一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统
阅读：808发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，公开了一种以 真菌 操纵子为 基础 的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游 片段 、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，利用真菌操纵子基因间隔区序列连接目标基因，通过定点基因插入的方式将其插入到宿主细胞表达基因终止密码子的下游，利用靶基因的启动子完成目标基因的转录表达。该表达系统简化了实验操作步骤，提高了工作效率，增加了目标基因表达的可控性和 稳定性 ，降低了多基因异源表达对已知启动子多样性的要求，对于利用合成生物学进行天然产物的挖掘、产量的提高以及非天然化合物的创造等方面具有较高的实际应用价值。，下面是一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统专利的具体信息内容。
1.一种操纵子基因间隔区，其序列是5’-GAGTCAATCAAACACTC- 3’。
2.一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：
含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游片段、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，
其中所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：
5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’相对应，优选的是5’-
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
3.如权利要求2所述表达系统，其特征在于，在目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段之间还连接有筛选标记基因。
4.如权利要求2所述表达系统，其特征在于，所述目标基因是一个或多个，优选为2、3、4个。
5.如权利要求2所述表达系统，其特征在于，所述表达系统适合于真菌或植物，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。
6.含有权利要求1所述操纵子基因间隔区，或权利要求2至5任一项所述表达系统的重组菌或重组植株。
7.一种真菌操纵子基因间隔区在异源表达中的应用，其特征在于，所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：
5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’相对应，优选的是5’-
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述异源表达是真菌或植物，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。
9.如权利要求2至5任一项所述表达系统在表达异源基因中的应用，其特征在于，其是将所述表达系统转化到宿主中，实现异源基因的表达。
一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统
技术领域
背景技术
[0002] 天然产物是现代药物创制的重要来源。然而，目前利用传统的筛选技术获得具有实用价值的新结构天然产物的难度越来越大，另外还有一部分已知的活性天然产物来源稀缺、天然含量低、组份复杂且难以完全分离。基因组测序技术的发展和天然产物合成途径的解析，为通过异源生物合成技术生产这些有价值的天然产物提供了可能。合成生物学技术以其“跨物种”转移功能元件以及模块的能力，逐渐成为解决这些问题的主要手段。目前，在基因组测序的基础上，利用合成生物学的方法已完成青蒿素前体青蒿酸、阿片类药物等重要活性天然产物在细胞工厂中的生产。
[0003] 酿酒酵母、构巢曲霉等真菌底盘细胞的遗传背景清楚，遗传操作相对于其它真核生物更为简单。与大肠杆菌、放线菌等原核生物类底盘细胞相比，来源于真核生物的生物合成酶在真菌中更容易成功表达并发挥其催化作用。在真菌中，基因是受独立调控并转录成单顺反子mRNA的，因此外源基因在其中的表达也需要以启动子-基因-终止子的模块形式进行。然而，天然产物的合成通常涉及到多基因的表达，这就需要为每一个基因提供单独的启动子和转录终止子，从而致使实验操作繁复、目标DNA片段过长。尤其是在目前可供选择的启动子数量有限的情况下，多基因的表达常常需要同一启动子和终止子的重复使用，这极大的增加了转化子内部基因同源重组的概率。
[0004] 2015年，首次在真菌中发现了操纵子结构。Yue等（Yue Q, Chen L, Li Y, Bills G, Zhang X, Xiang M, Li S, Che Y, Wang C, Niu X, An Z, Liu X. 2015. Functional operons in secondary metabolic gene clusters in Glarea lozoyensis (Fungi, Ascomycota, Leotiomycetes). mBio6:e00703-15.）在重要抗真菌药物棘白菌素的产生菌Glarea lozoyensis中识别并鉴定了真菌操纵子glpks3-glnrps7，其基因间隔区为26 bp，二者在共同转录成1条成熟的双顺反子mRNA后直接翻译成2个蛋白。若将操纵子结构应用于真菌中多基因的异源表达，这将极大的降低目标DNA片段的长度，减少实验操作步骤，提高工作效率。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，它利用真菌操纵子基因间隔区序列连接目标基因，通过基因插入的方式将其插入到宿主细胞表达基因终止密码子的下游，在不破坏原有基因（即靶基因）表达的情况下，利用靶基因的启动子完成目标基因的转录表达。
[0007] 本发明提供的技术方案是：一种操纵子基因间隔区，其序列是5’-GAGTCAATCAAACACTC- 3’。
[0008] 一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，其包括顺序连接的序列：含终止密码子的宿主靶基因终止密码子上游片段、真菌操纵子基因间隔区、目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，
其中所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：
5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’相对应，优选的是5’-
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
其中所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：
5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’相对应，优选的是5’-
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
[0009] 所述表达系统：在目标基因、宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段之间还连接有筛选标记基因；所述目标基因是一个或多个，优选为2、3、4个。
[0011] 本发明还提供一种含有所述操纵子，或所述表达系统的重组菌或重组植株。
[0012] 本发明还提供一种真菌操纵子基因间隔区在异源表达中的应用，所述真菌操纵子基因间隔区具有下述序列：5’-CAATCAAAC-3’，或其5’端增加1至8个核苷酸，3’端增加1至9个核苷酸，其中增加核苷酸与5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’相对应，优选的是5’-
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’、 5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
[0013] 上述的应用，所述异源表达是真菌或植物，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。
[0014] 同时，本发明还提供所述表达系统在表达异源基因中的应用，其是将所述表达系统转化到宿主中，实现异源基因的表达。
[0015] 具体而言，本发明的实施方案如下。
[0016] 1）真菌操纵子基因间隔区序列的确定。原始序列为5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG-3’，基本序列为5’-CAATCAAAC-3’。优选序列为5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’。
[0017] 2）根据真菌操纵子基因间隔区序列、目标基因序列、筛选标记基因序列和宿主靶基因序列设计引物，通过PCR对目标基因、宿主靶基因终止密码子的上下游片段和筛选标记基因进行扩增，进一步通过无缝克隆（或融合PCR）进行连接与克隆（或扩增），最终通过PCR获得含有宿主靶基因终止密码子上游片段（含终止密码子）-真菌操纵子基因间隔区-目标基因-筛选标记基因-宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段。
[0018] 3）通过转化将获得的DNA片段转入宿主细胞中，进行目标基因的定点插入。
[0019] 4）通过PCR对获得的转化子进行筛选，获得表达目标基因的阳性转化子。
[0020] 本发明的外源基因表达系统可用于真菌、植物等真核生物基因的异源表达，对于利用合成生物学进行天然产物的挖掘、产量的提高以及非天然化合物的创造等方面具有较高的实际应用价值。
[0021] 本发明的外源基因表达系统无需为目标基因单独提供启动子和转录终止子，在不破坏宿主细胞原有基因表达的情况下，可以将目标基因插入到宿主任一基因的下游，利用靶基因的启动子和终止子即可控制目标基因的转录表达。不仅简化了实验操作步骤，提高了工作效率，而且极大的增加了目标基因表达的可控性和稳定性，降低了多基因异源表达对已知启动子多样性的要求，极大的降低了目标DNA片段的长度。附图说明
[0022] 图1以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统的构建策略示意图。
[0023] 图2 真菌操纵子基因间隔区的比较，其中（A）真菌操纵子基因间隔区序列和二级结构；（B）基因间隔区序列对下游基因表达的影响。
[0024] 图3 LtLasS1和 LtLasS2和HsOMT异源表达转化子中的DLD及其甲基化产物的生产。
具体实施方式
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0026] 载体pJET1.2/blunt Cloning Vector：购自Thermo Scientific公司。
[0027] 酿酒酵母BJ5464：MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1 trp1 pep4::HIS3 prb1 Δ1.6R can1 GAL。美国模式培养物集存库（ATCC，网址为www.atcc.org/），ATCC编号为208288。
[0028] 酶与试剂盒：高保真DNA扩增MIX、无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司；
DNA loading buffer和DNA marker购自康为世纪公司；
DNA纯化胶回收试剂盒购自康宁公司；
冷冻酵母转化试剂盒购自YMO RESEARCH生物公司；
大肠杆菌DH5α感受态购自康为世纪公司；
液相检测用试剂为色谱纯，其它试剂均为国产分析纯产品 。
DNA loading buffer和DNA marker购自康为世纪公司；
DNA纯化胶回收试剂盒购自康宁公司；
冷冻酵母转化试剂盒购自YMO RESEARCH生物公司；
大肠杆菌DH5α感受态购自康为世纪公司；
液相检测用试剂为色谱纯，其它试剂均为国产分析纯产品 。
[0029] 培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）。SC--Trp或SC--Trp/-Leu或SC--Trp/-Leu/-ura缺陷培养基（1%葡萄糖、6.7%DifcoTM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids、-Trp或-Trp/-Leu或-Trp/-Leu/-ura DO Supplement）。YPD低糖培养基（1%酵母膏、2% Peptone蛋白胨、1%葡萄糖）。若制固体培养基，加入2%琼脂粉。
[0030] 实施例1、真菌操纵子序列间隔区的比较1.实验目的
以营养缺陷型酿酒酵母BJ5464-NpgA为底盘细胞，以本研究团队前期报道的糖基转移酶-甲基转移酶模块编码基因BbGT和BbMT为报告基因（Xie L, Zhang L, Wang C, Wang X, Xu YM, Yu H, Wu P, Li S, Han L, Gunatilaka AAL, Wei X, Lin M, Molnar I, Xu Y.
2018. Methylglucosylation of aromatic amino and phenolic moieties of drug-like biosynthons by combinatorial biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 115:
E4980-E4989.），针对26 bp基因间隔区原始序列设计碱基替换或缺失，通过液相色谱检测阳性转化子中BbGT和BbMT对底物的糖甲基化效率，阐明基因间隔区序列中影响下游基因翻译的基序或二级结构等关键要素。
以营养缺陷型酿酒酵母BJ5464-NpgA为底盘细胞，以本研究团队前期报道的糖基转移酶-甲基转移酶模块编码基因BbGT和BbMT为报告基因（Xie L, Zhang L, Wang C, Wang X, Xu YM, Yu H, Wu P, Li S, Han L, Gunatilaka AAL, Wei X, Lin M, Molnar I, Xu Y.
2018. Methylglucosylation of aromatic amino and phenolic moieties of drug-like biosynthons by combinatorial biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA 115:
E4980-E4989.），针对26 bp基因间隔区原始序列设计碱基替换或缺失，通过液相色谱检测阳性转化子中BbGT和BbMT对底物的糖甲基化效率，阐明基因间隔区序列中影响下游基因翻译的基序或二级结构等关键要素。
[0031] 2.实验方法：（1）BbGT和BbMT异源表达盒的构建
根据26 bp基因间隔区原始序列（5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’）的信息，设计一系列含有点突变或片段缺失的特异性引物，通过融合PCR将其与基因BbGT、BbMT相连，之后与ADH2的转录终止子、trp1的启动子及基因顺序相连，并在第一个基因BbGT的上游连接酿酒酵母葡萄糖苷酶基因EXG1的部分上游片段，在trp1基因的下游添加EXG1的下游片段，最终获得一系列4.2 kb左右的拥有不同基因间隔区序列的BbGT和BbMT异源表达盒。
根据26 bp基因间隔区原始序列（5’-TGTTGAGTCAATCAAACACTCAACAG- 3’）的信息，设计一系列含有点突变或片段缺失的特异性引物，通过融合PCR将其与基因BbGT、BbMT相连，之后与ADH2的转录终止子、trp1的启动子及基因顺序相连，并在第一个基因BbGT的上游连接酿酒酵母葡萄糖苷酶基因EXG1的部分上游片段，在trp1基因的下游添加EXG1的下游片段，最终获得一系列4.2 kb左右的拥有不同基因间隔区序列的BbGT和BbMT异源表达盒。
[0032] （2）酵母转化按照冷冻酵母转化试剂盒说明书，将异源表达盒转入酿酒酵母中。通过PCR对获得的酵母转化子进行验证。将获得的阳性酵母转化子划线培养在新的SC--Trp缺陷培养基上，于30 ℃培养箱中培养2天左右。
[0033] （3）发酵培养采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至10 mL SC--Trp液体缺陷培养基中，30 ℃、200 rpm培养 16 h左右，再加入等体积YPD低糖培养基，同时加入溶于甲醇的0.2 mg山奈酚纯品继续培养48 h；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1；旋转蒸发后获得干燥萃取物，1 mL甲醇复溶萃取物。
[0034] （4）液相色谱（LC）检测：取1 mL上述所得发酵产物经高速离心和0.22 µm滤膜过滤后，用超高效液相色谱检测。
[0035] 液相色谱分析仪器为Agilent公司1290超高效液相色谱，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD column (1.8 µm, 50 mm x 2.1 mm)；流动相总流速为0.35 mL min-1；流动相为流动相A和流动相B的混合物，流动相A为0.1%（体积比）甲酸水溶液、流动相B为0.1%（体积比）甲酸乙腈；总洗脱时间为10分钟；洗脱过程为：0～4 min，流动相B占流动相的体积比由10%线性上升至50%，4～8 min流动相B占流动相的体积比由50%线性上升至95%，8～9.3 min流动相B占流动相的体积比为95%，9.3～10 min流动相B占流动相的体积比由95%线性下降至10%；柱温40 ℃，样品的进样量为2 μL，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。
[0036] 3.实验结果及分析：通过LC检测发现，不同基因间隔区序列会影响下游基因的表达，即影响到相应酵母转化子对底物山萘酚的糖甲基化效率（图2）。与转入原始序列的酵母转化子相比，基因间隔区仅保留环状结构即5’-CAATCAAAC-3’（图2中的（2）号序列）时的山萘酚糖甲基化效率未有显著性变化，当序列进一步缩短时，山萘酚则无法进行糖甲基化，说明（2）号序列是下游基因表达的基本序列即为5’-CAATCAAAC-3’。除了（2）号序列内4号位的T变为A外，其序列内部的点突变多导致山萘酚糖甲基化效率的急剧下降或消失，说明（2）号序列内的碱基是下游基因表达的关键碱基。当基因间隔区为5’- GAGTCAATCAAACACTC-3’（图2中的（4）号序列）时，山萘酚糖甲基化效率显著提高 ，因此我们选择其作为优选序列，即5’-
GAGTCAATCAAACACTC-3’。
GAGTCAATCAAACACTC-3’。
[0037] 实施例2、以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统在desmethyl-lasiodiplodin (DLD)及其甲基化产物生物合成途径重构中的应用。
[0038] 1.实验目的以营养缺陷型酿酒酵母BJ5464-NpgA为底盘细胞，以优选序列作为基因间隔区，利用以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统，重构本发明人研究团队前期发现的DLD及其甲基化产物的生物合成途径（Xu Y, Zhou T, Espinosa-Artiles P, Tang Y, Zhan J, Molnar I. 2014. Insights into the biosynthesis of 12-membered resorcylic acid lactones from heterologous production in Saccharomyces cerevisiae. ACS Chem Biol 9:1119-1127. Wang X, Wang C, Duan L, Zhang L, Liu H, Xu YM, Liu Q, Mao T, Zhang W, Chen M, Lin M, Gunatilaka AAL, Xu Y, Molnar I. 2019. Rational reprogramming of O-methylation regioselectivity for combinatorial biosynthetic tailoring of benzenediol lactone scaffolds. J Am Chem Soc 141:4355-4364.），通过LC检测阳性转化子中产生的DLD及其甲基化产物。
[0040] 选择酿酒酵母中的表达基因FBA1、TDH3和EXG1作为靶基因，根据LtLasS1、 LtLasS2、FBA1、TDH3和EXG1以及基因间隔区优选序列的信息，设计特异性引物，通过PCR获得相应片段后，通过多片段无缝克隆将片段连接到pJET1.2/blunt Cloning Vector，通过对阳性克隆的菌落PCR获得宿主靶基因终止密码子上游片段（含终止密码子）-真菌操纵子基因间隔区-目标基因-筛选标记基因-宿主靶基因终止密码子下游片段的DNA片段，即：uFBA1-（4）号序列-LtLasS1-Trp1-dFBA1、uTDH3-（4）号序列-LtLasS2-Leu2-dTDH3和uEXG1-（4）号序列-LtLasS2-Ura3-dEXG1。
[0041] （2）酵母转化按照冷冻酵母转化试剂盒说明书，将LtLasS1和 LtLasS2或LtLasS1、LtLasS2和HsOMT的异源表达盒共转入酿酒酵母中。通过PCR对获得的酵母转化子进行验证。将获得的阳性酵母转化子划线培养在新的SC--Trp/-Leu或SC--Trp/-Leu/-ura缺陷培养基上，于30 ℃培养箱中培养2天左右。
[0042] （3）发酵培养采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至10 mL SC--Trp/-Leu或SC--Trp/-Leu/-ura 液体缺陷培养基中，30 ℃、200 rpm培养 16 h左右，再加入等体积YPD低糖培养基继续培养48 h；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1；旋转蒸发后获得干燥萃取物，1 mL甲醇复溶萃取物。
[0043] （4）液相质谱检测：同实施例1中液相色谱检测步骤。
[0044] 3.实验结果及分析：本发明人通过LC在表达LtLasS1和 LtLasS2的酵母阳性转化子中成功检测到DLD，并在LtLasS1、LtLasS2和HsOMT的异源表达阳性转化子中成功检测到5-氧甲基-DLD（图3）。这是以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统在多基因异源表达上的成功应用，也是该系统在组合生物合成上的成功应用。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 熊果酸吗啉盐和熊果酸二乙醇胺盐 | 2020-05-11 | 63 |
| 有效抗细菌和真菌的抗微生物组合物 | 2020-05-11 | 551 |
| 三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用 | 2020-05-11 | 97 |
| 药物递送组合物 | 2020-05-11 | 655 |
| 一种食线虫真菌分离株次级代谢产物及粗提物和医用用途 | 2020-05-11 | 855 |
| 乙烯基共轭的吲哚氨基噻唑类化合物及其制备方法和应用 | 2020-05-12 | 597 |
| 细胞表面修饰的方法 | 2020-05-11 | 745 |
| 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法 | 2020-05-11 | 728 |
| 腙基桥连的萘酰亚胺咪唑类化合物及其制备方法和应用 | 2020-05-12 | 938 |
| 蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用 | 2020-05-12 | 792 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈