商业虾养殖场因为大量常见病原体的影响而遭受广泛损失。白斑病 综合征病毒(WSSV)可以导致商业虾斑节对虾(Penaeus monodon)的 迅速死亡。WSSV是双链DNA杆状病毒，其完整基因组已经得到测序 (van Hulten等人，Virology 286：7-22(2001)；以及Yang等人，J.Virol. 75：11811-11820(2001))。在泰国至少发现12个WSSV变种，其区别在 于可读框(ORF)94内多个重复长度的不同。
WSSV扩散迅速并且可以在两周之内毁灭商业虾的运作。对孵育场 孵卵原种(broodstock)和后期仔虾(post-larvae)的WSSV检测允许将感染 虾在进入商业生产体系之前消除。因此，已开发了检测虾中WSSV的多 种方法，包括基于核酸的方法和免疫学方法(You等人，Current Topics in Virology 4：63-73(2004)；以及Lightner等人，Aquaculture 164(1)：201-220(1998))。聚合酶链反应(PCR)方法因其简单、快速和灵 敏而备受关注。基于扩增基因组不同诊断区域检测WSSV的PCR方法 已有描述(见例如Kou等人，美国专利号6,190,862；Lee，美国专利号 6,872,532；Hameed等人，Aquaculture International 13(5)：441-450(2005)； Jian等人，Diseases of Aquatic Organisms 67(1&2)：171-176(2005)；以及 Durand等人，Journal of Fish Diseases 25(7)：381-389(2002))。另外，基 于PCR的方法，具体而言为WSSV-232测定已经在泰国用于虾工业。 该测定涉及使用ORF21中靶序列的引物检测WSSV DNA (Kiatpathomchai等人，J.of Virology Methods 130：79-82(2005))。然而， 使用WSSV-232测定测试WSSV后已经发生了WSSV感染爆发，其归 因于灵敏度不足(Kiatpathomchai等人，同上)。显然，需要新的及更加 灵敏的WSSV检测测定。
上述所有方法均可用于WSSV检测；然而，这些方法通常缺乏特异 性、灵敏度，或者复杂且耗时。另外，由于病毒中的高基因突变率，针 对基因组不同区域的测试将会是有用的。因此，需要快速、准确并且易 于使用于本领域的高灵敏度的WSSV测定。通过基于WSSV基因组新 部分的引物的发现，所述问题在此得到解决。在此鉴定的引物可用于检 测WSSV的引物指导的扩增或核酸杂交测定方法，而不具有前述方法学 相关的问题。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NOs：1-8任一项中所述的 分离的WSSV诊断引物序列，或者与SEQ ID NOs：1-8完全互补的分离 的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了在此公开的一对不同的两个 WSSV诊断引物序列，其中该对能够引发扩增WSSV基因组内核酸区域 的核酸扩增反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测WSSV的试剂盒，包括至 少一对在此公开的WSSV诊断引物序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在WSSV的方 法，包括：
(i)提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA；以及
(ii)在合适的杂交条件下用探针探测该DNA，所述探针来自SEQ ID NOs：1-8任一项的分离的WSSV诊断引物序列；
其中可杂交核酸片段的鉴定证实了WSSV的存在。
在其他实施方案中，该检测方法鉴定未被WSSV感染的DNA样品。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在WSSV的方 法，包括：
(i)提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA；以及
(ii)用至少一对在此公开的WSSV诊断引物序列扩增DNA从而产 生扩增产物；
其中扩增产物的存在证实了WSSV的存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了样品中WSSV量的定量方法， 包括
(i)提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA；
(ii)在核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针的存在下，用至少一对 在此公开的WSSV诊断引物序列，通过至少变性温度和延伸温 度之间的热循环扩增DNA；
(iii)测量热循环期间由核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针产生的 荧光量；
(iv)确定核酸结合荧光分子或荧光标记的探针产生的荧光量达到基 线值以上固定阈值时的阈循环数；并且
(v)通过将测得的样品中WSSV的阈循环数与阈循环数对模板浓度 对数的标准曲线进行比较，计算样品中WSSV的量，所述标准 曲线使用已知浓度的标准溶液确定。
附图简述及序列描述
本发明的各个实施方案可以通过下列详述、附图和附加序列描述而 得到更加全面的理解；所述详述、附图和附加序列描述形成本申请的一 部分。
图1A显示由WSSV病毒DNA和肌动蛋白DNA同时PCR扩增形 成的WSSV产物以及肌动蛋白内部样品对照产物的解链曲线，如实施例 10所述。WSSV和肌动蛋白产物的解链温度(Tm)值显示于其对应解链 曲线上。
图1B显示含有由WSSV病毒DNA和肌动蛋白DNA同时PCR扩 增形成的WSSV产物以及肌动蛋白内部样品对照产物的样品的琼脂糖 凝胶电泳分离结果，如实施例10所述。WSSV和虾DNA的量显示于各 泳道之上；“M”为100-bp DNA梯。
下列序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(“关于含有核苷酸序列和/或氨 基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”)并且与世界知识产 权组织(WIPO)标准ST.25(1998)及EPO与PCT的序列表要求(规则 5.2和49.5(a-bis)及208节以及管理说明书附件C)一致。用于核苷酸 和氨基酸序列数据的符号及格式遵守37 C.F.R.§1.822中所述规则。
SEQ ID NOs：1-8是用于检测WSSV的WSSV诊断引物的核苷酸序 列。
SEQ ID NOs：9-12是实施例一般方法部分中所述的合成WSSV模板 的核苷酸序列。这些序列也是使用在此公开的WSSV诊断引物对所得扩 增产物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：13-16是实施例10所述内部样品对照引物的核苷酸序 列。
SEQ ID NOs：17-19是实施例11和12所述荧光标记的探针的核苷酸 序列。
发明详述
在此公开的是用于检测白斑病综合征病毒的测定中的引物。该引物 可用于有效检测和定量强毒白斑病综合征病毒的核酸扩增方法和杂交 测定中。
在本公开内容中使用了大量术语和缩写。提供下列定义，并应作为 权利要求和说明书的解释的参考。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“白斑病综合征病毒”缩写为WSSV。
术语“分离的WSSV诊断引物序列”指与诊断WSSV存在的WSSV 基因组部分对应的序列。
在此所用的“分离的核酸片段”是单链或双链的任选含有合成的、非 天然的或改变的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式 的分离的核酸片段可以包括cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或 多个片段。
术语“扩增产物”或“扩增子”指在引物指导的扩增反应中产生的核酸 片段。一般的引物指导的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链 反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或其它等温扩增过程。如果选择PCR 方法，则复制组合物通常将包括例如脱氧核苷酸三磷酸、具有合适序列 的两个引物、热稳定DNA聚合酶和蛋白质。在美国专利No.4,683,202 (1987，Mullis，等人)和美国专利No.4,683,195(1986，Mullis，等人)中提 供了这些试剂及描述其用于扩增核酸的程序的细节。如果选择LCR方 法，则核酸复制组合物将包括例如热稳定连接酶(例如水生栖热菌(T. aquaticus)连接酶)，两套邻近的寡核苷酸(其中每套中的一个成员与各 自靶链互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NAD、二硫苏糖醇和鲑 精DNA(见例如Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078 (1985))。
术语“引物”指寡核苷酸(合成的或自然存在的)，当处于由聚合酶催 化互补链合成的条件下时，所述寡核苷酸能够起到核酸沿互补链合成或 复制的起始点的作用。
术语“热循环”指某种核酸扩增方法例如PCR和LCR中采用的改变 温度的完整模式。该过程是常见的且为本领域所公知的。见例如 Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，NY(1989)；以及Mullis等人的美国专利No.4,683,202和 Mullis等人的美国专利No.4,683,195。总体而言，PCR热循环包括高温 下的起始变性步骤、随后为经过设计以允许模板变性、引物退火以及退 火引物被聚合酶延伸的温度循环的重复系列。
术语“阈循环数”，在此也称为“CT”，指热循环过程中由于产物形成 导致的荧光量达到基线值上固定阈值的循环数。
术语“探针”指寡核苷酸(合成的或自然存在的)，其与靶序列显著互 补、并且与靶序列的至少一条链杂交形成双链体的结构，其中靶序列在 此也称为片段(即待检测序列或待检测序列的部分)。可以使用例如荧光 标记或配体标记将探针标记以便检测。
术语“复制抑制剂部分”指与寡核苷酸3’末端羟基附着、将阻断核酸 链复制链延伸起始的任何原子、分子或化学基团。实例包括但不限于3′ 脱氧核苷酸(例如蛹虫草菌素)、双脱氧核苷酸、磷酸盐、配体(例如生 物素和二硝基苯酚)、报道分子(例如荧光素和罗丹明)、碳链(例如丙 醇)、错配核苷酸或多核苷酸，或肽核酸单元。
术语“非参与性的”指探针或引物在核酸分子扩增反应中缺乏参与。 具体而言，非参与性探针或引物是不作为DNA聚合酶的底物或不被其 延伸的探针或底物。“非参与性探针”先天不能被聚合酶链延伸。其可能 具有或可能不具有复制抑制剂部分。
当核酸分子的单链形式可在稳定的温度和溶液离子强度条件下与 其他核酸分子退火时，核酸分子能够与另一个核酸分子例如cDNA、基 因组DNA或RNA杂交。杂交和洗涤条件广为人知，并示例于Sambrook， J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor， NY(1989)，特别是其中第11章和表11.1中(在此完整引用作为参考)。 温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。对于同源性核酸的初步筛 选，可以使用对应于55℃解链温度(Tm)的低严格性杂交条件，例如 5X SSC，0.1％ SDS，0.25％乳且无甲酰胺；或30％甲酰胺，5X SSC，0.5％ SDS。中等严格性杂交条件对应于更高Tm，例如40％甲酰胺和5X或 6X SSC。尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的，但杂交 要求两个核酸含有互补序列。合适的核酸杂交严格性取决于核酸长度和 互补程度，本领域所公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源 性程度越高，具有这些序列的核酸的杂交体Tm值越高。核酸杂交的相 对稳定性(对应于较高的Tm)按照下列顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA， DNA：DNA。对于长度在100个核苷酸以上的杂交体，推理出了计算Tm 的等式(见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短的核酸即寡核苷 酸的杂交，错配的位置变得更为重要，而寡核苷酸长度决定其特异性(见 Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸长 度为至少约10个核苷酸。优选的，可杂交核酸的最小长度为至少约15 个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸；且最优选长度为至少30个核苷 酸。此外，技术人员将认识到可以根据例如探针长度的因素对温度和洗 涤溶液盐浓度进行必要调整。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包含编码序列之前(5′非编 码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指在自然界中 发现的具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基 因，包括没有在自然界被一同发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因 可以包括来自于不同来源的调节序列和编码序列，或者来自于相同来 源，但是按照与其发现于自然中的不同方式排列的调节序列和编码序 列。“内源基因”指在其生物基因组内自然位置的天然基因。“外来”基因 指通常不发现于宿主生物内，但是通过基因转移而引入宿主生物内的基 因。外来基因可以包括插入到非天然生物内的天然基因或嵌合基因。“转 基因”是已通过转化程序引入基因组中的基因。
术语“可操作地连接的”指核酸序列结合在单独一个核酸片段上，因 此一个的功能受另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列表达时， 该启动子与所述编码序列可操作地连接(即，编码序列在该启动子转录控 制之下)。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列可操作地连接。
如此处所使用的术语“表达”指来自本发明核酸片段的有义(mRNA) 或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指将mRNA翻译为多肽。
术语“质粒”、“载体”和“盒(cassette)”指经常携带非细胞中心代谢部 分的基因、且通常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这种元 件可能是来自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状自主复 制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列 被连接或重组为独特结构，所述独特结构能够将所选基因产物的启动子 片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列一起引入细胞。“转化盒”指 含有外来基因并除外来基因之外具有帮助特定宿主细胞转化的元件的 特定载体。“表达盒”指含有外来基因并除外来基因之外具有允许所述基 因在外来宿主内表达增强的元件的特定载体。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算 机算法或软件程序。“序列分析软件”可以通过商业途径获得或独立开 发。一般的序列分析软件将包括但不限于程序GCG组(Wisconsin Package 9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)，BLASTP， BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)， DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，以及Vector 软件7.0 版。在本申请背景下，除非另有说明，将理解为，当序列分析软件用于 分析时，分析结果将基于程序引用的“默认值”。此处所用的“默认值”意 味着在首次初始化时软件最初加载的任一套值或参数。
在此使用的标准重组DNA及分子克隆技术为本领域所公知，并且 描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文为“Maniatis”)；以及Ausubel，F.M.等人， Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。
白斑病综合征病毒基因组
白斑病综合征病毒(WSSV)，也称为白斑病杆状病毒，是具有高死 亡率和广泛宿主范围的主要虾病原体。WSSV的完整基因组已被测序 (van Hulten等人，Virology 286：7-22(2001)；以及Yang等人，J.Virol. 75：11811-11820(2001))。该基因组由含有305,107个碱基对(bp)和181 个可读框(ORFs)的双链环状DNA(GenBank AF332093)组成。在泰国至 少发现了12个WSSV变种，其区别在于ORF94中多个重复长度的不同 (Wongteerasupaya等人，Dis.Aquat.Org.54：253-257(2003))。
WSSV诊断引物序列
在此公开可用于高灵敏度检测WSSV的多种测定形式的诊断引物 序列。这些引物针对以前未被用于WSSV检测的WSSV基因组区域。
使用一系列“在计算机芯片上”(即基于计算机的)序列分析工具经验 性鉴定引物序列。在此过程中，组装含有所有已知WSSV序列的数据库。 首先将这些序列进行比对，然后基于与其他WSSV序列的同源性、特定 扩增子长度、盐浓度、Tm(解链温度)、C+G含量和免于发夹及二级结构 参数，使用Vector 软件(InforMax Inc.，Bethesda，MD)分析引物位 点。然后对GenBank序列筛选预期引物。选择那些所确立的含有与其他 非靶基因序列少于5个同源性碱基的引物，用于PCR扩增效率和最小引 物二聚体形成的实验研究。选择表现出高扩增效率和最小引物二聚体形 成的引物，用于与一组分离自用各种虾病原体感染的虾的DNA以及合 格无病的虾的DNA进行测试。选择那些扩增所有WSSV链、且对来自 非WSSV病原体感染虾的DNA以及分离自不同物种的合格无病虾的 DNA表现为无反应的引物作为有用的引物。
表1中提供了发现可用于检测WSSV的引物序列及其在WSSV基 因组中的位置。可以使用标准亚磷酰胺化学合成或从公司例如Sigma Genosys(The Woodlands，TX)购买这些引物。
表1
WSSV诊断引物序列
  引物，方向 SEQ ID NO：   ORF WSSV基因组位置    (GenBank AF332093) WSSV77F，正向 1 77 61335-61358 WSSV77R，反向 2 77 61420-61443 WSSV54F，正向 3 54 31287-31309 WSSV54R，反向 4 54 31391-31414 WSSV56F，正向 5 56 33145-33168 WSSV56R，反向 6 56 33269-33292 WSSV130F，正向 7 130 146110-146132 WSSV130R，反向 8 130 146212-146234
测定方法
在此公开的引物序列可以用于WSSV检测和定量的多种测定形 式。两个最方便的形式依赖于核酸杂交方法或引物指导的扩增方法例如 PCR。
引物指导的扩增测定方法
在一个实施方案中，本WSSV诊断引物序列可用于检测WSSV存 在的引物指导的核酸扩增。多种引物指导的核酸扩增方法为本领域所公 知并且适用于使用在此公开的引物。这些核酸扩增方法包括热循环方法 (例如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR))，以及等温方法和链 置换扩增(SDA)。
LCR方法为本领域所公知(见例如Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，82：1074-1078(1985))。一般而言，LCR核酸复制组合物包括例如： 热稳定连接酶(例如水生栖热菌连接酶)，两套邻近的寡核苷酸引物(其 中每套的一个成员与各自靶链互补)，Tris-HCl缓冲液，KCl，EDTA， NAD，二硫苏糖醇和鲑精DNA。
SDA方法也为本领域所公知。Walker等人(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，89：392(1992))给出了关于SDA方法学的深入探讨。在SDA中， 一般使用两个寡核苷酸引物，各具有仅与靶中一条链互补的区域。热变 性后，单链靶片段与过量存在的各自的引物结合。两个引物都含有位于 靶结合序列5’的不对称限制酶识别序列。在限制酶、DNA聚合酶和三 种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和一种脱氧核苷酸α-硫代三磷酸 (dNTP[aS])的存在下，各引物-靶复合物通过产生切口及聚合/置换步 骤循环。
使用在此公开的诊断引物序列检测WSSV的优选方法是PCR，其由 Mullis等人在美国专利No.4,683,202和美国专利No.4,683,195中描述， 在此将二者明确引用作为参考。在PCR方法中，成对使用在此公开的 WSSV诊断引物序列及其完全互补序列，所述WSSV诊断引物序列及其 完全互补序列能够引发扩增WSSV基因组内区域的核酸扩增反应。可以 使用所述WSSV诊断引物序列及其互补物的各种组合。合适的引物对包 括但不限于SEQ ID NOs：1和2，SEQ ID NOs：3和4，SEQ ID NOs：5和6， SEQ ID NOs：7和8，SEQ ID NOs：3和6，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5 的完全互补物，以及SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4的完全互补物。通常， 在缓冲液中将两个引物与样品DNA、四种脱氧核苷酸三磷酸(即dATP、 dCTP、dTTP和dGTP)的混合物、热稳定DNA聚合酶例如Taq DNA聚 合酶混合。然后使用热循环仪将此混合物热循环以扩增所需靶区域。可 以通过商业途径从多个来源获得热循环仪(例如Applied Biosystems (Foster City，CA)；Brinkmann(Westbury，NY)、MJ Research(Waltham， MA)、以及Stratagene(La Jolla，CA))。
通常，PCR热循环包括高温下的起始变性步骤，随后为经过设计以 允许模板变性、引物退火以及退火的引物被聚合酶延伸的温度循环的重 复系列。一般而言，将样品最初在约95℃的温度下加热约2至10分钟 以变性双链DNA样品。然后，在各循环开始，取决于样品及使用的仪 器类型，将样品变性约10至60秒。变性后，允许引物与靶DNA在较 低温度下约40℃至约60℃退火约20至60秒。聚合酶延伸引物常在约 60℃至约72℃的温度范围内进行。延伸使用的时间量将取决于扩增子的 大小以及用于扩增的酶的类型，并且容易通过常规实验确定。另外，退 火步骤可以与延伸步骤组合，从而得到两步循环。在PCR测定中热循环 也可以包括额外的温度改变。测定中使用的循环数取决于许多因素，包 括使用的引物、存在的样品DNA的量，以及热循环条件。用于任何测 定的循环数容易由本领域熟练技术人员使用常规实验确定。任选的，热 循环完成后，可以添加最终延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。
扩增后，可以将扩增的核苷酸序列连接到合适的载体，随后用该载 体转化合适的宿主生物。人们因此保证了更易于获得的扩增序列供给。 备选的，扩增后，可以将扩增序列或其部分化学合成用作核苷酸探针， 用于如下所述杂交测定。在任一情况下，都可使用例如双脱氧法(Sanger， F.等人Proc.Natl.Acad.Sci.74：5463-5467(1977))的方法确立可变区 DNA序列。使用所得序列指导对生物的探针选择，并选择最适合序列。
为了使用引物指导的核酸扩增方法检测怀疑含有WSSV的样品(例 如虾或其他甲壳动物)中WSSV的存在，必须以能够扩增的形式提供样 品DNA。一般，DNA必须不含有细胞和样品材料，并且可以经过处理 而去除蛋白质和其他细胞组分。DNA可以从任何合适的组织、流体或样 品材料获得，包括但不限于虾组织(例如鳃、腹肢、血淋巴、肌肉、尾、 眼柄、胃、腿和结缔组织)、洗涤流体和池水样品。样品可能因为多种原 因而怀疑含有WSSV，包括接近已知污染物或其他，或仅由于WSSV普 遍存在于商业虾工业中而被怀疑为污染。因此，怀疑含有WSSV的样品 可以是上述任何DNA样品。
从组织中提供适于扩增的DNA的方法为本领域所公知。例如，可 以通过将组织或样品材料在Tris-HCl缓冲液中匀浆，离心以去除固体碎 片、用蛋白酶K和十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)处理而分离DNA，用 苯酚和氯仿-异戊醇提取DNA，以及用无水乙醇沉淀DNA而从样品中 提取DNA，如由Kiatpathomchai等人(J.of Virology Methods 130：79-82 (2005))所述。备选的，可以使用Yoganandhan等人(Aquaculture Research 34(12)：1093-1097(2003))和Kou等人(美国专利No. 6,190,862)描述的从各种组织分离WSSV病毒DNA的方法。另外，可 以使用可商业获得的DNA分离试剂盒例如QIAamp DNA迷你试剂盒 (Qiagen，Valencia CA)、QIAamp组织试剂盒(Qiagen)、或高纯PCR模 板制备试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)提供适于扩增 形式的DNA。
然后使用如上所述的核酸扩增方法，用至少一对在此公开的WSSV 诊断引物序列扩增DNA。也可以使用不同对诊断引物序列的组合。如下 所述所检测到扩增产物的存在，证实了样品中存在WSSV。在一个实施 方案中，使用PCR扩增DNA。
在核酸扩增方法中，测试结果可以由于试剂错误、程序错误和仪器 故障而被曲解。另外，由于样品材料中存在抑制物质，或样品DNA或 RNA在样品处理和核酸回收期间降解而出现问题。为了克服这些问题， 可以与WSSV测定组合实施内部对照测试，以警告用户这些类型的错误 并帮助测试结果的定量。
可以使用两类内部对照测试。一条途径是基于共扩增“内部模板对 照”(ITC)，所述内部模板对照在反应之前加入核酸扩增试剂混合物中。 第二条途径是基于共扩增样品中含有的“内部样品对照”(ISC)。在两种情 况下，内部对照DNA或RNA的序列均不同于WSSV DNA序列。
内部样品对照可以是保守的或一贯存在于样品材料(例如虾组织和 血淋巴)中的DNA或RNA基因序列。选择用于扩增ISC靶DNA或RNA 的引物，从而使其不扩增WSSV DNA，并且选择WSSV测试引物从而 使其不扩增内部样品对照DNA或RNA靶。在这个方法中，ISC和WSSV 靶独立扩增。在本测定中，ISC和WSSV靶均使用相同的试剂和条件处 理。另外，使用相同的试剂和反应条件扩增靶模板。因为ISC模板和引 物存在于测试样品中，所以应该在扩增中产生ISC产物。如果没有形成 ISC产物，则提示测试化学法没有正确发挥功能，且WSSV测试结果不 准确，不应当信任。如果发生了正确的ISC产物形成，则提示测试化学 法正确工作，且假定WSSV样品处理和测试反应正确发挥功能，因此可 以更加准确的解释WSSV测试。
ISC引物可选自编码遭受WSSV感染的病原体宿主物种的结构蛋白 质、代谢酶或核糖体产物的基因的基因序列。例如，ISC引物可以是来 源于虾肌动蛋白基因、或虾18S、23S或5S核糖体基因、或其他组成型 基因的基因序列。ISC引物对的合适实例包括但不限于来源于斑节对虾 肌动蛋白1基因(GenBank AF100986)的SEQ ID NOs：13，14和SEQ ID NOs：15，16，如表2所示。
表2
内部样品对照(ISC)引物序列
  引物，方向 SEQ ID NO： 肌动蛋白1基因位置 (GenBank AF100986) 肌动蛋白F2，正向 13 391-411 肌动蛋白R2，反向 14 608-629 肌动蛋白F3，正向 15 326-346 肌动蛋白R3，反向 16 553-574
在一个实施方案中，为了在扩增反应中产生内部样品对照产物，核 酸扩增试剂混合物中包括至少一对ISC引物。在一个实施方案中，所述 至少一对ISC引物选自SEQ ID NOs：13，14和SEQ ID NOs：15，16。
另外，可以有利地与WSSV测试引物一起利用内部模板对照(ITC)， 以帮助测试反应的定量。除了将ITC模板和引物都加入扩增试剂混合物 中，对于ITC的引物要求与ISC引物的要求类似。选择ITC引物从而使 其不扩增测试物种例如遭受WSSV的虾的基因组DNA或RNA。加入已 知浓度的ITC模板，从而已知每个反应的拷贝数。因为ITC模板包括在 扩增试剂混合物中，所以在扩增期间中产生ITC产物。根据反应的扩增 效率和其他变量，在反应和反应之间ITC产物的量将有变化。因为这些 相同的变量也影响WSSV DNA扩增，所以产生的WSSV产物量将与反 应中产生的ITC产物量成比例。因此，可以通过最初加入的ITC、形成 的ITC产物和产生的WSSV产物之间的比例推断测定中WSSV模板的 拷贝数。当使用标记的内部探针，或者通过在产物各自解链温度的解链 曲线的导数，可以确定相对产物形成的CT单位。
ITC引物序列可以是经过理性设计的，或者来自非测试物种例如其 他病毒的基因序列，或者不存在于测试样品中的植物和动物基因。在该 方法中，样品材料不含有可由ITC引物扩增的其他DNA或RNA。
在一个实施方案中，为了在扩增反应中产生至少一个ITC产物，将 至少一个内部模板对照和至少一对ITC引物包括在核酸扩增试剂混合物 中。
本领域所公知的多个检测方法可用于在此公开的方法中。这些检测 方法包括但不限于标准非变性凝胶电泳(例如丙烯酰胺或琼脂糖)、变性 梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳和荧光检测。
荧光检测方法提供了对扩增产物的快速及灵敏检测。荧光检测也提 供了在热循环过程中监控扩增产物形成的实时检测能力。另外，使用荧 光检测可以定量初始靶的量。可以通过在热循环过程之前或之后将核酸 结合荧光试剂加入反应混合物进行荧光检测。优选的，核酸结合荧光试 剂是能够非共价插入核酸双螺旋堆叠碱基对之间的嵌入染料。然而，非 嵌入核酸结合荧光试剂也是合适的。可用于本发明方法中的核酸结合荧 光试剂的非限定性实例是溴化乙锭和 Green I(可从Molecular Probes；Eugene，OR获得)。在热循环之前将核酸结合荧光试剂加入反应 混合物允许对扩增产物形成的实时监控，如Higuchi所述(美国专利No. 5,994,056)。可以通过商业途径从公司获得能够实时荧光测量的热循环 仪，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)，MJ Research(Waltham， MA)，和Stratagene(La Jolla，CA)。扩增后，可以通过使用本领域已知的 方法确定产物解链温度，例如使用荧光测量产生解链曲线，而对扩增产 物的确认进行评价。
扩增产物的荧光检测也可以使用本领域已知的其他方法实现，例如 使用荧光标记的探针。探针包含与扩增产物的至少部分互补的序列。这 种探针的非限制性实例包括探针(Applied Biosystems)和 Molecular Beacons(Goel等人，J.Appl.Microbiol.99(3)：435-442(2005))。 例如，可以通过使用可商购分析软件例如Primer  v2.0(Applied BioSystems Inc.，Foster City California)分析WSSV基因和测试扩增子而 选择用于构建荧光标记的探针的基因序列，所述荧光标记的探针与在此 公开的WSSV引物一起使用，如在下文实施例11和12中所详细描述的。 选择探针序列以落在特定WSSV测试扩增子的近端之内。合适的探针序 列包括但不限于SEQ ID NOs：17-19中所述的序列。可以使用本领域已知 方法对探针进行荧光标记，例如下述用于标记杂交探针的方法。对于实 时荧光检测，可以将探针进行双标记。例如，可以将探针的5’末端用荧 光团如6FAMTM(Applied BioSystems)标记，而3’末端可以用猝灭剂染 料例如6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记。对于小沟结合探针的情况， 可以用猝灭剂染料和小沟结合复合体标记3’末端。可通过商业来源例如 Applied BioSystems获得荧光标记的探针。
在一个实施方案中，本发明提供了用于样品中WSSV定量的方法。 在此实施方案中，如上所述提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA。 在核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针的存在下，使用至少一对在此公 开的寡核苷酸引物通过至少变性温度和延伸温度之间的热循环扩增 DNA。在热循环过程中测量由核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针产生 的荧光量。通过荧光测量，确定核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针产 生的荧光量达到基线值上固定阈值时的阈循环数。在此将阈循环数称为 CT数或值。可以人工确定CT数或由仪器自动确定。为了确定CT数， 在起始扩增循环中确定各样品的基线荧光。采用数学算法以确定荧光信 号在背景之上所需要的荧光中的统计学显著性变化。将荧光超过该阈时 的循环数称为CT数。一般而言，热循环开始时存在于样品中的DNA 越多，达到阈值所需的循环数越少。因此，CT数与样品中WSSV的初 始量反相关。确定WSSV样品的CT数之后，如本领域所公知，可以通 过将对样品中WSSV确定的阈循环数与阈循环数对模板浓度对数的标 准曲线进行比较，计算样品中最初存在的WSSV量，所述标准曲线使用 已知浓度的标准溶液确定。
核酸杂交方法
WSSV核酸杂交测试的基本组分包括DNA探针，怀疑含有WSSV 的样品，以及特定的杂交方法。本发明的探针是与待检核酸序列互补并 与其“可杂交”的单链核酸序列。在杂交方法中，探针长度一般可以在少 至5个碱基至几千碱基内变化，并且取决于要执行的特定测试。仅仅部 分探针分子需要同待检核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间的互补 性不必完美。杂交确实发生在不完全互补分子之间，结果是杂交区域中 一定部分的碱基没有与正确的互补碱基配对。
在此公开的DNA探针来自上述WSSV诊断引物序列。在此使用的 短语“来自WSSV诊断引物序列”指DNA探针可以是WSSV诊断引物序 列、使用核酸扩增方法从其获得的扩增产物序列、WSSV诊断引物序列 或扩增产物序列的部分或任何上述序列的完全互补序列。上面使用的术 语“部分”指WSSV诊断引物序列或由其获得的扩增产物的小于完整序 列的任何部分。优选的，用作探针的部分的长度为至少约15个碱基， 更优选为至少约20个碱基。来自WSSV诊断引物序列的DNA探针的非 限制性实例包括SEQ ID NOs：1-8中给出的WSSV诊断引物序列，SEQ ID NOs：9、10、11和12中给出的扩增产物序列，以及SEQ ID NOs：1-12的 完全互补序列。
可以将探针进行标记以方便检测。向核酸探针附着标记的方法为本 领域所公知。例如，可以在合成期间通过整合标记的核苷酸而标记探针。 备选的，可以通过切口平移或末端标记而完成探针标记。标记可以包含 用于荧光检测的荧光团，或者配体例如生物素，所述配体可以通过使用 杂交后与该配体结合的酶标记的结合分子(例如酶标记的链霉抗生物素 蛋白)检测。
为了检测怀疑似含有WSSV的样品(例如虾或其他甲壳动物)中 WSSV的存在，提供如上所述来自该样品的DNA。在探针与靶分子的任 何杂交可能发生之前，使样品DNA与探针接触。因此，DNA必须脱离 细胞并且在可以发生杂交之前置于正确的条件下。另外在一些实施方案 中，可能需要纯化DNA以去除蛋白质、脂质和其他细胞组分。多种核 酸纯化方法为本领域技术人员所公知，例如苯酚-氯仿提取(Maniatis， 如上)。另外，可以从商业来源获得DNA提取和纯化试剂盒(例如 核酸提取试剂盒(MicroProbe Corp.，Bothell，WA)；以及 QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen，Valencia CA))。预杂交纯化对于标准 过滤器杂交测定尤其有用。
在一个实施方案中，可以不需要提取核酸而直接在细胞裂解物上进 行杂交测定。这去除了样品处理过程的几个步骤并且加快了测定。为了 在粗细胞裂解物上实施这种测定，一般将离液剂加入如上所述制备的细 胞裂解物。离液剂通过抑制核酸酶活性而稳定核酸。另外，离液剂允许 短寡核苷酸探针在室温下与DNA的灵敏及严格的杂交(Van Ness和 Chen，Nuc l.Acids Res.19：5143-5151(1991))。其中，合适的离液剂包括 氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸纳、四氯乙酸锂(lithium tetrachloroacetate)、 高氯酸钠、四氯乙酸铷(rubidium tetrachloroacetate)、碘化钾和三氟乙 酸铯。一般而言，离液剂以终浓度约3M存在。如果需要，人们可以将 甲酰胺加入杂交混合物中，通常为30～50体积％。
杂交方法已得到充分说明且包括液相(即均匀的)和固相(即不均匀 的)杂交方法。通常而言，用衍生自在此公开的WSSV诊断引物序列的 探针探测样品DNA(即，在允许核酸杂交的条件下接触)。这涉及在无机 或有机盐存在下在正确的浓度和温度条件下将探针与样品DNA接触。 探针和样品核酸必须接触足够长的时间，从而使得探针与样品核酸之间 任何可能的杂交能够发生。混合物中探针或靶的浓度将决定杂交发生所 必需的时间。探针或靶的浓度越高，所需的杂交温育时间越短。
可以采用各种杂交溶液。一般，这些溶液可以包含约20至60体积 ％、优选30％的极性有机溶剂。普通杂交溶液采用约30至50体积％的 甲酰胺，约0.15至1M氯化钠，约0.05至0.1M缓冲液，例如柠檬酸 钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9)，约0.05至0.2％的去 污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5至20mM的EDTA，FICOLL (Amersham Bioscience Inc.，Piscataway，NJ)(分子量约300-500千道尔 顿)，聚乙烯吡咯烷酮(分子量约250-500千道尔顿)，以及血清清蛋白。 在一般杂交溶液中也包括约0.1至5mg/mL非标记的载体核酸、断裂的 核DNA(例如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选的每体积约 0.5至2％重量的甘氨酸。其他添加剂也可以包括，例如体积排除剂， 其包括多种极性水溶性或膨胀剂(例如聚乙二醇)，阴离子聚合物(例如 聚丙烯酸酯或聚丙烯酸甲酯)、以及阴离子糖类聚合物(例如硫酸葡聚 糖)。
核酸杂交适用于多种测定形式。最适合的一种是夹心测定形式。夹 心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心类型测定的基本组分是固 体支持物。固体支持物在其上吸附并共价偶联固定化的核酸捕获探针， 所述核酸捕获探针是未标记的并且与样品DNA序列一个部分互补。在 本发明中尤其有用的探针是如上所述衍生自本WSSV诊断序列的探针。 使用上述被标记的、并且与样品DNA序列不同部分互补的第二个探针 检测捕获的DNA。可以使用本领域已知方法检测标记(例如荧光、化学 发光、结合对酶测定等)。
杂交方法也可以与核酸扩增方法例如PCR组合使用。例如，本 WSSV诊断序列可以作为3′封闭的检测探针用于均匀或不均匀测定形 式。例如，从本序列产生的探针可以是3′封闭的或非参与性的，且将不 通过核酸扩增反应延伸或不参与核酸扩增反应。另外，探针掺合标记， 所述标记可以作为反应性配体，其起到探针/分析物杂交物固定化附着点 的作用，或起到产生可检测信号的报道分子的作用。因此，可以在过量 3’封闭的检测探针存在下，通过标准引物指导的扩增规程，扩增从怀疑 含有WSSV的样品分离的基因组DNA，以产生扩增产物。因为探针是 3′封闭的，所以其不参与或干扰靶的扩增。在最后的扩增循环后，将检 测探针与扩增DNA的相关部分退火，且然后通过反应性配体将退火的 复合体捕获到支持物上。
该探针是通用的并且可以设计为几个备选形式。可以通过附着复 制抑制部分将探针3′末端封闭从而不参与引物延伸反应。一般的复制抑 制剂部分包括但不限于双脱氧核苷酸、3’脱氧核苷酸、错配核苷或核苷 酸序列、3′磷酸盐基团和化学试剂例如生物素、二硝基苯酚、荧光素、 罗丹明和碳链。使用标准氰乙基亚磷酰胺化学法，在化学合成过程中， 复制抑制剂与非参与性探针3’末端核苷酸的3′羟基共价附着。该过程使 用固相合成化学法，其中3′末端与不可溶性支持物(可控孔度玻璃或 “CPG”)共价附着，而新合成的链在5’末端增长。在本发明背景下，3-脱 氧核糖核苷酸是优选的复制抑制剂。蛹虫草菌素(3-脱氧腺苷)是最优选 的。因为蛹虫草菌素将被附着到探针的3′末端，所以合成从与CPG，5-二 甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-3-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)，2-琥珀酰 (succinoyl)-长链烷氨基-CPG(Glen Research，Sterling，VA)共价附着的 蛹虫草菌素起始。二甲氧基三苯甲基基团被去除，且链合成启动在固相 蛹虫草菌素的去保护的5’羟基基团开始。合成完成后，将寡核苷酸探针 从固体支持物切割，游离2′羟基基团留在3′末端附着的蛹虫草菌素上。 合成非参与性探针期间其他试剂也可以附着在3′末端以用作复制抑制 剂。这些试剂包括但不限于其他3-脱氧核糖核苷酸、生物素、二硝基苯 酚、荧光素和洋地黄毒苷。用这些试剂各自衍生的CPG支持物可以通 过商业来源获得(例如Glen Research，Sterling，VA；和CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)。
备选的，不对称扩增可用于产生与检测探针互补的链。产生单链 DNA的不对称PCR条件与上述PCR条件类似；然而，引物浓度经过调 整从而使得一个引物过量而另一个引物受限制。预期此程序将增加该方 法的灵敏度。通过增加与检测探针可结合的单链数目，将出现灵敏度的 提高。
评价感染风险和DNA损伤或WSSV灭活
在此公开的检测样品中存在WSSV并对其定量的方法可用于评价 DNA损伤或WSSV灭活的程度。例如，在此公开的方法可与化学处理 组合使用以改进虾的健康和出芽(grow-out)。具体而言，在生产和出芽期 间，可以取样虾、采自生产设备的样品或采自虾环境的样品，并使用在 此公开的方法测试WSSV的存在。如果发现WSSV，则可以对设备和/ 或虾进行处理，以杀死或控制病毒。因为该测试的高灵敏度，所以WSSV 可以在毁坏和产量损失之前得到早期检测。因此，与化学干预组合使用 在此公开的本方法，可以提高生产效率和产量。化学处理的实例包括但 不限于氧化消毒剂例如S消毒剂(E.I.Du Pont de Nemours and Co.的注册商标)、过乙酸、过氧化氢、高锰酸盐、单过硫酸钾、次氯酸、 次氯酸盐、碘等；益生菌剂、免疫刺激剂、饲料补充剂以及防止病毒宿 主结合的重组蛋白质/核酸。化学处理后，可以取虾样品并复检以确定处 理是否成功根除了病毒。
在另一个实施方案中，预期引物可以以各种组合使用以确定化学处 理导致的病毒基因组的完整性和损伤程度。例如，WSSV54F正向引物 (SEQ ID NO：3)和WSSV56R反向引物(SEQ ID NO：6)可以组合使用以 产生2008个碱基的扩增产物。仅当病毒基因组保持完整和未损伤时才 能形成此较长的产物。因此，通过比较扩增过程中形成的较短产物(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)与较长产物的比率(或不存在较长产物)，可 以评价化学处理或干预所导致的病毒基因组损伤程度。这可有助于确定 化学处理或干预的功效。
检测试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了基于核酸扩增方法检测WSSV 的试剂盒。该试剂盒包含至少一对上述WSSV诊断引物序列。另外，该 试剂盒可以另外包含至少下列试剂之一：热稳定DNA聚合酶，四种不 同脱氧核苷酸三磷酸的混合物、核酸结合荧光试剂、至少一对内部样品 对照引物、至少一个内部模板对照和至少一对内部模板对照引物、含有 WSSV基因组内核酸至少一个区域的部分的互补序列的探针，所述 WSSV基因组内核酸能够以该试剂盒内含有的WSSV诊断引物序列扩 增。该试剂盒的引物和其他试剂可以是各种形式的，例如液体的、干燥 的、或片剂，并且可以出现在任何合适的容器或多个容器中，例如小瓶、 管等。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于夹心测定杂交方法检测 WSSV的试剂盒。该试剂盒包含用于从怀疑已感染WSSV的虾或其他甲 壳动物收集样品的第一个组分，以及分配和裂解样品的缓冲液。第二个 组分包括干燥或液体形式的介质，用于靶和探针核酸杂交、以及通过洗 涤去除不需要的和非杂交形式。第三个组分包含固体支持物(例如量杆、 珠等)，其上固定了(或缀合了)未标记的核酸探针，所述未标记的核酸 探针衍生自在此公开的分离的WSSV诊断引物序列。第四个组分含有标 记的探针，所述探针与相同DNA链的第二个且不同区域互补，所述相 同DNA链与第三个组分中固定化的未标记的核酸探针杂交。标记的探 针也可以来自在此公开的分离的WSSV诊断引物序列。
实施例
本发明在下列实施例中得到进一步详细说明。应当理解的是，尽管 显示本发明优选的实施方案，但这些实施例仅供说明。通过上述讨论和 这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且在不 背离其精神和范围的情况下对本发明进行各种改变和修饰以使之适用 于各种用途和条件。
缩写含义如下：“sec”指秒钟，“min”指分钟，“hr”指小时，“d”指天， “μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“μM”指微摩尔的，“mM”指毫摩 尔的，“nM”指纳摩尔的，“M”指摩尔的，“mmol”指毫摩尔，“μmol”指微 摩尔，“ng”指纳克，“fg”指毫微微克，“μg”指微克，“mg”指毫克，“g” 指克，“nm”指纳米，“mU”毫单位，“U”指单位，“rxn”指反应，“PCR” 指聚合酶链反应，“OD”指光密度，“OD260”指在波长260纳米下测量的 光密度，“OD280”指在波长280纳米下测量的光密度，“OD280/260”指 OD280值与OD260值的比率，“rpm”指每分钟转数，“bp”指碱基对，“CT” 指在反应中荧光形成超过检测阈的循环数，且“SPF”指合格无特定病原 的。
一般方法
在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所公 知，并描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；T.J.Silhavy，M.L Bennan和L.W.Enquist， Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，N.Y.， 1987。
使用获自InforMax Inc.(Bethesda，MD)的Vector 软件组实现 基因组序列分析和引物指定。
在此使用的酶和试剂购自下列卖主：
Applied Biosystems，Foster City，CA：AmpliTaq(目录号N808-0160)；
New England Biolabs，Beverly，MA：脱氧核苷酸溶液混合物(目录 号N0447S)；
Sigma Genosys，The Woodlands，TX：寡核苷酸；
Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA：4％琼脂糖E-gels(目录 号G6018-02)；
Qiagen，Valencia，CA：蛋白酶K(目录号19131)；以及无DNA酶的 RNA酶A(目录号19101)。
另外，试剂盒和试剂购自下列卖主： Green PCR主混合物 (Master Mix)(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)，以 及QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen，Valencia，CA；目录号51304)。
所有的虾DNA样品均获自Donald V.Lightner，Department of Veterinary Science and Microbiology，The University of Arizona，Tucson， AZ 85721，美国。这些样品包括来自合格无病虾(SPF)以及感染虾的样 品，所述感染虾含有(斑节对虾型杆状病毒(MBV)、Taura综合征病 毒(Taura syndrome virus)(TSV)、白斑病综合征病毒(WSSV)、斑节对 虾黄头病毒(yellow head virus of P.monodon)(YHV)、传染性皮下及造血 器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis virus)(IHHNV)和传染性肌肉坏死病毒(Infectious Myonecrosis virus)(IMNV)。
模板和引物
用于合成性WSSV模板合成的DNA寡核苷酸序列从白斑病综合征 病毒(WSSV)DNA基因组(GenBank登记号AF332093；Yang，F.，等 人，J.Virology 75(23)，11811-11820(2001))制备，且使用标准亚磷酰胺 化学技术合成，或商业购买(Sigma Genosys Company，The Woodlands， TX)。通过260nm分光光度测量(OD260)确定合成模板靶的浓度和拷贝 数。将模板在纯化水中稀释到特定拷贝数，且用作阳性对照及测定定量 标准。表3显示了模板靶的基因组位置、序列鉴定及长度。SEQ ID NOs：1-8中给出了可用于WSSV检测的引物序列。
表3
模板序列
  模板 大小(bp) SEQ ID NO： WSSV基因组位置    (GenBank AF332093) WSSV 77T 109 9 61335-61443 WSSV 54T 128 10 31287-31414 WSSV 56T 148 11 33145-33292 WSSV 130T 125 12 146110-146234
实施例1-4
使用合成靶的WSSV PCR测定说明
这些实施例的目的是说明以在此公开的引物使用PCR扩增检测 WSSV合成模板。
通过在无DNA酶水中十倍连续稀释合成WSSV模板(如上所述) 制备模板标准。通常，标准模板浓度范围在107至0拷贝/μL之间。通 过将25μL/反应的 Green PCR主混合物(Applied Biosystems， Foster City，CA；目录号4309155)与一定体积的引物母液(WSSV引物 各20μM)以及足够补足终体积45uL/反应的无DNA酶水组合制备主混 合物，所述一定体积的引物母液足够提供表4所示各个适当的WSSV正 向和反向引物的125nM的终浓度。将主混合物保持于冰上直至使用。
对于每个反应，首先将5μL模板标准加入PCR反应孔，然后加入 45μL主混合物。然后将反应热循环40个循环，使用的温度程序为具有 95℃下10分钟的起始变性步骤的95℃ 15秒及60℃ 1分钟。使用ABI PRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在 MicroAmp光学96孔反应板中进行扩增。各循环期间，通过监控 Green报道染料与DNA扩增产物相互作用所产生荧光的增加而检测 PCR产物的形成。PCR完成后，产生60℃至95℃范围内的解离曲线(在 此也称为解链曲线)。使用ABI PRISM 7900 SDS软件分析数据。另外， 使用4％琼脂糖Egels(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录 号G6018-02)及凝胶制造商规程通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物形 成。
概括于表4中的结果显示，当存在合适的WSSV模板时，对各引物 产生了合适大小的扩增子产物。取决于所用的引物，最低可检测模板水 平在1至100拷贝/rxn之间。不含有模板的样品不产生可检测产物。
扩增(CT)及扩增子产物形成分别与起始模板浓度对数成反比和 正比。
表4
使用合成靶的PCR扩增结果
  实施例        正向引物， SEQ ID      NO：        反向引物， SEQ ID      NO：        模板  SEQ ID NO：   产物 大小 (bp) 最小可检测模板 (拷贝/rxn)     1 1 2 9 109 1 2 3 4 10 128 1 3 5 6 11 148 1 4 7 8 12 125 100
实施例5-8
使用PCR测定对感染虾组织WSSVDNA的检测和定量
这些实施例的目的在于说明使用在此公开的引物用PCR测定对感 染虾中的WSSV检测和定量。
在这些实施例中，使用实施例1-4中提出的条件扩增每反应106至100 拷贝范围之间的合适的合成模板DNA的连续稀度(如上所述)。使用从各 合成模板浓度确定的CT值，通过以95％置信区间将CT值对标准中起始模 板拷贝数的对数作图，产生标准曲线(未显示)。然后使用该曲线的斜率 (即CT相对于对数浓度)从样品各自的CT值估计未知样品中病毒基因组 的拷贝。
使用以WSSV中国株感染的虾的基因组DNA。将从感染虾鳃中分离 的总DNA(230ng/μL)连续稀释在纯化水中，且用于提供DNA浓度为1 ng/μL至1fg/μL总DNA的一系列样品。阴性对照包括不含有模板的水对 照以及两个DNA虾样品(10ng/rxn)，所述DNA虾样品通过从两个未感染 的(SPF)虾株(凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和斑节对虾)提取 DNA而获得。
使用引物对之一(见表5)以及实施例1-4中提出的相同扩增、主混 合物、热循环条件和仪器扩增稀释的样品。然后从PCR扩增反应评定各 稀释DNA样品的CT值。从CT值和标准CT相对于对数模板浓度图的斜率 估计样品中病毒基因组的拷贝。PCR产物也经过琼脂糖凝胶电泳分析， 如实施例1-4所述。
结果概括于表5。该表中，以三次重复的平均值及95％置信区间提供 每反应WSSV拷贝数。结果显示，所有引物组从感染虾DNA产生了正确 的扩增子产物大小，并且在感染虾样品中检测到WSSV DNA。取决于使 用的引物对，检测限在病毒基因组约2拷贝/rxn至约300拷贝/rxn范围之 间。在水对照样品或两个SPF虾样品中没有检测到扩增产物。从阴性对 照样品得到的结果显示该测定对两个测试虾株的非病毒DNA没有反应 性。
表5
感染虾组织WSSV DNA检测结果
         实施例                 正向引物 SEQ ID    NO：               反向引物 SEQ ID    NO：              感染虾  DNA/rxn (ng)    CT       WSSV              拷贝/rxn 5 1 2 1 22.9 48±1×104 5 1 2 0.1 26.5 3.9±0.1×104 5 1 2 0.01 29.8 3.0±0.2×103
  5 1 2 0.001 33.2 3.5±0.4×102 5 1 2 0.0001 37.4 1.7±0.3×101 5 1 2 0.00001 >40 0 5 1 2 0.000001 >40 0 5 1 2 0    (水) >40 0 5     1     2     0          (SPF       凡纳滨对虾 (10ng))    38.9           0     5     1     2     0        (SPF     斑节对虾 (10ng))  37.9           0     6 3 4 1 19.9 18±3×104 6 3 4 0.1 23.6 1.7±0.1×104 6 3 4 0.01 27.1 1.7±0.1×103 6 3 4 0.001 30.9 1.5±0.1×102 6 3 4 0.0001 35.5 7±1 6 3 4 0.00001 36.5 2±3 6 3 4 0.000001 >40 0 6 3 4 0    (水) >40 0 6     3     4     0          (SPF       凡纳滨对虾 (10ng))    >40         0     6     3     4     0        (SPF     斑节对虾 (10ng))  >40         0     7 5 6 1 19.0 36±2×104
  7 5 6 0.1 33.7 3.4±0.01×104 7 5 6 0.01 30.5 2.5±0.4×103 7 5 6 0.001 26.1 1.2±0.6×102 7 5 6 0.0001 22.4 13±8 7 5 6 0.00001 36.1 2±1 7 5 6 0.000001 >40 0 7 5 6 0    (水) >40 0 7     5     6     0          (SPF       凡纳滨对虾 (10ng))    >40         0     7     5     6     0        (SPF     斑节对虾 (10ng))  >40         0     8 7 8 1 23.3 88±2×104 8 7 8 0.1 28.3 4±3×104 8 7 8 0.01 31.9 4.3±0.6×103 8 7 8 0.001 36.3 3±1×102 8 7 8 0.0001 >40 0 8 7 8 0.00001 >40 0 8 7 8 0.000001 >40 0 8 7 8 0    (水) >40 0 8     7     8     0          (SPF       凡纳滨对虾 (10ng))    >40         0     8     7     8     0        (SPF     斑节对虾 (10ng))  >40         0    
实施例9
WSSV引物特异性
该实施例的目的是证明在此公开的引物扩增来自世界不同地理区 域WSSV株的DNA，但是不扩增其他虾病原体感染虾的DNA。
在此实施例中，使用由其他虾病原体感染虾的DNA。具体而言，使 用实施例5-8中描述的引物和PCR方法测试从WSSV株以及非WSSV 虾病毒(MBV、IHHNV、YHV和IMNV)感染虾分离的DNA样品，所 述WSSV株来自不同地理区域(即，夏威夷、菲律宾、泰国、巴拿马、 墨西哥、莫桑比克以及马达加斯加)。
用与实施例5-8中所述株类似的检测限检测所有WSSV株。当测试 非WSSV感染虾的DNA样品时，没有观察到PCR扩增。这些发现一起 证明了在此公开的WSSV诊断引物序列和方法对WSSV具有选择性， 而且引物与虾DNA或其他虾病毒不反应。
实施例10
与内部样品对照组合使用PCR检测WSSV DNA
该实施例的目的是证明在此公开的WSSV引物可以与内部样品对 照(ISC)引物组合用于除WSSV产物之外产生ISC产物。下文所示结 果证明ISC引物独立扩增样品DNA，并且不干扰WSSV DNA的扩增。 ISC产物的存在为测试提供了可用作已回收了足够数量和质量的样品 DNA的指示的标记。
ISC引物来自斑节对虾肌动蛋白1基因序列(GenBank：AF100986)。 为了促进WSSV扩增子的优选扩增，设计ISC引物以扩增长于靶WSSV 扩增子的DNA片段。ISC引物对序列以SEQ ID NOs：13，14，以及SEQ ID NOs：15，16给出(见表2)。
通过用无DNA酶水将WSSV感染虾(斑节对虾)的基因组DNA制 剂10倍连续稀释，制备含有WSSV和虾肌动蛋白DNA的样品。样品 DNA含量在每反应0.1ng至0.1pg范围内。然后将未感染虾基因组DNA (10ng)加入各WSSV样品以及不含有WSSV DNA的阴性对照样品中。
通过将15μL/反应的 Green PCR主混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)与一定体积的引物母液 (WSSV54引物各20μM以及肌动蛋白引物各10μM)组合，制备PCR主 混合物；所述一定体积的引物母液足够提供WSSV54正向和反向引物 (分别为SEQ ID NOs：3和4)各125nM、以及肌动蛋白正向和反向引物 (分别为SEQ ID NOs：13和14或SEQ ID NOs：15和16)各32nM的终 浓度。加入无DNA酶水以补足25μL/反应的终体积。将主混合物保持 于冰上直至使用。
各反应中，首先将5μL样品加入PCR反应孔，然后加入25μL主 混合物。然后将反应热循环40个循环，使用的温度程序为具有95℃ 5 分钟的起始变性步骤的95℃ 15秒及60℃ 1分钟。使用ABI PRISM 7900 热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp光学96 孔反应板中进行扩增。
如上所述，各循环期间，通过CT值监控产物形成，所述CT值通 过 Green报道染料与DNA扩增产物相互作用所产生荧光的增加 而确定。40个循环后，产生60℃至95℃范围间的解离曲线(解链曲 线)。使用ABI PRISM 7900 SDS软件分析数据。另外，使用4％琼脂糖 Egels(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)及 凝胶制造商规程通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物形成。使用ISC引物 肌动蛋白F2(SEQ ID NO：13)和肌动蛋白R2(SEQ ID NO：14)获得的结 果显示于图1A和1B中，这证明两个模板靶同时扩增。特定WSSV DNA 产生了解链温度为78.5℃的128bp的产物。肌动蛋白ISC产生了239bp 的产物(Tm＝83.8℃)。基于这些大小和解链温度的差别，在解链曲线 分析(图1A)和凝胶电泳(图1B)中均检测到WSSV产物和肌动蛋白 内部对照产物。不存在WSSV靶以及在各种WSSV靶浓度时，以83.8℃ 处单独的解链温度峰(如图1A所示)以及电泳(如图1B所示)检测到 ISC产物形成。在所有含有WSSV模板的样品中，通过解链温度(Tm＝ 78.5℃)和凝胶电泳均检测到特定的WSSV扩增子。这些结果证明肌动 蛋白ISC模板与WSSV模板共扩增，而且ISC的存在没有影响PCR扩 增以及PCR测定的检测限(0.1pg WSSV DNA)。
实施例11和12
使用荧光标记的探针实时检测WSSV DNA
该实施例证明在此公开的WSSV引物可以与荧光标记的探针组合 用于WSSV的实时检测和定量。
通过使用购自Applied BioSystems Inc.(Foster City，CA 94404)的 Primer  2.0版软件分析WSSV基因和测试扩增子选择用于构建 荧光标记的探针的基因序列。选择探针序列以落在特定WSSV测试扩增 子近端内，且长度为50至110个碱基，取决于扩增子的大小和序列。 探针序列优选G/C含量为30～80％、并且C含量比G高、以及没有5’G 的区域。一般，选择Tm比各自测试引物Tm高8至10℃的探针序列。 不选用与其他物种交叉杂交的探针序列。经选择以满足这些标准的探针 序列列于表6。
对于实时检测，将探针序列进行双标记。采用两种不同的标记途径。 用荧光团(6FAMTM，Applied Biosystems)标记探针5’末端。3’末端以猝 灭剂染料标记，或者在小沟结合(MGB)探针的情况下用猝灭剂染料和 小沟结合复合体标记3’末端。从Applied BioSystems制备并商业购买标 记的探针。
表6
荧光标记的探针序列
  探针      SEQ ID       NO：   GenBank         No：    位置      5’  标记 3’  标记 WSSV 54PM 17 AF332093 31345-31364 FAM1 MGB2 WSSV 54PT 18 AF332093 31345-31364 FAM TAMRA3 WSSV 77PT 19 AF332093 61363-61385 FAM TAMRA
1FAM为6FAMTM试剂，Applied Biosystems
2MGB为MGBTM，Applied Biosystems
3TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明
通过在无DNA酶水中将合成WSSV模板(上述)10倍连续稀释制备 模板标准。通常，标准模板浓度范围在107至0拷贝/μL之间。通过将 25μL/反应的 Universal主混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4326708)与一定体积的引物母液(WSSV引物各20 μM)、一定体积的探针母液和足够补足终体积45uL/反应的无DNA酶 水组合，制备主混合物；所述一定体积的引物母液足够给出表7所示各 适当WSSV正向和反向引物125nM的终浓度，所述一定体积的探针母 液给出50nM的终浓度。将主混合物保持于冰上直至使用。
各反应中，将5μL模板标准和45μL主混合物加入各PCR反应孔。 然后将反应热循环40个循环，使用的温度程序为具有95℃ 10分钟的起 始变性步骤的95℃ 15秒及60℃ 1分钟。使用ABI PRISM 7900热循环仪 (Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp光学96孔反应板中 进行扩增。各循环期间，通过监控荧光标记的探针产生荧光的增加而检 测PCR产物形成。
使用ABI SDS 2.2软件分析数据。另外，使用4％琼脂糖Egels (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)及制造 商规程通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物形成。
概括于表7中的结果证明在合适的WSSV模板存在时，对各引物/ 探针组产生了合适大小的扩增子产物。取决于使用的引物和探针，最小 可检测模板水平在100至1000拷贝/rxn之间。不含有模板的样品没有产 生可检测产物。
扩增(CT)和扩增子产物形成分别与初始模板浓度对数成反比和 正比。
表7
使用合成靶的PCR扩增结果
  实施例        正向引物， SEQ ID      NO：        反向引物， SEQ ID      NO：        模板  SEQ   ID NO： 探针  SEQ   ID NO： 产物 大小 (bp) 最小可检   测模板     (拷贝/rxn) 11 3 4 10 17 128 1000 12 1 2 9 19 109 100
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
     Ebersole，Richard
<120>用于诊断虾病原体的序列
<130>CL3502
<160>19
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1

<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物

<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3

<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4

<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5

<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6

<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7

<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8

<210>9
<211>109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成WSSV模板
<400>9

<210>10
<211>128
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成WSSV模板
<400>10

<210>11
<211>148
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成WSSV模板
<400>11

<210>12
<211>125
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成WSSV模板
<400>12

<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13

<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14

<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15

<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16

<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>荧光标记的DNA探针
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>用荧光团6FAM标记的
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>用猝灭剂染料和小沟结合复合体MGB标记的
<400>17

<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>荧光标记的DNA探针
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>用荧光团6FAM标记的
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>用猝灭剂染料TAMRA标记的
<400>18

<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>荧光标记的DNA探针
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>用荧光团6FAM标记的
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>用猝灭剂染料TAMRA标记的
<400>19