一种抑制WSSV早期感染的基因Cq-VCP及其制备与应用
阅读：280发布：2020-05-25
专利汇可以提供一种抑制WSSV早期感染的基因Cq-VCP及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种抑制WSSV早期感染的基因Cq‑VCP及其制备与应用，涉及 白斑综合征病毒 。所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白命名为Cq‑VCP。将Cq‑VCP基因连接到载体pMD18‑T，并分析其开放阅读框，得Cq‑VCP基因序列；所得的Cq‑VCP基因序列进行进化树分析并分析其蛋白结构域。所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白可在制备抗WSSV感染药物中应用。涉及新的基因及其蛋白功能，即红螯螯虾VCP基因扩增及其功能验证。在WSSV感染宿主细胞过程中，Cq‑VCP能够调控病毒的早期入胞及随后的囊泡转运过程。Cq‑VCP调控WSSV早期感染阶段，对于作为病毒入侵细胞靶点设计抗白斑综合征病害有效药物防治具有重要应用前景。，下面是一种抑制WSSV早期感染的基因Cq-VCP及其制备与应用专利的具体信息内容。
一种抑制WSSV早期感染的基因Cq-VCP及其制备与应用
技术领域
背景技术
[0002] 白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是对虾和螯虾等重要甲壳类养殖业最具毁灭性的病毒性病原之一，能够引起大规模白斑综合征病害暴发和被感染动物的高死亡率，对水产甲壳动物养殖业的经济造成极大的危害，迄今为止，依然缺乏有效的药物治疗或预防手段。
[0003] 含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP)是高度保守的三磷酸腺苷酶超家族(ATPases associated with various cellular activities，AAA)中的一员[1]，参与多种细胞活性调控，包括泛素-蛋白酶体依赖的蛋白降解、膜融合、抗细胞凋亡、内质网相关降解和核酸修复等[2]。VCP在细胞内的多种生物学功能的实现主要依赖于与其结合的各[3]种辅因子以及与其互作的适配蛋白 。与VCP结合的辅因子主要分为底物募集辅因子和底物加工辅因子，前者包括Ufd1-Npl4异源二聚体、Shp1/p47和Derlin-1等；后者主要包括VCIP135和SVIP等。
[0004] WSSV是双链DNA病毒，DNA病毒的感染过程，一般分为黏附、入胞、胞内转运、病毒核酸入核与转录复制、子代病毒组装及成熟过程[4]。在病毒早期入侵宿主细胞的内吞途径中，VCP通过连接网格蛋白clathrin和接头蛋白Aps，参与网格蛋白介导的内吞过程[5]，之前研究报道已验证网格蛋白介导的内吞过程正是WSSV感染宿主细胞的关键主要途径[6]。在胞内内体转运过程中，VCP与辅因子UBXD1结合，促进泛素化的蛋白分选及降解。而VCP功能障碍可致使晚期内体聚集，影响管腔内的底物分选，及随后的囊泡与溶酶体融合降解[7]。在冠状病毒早期感染中，药物抑制VCP功能，能够抑制转运病毒的内体成熟从而抑制其释放出来[8]。库蚊传播的辛德毕斯病毒(Sindbis virus)可感染果蝇和哺乳动物细胞。基因敲降或药物抑制VCP功能，能影响病毒早期入胞并改变病毒受体的囊泡转运途径[9]。另外VCP在poliovirus[10]、hepatitis B virus[11]等病毒的感染过程也发挥一定作用。
[0005] 参考文献：
[0006] 1.Erzberger J P,Berger J M.Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+proteins[J].Annual Review of Biophysics&Biomolecular Structure,2006,35(1):93.
[0007] 2.Meyer H,Bug M,Bremer S.Emerging functions of the VCP/p97AAA-ATPase in the ubiquitin system.[J].Nature Cell Biology,2012,14(2):117.[0008] 3.Yeung H O,Kloppsteck P,Niwa H,et al.Insights into adaptor binding to the AAA protein p97.[J].Biochemical Society Transactions,2008,36(1):62-7.[0009] 4.Marsh M,Helenius A.Virus entry:open sesame[J].Cell,2006,124(4):729.[0010] 5.Pleasure I T,Black M M,Keen J H.Valosin-containing protein,VCP,is a ubiquitous clathrin-binding protein[J].Nature,1993,365(6445):459-462.[0011] 6.Chen R,Shen K,Zhen C,et al.White spot syndrome virus entry is dependent on multiple endocytic routes and strongly facilitated by Cq-GABARAP in a CME-dependent manner[J].Scientific Reports,2016,6:28694.
[0012] 7.Ritz D,Vuk M,Kirchner P,et al.Endolysosomal sorting of ubiquitylated caveolin-1 is regulated by VCP and UBXD1and impaired by VCP disease mutations.[J].Nature Cell Biology,2011,13(9):1116-23.
[0013] 8.Wong H H,Kumar P,Tay F P,et al.Genome-Wide Screen Reveals Valosin-Containing Protein Requirement for Coronavirus Exit from Endosomes.[J].Journal of Virology,2015,89(21):11116.
[0014] 9.Panda D,Rose P P,Hanna S L,et al.Genome-wide RNAi screen identifies SEC61A and VCP as conserved regulators of Sindbis virus entry[J].Cell Reports,2013,5(6):1737-48.
[0015] 10.Arita M,Wakita T,Shimizu H.Valosin-containing protein(VCP/p97)is required for poliovirus replication and is involved in cellular protein secretion pathway in poliovirus infection[J].J Virol,2012,86(10):5541-5553.[0016] 11.Jiao BY,Lin WS,She FF,et al.Hepatitis B virus X protein enhances activation of nuclear factor kappaB through interaction with valosin-containing protein[J].Arch Virol,2011,156(11):2015-2021.
发明内容
[0017] 本发明的第一目的在于提供红螯螯虾含缬酪肽蛋白的基因序列。
[0018] 本发明的第二目的在于提供红螯螯虾含缬酪肽蛋白氨基酸序列。
[0019] 本发明的第三目的在于提供红螯螯虾含缬酪肽蛋白的制备方法。
[0020] 本发明的第四目的在于提供红螯螯虾含缬酪肽蛋白在制备抗WSSV感染药物中的应用。
[0021] 所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein)命名为Cq-VCP。
[0022] 所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白的基因序列为：
[0023]
[0024]
[0025] 所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白氨基酸序列为：
[0026]
[0027]
[0028]
[0029]
[0030] 所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白的制备方法包括以下步骤：
[0031] 1)将Cq-VCP基因连接到载体pMD18-T，并分析其开放阅读框(ORF)，得Cq-VCP基因序列；
[0032] 2)步骤1)所得的Cq-VCP基因序列，进行进化树分析并分析其蛋白结构域。
[0033] 所述Cq-VCP为三磷酸腺苷酶超家族(ATPases associated with various cellular activities，AAA)中的一员，其具有典型的结构域，具有高度的保守性。
[0034] 所述红螯螯虾含缬酪肽蛋白可在制备抗WSSV感染药物中应用。
[0035] 本发明涉及一种新的基因及其蛋白功能，即红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)VCP基因扩增及其功能验证。在WSSV感染宿主细胞过程中，Cq-VCP能够调控病毒的早期入胞及随后的囊泡转运过程。Cq-VCP调控WSSV早期感染阶段，对于作为病毒入侵细胞靶点设计抗白斑综合征病害有效药物防治具有重要应用前景。本发明在扩增得到Cq-VCP的基础上，根据获取Cq-VCP基因序列设计dsRNA干扰其表达，并使用其特异药物DBeQ抑制其功能。研究结果表明，Cq-VCP功能抑制，能减少病毒入胞和病毒复制过程。因此，Cq-VCP在探究WSSV如何感染虾类细胞的病毒胞内转运机制中具有重要研究价值，并且在以VCP为靶点制备抗WSSV感染新药开发应用中具有很好的潜在的应用前景。附图说明
[0036] 图1为Cq-VCP结构域预测。在图1中，Cq-VCP由CDC48＿N、CDC48＿2和2个AAA结构域(通常称D1、D2)共4个典型的结构域构成，其中D1和D2发挥ATPase酶的功能。
[0037] 图2为利用双链RNA干扰技术敲降细胞內源VCP后WSSV侵染降低。在图2中，WSSV，MOI＝10，感染细胞1h，然后检测发现WSSV入胞量减少。
[0038] 图3为利用双链RNA干扰技术敲降细胞内源VCP后WSSV复制降低。在图3中，MOI＝1，WSSV感染3h、6h、12h，发现其早期基因IE1和晚期基因VP28复制均显著降低。
[0039] 图4为VCP特异药物DBeQ抑制WSSV复制。在图4中，DBeQ药物显著抑制WSSV基因IE1和VP28的复制，低浓度(5μm/L)效果低于高浓度(15μm/L)，显示其对于病毒感染具有浓度依赖性。
[0040] 图5为VCP特异药物DBeQ抑制WSSV降解。在图5中，高浓度(15μm/L)DBeQ药物显著抑制WSSV基因IE1和VP28的复制，并显著抑制了囊膜病毒的降解，显示其抑制了病毒囊膜的融合发生及降解。
具体实施方式
[0041] 以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
[0042] 实施例1红螯螯虾含缬酪肽蛋白Cq-VCP基因克隆
[0043] 提取红螯螯虾Hpt细胞RNA，一部分经RT-PCR逆转录成cDNA作为基因扩增的模板，另一部分合成3'和5'RACE的cDNA第一链。根据实验室前期构建的红螯螯虾造血组织转录组里的部分Cq-VCP基因序列设计特异性基因扩增引物进行扩增。
[0044] 上游引物F：5′-ATGGCCGAACAGGAAGACTTAGC-3′；
[0045] 下游引物R：5′-CAAACCACTCATGAATGGTACACTAAT-3′。
[0047] 利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，回收的PCR产物，经与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，测序后比对分析以确定所得基因序列为Cherax quadricarinatus的VCP基因即Cq-VCP。
[0048] Cq-VCP结构域预测见图1。
[0049] 实施例2Cq-VCP基因敲降对WSSV感染Hpt细胞入胞的影响
[0050] 按照表1合成Cq-VCP双链RNA(dsRNA)用于干扰。制备培养红螯螯虾hpt细胞，加入5
96空细胞培养板中培养(10cells/孔)。然后取1μg dsRNA、0.8μL cellfectin与14μL DEPC水轻弹混匀后室温孵育15min，补L15培养基至50μL加至96孔细胞培养板每孔培养细胞中，
24h后更换1/2培养基，参照上述方法再次添加dsRNA，对照所用dsRNA为dsGFP RNA。基因干扰36h后以MOI＝10感染WSSV，感染1h后用1×SDS裂解收集细胞样品，Western blot检测病毒入胞量的变化。
96空细胞培养板中培养(10cells/孔)。然后取1μg dsRNA、0.8μL cellfectin与14μL DEPC水轻弹混匀后室温孵育15min，补L15培养基至50μL加至96孔细胞培养板每孔培养细胞中，
24h后更换1/2培养基，参照上述方法再次添加dsRNA，对照所用dsRNA为dsGFP RNA。基因干扰36h后以MOI＝10感染WSSV，感染1h后用1×SDS裂解收集细胞样品，Western blot检测病毒入胞量的变化。
[0051] 表1
[0052]
[0053] 结果见图2，在WSSV感染的入胞过程中，相对于对照组，Cq-VCP基因敲降后，Cq-VCP蛋白表达量降低，从而导致WSSV囊膜蛋白VP28降低，表明WSSV入胞量减少。
[0054] 实施例3Cq-VCP敲降对WSSV感染红螯螯虾造血组织细胞(Hpt细胞)后转录复制的影响
[0055] 按照表1合成Cq-VCP基因dsRNA用于干扰。制备培养红螯螯虾hpt细胞，加入24空细胞培养板中培养(5×105cells/孔)。取1μg dsRNA、0.8μL cellfectin与14μL DEPC水轻弹混匀后室温孵育15min，补L15培养基至100μL加至孔中，24h后换1/2培养基，照上述方法再次添加dsRNA，对照所用dsRNA为dsGFP。基因干扰36h后以MOI＝1感染WSSV，感染3h、6h、12h后裂解收集细胞样品，提取RNA，使用Takara公司的PrimeScriptTM RT reagentKit逆转录合成cDNA，半定量PCR检测VCP基因干扰效率、病毒极早期基因IE1和晚期基因VP28的表达量，以明确病毒的转录复制情况。
[0056] 结果见图3，在WSSV感染后3h、6h、12h，相对于对照组，Cq-VCP基因敲降后，Cq-VCPmRNA水平降低，从而导致WSSV极早期基因IE1和晚期基因VP28的表达量降低，表明WSSV的转录复制能力减弱。
[0057] 实施例4VCP抑制剂DBeQ对WSSV感染Hpt细胞后转录复制的影响
[0058] 选取针对VCP-ATPase活性特异药物，L15培养基稀释至工作浓度5μm/L和15μm/L，预处理细胞4h，然后以MOI＝1，WSSV感染细胞6、12h后裂解收集细胞样品。半定量PCR检测VCP基因干扰效率、病毒极早期基因IE1和晚期基因VP28的表达量，以明确病毒的转录复制情况。同时使用放线菌酮(CHX，100μg/mL)抑制病毒的复制，然后Western blot检测病毒降解的变化。
[0059] 结果见图4与5，在WSSV感染6h至12h，高浓度15μm/L显著降低病毒晚期基因VP28mRMA，而低浓度5μm/L没有影响，说明DBeQ能显著抑制病毒的复制；使用放线菌酮CHX完全抑制病毒的复制，WSSV感染6h至12h，相对于低浓度DBeQ5μm/L，高浓度DBeQ15μm/L导致WSSV囊膜蛋白VP28升高，说明DBeQ抑制病毒降解；高浓度DBeQ15μm/L处理细胞，WSSV感染6h至12h，WSSV晚期基因VP28mRNA水平降低，同时囊膜蛋白VP28也显著降低，说明随着时间变化DBeQ显著抑制WSSV复制。
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