本在2％乙酸双氧铀中染色15-20秒。吸取在栅 格上的过量的染料并接下来风干。每一样本制备三个栅格。用透射电镜 Hitachi 7000分析栅格。

单克隆抗体mACI-01-Ab7C2直接结合Aβ1-42纤维。令人感兴趣的是， 抗体显示非对称结合至单纤维的轴，但结合至特定且不是所有的纤维网络 侧支的区域。似乎抗体靶向侧支中的特定区域。可能的解释是仅在该特定 的侧支中存在特定的二级结构。该假设得到NMR数据的支持，显示抗体诱 导构象转换，并因此可能是其结合依赖于包含β折叠结构的淀粉状蛋白纤维 的构象。

实施例20：单克隆抗体mACI-01-Ab7C2的表位绘图

通过ELISA使用三个不同的肽文库进行单克隆抗体mACI-01-Ab7C2 的表位绘图。一个文库包含覆盖Aβ1-42的全部氨基酸(aa)序列的总共33种 生物素化的肽(由Mimotopes生产并购自ANAWA Trading SA)，第二个文 库含有使用来自第一个肽文库的肽12(Aβ的aa12-20)并用丙氨酸替换序列 中的每一氨基酸的生物素化肽(参见下表41)，并且第三个文库含有生物素 化肽13、14或15(Aβ的aa13-21，14-22或15-23)并且在每一情况下替换最后 的氨基酸为丙氨酸，或者对于aa21已是丙氨酸时替换最后的氨基酸为甘氨 酸(参见下表5)。生物素化的完整Aβ1-42肽用作阳性对照(Bachem)。根据生 产商(Mimotopes)的说明书进行表位绘图。简而言之，将链亲和素包被的板 (NUNC)用PBS中的0.1％BSA于4℃封闭过夜。用PBS-0.05％吐温20洗板 后，用来自文库的使用PBS中的0.1％BSA、0.1％叠氮钠稀释至终浓度10μM 的不同肽室温包被板1小时。洗涤后，将板在室温用mACI-01-Ab7C2抗体 或同种型对照小鼠IgG2b抗体室温孵育1小时，其中所述抗体用PBS中的2％ BSA、0.1％叠氮钠稀释至10μg/ml。再次洗板并用缀和有碱性磷酸酶的山 羊抗小鼠IgG室温孵育1小时。在最后的洗涤后，将板与磷酸酶底物(pNPP) 孵育并使用ELISA板读数仪在405nm处读数。

显示了单克隆抗体mACI-01-Ab7C2特异地结合至第一个肽文库的肽 12、13、14和15。这四个肽包含Aβ1-42的aa12-20(VHHQKLVFF)，13-21 (HHQKLVFFA)，14-22(HQKLVFFAE)和15-23(QKLVFFAED)，暗示了 表位位于Aβ的区域12-23。具有丙氨酸替换的第二个文库用于确定结合肽 12-20(VHHQKLVFF)的关键氨基酸。当氨基酸16、17、19或20被丙氨酸替 换后，mACI-01-Ab7C2抗体完全丧失结合，表明这些氨基酸对于抗体结 合至Aβ是绝对关键的。当氨基酸15和18被替换后，mACI-01-Ab7C2抗体 的结合部分丧失。

当氨基酸14被替换为丙氨酸，结合也是几乎完全丧失，表明氨基酸14 对于结合也是非常重要的。

最后，第三个文库用于确定氨基酸21、22或23是否对于结合至表位是 关键的。当氨基酸23被替换为丙氨酸，抗体对于氨基酸15-23的结合降低， 表明氨基酸23对于结合也是重要的。当氨基酸21被替换为甘氨酸时，结合 部分丧失；并且当氨基酸22被替换为丙氨酸时，结合略微丧失。

表4.用在第二个文库中的肽的总结

对于结合重要的氨基酸用斜体和下划线标出，并且对于结合绝对关键 的氨基酸用粗斜体和下划线标出

表5.用在第三个文库中的肽的总结

对于结合重要的氨基酸用斜体和下划线标出，并且对于结合绝对关键 的氨基酸用粗斜体和下划线标出

实施例21：用mACI-01-Ab7C2被动接种单转基因hAPP小鼠对脑淀 粉状蛋白负荷的影响

为了评估mACI-01-Ab7C2单克隆抗体结合和清除可溶的淀粉状蛋白 出脑的体内能力，将性别和年龄匹配的6月龄单hAPP小鼠9用不同剂量进行 被动免疫研究。在研究结束时通过收获动物的脑和进行Aβ1-40和Aβ1-42 特异性ELISA(TGC，德国)来分析可溶的淀粉状蛋白负荷。

每组8-13只动物接受在200μl PBS中的100、300和1000μg单克隆抗体 的两次注射，间隔为一周，而仅注射PBS的动物用作对照。在第二次注射 后一天，处死动物用于可溶的淀粉状蛋白组分的生物化学分析。为了定量 人Aβ1-40和人Aβ1-42在脑匀浆和/或在脑脊液(CSF)的可溶组分中的量， 使用了商业可获得的酶联免疫吸附测试(ELISA)试剂盒(人淀粉状蛋白β40 或β42ELISA高灵敏的，TGC，Switzerland)。按照制造商的方案进行 ELISA。简而言之，在无蛋白结合能力的96孔聚丙烯板(Greiner，德国)中 制备标准品(合成的Aβ1-40或Aβ1-42的稀释物)和样本。标准品稀释至终浓 度1000，500，250，125，62.5，31.3和15.6pg/ml，用ELISA试剂盒中的样 本稀释液制备样本至终体积60μl。由于随着小鼠年龄增加淀粉状蛋白水平 也增加，并且由于实际的评估需要在标准曲线的线性部分读取样本，用于 Aβ40分析的样本2∶3稀释，用于Aβ42分析的样本不稀释。

将样本、标准品和空白(50μl)添加至抗Aβ包被的聚苯乙烯板(捕捉抗体 选择性识别抗原的C-末端)，并添加选择性的抗Aβ抗体缀合物(生物素化的 检测抗体)，4℃孵育过夜，以允许形成抗体-淀粉状蛋白-抗体复合物。第二 天，添加链亲和素-过氧化物酶缀合物，30分钟后添加TMB/过氧化物混合 物，导致底物转化为有色产物，并用带有450nm滤器的ELISA读数仪通过 光度测定法测定颜色强度。通过将吸光度与合成的Aβ1-40或Aβ1-42制备的 标准曲线比较而定量样本的Aβ含量。数据表示为相对于平均对照值的各改 变(相对于对照的百分数)。

以剂量300μg两次腹膜内注射单克隆抗体ACI-01-Ab7C2而被动免疫 单hAPP小鼠时，脑匀浆中Aβ40的总量能够被显著降低，和Aβ42略不显著 (Aβ40：-27.3±13.9％，p＜0.05；Aβ42：-8.6±22.4，p＝0.56；不成对Student T检验)，而100和1000μg没有达到显著性。用100μg免疫导致脑匀浆中Aβ40 和Aβ42增加(Aβ40：32.3±36.8％；Aβ42：38.3±51.4％)，而用1000μg处理 导致淀粉状蛋白负荷降低的正确趋势和每组使用增加数量的动物能够潜在 有效(Aβ40：-2.2±26.0％；Aβ42：-9.3±15.9％)。这些数据表明，在短期免 疫方案(acute immunization protocol)中，抗体mACI-01-Ab7C2能够降 低这种鼠AD模型的脑中的Aβ。有趣的是，剂量关系似乎是瞬变的，而必 须使用较大的组进行更多研究以获得显著性数据。

实施例22：在双转基因hAPPxPS1小鼠中长期被动施用(Chronic Passive Administration)mACI-01-Ab7C2对斑块负荷的影响

为了评估mACI-01-Ab7C2单克隆抗体结合和降低脑中淀粉状蛋白斑 的体内能力，用性别和年龄匹配的3.5月龄双转基因hAPPxPS1小鼠10进行了 4个月长的长期被动免疫研究。在研究结束时通过硫代黄素S结合的动物脑 的组织化学来分析淀粉状蛋白斑。

15只转基因动物接受每周一次注射在PBS中的500μg单克隆抗体，接 受16次。仅注射PBS的15只动物用作对照。所有的注射均是腹膜内给予。 处死时，将小鼠麻醉并用4℃生理血清经心冲洗，以从脑血管去除血液。随 后，将脑从颅内取出，并在冠状缝/额板中切一下分开后脑和前脑。使用中 线矢状切将前脑平均地分为左半球和右半球。

将一个半球在4％多聚甲醛中后固定过夜用于组织学分析。切矢状振 动切片机切面(40μm)用于自由漂浮孵育并贮存在4℃直至在具0.1％叠氮钠 的PBS中染色。用硫代黄素S染色致密斑块的不同水平的五个切片。随机使 用所有动物的切片用于染色和不定样本定量。用配备有Sony DXC-9100P 照相机的Leica DMR显微镜成像并用计算机的Leica Q-Win软件进行分析。 在图像获得过程中保持显微镜光强度和聚光器设置恒定。对所有获得的图 像进行相同的计算机子程序以最小化研究者偏差。在分析中使用一致的密 度分割阈(Density slice thresholding)。选择脑下脚(subiculum)区域用 于自动定量硫代黄素S染色中的淀粉状蛋白负荷。

当双hAPP/PS1小鼠如上所述被动免疫4个月后，在脑下脚区域的总斑 块负荷和斑块数能够被显著降低。对于斑块负荷，能够达到显著降低 31％(mACI-01-Ab7C2：1.11±0.21％和对照：1.61±0.35％；p＝0.003， Mann-Whitney U-检验)，而长期被动免疫显著降低斑块量 19％(mACI-01-Ab7C2：8.73±1.36和对照：10.78±1.36；p＝0.006， Mann-Whitney U-检验)，表明发生斑块溶解的程度稍低于斑块破坏。

实施例23：用mACI-01-Ab7C2被动接种对单转基因hAPP小鼠记忆 能力的影响

为了分析mACI-01-Ab7C2抗体改变或增强认知功能的体内能力，将 性别和年龄匹配的9月龄单hAPP小鼠用于被动免疫研究。在研究结束时通 过新的目标识别任务(Object Recognition Task；ORT)评估来测定非空间 认知。

每组12只动物接受两次腹膜内注射在200μl PBS中的400μg单克隆抗 体，将仅注射PBS的用作对照。在第二次注射后一天，在新的目标识别任 务(ORT)中研究认知能力。对于ORT的记录而言，将小鼠置于一个行为活 动场10分钟并面对新的未知目标。记录探索时间。三小时后将相同的动物 再置于相同的活动场进行第二次研究，但是除了旧的之前探索过的目标之 外，还有新的目标。再次记录对两种目标的探索时间，并将所获得的认知 指数计算为对新的目标的探索时间与总探索时间的比值，并表示为相对于 对照的改变百分率。

用mACI-01-Ab7C2被动接种导致单转基因AD小鼠的认知记忆能力 显著增强(mACI-01-Ab7 C2：131.6±9.1％和对照：100.0±9.2％，p＜0.05； 非成对Student T检验，且每组n＝12)。

参考文献：

Barghorn S，Nimmrich V，Striebinger A，Krantz C，Keller P，Janson B，Bahr M，Schmidt M，Bitner RS，Harlan J，Barlow E，Ebert U，Hillen H (2005)球形淀粉状蛋白β肽寡聚体-在阿尔茨海默病中的同质且稳定的 神经病理蛋白，J Neurochem 95：834-847.

Blond和Goldberg，1987，PNAS，1987年3月1日，卷84|5期| 1147-1151

Cox JPL，Tomlinson IM和Winter G.Eur.J.Immunol.1994；24： 827-836.人类种系Vκ片段的目录揭示它们使用中的强偏差。

Hieter PA，Max EE，Seidman JG，Maizel JV Jr，Leder P.克隆的人类 和小鼠κ免疫球蛋白恒定和J区基因在功能片段中保留同源性，Cell.1980 年11月；22(1Pt1)：197-207.

Kabat EA，Wu TT，Perry HM，Gottesman KS，Foeller C.免疫学感兴 趣的蛋白质序列，美国健康和人类服务部，1991。

Klein WL(2002)在阿尔茨海默病中的Aβ毒性：球形可溶的多聚淀粉 状蛋白β(ADDLs)作为新疫苗和药物靶标.Neurochem Int 41(5)：345-352.

Langdon SD，Inaioki M，Kelsoe G.和Tedder TF.Immunogenetics 2000；51：241-245.C57BL/6小鼠中的V(H)7183基因家族成员的种系序列 显示在近期进化期间特定序列的自然选择。

Mulligan RC和Berg P.Science 1980；209：1422-1427.细菌基因在哺 乳动物细胞中的表达

Riechmann L，Clark M，Waldmann H，Winter G，Nature 1988；332： 323-327.重构人类抗体用于治疗.

Schable KP，Thiebe R，Bensch A，Brensing-Kueppers J，Heim V， Kirschbaum T，Lamm R，Ohnrich M，Pourrajabi S，Roschenthaler F， Schwendinger J，Wichelhaus D，Zocher I和Zachau HG.Eur.J.Immunol. 1999；29：2082-2086.小鼠基因组中的免疫球蛋白Vκ基因、假基因、残余 基因和孤儿基因的特征.

Tomlinson IM，Walter G，Marks JD，Llewelyn MB和Winter G.，J. Mol.Biol.1992；227：776-798.人类种系VH序列库揭示约50组具有不同 高变环的VH片段.

序列表

<110>AC免疫有限公司

<120>针对淀粉状蛋白β的人源化抗体

<130>M1967EP S3

<160>32

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<223>C2HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR1)

<400>1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

1               5                   10

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>小家鼠

<220>

<223>C2HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR2)

<400>2

Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>3

<211>3

<212>PRT

<213>小家鼠

<220>

<223>C2 HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR3)

<400>3

Gly Asp Tyr

1

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>小家鼠

<220>

<223>C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR1)

<400>4

Arg Ser  Ser Gln Ser Leu Val  Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His

1                5                    10                  15

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

<220>

<223>C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR2)

<400>5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<220>

<223>C2HuVK1人源化轻链可变区(CDR3)

<400>6

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1               5

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<220>

<223>Aβ表位，区域2

<400>7

Val Phe Phe Ala Glu Asp

1               5

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>Aβ表位，区域1

<400>8

His Gln Lys Leu Val

<210>9

<211>6

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>9

Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1               5

<210>10

<211>5

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln Lys，或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<400>10

Xaa Xaa Lys Leu Xaa

1               5

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln Lys，或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>11

Xaa Xaa Lys Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1               5                   10

<210>12

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2 HuVK 1可变轻链

<400>12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>13

<211>219

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2轻链

<400>13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

        115                 120                 125

Gln Leu Lys  Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

    130                 135                 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145                 150                 155                 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

                165                 170                 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

            180                 185                 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

      195                 200                 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210                 215

<210>14

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2轻链恒定区

<400>14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1               5                   10                  15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

            20                  25                  30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

        35                  40                  45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

    50                  55                  60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

            100                 105

<210>15

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2 HuVH AF 4可变重链

<400>15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

<210>16

<211>439

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2重链

<400>16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

        115                 120                 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

    130                 135                 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145                 150                 155                 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

                165                 170                 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

            180                 185                 190

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

        195                 200                 205

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

    210                 215                 220

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225                 230                 235                 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

                245                 250                 255

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

            260                 265                 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

        275                 280                 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

    290                 295                 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

305                 310                 315                 320

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

                325                 330                 335

Glu  Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

             340                 345                 350

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro  Ser Asp

        355                 360                 365

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

    370                 375                 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

385                 390                 395                 400

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

                405                 410                 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

            420                 425                 430

Leu  Ser Leu Ser Leu Gly Lys

         435

<210>17

<211>326

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>Igγ-4链C区域-经修饰的

<400>17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

            100                 105                 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

        115                 120                 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValVal Val

    130                 135                 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145                 150                 155                 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

                165                 170                 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

            180                 185                 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

        195                 200                 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

    210                 215                 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225                 230                 235                 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

                245                 250                 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

            260                 265                 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

        275                 280                 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

    290                 295                 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305                 310                 315                 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

                325

<210>18

<211>51

<212>DNA

<213>小家鼠

<220>

<223>C2 HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR2)

<400>18

agcatcaata gtaatggtgg tagcacctat tatccagaca gtgtgaaggg c       51

<210>19

<211>9

<212>DNA

<213>小家鼠

<220>

<223>C2 HuVH AF 4人源化重链可变区(CDR3)

<400>19

ggtgactac                                                      9

<210>20

<211>49

<212>DNA

<213>小家鼠

<220>

<223>C2 HuVK 1人源化轻链可变区(CDR1)

<400>20

agatctagtc agagccttgt atatagtaat ggagacacct atttacatt         49

<210>21

<211>635

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2 Hu VK 1可变轻链

<400>21

atattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggtga gcctgcctcc         60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg    120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240

agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct    300

tggacgttcg gccaaggcac caaggtggaa atcaaa                              336

<210>22

<211>657

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2轻链

<400>22

gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggtga gcctgcctcc    60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg    120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240

agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct    300

tggacgttcg gccaaggcac caaggtggaa atcaaaagga ctgtggctgc accatctgtc    360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg    420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa    480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc    540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa    600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt       657

<210>23

<211>321

<212>DNA

<213>人

<220>

<223>人工的人源化C2轻链恒定区

<400>23

aggactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct    60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag    120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac    180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag    240

aacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag         300

agcttcaaca ggggagagtg  t                                             321

<210>24

<211>798

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2 HuVH AF可变重链

<400>24

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc    60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct    120

ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat    180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac    240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac    300

tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc tcctca                              336

<210>25

<211>1317

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工的人源化C2重链

<400>25

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc    60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct    120

ccaggcaagg gtctcgaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat    180

cagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtac         240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac accgccgtgt attactgtgc aagtggtgac    300

tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc    360

ttccccctgg cgccctgctc cagatcgacc tccgagagca cagccgccct gggctgcctg    420

gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc    480

ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg    540

gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag    600

cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagtccaaat atggtccccc gtgtccccca    660

tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag    720

gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag    780

gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag    840

acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc    900

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc    960

ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg    1020

tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg    1080

gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag    1140

aacaactaca agaccacgcc tcccgtcctc gattccgacg gctccttctt cctctacagc    1200

aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg    1260

catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaa       1317

<210>26

<211>981

<212>DNA

<213>人

<220>

<223>人工的人源化C2重链恒定区

<400>26

gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccagatc gacctccgag    60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg    120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca    180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc    240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc    300

aaatatggtc ccccgtgtcc cccatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc    360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg    420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat    480

gcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac         540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag    600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa    660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag    720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag    780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt cctcgattcc    840

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg    900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc    960

ctctccctgt ctctgggtaa  a                                             981

<210>27

<211>112

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>27

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>28

<211>112

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

<210>29

<211>336

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>29

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc    60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg    120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct    300

tggacgttcg gtggaggcac caagctagaa atcaaa                              336

<210>30

<211>417

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>30

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat    60

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc    120

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtatat agtaatggag acacctattt acattggtac    180

ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct    240

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc    300

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccttgg    360

acgttcggtg gaggcaccaa gctagaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgta       417

<210>31

<211>336

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>31

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc    60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact    120

ccagacaaga ggctggaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat    180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac    240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagtggtgac    300

tactggggcc aaggctccac tctcacagtc tcctca                              336

<210>32

<211>408

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>32

atgrasttsg ggytcagmtt grttttcctt gcccttattt taaaaggtgt ccaatgtgag    60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc    120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca    180

gacaagaggc tggaattggt cgcaagcatc aatagtaatg gtggtagcac ctattatcca    240

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg    300

caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag tggtgactac    360

tggggccaag gctccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacaccc                 408

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>33

His Xaa Lys Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1               5                   10

<210>34

<211>11

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln，Lys或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln，Lys或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>34

Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1               5                   10

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln，Lys或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>35

Xaa Xaa Lys Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1               5                   10

<210>36

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9).(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>36

His Xaa Lys Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1                5                   10

<210>37

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln，Lys或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>37

Xaa Xaa Lys Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Asp

1               5                   10

<210>38

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>38

His Xaa Lys Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Asp

1                5                  10

<210>39

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是His，Asn，Gln，Lys或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是Asn或Gln

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa可以是Lys，His，Asn，Gln或Arg

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，正亮氨酸，Met，Phe，或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>Xaa可以是Ala，Val，Leu，Ser或Ile

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是Glu或Asp

<400>39

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Phe Phe Xaa Xaa Xaa

1                5                   10

<210>40

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>40

Val His His Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp

1           5                       10

<210>41

<211>219

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>41

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

                85                  90                  95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

        115                 120                 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

    130                 135                 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145                 150                 155                 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

                165                 170                 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

            180                 185                 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

        195                 200                 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

    210                 215

<210>42

<211>448

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

        115                 120                 125

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

    130                 135                 140

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

                165                 170                 175

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

            180                 185                 190

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

        195                 200                 205

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

    210                 215                 220

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser

225                 230                 235                 240

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

                245                 250                 255

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

            260                 265                 270

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

        275                 280                 285

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

    290                 295                 300

Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

305                 310                 315                 320

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

                325                 330                 335

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu

            340                 345                 350

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys

        355                 360                 365

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser

    370                 375                 380

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

385                 390                 395                 400

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser

                405                 410                 415

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly

            420                 425                 430

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

        435                 440                 445

<210>43

<211>15

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ1-15

<400>43

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1               5                   10                  15

<210>44

<211>16

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ1-16

<400>44

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

<210>45

<211>15

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ1-16(A14)

<400>45

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His Gln Lys

1               5                   10                  15

<210>46

<211>14

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ22-35

<400>46

Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met

1               5                   10

<210>47

<211>12

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ29-40

<400>47

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

1               5                   10

<210>48

<211>17

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>抗原性肽Aβ1-17

<400>48

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1               5                   10                  15

Leu