生物相容性调整细胞培养基组合物及其用途
阅读：1038发布：2020-05-30
专利汇可以提供生物相容性调整细胞培养基组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 部分涉及 生物 相容性 组合物，其包含生物相容性 聚合物 基质和调整细胞培养基，所述调整细胞培养基包括：i)细胞培养基和ii)由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂，及其 治疗 用途 ，特别是在调节骨和/或 牙龈 组织生长方面。，下面是生物相容性调整细胞培养基组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种生物相容性组合物，其包含：
(a) 生物相容性聚合物基质；和
(b) 调整细胞培养基，包括i) 细胞培养基和ii) 由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂。
2.权利要求1的组合物，其中细胞是成纤维细胞。
3.权利要求2的组合物，其中成纤维细胞是真皮成纤维细胞。
4.权利要求3的组合物，其中真皮成纤维细胞为新生儿真皮成纤维细胞。
5.权利要求1的组合物，其中细胞是成骨细胞。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中细胞是成纤维细胞和成骨细胞。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中细胞是成纤维细胞和成骨细胞的共同培养物。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中细胞是活跃增殖的细胞。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中细胞培养基包含基础细胞培养基，并且还包含一种或多种选自胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗坏血酸的补充剂。
10.权利要求9的组合物，其中基础细胞培养基是Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)。
11.权利要求9或10的组合物，其中补充剂是重组生长因子。
12.权利要求11的组合物，其中重组生长因子是人重组生长因子。
13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中一种或多种药剂包括生长因子。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中一种或多种药剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11，和生长分化因子(GDF)，或其组合。
15.权利要求1-14中任一项的组合物，其中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍，和约100倍。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。
17.权利要求1-16中任一项的组合物，其中生物相容性组合物不包含细胞。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中调整细胞培养基被浓缩，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。
19.权利要求1-18中任一项的组合物，其中聚合物基质为琼脂糖。
20.权利要求19的组合物，其中琼脂糖是从海草衍生的。
21.权利要求19或20的组合物，其中琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。
22.权利要求19-21中任一项的组合物，其中琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v和约3.0% w:v。
23.权利要求1-22中任一项的组合物，其中调整细胞培养基是生物相容性组合物体积的约50%。
24.一种生产生物相容性组合物的方法，其包括：
(a) 在细胞培养基中培养细胞；
(b) 将培养细胞与用由细胞培养基中的细胞合成和分泌的一种或多种药剂调整的细胞培养基分离，以产生调整细胞培养基；和
(c) 使调整细胞培养基与生物相容性聚合物基质混合。
25.权利要求24的方法，其中细胞是成纤维细胞。
26.权利要求25的方法，其中成纤维细胞是真皮成纤维细胞。
27.权利要求26的方法，其中真皮成纤维细胞为新生儿真皮成纤维细胞。
28.权利要求25的方法，其中细胞是成骨细胞。
29.权利要求24-28中任一项的方法，其中细胞是成纤维细胞和成骨细胞。
30.权利要求24-29中任一项的方法，其中细胞是成纤维细胞和成骨细胞的共同培养物。
31.权利要求24-30中任一项的方法，其中细胞是活跃增殖的细胞。
32.权利要求24-31中任一项的方法，其中细胞培养基包含基础细胞培养基，并且还包含一种或多种选自胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗坏血酸的补充剂。
33.权利要求32的方法，其中基础细胞培养基是Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)。
34.权利要求32或33的方法，其中补充剂是重组生长因子。
35.权利要求34的方法，其中重组生长因子是人重组生长因子。
36.权利要求24-35中任一项的方法，其中一种或多种药剂包括生长因子。
37.权利要求24-36中任一项的方法，其中一种或多种药剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11，和生长分化因子(GDF)，或其组合。
38.权利要求24-37中任一项的方法，其中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍和约100倍。
39.权利要求24-38中任一项的方法，其中细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。
40.权利要求24-39中任一项的方法，其中生物相容性组合物不包含细胞。
41.权利要求24-40中任一项的方法，其中在调整细胞培养基与生物相容性聚合物基质混合前，浓缩调整细胞培养基，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。
42.权利要求24-41中任一项的方法，其中聚合物基质为琼脂糖。
43.权利要求42的方法，其中琼脂糖是从海草衍生的。
44.权利要求42或43的方法，其中琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。
45.权利要求42-44中任一项的方法，其中琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约
0.9% w:v、约1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约
1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约
2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v和约3.0% w:v。
46.权利要求24-45中任一项的方法，其中调整细胞培养基以生物相容性组合物体积的约50%存在。
47.权利要求1-23中任一项的生物相容性组合物在制备药物制剂中的用途，任选其中药物制剂是局部应用的牙周治疗物。
48.一种在受试者中生长骨或抑制骨吸收的方法，该方法包括将有效量的权利要求1-
23中任一项的生物相容性组合物施用于受试者中需要骨生长和/或骨吸收抑制的部位，任选其中方法在骨生长和/或骨吸收抑制的部位增强新骨生长的总骨整合、垂直骨整合和/或横向骨整合。
49.权利要求48的方法，其中受试者患有骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、骨质疏松和/或溶骨性骨病。
50.一种治疗受试者的牙周病症的方法，该方法包括对受试者中需要a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的牙周部位施用有效量的权利要求1-23中任一项的生物相容性组合物，任选其中方法在牙周部位增强新骨生长的总骨整合、垂直骨整合和/或横向骨整合。
51.权利要求50的方法，其中受试者患有牙周病、牙龈炎症、蛀牙、牙龈病、牙龈炎和/或牙周炎。
52.权利要求48-51中任一项的方法，其中骨量维持或增加，骨密度维持或增加，牙龈组织维持或增加，或其任何组合。
53.权利要求48-52中任一项的方法，其中方法还包括施用给受试者有效量的治疗剂，该治疗剂a) 促进牙龈和/或骨生长和/或b) 抑制牙龈侵蚀和/或骨吸收。
54.权利要求53的方法，其中施用所述生物相容性组合物和施用所述治疗剂是顺序或同时进行的。
55.权利要求53或54的方法，其中所述治疗剂选自骨形态发生因子、抗吸收剂、成骨因子、软骨衍生形态发生蛋白、生长激素、雌激素、双膦酸盐、他汀类、分化因子、镇痛剂、麻醉药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗生素、抗炎药、抗氧化剂、防腐剂、免疫刺激剂，及其组合。
56.权利要求48-55中任一项的方法，其中生物相容性组合物被局部施用于所述部位。
57.权利要求56的方法，其中局部施用选自伤口敷料、手术闭合、吻合术、粘合带、生物粘合剂或牙龈瓣。
58.权利要求48-57中任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。
59.权利要求58的方法，其中哺乳动物是人类、猫、狗、马或啮齿动物。
60.权利要求58的方法，其中哺乳动物是需要牙周a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的疾病的动物模型。
生物相容性调整细胞培养基组合物及其用途
[0002] 本发明的领域是细胞培养、牙周和骨应用以及医学生物技术，特别是生物相容性组合物，其包含注入有培养细胞产生的调整细胞培养基的聚合物基质。包括任何种类的细胞(例如成纤维细胞和成骨细胞)的培养细胞，在细胞培养基中体外生长，且在培养过程中，培养细胞合成并分泌药剂到细胞培养基中。收集含有药剂的细胞培养基，并将其与聚合物基质结合以生成生物相容性组合物和药物制剂。该组合物和制剂可用于再生过程，包括但不限于，再生骨、牙龈或组织；促进骨生长；更新皮肤细胞和组织；刺激伤口愈合；和治疗牙科相关的疾病、紊乱和病症，例如牙周病和牙龈病。
[0003] 发明背景牙周病，范围从牙龈炎到更严重形式的牙周炎，仍然是一个重要的健康问题，并且是美国和全世界成人牙齿脱落的主要原因(E. Reich等人(1993) Comm. Dent. Oral Epidem.
21:379; J. Angelillo等人(1996) Comm. Dent. Oral Epidem. 24:336; H. Murray等人(1997) Int. Dent. J. 47:3-8; R. C Oliver等人(1998) J. Periodontol. 69:269-
278; G. Ong (1998) Int. Dental J. 48:233-238; I. Haddad等人(1999) Dental J.
49:343-346; E. F. Corbet等人(2000) Periodontol. 29:122-152; A. Sheiham等人
(2000) Periodontol. 29:104-121; I. Chestnutt等人(2000) J. Dentist. 28:295-
297; U. M. Irfan等人(2001) J. Int. Acad. Periodontol. 3:14-21)。据估计，不同类型的牙周病影响到美国人口的15-35%，这换算为数以千万计的患者(J. M. Albandar等人(1999) J. Peridontol. 70:13-29)并每年花费数十亿美元。此外，牙周病的所涉问题超出对口腔组织和结构完整性的有害影响，并且代表在包括心血管疾病、妊娠并发症和糖尿病在内的几种全身性病症中增加发病率和死亡率的潜在危险因素(R. C. Page等人(1998) Ann. Periodontol. 3:108-120; R. I. Garcia等人(1998) Ann. Periodontol. 3:339-
349)。
21:379; J. Angelillo等人(1996) Comm. Dent. Oral Epidem. 24:336; H. Murray等人(1997) Int. Dent. J. 47:3-8; R. C Oliver等人(1998) J. Periodontol. 69:269-
278; G. Ong (1998) Int. Dental J. 48:233-238; I. Haddad等人(1999) Dental J.
49:343-346; E. F. Corbet等人(2000) Periodontol. 29:122-152; A. Sheiham等人
(2000) Periodontol. 29:104-121; I. Chestnutt等人(2000) J. Dentist. 28:295-
297; U. M. Irfan等人(2001) J. Int. Acad. Periodontol. 3:14-21)。据估计，不同类型的牙周病影响到美国人口的15-35%，这换算为数以千万计的患者(J. M. Albandar等人(1999) J. Peridontol. 70:13-29)并每年花费数十亿美元。此外，牙周病的所涉问题超出对口腔组织和结构完整性的有害影响，并且代表在包括心血管疾病、妊娠并发症和糖尿病在内的几种全身性病症中增加发病率和死亡率的潜在危险因素(R. C. Page等人(1998) Ann. Periodontol. 3:108-120; R. I. Garcia等人(1998) Ann. Periodontol. 3:339-
349)。
[0004] 牙周炎是一种传染病，其中，牙菌斑的存在会刺激炎症过程，这可导致临床附着体和牙槽骨的丢失。在成人中观察到最常见的牙周病形式，并显示出慢性进展(I. Brook (2003) Gen. Dent. 51:424-428)。牙周病的进展依赖于宿主响应的慢性持续。在口腔中存在的数百种细菌菌种中，仅有少量牵涉到牙周病的病因(S. S. Socransky等人(2002) Periodontal. 28:12-55)。生物膜可含有细菌，例如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福氏拟杆菌(Bacteroides forsythus)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)，其存在与牙周病的临床特征、尤其是探查时的袋深度和出血明显相关(S. S. Socransky等人(1998) J. Clin. Periodontol. 25:134-144)。这些致病生物中的一些可以侵入牙周组织、牙本质小管以及口腔的其它区域。常规的牙周治疗强调，通过使用放置在齿龈缝中的牙科器械以机械地剪切来自牙齿结构的积垢，从根表面机械去除细菌的软和硬的积垢。然而，刮治术(scaling)和牙根平整(root planning)在去除这些积垢方面往往只是部分有效。此外，即使在容易接近的区域的情况下，去除也是短暂的，细菌会重新定植在根表面。
[0005] 当毒性菌开始在牙周区域大量生长时，它们会在牙龈线下释放有毒和致病性产物，这引起炎症反应，并可导致慢性感染。当细菌毒素溶解牙槽骨时，牙龈和骨会一起后退，暴露出齿根。在其它情况下，骨可以后退，但牙龈仍然肿胀，并在已替换丢失的骨的碎屑袋周围形成壁。在这两种情况下，齿根都会暴露在空气或刺激性细菌毒素中，这二者都会导致自发性疼痛或牙齿对冷、热、甜或酸味食物的敏感性。虽然由骨丢失造成的损伤通常是永久性的，但是早期的牙周炎可以用适当的家庭口腔卫生来阻止，从而使牙齿脱落的风险最小化。随着骨丢失的进展，必须进行更积极的治疗以保持牙齿清洁。如果骨丢失持续和牙支持受损，牙齿就会松动，最终会脱落或需要拔出。
[0006] 目前的牙周病治疗主要涉及使用含有抗微生物化合物或各种非甾体抗炎药(NSAID)的组合物。全身抗生素已被用于牙周治疗(R. J. Genco (1981) J. Periodontal.
52:545-558)。然而，全身性递送(如口服或肌内)通常不能在延长的时间段内提供足够浓度的抗生素到齿龈缝区域。在牙周病的晚期病例中，可进行外科干预以消除牙周袋并修整骨的轮廓。松动牙的夹板疗法和牙齿表面的选择性整形以消除创伤性咬合可能是必要的。尽管有这些已知的治疗，仍然需要改进的组合物和方法用于预防和治疗牙周病。特别是，预防和治疗牙周炎相关骨丢失的方法是非常合乎需要的。
52:545-558)。然而，全身性递送(如口服或肌内)通常不能在延长的时间段内提供足够浓度的抗生素到齿龈缝区域。在牙周病的晚期病例中，可进行外科干预以消除牙周袋并修整骨的轮廓。松动牙的夹板疗法和牙齿表面的选择性整形以消除创伤性咬合可能是必要的。尽管有这些已知的治疗，仍然需要改进的组合物和方法用于预防和治疗牙周病。特别是，预防和治疗牙周炎相关骨丢失的方法是非常合乎需要的。
[0007] 发明概述本发明至少部分地基于这样的发现，即调整细胞培养基可与聚合物基质(例如，琼脂
糖)结合，以产生生物相容性组合物和药物制剂，以供再生用途。
糖)结合，以产生生物相容性组合物和药物制剂，以供再生用途。
[0008] 在一个方面，提供了一种生物相容性组合物，其包含(a) 生物相容性聚合物基质和(b) 调整细胞培养基，所述调整细胞培养基包含i) 细胞培养基和ii) 由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂。
[0009] 还提供了许多实施方案，这些实施方案可应用于本发明的任何方面和/或与本文描述的任何其它实施方案相结合。例如，在一个实施方案中，细胞是成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞，且特别是新生儿真皮成纤维细胞。在另一个实施方案中，细胞是成骨细胞。在又一个实施方案中，细胞是成纤维细胞和成骨细胞。在再一个实施方案中，细胞是成纤维细胞和成骨细胞的共同培养物。在另一个实施方案中，细胞是活跃增殖的细胞。在又一个实施方案中，细胞培养基包含基础细胞培养基，并且还包含一种或多种选自胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗坏血酸的补充剂。在再一个实施方案中，基础细胞培养基是Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)。在另一个实施方案中，补充剂是重组生长因子，例如人重组生长因子。在又一个实施方案中，一种或多种药剂包括生长因子。在再一个实施方案中，一种或多种药剂选自血小板衍生生长因子
(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子
(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11和生长分化因子(GDF)，或其组合。在另一个实施方案中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍和约100倍。在又一个实施方案中，细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。在再一个实施方案中，生物相容性组合物不包括细胞。在另一个实施方案中，调整细胞培养基被浓缩，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。在又一个实施方案中，聚合物基质为琼脂糖，例如源自海草的琼脂糖。在再一个实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。在另一个实施方案中，琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约
1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约
1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约
2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v和约3.0% w:v。
在又一个实施方案中，调整细胞培养基是生物相容性组合物体积的约50%。
(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子
(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11和生长分化因子(GDF)，或其组合。在另一个实施方案中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍和约100倍。在又一个实施方案中，细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。在再一个实施方案中，生物相容性组合物不包括细胞。在另一个实施方案中，调整细胞培养基被浓缩，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。在又一个实施方案中，聚合物基质为琼脂糖，例如源自海草的琼脂糖。在再一个实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。在另一个实施方案中，琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约
1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约
1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约
2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v和约3.0% w:v。
在又一个实施方案中，调整细胞培养基是生物相容性组合物体积的约50%。
[0010] 在另一个方面，提供了一种生产生物相容性组合物的方法，其包括(a) 在细胞培养基中培养细胞；(b) 将培养细胞与用由细胞培养基中的细胞合成和分泌的一种或多种药剂调整的细胞培养基分离，以产生调整细胞培养基；和(c) 使调整细胞培养基与生物相容性聚合物基质混合。
[0011] 如上所述，对本文描述的本发明的任何方面都设想了许多实施方案。例如，在一个实施方案中，细胞是成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞，且特别是新生儿真皮成纤维细胞。在另一个实施方案中，细胞是成骨细胞。在又一个实施方案中，细胞是成纤维细胞和成骨细胞。在再一个实施方案中，细胞是成纤维细胞和成骨细胞的共同培养物。在另一个实施方案中，细胞是活跃增殖的细胞。在又一个实施方案中，细胞培养基包含基础细胞培养基，并且还包含一种或多种选自胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、人表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗坏血酸的补充剂。在再一个实施方案中，基础细胞培养基是
Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)。在另一个实施方案中，补充剂是重组生长因子，例如人重组生长因子。在又一个实施方案中，一种或多种药剂包括生长因子。在再一个实施方案中，一种或多种药剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11和生长分化因子(GDF)，或其组合。在另一个实施方案中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍和约100倍。在又一个实施方案中，细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。在再一个实施方案中，生物相容性组合物不包括细胞。
在另一个实施方案中，在调整细胞培养基与生物相容性聚合物基质混合之前，浓缩调整细胞培养基，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。在又一个实施方案中，聚合物基质为琼脂糖，例如衍生自海草的琼脂糖。在再一个实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。在另一个实施方案中，琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v，和约
3.0% w:v。在又一个实施方案中，调整细胞培养基是生物相容性组合物体积的约50%。
Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)。在另一个实施方案中，补充剂是重组生长因子，例如人重组生长因子。在又一个实施方案中，一种或多种药剂包括生长因子。在再一个实施方案中，一种或多种药剂选自血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)、转化生长因子β-1 (TGFβl)、转化生长因子β-2 (TGFβ2)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、白介素-1、白介素-6、白介素-8 (IL-8)、白介素-11和生长分化因子(GDF)，或其组合。在另一个实施方案中，由在细胞培养基中培养的一种或多种细胞合成和分泌的一种或多种药剂以选自以下的浓度存在于调整培养基中：与培养前细胞培养基中的浓度相比，增加到约至少2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、约20倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍和约100倍。在又一个实施方案中，细胞在细胞培养基中培养至少24小时，任选至少48小时或至少72小时。在再一个实施方案中，生物相容性组合物不包括细胞。
在另一个实施方案中，在调整细胞培养基与生物相容性聚合物基质混合之前，浓缩调整细胞培养基，任选其中调整细胞培养基通过切向流过滤来浓缩。在又一个实施方案中，聚合物基质为琼脂糖，例如衍生自海草的琼脂糖。在再一个实施方案中，琼脂糖是低熔点琼脂糖或超低熔点琼脂糖。在另一个实施方案中，琼脂糖选自约0.8%-3.0%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约1.0% w:v、约1.1% w:v、约1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v，和约
3.0% w:v。在又一个实施方案中，调整细胞培养基是生物相容性组合物体积的约50%。
[0012] 在又一个方面，本发明的生物相容性组合物可被用于制备药物制剂，任选其中药物制剂是一种局部应用的牙周治疗物。
[0013] 在又一个方面，提供了一种在受试者中生长骨或抑制骨吸收的方法，该方法包括将有效量的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要骨生长和/或骨吸收抑制的部位，任选其中方法在牙周部位增强新骨生长的总骨整合、垂直骨整合和/或横向骨整合。在一个实施方案中，受试者患有骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、骨质疏松和/或溶骨性骨病。
[0014] 在再一个方面，提供了一种治疗受试者的牙周病症的方法，该方法包括将有效量的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的牙周部位，任选其中方法在牙周部位增强新骨生长的总骨整合、垂直骨整合和/或横向骨整合。
[0015] 如上所述，对本文描述的本发明的任何方面都设想了许多实施方案。例如，在一个实施方案中，受试者患有牙周病、牙龈炎症、蛀牙、牙龈病、牙龈炎和/或牙周炎。在另一个实施方案中，骨量维持或增加，骨密度维持或增加，牙龈组织维持或增加，或其任何组合。在又一个实施方案中，将有效量的a) 促进牙龈和/或骨生长和/或b) 抑制牙龈侵蚀和/或骨吸收的治疗剂施用于受试者。在再一个实施方案中，施用生物相容性组合物和施用治疗剂是顺序或同时进行的。在另一个实施方案中，治疗剂选自骨形态发生因子、抗吸收剂、成骨因子、软骨衍生形态发生蛋白、生长激素、雌激素、双膦酸盐、他汀类、分化因子、镇痛剂、麻醉药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗生素、抗炎药、抗氧化剂、防腐剂、免疫刺激剂，及其组合。在又一个实施方案中，生物相容性组合物被局部施用于所述部位。在再一个实施方案中，局部施用选自伤口敷料、手术闭合、吻合术(stapling)、粘合带、生物粘合剂或牙龈瓣。在另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、猫、狗、马或啮齿动物。在又一个实施方案中，哺乳动物是需要牙周a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的疾病的动物模型。
[0016] 本发明的这些和其它目的、优点和特征在本领域的普通技术人员阅读了下面的详细描述后将变得显而易见。
[0018] 图2显示24小时后的细胞增殖试验。对照培养基对应于DPBS。未调整培养基相当于未调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物。调整培养基相当于成纤维细胞和成骨细胞调整培养基的50:50混合物。
[0019] 图3A和3B显示划痕试验的显微照片。图3A描绘了使用成骨细胞未调整培养基的划痕试验。24 小时生长后，成骨细胞生长至填补大约40%的原始间隙。48 小时生长后，成骨细胞生长至填补大约50%的原始间隙，伴有在相对两侧之间的很少沟通。图3B描绘了使用成骨细胞调整培养基的划痕试验。24 小时生长后，成骨细胞生长至填补大约40%的原始间隙。48 小时生长后，成骨细胞生长至填补大约75% 的原始间隙，伴有来自相对两侧的成骨细胞沟通。
[0020] 图4显示出在24小时时琼脂糖盘对邻近细胞的旁分泌样效应的显微照片。含有调整培养基的琼脂糖盘边缘周围的细胞聚集明显多于对照(PBS)或未调整(未调整培养基)。
[0021] 图5显示治疗8周后骨再生的显微CT断面扫描图像。
[0022] 图6显示治疗8周后骨生长和植入物-骨整合的显微CT断面扫描图像。
[0023] 发明详述本发明提供包含注入有调整细胞培养基的聚合物基质(例如琼脂糖)的生物相容性组
合物，所述调整细胞培养基含有一种或多种由一或多种培养细胞(如成纤维细胞和/或成骨细胞)合成和分泌的培养药剂。所述组合物可用于诱导或促进牙龈生长和/或骨生长的方法，以及减少或预防受试者(如人或动物)骨退化的方法。所述方法主要包括施用给受试者有效量的生物相容性组合物。本发明的方法，其是非手术性、非侵入性和安全的，可用于治疗和/或预防与牙龈和/或骨降解、牙龈和/或骨退化和/或牙龈和/或骨变性相关的疾病状态或病症，包括但不限于牙周病、骨关节炎、转移性骨病和溶骨性骨病。还设想了另外的再生用途，包括但不限于刺激伤口愈合，再生骨、牙龈或组织，以及治疗牙科相关的疾病、紊乱和病症，例如牙周炎、牙龈炎和牙龈病。还提供了包含生物相容性组合物的药物组合物和试剂盒，其可用于执行所述方法。
合物，所述调整细胞培养基含有一种或多种由一或多种培养细胞(如成纤维细胞和/或成骨细胞)合成和分泌的培养药剂。所述组合物可用于诱导或促进牙龈生长和/或骨生长的方法，以及减少或预防受试者(如人或动物)骨退化的方法。所述方法主要包括施用给受试者有效量的生物相容性组合物。本发明的方法，其是非手术性、非侵入性和安全的，可用于治疗和/或预防与牙龈和/或骨降解、牙龈和/或骨退化和/或牙龈和/或骨变性相关的疾病状态或病症，包括但不限于牙周病、骨关节炎、转移性骨病和溶骨性骨病。还设想了另外的再生用途，包括但不限于刺激伤口愈合，再生骨、牙龈或组织，以及治疗牙科相关的疾病、紊乱和病症，例如牙周炎、牙龈炎和牙龈病。还提供了包含生物相容性组合物的药物组合物和试剂盒，其可用于执行所述方法。
[0024] 本文提供的生物相容性组合物为医生提供了一种治疗替代物/辅助物，利用包含大量培养药剂(包含细胞因子和生长因子)的调整细胞培养基，来缩短恢复时间和提高患者与再生过程相关的整体结果。培养药剂(例如从增殖、培养的成纤维细胞和成骨细胞释放的细胞生长因子)的异质组成，为分别刺激参与牙龈再生的成纤维细胞的增殖和分化以及参与骨再生的成骨细胞的增殖/成熟提供了完整的细胞因子和生长因子来源。
[0025] 到目前为止，还不存在当前市场上可得的包含从活跃增殖的成纤维细胞或成骨细胞内源性释放的生长因子的产品。GEM21® (Osteohealth)是市场上一种利用重组PDGF以促进骨生长的产品，但它是一种用作牙科骨填充装置的合成磷酸钙生长因子-增强基质。其它产品，例如Emdogain® (Straumann)，其是一种包含釉质素和成釉蛋白的含蛋白凝胶，能提高成釉细胞活性和牙釉质基质蛋白，以治疗因牙周病引起的骨缺损。
[0026] 这些现有的产品未认识到，再生过程如牙周再生和骨再生为复杂的生物过程。这些生物过程涉及几种生长因子，而这些生长因子在现有产品中是缺乏的，导致并非最优的结果。
[0027] 相比之下，本发明提供了一种生物相容性的组合物，其包含由培养细胞(如成纤维细胞和成骨细胞)内源性释放的生长因子的完全混合物。这背后的理由是为了解决再生过程如牙龈再生和骨再生的复杂性，并且还能够使用一种方式来实现这一点。不受理论的束缚，使用聚合物基质(例如，琼脂糖)作为持续释放生长因子的贮库发挥作用，允许增加对创伤或骨损失的区域的暴露，最终导致细胞增殖的增加。
[0028] I. 定义本文使用冠词“一”和“一个”来指文章语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。例如，“一个要素”指一个要素或多于一个要素。
[0029] 术语“约”一般是指在所叙述物的10%以内、或之间的任何范围内的值，包括所有在内，例如比所述范围小5%到大8%内的范围值，除非另有规定。
[0030] 术语“骨病症”包括希望增加、改善或促进骨量和/或骨密度和/或预防、抑制或减少骨量和/或骨密度的损失的任何病症。术语“骨病症”涵盖增加破骨细胞和/或成骨细胞数、增加破骨细胞和/或成骨细胞活性、增加骨吸收、增加骨髓纤维化或改变骨钙含量的任何病症。
[0031] 术语“骨丢失”指骨骼的质量、物质或基质或骨骼的任何成分(如钙和磷酸盐)减少，或骨或牙齿丢失、损坏或削弱(如其抵抗破裂的能力方面)的任何情况。术语“骨丢失”也涵盖任何以骨退化、骨降解、骨变性、骨量损失、骨密度损失以及这些病症的任何组合为特征的情况。
[0032] 术语“有效量”指本文提供的分子、药剂、因子和/或生物相容性组合物的任何量，其足以满足其预期目的(例如，目的可以是治疗或预防骨丢失，例如与牙周病有关的骨丢失)。
[0033] 术语“局部的(local)”和“局部的(topical)”指化合物或组合物的递送、施用或应用，意在指明该化合物或组合物直接递送、施用或应用于感兴趣的部位(例如，在口腔中用于口腔疾病，如牙周病)用于局部作用。在某些实施方案中，局部(local)或局部(topical)施用在没有任何明显吸收组合物的成分进入受试者的血流的情况下实施。
[0034] 术语“成骨细胞”指分泌用于骨形成的基质的细胞。
[0035] 术语“破骨细胞”指在生长和愈合期间吸收骨组织的大型多核骨细胞。
[0036] 术语“骨引导性(osteoconductive)”指化合物、组合物、过程或材料为成骨细胞从周围组织的向内生长和定向提供环境的能力。
[0037] 术语“成骨性”指化合物、组合物、过程或材料导致(例如，引发、提高、促进、加速、增强、刺激等)骨形成的能力。
[0038] 术语“骨诱导性”指化合物、组合物、过程或材料诱导从前体细胞、特别是间充质干细胞产生成骨细胞的能力。骨诱导性化合物、组合物、过程或材料可以直接起作用(例如，生长因子，其与前体细胞相互作用以诱导成骨细胞分化)或它可以通过诱导骨诱导性生长因子的产生而间接起作用。
[0039] 术语“口腔疾病”与“牙科疾病”可互换使用，并包括异常低或不足水平的口腔骨(如口腔中的骨)所引起或表征的紊乱、疾病或病症。示例性口腔骨包括牙槽骨和基骨。根据本发明通过增加骨量或骨生长可以治疗的口腔疾病，包括但不限于牙周病，牙槽骨丢失，牙龈炎，骨质疏松，骨质减少，口腔骨切除，口腔骨骨折，关节炎，骨关节炎，截骨术骨丢失，儿童特发性骨丢失等。根据本发明可治疗的破坏性口腔骨疾病包括但不限于骨质疏松、骨量减少、骨关节炎和溶骨性病变，如由肿瘤性疾病、放射治疗或化疗引起的那些。本发明还设想了再生其它口腔组织，包括软组织、上皮和结缔组织，如胶原和血管。
[0040] 术语“牙周病”包括围绕和支持牙齿的牙周组织的所有疾病(见例如，D. M. Williams等人, Pathology of Periodontal Disease (1992) Oxford University
Press)。这些包括牙龈、牙骨质、牙周膜、牙槽突骨和牙支持骨。具体来说，牙周病包括牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是炎症局限于牙龈中且在牙齿和牙龈之间的骨中没有发生任何病变的疾病。牙周炎是牙龈炎症达到牙周膜和牙槽骨的疾病。如果不治疗，牙周炎可导致牙齿脱落。牙周病也涵盖影响牙周组织的更多炎性疾病。例如，这类疾病包括牙菌斑引起的牙龈病；慢性牙周炎(以前为成人牙周炎)；侵袭性牙周炎(以前为早发、青春期前、青少年或快速进展性牙周炎)；坏死性牙周病；牙周组织脓肿；和术后细菌感染(特别是由牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)引起、传播和/或加重的那些)。
Press)。这些包括牙龈、牙骨质、牙周膜、牙槽突骨和牙支持骨。具体来说，牙周病包括牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是炎症局限于牙龈中且在牙齿和牙龈之间的骨中没有发生任何病变的疾病。牙周炎是牙龈炎症达到牙周膜和牙槽骨的疾病。如果不治疗，牙周炎可导致牙齿脱落。牙周病也涵盖影响牙周组织的更多炎性疾病。例如，这类疾病包括牙菌斑引起的牙龈病；慢性牙周炎(以前为成人牙周炎)；侵袭性牙周炎(以前为早发、青春期前、青少年或快速进展性牙周炎)；坏死性牙周病；牙周组织脓肿；和术后细菌感染(特别是由牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)引起、传播和/或加重的那些)。
[0041] 术语“受试者”指任何健康的动物、哺乳动物或人类，或任何患有所关注病症(如牙周病)的动物、哺乳动物或人类。术语“受试者”与“患者”或“个体”可互换。它们指的是一种高级脊椎动物，优选人类或其它哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、猪、牛、马等)，它们可以罹患了施用本发明的生物相容性组合物对其有益的疾病状态或病症，但也可能有或可能没有所述疾病状态或病症。在许多实施方案中，受试者罹患或易患(即，表现出高或更高的发展风险)骨病症，例如与骨丢失有关的骨病症。在某些实施方案中，受试者是人类。这些术语并不表示特定的年龄，因此涵盖成人、儿童和新生儿。在其它实施方案中，受试者是所关注疾病(例如骨丢失和/或牙周病)的动物模型。
[0042] 术语“缝合线”指将伤口或手术切口的边缘保持在一起以实现组织修复的缝线或一排缝线。通过缝合愈合包括：通过用在缝合线端部之一连接的金属针在组织中引入缝合线，使针依次穿过切口两侧，来把伤口的边缘集合在一起，从而被动地促进伤口的闭合。缝合线也被用于外科手术以停止出血(止血)和修复人体的器官和其它结构。在某些情况下，由于应用的组织的愈合困难，这些缝合线特别精细。这是用于结肠壁、肌腱以及涉及神经组织和血管的显微手术中的缝合线的情况。
[0043] 本文使用术语“治疗”来表征旨在如下的过程/方法：(1) 延缓或预防疾病状态或病症的发生；(2) 减缓或停止临床病症症状的进展、加重或恶化，(3) 带来病症症状的改善；和/或(4) 治愈病症。为了预防作用，治疗可以在病症发生前施用，或者为了治疗作用，它可以在病症起病后施用。
[0044] 本文使用的术语“伤口”指诸如擦伤、烧伤、皲裂、磨损、切割、糖尿病小腿溃疡、撕裂、深切、器官移植、子弹伤、切口、小腿溃疡、褥疮溃疡、烧伤疤痕、搔痕、皮肤灼伤、皮肤酸痛、褥疮疤痕、刺伤、移植、静脉溃疡或与手术或整形手术有关的伤口的伤口。
[0045] II. 生物相容性组合物和制备生物相容性组合物的方法本文提供包含注入有来自培养细胞(如成纤维细胞和成骨细胞二者)的调整细胞培养
基的聚合物基质(如琼脂糖)的生物相容性组合物。例如，来自成纤维细胞与来自成骨细胞的调整细胞培养基之比可以是5%:95%、10%:90%、15%:85%、20%:80%、25%:75%、30%:70%、35%:
65%、40%:60%、45%:55%、50%:50%、55%:45%、60%:40%、65%:35%、70%:30%、75%:25%、80%:20%、
85%:15%、90%:10%、95%:5%，或更高，或之间的任何范围，包括所有在内，例如40%:60%-60%:
40%。含有培养药剂的调整细胞培养基代表细胞增殖过程中释放的生长因子的异质组成，旨在刺激包括炎性、增殖和成熟阶段在内的再生过程。总之，从活跃增殖的细胞(如成纤维细胞和成骨细胞)分泌到调整培养基中的生长因子，代表了为再生用途(如牙周、骨、皮肤再生和重建)所必需的生长因子和蛋白质的完全混合物。使用聚合物基质(如琼脂糖)作为贮库，用于持续释放生长因子，允许增加对创伤区域的暴露，最终导致细胞增殖增加。
基的聚合物基质(如琼脂糖)的生物相容性组合物。例如，来自成纤维细胞与来自成骨细胞的调整细胞培养基之比可以是5%:95%、10%:90%、15%:85%、20%:80%、25%:75%、30%:70%、35%:
65%、40%:60%、45%:55%、50%:50%、55%:45%、60%:40%、65%:35%、70%:30%、75%:25%、80%:20%、
85%:15%、90%:10%、95%:5%，或更高，或之间的任何范围，包括所有在内，例如40%:60%-60%:
40%。含有培养药剂的调整细胞培养基代表细胞增殖过程中释放的生长因子的异质组成，旨在刺激包括炎性、增殖和成熟阶段在内的再生过程。总之，从活跃增殖的细胞(如成纤维细胞和成骨细胞)分泌到调整培养基中的生长因子，代表了为再生用途(如牙周、骨、皮肤再生和重建)所必需的生长因子和蛋白质的完全混合物。使用聚合物基质(如琼脂糖)作为贮库，用于持续释放生长因子，允许增加对创伤区域的暴露，最终导致细胞增殖增加。
[0046] 本发明也提供一种生产组合物或制剂的方法，其包含含有由培养细胞产生的一种或多种培养药剂的调整细胞培养基。该方法包括培养细胞，例如成纤维细胞和/或成骨细胞，以便细胞合成和分泌一种或多种细胞因子、生长因子和/或蛋白质到培养基中。产生的调整细胞培养基，现在含有一种或多种培养药剂，与培养细胞分离，并与聚合物基质结合以形成生物相容性组合物。
[0047] A. 调整细胞培养基术语“调整细胞培养基”或“调整培养基”指一种细胞培养基，其已被细胞培养物的细胞用作营养物、维生素、激素、以及无机化合物和盐的来源，并且通过接触细胞培养物，从而现在已加上由细胞合成和分泌到培养基中的细胞产物或“培养药剂”，例如细胞因子、蛋白质、细胞外基质成分或其任何组合。调整是细胞在与培养基之间接触、暴露、交换和相互作用一段时间后，细胞合成和分泌细胞因子、蛋白质和细胞外基质成分到新鲜培养基中的行为，上述一段时间优选在6小时到3天之间的时间，更优选12小时到2天，以调整培养基，例如至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时、至少约30小时、至少约36小时、至少约42小时、至少约48小时、至少约54小时、至少约60小时、至少约66小时、至少约72小时、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约2周，包括所有在内，或之间的任何范围，例如24小时和3天之间。调整细胞培养基从含有培养细胞的培养设备中取出并收集用于纯化其培养药剂，或全部或部分用作药物、化妆品或伤口愈合组合物，用于本文所述的各种再生过程，或用于体外细胞培养。
[0048] 细胞因子是使细胞的功能或活性发生变化如分化、增殖、分泌或运动的蛋白质。生长因子是细胞因子的亚群，其也是引起促进或抑制细胞生长、增殖、迁移或其它相关细胞事件的功能或活性变化的蛋白质。趋化因子是细胞因子的另一个亚群，它吸引和引导T-细胞、B-细胞和其它趋化因子反应性细胞到体内的特定组织。淋巴因子是参与免疫反应的细胞因子的另一个亚群。如本文所用，术语“细胞因子”包括细胞因子，包括生长因子、趋化因子和淋巴因子，且不限于其正常的结构和功能，而且还可以包括其天然存在的变体和杂种。本发明的培养药剂可包括细胞因子、生长因子和蛋白质。
[0049] 在其整个制造中以及在完全形成时，培养细胞含有活细胞，这些细胞合成并分泌一系列细胞因子和其它物质进入浸泡培养细胞的培养基中。培养细胞通常由成纤维细胞和成骨细胞的细胞组成，但可包含任何种类的细胞。在制造和培养细胞的过程中，成纤维细胞和成骨细胞可以提供类似组织的环境，结合细胞外基质的有组织的共同培养，以供细胞-细胞和细胞-基质相互作用，类似于在天然组织和/或骨(例如牙周组织和骨)中发生的相互作用。在不断发展的细胞培养中，这些相互作用允许细胞因子表达的广谱(wide profile)并分泌到培养基中，以诱导培养中的其它细胞执行细胞外基质发展、基底膜生成以及细胞增殖和分化的功能。
[0050] 调整培养基可包含生长因子，包括熟知的血小板衍生生长因子(PDGF)，其对细胞生长、细胞分裂和血管生成都很重要。重组PDGF目前已被FDA批准用于骨修复和再生。其它生长因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，和血管内皮生长因子(VEGF)，所有这些都有助于涉及血管生成、胶原沉积、肉芽组织形成和上皮化的增殖期(新组织的生长)。来自增殖成骨细胞的调整培养基包括从如上文所述的增殖成纤维细胞类似释放的生长因子，以及独特蛋白——骨钙蛋白和骨桥蛋白，其构成骨的有机基质。由培养细胞产生的其它细胞因子和生长因子包括但不限于角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子α (TGFα)、转化生长因子β (TGFβ)(包括转化生长因子β-1 (TGFβl)和转化生长因子β-2 (TGFβ2))、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF)。另外，成分可包括生物活性剂，例如胰岛素、氢化可的松、尿抑胃素、血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板因子IV (PF IV)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、集落刺激因子(CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)和生长分化因子(GDF)。应该注意的是，括号中的上述术语是它们前面的正式名称在本领域中通常已知和使用的缩略语。
[0051] 许多白介素，包括白介素-1 (IL-1)、白介素-6 (IL-6)、白介素-8 (IL-8)、白介素-11 (IL-11)，也可由培养细胞合成并且也是本发明的一个特征。在趋化因子亚群中，白细胞介素影响细胞凋亡。应该注意到，括号中的上述术语是它们前面的正式名称在本领域中通常已知和使用的缩略语。
[0052] 构成本发明的培养药剂的其它细胞因子和生长因子包括但不限于双调蛋白、血管生成素、促血管生成素-2、DTK、EGF-R、ENA-78、FAS、FGF-I、FGF-2、FGF-6、FGF-7、FGF-9、FIT-3配体、GCP-2、GM-CSF、GRO-α、HGF、IGF-I、IGF-2、IGFBP-2、IL-lα、IL-lβ、L-IRA、IL-6R、瘦蛋白、MCP-I、MCP-2、M-CSF、骨保护素(osteoprotegrin)、PIGF、RANTES、干细胞因子、TGFβ3、TIMP-I、TIMP-2、TRAIL和UPAR。
[0053] 本发明的调整细胞培养基可由培养细胞产生，培养细胞包括但不限于成骨细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、真皮成纤维细胞、表皮细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、专能干细胞(multipotent stem cells)、未分化干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cells)、成体干细胞、肝细胞和胰腺细胞或其任何组合。在某些实施方案中，细胞作为成骨细胞和成纤维细胞二者的共同培养物在一起培养。
[0054] 本发明中使用的另外的细胞类型可以从间充质中衍生出来。在某些实施方案中，优选的细胞类型是成骨细胞、成纤维细胞、基质细胞和其它支持性结缔组织细胞，或者，如在最优选的实施方案中的人成骨细胞和成纤维细胞。人成纤维细胞细胞株可衍生自许多来源，包括但不限于新生儿男性包皮、真皮、肌腱、肺、脐带、软骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜和肠。人细胞可包括但不必限于成纤维细胞、平滑肌细胞、软骨细胞和其它间充质起源的结缔组织细胞。在某些实施方案中，用于生产组织结构的基质-生成细胞的起源可以衍生自在采用本发明的培养方法后将类似或模仿的组织类型。例如，将多层片状结构与成纤维细胞一起培养以形成活的结缔组织结构；或与成肌细胞一起培养以用于骨骼肌结构。多于一种的细胞类型可以用来制造一个组织结构。细胞供体在发育和年龄上可有所不同。细胞可衍生自胚胎、新生儿或年长个体(包括成人)的供体组织。胚胎祖细胞，如间充质干细胞，可用于本发明，并可诱导分化以发育为所需的组织。
[0055] 虽然人类细胞优选用于本发明中，但在该方法中要使用的细胞并不局限于人类来源的细胞。可以使用来自其它哺乳动物物种的细胞，包括但不限于马、犬、猪、牛、猫科动物、山羊和绵羊来源。也可使用鼠科动物细胞，和其它来自啮齿动物来源的细胞。此外，本发明还可使用自发、化学或病毒转染的基因工程细胞。对于结合了多于一种细胞类型的那些实施方案，可以使用正常细胞和基因修饰或转染细胞的混合物，并可以使用两个以上物种或组织来源的细胞的混合物，或者可以两者兼而有之。
[0056] 重组细胞或基因工程细胞可用于组织结构的生产，以创建组织结构，其作为对需要增加水平的天然细胞产品或用治疗剂治疗的患者的药物递送移植物发挥作用。细胞可以产生重组细胞产品、生长因子、激素、肽或蛋白质持续的时间，或者由于在培养中存在的调整而在生物学、化学或热力学上发出信号时的所需的时间。细胞也可以进行基因工程来表达细胞因子、生长因子、蛋白质或不同类型的细胞外基质成分，这些细胞外基质成分或者是“正常的”，但是以高水平表达，或者是经过某种方式修饰的，以制造在治疗上有益于包括改进伤口愈合、促进或引导新血管形成的再生用途的细胞产品。这些程序是本领域通常已知的，并描述于Sambrook等人, 分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)，通过引用并入本文。根据本发明，所有上述类型的细胞都可用于培养细胞的生产，培养细胞将合成含有诸如细胞因子和/或生长因子的药剂的调整培养基。在一些实施方案中，培养细胞中的细胞在支架中进行培养，支架以模仿所关注的正常骨骼、皮肤或组织中发现的细胞排列和组成支持细胞。
[0057] 细胞数、细胞培养基浓度和细胞培养底物体积可以根据本领域熟知的方法进行调节，以优化细胞的增殖。培养物也可以被维持在温育器中，以确保受控制温度、湿度和气体混合物的足够的环境条件用于细胞培养。优选的条件是在约34℃-约38℃之间，更优选37 ± 1℃，伴有在约5-10 + 1% CO2之间的气氛和在约80-90%之间的相对湿度(Rh)。
[0058] 培养细胞是通过接触培养基来获得营养的，当它们代谢培养基中的成分并分泌细胞因子、生长因子和其它蛋白质到其中时，培养基就会受到细胞的调整。限定的培养基是指用于细胞培养的培养基，其含有化学限定成分且不含未限定的动物器官或组织提取物(如血清、垂体提取物、下丘脑提取物、胎盘提取物或胚胎提取物)或由饲养细胞分泌的蛋白质和因子。在一些实施方案中，细胞培养基可以不含未限定的成分和源自非人类来源的限定生物成分。虽然添加未限定的成分不是优选的，但它们可以在培养中的任何时间点按照所公开的方法使用，以便生成调整培养基。当利用筛选的人类细胞来执行本发明时，所述人类细胞使用从没有非人类来源的生物成分衍生的化学限定成分来培养，则所得到的组织结构是限定的人骨、组织或皮肤结构。使用这样的结构来产生本发明的调整培养基的优点是消除了在组织结构或调整培养基中可能存在外来动物或跨物种病毒污染和感染的担忧。
[0059] 培养基当为新鲜的和未使用时由营养成分构成，其还可以进一步补充其它成分。本领域技术人员可以确定哺乳动物细胞培养领域中合适的营养基础。例如，许多商业上可得的营养源对本发明的实践是有用的。这些包括提供无机盐、能源、氨基酸和B-维生素的商业上可得的营养源，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、M 199、RPMI 1640、Iscove改良Dulbecco培养基(EDMEM)。最小必需培养基(MEM)和M199需要额外补充磷脂前体和非必需氨基酸。商业上可得的富含维生素的混合物，其提供额外的氨基酸、核酸、酶辅因子、磷脂前体和无机盐，包括Ham's F-12、Ham's F-10、NCTC 109和NCTC 135。尽管浓度不同，但所有的基础培养基都以葡萄糖、氨基酸、维生素和无机离子以及其它基础培养基成分的形式为细胞提供了基础的营养来源。
[0060] 基础培养基可补充诸如氨基酸、生长因子和激素的成分。用于本发明的细胞培养的限定的培养基描述于授予Parenteau的美国专利号5,712,163和国际PCT公布号WO95/31473中，其公开内容通过引用并入本文。其它培养基为本领域已知的，例如在Ham和
McKeehan, 酶学方法(Methods in Enzymology)(1979) 58:44-93中公开的那些培养基，或在Bottenstein等人 酶学方法(Methods in Enzymology) (1979) 58:94-109中公开的其它适宜的化学限定的培养基。常见的有代表性的补充剂描述如下。
McKeehan, 酶学方法(Methods in Enzymology)(1979) 58:44-93中公开的那些培养基，或在Bottenstein等人 酶学方法(Methods in Enzymology) (1979) 58:94-109中公开的其它适宜的化学限定的培养基。常见的有代表性的补充剂描述如下。
[0061] 例如，胰岛素是一种促进葡萄糖和氨基酸的摄取以在多次传代内提供长期益处的多肽激素。补充胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)是长期培养所必需的，因为细胞摄取葡萄糖和氨基酸的能力最终会枯竭，细胞表型可能会退化。胰岛素补充对于系列培养是适宜的，并且可提供给培养基的浓度范围优选在约0.5 μg/ml-约50 μg/ml之间，更优选为约5 μg/ml。对于为培养而选择的细胞类型而言，用于补充胰岛素样生长因子如IGF-I或IGF-2的合适浓度可以由本领域技术人员容易地确定。
[0062] 转铁蛋白处于铁运输调节的培养基中。铁是血清中发现的必需微量元素。由于游离形式的铁对细胞可能是有毒性的，所以在血清中，铁可以优选在约0.05-约50 μg/ml之间的浓度范围，更优选以约5 μg/ml提供给结合转铁蛋白的细胞。
[0063] 三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine) (T3)是一种基本成分，也是甲状腺激素的活性形式，它被包含在培养基中以维持细胞代谢速率。三碘甲状腺原氨酸可以以约0-约400 pM，更优选在约2-约200 pM之间的浓度范围和最优选以约20 pM补充到培养基中。
[0064] 乙醇胺和邻磷酰基-乙醇胺之一或者二者(其均为磷脂)可作为肌醇途径和脂肪酸代谢的前体加入。在无血清培养基中补充通常在血清中发现的脂质是必要的。乙醇胺和邻-磷酰基-乙醇胺可以以约10-6-约10-2 M之间的浓度范围，更优选以约1 x 10-4 M提供给培养基。
[0065] 硒可以添加到无血清培养基中，以补充通常由血清提供的微量元素硒。硒可以以约10-9 M-约10-7 M的浓度范围，最优选以约5.3 x 10-8 M提供。
[0066] 氨基酸L-谷氨酰胺存在于某些营养基础中并且可以在没有或以不足量存在的情况下加入。L-谷氨酰胺也可以稳定的形式提供，如在商标GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY)下出售。GlutaMAX-1™是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定二肽形式，可与L-谷氨酰胺互换使用，并以等摩尔浓度提供作为L-谷氨酰胺的替代物。该二肽对L-谷氨酰胺提供稳定性以避免在贮存和温育过程中随时间推移的降解，这种降解可导致L-谷氨酰胺在培养基中的有效浓度不确定。通常，基础培养基优选以约1 mM-约6 mM之间，更优选约2 mM-约5 mM之间，和最优选4 mM的L-谷氨酸或GlutaMAX-1™补充。
[0067] 生长因子，例如本文描述的表皮生长因子(EGF)和其它生长因子如bFGF，也可加入到培养基中，以通过细胞规模的扩大和接种来帮助培养物的建立。例如，可以使用天然形式或重组形式的EGF。当制造不含非人类生物成分的皮肤等效物时，优选在培养基中使用人类形式(天然或重组)的EGF。EGF和/或其它生长因子可以以约1-约15 ng/mL之间，更优选约5-约10 ng/mL之间的浓度提供。
[0068] 细胞培养基通常如下面在实施例中阐述的那样制备。然而，应当理解，可以使用与它们的物理性质相容的常规方法来制备和组装本发明的成分。本领域公知的是用合适的类似物或功能等效的作用剂代替某些成分以达到可用性或经济性的目的，并达到类似的结果。当用于本发明的性能时，天然存在的生长因子可以用具有类似品质和结果的重组或合成生长因子替代。
[0069] 根据本发明的细胞培养基是无菌的。无菌成分是购买的或在制备后通过常规程序(如过滤)使其无菌的。以下实施例都使用了适当的无菌程序。例如，获得DMEM，然后添加其它成分以完成培养基。所有成分的储备溶液可在-20℃下储存，除了可在4℃下储存的营养来源外。所有溶液都可以作为浓缩储备液来制备。
[0070] 向培养物中提供新鲜培养基的方式是通过将培养基移液、倾析或泵送入培养装置来进行的。培养基的调整通过如下发生：使培养基与培养细胞接触足够的时间，通常约6小时-3天或更长时间，以允许细胞从新鲜培养基中吸收或摄取营养物等，并将细胞因子、生长因子和/或蛋白质分泌到培养基中。由于培养细胞处于恒定的代谢状态，只需要短的时间来调整培养基。优选的是，为了交换，结构和培养基彼此接触以进行交换，直到营养物几乎从新鲜培养基中耗尽为止。
[0071] 在每一次调整培养基与新鲜培养基交换时，调整培养基通过移液、抽吸、倾析、排出、虹吸或泵送而从培养物中去除和收集。调整培养基收集物可以单独用作单独的收集物，或汇合在一起。培养的骨、组织或皮肤结构的发育以许多事件为标记，这些事件在每个收集点产生具有变动的调整特征(conditioned profile)的调整培养基。作为分开的收集物，调整培养基将具有某些对特定的治疗指征或产品可能是理想的分泌因子。当将这些收集物通过汇合合并在一起时，调整培养基将有更广泛范围的用于治疗或产品的分泌因子。
[0072] 一旦收集到，调整培养基就会如收集的那样使用，或者对培养基进行进一步的处理，以便在使用前纯化或便于使用或储存。调整培养基可以被冻干或蒸发，以除去组合物中的液体或水部分。去除水留下含有以下培养药剂的调整培养基的结晶粉末形式：生长因子、细胞因子、蛋白质和细胞外基质成分，具有减少的体积。这种形式使制备含有较高剂量的培养药剂的产品更容易，而无需稀释制剂，因而由于其体积减少而更易于储存。
[0073] 调整培养基也可使用过滤方法浓缩，特别是具有分子量截留或一系列分子量过滤器的过滤方法。使用分子量过滤器将去除培养基中存在的大成分，如白蛋白、血清中存在的某些大分子量成分、细胞和细胞碎片。尽管不是必需的，但可能希望预先过滤调整培养基，以便在用较小孔的过滤器过滤前去除这些较大的成分，以防止任何随后使用的过滤器堵塞而降低过滤容量。其它过滤和透析方法可以用来从细胞产品组合物中去除盐。例如，可以采用切向流过滤来增加在调整培养基中培养药剂的浓度。另外，切向流过滤可被用来降低调整培养基中的盐浓度。为了降低盐的浓度，当调整培养基中的水性成分被去除时，它被水替代。事实上，培养药剂的浓缩和盐浓度的降低可以重复至少一次，以便有效地冲洗培养药剂中的盐。培养药剂可以被进一步纯化、片段化或缀合以形成纯的细胞因子、蛋白质或细胞外基质组合物，或者可以增强以向特定组织、组织结构或细胞类型定向递送。培养药剂的纯化和减少盐的方面使它们更相容，因此是优选的，以配制本发明的局部制剂。
[0074] 含有仅由培养细胞产生的分泌药剂、例如细胞因子和/或生长因子的调整培养基可用在细胞培养中或与聚合物基质结合，如本文进一步描述的那样。调整培养基可被用来通过增加细胞增殖和生成重要的新骨和/或牙龈组织、控制干细胞和祖细胞的增殖和分化、以及间充质分化(如间充质细胞向骨细胞的分化)来生长和维持细胞系。调整培养基还用于制备其它组织结构，以抑制或刺激在特定层或方向的细胞生长。调整培养基的作用被认为是浓度依赖性的，较高浓度比较低浓度产生更大的影响。
[0075] B. 聚合物基质如上面所指出的，本发明的生物相容性组合物可包含注入有来自培养细胞的调整细胞
培养基的聚合物基质。在某些实施方案中，聚合物基质可以是可生物降解的。在某些实施方案中，聚合物基质可包含多糖。多种多糖可适合作为水相增稠剂。这样的多糖的例子包括天然衍生的材料例如琼脂、琼脂糖、产碱杆菌多糖多糖(alicaligenes polysaccharides)、藻胶、藻酸、阿拉伯树胶、支链淀粉、壳多糖、右旋糖酐、决明胶、纤维素胶、明胶、结冷胶(gellan gum)、透明质酸、羟乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、果胶、小核菌胶(sclerotium gum)、黄原胶、果胶、海藻糖(trehelose)、明胶等。在某些实施方案中，琼脂糖可包括从海草或植物提取物中提取的多糖聚合物基质。提取物可提供在生物相容性组合物中，范围为总组合物的约0.0001-10%，优选约0.0005-8%，且更优选约0.001-5%重量。合适的植物提取物包括来自植物(草本植物、根、花、果、种子)例如花、果、蔬菜等的提取物，包括酵母发酵提取物、粉团扇藻(padica pavonica)提取物、嗜热栖热菌(thermus thermophilis)发酵提取物、亚麻荠籽油(camelina sativa seed oil)、齿叶乳香树(boswellia serrata)提取物、橄榄提取物、拟南芥(aribodopsis thaliana)提取物、银荆(acacia dealbata)提取物、银白槭(acer saccharinum) (糖枫)、嗜酸菌(acidopholus)、菖蒲(acorus)、七叶树(aesculus)、落叶松蕈(agaricus)、龙舌兰(agave)、龙芽草(agrimonia)、藻类、芦荟、柑橘、芸苔(brassica)、肉桂、桔、苹果、蓝莓、蔓越莓、桃、梨、柠檬、酸橙、豌豆、海草、咖啡因、绿茶、甘菊、柳树皮、桑树、罂粟，和CTFA化妆品成分手册(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)，第8版，第2卷，第1646至1660页中阐述的那些。其它具体实例包括但不限于光果甘草(Glycyrrhiza Glabra)、黑柳(Salix Nigra)、巨藻(Macrocycstis Pyrifera)、苹果(Pyrus Malus)、草莓虎耳草(Saxifraga Sarmentosa)、葡萄(Vilis Vinifera)、黑桑(Morus Nigra)、黄芩(Scutellaria Baicalensis)、白花春黄菊(Anthemis Nobilis)、南欧丹参(Salvia Selarea)、迷迭香(Rosmarinus Officianalis)、香橼(Citrus Medica
Limonum)、人参(Panax Ginseng)，及其混合物。
培养基的聚合物基质。在某些实施方案中，聚合物基质可以是可生物降解的。在某些实施方案中，聚合物基质可包含多糖。多种多糖可适合作为水相增稠剂。这样的多糖的例子包括天然衍生的材料例如琼脂、琼脂糖、产碱杆菌多糖多糖(alicaligenes polysaccharides)、藻胶、藻酸、阿拉伯树胶、支链淀粉、壳多糖、右旋糖酐、决明胶、纤维素胶、明胶、结冷胶(gellan gum)、透明质酸、羟乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、果胶、小核菌胶(sclerotium gum)、黄原胶、果胶、海藻糖(trehelose)、明胶等。在某些实施方案中，琼脂糖可包括从海草或植物提取物中提取的多糖聚合物基质。提取物可提供在生物相容性组合物中，范围为总组合物的约0.0001-10%，优选约0.0005-8%，且更优选约0.001-5%重量。合适的植物提取物包括来自植物(草本植物、根、花、果、种子)例如花、果、蔬菜等的提取物，包括酵母发酵提取物、粉团扇藻(padica pavonica)提取物、嗜热栖热菌(thermus thermophilis)发酵提取物、亚麻荠籽油(camelina sativa seed oil)、齿叶乳香树(boswellia serrata)提取物、橄榄提取物、拟南芥(aribodopsis thaliana)提取物、银荆(acacia dealbata)提取物、银白槭(acer saccharinum) (糖枫)、嗜酸菌(acidopholus)、菖蒲(acorus)、七叶树(aesculus)、落叶松蕈(agaricus)、龙舌兰(agave)、龙芽草(agrimonia)、藻类、芦荟、柑橘、芸苔(brassica)、肉桂、桔、苹果、蓝莓、蔓越莓、桃、梨、柠檬、酸橙、豌豆、海草、咖啡因、绿茶、甘菊、柳树皮、桑树、罂粟，和CTFA化妆品成分手册(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)，第8版，第2卷，第1646至1660页中阐述的那些。其它具体实例包括但不限于光果甘草(Glycyrrhiza Glabra)、黑柳(Salix Nigra)、巨藻(Macrocycstis Pyrifera)、苹果(Pyrus Malus)、草莓虎耳草(Saxifraga Sarmentosa)、葡萄(Vilis Vinifera)、黑桑(Morus Nigra)、黄芩(Scutellaria Baicalensis)、白花春黄菊(Anthemis Nobilis)、南欧丹参(Salvia Selarea)、迷迭香(Rosmarinus Officianalis)、香橼(Citrus Medica
Limonum)、人参(Panax Ginseng)，及其混合物。
[0076] 在某些实施方案中，生物相容性组合物被配制以提供一种或多种活性成分的局部控制释放。适合于局部施用的任何药学上可接受的载体媒介或制剂都可以使用。本领域已知的缓释制剂包括但不限于包衣颗粒、聚合物制剂(如囊泡或脂质体)和微粒(例如微球或微囊)。
[0077] 种类繁多的可生物降解的材料可被用来提供控制释放。控制释放材料应为生物相容性的，并应以安全和药学上可接受的方式原位降解、溶解或吸收，以便通过天然组织过程并以适当的时间(例如少于一年，不到6个月，少于一个月，少于一周，不足一天或少于数小时)将该材料从施用部位去除。控制释放载体不应引起任何不希望的局部组织反应，也不应引起全身或局部的毒性。
[0078] 用于本发明的生物相容性组合物的适合控制释放可生物降解聚合物可包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚己内酯、多糖、聚磷腈、蛋白质聚合物及其可溶性衍生物(如凝胶化生物可降解合成多肽、烷基化胶原和烷基化弹性蛋白)，多糖、多肽、聚酯和聚原酸酯的可溶性衍生物。
[0079] 在某些实施方案中，细胞外基质蛋白可用于产生生物相容性支架。例如，胶原是用作可生物降解支架的常见组分。虽然胶原是用于生物相容性组合物的最优选的细胞外基质组分，其它细胞外基质也可使用，例如其它胶原，来自胶原家族的纤维和非-纤维胶原二者，例如胶原类型II、III、IV、V、VI5 VII、VIII5 IX、X5 XI、XII5 XIII、XTV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX5。其它基质蛋白质可包括但不限于弹性蛋白、蛋白多糖例如核心蛋白多糖或双糖链蛋白多糖(biglycan)，或糖蛋白例如腱生蛋白(tenascin)、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白I，和糖胺聚糖(GAG)例如透明质酸(HA)。真皮基质可以在组成和结构上有所变化。胶原海绵、生物相容性、生物可重塑的脱细胞真皮或胶原凝胶。不是向真皮细胞提供细胞外基质成分，而是它们可在可生物降解的网状构件(如尼龙或polygalactin (PGA))上培养，以提供培养支持，并培养以产生细胞外基质，直到细胞及其基质包裹支持物为止。在某些实施方案中，可以使用胶原凝胶，例如在授予Bell的美国专利号4,485,096 (通过引用并入本文)中描述的那些胶原凝胶。收缩的胶原凝胶可以放置在多孔膜上的大块脱细胞胶原层上，以将凝胶锚定在膜上，并防止凝胶过度径向收缩。结合大块脱细胞胶原层的方法在授予Kemp等人的美国专利号5,536,656，在Wilkins, L.M.等人 Biotechnology and Bioengineering (1994) 43:747-756，和在Parenteau, N.L. 皮肤等效物(Skin equivalents)，T. Leigh和F. Watt (编辑)，Keratinocyte Handbook Cambridge
University Press, London (1994)中描述，这些文献的公开内容通过引用并入本文。组织等效物和脱细胞水合胶原凝胶可以用皮肤和肌腱(包括大鼠尾肌腱、犊牛皮胶原和犊牛伸肌腱)衍生的胶原制备。胶原的其它来源将是合适的。从犊牛普通指伸肌腱衍生的胶原组合物和衍生这样的胶原组合物的方法公开于授权给Kemp的美国专利号5,106,949中，其公开内容通过引用并入本文。
University Press, London (1994)中描述，这些文献的公开内容通过引用并入本文。组织等效物和脱细胞水合胶原凝胶可以用皮肤和肌腱(包括大鼠尾肌腱、犊牛皮胶原和犊牛伸肌腱)衍生的胶原制备。胶原的其它来源将是合适的。从犊牛普通指伸肌腱衍生的胶原组合物和衍生这样的胶原组合物的方法公开于授权给Kemp的美国专利号5,106,949中，其公开内容通过引用并入本文。
[0080] 在某些实施方案中，聚合物基质可包含琼脂糖或琼脂糖-样材料。琼脂糖提供了几个优点。首先，它是全天然的且通常来源于海草。琼脂糖由相对简单的重复二糖组成，提供化学和热稳定性，使其在室温下保持凝胶样稠度，用作生长因子和蛋白质的物理贮库，同时将与上述物质在结合或改变其结构方面的任何相互作用最小化，从而保持它们的生物活性。这使得参与牙周再生和骨生长的生物过程中的生长因子和蛋白质能够立即和持续地被动分泌。随着时间的推移，基质将溶解并经历再吸收。
[0081] 其次，当从水相转变为半固体凝胶相时，琼脂糖形成三维网状网络，这形成通道网络，允许预先注入的生长因子和细胞因子被动地扩散出琼脂糖，以刺激细胞增殖，并且还通过允许代谢的副产物从基质的一侧横越到另一侧的通行而允许细胞发挥它们的旁分泌样效应，增强修复和生长。
[0082] 在某些实施方案中，低熔点琼脂糖是优选的基质，这是由于它的化学和热稳定性以及它在蛋白质相互作用(结合或改变)方面的惰性。当冷却到凝胶状态时，琼脂糖凝胶代表了各个生长因子的物理贮库，导致与牙周和骨再生相关的生长因子的立即和持续释放。此外，琼脂糖聚合物链形成通道的三维网状网络，允许生长因子和和其它天然存在的细胞因子被动扩散，增强在细胞水平上增殖和分化所需的细胞与细胞间相互作用的旁分泌样效应，导致表现为牙周生长和新骨形态发生的表型变化。
[0083] 在某些实施方案中，琼脂糖可以是低熔点的琼脂糖，或者甚至可以是超-低熔点的琼脂糖(来自Lonza的SeaPrepTM琼脂糖)。术语“低熔点琼脂糖”通常是指在约65℃或更高的温度下将熔化成流体的琼脂糖(见例如，UltraPure™低熔点琼脂糖, ThermoFisher Scientific)。术语“超-低熔点琼脂糖”通常是指在约40-50℃或更高的温度下将熔化成流体的琼脂糖(见例如，琼脂糖A5030, Sigma-Aldrich，和SeaPrep®琼脂糖, Lonza)。这样的琼脂糖组分的浓度可以是0.8%重量:体积(w:v)、约0.9% w:v、约1.0% w:v、约1.1% w:v、约
1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约
1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约
2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v、约3.0% w:v、约3.1% w:v、约3.2% w:v、约
3.3% w:v、约3.4% w:v、约3.5% w:v，或之间的任何范围，包括所有在内，例如约0.8% w:v-约3.0% w:v。例如，在一个实施方案中，琼脂糖可以最初溶解到代表产生最终的1% w:v浓度所需总体积的½的体积中，以便将粉末形式完全溶解成温热的凝胶状态。将该混合物冷却到低于37℃后，可以加入剩余的½体积的调整培养基(例如调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物)并完全混合以充分结合所有成分。溶于调整成纤维细胞/成骨细胞培养基的1% w:v超-低熔点琼脂糖的基质可冷却至4℃，以帮助琼脂糖的聚合直至进一步的使用。
1.2% w:v、约1.3% w:v、约1.4% w:v、约1.5% w:v、约1.6% w:v、约1.7% w:v、约1.8% w:v、约
1.9% w:v、约2.0% w:v、约2.1% w:v、约2.2% w:v、约2.3% w:v、约2.4% w:v、约2.5% w:v、约
2.6% w:v、约2.7% w:v、约2.8% w:v、约2.9% w:v、约3.0% w:v、约3.1% w:v、约3.2% w:v、约
3.3% w:v、约3.4% w:v、约3.5% w:v，或之间的任何范围，包括所有在内，例如约0.8% w:v-约3.0% w:v。例如，在一个实施方案中，琼脂糖可以最初溶解到代表产生最终的1% w:v浓度所需总体积的½的体积中，以便将粉末形式完全溶解成温热的凝胶状态。将该混合物冷却到低于37℃后，可以加入剩余的½体积的调整培养基(例如调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物)并完全混合以充分结合所有成分。溶于调整成纤维细胞/成骨细胞培养基的1% w:v超-低熔点琼脂糖的基质可冷却至4℃，以帮助琼脂糖的聚合直至进一步的使用。
[0084] 生物相容性支架的药代动力学释放曲线可以是一级、零级、双相或多相的，以在所需的时间段内提供所需的治疗效果。通过使用具有不同释放速率和/或组合物成分的不同百分比载荷的聚合物混合物，可以实现所需的释放曲线。包衣颗粒、脂质体、微球和微囊的制备方法在该领域中是众所周知的。
[0085] 一旦形成本发明的生物相容性组合物，调整细胞培养基可以占总生物相容性组合物的约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多的重量、体积、重量:体积和/或重量:重量。
[0086] III. 生物相容性组合物的用途和方法生物相容性组合物可用于受试者中生长骨或抑制骨吸收的方法，该方法包括将有效量
的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要骨生长和/或骨吸收抑制的部位。这样的受试者可患有骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、骨质疏松和/或溶骨性骨病。类似地，生物相容性组合物可用于治疗受试者的牙周病症的方法，该方法包括将有效量的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的牙周部位。可使用该方法治疗的有用的牙周病症包括但不限于牙周病、牙龈炎症、蛀牙、牙龈病、牙龈炎和牙周炎。例如，生物相容性组合物可用作局部应用的牙周治疗物。当根据上述方法使用本发明的生物相容性组合物时，可维持或增加骨量，可维持或增加骨密度，可维持或增加牙龈组织，或其任何组合。
的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要骨生长和/或骨吸收抑制的部位。这样的受试者可患有骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、骨质疏松和/或溶骨性骨病。类似地，生物相容性组合物可用于治疗受试者的牙周病症的方法，该方法包括将有效量的本发明的生物相容性组合物施用于受试者中需要a) 牙龈和/或骨生长和/或b) 牙龈侵蚀和/或骨吸收抑制的牙周部位。可使用该方法治疗的有用的牙周病症包括但不限于牙周病、牙龈炎症、蛀牙、牙龈病、牙龈炎和牙周炎。例如，生物相容性组合物可用作局部应用的牙周治疗物。当根据上述方法使用本发明的生物相容性组合物时，可维持或增加骨量，可维持或增加骨密度，可维持或增加牙龈组织，或其任何组合。
[0087] 本发明的方法主要包括施用给受试者有效量的生物相容性组合物。本发明的方法是非手术性、非侵入性和安全的，可用于治疗和/或预防与骨丢失、骨降解、骨退化或骨变性相关的疾病状态或病症，包括但不限于骨关节炎、转移性骨病、溶骨性骨病和牙科相关的疾病，例如牙周炎、牙龈炎、牙龈病和牙周病。
[0088] 本文提供的生物相容性组合物为医生提供了一种治疗替代物/辅助物，利用生长因子来缩短恢复时间和改善患者有关牙龈和骨再生的整体结果。从增殖成纤维细胞和成骨细胞释放的生长因子的异质组成，提供了生长因子的完整来源，以分别刺激参与牙龈再生的成纤维细胞的增殖和分化以及参与骨再生的成骨细胞增殖/成熟。
[0089] 本发明的方法还至少部分涉及治疗或预防会受益于增加口腔骨形成的口腔病症，包括例如牙周炎或与牙周炎相关的疾病。生物相容性组合物可用于增加口腔骨形成的方法，从而治疗或预防会受益于增加口腔骨形成的口腔病症，如牙周炎或与牙周炎有关的疾病。这样的方法包括将生物相容性组合物施用于需要增加口腔骨形成的口腔表面。口部施用的目标是应用于口腔，例如通过将生物相容性组合物和其中所含的有效成分应用于口腔表面，包括但不限于唾液腺、唾液、牙龈、牙菌斑、牙齿、舌头、颊组织等。口部施用的药剂可以单独施用，或者与药学上可接受的载体和/或其它活性成分(例如会受益于增加口腔骨形成药剂的抗口腔疾病的成分)联合，在口用组合物之前、之后或同时施用。本发明还设想了再生其它口腔组织，包括软组织、上皮和结缔组织，如胶原和血管。
[0090] 一般来说，本发明的生物相容性组合物直接或间接地应用于诸如骨腔、牙周袋、伤口床等的部位。在一些实施方案中，生物相容性组合物可结合到伤口敷料中。生物相容性组合物可用作移植物的辅助物，如自体移植物(从患者身上取下皮肤，并重新应用于同一患者的其它部位)或牙龈瓣。使用许多熟知的方法中的任何一种，可将生物相容性组合物或包括它的药物制剂物理应用于感兴趣的接触区域，例如物理袋或外科闭合。例如，可通过生物相容性组合物引入缝合线，用于结合到手术部位中。在一些实施方案中，缝合线可以是可吸收线、不可吸收线、天然线、合成线、单丝线或复丝线。缝合线也可以浸渍有杀菌物质以防止缝合线被污染，抗凝血剂，或自体细胞以防止不良免疫反应。
[0091] 在另一个实施方案中，含有生物相容性组合物的药物制剂可使用生物粘合剂，以维持生物相容性组合物与接触表面的物理接触。这些生物相容性粘合剂一般分为两类：生物粘合剂，由血浆蛋白合成；以及合成聚合物，主要是氰基丙烯酸酯及其衍生物。
[0092] 如上所述，伤口敷料、手术闭合、吻合术、粘合带、生物粘合剂、牙龈瓣，及其它物理约束手段可用于将生物相容性组合物固定于接触表面。
[0093] 一般来说，治疗有效量的本发明的生物相容性组合物或包含其的药物组合物的施用可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别、体重以及肽在该个体中引起所需反应的能力的因素而变化。可以调整剂量方案，以提供最佳的治疗反应。例如，每天可以施用几个分剂量，或者根据治疗情形的紧急情况所示按比例减少剂量。
[0094] 例如，在实施本发明的一些实施方案中，安全和有效量的本发明的生物相容性组合物可以局部应用于骨、骨表面、口腔骨、口腔骨表面、口腔粘膜组织、口腔牙龈组织、舌、唾液腺、唾液和/或牙齿表面、软组织、上皮及结缔组织，例如胶原及血管，以治疗或预防上述口腔疾病或病症，优选应用至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长或之间的任何范围，例如至少约10分钟和至少约1小时之间，至少约1分钟和至少约14天之间或更长等。一般来说，生物相容性组合物局部施用在物理袋内，例如牙龈瓣或骨缺损，并允许其作用直到生物相容性聚合物基质降解或以其它方式吸收。施用方法可每天重复应用或重复1次至5次，优选地1-3次。作为替代或者补充，口部递送可以以每天一次至几次的频率进行，持续至多12个月，例如每天一次至几次，持续1、2、3、4、5、6或7天；或1、2、3或4周；或1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11或12个月或更长时间(或之间的任何范围)。通常，该组合物的有效量为约0.5-
10克，优选为约1克。
7、8、9、10、11或12个月或更长时间(或之间的任何范围)。通常，该组合物的有效量为约0.5-
10克，优选为约1克。
[0095] 在某些实施方案中，施用预防剂(例如，生物相容性组合物)可在牙龈丢失、牙龈退化、骨丢失、骨降解、骨退化、骨变性等特征性症状显现之前进行，包括但不限于牙周病、骨关节炎、转移性骨病和溶骨性骨病，以便预防疾病或紊乱或延缓其进展。
[0096] 本发明的方法可用于预防、抑制或减少骨丢失/吸收。作为替代或者补充，本发明的方法也可用于增加、增强、改善或促进骨生长。例如，某些方法可用于治疗、预防或延缓骨降解、骨变性和/或骨退化；增加或维持/稳定骨量和/或骨密度；和/或逆转骨丢失、骨降解、骨变性和/或骨退化。这同样适用于牙周组织和结构，包括牙龈和牙周骨。
[0097] 本发明的方法可用于增加口腔骨形成，包括延缓或预防此类疾病或紊乱的发生，逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止与此类疾病或紊乱相关的病症的进展、加重、恶化或严重程度。
[0098] 如果任何一种或所有的会受益于骨形成的增加、骨生长的增强和/或牙龈/骨丢失的减少的骨和/或牙周病的迹象或症状以有益的方式改变，其它临床上可接受的疾病症状或标志得到改善，或甚至在使用该药剂治疗后改善例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，则使用本文描述的生物相容性组合物治疗被认为是“有效的治疗”。效力也可以通过个体没有如通过住院或需要医疗或牙科干预评估的恶化(即疾病的进展停止或至少减缓)来测量。测量这些指标的方法为本领域技术人员所熟知和/或在此描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性的例子包括人类或哺乳动物)疾病的任何治疗，包括：(1) 抑制疾病，例如阻止骨和/或牙龈丢失；或(2) 缓解疾病，例如增加骨和/或牙龈生长；和(3) 预防或减少由骨和/或牙周疾病发展并发症的可能性。
[0099] 在一些实施方案中，生物相容性组合物作为牙周瓣手术的辅助物提供。例如，本发明的生物相容性组合物可应用于本文确定的瓣下的外科伤口，以在诱导口腔骨形成和/或牙龈再生、促进骨和/或牙龈生长和/或预防骨和/或牙龈丢失方面具有持续的术后效果。通常进行牙周瓣手术，以治疗表现出显著骨丢失的慢性牙周病变，以便对病变区域进行清创，并从牙齿上去除沉积物。一般来说，当患者对刮治术和牙根平整程序和/或抗生素治疗无反应时，通常需要进行牙周手术，如牙龈切除术或牙周瓣手术。这样的治疗方法是本领域众所周知的。例如，在牙龈切除术中，牙医会对不健康的牙龈组织进行整形，以减少被感染的袋的大小。减少袋大小可以使患者通过常规刷牙和牙线保持袋卫生，从而消除细菌生长的有利环境。牙周瓣手术也是在刮治术和牙根平整程序不成功的情况下进行的，尤其是在骨丢失或组织脱离的情况下。在此程序中，在牙龈上切开切口并修整周围牙槽骨的轮廓，以帮助感染区域的愈合。通常，外科治疗不足以刺激由严重牙周病引起的受损骨和牙骨质的再生长或替换，以致使用本文描述的生物相容性组合物的辅助方法特别有用。然而，如上所述，本发明的生物相容性组合物可以应用或施用于任何有需要的骨或牙周结构，无论是否与牙周瓣手术有关。
[0100] 本文描述的任何口腔组合物治疗骨和/或牙周疾病的有效性可以通过比较从接受治疗的受试者中获得的两个或更多个样品来监测。一般来说，在开始治疗前从受试者获得第一个样本，并在治疗期间获得一个或多个样本是优选的。在这样的用途中，确定治疗前来自有口腔疾病的受试者的细胞表达的基线，然后在治疗过程中监测来自有口腔疾病的受试者的细胞表达的基线状态或骨生长检测的变化，这些变化将受益于口腔骨形成的增加、骨生长的增强和/或骨丢失的减少。或者，在治疗期间获得的两个或更多个连续的样品可以在不需要治疗前基线样品的情况下使用。
[0101] 在接受治疗的受试者中一种或多种骨和/或牙周疾病是否正在得到改善，可以根据本领域众所周知的试验来确定。例如，可监测下列指标：1) 增加牙龈/骨生长和/或牙龈/骨密度；2) 减少牙龈/骨丢失和/或逆转牙龈/骨密度损失；3) 减少牙齿移动；4) 增加牙龈、成骨细胞或骨-特异性基因，如碱性磷酸酶(ALP)、胶原I型、骨钙蛋白、骨桥蛋白、Cbfa1/Runx2、gsc、Dlx1、DlxS、Msx1、Cart1、Hoxa1、Hoxa2、Hoxa3、Hoxb1、rae28、Twist、AP-2、Mf1、Pax1、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBXS和鼠短尾突变体表型(Brachyury) (如通过基因表达、酶活性、免疫组织化学等测定的；Olsen等人Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (2000) 16:191); 5) 减少牙周袋尺寸；6) 增加牙龈附着水平；7) 减少牙齿脱落；8) 减少牙周炎症；
9) 减少牙周病进展期；及其组合。
9) 减少牙周病进展期；及其组合。
[0102] 在本发明的方法中，生物相容性组合物可以在与骨丢失相关的病理生理学病症发作之前施用以进行预防作用，或者它们可以在该病症开始后施用以进行治疗作用。
[0103] 一般来说，可以使用本发明的方法治疗的脊椎动物受试者(人类或其它哺乳动物)罹患与骨丢失相关的疾病或病症，或易患与骨丢失有关的疾病或病症(例如，表现出发展这种疾病或病症的风险高或更高，或已被诊断患有已知引起、导致或关联骨丢失的疾病状态或病症)。
[0104] 可采用本发明方法治疗和/或预防的与骨丢失相关的疾病状态和病症包括表征为、伴随着、关联、导致或诱导骨降解、骨退化或骨变性(例如导致骨量损失和/或骨密度损失)的任何病症。这样的病症的实例包括但不限于牙周病例如牙周炎、骨折或骨缺损、骨关节炎、转移性骨病和溶骨性骨病。这样的病症的其它实例包括而不限于癌症和肿瘤(例如骨肉瘤和多发性骨髓瘤)、肾病(包括急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、肾骨营养不良和肾再灌注损伤)、肾脏疾病和卵巢早衰。因此，本发明的方法可用于预防骨丢失，填补骨缺损，刺激骨折、移植物和骨假体的快速融合，和促进骨质疏松骨的强化。
[0105] 在某些本发明的方法中，生物相容性组合物与至少一种治疗剂组合施用，所述治疗剂a) 促进牙龈和/或骨生长和/或b) 抑制牙龈侵蚀和/或骨吸收。例如，这样的药剂可以是骨形态发生因子、抗吸收剂、成骨因子、软骨衍生形态发生蛋白、生长激素、雌激素、双膦酸盐、他汀类、分化因子，或其组合。
[0106] 在一些本发明的方法中，生物相容性组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用。另外的治疗剂的实例包括但不限于镇痛剂、麻醉药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗生素、抗炎药、抗氧化剂、防腐剂、免疫刺激剂，及其组合。例如，这样的药剂可以是抗微生物化合物和/或非甾体抗炎药(NSAID)。在某些实施方案中，另外的治疗剂或药剂是COX-2抑制剂，例如选择性COX-2抑制剂，例如塞来考昔、罗非考昔和/或伐地考昔。在这样的实施方案中，生物相容性组合物和其它药剂可顺序或同时施用。
[0107] 作为替代或者补充，生物相容性组合物可与医疗程序组合地(即在医疗程序之前、同时和/或随后)施用。例如，医疗程序可以是外科干预以消除牙周袋和/或修整骨的轮廓，或者在患有牙周病的受试者中选择性地将牙齿表面整形。或者，医疗程序可以是骨移植、手术切除肿瘤等。
[0108] 这样的另外的药剂可以是那些天然存在于体内和/或在经历骨生长/形成的部位自然分泌并在骨形成过程的一个或多个步骤中起作用的药剂。对于那些本领域的普通技术人员来说，显而易见的是这些药剂或生物分子的变体、合成类似物、衍生物和活性部分可以替代性地用于本发明的组合物中，只要它们表现出与天然生物分子实质上相同类型的性质/活性。这样的变体、合成类似物、衍生物和活性部分意欲在术语“治疗性生物分子”的范围内。
[0109] 治疗剂或生物分子可从哺乳动物组织中提取并用于本发明，无论是粗制的还是在纯化后的。或者，它们可以通过化学或常规的基因工程技术制备，例如通过合成基因或由位点特异性突变改变的基因的表达。
[0110] 增加骨量或骨密度的治疗剂或生物分子包括但不限于生长因子(例如IGF-1、IGF-2、巨噬细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、软骨衍生形态发生蛋白(CDMP-1、CDMP-2、CDMP-3)和结缔组织活化肽(CTAP)、矿物质(如钙、铝、锶和氟化物)、维生素(例如维生素D3)、激素(例如甲状旁腺激素(PTH)，和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP))、前列腺素(例如PDG1、PDG2、PGE2、PGE1和PGF2)；15-脂氧化酶抑制剂、地塞米松、他汀类和骨形态发生蛋白(例如BMP-2、BMP-4和BMP-7)。
[0111] 在某些实施方案中，治疗剂或生物分子可以是转化生长因子β (TGF-β)。TGF-β是参与广泛的生物学过程的细胞外多肽(J. Massague, Annu. Rev. Cell. Biol. (19900 6: 597-641)并在胚胎发生、成人组织修复和免疫抑制过程中的关键事件中发挥中心作用(M. B. Sporn等人Cell. Biol. (1992) 119: 1017-1021; S. W. Wahl, J. Clin.
Immunol. (1992) 12: 61-74; D. M. Kingsley, Genes Dev. (1994) 8: 133-146)。已知TGF-β引起成骨细胞的增殖和分化(M. Centrella等人, J. Bone Join. Surg. (1991)
73: 1418-1428; T. A. Mustoe等人Science, 1987, 237: 1333-1336; L. S. Beck等人J. BoneMiner. Res. (1991) 6: 961-968)。还已知TGF-β在骨生成早期起着重要作用(S. Dieudonne等人J. Cell. Biochem. (1999) 76: 231-243)。用于本发明组合物中的TGF-β可以由重组细胞培养物生产。或者，TGF-β可以使用任何合适的方法从血小板或任何其它哺乳动物组织中衍生。优选地，TGF-β从人的组织衍生而来。然而，由于TGF-β不是物种特异性的，它也可以替代性地衍生自动物来源例如骨或猪来源。在某些情况下，TGF-β优选使用顺序凝胶过滤、阳离子交换层析或高效液相色谱纯化至基本同质。
Immunol. (1992) 12: 61-74; D. M. Kingsley, Genes Dev. (1994) 8: 133-146)。已知TGF-β引起成骨细胞的增殖和分化(M. Centrella等人, J. Bone Join. Surg. (1991)
73: 1418-1428; T. A. Mustoe等人Science, 1987, 237: 1333-1336; L. S. Beck等人J. BoneMiner. Res. (1991) 6: 961-968)。还已知TGF-β在骨生成早期起着重要作用(S. Dieudonne等人J. Cell. Biochem. (1999) 76: 231-243)。用于本发明组合物中的TGF-β可以由重组细胞培养物生产。或者，TGF-β可以使用任何合适的方法从血小板或任何其它哺乳动物组织中衍生。优选地，TGF-β从人的组织衍生而来。然而，由于TGF-β不是物种特异性的，它也可以替代性地衍生自动物来源例如骨或猪来源。在某些情况下，TGF-β优选使用顺序凝胶过滤、阳离子交换层析或高效液相色谱纯化至基本同质。
[0112] 在其它实施方案中，治疗剂或生物分子是骨形态发生蛋白(BMP)。BMP是一种骨形成蛋白，据报道刺激多能细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，并在骨再生中发挥重要作用(M. R. Urist Science (1965) 150: 893-899; M. R. Urist等人J. Dent. Res. (1971) 50: 1392-1406; J. M. Wozney Mol. Reprod. Dev. (1992) 32: 160-167; J. M. Wozney等人Science (1988) 242: 1528-1534; I. One等人Craniofac. Surg. (1996) 7: 418-
425)。可用于本发明的BMP包括但不限于BMP-1、BMP-2α、BMP-2β、BMP-3β、BMP-4、BMP-5、BMP-
6、BMP-7、BMP-8β、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14和BMP-15。
425)。可用于本发明的BMP包括但不限于BMP-1、BMP-2α、BMP-2β、BMP-3β、BMP-4、BMP-5、BMP-
6、BMP-7、BMP-8β、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14和BMP-15。
[0113] 在又一个实施方案中，组合物包含钙和磷酸根的来源，以局部提高溶解的钙(Ca2+)和磷酸根(PO4-)在组合物的应用部位内及周围的可溶性浓度。钙来源和磷酸根来源可以是相同的材料或者可以是不同的材料。用于本发明的合适的钙来源包括任何酸性钙盐，例如磷酸钙盐(例如，磷酸一钙、磷酸钙二水合物(也称为dical)和焦磷酸钙)或柠檬酸钙盐。用于本发明的合适的磷酸根来源包括任何磷酸盐，例如磷酸钙盐(例如，酸性磷酸钙盐)和磷酸钠盐。酸性磷酸钙盐的实例包括磷酸氢盐二水合物、磷酸一钙和焦磷酸钙。
[0114] 在再一个实施方案中，治疗剂或生物分子是他汀类。术语“他汀类”和“HMG-CoA还原酶抑制剂”在本文中可互换使用，并指抑制酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的化合物。HMG-CoA还原酶是参与细胞胆固醇生物合成的主要限速酶。他汀类促进成骨细胞(产生新骨的细胞)的产生，并增强成骨细胞分化(E. Harris等人Mol. Cell. Diff. (1995) 3: 137-147; G. Mundy等人, Science (1999) 286: 19464949)。特别是，他汀类已被证明能系统地或在骨折部位促进BMP的产生(美国专利号6,022,887; 6,080,779;和6,376,476)。用于本发明的他汀类的实例包括但不限于洛伐他汀、普伐他汀、韦洛他汀
(velostatin)、辛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、达伐他汀、氟茚他汀
(fluindostatin)、阿托伐他汀、其前药或其生理上可接受的盐。
(velostatin)、辛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、达伐他汀、氟茚他汀
(fluindostatin)、阿托伐他汀、其前药或其生理上可接受的盐。
[0115] 可在本发明中使用的预防骨丢失/吸收的药剂包括但不限于孕激素、雌激素、雌激素/孕激素组合、雌酮、雌三醇、17α-或17β-乙炔基雌二醇、SB242784、聚膦酸盐和双膦酸盐。可市售获得的双膦酸盐包括依替膦酸盐(etidronate)、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、阿仑膦酸盐、帕米膦酸盐和伊班膦酸盐(ibandronate)。
[0116] 在一些实施方案中，促进组织中血管生成的药剂和/或可用于治疗手术或损伤后粘膜表面的药剂是有用的。
[0117] 适用于本发明的镇痛剂包括非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID具有镇痛、解热和抗炎活性。它们在外周发挥作用，通过环氧合酶(COX)抑制，干扰前列腺素的合成来提供其镇痛作用。有许多不同类型的NSAID，包括阿司匹林和其它水杨酸盐(酯)。代表性的例子包括但不限于布洛芬、萘普生、舒林酸、双氯芬酸、吡罗昔康、酮洛芬、二氟尼柳、萘丁美酮、依托度酸、噁丙嗪和吲哚美辛。几种更有效的NSAID已被开发成局部施用于身体疼痛部位的局部产品。
[0118] 麻醉药，例如赛罗卡因、利多卡因或苯佐卡因(或其它药物例如下面描述的那些药物)可加入到本发明的镇痛剂组合物，以提供即时但短期的疼痛缓解，直至镇痛剂变得完全有效为止。适用于本发明的实施的麻醉药包括钠通道阻滞剂。钠通道阻滞剂通过降低或防止可兴奋膜对钠离子(Na+)的渗透性的瞬时大量增加而防止神经脉冲的产生和传导。
[0119] 钠通道阻滞剂的实例包括但不限于氨布卡因、阿莫拉酮、戊卡因、奥布卡因(benoxinate)、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯(biphenamine)、布吡卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因、丁胺卡因、丁托西卡因、卡替卡因、氯普鲁卡因、可卡乙碱(cocaethylene)、可卡因、环美卡因、狄步卡因、奎尼卡因
(dimethisoquin)、二甲卡因、地哌冬(diperodon)、达克罗宁、ecogonidine、ecogonine、依替卡因、尤普罗辛(euprocin)、非那可明、福莫特卡因(formocaine)、海克卡因
(hexylcaine)、羟替卡因、对氨苯甲酸异丁酯、亮氨卡因、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因、甲哌卡因、甲丙胺卡因、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷、麦替卡因、纳依卡因(naepaine)、辛卡因、奥索卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、parenthoxycaine、芬那卡因(phenacaine)、苯酚、皮珀罗卡因(piperocaine)、哌啶卡因、聚多卡醇(polidocanol)、普莫卡因、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、假可卡因(pseudococaine)、吡咯卡因、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏(zolamine)，及其活性衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐，或其混合物。
(dimethisoquin)、二甲卡因、地哌冬(diperodon)、达克罗宁、ecogonidine、ecogonine、依替卡因、尤普罗辛(euprocin)、非那可明、福莫特卡因(formocaine)、海克卡因
(hexylcaine)、羟替卡因、对氨苯甲酸异丁酯、亮氨卡因、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因、甲哌卡因、甲丙胺卡因、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷、麦替卡因、纳依卡因(naepaine)、辛卡因、奥索卡因、奥昔卡因(oxethazaine)、parenthoxycaine、芬那卡因(phenacaine)、苯酚、皮珀罗卡因(piperocaine)、哌啶卡因、聚多卡醇(polidocanol)、普莫卡因、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、假可卡因(pseudococaine)、吡咯卡因、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏(zolamine)，及其活性衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐，或其混合物。
[0120] 本发明的生物相容性组合物还可以组合抗感染剂或与抗感染剂联合使用，抗感染剂包括具有抗感染活性的化合物、分子或药物(即，它们可以降低感染的风险，预防感染，或者抑制、阻止、对抗或以其它方式治疗感染)。在某些实施方案中，这些化合物、分子或药物在局部应用时具有抗感染活性。适用于本发明的抗感染剂包括但不限于防腐剂、抗微生物剂、抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、免疫刺激剂及其任何组合。
[0121] 抗病毒剂可存在于组合物中以预防病毒感染和/或减少某一部位的病毒滴度。合适的抗病毒剂包括RNA合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、免疫刺激剂和蛋白酶抑制剂。抗病毒剂可以例如选自阿昔洛韦、金刚烷胺盐酸盐、膦甲酸钠(foscarnet sodium)、更昔洛韦钠、苯酚、利巴韦林、阿糖腺苷(vidarabine)和齐多夫定。
[0122] 抗真菌剂可选自广泛种类的治疗剂。例如，乳酸(即，2-烃基丙酸)是已知抑制病原体生长的抗真菌剂。山梨酸(即，2,4-己二烯酸)是杀死白色念珠菌(Candida albicans)的天然抗真菌剂。其它抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、环吡酮、克霉唑(Clotrimazole)、恩康唑、益康唑、氟康唑、灰黄霉素、卤绿霉素(Halogropin)、内康唑(Introconazole)、酮康唑、咪康唑、萘替芬(Naftifine)、制霉菌素、奥昔康唑、硫康唑、噻苯咪唑、特比萘芬、托萘酯、十一碳烯酸、磺胺米隆、磺胺嘧啶银盐(Silver Sulfadiazine)和石炭酸-品红(Carbol-Fushsin)。
[0123] 抗生素和其它抗微生物剂可选自杆菌肽(bacitracin)；头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西(cefonicid)、头孢雷特(ceforanide)、头孢西丁、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松和美罗培南)；环丝氨酸；磷霉素(fosfomycin)、青霉素类(例如阿姆地诺西林、氨比西林、阿莫西林、阿洛西林(azlocillin)、巴卡米西林(bacamipicillin)、苄星青霉素G、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯唑西林、氨环己西林(cyclacillin)、双氯青霉素、甲氧西林
(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林和替卡西林)；利托菌素；万古霉素；多粘菌素E(colistin)；新生霉素；多粘菌素类(例如多粘菌素E、噻吗酯(colistimathate)和多粘菌素B)；氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、帕罗霉素、大观霉素、链霉素和妥布霉素)，四环素类(例如地美环素、多西环素、甲环素、米诺环素和土霉素)；碳青霉烯类(例如亚胺培南)；单内酰环类(例如氨曲南)；氯霉素；克林霉素；放线菌酮；梭链孢酸钠(fucidin)；林可霉素；嘌呤霉素；利福平；其它链霉素；大环内酯类(例如红霉素和竹桃霉素)；氟喹诺酮；放射菌素；乙氨丁醇(ethambutol)；5-氟胞嘧啶；灰黄霉素；利福霉素；磺胺类(例如磺胺乙胞嘧啶、磺胺嘧啶、碘胺异噁唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑和磺胺吡啶)和甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)。
(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林和替卡西林)；利托菌素；万古霉素；多粘菌素E(colistin)；新生霉素；多粘菌素类(例如多粘菌素E、噻吗酯(colistimathate)和多粘菌素B)；氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、帕罗霉素、大观霉素、链霉素和妥布霉素)，四环素类(例如地美环素、多西环素、甲环素、米诺环素和土霉素)；碳青霉烯类(例如亚胺培南)；单内酰环类(例如氨曲南)；氯霉素；克林霉素；放线菌酮；梭链孢酸钠(fucidin)；林可霉素；嘌呤霉素；利福平；其它链霉素；大环内酯类(例如红霉素和竹桃霉素)；氟喹诺酮；放射菌素；乙氨丁醇(ethambutol)；5-氟胞嘧啶；灰黄霉素；利福霉素；磺胺类(例如磺胺乙胞嘧啶、磺胺嘧啶、碘胺异噁唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑和磺胺吡啶)和甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)。
[0124] 其它合适的抗细菌剂包括但不限于含铋化合物(例如铝酸铋、次枸橼酸铋、次没食子酸铋(bismuth subgalate)和次水杨酸铋(bismuth subsalicylate))；硝基呋喃类(例如呋喃西林(nitrofurazone)、呋喃妥因和呋喃唑酮(furozolidone))；甲硝哒唑；替硝唑；尼莫唑(nimorazole)和苯甲酸。
[0125] 防腐剂可选自苯扎氯铵、氯己定、过氧化苯甲酰、过氧化氢、六氯酚、苯酚、间苯二酚和西吡氯铵。
[0126] 适用于本发明的组合物的免疫刺激剂可选自广泛种类的治疗剂，例如白介素1激动剂、白介素2激动剂、干扰素激动剂、RNA合成抑制剂和T细胞刺激剂。
[0127] 用于本发明的抗炎药是具有抗炎活性的化合物、分子或药物(即，它们可以预防或减少炎症的持续时间和/或严重程度；预防或减少组织损伤；和/或提供至少一种炎症表现如红斑、肿胀、组织缺血、发烧等的缓解)。在某些实施方案中，这些化合物、分子或药物在局部应用时具有抗炎活性。
[0128] 适用于本发明的抗炎药可选自广泛种类的甾体和非-甾体抗炎药。NSAID的例子可在上文找到。甾体抗炎药的例子包括但不限于二丙酸阿氯米松、氟尼松、氟替卡松、布地奈德、曲安奈德、醋酸曲安奈德、二丙酸倍氯米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、氢化可的松、可的松、地塞米松、糠酸莫米松、泼尼松、甲基强的松龙醋丙酯和泼尼松龙。
[0129] 作为替代或者补充，抗炎药可选自广泛种类的表现出抗氧化剂活性的化合物、分子和药物。抗氧化剂是可以防止或减少对组织的氧化损伤的药物。抗氧化剂可选自维生素A (视黄醛)、维生素B (3,4-二脱氢视黄醇)、维生素C (D-抗坏血酸、L-抗坏血酸)、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、维生素E (α-生育酚)、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、生育醌(tocoquinone)、生育三烯酚、丁羟茴醚、半胱氨酸，及其活性衍生物、类似物、前体、前药、药学上可接受的盐或混合物。
[0130] 本发明组合物中存在的治疗剂成骨因子、生长激素、镇痛剂、抗炎药的量可能取决于特定治疗剂推荐或允许的剂量以及所治疗的骨丢失类型和组合物中其他成分/组分的存在和性质而变化。在某些实施方案中，治疗剂存在的量是通过局部施用获得预期结果所需的普通剂量。此类剂量是药学或医学领域的熟练从业者已知或容易地确定的。
[0131] 在一些实施方案中，本发明的调整细胞培养基和生物相容性组合物通过混合药学上可接受的载体或赋形剂而配制成一种药物组合物。包含本发明的生物相容性组合物的药物组合物可根据一般制药实践配制(见例如，“雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”和“药学技术百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)”, J. Swarbrick，和J. C. Boylan (Eds.), Marcel Dekker, Inc: New York, 1988)。例如，“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或媒介，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将主题化学品从身体的一个器官或部分运送或运输至身体的另一器官或部分。每一载体必须在与制剂的其它成分相容且不损害受试者的意义上是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：
(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4) 粉状黄蓍胶；(5) 麦芽；(6) 明胶；(7) 滑石；(8) 赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9) 油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 琼脂；(14) 缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 藻酸；(16) 无热原水；(17) 等渗盐水；(18) 林格氏溶液；(19) 乙醇；(20) 磷酸盐缓冲溶液；和(21) 药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4) 粉状黄蓍胶；(5) 麦芽；(6) 明胶；(7) 滑石；(8) 赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9) 油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 琼脂；(14) 缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 藻酸；(16) 无热原水；(17) 等渗盐水；(18) 林格氏溶液；(19) 乙醇；(20) 磷酸盐缓冲溶液；和(21) 药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
[0132] 在一些实施方案中，调整细胞培养基可以单独使用，而不与生物相容性聚合物基质一起配制。在一些实施方案中，调整细胞培养基可与生物相容性聚合物基质一起用于制剂中。无论调整细胞培养基是单独使用还是与生物相容性聚合物一起使用，所产生的组合物都可以单独使用，例如直接施用于感兴趣的递送部位。或者，在一些实施方案中，无论调整细胞培养基是单独使用还是与生物相容性聚合物一起使用，所产生的组合物可与另外的基质材料一起和/或在另外的基质材料内用于制剂中。基质材料的选择基于生物相容性、生物降解性、力学性能、外观和界面性能。代表性的非限制基质包括可生物降解和化学限定的材料，包括硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它基质材料是可生物降解的和生物明确限定的，例如骨或真皮胶原。其它基质由纯蛋白质或细胞外基质成分构成。其它代表性的基质是不可生物降解的和化学限定的，如烧结羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可以由上述任何类型的材料的组合构成，如聚乳酸和羟基磷灰石，或者胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可以改变其组成，如磷酸铝酸钙，和加工来改变孔径、粒径、颗粒形状和生物降解性。不受理论的约束，相信用本发明所涵盖的生物相容性聚合物基质配制的调整细胞培养基，与没有生物相容性聚合物基质的调整培养基相比，由于生物相容性聚合物基质调节调整细胞培养基随时间推移的释放的能力，允许显著减少要使用的基质材料以导致骨生长(如总骨整合、垂直骨整合、横向骨整合等)和/或抑制骨吸收。例如，在一些实施方案中，与无生物相容性聚合物的组合物比较，对骨、包括与并置的骨和其它组织的接合(即骨整合)具有预期效果的组合物的能力，使用少至5%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、1/3、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，或之间的任何范围，包括所有在内，例如30%-40%即得到维持。
[0133] IV. 试剂盒在另一个方面中，本发明提供试剂盒，其包含本发明的生物相容性组合物或包含其的
药物组合物。在某些实施方案中，生物相容性组合物与至少一种治疗剂一起提供在试剂盒中。该至少一种治疗剂可分开提供或作为混合物提供。
药物组合物。在某些实施方案中，生物相容性组合物与至少一种治疗剂一起提供在试剂盒中。该至少一种治疗剂可分开提供或作为混合物提供。
[0134] 例如，试剂盒可包括两个分开的容器，第一个容器包含其生物相容性组合物，而第二个容器包含治疗剂或其组合物。或者，试剂盒可包括两个分开的容器，第一个容器包含包含生物相容性组合物和治疗剂的混合物或组合物，而第二个容器包含打算在使用前添加到第一个容器中以便获得即用型组合物的合适培养基。作为替代或补充，试剂盒可包括容器，其包含含有生物相容性组合物和治疗剂的混合物或组合物和工具(例如，牙刷、注射器、铲子)，所述工具将用来应用第一组合物的混合物或组合物。
[0135] 在某些实施方案中，各个容器(例如，小瓶、安瓿、烧瓶、瓶子、具有狭窄尖头的管)都维持紧密封闭以用于商业用途。
[0136] 试剂盒还可包括使用根据本发明的生物相容性组合物和治疗剂(和任何其它另外的药剂和试剂)的说明书。根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书可包括关于指征、优选的施用方式、优选的方案、优选的剂量、潜在副作用等方面的信息。试剂盒也可包括由政府机构(例如，FDA)规定的形式的公告，以规范药品的制造、使用或销售。标识符，例如条形码、射频、ID标签等，可以存在于试剂盒内或其上。例如，该标识符可用于唯一地标识该试剂盒，目的是为了质量控制、库存控制、跟踪工作站之间的移动等。在本发明的某些实施方案中，试剂盒可以按照如政府机构(例如，FDA)批准的药品所要求的良好制造惯例来制造。
[0137] 示例本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应该被解释为限制。
[0138] 实施例1：实施例2-3的材料和方法A. 体外研究
本研究采用人原代新生儿真皮成纤维细胞和人原代成骨细胞。对于成纤维细胞，大约
500毫升(mL)的含胎牛血清(FBS) (4.6% v:v)、GlutaMax™ (1.1% v:v)、重组人表皮生长因子(2.25微克)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(0.68微克)的DMEM基础细胞培养基。成骨细胞原代培养基含有大约500 mL总体积的、补充有抗坏血酸(2.75 mg)、GlutaMax™ (1% v:v)和FBS (9.8% v:v)的DMEM基础细胞培养基。
本研究采用人原代新生儿真皮成纤维细胞和人原代成骨细胞。对于成纤维细胞，大约
500毫升(mL)的含胎牛血清(FBS) (4.6% v:v)、GlutaMax™ (1.1% v:v)、重组人表皮生长因子(2.25微克)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(0.68微克)的DMEM基础细胞培养基。成骨细胞原代培养基含有大约500 mL总体积的、补充有抗坏血酸(2.75 mg)、GlutaMax™ (1% v:v)和FBS (9.8% v:v)的DMEM基础细胞培养基。
[0139] 加入成纤维细胞培养基(培养基A)和成骨细胞培养基(培养基B)以分别增殖成纤维细胞和成骨细胞，且细胞培养物在37℃、5% CO2的加湿室中持续温育24小时后收获。生成为成纤维细胞调整培养基和成骨细胞调整培养基的50:50混合物的调整细胞培养基(培养基C)。
[0140] B. 聚合物基质TM
聚合物基质包含浓度为1% w:v的超-低熔点琼脂糖(来自Lonza的SeaPrep 琼脂糖)，
琼脂糖最初溶解到代表产生最终的1% w:v浓度所需总体积的½的体积中，以将粉末形式完全溶解成温热的凝胶状态。在将该混合物冷却至低于37℃后，加入剩余的½体积的培养基C (调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物)并完全混合以充分结合所有成分。使溶于调整成纤维细胞/成骨细胞培养基的1% w:v超-低熔点琼脂糖的基质冷却至4℃，以帮助琼脂糖的聚合直至进一步的使用。
聚合物基质包含浓度为1% w:v的超-低熔点琼脂糖(来自Lonza的SeaPrep 琼脂糖)，
琼脂糖最初溶解到代表产生最终的1% w:v浓度所需总体积的½的体积中，以将粉末形式完全溶解成温热的凝胶状态。在将该混合物冷却至低于37℃后，加入剩余的½体积的培养基C (调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物)并完全混合以充分结合所有成分。使溶于调整成纤维细胞/成骨细胞培养基的1% w:v超-低熔点琼脂糖的基质冷却至4℃，以帮助琼脂糖的聚合直至进一步的使用。
[0141] C. 形态学将成骨细胞接种在6孔板上在基础成骨细胞生长培养基中过夜。将培养基吸出，并在加入各培养基之前，用dPBS洗涤粘附细胞。细胞生长另外24小时，然后用奥林巴斯CK2倒置显微镜(Olympus CK2 inverted microscope)以10X观察。
[0142] D. 细胞增殖试验CellTiter 96® 水性单溶液细胞增殖试验被用来确定24 hr和48 hr时间点的活细胞
数。简单地说，大约2 x 104个细胞被接种在96孔板上在原代成骨细胞生长培养基中过夜。
细胞播种24小时后，吸出生长培养基并用dPBS冲洗。吸出dPBS后，将100µl的各培养基添加到各孔中。试验时间点分别为加入各生长培养基后大约24 小时和48 小时。在490 nm处的吸光度被记录为细胞生长的函数。
数。简单地说，大约2 x 104个细胞被接种在96孔板上在原代成骨细胞生长培养基中过夜。
细胞播种24小时后，吸出生长培养基并用dPBS冲洗。吸出dPBS后，将100µl的各培养基添加到各孔中。试验时间点分别为加入各生长培养基后大约24 小时和48 小时。在490 nm处的吸光度被记录为细胞生长的函数。
[0143] E. 划痕试验将成骨细胞接种在6孔板上在基础成纤维细胞生长培养基中过夜。在每一个融合孔中，都使用移液器吸头进行物理分离。然后吸出基础培养基，随后用dPBS洗涤。然后，将各培养基加入到各孔中，并允许它们生长另外24 小时。使用奥林巴斯CK2倒置显微镜(Olympus CK2 inverted microscope)获取图像。
[0144] F. 体内研究所有动物实验均根据哥伦比亚大学ILAR对于实验室动物的护理和使用的指南以及美
国农业部执行的动物福利法案条例进行。根据动物福利法案条例的要求，所有实验程序均由IACUC批准。
国农业部执行的动物福利法案条例进行。根据动物福利法案条例的要求，所有实验程序均由IACUC批准。
[0145] 本研究共使用了8只犬。在每一个犬受试者中，总共使用了被定义为拔牙/植入部位的8个缺损。8个缺损如下分为2组：组1：垂直骨缺损(5 mm) + 4个植入物+骨移植；和组2：垂直骨缺损(5 mm) + 4个植入物+骨移植+ (生长因子; DentaPro：成纤维细胞/成骨细胞-调整培养基单独，没有如上在实施例1中所述的低熔点琼脂糖，PeriOSM：成纤维细胞/成骨细胞-调整培养基+如上在实施例1中所述的低熔点琼脂糖)。
[0146] 动物受试者共接受了一系列的3次手术。特别是，最初的手术包括拔牙后12周的愈合，以使拔牙窝完全愈合。随后又进行了第二次手术程序，以制造标准骨缺损(20 x 5 mm；长度x高度)，以及插入有或没有生长因子的骨植入物和骨移植材料(羟基磷灰石)。在4周和
8周时间点处死动物，测量植入后的插入/骨缺损，并通过显微计算机断层扫描(micro CT)和标准组织学过程进行分析。
8周时间点处死动物，测量植入后的插入/骨缺损，并通过显微计算机断层扫描(micro CT)和标准组织学过程进行分析。
[0147] 实施例2: 生物相容性组合物积极影响细胞为分析琼脂糖的旁分泌样效应，将1% w:v浓度的凝固琼脂糖切成1 cm直径盘。在6孔板的单个孔中，将含有PBS、未调整培养基或调整培养基的3个盘分别放置在一起，但在同一孔中彼此隔开，并允许在加入成骨细胞之前粘附。基础的、未调整成骨细胞培养基被添加以覆盖细胞，但确实取代了琼脂糖盘。允许细胞在37℃和5% CO2下生长24 小时。然后拍摄图像以观察各盘周围的细胞行为。
[0148] 含有调整培养基的凝固琼脂糖盘如下产生：简单地说，最初加热在代表产生最终的1% w:v浓度所需总体积的½的ddH2O体积中的琼脂糖，以便将粉末形式完全溶解成温热的凝胶状态。将该混合物冷却到低于37℃后，加入剩余的½体积的调整培养基，例如调整成纤维细胞和成骨细胞培养基的50:50混合物，并完全混合以充分结合所有成分。然后将溶于调整成纤维细胞/成骨细胞培养基的1% w:v超-低熔点琼脂糖的基质倒入皮氏培养皿(petri dishes)中至厚度高达1 cm。然后将培养皿冷却至4℃，以帮助琼脂糖的聚合直至进一步的使用。在使琼脂糖盘凝固后，分离出直径达1.5 cm的圆形盘，以供进一步实验。
[0149] 当未调整培养基与调整培养基比较时，细胞大小或形态没有明显的差异(图1)。DPBS的阴性对照与其它两种培养基(即未调整培养基和调整培养基)相比，之间有显著差异。
[0150] 根据基于荧光的试验，与未调整培养基和对照培养基比较，调整培养基导致最高水平的细胞增殖(图2)。
[0151] 与未调整培养基相反，成骨细胞调整培养基导致伤口愈合加速(图3)。
[0152] 注入有调整培养基的琼脂糖似乎会发挥更强的趋化作用，这可能是由于生长因子从基质中释放的被动扩散所致(图4)。就本文描述的生物相容性组合物的临床应用以及它们填充物理空隙(例如，在牙科植入物和相邻牙龈线之间)和刺激细胞向生物相容性组合物的聚合物基质迁移的能力而言，该特性代表重要的特征。随着聚合物基质的溶解，来自聚合物基质两侧的细胞会聚集在一起。
[0153] 实施例3：生物相容性组合物的体内牙周作用使用犬科动物模型进行了体内研究，以评价DentaPro和PeriOSM对新骨再生和牙科植
入物骨整合的作用，在动物模型中使用了右侧(对照)和左侧(实验)下颌前磨牙区。图5显示出，8周后与对照相比，使用DentaPro和PeriOSM的骨再生显著。类似地，图6显示了8周后植入物骨整合的结果(如骨生长和植入物-骨整合高度的差异)。特别是，图6证实，与对照相比，使用DentaPro和PeriOSM治疗均显示出显著的骨整合(圆形)。此外，与对照相比，DentaPro和PeriOSM均表现出显著的垂直骨整合(未标记条)。此外，与DentaPro和对照相比，尽管仅使用羟基磷灰石基质量的1/3，但PeriOSM出人意料地表现出轻微改善的垂直骨整合和显著的新的横向骨生长。
入物骨整合的作用，在动物模型中使用了右侧(对照)和左侧(实验)下颌前磨牙区。图5显示出，8周后与对照相比，使用DentaPro和PeriOSM的骨再生显著。类似地，图6显示了8周后植入物骨整合的结果(如骨生长和植入物-骨整合高度的差异)。特别是，图6证实，与对照相比，使用DentaPro和PeriOSM治疗均显示出显著的骨整合(圆形)。此外，与对照相比，DentaPro和PeriOSM均表现出显著的垂直骨整合(未标记条)。此外，与DentaPro和对照相比，尽管仅使用羟基磷灰石基质量的1/3，但PeriOSM出人意料地表现出轻微改善的垂直骨整合和显著的新的横向骨生长。
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