蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用
阅读：792发布：2020-05-12
专利汇可以提供蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了蛋白酶基因在促进 纤维 素酶生产和复杂氮源利用中的应用。本发明是利用敲除或突变蛋白酶基因部分 碱 基或减弱蛋白酶基因的表达的 微 生物 菌株，提升降解木质 纤维素 或是生产纤维素酶、半纤维素酶能 力 ，所述微生物为毁丝霉、曲霉、木霉、青霉、镰刀霉，所述蛋白酶基因包括MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。同时，通过把这组蛋白酶基因重组过表达，可以帮助重组微生物利用复杂氮源，生长更好，可在产品 发酵 中应用。，下面是蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用专利的具体信息内容。
1.一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，其特征在于，包括步骤：
抑制丝状真菌的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
2.一种蛋白酶、或蛋白酶基因、或其抑制剂的用途，其特征在于，用于：
(a)调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或
(b)调控丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；
(ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；
所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；
(2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥
90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.一种蛋白酶或蛋白酶基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于：
(a)提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或
(b)提高丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
4.一种用于降解纤维素的工程菌，其特征在于，所述工程菌中蛋白酶或蛋白酶基因被下调或被敲除，其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
5.一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，其特征在于，在纤维素原料的存在下，培养权利要求4所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。
6.一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，其特征在于，在木质纤维素原料的存在下，培养权利要求4所述的工程菌，从而降解木质纤维素并获得木质纤维素降解产物。
7.权利要求4所述工程菌的用途，其特征在于，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。
8.一种生产有机酸和/或提高有机酸产量的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在氮源的存在下培养工程菌，所述工程菌的蛋白酶基因和/或蛋白酶被过表达或被上调；
其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；所述的蛋白酶基因包括：(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；
(b)从培养物中分离提纯所述的有机酸。
9.一种蛋白酶或蛋白酶基因的促进剂的用途，其特征在于，用于：
(c)提高微生物利用复杂氮源的能力；和/或
(d)提高微生物的有机酸合成能力；
其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或
所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
10.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌中蛋白酶基因和/或蛋白酶被过表达或被上调，其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 木质纤维素是自然界中一种丰富的可再生资源，主要由碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)和芳香族化合物的聚合物(木质素)组成。木质纤维素的利用需要通过酶解液化和糖化发酵两个基本步骤。其中，酶解过程中所需要的木质纤维素水解酶(纤维素酶、半纤维素酶等)的生产成本过高，已成为制约整个生物炼制产业发展的核心问题。如何高效、廉价的生产这些酶制剂或是如何低成本地将生物质高效地降解为可发酵的单体化合物(葡萄糖、木糖等)、低聚化合物(纤维寡糖、木寡糖等)已成迫切需要解决的问题。
[0003] 在自然界中，多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，特别是子囊菌和担子菌等丝状真菌可以分泌多种木质纤维素水解酶，与其它微生物相比，其具有完整的纤维素酶系。同时，丝状真菌具有强大的蛋白质分泌能力，而且丝状真菌表达的异源蛋白质会经历糖基化和蛋白质折叠等真核翻译后修饰，这些特性使其成为研究纤维素利用，纤维素酶等蛋白质生产中的热点。参与丝状真菌蛋白质表达分泌的基因众多，其中蛋白酶对蛋白质的降解特性是工业酶生产表达中的一个瓶颈，成为工业酶高产的限制因素。目前，丝状真菌作为工业酶生产宿主受到越来越多的关注，因此，建立丝状真菌纤维素酶等蛋白质高效表达系统具有重要意义与价值。
[0004] 另一方面，豆粕等复杂氮源是微生物发酵中常用的氮源，但由于含有复杂蛋白质，而不是简单多肽和氨基酸，很多微生物直接利用豆粕效果不佳，使得豆粕在部分微生物发酵中不能广泛应用，限制了这一廉价氮源使用，从而抬高整个发酵成本。
[0005] 因此，本领域迫切需要建立丝状真菌纤维素酶高效表达系统和复杂氮源利用系统。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：
[0008] 抑制丝状真菌的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性；
[0009] 其中，所述的蛋白酶包括：
[0010] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0011] 所述的蛋白酶基因包括：
[0012] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0013] 在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性。
[0014] 在另一优选例中，所述提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达包括：
[0015] (a)提高纤维素酶和/或半纤维酶的表达；和/或
[0016] (b)减少纤维素酶和/或半纤维酶的降解。
[0017] 在另一优选例中，所述丝状真菌选自下组：曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝霉(Myceliophthora)。
[0018] 在另一优选例中，所述丝状真菌为毁丝霉，较佳地，为嗜热毁丝霉。
[0019] 在另一优选例中，所述的蛋白酶还包括：
[0020] (ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或[0021] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽。
[0022] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因还包括：
[0023] (2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
[0024] (3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0025] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。
[0026] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因选自下组中的一个或多个：MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。
[0027] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因至少包括序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸(MYCTH_2303011)；和/或
[0028] 所述的蛋白酶至少包括序列如SEQ ID NO.:2所示的多肽(MYCTH_2303011)。
[0029] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因至少包括序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸(MYCTH_2308737)；和/或
[0030] 所述的蛋白酶至少包括序列如SEQ ID NO.:4所示的多肽(MYCTH_2308737)。
[0031] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2303011的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，编码序列如SEQ ID NO.:2所示的蛋白。
[0032] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2308737的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，编码序列如SEQ ID NO.:4所示的蛋白。
[0033] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2295424的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示，编码序列如SEQ ID NO.:6所示的蛋白。
[0034] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_111035的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示，编码序列如SEQ ID NO.:8所示的蛋白。
[0035] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2308168的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示，编码序列如SEQ ID NO.:10所示的蛋白。
[0036] 本发明的第二方面，提供了一种蛋白酶、或蛋白酶基因、或其抑制剂的用途，用于：
[0037] (a)调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或[0038] (b)调控丝状真菌的纤维素降解活性；
[0039] 其中，所述的蛋白酶包括：
[0040] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；
[0041] (ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或[0042] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；
[0043] 所述的蛋白酶基因包括：
[0044] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；
[0045] (2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
[0046] (3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0047] 在另一优选例中，所述调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达包括调控纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或降解。
[0048] 在另一优选例中，所述抑制剂为所述蛋白酶或蛋白酶基因的抑制剂。
[0049] 本发明的第三方面，提供了一种蛋白酶或蛋白酶基因的抑制剂的用途，用于：
[0050] (a)提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或[0051] (b)提高丝状真菌的纤维素降解活性；
[0052] 其中，所述的蛋白酶包括：
[0053] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0054] 所述的蛋白酶基因包括：
[0055] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0056] 在另一优选例中，所述的蛋白酶还包括：
[0057] (ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或[0058] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽。
[0059] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因还包括：
[0060] (2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
[0061] (3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0062] 在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制蛋白酶或蛋白酶基因表达、或降低蛋白酶表达量、或降低蛋白酶活性的化合物或制剂。
[0063] 在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性。
[0064] 在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、多肽(如抗体)、小分子配体、或其组合。
[0065] 在另一优选例中，所述的核酸分子选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。
[0066] 在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。
[0067] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因选自下组中的一个或多个：MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。
[0068] 在另一优选例中，所述丝状真菌选自下组：曲霉、木霉、青霉、镰刀霉、毁丝霉、或其组合。
[0069] 在另一优选例中，所述丝状真菌为毁丝霉，较佳地，为嗜热毁丝霉。
[0070] 本发明的第四方面，提供了一种用于降解纤维素的工程菌，所述工程菌中蛋白酶或蛋白酶基因被下调或被敲除，其中，所述的蛋白酶包括：
[0071] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0072] 所述的蛋白酶基因包括：
[0073] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0074] 在另一优选例中，所述的工程菌不表达或基本不表达蛋白酶。
[0075] 在另一优选例中，所述的“基本不表达”指的是与野生型菌株相比，所述工程菌蛋白酶的表达量至少降低了20％，较佳地，至少降低了30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
[0076] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了50-80％，更佳地，至少提高了100-500％。
[0077] 在另一优选例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：曲霉、木霉、青霉、镰刀霉、或毁丝霉；较佳地为毁丝霉，更佳地，为嗜热毁丝霉。
[0078] 本发明的第五方面，提供了一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，在纤维素原料的存在下，培养本发明第四方面所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。
[0079] 在另一优选例中，所述的诱导物即纤维素原料包括：木质纤维素、结晶纤维素、木聚糖、木质纤维素水解物、木寡糖、纤维寡糖、木糖、阿拉伯糖、或其组合。
[0080] 本发明的第六方面，提供了一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，在木质素原料的存在下，培养本发明第四方面所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。
[0081] 本发明的第七方面，提供了本发明第四方面所述工程菌的用途，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。
[0082] 本发明的第八方面，提供了一种生产有机酸和/或提高有机酸产量的方法，包括步骤：
[0083] (a)在氮源的存在下培养工程菌，所述工程菌的蛋白酶基因和/或蛋白酶被过表达或被上调；
[0084] 其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；所述的蛋白酶基因包括：(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；
[0085] (b)从培养物中分离提纯所述的有机酸。
[0086] 在另一优选例中，所述氮源选自下组：无机氮源、复杂氮源、或其组合。
[0087] 在另一优选例中，所述氮源含有复杂氮源，较佳地所述复杂氮源的含量至少为30wt％，较佳地，至少为50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％，按氮源的总重量计。
[0088] 在另一优选例中，所述复杂氮源包括来自动植物或微生物的成分复杂、营养丰高、价格低廉的有机氮源，其成分主要是蛋白质、核酸及其各级降解物。
[0090] 在另一优选例中，所述无机氮源选自下组：尿素、硝酸铵、或其组合。
[0092] 在另一优选例中，所述工程菌为真菌，较佳地为酵母和/或丝状真菌。
[0093] 在另一优选例中，所述酵母选自下组：毕赤酵母、酿酒酵母、克鲁维酵母、汉逊酵母、或其组合。
[0094] 在另一优选例中，所述的工程菌蛋白酶的表达量和/或活性显著提高。
[0095] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌蛋白酶的表达量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
[0096] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌的有机酸产量至少提高了20％，较佳地，至少提高了50-80％，更佳地，至少提高了100-500％。
[0097] 在另一优选例中，所述的蛋白酶还包括：
[0098] (ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或[0099] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽。
[0100] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因还包括：
[0101] (2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
[0102] (3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0103] 本发明的第九方面，提供了一种提高微生物利用复杂氮源和/或有机酸合成的能力的方法，包括步骤：
[0104] 促进微生物的蛋白酶基因和/或蛋白酶的表达和/或活性，从而提高微生物利用复杂氮源和/或有机酸生产的能力；
[0105] 其中，所述的蛋白酶包括：
[0106] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0107] 所述的蛋白酶基因包括：
[0108] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0109] 在另一优选例中，所述促进包括过表达和/或上调所述的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性。
[0110] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：在氮源存在下，促进微生物的蛋白酶基因和/或蛋白酶的表达和/或活性，从而提高微生物利用复杂氮源和/或有机酸合成的能力[0111] 在另一优选例中，所述氮源含有复杂氮源，较佳地所述复杂氮源的含量至少为30wt％，较佳地，至少为50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％，按氮源的总重量计。
[0112] 在另一优选例中，所述复杂氮源选自下组：豆粕、酵母粉、蛋白胨、或其组合。
[0113] 在另一优选例中，所述有机酸包括：苹果酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、柠檬酸、或其组合。
[0114] 在另一优选例中，所述微生物为真菌，较佳地为酵母和/或丝状真菌。
[0115] 在另一优选例中，所述丝状真菌选自下组：曲霉、木霉、青霉、镰刀霉、毁丝霉、或其组合。
[0116] 在另一优选例中，所述丝状真菌为毁丝霉，较佳地，为嗜热毁丝霉。
[0117] 在另一优选例中，所述酵母选自下组：毕赤酵母、酿酒酵母、克鲁维酵母、汉逊酵母、或其组合。
[0118] 在另一优选例中，所述的蛋白酶还包括：
[0119] (ii)将如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或[0120] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽。
[0121] 在另一优选例中，所述的蛋白酶基因还包括：
[0122] (2)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
[0123] (3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0124] 本发明的第十方面，提供了一种蛋白酶、或蛋白酶基因、或其促进剂的用途，用于：
[0125] (c)调控微生物利用复杂氮源的能力；
[0126] (d)调控微生物的有机酸生产能力；
[0127] 其中，所述的蛋白酶包括：
[0128] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0129] 所述的蛋白酶基因包括：
[0130] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0131] 本发明的第十一方面，提供了一种蛋白酶或蛋白酶基因的促进剂的用途，用于：
[0132] (c)提高微生物利用复杂氮源的能力；和/或
[0133] (d)提高微生物的有机酸合成能力；
[0134] 其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或
[0135] 所述的蛋白酶基因包括：
[0136] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0137] 在另一优选例中，所述促进剂包括促进蛋白酶或蛋白酶基因表达、或提高蛋白酶表达量、或增强蛋白酶活性的化合物或制剂。
[0138] 在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、多肽、小分子配体、或其组合。
[0139] 在另一优选例中，所述的核酸分子选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。
[0140] 在另一优选例中，所述蛋白酶基因选自下组中的一个或多个：MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。
[0141] 在另一优选例中，所述微生物为真菌，较佳地为酵母和/或丝状真菌。
[0142] 本发明的第十二方面，提供了一种工程菌，所述工程菌中蛋白酶基因和/或蛋白酶被过表达或被上调，其中，所述的蛋白酶包括：
[0143] (i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或[0144] 所述的蛋白酶基因包括：
[0145] (1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。
[0146] 在另一优选例中，所述的工程菌蛋白酶的表达量和/或活性显著提高。
[0147] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌蛋白酶的表达量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
[0148] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌的有机酸产量至少提高了20％，较佳地，至少提高了50-80％，更佳地，至少提高了100-500％。
[0149] 本发明的第十三方面，提供了本发明第十二方面所述工程菌的用途，用于制备有机酸。
[0150] 本发明的第十四方面，提供了一种菌株组合，所述菌株组合包括：
[0151] (a)第一菌株，所述第一菌株为本发明第四方面所述的工程菌；和
[0152] (b)第二菌株，所述第二菌株为本发明第十二方面所述的工程菌。
[0153] 在另一优选例中，所述第一菌株为丝状真菌，较佳地为毁丝霉、木霉、或其组合。
[0154] 在另一优选例中，所述第二菌株为酵母，较佳地为毕赤酵母、酿酒酵母、或其组合。
[0155] 所述蛋白酶基因包括MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168，敲除或过表达其中的任意蛋白酶，或是突变任意一个蛋白酶基因的部分碱基或蛋白酶的部分氨基酸，或是减弱或提高任意一个或多个蛋白酶的表达。
[0156] 所述蛋白酶基因MYCTH_2303011的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，编码SEQ ID NO.:2所示蛋白；所述蛋白酶基因MYCTH_2308737的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，编码SEQ ID NO.:4所示蛋白；所述蛋白酶基因MYCTH_2295424的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示，编码SEQ ID NO.:6所示蛋白；所述蛋白酶基因MYCTH_111035的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示，编码SEQ ID NO.:8所示蛋白；所述蛋白酶基因MYCTH_2308168的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示，编码SEQ ID NO.:10所示蛋白。
[0157] 具体的，该方法利用以下任一菌株：以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的部分碱基敲除蛋白酶MYCTH_2303011基因的菌株；以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的过表达蛋白酶MYCTH_2303011基因的菌株；以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶MYCTH_2303011基因的菌株；以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的部分碱基敲除蛋白酶MYCTH_2308737基因的菌株；以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的部分碱基敲除蛋白酶MYCTH_2295424基因的菌株；以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的部分碱基敲除蛋白酶MYCTH_111035基因的菌株；以嗜热毁丝霉ATCC 42464为出发菌株构建的部分碱基敲除蛋白酶MYCTH_2308168基因的菌株。
[0158] 本发明提供的提高木质纤维素降解和纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白表达的方法，是以微生物为出发菌株，敲除其中蛋白酶基因而得到。所述微生物为嗜热毁丝霉ATCC 42464。所述敲除基因是针对蛋白酶基因MYCTH_2303011，MYCTH_2308737，MYCTH_2295424，MYCTH_111035和MYCTH_2308168。
[0159] 本发明方法的应用是广泛的，其为高效表达生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白质。其中：
[0160] 生产纤维素酶的方法，是以木质纤维素、结晶纤维素、经过预处理的木质纤维素、纤维寡糖为诱导物，发酵所述的方法得到纤维素酶。
[0161] 生产半纤维素酶的方法，是以木质纤维素、木聚糖、经过预处理的木质纤维素、阿拉伯糖、木寡糖、木糖为诱导物，发酵所述方法得到半纤维素酶。
[0162] 生产其它蛋白的方法，包括将编码蛋白功能片段的基因导入所述受体菌中形成工程菌，再发酵该工程菌生产蛋白的过程。
[0163] 因此，本发明还涉及这些蛋白酶基因在构建功能性工程菌中的应用。该应用是将编码蛋白功能片段的基因导入所述的出发菌株中形成的工程菌。
[0164] 由此形成的高效表达蛋白的工程菌也属于本发明的技术内容。
[0166] 图1显示了蛋白酶缺失突变株在微晶纤维素条件下发酵的蛋白分泌(A)，发酵上清的SDS-PAGE电泳分析图(B)，内切-1,4-β-葡聚糖酶活力(C)，木聚糖酶活力(D)和蛋白酶活力(E)图。
[0167] 图2显示了微晶纤维素条件下发酵上清蛋白分别在4℃(A)和40℃(B)下放置不同时间的SDS-PAGE蛋白电泳分析图。
[0168] 图3显示了表达蛋白酶提升毕赤酵母合成苹果酸。
[0169] 图4显示了过表达proB提高嗜热毁丝霉蛋白酶的酶活。
[0170] 图5显示了提高蛋白酶活力有利于提高嗜热毁丝霉利用复杂氮源合成有机酸。
具体实施方式
[0171] 本发明人经过广泛而深入的研究，从大量的丝状真菌蛋白酶中筛选，首次意外地发现，丝状真菌中存在一系列与纤维素降解调控相关的蛋白酶。实验证明，当这些特定的蛋白酶表达降低或不表达、或蛋白酶活降低时，丝状真菌中的纤维素酶或半纤维素酶的表达量和/或活性会显著上升，从而能够提高菌株对木质纤维素的利用，并增强木质纤维素的降解。
[0172] 本发明还意外地发现，对于工程菌(优选为酵母或丝状真菌)而言，通过过表达或上调本发明特定的蛋白酶或蛋白酶基因，居然可以意外地大幅提高菌株利用复杂氮源和有机酸生产的能力。尤其在仅使用复杂氮源或以复杂氮源为主要氮源的情况下，所述工程菌的有机酸产量显著提高。在此基础上，完成了本发明。
[0173] 术语
[0174] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0175] 如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0176] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
[0177] 嗜热毁丝霉
[0178] 嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)是一种高效的木质纤维素利用菌，能够分泌大量的木质纤维素水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶，而且其分泌的纤维素酶具有耐高温、酶活力高、稳定等多个优点，是一类非常具有开发潜力的利用木质纤维素的产酶体系。此外，在异源蛋白表达方面，嗜热毁丝霉具有表达量大、分泌率高、分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，使其在异源蛋白质表达方面展现出巨大潜力。目前，嗜热毁丝霉已经被成功开发用于表达和生产各种工业酶。然而，根据其基因组数据分析显示，嗜热毁丝霉中有237个肽酶基因，普遍高于其他真菌物种，这些蛋白酶参与纤维素酶表达及分泌的一系列途径，其对纤维素酶的水解特性成为纤维素酶生产表达中的一个瓶颈。
[0179] 蛋白酶
[0180] 如本文所用，术语“蛋白酶”、“本发明蛋白酶”均指本发明所述的蛋白酶，在丝状真菌中属于蛋白酶家族且具有调控(半)纤维素酶表达或活性和利用复杂氮源能力，从而与纤维素降解和复杂氮源利用相关的蛋白或其编码基因。
[0181] 实验证明，当敲除或下调了本发明蛋白酶后，能够有效地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达，并进一步提高丝状真菌对木质纤维素的利用从而加强其降解；当过表达本发明蛋白酶后，能够有效地提高微生物对复杂氮源的利用和有机酸的合成。
[0182] 此外，本发明人还通过实验发现，当单个敲除或多个敲除所述的蛋白酶后，均能够有效地使(半)纤维素酶活性增加，而不影响菌株的正常生长。
[0183] 优选地，本发明蛋白酶指的是在嗜热毁丝霉中的蛋白酶，例如，如SEQ ID NO.:2、4、6、8、或10所示序列的一种或多种。编码这些蛋白酶的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.:1、
3、5、7或9所示。
3、5、7或9所示。
[0184] 同时，本领域技术人员可以根据本发明教导在其他丝状真菌中找到同源性较高且与纤维素降解相关的蛋白酶。
[0185] 纤维素、纤维素酶、半纤维素酶
[0186] 纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，其可以分泌多种纤维素水解酶。
[0187] 纤维素酶是一种多酶体系，由多种组份组成。按底物特异性可将纤维素酶分为以下组分：(1)外切β-1,4-葡萄糖酶(exo-beta-1,4-glucanase，EC.3.2.1.91)简称为外切酶，又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)。纤维二糖水解酶可以水解纤维素结晶区，从纤维素链的非还原端/还原端开始水解并释放纤维二糖。(2)内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-beta-1,4-glucanase，EC3.2.1.74)简称内切酶。纤维素内切酶能够在纤维素多糖链上无定形部分随机切断糖苷键，产生新的糖链末端和长度不一的纤维寡糖。(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(beta-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)简称纤维二糖酶。纤维二糖水解酶水解可溶性的纤维糊精和纤维二糖生成葡萄糖。(4)其它组分，除了以上三大组分外还有纤维二糖脱氢酶、纤维二糖醌氧化还原酶、磷酸化酶、纤维素酶小体等都会参与纤维素降解过程。
[0188] 半纤维素具有与纤维素一样的复杂结构，其降解需要多种半纤维素酶的共同作用。其中主要有两种：β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者从半纤维素主链内部作用于木糖苷键，分解成低聚木糖，后者作用于低聚木糖的末端，释放出单糖。除此之外，降解半纤维素还需要多种侧链裂解酶的共同作用，主要有乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶等。
[0189] 通过敲除本发明蛋白酶基因，可以人为地提高丝状真菌中(半)纤维素酶和/或其他蛋白的表达量和/或活性，从而增加菌株对纤维素(尤其是木质纤维素)的利用和/或强化目的蛋白的生产能力。
[0190] 例如，当获得了本发明的工程菌后，可以通过加入纤维素原料的诱导，对所述的工程菌进行培养。此时，所述的菌株会分泌纤维素酶和半纤维素酶，对其进行分离并提纯后，就可以获得较纯的纤维素酶和半纤维素酶。
[0191] 由于产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中，纤维素原料受其降解，形成降解产物。因此当进一步对培养物进行分离时，就可以获得纤维素的多种降解产物，例如多种单体化合物：葡萄糖、木糖等。
[0192] 复杂氮源
[0193] 氮源是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源的营养物质。复杂氮源常指常指来自动植物或微生物的一类成分复杂、营养丰高、价格低廉的有机氮源，其成分主要是蛋白质、核酸及其各级降解物。例如各种动物肌肉、皮、内脏、乳及其水解物，蚕蛹粉，各种植物浆、粕(如豆粕)及其水解物，以及各种蛋白陈、酵母浸膏等。
[0194] 在另一优选例中，所述复杂氮源指廉价的、成分复杂、难以利用的有机氮源，例如豆粕、豆饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米粉、麸皮、米糠等。
[0195] 工程菌
[0196] 本发明“工程菌”、“突变体”可互换使用，均是指本发明第五方面或第十方面的菌株。
[0197] 具体地，将出发菌株中本发明蛋白酶敲除后获得的具有(增强的)降解纤维素活性的工程菌株。其中，本发明工程菌在改造后，不表达或基本不表达纤维素酶降解相关蛋白酶。
[0198] 本领域技术人员应理解，当获得了蛋白酶的序列后，可以通过多种常规技术使某出发菌株中的蛋白酶的表达下调或沉默。通常，可采用同源重组的方法，采用某标记(或抗性)基因置换出发菌株的原始编码序列。
[0199] 当然，还可以采用能够抑制本发明蛋白酶表达和/或活性的其他基因工程手段或物质对该蛋白进行敲除或下调，从而获得新的转基因工程菌。这一类物质被称为“本发明蛋白酶或其基因的抑制剂”或“本发明抑制剂”。
[0200] 具体地，将出发菌株中本发明蛋白酶过表达后获得的具有(增强的)利用复杂氮源的工程菌株。其中，本发明工程菌在改造后，本发明蛋白酶高表达或酶活提高。
[0201] 本领域技术人员应理解，当获得了蛋白酶的序列后，可以通过多种常规技术使某出发菌株中的蛋白酶的表达或酶活上调。
[0202] 当然，还可以采用能够促进本发明蛋白酶表达和/或活性的其他基因工程手段或物质对该蛋白酶进行过表达或提高酶活，从而获得新的转基因工程菌。这一类物质被称为“本发明蛋白酶或其基因的促进剂”或“本发明促进剂”。
[0203] 菌株组合
[0204] 在本发明中，还提供了一种菌株组合，所述菌株组合包括：
[0205] (a)第一菌株，所述第一菌株为本发明第五方面所述的工程菌；和
[0206] (b)第二菌株，所述第二菌株为本发明第十方面所述的工程菌。
[0207] 本发明的菌株组合既可以利用廉价的纤维素作为碳源，又可以利用廉价的复杂氮源(如豆粕)，产生大量的有机酸和纤维素降解产物。
[0208] 本发明菌株组合可以将廉价的复杂碳源(如纤维素，需要多分泌纤维素酶)和复杂氮源(需要多分泌蛋白酶)更好利用结合起来，提高发酵水平，降低发酵成本。
[0209] 本发明的主要优点包括：
[0210] (1)本发明通过改善丝状真菌纤维素酶表达分泌过程中的降解，增强了丝状真菌对纤维素的利用，提高了生物质降解，从而成为能量利用中的新途径。
[0211] (2)本发明通过提高特定蛋白酶的表达或酶活，显著提高了微生物利用复杂氮源和合成有机酸的能力，从而降低了发酵的成本。
[0212] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0213] 本发明所采用的原始出发菌株嗜热毁丝霉ATCC42464购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)，购买于Centraalbureau voor Schimmelcultures CBS Fungal Biodiversity Centre真菌生物多样性中心，为商业渠道获得。
[0214] 实施例1工程菌的构建
[0215] 可采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对嗜热毁丝霉野生型菌株的蛋白酶基因进行敲除。
[0216] 以蛋白酶基因proB(MYCTH_2303011)为例，构建CRISPR-Cas9介导的嗜热毁丝霉基因组编辑载体。具体方法由Qian Liu et al.2017发明(Liu et al.2017.Development of a genome-editing CRISPR-Cas9system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering.Biotechnol Biofuels(2017)10:1)。
[0217] 1)Cas9表达框载体的构建
[0218] 以p0380-bar为骨架构建表达载体，在密码子优化的Cas9蛋白的N-端和C-端添加核定位序列NLS，利用嗜热毁丝霉内源翻译延伸因子启动子Ptef1进行转录表达，同时选用构巢曲霉TtrpC为终止子，构建Cas9表达框载体p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC。引物如下所示:
[0219] Cas9-F(SEQ ID NO.:11):
[0220] GCCAGTTTCGTTCTTCAGAAAGCTTATGGACTACAAGGACCATGATGGCG
[0221] Cas9-R(SEQ ID NO.:12):
[0222] TGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCTCATCACTCATCTTCTGTTTTGGCAC
[0223] 2)sgRNA表达框载体的构建
[0224] 参照嗜热毁丝霉的基因组，针对蛋白酶基因ORF核酸序列，根据软件sgRNACas9tool设计蛋白酶基因靶标位点(protospacer)，采用融合PCR的方法将序列U6p启动子、protospacer及sgRNA融合，通过SOE-PCR的扩增形成sgRNA表达质粒U6p-3011-gRNA。引物如下所示:
[0225] U6p2-F(SEQ ID NO.:13)：
[0226] AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA
[0227] gRNA-R(SEQ ID NO.:14)：
[0228] AAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT
[0229] U6p2-3011-R(SEQ ID NO.:15)：
[0230] GCTCTAAAACCTGAACTTGCCGCGGTAGACGAGGAAAGAAAGAAAAGAAGAGGAG
[0231] 3011-gRNA-F(SEQ ID NO.:16)：
[0232] TTCTTTCCTCGTCTACCGCGGCAAGTTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
[0233] 3)供体DNA序列的构建
[0234] 供体DNA序列(donor-3011)片段由左右两条600bp同源片段与带有G418抗性基因neo构成。左右两条600bp同源片段与带有G418抗性neo基因3个PCR片段通过Gibson Assembly的方法连接到由限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切的质粒pCAMBIA-0380。引物如下所示:
[0235] 3011U-5F(SEQ ID NO.:17):
[0236] GCCACCATGTTGGGCCCGGCGCGCCGAATTCACCACAACACACACGCACACACATAG
[0237] 3011U-3R(SEQ ID NO.:18):
[0238] ATGCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGGTGGTCGGCCTTGGAGCGGAGCTTGC
[0239] 3011-418-5F(SEQ ID NO.:19):
[0240] GCAAGCTCCGCTCCAAGGCCGACCACCGACGTTAACTGATATTGAAGGAGCAT
[0241] 3011-418-3R(SEQ ID NO.:20):
[0242] TGTCGTAGGTGTAGGTGGTGGAGCCCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT
[0243] 3011D-5F(SEQ ID NO.:21):
[0244] GGCTCCACCACCTACACCTACGACTTGCTTGTTACCTGCACTCGAAGTATGACTCAT
[0245] 3011D-3R(SEQ ID NO.:22):
[0246] GATCTACCATGGTGGACTCCTCTTAAAGCTTATGTTGGAGCCGGGGGCCTGGATATC
[0247] 4)CRISPR-Cas9系统对毁丝霉pr1基因的编辑
[0248] PCR扩增Ptef1-Cas9-TtprC，U6p-3011-gRNA和donor-3011表达框，将它们以1:1:1的分子摩尔比例共转化进入嗜热毁丝霉野生菌株的原生质体细胞后，Cas9在gRNA介导下，通过protospacer与宿主细胞基因组上的目标基因proB的DNA链配对来识别靶标位点进行切割，通过同源重组进行精确修复，在平板中加入G418抗生素进行孵育，培养3-4天后挑选出转化子。扩增引物如下：
[0249] Cas9表达框扩增引物：
[0250] Ptef1-Cas9-TtprC-F(SEQ ID NO.:23):
[0251] TCCTCCGAGGTTCGACATCAG
[0252] Ptef1-Cas9-TtprC-R(SEQ ID NO.:24):
[0253] CGACGTTATCTGATATTGAAGG
[0254] U6p-3011-gRNA表达框扩增引物：
[0255] U6p2-F(SEQ ID NO.:25)：
[0256] AGGATCGGTGGAGTGAAGTTCGGAA
[0257] gRNA-R(SEQ ID NO.:26)：
[0258] AAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT
[0259] donor-3011表达框扩增引物：
[0260] 3011U-5F(SEQ ID NO.:27)：
[0261] GCCACCATGTTGGGCCCGGCGCGCCGAATTCACCACAACACACACGCACACACATAG
[0262] 3011D-3R(SEQ ID NO.:28)：
[0263] GATCTACCATGGTGGACTCCTCTTAAAGCTTATGTTGGAGCCGGGGGCCTGGATATC
[0264] 5)嗜热毁丝霉转化子验证
[0265] 提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物3011-KO-SF和3011-KO-SR对转化子进行目标基因敲除PCR验证。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(110V电压，30分钟)，在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在上游引物3011-KO-SF和下游引物3011-KO-SR引导下经PCR扩增获得了1630bp目的条带，验证正确后保存于-80℃。所需引物如下所示：
[0266] 3011-KO-SF(SEQ ID NO.:29)：
[0267] CCAGGATGATGCGAGATTGA
[0268] 3011-KO-SR(SEQ ID NO.:30)：
[0269] CGAGACATACGGAGTGGCTAGTGT
[0270] 其余工程菌株(△MYCTH_2308737，△MYCTH_2295424，△MYCTH_111035,和△MYCTH_2308168)均根据类似方法获得，所需的引物如表1所示：
[0271] 表1突变体构建所用引物
[0272]
[0273]
[0274] 实施例2蛋白酶缺失突变株的生物学表型分析
[0275] 将PCR验证正确的蛋白酶缺失突变株和嗜热毁丝霉野生型菌株进行生物学表型分析。
[0276] 2.1蛋白酶缺失突变株的蛋白质分泌水平
[0277] 2.1.1方法：
[0278] 1)蛋白酶缺失突变株和嗜热毁丝霉野生型WT以分生孢子终浓度2.5×105个/mL分别在2％微晶纤维素培养基(配方：50×Vogel’s盐2mL，微晶纤维素2g，定容体积到100mL，高压灭菌)中45℃培养3-5d，4℃，13000rpm离心20min，保留上清，测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分析。
[0279] 2)上清蛋白浓度测定：使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测上清中的蛋白浓度。取20μL上清液，加入1mL Bradford蛋白显色溶液(Bio-Rad)，室温下反应5min，在595nm处测定吸光值。标准曲线用小牛血清蛋白作为标准蛋白样绘制。
[0280] 3)上清SDS-PAGE电泳检测：吸取等体积上清液进行4-12％SDS-PAGE电泳检测，恒压200V运行50min。
[0281] 4)蛋白酶缺失突变株对体外蛋白质降解的测定
[0282] 取2％Avicel，45℃，200rpm液体培养4天时野生型和突变株的菌液，4℃，13000rpm离心20min，保留上清，将它们分别放置于4℃和40℃，对放置不同时间后的上清液进行SDD-PAGE蛋白检测。
[0283] 2.1.2结果：
[0284] 蛋白酶基因敲除后，突变株分泌蛋白浓度均较WT高。突变株△MYCTH_2303011，△MYCTH_2308737，△MYCTH_2295424，△MYCTH_111035,和△MYCTH_2308168上清总蛋白分别为野生型菌株的162％、107％、152％、144％和150％。proB蛋白酶基因敲除后，其中突变株△MYCTH_2303011，△MYCTH_2295424，△MYCTH_111035,和△MYCTH_2308168上清液总蛋白增加显著，突变株△MYCTH_2308737的上清液总蛋白量(即纤维素酶等酶的表达量)没有明显变化(图1A)。野生型的菌液上清总蛋白在4℃和40℃均明显降解，在40℃尤为明显(图2)；而突变株的菌液上清的总蛋白降解缓慢，蛋白酶基因缺失导致蛋白质的降解减弱。
[0285] 2.2突变体产纤维素酶实验
[0286] 2.2.1方法：
[0287] (1)酶活测定
[0288] 1)内切-1,4-β-葡聚糖酶活力的测定方法：将粗酶液用0.1M醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.5mL，放入45℃水浴锅内预热，取出，加入0.5mL Megazyme AZO-CM-CELLULOSE底物溶液，混匀，45℃温育10min，用2.5mL沉淀溶液终止反应，室温静置10min，混匀，1000g离心10min，590nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。
[0289] 2)木聚糖酶活力的测定方法：将粗酶液用0.1M醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.5mL，放入45℃水浴锅内预热，取出，加入0.5mL Megazyme AZO-XYLAN底物溶液，混匀，45℃温育10min，用2.5mL沉淀溶液终止反应，室温静置10min，混匀，1000g离心10min，590nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。
[0290] 3)蛋白酶酶活力的测定方法：将粗酶液用50mM，pH 8.5硼酸盐缓冲液稀释适宜的倍数，取50μL加入至透明的微孔板，然后加100μL琥珀酰化酪蛋白底物溶液混匀，37℃孵育微孔板20min，最后用50μL TNBSA工作液终止反应，混匀，室温静置20min，450nm波长下测OD。空白组使用硼酸盐缓冲液代替粗酶液作为对照。
[0291] 4)活性定义：1mL酶液于50℃pH 4.8条件下，每min水解底物产生1μmol产物的酶量定义为1个酶活力单位。
[0292] 2.2.2结果：
[0293] 在2％结晶纤维素条件下培养4天，蛋白酶缺失突变株△MYCTH_2303011，△MYCTH_2308737，△MYCTH_2295424，△MYCTH_111035,和△MYCTH_2308168的培养基上清液中的蛋白表达水平，尤其是纤维素酶表达水平显著提高。其中，内切-1,4-β-葡聚糖酶酶活分别为野生型菌株的162％、124％、146％、141％和132％(图1C)，内切-1,4-β-木聚糖酶酶活分别为野生型菌株的196％、124％、254％、145％和161％(图1D)，蛋白酶活力分别为野生型菌株的4.5％、43％、61％、72％和44％(图1E)。
[0294] 此外，从图1A和图1C-E中可以看出，相比野生型菌株，突变株△MYCTH_2308737的总蛋白量(即纤维素酶等酶的表达量)没有明显变化，而其对应的纤维素酶、木聚糖酶的酶活显著提高，同时蛋白酶的酶活显著下降。结果表明，蛋白酶缺失突变株不仅可以提高纤维素酶等的表达量，还可以提高纤维素酶或半纤维素酶的(单位)活力。
[0295] 实施例3：过表达蛋白酶提升毕赤酵母利用复杂氮源能力，提高化学品合成[0296] 1、pGCWZaA-G418载体构建
[0297] 以Pgcw-BglII和Pgcw-BstBI为引物，以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，扩增获取GCW启动子，经过BglII和BstBI酶切，pGAPZaA经过同样酶切，然后将启动子与载体骨架相连接，转化DH5样，单克隆测序正确，获得pGCWZaA载体，进一步以g418-BamH1-F和g418-BamH1-R为引物，以Ppic9k为模板，PCR扩增获得G418抗性基因，经过BamHI酶切纯化，T4 DNA连接酶连接于pGCWZaA(BamHI酶切)，转化DH5，感受态细胞，涂布于25μg/mL zeocin的LB平板，待长出单克隆进行测序鉴定。
[0298] 所用引物序列如下：
[0299] Pgcw-BglII(SEQ ID NO.:81):
[0300] GGGAGATCTAGATCTCAGGTGAACCCACCTAAC
[0301] Pgcw-BstBI(SEQ ID NO.:82):
[0302] GGGTTCGAATTCGAATTTTGTTGTTGAGTGAAG
[0303] g418-BamH1-F(SEQ ID NO.:83):
[0304] GGGGGATCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGG
[0305] g418-BamH1-R(SEQ ID NO.:84):
[0306] GGGGGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCACC
[0307] 2、蛋白酶ProB(MYCTH_2303011)表达载体构建
[0308] 嗜热毁丝霉ATCC42464孢子接种于含75g/L Avicel,45℃(终浓度为1×106个/mL),150rpm培养1d，液氮研磨后采用Trizol方法提取总RNA，进一步经过RNeasy mini kit纯化去除DNA，进一步通过TOYOBO反转录试剂盒，获取cDNA。以011-EcoRI-F和011-NotI-R为引物，以cDNA为模板PCR扩增获得目的基因片段，然后通过EcoRI和NotI酶切连接于载体pGCWZaA-G418，获得表达载体pGCWZaA-G418-011。
[0309] 所用引物序列如下：
[0310] 011-EcoRI-F(SEQ ID NO.:85):
[0311] GGGGAATTCATGCACTTCTCCACCGCTCTCC
[0312] 011-NotI-R(SEQ ID NO.:86):
[0313] GGGGCGGCCGCCTAGAATAAGAAGAGGTGCAG
[0314] 3、过表达蛋白酶合成苹果酸菌株构建和苹果酸测定
[0315] A感受态细胞制备
[0316] 将保存在-80℃的毕赤酵母产苹果酸菌株272F接菌于装量为30mL的液体YPD培养基，200rpm，30℃培养活化1-2d。
[0317] 将活化好的272F菌株转接于装有30mL液体YPD的培养基，200rpm，30℃培养至OD600＝1.0。
[0318] 3000rpm，4℃离心，收集菌体，用预冷的无菌水洗涤2次。
[0319] 然后用预冷的1M山梨醇洗涤1次，离心收集沉淀。
[0320] 加入约600μL 1M山梨醇重悬菌体，然后以每支80μL分装于预冷的1.5mL离心管，制成毕赤感受态细胞，保存于-80℃备用。
[0321] B质粒转化
[0322] 提取Pgap-ZaA-G418-011质粒，对质粒采用AvrII进行线性化，然后通过电击转化于272F感受态细胞，之后加入1mL预冷1M山梨醇，30℃静置2h，然后涂布于含100μg/mL的YPD平板，待长出菌落后用于苹果酸合成测试。
[0323] C苹果酸合成能力测定
[0324] 苹果酸合成菌株首先用YPD培养基活化48h，然后以初始OD600＝1.0，接种于产苹果酸培养基(100g/L glucose，1.24g/L KNO3，0.64g/L KH2PO4,0.04g/L ZnSO4·7H2O，0.25g/L MgSO4·7H2O,0.0005g/L FeSO4·H2O 16g/L豆饼粉,0.1g/L CaCl2，75g/L CaCO3，0.1g/L Histine)，250mL三角瓶装液量30mL，200rpm，30℃培养，第5天取样1mL，加入1mL 20％(V/V)H2SO4，80℃酸化处理30min，加入一定量的水进行稀释，然后离心，取上清用HPLC Aminex 87H色谱柱进行苹果酸含量测定。HPLC参数条件如下；色谱柱温度35℃，检测器温度40℃，流动相5mM H2SO4，流速0.5mL/min，以苹果酸标品进行定量。
[0325] 结果如图3所示，和272F相比，在以豆粕为氮源条件下，过表达蛋白酶的苹果酸合成菌株(272F-011)能够更有效地利用复杂氮源(如豆粕)，可以合成更多的苹果酸。苹果酸产量从原来的23.6g/L提高到72.6g/L。
[0326] 实施例4、提高蛋白酶分泌能力，促进复杂氮源利用，进而提升嗜热毁丝霉化学品合成
[0327] 1、proB过表达载体的构建
[0328] 以出发菌株嗜热毁丝霉ATCC42464(购自美国模式培养物集存库，American type culture collection)基因组为模板，PCR扩增出磷酸甘油酸激酶编码阅读框(MYCTH_2316240)的启动子(命名为Ppgk启动子)。
[0329] 引物如下所示：
[0330] Ppgk-F(SEQ ID NO.:87):
[0331] AGTTGGCTGACTTGAAGTAATCTCTGCAGATCTTGGCCATCGAGATCCACGAG
[0332] Ppgk-R(SEQ ID NO.:88):
[0333] GCAGGAAGGCCAGGAGAGCGGTGGAGAAGTGCATCTTGGTGATTCTACTGAGCAA
[0334] 从嗜热毁丝霉ATCC42464的cDNA,扩增出蛋白酶编码基因proB(MYCTH_2303011，SEQ ID NO.:1)。
[0335] 引物如下所示：
[0336] ProB-F(SEQ ID NO.:89):
[0337] TTCTGTCGCCAATTGCTCAGTAGAATCACCAAGATGCACTTCTCCACCGCTCTC
[0338] ProB-R(SEQ ID NO.:90):
[0339] GATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCGAATTCTCAGGCAGAGGGGTTGCCGTT
[0340] 利用Gibson连接酶，将Ppgk片段和proB片段，连接入经BglII及EcoRV酶切后线性化载体pAN52-neo，将连接产物用限制性内切酶进行酶切鉴定，得到过表达载体，命名为pAN52-proB
[0341] 引物如下所示：
[0342] 2、将表达载体导入嗜热毁丝霉
[0343] 2.1将嗜热毁丝霉JG207在MM平板[50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s盐(1L)：柠檬酸三钠(1/2H2O)150g，无水KH2PO4 250g，无水NH4NO3 100g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 5g，微量元素盐溶液5mL，生物素(0.1mg/mL)2.5mL，体积定容到1L]。
[0344] 2.2嗜热毁丝霉原生质体转化
[0345] 1)菌丝体准备
[0346] 将成熟的嗜热毁丝霉孢子，用0.05％吐温80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的MM平板，45℃培养14h。
[0347] 2)原生质体制备
[0348] 将带有菌丝的玻璃纸放置于30mL裂解液(配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30mL溶液A，过滤除菌；溶液A:1.0361g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90mL去离子水，氢氧化钾调PH到5.6，定量至100mL，高温灭菌)中，28℃裂解2h，每隔20min轻轻摇动。
[0349] 而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4mL溶液B(0，735g氯化钙，18，22g山梨醇，1mL Tris HCl 1M pH 7.5，溶于90mL去离子水，盐酸调PH到7.6，定量至100mL，高温灭菌)，2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200μL/质粒加入一定体积溶液B。
[0350] 3)原生质体转化
[0351] 预冷的15mL离心管，依次加入50uL预冷PEG(12.5gPEG6000，0，368g氯化钙，500ul Tris HCl 1M pH 7.5。)，10μL用HindIII线性化的质粒，200uL原生质体。放置冰上20min后加入2mL预冷PEG，室温5min，加入4mL溶液B，轻轻混匀。取3mL上述溶液加入12mL融化的含相应抗生素MM培养基中，置于平板中，45℃培养，2d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长，而后用PCR进行验证，转化子命名为JG207ProB。
[0352] 3、嗜热毁丝霉转化子生产苹果酸能力测定
[0353] 将上述验证的转化子接种至250mL三角瓶中的50mL培养基中(葡萄糖75g/L，豆饼粉8.0g/L，0.15g/L KH2PO4，0.15g/L K2HPO4，0.10g/L CaCl2·2H2O，0.10g/L MgSO4·7H2O，碳酸钙80.0g/L，1mL/L 0.5g/L生物素，1ml/L微量元素液；微量元素配方(100mL)：5g C6H8O·7H2O，5g ZnSO4·7H2O，1g Fe(NH4)2(SO4)·6H2O，0.25g CuSO4·5H2O，0.05g MnSO4·H2O，0.05g H3BO3，0.05g NaMoO4·2H2O，溶于水中，定容至100mL)，接种量为2.5×105个/mL，45℃，150rpm培养，第四天取样测定苹果酸含量。
[0354] 1)样品处理：
[0355] 取1mL发酵液于15mL离心管中，并添加1mL 1M H2SO4，而后80℃下放置30min，每隔10min进行充分震荡。之后将2mL双蒸水添加至离心管中，充分震荡后，取1mL液体于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清液测定苹果酸含量。
[0356] 2)苹果酸含量测定
[0357] 处理后的样品用高效液相色谱测定苹果酸含量，其中检测器为紫外检测器，5mM H2SO4为流动相，流速为0.5mL/min。
[0358] 结果表明，以复杂豆饼粉为氮源时，过表达蛋白酶，能显著促进嗜热毁丝霉苹果酸的合成，提高苹果酸的产量。
[0359] 与对照菌株JG207相比，转化子JG207proB的蛋白分泌能力提高43.9％，发酵液中蛋白酶酶活提高11％(图4)。第四天时，转化子JG207proB的苹果酸产量为42g/L，相比对照菌株JG207(35g/L)提高20％(图5)。实验证实过表达蛋白酶基因proB，能够显著提高嗜热真菌嗜热毁丝霉苹果酸生产能力。
[0360] 实施例5不同氮源对苹果酸合成的影响
[0361] 实施例3制备的过表达蛋白酶合成苹果酸菌株272F-011首先用YPD培养基活化48h，然后以初始OD600＝1.0，接种于产苹果酸培养基(100g/L glucose，1.24g/L KNO3，
0.64g/L KH2PO4,0.04g/L ZnSO4·7H2O，0.25g/L MgSO4·7H2O,0.0005g/L FeSO4·H2O,
0.1g/L CaCl2，75g/L CaCO3，0.1g/L Histine,无机氮源分别采用8g/L尿素或8g/L硝酸铵；
有机氮源分别采用16g/L豆粕或8g/L蛋白胨或者8g/L酵母粉)，250mL三角瓶装液量30mL，
200rpm，30℃培养，第5天取样1mL，加入1mL 20％(V/V)H2SO4，80℃酸化处理30min，加入一定量的水进行稀释，然后离心，取上清用HPLC Aminex 87H色谱柱进行苹果酸含量测定。HPLC参数条件如下：色谱柱温度35℃，检测器温度40℃，流动相5mM H2SO4，流速0.5mL/min，以苹果酸标品进行定量。
0.64g/L KH2PO4,0.04g/L ZnSO4·7H2O，0.25g/L MgSO4·7H2O,0.0005g/L FeSO4·H2O,
0.1g/L CaCl2，75g/L CaCO3，0.1g/L Histine,无机氮源分别采用8g/L尿素或8g/L硝酸铵；
有机氮源分别采用16g/L豆粕或8g/L蛋白胨或者8g/L酵母粉)，250mL三角瓶装液量30mL，
200rpm，30℃培养，第5天取样1mL，加入1mL 20％(V/V)H2SO4，80℃酸化处理30min，加入一定量的水进行稀释，然后离心，取上清用HPLC Aminex 87H色谱柱进行苹果酸含量测定。HPLC参数条件如下：色谱柱温度35℃，检测器温度40℃，流动相5mM H2SO4，流速0.5mL/min，以苹果酸标品进行定量。
[0362] 结果表明，本发明过表达蛋白酶合成苹果酸菌株能有效地利用复杂氮源。在氮源的含氮量相同的情况下，过表达蛋白酶合成苹果酸菌株利用复杂氮源(豆粕、蛋白胨、酵母粉)产生的苹果酸的产量明显高于利用无机氮源(尿素、硝酸铵)的苹果酸产量。
[0363] 实施例6多基因敲除的突变体生长活性研究以及酶活性测定
[0364] 利用实施例1的方法、实施例2的测定和分析，构建了如下菌株并对其进行生物学表型分析：
[0365] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308737的菌株为B1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737)；
[0366] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2295424的菌株为B2(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424)；
[0367] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_111035的菌株为B3(MYCTH_2303011×MYCTH_111035)；
[0368] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308168的菌株为B4(MYCTH_2303011×MYCTH_2308168)；
[0369] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为B5(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424)；
[0370] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为B6(MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0371] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为B7(MYCTH_2308737×MYCTH_2308168)；
[0372] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为B8(MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0373] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为B9(MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0374] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱蛋白酶基因MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为B10(MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0375] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为T1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424)；
[0376] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为T2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0377] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为T3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168)；
[0378] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为T4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0379] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为T5(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0380] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为T6(MYCTH_2303011×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0381] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为T7(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0382] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为T8(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0383] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为T9(MYCTH_2308737×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0384] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为T10(MYCTH_2295424×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0385] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为F1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0386] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为F2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0387] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为F3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0388] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为F4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0389] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为F5(MYCTH_2295424×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0390] 以毁丝霉为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为M1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)。
[0391] 培养结果显示，在敲除了多个基因后的突变工程菌株的生长情况与野生菌株相似，并没有出现明显的株系生长障碍。此外，对这些突变工程菌株进行酶活测试显示，经敲除基因后的突变体纤维素酶、半纤维素酶的表达量(或浓度)和活力均高于野生菌株，酶活增长范围至少为30％，部分多基因敲除后的菌株酶活可增长300％。可见，多基因敲除更能够有效地提高纤维素酶和半纤维素酶的活性。
[0392] 实施例7多基因过表达的毁丝霉突变体生长活性研究以及酶活性测定[0393] 利用实施例4的方法，构建了如下菌株并对其进行生物学表型分析：
[0394] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737的菌株为A1(MYCTH_2308737)；
[0395] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424的菌株为A2(MYCTH_2295424)；
[0396] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308168的菌株为A2(MYCTH_2308168)；
[0397] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_111035的菌株为A4(MYCTH_111035)；
[0398] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308737的菌株为C1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737)；
[0399] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2295424的菌株为C2(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424)；
[0400] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_111035的菌株为C3(MYCTH_2303011×MYCTH_111035)；
[0401] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308168的菌株为C4(MYCTH_2303011×MYCTH_2308168)；
[0402] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为C5(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424)；
[0403] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为C6(MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0404] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为C7(MYCTH_2308737×MYCTH_2308168)；
[0405] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为C8(MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0406] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为C9(MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0407] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为C10(MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0408] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为D1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_
2295424)；
2295424)；
[0409] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为D2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0410] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为D3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0411] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为D4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0412] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为D5(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0413] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为D6(MYCTH_2303011×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0414] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为D7(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0415] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为D8(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0416] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为D9(MYCTH_2308737×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0417] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为D10(MYCTH_2295424×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0418] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为E1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0419] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为E2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0420] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为E3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0421] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为E4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0422] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为E5(MYCTH_2295424×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0423] 以毁丝霉为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为G1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)。
[0424] 培养结果显示，在过表达了单个或多个基因后的突变工程菌株的生长情况与野生菌株相似，并没有出现明显的株系生长障碍。此外，对这些突变工程菌株进行测试，方法同实施例4。结果显示，多基因过表达更能够有效地提高微生物利用复杂氮源和有机酸合成的能力。
[0425] 实施例8多基因过表达的毕赤酵母突变体生长活性研究以及酶活性测定[0426] 利用实施例3的方法，构建了如下菌株并对其进行生物学表型分析：
[0427] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737的菌株为H1(MYCTH_2308737)；
[0428] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424的菌株为H2(MYCTH_2295424)；
[0429] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308168的菌株为H3(MYCTH_2308168)；
[0430] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_111035的菌株为H4(MYCTH_111035)；
[0431] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308737的菌株为I1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737)；
[0432] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2295424的菌株为I2(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424)；
[0433] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_111035的菌株为I3(MYCTH_2303011×MYCTH_111035)；
[0434] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2303011和MYCTH_2308168的菌株为I4(MYCTH_2303011×MYCTH_2308168)；
[0435] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为I5(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424)；
[0436] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为I6(MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0437] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为I7(MYCTH_2308737×MYCTH_2308168)；
[0438] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为B8(MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0439] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为I9(MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0440] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达蛋白酶基因MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为I10(MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0441] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2295424的菌株为J1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_
2295424)；
2295424)；
[0442] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_111035的菌株为J2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_111035)；
[0443] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737和MYCTH_2308168的菌株为J3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0444] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为J4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0445] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为J5(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0446] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为J6(MYCTH_2303011×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0447] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为J7(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0448] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为J8(MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_
2308168)；
2308168)；
[0449] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2308737、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为J9(MYCTH_2308737×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0450] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168的菌株为J10(MYCTH_2295424×MYCTH_111035×MYCTH_2308168)；
[0451] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_111035的菌株为K1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_111035)；
[0452] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424和MYCTH_2308168的菌株为K2(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168)；
[0453] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为K3(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0454] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为K4(MYCTH_2303011×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0455] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2295424、MYCTH_2308737、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为K5(MYCTH_2295424×MYCTH_2308737×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)；
[0456] 以毕赤酵母为出发菌株构建的过表达表达蛋白酶基因MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_2308168和MYCTH_111035的菌株为L1(MYCTH_2303011×MYCTH_2308737×MYCTH_2295424×MYCTH_2308168×MYCTH_111035)。
[0457] 培养结果显示，在过表达了单个或多个基因后的突变工程菌株的生长情况与野生菌株相似，并没有出现明显的株系生长障碍。此外，对这些突变工程菌株进行测试，方法同实施例3。结果显示，多基因过表达更能够有效地提高微生物利用复杂氮源和有机酸合成的能力。
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