对虾白斑综合征病毒VP292多肽与应用
阅读：998发布：2020-05-11
专利汇可以提供对虾白斑综合征病毒VP292多肽与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 利用对虾 白斑综合征病毒 (WSSV)基因表达技术，获得一种对虾白斑杆状病毒WSV237基因编码的蛋白起名VP292。本发明还涉及VP292的生产方法，VP292多核苷酸和多肽的应用以及与VP292多肽特异性结合的 抗体 。对该基因及其表达产物的抑制可能是防治对虾白斑病的有效途径之一，有望运用于对虾白斑病的防治。，下面是对虾白斑综合征病毒VP292多肽与应用专利的具体信息内容。
对虾白斑综合征病毒VP292多肽与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因生物工程技术领域。具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒VP292的核苷酸序列，还涉及由该核苷酸序列编码的一种多肽。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。
背景技术
[0002] 对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSSV是双链DNA病毒，基因组全长305Kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J Virol.2001，75：11811-11820)。基因组序列遗传及形态学特征都表明WSSV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族，因此国际病毒分类委员会将WSSV归属为新的Whispovirus属，Nimaviridae种(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。由于这是一个全新的病毒，而且WSSV基因组较大，所以绝大多数WSSV病毒结构蛋白与其他病毒没有同源性，因此这些蛋白的功能无法通过与其他病毒蛋白的同源性分析进行预测，因而使WSSV功能研究具有极大的难度。已有20余个基因初步确证其功能，尚有许多基因的功能未知。目前还难以对WSSV进行预防和控制，一方面由于WSSV能在自然环境中存活长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解还很少。
[0003] 已有研究表明，虽然对虾等无脊椎动物没有类似于脊椎动物的适应性免疫系统，但最新的研究发现，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。Witteveldt，J等人首先用pET28原核表达载体表达VP28蛋白用于制备亚单位疫苗，试验结果效果很 好 (Witteveldt，J.，Cifuentes，C.C.，Vlak，J.M.，van Huhen，M.C.W.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oralvaccination.J Viro1.2004.78(4)：2057-2061)。贾启军(贾启军，孟小林，徐进平等.对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用.2006，21(6)：585-588)等人用WSSV囊膜蛋白VP19免疫螯虾，证实了VP19也可以作为亚单位疫苗应用于预防WSSV。鉴于VP28和VP19都对白斑综合症病毒有很好的防治效果，有些研究人员着手研究是否其他的一些结构蛋白也可以对白斑综合症病毒产生免疫的效果。而结果也证实了当初的设想，已经证实的如VP37，VP187都可以有效地抑制白斑综合症病毒的感染(Qing-hui Liu，Xiu-LiZhang，Cui-Yan Ma，Yan Liang，Jie Huang.VP37 of white spot syndrome virus interactwith shrimp cells.Letters in Applied Microbiology.2009.48：44-50；Deng-Feng Li，Ming-Chang Zhang，Hai-Jie Yang，Yan-Bing Zhu，Xun Xu，β-integrin mediatesWSSV infection.Virology.2007368：122-132)。
[0004] 由于WSSV具有广泛的宿主范围，在甲壳纲和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主，以虾、蟹等十足目类为多。目前，普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或浸泡感染)及垂直传播两种传播途径，可独立在动物中流行，因此难于在短期内彻底消除。而WSSV为暴发性传染病，该病感染率和死亡率都极高，所以研究针对WSSV的全新预防用的安全有效疫苗，实数当务之急。基因工程疫苗技术是一项新兴的具有应用前景的生物技术，对WSSV囊膜蛋白的表征为发展免疫途径预防WSSV感染提供技术方法。
发明内容
[0005] 本发明中的编码VP292序列是如此获得的。以纯化的WSSV基因组DNA作为模板。根据WSV237序列设计合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作为引物，经PCR扩增获得了WSV237的部分序列SED ID No.1的序列。然后通过重组表达WSV237基因，纯化WSV237基因的表达产物，动物活体实验分析其在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的VP292序列。
[0006] 本发明的目的是提供一种新的WSSV多肽，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳，该多肽是具有SEQID No.1序列的多肽。此蛋白被命名为VP292。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的VP292的方法。
[0008] 本发明还提供了VP292的应用，即蛋白疫苗，其含有VP292编码序列，以及药学上可接受的载体。更明确的，本发明的这种疫苗含有SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列或其衍生序列。
[0009] 此外，本发明的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗，对甲壳动物进行接种，以抗WSSV感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗，以及药学上可接受的载体。
[0010] 在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为876个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.1，其中开放阅读框位于1-876位核苷酸。
[0011] 另一方面，本发明还包括对VP292DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用的多克隆抗体、单克隆抗体及其它能抑制VP292基因产物或片段。
[0012] 本发明的技术方案如下：
[0013] 1.WSSV-VP292基因的制备：
[0014] (1)采用酚-氯仿法提取DNA。取400μl纯化的病毒液，加入DNA抽提缓冲液5.3μl，0.5mol/L的EDTA(pH8.0)106.7μl，胰RNA酶6.5ul和10％SDS 28μl，37℃下温育1h。加入蛋白酶K(20mg/ml)4μl，50℃孵育3-4h。用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，收集DNA，用TE缓冲液稀释DNA至100μg/ml，用于PCR反应的模板。
[0015] (2)PCR扩增VP292基因：以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP292。PCR反应条件为：20μl反应体系中含双蒸水14μL，2.5μL 10x PCR buffer，0.5μL25mmol/L MgCl2，1μL dNTPs，上、下游引物各0.5μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/L)，0.5μL模板。PCR反应条件：94℃10min，94℃30s，51.0℃30s，72℃1min(8个循环)，94℃30s，56.2℃30s，
72℃1min(30个循环)，72℃10min。取2μl PCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物应在约876bp处有一条扩增带。
72℃1min(30个循环)，72℃10min。取2μl PCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物应在约876bp处有一条扩增带。
[0016] 2.重组体的构建：
[0017] (1)表达载体的构建：用XhoI和Hind III对VP292基因片段和质粒pBAD/gIIIA进行双酶切，酶切体系见下表，酶切条件为：37℃水浴2h，65℃加热5min，等体积酚：氯仿抽提，无水乙醇沉淀DNA。纯化的酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组载体质粒，进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定。
[0018] 质粒的双酶切体系：
[0019]
[0020] (2)目的产物VP292的表达：挑重组体单菌落接种到含50μg/ml Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃培养8～10h，之后按1％接种到新鲜的LB(含50μg/mlAmp)液体培养基中，37℃培养到OD值为0.6时加终浓度为0.4mmol/L的阿拉伯糖诱导，10000g，4℃，离心10min，收集菌体，用10mM PBS(pH 8.0)重悬菌体，超声破碎，离心收集上清和沉淀。将收集的上清和沉淀，进行SDS-PAGE和Western-blot。
[0021] (3)纯化VP292：以优化后的条件扩大培养重组基因工程菌，超声波破碎后，离心(10000g，4℃，10min)将得到的裂解物沉淀收集，镍琼脂糖凝胶装柱，用缓冲液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)平衡2-5个床体积，将收集的沉淀重悬(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样流速1ml/min，选择在50mM的咪唑缓冲液的阶段选择洗脱，收集。
[0022] 3.动物活体实验分析VP292在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用：将表达的VP292多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵，挑选体重2-5g的健康的凡钠缤对虾，随机分为3个处理组，(a.VP292组，b.阳性对照组，c.阴性对照组)，各实验组分别投喂各种饲料，连续喂7天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾，记录各组死亡率。
[0023] 在本发明中，术语“编码VP292序列”是指编码具有WSV237蛋白多肽的核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
[0024] 该术语还包括能编码具有与VP292相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些形式包括：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳的5个以内)核苷酸。
[0025] 在本发明中，“纯化”VP292是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。
[0026] 在本发明中，术语“VP292”指具有基因调控活性的SEQ ID NO.2的多肽。该术语还包括具有基因调控功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为30个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VP292多肽的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与WSV292DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗VP292多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含VP292多肽或片段的融合蛋白。
[0027] 在本发明中，术语“WSSV感染抑制”是指在易感对虾白斑综合征病毒(WSSV)的动物中，WSSV感染的发生率和严重程度的降低，如降低动物死亡数量。如果相对于对照群体，VP292降低感染性至10％，通常至少20％，较好至少50％或更高时即达到WSSV感染抑制。
[0028] 在本发明中，术语“甲壳动物”，通常指“虾”，“螃蟹”和“龙虾”甲壳动物。
[0029] 本发明还提供VP292蛋白多肽的类似物，这些类似物与天然VP292多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传突变体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如-氨基酸)类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。
[0030] 本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
[0034] G，Gly：苷氨酸；A，Ala：丙氨酸；V，Val：缬氨酸；L，Leu：亮氨酸；I，Ile：异亮氨酸；S，Ser：丝氨酸；T，Thr：苏氨酸；C，Cys：半胱氨酸；M，Met：甲硫氨酸；E，Glu：谷氨酸；D，Asp：天门冬氨酸；K，Lys：赖氨酸；R，A：g：精氨酸；H，His：组氨酸；F，Phe：苯丙氨酸；Y，Tyr：酪氨酸；W，Trp：色氨酸；P，Pro：脯氨酸；N，Asn：天冬酰胺；Q，Gin：谷酰胺。
附图说明
[0035] 图1 PCR扩增WSSV-VP292
[0036] 图1说明如下：Lane 1：VP292gene；Lane-M：DNA marker.
[0037] 图2重组质粒的双酶切核酸电泳图
[0038] 图2说明如下：Lane1：DNAMarker DL15000，Lane 2：重组质粒双酶切，Lane 3：重组质粒，Lane 4：DNA Marker DL2000.
[0039] 图3重组VP292及表达纯化的SDS-PAGE图谱
[0040] 图3说明如下：1，阿拉伯糖诱导的空载质粒菌株；2，，3重组质粒包涵体上清；4和5，重组质粒包涵体沉淀；M，Marker；
[0041] 图4 Westem-bloting分析表达的VP292
[0042] 图4说明如下：1，重组质粒包涵体沉淀，Lane 2：重组质粒包涵体上清，Lane 3：空载体对照
具体实施方式
[0043] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0044] 实施例1WSV254基因片段的克隆和测序
[0045] 以WSSV基因组DNA为模板，用引物P1、P2扩增WSV237基因部分片段。
[0046] P1：5’-TTACTCGAGATGTTGTTTGATTTCT-3；
[0047] P2：5’GACAAGCTTTAATACGGGACCT-3’；
[0048] 划线部分CTCGAG为Xhol酶切位点，AAGCTT为HindIII酶切位点，
[0049] PCR反应条件为：
[0050] 94℃ 10分钟
[0051] 94℃ 30秒
[0052] 44.2℃ 30秒
[0053] 72℃ 1分钟(8个循环)
[0054] 94℃ 30秒
[0055] 51.7℃ 30秒
[0056] 72℃ 1分钟(30个循环)
[0057] 72℃ 10分钟
[0058] 琼脂糖凝胶电泳纯化扩增片段后，克隆到原核表达质粒载体pBAD/gIIIA，获得重组表达质粒pBAD/gIIIA-rVP292，进行测序，测序所得WSV237部分基因序列详见SEQIDNo.1.
[0059] 根据得到的核苷酸序列推导出的WSV237的氨基酸序列，共292个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQIDNo.2.
[0060] 实施例2重组VP292片段的表达与纯化
[0061] 将含有WSV237基因的重组表达质粒pBAD/gIIIA-VP292转化大肠杆菌TOP10，选取阳性克隆在含100mg/L氨苄霉素的LB培养基中37℃摇培至OD600＝0.6时，加入L-阿拉伯糖至终浓度0.2％，37℃诱导5h后收集菌体。加入冰冷的裂解缓冲液(1×PBS，10mMNaHPO4，140mMNaCl，2.7mM KCL，1.8mMKH2HPO4)，超声裂解细菌(300W×10s×10次)，4℃15,000rpm离心20min，装镊柱(Ni-nitriloacetic acid resins)，用5-10个柱床体积的洗涤缓冲液(1×PBS)洗去杂蛋白；洗脱缓冲液(50mM Tris-HCL，100mM，咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。
用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白的分子量约为12.09kD，纯度达90％以上。结果见图1。
用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白的分子量约为12.09kD，纯度达90％以上。结果见图1。
[0062] 实施例3重组VP292片段的抗体制备
[0063] 将实施例2中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用0.25-0.5mg/mL乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射，每只0.2mL。2周后用不完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的相同抗原再注射以加强免疫产生抗体，之后每隔10天加强免疫一次，至少进行2次。分析所获抗血清的滴度和特异性。
[0065] 实施例4：使用VP292蛋白片段对WSSV感染的抑制
[0066] (1)药饵制作：将表达的VP292多肽片段以2-5％(W/W)的比例均匀加入普通饵料中制成药饵，晾干后封存，备用。
[0067] (2)实验动物分组：a.VP292组，b.阳性对照组，投喂普通饵料；c.阴性对照组，投喂普通饵料。挑选体重2-5g的健康凡纳滨对虾，随机分为3个处理组，每个实验组3个重复，每组20尾，实验前暂养7天。
[0068] (3)动物实验：各实验组分别投喂各种饲料，连续喂7天，然后分别投喂(除阴性对照组外)WSSV感染致死的剪碎螯虾，记录各组死亡率。
[0069] 在22-26℃条件下的养殖结果显示，VP292蛋白组的对虾感染7d后的累积死亡率为80％，阳性对照组的对虾在感染7天后累积死亡率达到100％，阴性对照组对虾无任何死亡现象。
[0071] 1.1.SEQ ID No.1的信息
[0072] (1)序列特征：
[0073] 长度：876bp
[0074] 类型：核酸
[0075] 链性：双链
[0076] 拓扑结构：线性
[0077] (2)分子类型：DNA
[0078] (3)序列描述：SEQ ID No.1
[0079] 1 atgttgtttg atttctttct aaaaatggct gctgcaaaaa tggacgctat ccttgcggat[0080] 61 attaatggga atgatacaga tttatccaag ctaatcacag acgtgattca aaagagagcc[0081] 121 aaggctgtca tggatagaaa tagggctaaa atggacatga atagaagagt agatgaggct[0082] 181 attcaggaag ccgtagcggc caagaaacaa aaagcattag tggtatttga taaactcgtg[0083] 241 gaagaaactg acagcggaca aagtgtccct ccaacattat cgggatccga ttacgacgcg[0084] 301 tgggtagaca gagccatgcc ttcgcatatt gaacttgtag agagtgttga gggagattct[0085] 361 ttgtatgata aactccctcc ttttaacgta caagacatag acgaccaaat cggtgatgag[0086] 421 atagatacac caatatctta ccttgccatg gtagtggtaa aagtcgactg tgaaactggg[0087] 481 gatatcgaag aagagtacaa tcttgctcct acctttggtg tgacacaaaa taataaaata[0088] 541 tacagagatg aaagagacca gatttttaca aaggctgata aatctgtgcg tatttttaaa[0089] 601 cttgctaaat tggatagtat atcaggtaaa agtagacaac tgacgtatgc ggtaaaaaat[0090] 661 aacaatgaat atacagagtt tgtctgtagc gtctttgcag agtttgaatc tgacagtgac[0091] 721 actactaaat caggtatagg tattcgtgaa tatgacaaac ctaaaaatga attcgaatat[0092] 781 gaggagcgag agatctttac attttttatt ccaatacaac ccgcagggac gaaattattg[0093] 841 ttatactttt tggtggacgt caggtcccgt attatatag
[0094] 2.SEQ ID No.2的信息
[0095] (1)序列特征：
[0096] 长度：292个氨基酸
[0097] 类型：氨基酸
[0098] 拓扑结构：线性
[0099] (2)分子类型：蛋白质
[0100] (3)序列描述：SEQ ID No.2
[0101] 1 mlfdfflkma aakmdailad ingndtdlsk litdviqkra kavmdmrak mdmnrrvdea[0102] 61 iqeavaakkq kalvvfdklv eetdsgqsvp ptlsgsdyda wvdrampshi elvesvegds[0103] 121 lydklppfnv qdiddqigde idtpisylam vvvkvdcetg dieeeynlap tfgvtqnnki[0104] 181 yrderdqift kadksvrifk lakldsisgk srqltyavkn nneytefvcs vfaefesdsd[0105] 241 ttksgigire ydkpknefey eereiftffi piqpagtkll lyflvdvrsr ii
[0106] 3.SEQ ID No.3的信息
[0107] (1)序列特征
[0108] A.长度：25bp
[0109] B.类型：核酸
[0110] C.链性：单链
[0111] D.拓扑结构：线性
[0112] (2)分子类型：寡核苷酸
[0113] (3)序列描述：SEQ ID No.3
[0114] TTACTCGAGATGTTGTTTGATTTCT
[0115] 4.SEQ ID No.4的信息
[0116] (1)序列特征
[0117] E.长度：22bp
[0118] F.类型：核酸
[0119] G.链性：单链
[0120] H.拓扑结构：线性
[0121] (2)分子类型：寡核苷酸
[0122] (3)序列描述：SEQ ID No.4
[0123] GACAAGCTTTA ATACGGGACCT
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