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一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法

阅读：998发布：2020-05-26

专利汇可以提供一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法，将新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序，得藻粉；将上述藻粉与水产用饲料药物粘合剂混合均匀后加入水中，再与普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得；该制备方法操作简单，生产安全且成本低廉，适用性广，得到的转基因免疫口服剂药效稳定，无任何污染，用于日本沼虾后大大提高抵抗白斑综合征病毒的免疫力，减少白斑综合征病毒在体内的增殖，有助于提高其养殖产量，同时也为其他养殖品种提供参考。，下面是一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序，得藻粉；
(2)将上述藻粉与水产用饲料药物粘合剂混合均匀，得混合药物；所述藻粉与水产用饲料药物粘合剂的质量比为50:16.1-17.9；
(3)将上述混合药物加入水中，边加边搅拌，得药液；所述藻粉与水的质量体积比为1:
6-7；
(4)将上述药液与普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得；所述藻粉与普通虾用饲料的质量比为1:25.9-26.1。
2.如权利要求1所述预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，其特征在于，所述新鲜转vp28蓝藻由藻种Anabaena sp.PCC7120pRL-489-vp28经扩培制得。
3.如权利要求2所述预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，其特征在于，所述扩培条件为：培养基为BG-11无N培养基，pH为7.5，温度为32.5-33.5℃。
4.如权利要求1所述预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，其特征在于，所述水产用饲料药物粘合剂包括木薯淀粉和/或马铃薯淀粉。
5.如权利要求1所述预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，其特征在于，所述普通虾用饲料包括虾粉、去皮豆粕、高筋面粉、虾油、免疫多糖、蛋氨酸、赖氨酸、复合维生素和VC磷脂。
6.一种转基因免疫口服剂，其特征在于，通过权利要求1-5任一项所述预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法制得。
7.如权利要求6所述转基因免疫口服剂在预防日本沼虾WSSV的用途。
8.如权利要求7所述转基因免疫口服剂在预防日本沼虾WSSV的用途，其特征在于，所述转基因免疫口服剂的用量为：每天按所述日本沼虾体重的1％-10％投喂，且至少连续投喂
7d以上。
9.如权利要求8所述转基因免疫口服剂在预防日本沼虾WSSV的用途，其特征在于，所述转基因免疫口服剂的用量为：每天按所述日本沼虾体重的5％投喂，且至少连续投喂7d以上。

说明书全文

一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本专利涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称为河虾、青虾，属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，是许多亚洲国家养殖的主要淡水品种之一，日本沼虾已经成为我国重要的淡水经济虾类。我国虾类养殖品种众多，养殖效益巨大，然而近年来虾病频繁暴发，给虾类养殖产业造成了巨大灾难，尤其是白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，一旦暴发对虾几乎100％死亡，目前尚无有效药物应用。

[0003] 白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)于20世纪90年代初首先在我国台湾地区发现，并迅速波及25个国家之多，WSSV感染对虾后，3-10d内其死亡率可达100％，已成为全球养虾业中蔓延最广、传播最快、死亡率最高的病毒，给虾类养殖业造成巨大的经济损失。它感染宿主范围很广，在甲壳类和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主，已经鉴定到它可感染40种虾，39种蟹，涉及到我们常见的大部分虾蟹类水产品，另外有研究者在浮游生物、海葵、糠虾、白虾、毛虾等动物中也检测出WSSV。然而关于WSSV感染沼虾方面的研究却很少，目前鲜有关于日本沼虾是否能够感染WSSV以及感染途径、发病规律及病毒在其体内增殖的研究报道。
发明内容

[0004] 本发明的发明人经过大量研究发现，转vp28蓝藻口服剂作用于日本沼虾后，可以大大提高抵抗WSSV的免疫力，减少WSSV在体内的增殖，有效保护日本沼虾的腮、肝胰腺等组织，将转vp28蓝藻口服剂与饲料混合投喂日本沼虾不仅有助于提高其养殖产量，也可有效提高沼虾对WSSV的抵抗力，同时也为其他养殖品种提供技术参考。

[0005] 本发明的目的在于提供一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，方法简单、成本低廉，操作简便、生产安全无污染。

[0006] 本发明的另一个目的在于提供由上述制备方法得到的转基因免疫口服剂，药效稳定，可有效提高沼虾对WSSV的抵抗力。

[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

[0008] 一种预防日本沼虾WSSV的转基因免疫口服剂的制备方法，具体地，包括以下步骤：

[0009] (1)将新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序，得藻粉；

[0010] (2)将上述藻粉与水产用饲料药物粘合剂混合均匀，得混合药物；所述藻粉与水产用饲料药物粘合剂的质量比为50:(16.1-17.9)；

[0011] (3)将上述混合药物加入水中，边加边搅拌，得药液；所述藻粉与水的质量体积比为1:(6-7)；

[0012] (4)将上述药液与普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得；所述藻粉与普通虾用饲料的质量比为1:(25.9-26.1)。

[0013] 在一些优选的实施方式中，上述步骤(2)中，所述藻粉与水产用饲料药物粘合剂的质量比为50:17；步骤(3)中，所述藻粉与水的质量体积比为1:6.67；步骤(4)中，所述藻粉与普通虾用饲料的质量比为1:25.97。

[0014] 进一步地，所述新鲜转vp28蓝藻由藻种Anabaena sp.PCC7120pRL-489-vp28经扩培制得。在一些优选的实施方式中，扩培条件为：培养基为BG-11无N培养基，pH为7.5，温度为32.5-33.5℃。

[0015] 在一些优选的实施方式中，所述水产用饲料药物粘合剂包括木薯淀粉和/或马铃薯淀粉；所述普通虾用饲料包括虾粉、去皮豆粕、高筋面粉、虾油、免疫多糖、蛋氨酸、赖氨酸、复合维生素和VC磷脂，优选地，所述虾粉为进口虾粉和/或普通虾粉。

[0016] 本发明的第二方面，在于上述转基因免疫口服剂的制备方法制得的转基因免疫口服剂。

[0017] 本发明的第三方面，在于上述转基因免疫口服剂在预防日本沼虾白斑综合征病毒的用途，投喂方法为：每天按所述日本沼虾体重的1％-10％投喂转基因免疫口服剂，且至少连续投喂7d以上；优选地，按所述转基因免疫口服剂为日本沼虾体重的5％进行投喂。

[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0019] 一、本发明的转基因免疫口服剂药效稳定、成本低：蓝藻细胞生长消耗基础营养液且增殖快速，vp28与蓝藻细胞组分在一起不易分解失活，药物饵料制备避免高温、长时间暴露等缺点，保证药物药效。

[0020] 二、本发明的制备方法首次将蓝藻粉通过水产用饲料药物粘合剂与普通虾用饲料进行粘合制成混合饵料，工艺简单、适用性广，且蓝藻本身可以作为虾的饵料，大规模培养蓝藻表达目的蛋白后，不需要将vp28从蓝藻中分离即可投喂虾进行免疫；其中，蓝藻粉可直接投喂幼虾，还可根据不同虾大小设计不同转基因免疫口服剂的口径用于投喂成虾。

[0021] 三、本发明的制备方法生产安全，成本低廉，且排放无任何污染。附图说明

[0022] 图1为本发明日本沼虾体内肝胰腺、腮、肌肉中的白斑综合征病毒含量；其中，P：阳性对照组；W：野生型组；B：空载体组；I1：免疫组1；I2：免疫组2。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例中实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。

[0024] 实施例1

[0025] 先由藻种Anabaena sp.PCC7120pRL-489-vp28扩培制得的新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序制成藻粉，再将1g上述藻粉与0.34g水产用饲料药物粘合剂混合均匀，并加到6.67mL的水中，边加边搅拌，当药液粘稠后加入25.97g普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得。

[0026] 其中，扩培条件为：培养基为BG-11无N培养基，配料参见申请号为201310228428.7中BG-11培养液的组成，pH为7.5，温度为33℃，扩培方法采用本领域的常规实验方法。水产用饲料药物粘合剂为木薯淀粉和马铃薯淀粉的混合物，是纯天然绿色产品，具有较强的粘性和弹性，口味温和无毒、易消化、有营养，透明且成形性好，减少动物挑食习惯，提高饲料利用率。普通虾用饲料为进口虾粉、普通虾粉、去皮豆粕、高筋面粉、虾油、免疫多糖、蛋氨酸、赖氨酸、复合维生素和VC磷脂的混合物，含有丰富的脂质成分、蛋白质和氨基酸。

[0027] 实施例2

[0028] 先由藻种Anabaena sp.PCC7120pRL-489-vp28扩培制得的新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序制成藻粉，再将1g上述藻粉与0.322g水产用饲料药物粘合剂混合均匀，并加到6mL的水中，边加边搅拌，当药液粘稠后加入25.9g普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得。

[0029] 实施例3

[0030] 先由藻种Anabaena sp.PCC7120pRL-489-vp28扩培制得的新鲜转vp28蓝藻经沉淀、离心、冷冻干燥工序制成藻粉，再将1g上述藻粉与0.358g水产用饲料药物粘合剂混合均匀，并加到7mL的水中，边加边搅拌，当药液粘稠后加入26.1g普通虾用饲料拌匀，于阴凉处晾干即得。

[0031] 效果例

[0032] 将上述实施例1制得的转基因免疫口服剂投喂日本沼虾，其中，转基因免疫口服剂为日本沼虾体重的1％-10％进行投喂且至少连续投喂7d以上。将投喂的日本沼虾分为如下6组进行处理：

[0033] (1)免疫组1(投喂低剂量转基因免疫口服剂饲料，转vp28蓝藻含量为30mg/d/尾)；

[0034] (2)免疫组2(投喂高剂量转基因免疫口服剂饲料，转vp28蓝藻含量为60mg/d/尾)；

[0035] (3)阴性对照组(既不喂转基因免疫口服剂，又不用WSSV攻毒)；

[0036] (4)阳性对照组(不喂转基因免疫口服剂，但用WSSV攻毒)；

[0037] (5)空载体组(投喂空载体蓝藻混合饲料，藻含量为30mg/d/尾)；

[0038] (6)野生型组(投喂野生型蓝藻混合饲料，藻含量为30mg/d/尾)。

[0039] 然后每组用WSSV攻毒四天后，检测日本沼虾体内腮、肝胰腺、尾部肌肉各组织中WSSV含量，按百分比计算，结果如附图1所示。由图可见，攻毒后各组沼虾体内均能检测到WSSV，但免疫组沼虾体内WSSV含量明显低于对照组。实验结果显示，感染日本沼虾同一个样本中病毒含量腮>肝胰腺>肌肉，其中，阳性对照组、野生型组、空载体组腮中WSSV含量达到108copies/mg，免疫组1降低了100倍，免疫组2降低了10000倍；肝胰腺中阳性对照组、野生型组、空载体组WSSV含量为107copies/mg，免疫组1和免疫组2分别降低了100倍与1000倍；
肌肉中WSSV含量较低，阳性对照组、野生型、空载体为106copies/mg，免疫组1降了100倍，而
2
免疫组2病毒含量低于10copies/mg。由此可见，上述转基因免疫口服剂有效降低了日本沼虾体内WSSV含量，从而抑制了白斑综合征的急性爆发，提高了存活率。

[0040] 另外，从免疫组1和免疫组2的对比数据可见，高剂量药物饲料比低剂量药物饲料更有效降低了日本沼虾体内WSSV含量。

[0041] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

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