在发现人类免疫缺陷性病毒(HIV)二十年后，迄今为止还没有可利 用的有效的预防性或治疗性疫苗。来自世界卫生组织和联合国艾滋病毒/ 艾滋病项目的最新预测表明，如果按照目前艾滋病的流行趋势，到2010 年将出现4,500万新感染者1。尽管通过抗逆转录病毒治疗在延长HIV感 染者的存活时间和减少母婴HIV传播方面取得了重大进展，但在长期抗 逆转录病毒治疗的情况下出现药物抗性和/或与药物相关的严重副作用的 患者的数目不断增加。因此急需其他的替代治疗策略以保护HIV感染个 体使其免于疾病发展。
在一个大规模的人类III期试验中，一种用以诱发体液免疫以中和 HIV的候选疫苗最近被证明是无效的2。这种保护作用的缺乏与已知的现 有疫苗不能在体内诱发有效的抗HIV中和抗体(Nab)是一致的3。这种 诱发有效的Nab的能力的缺失可能是由感染原的性质决定的。例如，迄 今为止还没有用于慢性感染(例如结核、麻风和丙型肝炎病毒感染)的成 功的预防性疫苗。相反，成功的疫苗可以通过诱导Nab预防急性传染病 (例如脊髓灰质炎、麻疹、白喉、破伤风或天花)，其中Nab也可经胎盘或 经乳汁传递以保护胎儿或新生儿免遭感染。
众所皆知，持久性细胞免疫可潜在地控制处于感染原未被清除的状 态的疾病，例如结核、麻风、乙型或丙型肝炎病毒和HIV慢性感染。在 这点上，已表明强烈的病毒特异性CD4+辅助性T细胞1(Th1)和效应物 (穿孔素+)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答与慢性HIV-1感染个体中病 毒血症的控制和长期不进展有关4-10。此外，在急性感染期或急性感染后 不久采用高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)早期介入可增强HIV-1特 异性CD4+Th1细胞应答11，12。相反，HAART在之后的阶段导致HIV-1 特异性CD4+Th1细胞和CTL应答的降低5，13，14，这表明捕获HIV-1的抗 原呈递细胞(APC)的功能活性(这是诱导免疫应答必需的)随感染进程 逐渐丧失15-18。由此可见，用于诱发HIV特异性持久性细胞免疫应答的 治疗性疫苗在以下两个先决条件下是可行的：1)发现能够诱发强烈、广 泛和持续的保护性细胞免疫的合适的免疫原；和2)通过离体激活的 APC的过继转移(即，替代策略)，或通过所述免疫原与合适的细胞因子 或佐剂同时联用在体内直接激活损伤较小的树突细胞(例如郎格汉斯细 胞)，重建体内损伤的APC的功能。成功的治疗性疫苗的最终目标是持续 地将HIV-1感染患者的病毒载量降低至尽可能低的水平。这将阻止他们 的疾病进展，并因此可以减少对有害的和昂贵的抗逆转录病毒药物的需 求。此外，持续地降低HIV病毒载量可以将该病毒性传播给健康人的风 险降至最小19。
根据免疫原的性质，疫苗诱导的保护性免疫应答可以完全不同。减 毒活疫苗诱发体液和细胞免疫应答，而灭活病毒疫苗和纯化的合成蛋白 质更倾向于诱发体液(抗体)应答。在一个旨在激发免疫系统的细胞免疫 方面的多中心临床试验中，研究人员失望地发现，用含HIV基因的细菌 DNA制备的实验性疫苗免疫的205个志愿者中，只有20％具有显著的 HIV特异性细胞免疫应答(尽管该DNA初始免疫(DNA prime)在小鼠 实验中确实表现良好)20。本申请发明人(以及其他人)最近发现其中保 留了包膜蛋白gp120的构象结构的灭活的全HIV-1(例如在通过 Aldrithiol-2[AT-2]处理病毒的情形)可被树突细胞(DC，最有效的APC) 加工和呈递，用于体外诱导有效的HLA-I限制性CTL应答21，22。几项研 究还证明灭活的全HIV-1体外负载的自体树突细胞的过继转移能够在 hu-PBL-SCID小鼠中诱导保护性抗病毒免疫23，24。本申请发明人先前已证 明在没有任何其他抗病毒治疗的情况下，由灭活的全猿猴免疫缺陷性病 毒(SIV)株mac251(SIVmac251)负载的树突细胞制备的治疗性疫苗对 已感染SIVmac251的中国恒河猴免疫两个月后，可导致显著的病毒抑制 25。综上所述，这些发现表明AT灭活的全病毒可用作有效的疫苗免疫原， 在慢性HIV-1感染人群中诱发保护性HIV-1特异性CTL应答。但是，HIV-1 在全球范围的广泛的变异性表明将GMP级的灭活全病毒制品用作HIV-1 的通用型治疗性疫苗的观念是行不通的。
发明概述
本发明提供一种疫苗，其包含灭活的特定亚型的灭活的全HIV，任 选地还包含佐剂。该疫苗可通过诱导抗用以制备该疫苗的相同HIV亚型 的保护性细胞免疫应答治疗慢性HIV感染个体。
本发明还提供一种药物组合物，其包含疫苗和药学上可接受的载体 的，所述疫苗包含灭活的特定亚型的全HIV。
本发明还提供灭活的特定亚型的全HIV在制备用于治疗慢性HIV感 染个体的药物中的用途。所述药物可通过诱导抗用以制备该疫苗的相同 HIV亚型的保护性细胞免疫应答治疗慢性HIV感染个体。
本发明还提供一种治疗慢性HIV感染个体的方法，包括给个体施用 包含灭活的特定亚型的全HIV的疫苗，任选地还包括施用一种佐剂，以 在该个体中诱导抗用以制备该疫苗的相同HIV亚型的保护性细胞免疫应 答。在一个实施方式中，灭活的HIV被离体负载于抗原呈递免疫细胞 (APC)，然后将其施用给个体。
附图说明
图1显示本发明疫苗的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。
图2显示用AT-2灭活的SIVmac251皮内免疫对慢性SIVmac251感 染的恒河猴的血浆病毒载量的影响。数据表示免疫前后每毫升血浆中SIV RNA拷贝数的几何平均数。P值代表Wilcoxon检验对免疫前、和免疫后 第3或第6个月的配对数据的统计分析。
发明详述
由于HIV基因组经常发生突变，存在两个主要的HIV群(HIV-1和 HIV-2)和许多亚群。群和亚群间的主要区别在于病毒包膜。HIV-1被分 入主要亚群(M)和第十局外亚群(10th outlier subgroup)(O)，其中M亚群 被分为9个亚型(分化单位)，命名为A到J28-29。HIV基因组中出现的遗 传变异是突变、重组、插入和缺失的结果29。
本发明的抗HIV、优选地抗HIV-1亚型(例如亚型A、B、C或E) 的疫苗显示出对亚型匹配的病毒株具有高CTL杀伤活性，但只显示出低 的亚型间杀伤活性。尽管在个别情况中观察到了亚型间杀伤活性，但与 亚型匹配的病毒株相比，在亚型不匹配的病毒株中CTL杀伤效力差异很 大(参见下面实施例1和图1)。因此，本发明提供了由灭活的特定亚型 的全HIV制品制备的抗HIV的亚型特异性治疗性疫苗。本发明的疫苗可 用于治疗慢性HIV感染个体，其中所述疫苗诱导抗用以制备该疫苗的相 同HIV亚型的保护性细胞免疫应答。
本申请所用术语“疫苗”指被施用以产生或者人为增加对特殊疾病 的免疫性的组合物。
优选地，用不是受治疗个体自体的HIV亚型制备疫苗。事实上，发 明人已证明，不是受治疗个体自体的HIV亚型疫苗能够出乎意料地显著 降低所述个体的病毒载量。
根据本发明，可以治疗任何HIV亚型的慢性感染，例如选自M群的 A、B、C或E(和其他)亚型以及HIV-2群和HIV O亚群的HIV病毒的 慢性感染。
在一个实施方式中，本发明的组合物可包含几种灭活的HIV亚型， 例如两种、三种、四种或更多种不同的灭活HIV亚型。
在本申请中，“治疗”慢性HIV感染个体意指预防、减轻或抑制HIV 感染的症状；在施用疫苗后病毒载量(尤其是血浆病毒载量)降低；和/ 或在该个体中诱导抗HIV的CTL应答。当然“治疗”慢性HIV感染个 体并不需要从个体中完全清除HIV。
在本申请中，“慢性HIV感染个体”指可被诊断为被HIV感染的个 体。
在本申请中，“灭活的全HIV”指已灭活的、不再具有感染性的完整 HIV颗粒。
在实施本发明时，可通过本领域技术人员已知的任何合适的技术手 段(例如紫外照射、加热或化学处理(如甲醛、多聚甲醛、propiolactene 或AT-2处理))灭活特定亚型的HIV。
优选地，通过化学处理灭活特定亚型的HIV，更优选用AT-2处理进 行灭活。出乎意料的是，这种AT-2灭活能够维持HIV蛋白的构象结构并 以非自体的HIV诱导切实有效的CTL应答。
亚型特异性的灭活的全病毒免疫原可用于抗原呈递免疫细胞(例如 成熟的或未成熟的树突细胞(DC)或郎格汉斯细胞(LC))的离体负载 (也称“脉冲式处理(pulsing)”)，以制备基于APC的治疗性疫苗；或者 可用于直接皮内注射到体内以使LC在体内负载以产生无细胞疫苗。
在一个实施方式中，可采用本领域中的方法，例如通过将灭活的亚 型特异性HIV直接(优选不用针)递送(例如通过皮内注射器)至患者皮 肤的方式施用本发明的无细胞疫苗。用于皮内施用疫苗的无针装置是本 领域技术人员公知的，包括例如US 6,933,319和国际专利申请WO 2004/101025中所描述的装置，在此通过引用并入本申请。通过皮肤(皮 内施用)进行免疫是特别有益的，因为表皮中含有大量LC。已知LC是 DC的未成熟形式，DC位于最接近皮肤最表层(角质层)的区域。这些 LC代表了一个占皮肤表面积25％的免疫细胞网络26，并在慢性HIV/SIV 感染的早期或无症状期保持功能完整性27。发明人已证明皮内施用本发 明的无细胞疫苗能够显著降低SIV病毒载量。
在另一个实施方式中，可通过本领域中的方法，例如通过将用灭活 的亚型特异性HIV负载的APC直接递送(例如通过皮下注射器)给患者 的方式施用本发明的基于APC的疫苗。
在一个实施方式中，所述方法包括在施用本发明的组合物前，检测 待治疗的患者所感染的HIV亚型的预步骤。可采用本领域公知的方法实 施这种检测，如通过分析所述患者的血液样品中存在的HIV对HIV序列 的特定区域进行基因分型。优选地，在该HIV亚型检测步骤之后，施用 本发明的基于APC的疫苗或无细胞疫苗，所述疫苗包含与感染待治疗的 患者的HIV亚型相同的HIV亚型。
在另一个实施方式中，用灭活的特定亚型的HIV负载的APC治疗个 体。首先用灭活的HIV离体负载APC，然后采用任何合适的技术将负载 的APC施用给患者。优选地，负载的APC通过皮下、皮内或者肌内方 式注射给该个体，优选采用皮下注射。更优选地，通过之前从待治疗的 个体采集PBMC以分离单核细胞(CD14+)而获得APC，然后依次用未 成熟的和成熟的树突细胞中已知的细胞因子进行转化。这些方法是本领 域技术人员公知的，例如实施例1中描述的方法。
与细菌产物不同，灭活的全HIV单用不能有效诱导DC的成熟25， 不能使这些细胞向它们在其中行使免疫刺激功能的引流淋巴结有效迁 移。因此，优选将一类称作佐剂的有效分子与灭活的全HIV组合以激发 最佳的免疫细胞(例如LC)的成熟，从而产生抗HIV-1的有效的细胞免 疫应答。
术语“佐剂”指加入疫苗以增强免疫应答的物质。
合适的佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物胶如 氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油或 碳氢化合物乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚、常规细菌产物(如霍乱毒素、 热不稳定肠毒素、减毒或灭活的BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin)) 和短小棒状杆菌，或BCG衍生蛋白)、生化分子(如TNF-α、IL-1-β、IL-6、 PGE2，或CD40L)、或含CpG基序的寡脱氧核苷酸。适合在疫苗组合物 中使用的材料的例子已公开，例如在Osol，A.，ed.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1980)，第 1324-1341页公开的材料，该文献通过引用以其全文并入本申请。
树突细胞在单核细胞的分化调节中，更尤其是在调节CD4-Th1模式 (profile)相对于CD4-Th2模式的分化中，起关键作用。优选地，本发 明的无细胞疫苗组合物包含能够刺激树突细胞以抑制CD4-Th2模式中 的细胞分化的佐剂，这种模式通常在慢性感染中被诱导；同时还能够 刺激树突细胞以激活CD4-Th1模式中的细胞分化。这种佐剂是本领域 技术人员公知的，其包括细菌产物(例如，一些BCG衍生蛋白，如 Ag85B)或化合物(如具有抗COX活性的化合物，尤其是具有抗COX2 活性的化合物(例如VIOX、CELEBREX或RIBAVERIN))。
本发明的疫苗可配制成用于治疗慢性HIV感染个体的药物组合物 (也称为“药物”)。本发明的药物组合物优选是无菌的且不含致热原，还 包括药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液 (例如生理盐水)、粘度调节剂和其他常规的制备人用药物组合物所使用的 药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、等 渗调节剂、缓冲液和pH调节剂。合适的添加剂包括生理相容性缓冲液(例 如盐酸氨丁三醇等)，螯合剂(例如DTPA、DTPA-双酰胺等)或螯合钙复 合物(例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺等)，或者可选地，添加钙或钠 盐(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙等)。制备本发明的 药物组合物是本领域公知的，例如在Remington′s Pharmaceutical Science， 17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1985)中所有描述的，其 完整公开内容通过引用并入本申请。
一种可以通过细胞免疫应答主动疗法减轻慢性HIV感染个体症状的 典型方案包括施用有效量的上述疫苗组合物，可以单次使用，或者以增 强的或加强免疫(booster)剂量重复使用，治疗周期持续一周至约24个 月。
根据本发明，疫苗组合物的“有效量”是指足以获得所需生物学效 应(在本申请中指抗HIV的细胞或体液免疫应答中的至少一种，优选细 胞免疫应答)的量。当然，有效剂量将取决于受者的年龄、性别、健康状 况和体重，同期治疗的方式，如果还有就是治疗频率以及所需的疗效。 下面提供的有效剂量的范围不是用于限定本发明，而是代表了优选的剂 量范围。但是，最优选的剂量要因个体而定，这是本领域技术能够理解 并确定的。例如，参见以下文献，Berkow(1987)，Goodman(1990)，Avery (1987)，Ebadi，Pharmacology，Little，Brown and Co.，Boston，Mass.(1985)， 和Katsung(1992)，这些文献及其所引用的文献通过引用完整地并入本申 请。
一般来说，用于成人的剂量范围是每剂约106至1014个灭活的全HIV 颗粒，优选108至1012个。无论使用什么剂量，其都应该是如通过已知方 法以及本申请所描述的方法所确定的安全和有效的剂量。
本发明将通过以下限制性的实施例进行阐述。
实施例
实施例1
方法
病毒和细胞样品
通过来自感染HIV-1亚型A(n＝10)、B(n＝10)、C(n＝10)或E(n＝10) 的患者的去除CD8的外周血单个核细胞(PBMC)培养物获得HIV-1株。 然后如文献21中所述，通过AT-2(Sigma，St Louis，Missouri)灭活这些 HIV-1亚型(A、B、C或E)株，文献21通过引用以其整体并入本申请。 在GMP条件下采用标准的7天培养25从每位患者制备衍生自单核细胞的 DC。简而言之，在存在0.5％临床用人血清白蛋白(LFB，Les Ulis，France) 的条件下，以106个细胞/cm2的密度将新采集的PBMC进行塑料粘附。 在5％CO2、37℃的条件下温育2小时后，用无菌PBS缓冲液漂洗掉未粘 附的细胞。然后，在含有添加了2000U/ml GM-CSF(Schering-Plough， Brinny，Ireland)和50ng/ml临床级IL-4(CellGenix)的临床级CellGro DC培养基的完全培养基中培养被粘附的细胞5天。在第5天，于37℃ 将DC暴露于AT-2灭活的自体病毒(109个病毒颗粒/ml)2小时。洗涤两 次除去未结合的灭活病毒后，将细胞在添加了临床级细胞因子IL-1β(10 ng/ml)(CellGenix)、IL-6(100ng/ml)(CellGenix)和TNF-α(50ng/ml) (CellGenix)的完全培养基中再培养2天。在第7天，通过流式细胞仪进 行DC的质量控制(QC)25，该文献通过引用以其整体并入本申请。然后 用上述文献21中所描述的共培养方案，将经QC证明的活DC扩增自体 病毒特异性CTL。
细胞毒性检测
用AT-HIV-1(109/ml)脉冲式处理DC 90min，然后用CFSE (Molecular Probes，PoortGebouw，The Netherlands)(10nM)标记15min， 洗涤两次。未脉冲式处理的DC用CFSE标记作为特异性对照。在存在 CFSE-标记的亚型匹配的或不匹配的AT-2-HIV-1脉冲式处理的树突细胞 (DC)的条件下，将HIV-1亚型株特异性CTL以E∶T比例10∶1置于Micro Tubes-Bulk(Bio-Rad，Hercules，CA)中，于37℃温育4小时。温育结束时， 每管加入10μl碘化丙啶(PI，Sigma)(20μg/ml)。在FACSCalibur(BD Immunocytometry System，San Jose，CA)上分析靶细胞溶解。在扣除未脉 冲式处理DC的非特异性CFSE/PI染色后，通过计算CFSE/PI染色DC 的百分比测定病毒特异性细胞溶解活性。
统计学分析
通过Mann-Whitney检验比较HIV-1亚型匹配的和亚型不匹配的细胞 杀伤活性之间的非配对数据。
结果
本发明的对HIV-1亚型A、B、C或E具有特异性的疫苗在体外对亚 型匹配的病毒株(n＝10)显示出高CTL杀伤活性(28-37％)，但仅观察到 低亚型间杀伤活性(5-17％)(P＜0.001)。尽管在个别情况中观察到了亚型 间杀伤活性，但与亚型匹配的病毒株(标准差/平均值＜20％)(P＜0.001) 相比，在亚型不匹配的病毒株中CTL杀伤效率差异很大(标准差/平均值 ＞50％)(图1)。这些发现表明药用HIV-1亚型特异性治疗性疫苗可通过 GMP级的灭活全病毒制品而制得。
实施例2
鉴定慢性HIV感染个体，并测定感染个体的HIV亚型。在用本发明 的疫苗进行治疗之前先测定每一个体的血浆病毒载量。获得与感染个体 的HIV亚型具有相同亚型的HIV，按照上述实施例1所述的方法进行培 养并用AT-2进行灭活。
通过无针皮内递送方式将灭活HIV亚型施用给一组慢性感染个体， 然后测量血浆病毒载量。可以预期一旦施用本发明的疫苗，所述慢性感 染个体的血浆病毒载量将显著降低。
给另一组慢性感染者施用树突细胞，所述树突细胞按上述实施例1 所述用AT-2灭活的HIV进行负载。给个体施用HIV负载的树突细胞。 可以预期一旦施用负载过的树突细胞，所述慢性感染个体的血浆病毒载 量将显著降低。
实施例3
将40只血浆病毒载量＞1000拷贝/ml的慢性(＞1年)SIVmac251感 染的恒河猴随机分组，或接受自动注射枪(AKRADERMOJET，Pau， France)每月一次皮内注射(背部25cm2)SIVac LA2.1(2.5ml含1010AT-2 灭活的SIVmac251的0.9％NaCl溶液)5个月(100μl/cm2/注射)(n＝20)； 或接受每月一次皮内注射安慰剂(单独的2.5ml的0.9％NaCl溶液)，共 5个月(n＝20)。之后每个月直至第6个月，自基线收集血浆样品，并保 存于-80℃直至使用。最后，通过定量RT-PCR分析(MUPROVAMA)测 定血浆SIV RNA载量。
结果
根据本发明的SIV亚型特异性的无细胞疫苗在第3个月(P＝0.037) 和第6个月(P＝0.013)诱导血液病毒载量降低近30％(图2)。这些发现 表明药用的亚型特异的SIV治疗性疫苗可通过GMP级灭活的全病毒制品 而制得。
实施例4
将140只血浆病毒载量＞1000拷贝/ml的慢性(＞1年)SIVmac251感 染的恒河猴随机分组，或接受自动注射枪(AKRADERMOJET，Pau， France)每月一次皮内注射(背部25cm2)SIVac LA2.1(2.5ml含1010AT-2 灭活的SIVmac251的0.9％NaCl溶液)和不同的佐剂(105UFC减毒或热 灭活BCG、BCG衍生的重组Ag85B)5个月(100μl/cm2/注射)，同时每 天口服或不口服200mg CELEBREX4周(每组n＝20)；或接受每月一 次皮内注射安慰剂(单独的2.5ml的0.9％NaCl溶液)，共5个月(n＝ 20)。之后每个月直至第6个月，自基线收集血浆样品，并保存于-80℃直 至使用。最后，通过定量RT-PCR分析(MUPROVAMA)测定血浆SIV RNA载量。
本申请中的所有参考文献(包括上述列举的文献)通过引用以其整 体并入本申请。从本申请所公开的内容得出的对上述实施方式的多种修 饰对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，在不偏离其精神或本 质特征的条件下，本发明可以还包括其他特定的形式。
参考文献
1.Stover，J.et al.Can we reverse the HIV/AIDS pandemic with an expanded response？Lancet 360，73-7(2002).
2.Cohen，J.HIV/AIDS.Vaccine results lose significance under scrutiny. Science 299，1495(2003).
3.Srivastava，I.K.，Ulmer，J.B.&Barnett，S.W.Neutralizing antibody responses to HIV：role in protective immunity and challenges for vaccine design.Expert Rev Vaccines 3 Suppl 1，S33-52(2004).
4.Rosenberg，E.S.et al.Vigorous HIV-1-specific CD4+T cell responses associated with control of viremia.Science 278，1447-50(1997).
5.Pitcher，C.J.et al.HIV-1-specific CD4+T cells are detectable in most individuals with active HIV-1 infection，but decline with prolonged viral suppression.Nat Med 5，518-25(1999).
6.Zaunders，J.J.et al.Identification of circulating antigen-specific CD4+T lymphocytes with a CCR5+，cytotoxic phenotype in an HIV-1 long-term non-progressor and in CMV infection.Blood(2003).
7.Boaz，M.J.，Waters，A.，Murad，S.，Easterbrook，P.J.&Vyakarnam，A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. J Immunol 169，6376-85(2002).
8.Younes，S.A.et al.HIV-1 viremia prevents the establishment of interleukin 2-producing HIV-specific memory CD4+T cells endowed with proliferative capacity.J Exp Med 198，1909-22(2003).
9.Harari，A.，Petitpierre，S.，Vallelian，F.&Pantaleo，G.Skewed representation of functionally distinct populations of virus-specific CD4 T cells in HIV-1-infected subjects with progressive disease：changes after antiretroviral therapy.Blood 103，966-72(2004).
10.Hess，C.et al.HIV-1 specific CD8+T cells with an effector phenotype and control of viral redlication.Lancet 363，863-6(2004).
11.Malhotra，U.et al.Effect of combination antiretroviral therapy on T-cell immunity in acute human immunodeficiency virus type 1 infection.J Infect Dis 181，121-31(2000).
12.Oxenius，A.et al.Early highly active antiretroviral therapy for acute HIV-1 infection preserves immune function of CD8+and CD4+T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA 97，3382-7(2000).
13.Gray，C.M.et al.Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy(HAART). J Immunol 162，1780-8.(1999).
14.Kalams，S.A.et al.Levels of human immunodeficiency virus type 1-specific cytotoxic T-lymphocyte effector and memory responses decline after suppression of viremia with highly active antiretroviral therapy.J Virol 73，6721-8.(1999).
15.McIlroy，D.et al.Low CD83，but normal MHC class II and costimulatory molecule expression，on spleen dendritic cells from HIV+patients.AIDS Res Hum Retroviruses 14，505-13.(1998).
16.Grassi，F.et al.Depletion in blood CDllc-positive dendritic cells from HIV-infected patients.Aids 13，759-66.(1999).
17.Donagby，H.et al.Loss of blood CDllc(+)myeloid and CDllc(-) plasmacytoid dendritic cells in patients with HIV-1 infection correlates with HIV-1RNA virus load.Blood 98，2574-6.(2001).
18.Pacarowski，J.et al.Reduced blood CD123+(lymphoid)and CDllc+ (myeloid)dendritic cell numbers in primary HIV-1 infection.Blood 98， 3016-21.(2001).
19.Quinn，T.C.et al.Viral load and heterosexual transmission of human immunodeficiency virus type 1.Rakai Project Study Group.N Engl J Med 342，921-9(2000).
20.Cohen，J.AIDS vaccines.HIV dodges one-two punch.Science 305， 1545-7(2004).
21.Lu，W.&Andrieu，J.M.In vitro HIV eradication by autologous CD8+T cells expanded with inactivated-virus-pulsed dendritic cells.J Virol 75， 8949-56(2001).
22.Buseyne，F.et al.MHC-I-restricted presentation of HIV-1 virion antigens without viral redlication.Nat Med 7，344-9.(2001).
23.Lapenta，C.et al.Potent immune response against HIV-1 and protection from virus challenge in hu-PBL-SCID mice immunized with inactivated virus-pulsed dendritic cells generated in the presence of IFN-alpha.J Exp Med 198，361-7(2003).
24.Yoshida，A.et al.Induction of protective immune responses against R5 human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)infection in hu-PBL-SCID mice by intrasplenic immunization with HIV-1-pulsed dendritic cells： possible involvement of a novel factor of human CD4(+)T-cell origin.J Virol 77，8719-28(2003).
25.Lu，W.，Wu，X.，Lu，Y.，Guo，W.&Andrieu，J.M.Therapeutic dendritic-cell vaccine for simian AIDS.Nat Med 9，27-32(2003).
26.Yu，R.C.，Abrams，D.C，Alaibac，M.&Chu，A.C.Morphological and quantitative analyses of normal epidermal Langerhans cells using confocal scanning laser microscopy.Br J Dermatol 131，843-8(1994).
27.Zimmer，M.I.et al.Disrupted homeostasis of Langerhans cells and interdigitating dendritic cells in monkeys with AIDS.Blood 99，2859-68. (2002).
28.Hu et al.，JAMA 275：210-216.(1996).
29.Korber et al.，Science 280：1868-1871.(1998).