包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)或白斑综合征(WSS)的饲料组合物
阅读：263发布：2020-05-24
专利汇可以提供包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)或白斑综合征(WSS)的饲料组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及用于 预防 或 治疗 急性肝胰腺 坏死 病(AHPND)或白斑综合征(WSS)的 饲料 组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。饲料组合物展现出抵抗引起虾AHPND的副溶血弧菌的抗菌活性和抵抗引起WSS的 白斑综合征病毒 (WSSV)的抗病毒活性。，下面是包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)或白斑综合征(WSS)的饲料组合物专利的具体信息内容。
1.用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
2.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述枯草芽孢杆菌是KCCM11143P、所述短小芽孢杆菌是KCCM11144P以及所述地衣芽孢杆菌是KCCM11270P。
3.根据权利要求1或2所述的饲料组合物，其中所述枯草芽孢杆菌、所述短小芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌的细菌计数为1×104CFU至1×1011CFU每克所述活性成分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的饲料组合物，其中所述急性肝胰腺坏死病(AHPND)由副溶血弧菌引起。
5.用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病的方法，包括向对象给予权利要求1至4中任一项所述的饲料组合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述对象是虾。
7.用于预防或治疗白斑综合征(WSS)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
8.根据权利要求7所述的饲料组合物，其中所述白斑综合征(WSS)由白斑综合征病毒(WSSV)引起。
9.根据权利要求7或8所述的饲料组合物，其中所述枯草芽孢杆菌是KCCM11143P、所述短小芽孢杆菌是KCCM11144P以及所述地衣芽孢杆菌是KCCM11270P。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的饲料组合物，其中所述枯草芽孢杆菌、所述短小芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌的细菌计数为1×104CFU至1×1011CFU每克所述活性成分。
11.用于预防或治疗白斑综合征(WSS)的方法，包括向对象给予权利要求7至10中任一项所述的饲料组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述对象是虾。
包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株
(AHPND)或白斑综合征(WSS)的饲料组合物
技术领域
[0001] 本公开涉及用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)或白斑综合征(WSS)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
背景技术
[0002] 早期死亡综合征(EMS)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)和急性肝胰腺坏死综合征(AHPNS)是虾养殖中快速发展的疾病，而副溶血弧菌是这些疾病的病原体；即，副溶血弧菌产生的昆虫毒素在6小时内或一周内导致100％的致死率(Tran等人.2013.Dis aquat Org 105:45-55)。昆虫毒素由存在于细菌的特定质粒中的特定基因的表达产生(即发光杆菌昆虫(photorhabdus insect)相关毒素；Pir毒素)，并且易于四处移动，即它们具有运动性。对此，这些疾病比诸如白斑综合征病毒(WSSV)、Taura综合征病毒(TSV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)等病毒性虾疾病传播得更快，其最近已受到关注。AHPND于2009年在中国开始，并在一年内在亚洲各国(例如泰国、马来西亚和越南)迅速传播，并进一步发生在墨西哥从而蔓延到其他中美洲国家，对大部分虾市场造成损失。韩国也因2015至2016年的AHPND遭受到极大的损失，而目前正在进行研究，以预防或控制疾病。
[0003] 最近，由于消费者对安全产品的需求和持续性养殖的生产策略，用于治疗现有病原菌的治疗剂受养殖相关法规的限制。因此，在虾养殖中，不仅要考虑到种子商品(seed goods)的质量和养殖方法，还要考虑控制疾病的重要因素。
[0004] 同时，益生菌被定义为微生物制剂或有助于肠道中微生物平衡的组分，并且具有与抗生素相反的词源含义，抗生素是指抗菌的物质。代表性地，益生菌的实例包括乳酸菌诸如乳杆菌和双歧杆菌。此外，益生菌不具有抵抗人类和动物的毒性基因，其也不产生致病物质，因此被归类为GRAS(通常被认为是安全的)。因此，使用益生菌的饲料添加剂(其安全性被证明)的开发已经积极地完成了。
[0005] 作为实例，韩国专利公开号10-2011-035554公开了新型的芽孢杆菌属的CMB L1和乳杆菌属的CMB201的混合菌株、使用其的抗癌和增强免疫力的食品组合物、和具有抗菌活性的微生物制剂。此外，韩国专利号10-0977407公开了一种用于动物的免疫增强剂和饲料添加剂，其含有拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的裂解物，其提高动物的嗜中性粒细胞、主要吞噬细胞的各种活性，并增强抵抗病原菌进行的侵袭接种的非特异性防御。然而，使用益生菌的饲料添加剂的实际免疫活性不足，因此需要对使用仍具有优异免疫活性的益生菌的饲料添加剂进行研究。
发明内容
发明内容
[0006] 技术问题
[0007] 本发明人已非常努力地开发补充有益生菌(芽孢杆菌)的虾饲料，从而预防虾AHPND或白斑综合征(WSS)。结果，他们已证实当向虾饲喂补充有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、和地衣芽孢杆菌的饲料组合物时，抵抗AHPND感染(由在2013年从越南的受影响区域分离的菌株所引起；Tran等人2013)或WSSV感染的虾的存活率得到提高，并且不仅虾的生长速度和非特异性免疫力得到提高，而且水质得到改善，以及可以获得高蛋白虾的生产，从而完成了本公开。
[0008] 技术方案
[0009] 本公开的目标是提供一种用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
[0010] 本公开的另一目标是提供一种预防或治疗急性肝胰腺坏死病的方法，包括向对象给予饲料组合物。
[0011] 本公开的又一目标是提供用于预防或治疗白斑综合征(WSS)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
[0012] 本公开的再另一目标是提供用于预防或治疗白斑综合征的方法，包括向对象给予饲料组合物。
[0013] 有利效果
[0014] 本公开的组合物具有抵抗副溶血弧菌(其引起对虾养殖造成问题的AHPND)的抗菌活性、和抵抗白斑综合征病毒(其引起WSS)的抗病毒活性、并展现出提高虾肝胰腺的免疫力的效果，所述组合物包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株，因此本公开的组合物可用作虾饲料组合物或饲料添加剂。附图说明
[0015] 图1是显示被副溶血弧菌感染的虾的存活率的图。
[0016] 图2是虾肝胰腺中AHPND含量的分析的图。
[0017] 图3是显示虾肝胰腺的病理学特征的图像。
[0018] 图4是显示虾的生长率的图。图4(a)至4(d)分别显示了最终体重、增重率、每日生长率和饲料转化率。
[0020] 图6是显示以零水交换(zero water exchange)来分析养殖水水质的结果的图。
[0021] 最佳实施方式
[0022] 在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的各个解释和示例性实施方式都可应用于其它解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应被下文中提供的具体公开内容限制。
[0023] 为了实现上述目标，本公开的方面提供了用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(AHPND)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
[0024] 如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌”是一种无毒且产生孢子的需氧细菌。枯草芽孢杆菌广泛分布于自然界中，如在干草、土壤、污水、空气等中。这种细菌因其产生凝固牛奶的酶、糖化淀粉、分解脂肪和油而广泛用于工业。细菌生长的最佳条件是pH为7至8.5，温度为37℃至40℃。由于芽孢杆菌属菌株的特征，该菌株不具有对人和动物的毒性基因、是非致病性的、不产生致病物质、并且在体内表现出快速的生长速率。枯草芽孢杆菌在葡萄糖等的存在下具有厌氧生境，并且内生孢子允许芽孢杆菌在诸如高温或低温的极端恶劣环境中生存。
[0025] 如本文所用，术语“短小芽孢杆菌”是一种产生孢子的需氧革兰氏阳性细菌。短小芽孢杆菌以菌落形式分布于土壤中或存在于某些植物的根部。短小芽孢杆菌孢子通常对包括暴露于紫外线、干燥和诸如过氧化氢的氧化剂存在的环境胁迫具有高抗性。
[0026] 如本文所用，术语“地衣芽孢杆菌”是一种常见于土壤中的细菌，并且是一种嗜温革兰氏阳性细菌。这种细菌的最佳生长温度为约50℃，但即使在高得多的温度下它也能存活。地衣芽孢杆菌可以以休眠孢子的形式存在，以抵御恶劣环境。
[0027] 在本公开中，枯草芽孢杆菌可以是以保藏号KCCM11143P保藏的菌株。
[0028] 在本公开中，短小芽孢杆菌可以是以保藏号KCCM11144P保藏的菌株。
[0029] 在本公开中，地衣芽孢杆菌可以是以保藏号KCCM11270P保藏的菌株。
[0030] 在本公开中，制备了包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)的饲料组合物。
[0031] 本公开的组合物可包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，其细菌计数为1×104CFU至1×1011CFU每克总活性成分。具体地，细菌计数可以是1×104CFU/g至1×1010CFU/g，并且更具体地，本公开的组合物包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，其细菌计数为1×108CFU/g至1×1010CFU/g。
[0032] 为了本公开的目标，饲料组合物中包含的作为活性成分的枯草芽孢杆菌可仅包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)。
[0033] 为了本公开的目标，饲料组合物中包含的作为活性成分的短小芽孢杆菌可仅包括短小芽孢杆菌(KCCM11144P)。
[0034] 为了本公开的目标，饲料组合物中包含的作为活性成分的地衣芽孢杆菌可仅包括地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)。
[0035] 如本文所用，术语“急性肝胰腺坏死病(AHPND)”是指一种名为早期死亡综合征(EMS)或急性肝胰腺坏死综合征(AHPNS)的疾病，概括性地指在放置于水产养殖场中30天内由病原体引起的群体死亡(mass mortality)。AHPND由副溶血弧菌引起，是一种存在于海水中的病原菌，在白腿虾中造成大量感染，占韩国养殖虾的约96％。由于生命早期的高死亡率，它对虾有害，但它对人类无害。副溶血弧菌是属于弧菌属的革兰氏阴性杆菌，其在人类中引起急性食物中毒和肠炎并引起鱼的弧菌病。最近，副溶血弧菌已被确认为急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病细菌，其导致虾养殖业中的群体死亡。
[0036] 如本文所用，术语“预防”是指通过给予根据本公开的包括枯草芽孢杆菌的组合物导致对虾AHPND的症状抑制或延迟的任何行为。
[0037] 如本文所用，术语“治疗”是指通过给予根据本公开的包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)的组合物导致对虾AHPND的症状缓解或完全康复的任何行动。
[0038] 除了所含作为活性成分的上述菌株外，组合物可以包括药物、食物或饲料用途可接受的已知的载体或添加剂。在本公开中，作为具有抵抗副溶血弧菌的抗菌活性的益生菌制剂，其包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，添加有粘合剂、乳化剂、防腐剂等以防止益生菌制剂质量的劣化(deterioration)；并且饲料添加有氨基酸、维生素、酶、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、提取剂、寡糖等以提高益生菌制剂的效力。除此之外，可进一步包括饲料混合物等，但本公开不限于此。
[0039] 在本公开的实施方式中，作为确认向虾饲喂饲料组合物是否会提高抵抗AHPND的免疫力并展现出疾病预防效果的结果，经确认相比于其中被给予比较实施例1(不包括益生菌)与比较实施例3和4(只包括枯草芽孢杆菌)的组(BS组3和4)，其中被给予本公开的包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株的饲料组合物(实施例5和6)的组(BS+BP+BL组1和2)可提高虾抵抗副溶血弧菌感染的抗病性并显著降低虾肝胰腺中AHPND的毒素量。
[0040] 在本公开的其它实施方式中，作为分析包括上述菌株的饲料组合物的非特异性免疫力的结果，经发现巨噬细胞(NBT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性、溶菌酶活性、酚氧化酶(PO)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和抗蛋白酶活性显著高于比较实施例中的那些。基于此结果，可见组合物可用于提高虾的非特异性免疫应答或提高其免疫力。
[0041] 本公开提供了用于虾养殖的饲料添加剂，其包括上述的饲料组合物。
[0042] 在本公开的饲料添加剂中，除上述活性成分外，可以添加药物、食物、或饲料用途可接受的已知载体或稳定剂。必要时，可以添加诸如维生素、氨基酸和矿物质的所有种类的营养素、抗氧化剂、以及其它添加剂，其形状可以是对其便利的，如粉末、颗粒、丸粒和悬浮液。当供给根据本公开的饲料添加剂时，所述饲料添加剂可单独地供给或与饲料混合供给非反刍类动物。
[0043] 另外，本公开提供了用于虾养殖的饲料，其包括上述的饲料添加剂。
[0044] 本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株，其为具有孢子形成能力的革兰氏阳性细菌，优选地以孢子形式被配制，但不限于此。本公开的饲料不受具体限制，而诸如粉末饲料、固体饲料、湿润丸粒饲料、干丸粒饲料、挤出机丸粒(EP)饲料和原饲料(raw feed)的任何饲料都是可用的。
[0045] 如上所述，芽孢杆菌形成内生孢子，因此对热非常稳定。因此，本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)分别可被制备成饲料添加剂形式，然后与饲料混合，或可在制备饲料时通过直接添加到饲料而被制备。包括在本公开饲料中的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以处于液体或干燥状态，并且优选地处于干燥粉末的形式。干燥过程可通过空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥进行，但不限于此。本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)可以基于饲料的重量、以按重量计0.05％至
10％，优选地按重量计0.1％至1％的量被混合成粉末形式。本公开的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以以1至5：1至5：1至5的浓度比混合。另外，饲料用于水产养殖，并且除了本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)之外，饲料可进一步包括能够提高饲料的保藏性的常规添加剂。
10％，优选地按重量计0.1％至1％的量被混合成粉末形式。本公开的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以以1至5：1至5：1至5的浓度比混合。另外，饲料用于水产养殖，并且除了本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)之外，饲料可进一步包括能够提高饲料的保藏性的常规添加剂。
[0046] 为了实现上述目标，本公开的另一方面提供了用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病的方法，包括向对象给予本公开的饲料组合物。
[0047] 在本文中，本公开的急性肝胰腺坏死病、预防和治疗如上文所述。
[0049] 饲料优选地以与常规饲料相同的量和相同的饲喂间隔供给。另外，病原菌指代在虾养殖中通过诱发AHPND而引起虾的群体死亡的细菌，并且具体地可以指代副溶血弧菌。
[0050] 在虾养殖中，群体死亡的原因不仅包括副溶血弧菌而且包括由各种病毒导致的感染和养殖水中氨的浓度。在虾养殖中，养殖水中的氨作为诸如虾排泄物、饲料废物等的蛋白质的代谢物出现，并且其随pH和水温的升高而很大地变化。高浓度氨是虾急性死亡的直接原因，导致群体死亡；并且低浓度氨从长期来看可导致虾的生长以及饲喂能力和免疫力的降低，进而可导致各种疾病的发展。
[0051] 在本公开的实施方式中，对其中已被饲喂本公开的饲料组合物的虾的养殖水进行收集和分析，并且作为结果，发现养殖水中总氨浓度显著低于对照的总氨浓度，从而本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株可提高养殖虾的水的水质。
[0052] 如上所述，本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)不仅可以增强虾的抗病性还可以抑制虾肝胰腺中AHPND的毒素。因此，通过使用所述菌株，可以获得预防引起疾病的副溶血弧菌的效果，也可以获得增强对白斑综合征病毒的抵抗的效果，从而能够更安全地养殖虾。
[0053] 为了实现上述目标，本公开的又另一方面提供了用于预防或治疗白斑综合征(WSS)的饲料组合物，包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株；其培养基；其浓缩物；或其干物质。
[0054] 本公开的术语枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、预防和治疗如上所述。
[0055] 本公开的组合物可包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，其细菌计数为1×104CFU至1×1011CFU每克总活性成分。具体地，细菌计数可以是1×104CFU/g至1×1010CFU/g，并且更具体地，本公开的组合物包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，其8 10
细菌计数为1×10CFU/g至1×10 CFU/g。
细菌计数为1×10CFU/g至1×10 CFU/g。
[0056] 如本文所用，术语“白斑综合征病毒(WSSV)”是指广泛分布于世界各地的病毒。由于WSSV在病毒体末端具有尾状附着物，并且具有类似于蛋形芽孢杆菌的形式，其中存在杆形壳体和被膜，因此它被认为是杆状病毒或芽孢杆菌样形成的病毒；然而，最近，它已被重命名为whispovirus，这是一种遗传上新的病毒组。该病毒长约275nm，直径约120nm，并且由大小约290kb的双链DNA组成。
[0057] 组合物除了所含作为活性成分的上述菌株之外可包括药物、食物或饲料用途可接受的已知载体或添加剂。在本公开中，作为具有抵抗白斑综合征病毒的抗病毒活性的益生菌制剂，其包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)，添加有粘合剂、乳化剂、防腐剂等以防止益生菌制剂质量的劣化；并且饲料添加有氨基酸、维生素、酶、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、提取剂、寡糖等以提高益生菌制剂的效力。除此之外，可进一步包括饲料混合物等，但本公开不限于此。
[0058] 在本公开的实施方式中，作为确认向虾饲喂饲料组合物是否会提高抵抗白斑综合征的免疫力并展现出疾病预防效果的结果，经确认相比于其中被给予比较实施例1(不包括益生菌)和只包括枯草芽孢杆菌KCCM11143P菌株的饲料组合物(比较实施例4)的组(BS组4)，其中被给予本公开的包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株的饲料组合物(实施例5和6)的组(BS+BP+BL组1和2)可提高虾抵抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的抗病性。
[0059] 在本公开的其它实施方式中，作为确认当向虾饲喂饲料组合物时对白斑综合征病毒(WSSV)和急性肝胰腺坏死病(AHPND)的复合(complex)感染的抵抗是否提高并且存活率增强效果是否会展现的结果，经确认相比于其中被给予比较实施例1(不包括益生菌)和只包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株的饲料组合物(比较实施例4)的组(BS组4)，其中被给予包括枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM11144P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株的饲料组合物(实施例5和6)的组(BS+BP+BL组1和2)可以增强虾抵抗WSSV和AHPND的复合感染的抗病性。
[0060] 本公开提供了用于虾养殖的饲料添加剂，包括上述的饲料组合物。
[0061] 在本公开的饲料添加剂中，可以添加除了上述活性成分外的药物、食物或饲料用途可接受的已知载体或稳定剂。必要时，可以添加诸如维生素、氨基酸和矿物质的所有种类的营养素、抗氧化剂、以及其它添加剂，其形状可以是对其便利的，如粉末、颗粒、丸粒和悬浮液。当供给根据本公开的饲料添加剂时，所述饲料添加剂可单独地供给或与饲料混合供给非反刍类动物。
[0062] 另外，本公开提供了用于虾养殖的饲料，包括上述的饲料添加剂。
[0063] 本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)菌株、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)菌株和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)菌株，其为具有孢子形成能力的革兰氏阳性细菌，优选地以孢子形式被配制，但不限于此。本公开的饲料不受具体限制，而诸如粉末饲料、固体饲料、湿润丸粒饲料、干丸粒饲料、挤出机丸粒(EP)饲料和原饲料的任何饲料都是可用的。
[0064] 如上所述，芽孢杆菌形成内生孢子，因此对热非常稳定。因此，本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)可分别被制备成饲料添加剂形式，然后与饲料混合，或可在制备饲料时通过直接添加到饲料而被制备。本公开的饲料中包括的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以处于液体或干燥状态，并且优选地处于干燥粉末的形式。干燥过程可通过空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥进行，但不限于此。本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)可以基于饲料的重量、以按重量计0.05％至
10％，优选地按重量计0.1％至1％的量被混合成粉末形式。另外，饲料用于水产养殖，并且除了本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)之外，饲料可进一步包括能够提高饲料的保藏性的常规添加剂。
10％，优选地按重量计0.1％至1％的量被混合成粉末形式。另外，饲料用于水产养殖，并且除了本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)之外，饲料可进一步包括能够提高饲料的保藏性的常规添加剂。
[0065] 为了实现上述目标，本公开的又另一方面提供了用于预防或治疗白斑综合征的方法，包括向对象给予本公开的饲料组合物。
[0066] 在本文中，本公开的术语白斑综合征、预防、治疗和对象如上所述。
[0067] 在虾养殖中，群体死亡的原因不仅包括副溶血弧菌而且包括由各种病毒导致的感染。具体地，病毒可以指代白斑综合征病毒(WSSV)。
[0068] 如上所述，本公开的枯草芽孢杆菌(KCCM11143P)、短小芽孢杆菌(KCCM1114P)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P)可以获得增强对白斑综合征病毒(WSSV)的抵抗的效果，从而能够更安全地养殖虾。
具体实施方式
[0069] 在下文中，将通过示例性实施方式详细描述本公开。然而，这些示例性实施方式仅出于示例性目的并且不意图限制本公开的范围。
[0070] 制备实施例1.具有抗菌活性的益生菌的选择
[0071] 为了选择具有抵抗诱发虾AHPND的副溶血弧菌的抗菌活性的菌株，进行透明区域(clear zone)试验。将0.5％琼脂(3mL)和100μL的病原菌振荡培养物(2.0×109CFU/mL)混+合并接种在TSA 培养基上从而制备上层(顶层，top)琼脂。12种枯草芽孢杆菌菌株(由CJ CheilJedang持有并且是商业菌株)的培养物，每一种的量是10μL，滴在所制备的上层琼脂的上部(顶部，top)，30℃下培养18小时，并观察清洁区域的存在/不存在。一起评估可商购的枯草芽孢杆菌和复合噬菌体的抗菌活性。
[0072] [表1]
[0073]
[0074]
[0075] ++++：强活性，+：存在活性，-：无活性
[0076] 如上表1中所示，枯草芽孢杆菌1微生物(CJBS-01)显示出抵抗引起AHPND的副溶血弧菌的最优异的体外抗菌效果。然而，虽然该微生物显示出抵抗特定病原体的体外抗菌活性，但是所观察到的抗菌活性只是体外效果，并且其不一定意味着动物对副溶血弧菌的摄取将能够提供给动物免疫力或抵抗特定病原体的预防效果。
[0077] 因此，在下述实验中，考察了当饲喂给虾时枯草芽孢杆菌1(CJBS-01)微生物是否会导致展现免疫力提高以及虾抵抗AHPND病的疾病预防效果。另外，还考察了枯草芽孢杆菌1(CJBS-01)是否对增重和消化率有影响。
[0078] 枯草芽孢杆菌1(CJBS-01)是2010年12月14日保藏于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(KCCM)的菌株，并指定保藏号为KCCM11143P。
[0079] 制备实施例2.用于虾的含枯草芽孢杆菌的饲料组合物的制备
[0080] 制备在制备实施例1中所选择的含枯草芽孢杆菌1(保藏号KCCM11143P，在下文中为“BS”)的饲料组合物。
[0081] 具体地，不含枯草芽孢杆菌的比较实施例1、含可商购的芽孢杆菌种属(即，三种芽孢杆菌种属(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的混合制备物)的比较实施例2和含所选的量为1010×0.2CFU/g的枯草芽孢杆菌1(BS)的实施例1的组合物各自与鱼油和水混合，并以丸粒形式制备。利用干燥器将比较实施例1和2与实施例1的饲料组合物在25℃下干燥约24小时，并在-20℃下储存直至后续实验。
[0082] [表2]
[0083]
[0084]
[0085] 实验实施例1.饲料组合物抵抗AHPND的预防效果的评估
[0086] 1-1.虾的准备和生长率的评估
[0087] 总共40个水箱，每个水箱中准备三十只白腿虾。所有实验水箱都装备有气石(air stones)以维持溶解氧，并且在整个实验期间将水箱温度维持在28℃至32℃的范围内。以有限的供给于一天4次饲喂饲料(鱼重量的4％至12％)。
[0088] 每2周测量虾的重量。评估项目和与生长率和饲料功效相关的计算等式如下：
[0089] ·增重(％)＝
[0090] 100×(最终平均体重–初始平均体重)/平均体重
[0091] ·饲料转化率(％)＝增重的量/饲料摄入的量
[0092] ·每日比生长率(％天-1)＝
[0093] 100×(loge最终体重–loge初始体重)/天数
[0094] 为了将实验饲料分布，进行完全随机化的设计并利用SPSS版本18.0程序通过单向ANOVA来统计学分析生长和分析的结果。在邓肯多重范围检验(Duncan’s multiple range test)(P<0.05)之间比较数据值的显著差异。数据被表示为平均值±SD，而百分比数据被计算为反正弦变换值并被统计学分析。
[0095] [表3]
[0096] 对照组1 对照组2 BS组1
IBW1(g) 0.51±0.01 0.51±0.01 0.51±0.01
FBW2(g) 3.49±0.12bc 3.80±0.22ab 3.86±0.18a
WG3(％) 592±18.9c 655±39.3ab 667±31.9a
4 b a a
SGR(％) 6.04±0.09 6.31±0.16 6.37±0.13
FCR5 1.30±0.26 1.28±0.09 1.19±0.12
存活率(％) 80.0±3.33 75.6±6.94 71.1±6.94
IBW1(g) 0.51±0.01 0.51±0.01 0.51±0.01
FBW2(g) 3.49±0.12bc 3.80±0.22ab 3.86±0.18a
WG3(％) 592±18.9c 655±39.3ab 667±31.9a
4 b a a
SGR(％) 6.04±0.09 6.31±0.16 6.37±0.13
FCR5 1.30±0.26 1.28±0.09 1.19±0.12
存活率(％) 80.0±3.33 75.6±6.94 71.1±6.94
[0097] 1IBW：初始体重
[0098] 2FBW：最终体重
[0099] 3WG：增重(％)＝[(最终体重–初始体重)/初始体重]×100
[0100] 4SGR：每日比生长率(％天-1)＝[(loge最终体重–loge初始体重)/天数]×100[0101] 5FCR：饲料转化率＝饲喂的干饲料/湿增重
[0102] 如表3中所示，作为饲喂检验的结果，经确认相比于分别以比较实施例1和比较实施例2的饲料组合物提供的对照组1和对照组2，以含制备实施例1中所选的枯草芽孢杆菌1(BS)的实施例1的饲料组合物提供的BS组1展现出显著更高的生长率。另外，经确认以实施例1的饲料组合物提供的组的每日比生长率显著高于分别以比较实施例1和比较实施例2的饲料组合物提供的组。
[0103] 1-2.副溶血弧菌对虾的侵袭的测试
[0104] 经总共两个分开的测试进行副溶血弧菌对虾的侵袭的测试。在弧菌菌株的情况下，2013年在越南分离的引起AHPND(EMS)的菌株被用于测试。侵袭测试如下进行：将实施例的饲料组合物饲喂给虾持续两周，然后将具有相同重量(平均重量：2.32g)的虾分配成4个重复，其中每组96只虾。采用TSB+培养基、在30℃下、以150rpm培养细菌24小时，并且将浓度为2×109CFU(OD：1.7)的副溶血弧菌(30mL)的悬浮液浸渍20个丙烯酸水箱(110L，工作体积：72.5L)中的每一个。浸渍之后，每小时确认虾的存活率和游动状态，并在8小时后，更换95％的水。一天三次(在8:30、13:30和18:30时)，以受限方式，分剂量给予测试饲料(鱼体重的10至12％)，观察死亡程度70小时。结果显示在下表4中。
[0105] [表4]
[0106]
[0107]
[0108] 如上表4所示，相比于对照组1和对照组2，以含制备实施例1中所选的枯草芽孢杆菌1(BS)的饲料组合物提供的BS组1在副溶血弧菌对虾的侵袭测试中展现出更高的存活率。
[0109] 另外，如图1中所述，在上述两个测试中通常观察到在将副溶血弧菌浸渍后，虾的移动变得缓慢，并且它们坐在水箱的底部而无游动活动，并且它们的饲料摄入也不积极。在浸渍8小时后，虾的迅速死亡开始出现，并且BS组1的存活率相比于对照组1或对照组2高至少17％。
[0110] 1-3.收集样本的方法和组织病理学分析的方法
[0111] 在副溶血弧菌对虾的侵袭测试的开始(在感染前)、中间时间(感染)和完成的各时间点处，每组随机选择两只虾并提取其肝胰腺。所提取的肝胰腺的一部分储存在乙醇(100％)中，用于定量实时PCR(qPCR)分析，而另一部分固定在Davidson固定剂(Davidson’s fixative)中24小时，然后储存在乙醇(70％)中，用于组织病理学分析。
[0112] 更具体地，通过如下方法进行组织病理学分析。
[0113] 为了最小化对提取的肝胰腺组织的损伤，在每个水箱取样后立即使用1mL注射器将Davidson固定剂注入虾的肝胰腺中，并提取肝胰腺。然后，将每个提取的肝胰腺在含有Davidson固定剂的1.5mLEppendorf管中固定24小时，储存在乙醇(70％)中，并用于分析。完成固定后，将器官修剪至尺寸为约2mm至约3mm的厚度，以适于制备组织样本并插入盒(cassette)中，并将它们的组织处理13小时。将这些组织薄切成约4μm的厚度，并用刷子收集所得样本，在无任何皱纹的情况下附着在每个载玻片上，置于空气中约5分钟，然后进行H&E染色。完成染色后，使用相差显微镜(BX50，Olympus)，使用用于显微镜的专业程序(TCapture，Tucen Photonics)将载玻片在200×放大率下拍照。然后，对于取样的肝胰腺中存在的AHPND毒素的量进行qPCR分析。
[0114] 结果显示在图2中，其中较低的Ct值表示较高量的毒素。
[0115] 在侵袭测试前的时间点(即0小时)取样的肝胰腺中，在所有组中均未检测到AHPND毒素，而在侵袭测试的10小时时间点(即10h；当死亡对象的数量最高时)取样的肝胰腺中，在所有样本中均检测到AHPND毒素。然而，与对照组1和对照组2相比，提供有包含根据本公开的枯草芽孢杆菌的饲料组合物的BS组1显示出显著更高的Ct值，并且在侵袭测试的24小时时间点取样的的肝胰腺中，在BS组1中检测到最低水平的AHPND毒素。此外，在侵袭测试的终止时间点(即193小时)，在BS组1和对照组2中未检测到AHPND毒素。
[0116] 另外，肝胰腺的组织病理学分析结果在图3中显示。
[0117] 在侵袭测试前的时间点(即0小时)取样的肝胰腺中，在所有组中观察到异常组织。在10小时时间点取样的肝胰腺中，对照组1中的损伤水平显示为最严重，并且在BS组1和对照组2中观察到组织坏死的进展。在24小时时间点取样的肝胰腺中，观察到炎症，而不是由AHPND毒素引起的组织坏死。在侵袭测试的终止时间点(即193小时)取样的肝胰腺中，由于在对照组1中37小时的时间点发生100％死亡，因此不可能进行取样，而在BS组1和对照组2中观察到一些炎性细胞。
[0118] 从以上结果可以确认，含有根据本公开的枯草芽孢杆菌的饲料组合物不仅可以提高虾对副溶血弧菌感染的抗病性，而且还可以显著降低虾的肝胰腺中AHPND毒素的量。
[0119] 实验实施例2.根据枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的浓度评价生长率和免疫力
[0120] 考虑制备实施例2中的结果，制备包含制备实施例1中所选的枯草芽孢杆菌1(KCCM11143P，在下文中为“BS”)、短小芽孢杆菌(KCCM11144P，在下文中为“BP”)和地衣芽孢杆菌(KCCM11270P，在下文中为“BL”)中的每一个的各种浓度的饲料组合物(实施例1至5)。结果显示在下表5中。
[0121] [表5]
[0122]
[0123]
[0124] 表5中各组的组合物通过加入鱼油和水、混合、然后造粒来制备。使用干燥器将表5中各组的组合物在25℃下干燥约24小时，并在-20℃下储存直至后续实验。
[0125] 2-1.虾的准备和生长率的评估
[0126] 在总共280个水箱中的每个水箱中准备五只白腿虾。所有的实验水箱都装备有气石以维持溶解氧，并且水箱的温度在整个实验期间维持在28℃到32℃的范围内。饲料每天饲喂4次，持续8周，有限供应(鱼重量的6％至12％，初始体重：0.14克)。
[0127] 每2周测量虾的重量。与生长率和饲料效率相关的评估项目和计算等式如下：
[0128] ·增重(％)＝
[0129] 100×(最终平均体重–初始平均体重)/平均体重
[0130] ·饲料转化率(％)＝增重的量/饲料摄入的量
[0131] ·每日比生长率(％天-1)＝
[0132] 100×(loge最终体重–loge初始体重)/天数
[0133] 结果显示在下表6中。
[0134] [表6]
[0135]
[0136] *(P<0.05)
[0137] 1IBW：初始体重
[0138] 2FBW：最终体重
[0139] 3WG：增重(％)＝[(最终体重–初始体重)/初始体重]×100
[0140] 4SGR：每日比生长率(％天-1)＝[(loge最终体重–loge初始体重)/天数]×100[0141] 5FCR：饲料转化率＝饲喂的干饲料/湿增重
[0142] 如表6和图4中所示，相比于饲喂之前的那些，饲喂8周的所有组的虾显示了超过7,000％的生长率。具体地，BS组1(提供有实施例1的饲料组合物)的最终平均体重和BS组2(提供有实施例2的饲料组合物)的最终平均体重比对照组1的最终平均体重分别大15.7％和
16.7％。BS+BP组1(提供有实施例3的饲料组合物)的最终平均体重、BS+BP组2(提供有实施例4的饲料组合物)的最终平均体重和BS+BP+BL组1(提供有实施例5的饲料组合物)的最终平均体重相比于对照组1的最终平均体重分别增加了7.8％、15.6％和8.8％。另外，关于每日比生长率，BS组1和BS组2的值相比于对照组1分别显示增加3.4％和4.1％。BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1的每日比生长率相比于对照组1分别增加2.4％、3.4％和2.5％。BS组1和BS组2的饲料效率相比于对照组1分别提高27.5％和26.1％。BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1的饲料效率相比于对照组1分别提高11.1％、20.9％和13.1％。然而，所有组中虾的存活率没有显著差异。
16.7％。BS+BP组1(提供有实施例3的饲料组合物)的最终平均体重、BS+BP组2(提供有实施例4的饲料组合物)的最终平均体重和BS+BP+BL组1(提供有实施例5的饲料组合物)的最终平均体重相比于对照组1的最终平均体重分别增加了7.8％、15.6％和8.8％。另外，关于每日比生长率，BS组1和BS组2的值相比于对照组1分别显示增加3.4％和4.1％。BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1的每日比生长率相比于对照组1分别增加2.4％、3.4％和2.5％。BS组1和BS组2的饲料效率相比于对照组1分别提高27.5％和26.1％。BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1的饲料效率相比于对照组1分别提高11.1％、20.9％和13.1％。然而，所有组中虾的存活率没有显著差异。
[0143] 2-2.样本收集
[0144] 每2周对测试虾进行称重，并且所有测试虾都在测量前18小时禁食以减少虾的应激(stress)。
[0145] 在测量最终重量后，从每个水箱中随机选择7只虾并在冰水中麻醉，并使用通过Alsever溶液(Alsever’s solution)处理的注射器收集血淋巴。收集的血淋巴用于分析氮蓝四唑(NBT)活性，其中使用离心机(800g，10分钟，4℃)分离血清的样本用于分析非特异性免疫力。
[0146] 关于用于消化率分析的虾粪的收集，在饲喂30分钟后通过虹吸和水更换来清洁水箱中剩余的饲料和杂质，并且此后3小时，使用虹吸管收集排泄的粪便。收集的样本用蒸馏水洗涤，通过滤纸过滤，并储存在-40℃的低温冷冻机中直至用作分析样本。
[0147] 2-3.统计学分析
[0148] 对于实验饲料的分布，进行完全随机化设计，并使用SPSS版本18.0程序通过单向ANOVA统计学分析生长和分析的结果。在邓肯多重范围检验(P<0.05)之间比较数据值的显著差异。数据被表示为平均值±SD，而百分比数据被计算为反正弦变换值并被统计学分析。
[0149] 2-4.常规成分的分析
[0150] 根据AOAC(2005)方法分析测试饲料与粪便的常规成分；通过大气压力加热干燥法(125℃，3h)(Kejltec系统2300，瑞典)分析水分含量；通过直接焚烧法(550℃，4h)分析粗灰分；通过自动化粗蛋白分析仪(Kejltec系统2300，瑞典)分析粗蛋白；并通过Folch等人(1957)的方法分析粗脂质。结果显示在下表7中。
[0151] [表7]
[0152] 对照组1 对照组2 BS组1 BS组2 BS+BP组1 BS+BP组2 BS+BP+BL组1
干物质 24.9±0.35 24.5±0.10 23.7±0.39 23.7±0.35 25.1±0.36 24.3±0.23 24.3±0.16粗灰分 12.9±2.34 12.8±0.12 12.3±0.33 14.5±0.22 14.8±3.47 13.9±1.46 14.6±3.60粗蛋白 76.5±3.46b 82.0±1.67a 84.3±2.85a 83.9±2.31a 79.4±2.23ab 82.0±3.58a 81.8±1.52a粗脂质 5.37±0.96 5.45±1.15 5.09±0.28 5.26±1.05 5.29±0.12 5.40±0.53 5.59±0.73[0153] (*P<0.05)
干物质 24.9±0.35 24.5±0.10 23.7±0.39 23.7±0.35 25.1±0.36 24.3±0.23 24.3±0.16粗灰分 12.9±2.34 12.8±0.12 12.3±0.33 14.5±0.22 14.8±3.47 13.9±1.46 14.6±3.60粗蛋白 76.5±3.46b 82.0±1.67a 84.3±2.85a 83.9±2.31a 79.4±2.23ab 82.0±3.58a 81.8±1.52a粗脂质 5.37±0.96 5.45±1.15 5.09±0.28 5.26±1.05 5.29±0.12 5.40±0.53 5.59±0.73[0153] (*P<0.05)
[0154] 如表7中所示，关于粗灰分和粗脂质的含量，组之间没有显著差异。然而，BS组2中粗蛋白的含量相比于对照组1和对照组2的粗蛋白的含量显著更高。即，经确认当向虾提供根据本公开的饲料组合物时，虾的蛋白质含量可被增加。
[0155] 2-5.与非特异性免疫相关的分析
[0156] 2-5-1.氮蓝四唑(NBT)活性的分析
[0157] 使用Zhang等人(2013)的分析方法测定呼吸性爆炸(respiratory explosion)期间嗜中性粒细胞产生的氧化自由基的量。
[0158] 具体地，首先，将血淋巴(50μL)与200μL的Hank平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)(HBSS)混合，并使其在25℃下反应。30分钟后，向其中加入100μL酵母聚糖(0.1％Hank溶液)并在37℃下反应2小时。每次以100μL的量向其中加入NBT溶液(0.3％)并在37℃下反应2小时。向其中加入100％甲醇(600μL)并将混合物以6,500rpm的速率离心10分钟。弃去上清液，并用70％甲醇(100μL)洗涤丸粒3次，并且干燥5分钟。然后，向其中加入2M KOH(700μL)和DMSO(800μL)，并在620nm处测量所得物的吸光度。
[0159] 2-5-2.谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的分析
[0161] 具体地，作为氢过氧化枯烯，使用其中混合过氧化物底物(ROOH)、谷胱甘肽还原酶(GSSG-R)和还原的b-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(b-nicotinamide adenine denucleotide phosphate)(NADPH)的反应混合物。首先，将血淋巴样本(50μL)加入小平板器(microplater)中，并向其中加入反应混合物(40μL)并反应。然后，向其中加入氢过氧化枯烯(10μL)，5分钟后，在340nm处测量所得物的吸光度。GPx活性被计算为nmol/min/mL。
[0162] 2-5-3.溶菌酶活性的分析
[0163] 基于Swain等人(2007)的方法分析溶菌酶活性分析。
[0164] 具体地，溶菌酶是参与非特异性(先天性)免疫应答的抗菌酶，是以非特异性方式而不是以针对特定细菌的特异性方式展现出抵抗各种细菌的抗菌活性的酶。
[0165] 抵抗病原菌的抗菌机制是水解肽聚糖的β-1,4-糖苷键的抗菌作用，肽聚糖是细菌细胞壁的组成部分，从而破坏细菌细胞壁。溶菌酶对革兰氏阳性细菌特别有效。基于这种机制，溶菌酶活性被广泛用于分析以测量虾(包括鱼)中的非特异性免疫应答。当将免疫刺激物(例如抗坏血酸、β-葡聚糖、益生菌等)添加到虾饲料中时，可以确认虾的血淋巴和组织中溶菌酶活性提高，并且这些结果被解释为增加非特异性免疫应答或提高鱼(虾)的免疫力。
[0166] 2-5-4.酚氧化酶(PO)活性的分析
[0167] 基于Hernandez-Lopez等人(1996)的方法分析酚氧化酶(PO)活性。
[0168] 具体地，酚氧化酶是在甲壳纲动物的防御机制中具有重要作用的酶，其在血细胞中以酚氧化酶的形式存在并由前酚氧化酶活化系统活化。活化的酚氧化酶产生调理素，其促进血细胞的吞噬作用和对外来抗原的包被作用并参与血液凝固反应。因此，血淋巴内的酚氧化酶活性被用作虾的先天免疫力的重要指标。
[0169] 2-5-5.超氧化物歧化酶(SOD)活性的分析
[0170] 使用SOD测定试剂盒(Sigma-Aldrich，19160，圣路易斯，美国)分析SOD活性。
[0171] 具体地，将自由基检测器(radical detector)(20μL)添加到96孔板中，并且将每个血液样本(20μL)添加到每个孔中。然后，向其中加入黄嘌呤氧化酶(20μL)并反应20分钟。使用Microplate Reader(Thermo)在450nm处测量所得物的吸光度。
[0172] 2-5-6.抗蛋白酶活性的分析
[0173] 使用Ellis(1990)的分析方法分析血淋巴内抗蛋白酶的活性。
[0174] 具体地，将血淋巴(20μL)和标准胰蛋白酶溶液(20μL；来自猪胰的II-S型，Sigma-Aldrich，A2765，圣路易斯，美国)混合并在22℃下培养10分钟。向其中加入磷酸盐缓冲液(200μL；0.1M，pH7.0)和偶氮酪蛋白(2％)(250μL；Sigma-Aldrich)，在22℃下培养1小时，并向其中再次加入三氯乙酸(500μL；10％)(TCA)，并在22℃下培养30分钟。将培养溶液离心(6000g，5分钟)，并将所得物(100μL)接种到96孔板中，并向其中加入1N NaOH(100μL)，并且使用Microplate Reader在430nm处测量所得物的吸光度。
[0175] 下表8中显示了其中进行了非特异性免疫学分析的实验实施例2-5-1至2-5-6的结果。
[0176] [表8]
[0177]
[0178]
[0179] (*P<0.05)
[0180] 1氮蓝四唑；吞噬活性(吸光度)
[0181] 2酚氧化酶活性(吸光度)
[0182] 3抗蛋白酶(％抑制率)
[0183] 4溶菌酶活性(μg mL-1)
[0184] 5超氧化物歧化酶(％抑制率)
[0185] 6谷胱甘肽过氧化物酶(mU mL-1)
[0186] 如表8和图5中所示，关于NBT活性和PO活性，BS组1、BS组2、BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1都显示了相比于对照组1和对照组2显著更高的值；并且具体地，在PO活性的情况下，BS组1的值显示相比于对照组1高26.8％。关于抗蛋白酶活性，BS组1、BS组2、BS+BP组2和BS+BP+BL组1都显示了相比于对照组1和对照组2显著更高的值；并且具体地，BS组1的值显示相比于对照组1高15.8％。关于溶菌酶活性和SOD活性，BS组1、BS组2、BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1都显示相比于对照组1显著更高。关于GPx活性，BS组1、BS组2、BS+BP组1、BS+BP组2和BS+BP+BL组1的值都显示相比于对照组1和对照组2显著更高；并且具体地，BS组1和BS组2的值显示相比于对照组1分别高27.7％和28.8％。
[0187] 2-6.水质的分析和零水交换实验
[0188] 在饲喂实验的8周期间，每5天从每个水箱收集一次培养水样本。从每个箱中的相同位置收集样本，并测量溶解氧(DO)、盐度、pH和氨(NH4+)浓度的水平。通过Thermo Scientific Orion Star A216 Benchtop Meter(ThermoScientific)测量DO，通过Master Refractometer(ATAGO)测量盐度。通过Seven Compact(METTLER TOLEDO)测量pH，并通过根据Verdouw等人(1978)的方法分析NH4+的浓度。
[0189] 使用零换水方法(zero water change method)，将平均重量为2.87(±0.08)g的十二只白腿虾(南美白对虾(L.vannamei))随机放入总共14个水箱的每个96L水箱中。每个测试组有两个重复，并且一天四次，以分剂量(在08:30、12:00、15:30和19:00时)给予虾其体重10％的测试饲料。根据Verdouw等人(1978)，一天收集一次水样，并测量水样中的总氨浓度持续10天。结果显示在表9中。
[0190] [表9]
[0191] DO mgL-1 pH NH4+mgL-1
平均值 6.85 7.10 0.102
最大值 7.21 6.78 0.154
最小值 6.39 6.48 0.035
平均值 6.85 7.10 0.102
最大值 7.21 6.78 0.154
最小值 6.39 6.48 0.035
[0192] 如表9和图6中所示，有趣地是，经发现从第7天起，所有测试组都开始显示比对照组低的总氨浓度，并且在第10天，所有测试组都显示比对照组显著低的氨浓度。
[0193] 2-7.消化率的分析
[0194] 2-7-1.指示物(Cr2O3)的分析
[0195] 为了分析测试饲料和粉末中氧化铬的含量，使用根据Divakaran等人(2002)的方法。
[0196] 具体地，将测试饲料和粉末样本在灰化炉(550℃)中进行灰化4小时，并将获得的样本用于分析。首先，为了将氧化铬氧化成单铬酸盐形式，称量5mg至10mg粉末样本并转移到玻璃试管中。将4mL高氯酸试剂(HClO4)加入含有样本的玻璃试管中。通过在100mL蒸馏水中混合200mL硝酸、冷却混合物、然后向其中混合200mL的70％高氯酸来制备高氯酸试剂(70％)。将含有样本和高氯酸试剂的玻璃试管置于加热板中，在300℃下加热15分钟，然后冷却至室温。将预处理的样本转移到50mL玻璃烧瓶中，并用三蒸水定量至25mL。此后，使用分光光度计(Beckman DU-730)在350nm处测量吸光度。使用如在样本分析中从预处理的标准溶液制备的标准等式，将测量的吸光度用于计算样本的氧化铬含量。
[0197] 2-7-2.干物质和蛋白质消化率的分析
[0198] 通过以下方法计算干物质和测试饲料的蛋白质消化率：
[0199] 干物质的ADC(％)＝100–100×(饮食中的％Cr2O3/粪便中的％Cr2O3)；
[0200] 蛋白质的ADC(％)＝100–100×(饮食中的％Cr2O3/粪便中的％Cr2O3)×(粪便中的％蛋白质/饮食中的％蛋白质)
[0201] 表10中显示了在饲喂实验结束时进行的消化率分析的结果。
[0202] [表10]
[0203]
[0204] 数值是三次重复组的平均值并表示为平均值±SD。相同栏中带有不同上标的数值是显著不同的(P<0.05)。
[0205] 1干物质的表观消化率系数
[0206] 2蛋白质的表观消化率系数
[0207] 如表10中所示，所有测试组都显示比对照组显著更高的干物质消化率和蛋白质消化率。
[0208] 制备实施例3.包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的虾饲料组合物的制备
[0209] 制备包括制备实施例1中所选的枯草芽孢杆菌1(保藏号KCCM11143P，在下文中被称为‘BS’)、短小芽孢杆菌(保藏号KCCM11144P，在下文中被称为‘BP’)和地衣芽孢杆菌(在下文中被称为‘BL’)的饲料组合物。
[0210] 具体地，通过添加鱼油和水并将其混合，以丸粒形式制备不含芽孢杆菌种属菌株的比较实施例1的组合物、含109×0.2CFU/g的BS的比较实施例3的组合物、含1010×0.2CFU/g的BS的比较实施例4的组合物、含109×0.2CFU/g的BS、BP和BL的实施例5的组合物，以及含10
10 ×0.2CFU/g的实施例6的BS、BP和BL的组合物。使用干燥器将比较实施例1、3和4及实施例5和6的饲料组合物在25℃下干燥约24小时，并在-20℃下储存直到实验。
10 ×0.2CFU/g的实施例6的BS、BP和BL的组合物。使用干燥器将比较实施例1、3和4及实施例5和6的饲料组合物在25℃下干燥约24小时，并在-20℃下储存直到实验。
[0211] [表11]
[0212]
[0213]
[0214] 实验实施例3.饲料组合物对AHPND的预防性效果的评估
[0215] 3-1.虾的准备
[0216] 在每个水箱中准备30只白腿虾，总共40个水箱。所有水箱都装备有气石以维持溶解氧，并且在整个实验过程中将用于饲喂的水温维持在28℃至32℃的范围内。饲料以受限方式一天给予4次(鱼体重的4％至12％)。
[0217] 3-2.副溶血弧菌的侵袭测试
[0218] 为了确认包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的饲料组合物的抗菌活性，进行了一次侵袭测试，使得虾被副溶血弧菌侵袭。在弧菌菌株的情况下，使用2013年从越南分离的AHPND(EMS)诱导的菌株进行测试。侵袭测试按如下方式进行：将实施例的饲料组合物饲喂虾4周，然后将具有相同重量(平均重量：2.30g)的虾分配成4个重复，其中每组96只虾。使用TSB+培养基在30℃下、以150rpm培养细菌24小时，并将6.3×105CFU/mL浓度的副溶血弧菌的悬浮液浸渍每箱。浸渍后，每小时确认虾的存活率和其游动状态，并在8小时后，更换95％的水。一天三次(在8:30、13:30和18:30时)，以受限方式，分剂量给予测试饲料(鱼体重的10％至12％)，并且观察死亡程度70个小时。结果如下表12所示。
[0219] [表12]
[0220]
[0221] 如表12中所示，在对于虾的副溶血弧菌侵袭测试中，提供有包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的实施例5和6的饲料组合物的BS+BP+BL组1和2显示比对照组1(向对照组1给予比较实施例1的饲料组合物)以及BS组3和4(向BS组3和4给予比较实施例3和4的饲料组合物)更高的存活率。
[0222] 实验实施例4.饲料组合物对WSSV预防性效果的评估
[0223] 为了确认包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的饲料组合物的抗病毒活性，进行侵袭测试，使得虾受到白斑综合症病毒的侵袭。在白斑综合症病毒的情况下，从感染WSSV的白腿虾(南美白对虾)中分离的病毒在2017年从国内农场(domestic farms)获得并用于测试。侵袭测试如下进行：将实施例的饲料组合物给予虾6周，然后将具有相同重量(平均重量：6.25g)的虾置于4个重复中，其中每组96只虾。病毒的接种浓度为4.1×105个拷贝/μL，并使用注射器用100μL病毒肌内接种每只虾。每只虾的最终接种浓度为4.1×107个拷贝/μL。
[0224] 接种后，确认虾的死亡率及其游动状态。一天三次(在8:30、13:30和18:30时)，以受限方式，分剂量给予测试饲料(鱼体重的10％至12％)，并且观察死亡程度125小时。结果显示在下表13中。
[0225] [表13]
[0226]
[0227] 如表13中所示，在对于虾的白斑综合征病毒的侵袭测试中，提供有包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的实施例5和6的饲料组合物的BS+BP+BL组1和2显示比对照组1(向对照组1给予比较实施例1的饲料组合物)和BS组4(向BS组4给予比较实施例4的饲料组合物)更高的存活率。
[0228] 实验实施例5.饲料组合物对同时感染WSSV和AHPND的预防性作用的评估[0229] 为了确认包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的饲料组合物的抗菌和抗病毒活性，进行了侵袭测试，使得虾被副溶血弧菌和白斑综合症病毒侵袭。在弧菌菌株的情况下，使用2013年从越南分离的AHPND(EMS)诱导的菌株进行测试。在白斑综合症病毒的情况下，从感染WSSV的白腿虾(南美白对虾)中分离的病毒在2017年从国内农场获得并用于测试。侵袭测试按如下方式进行：将实施例的饲料组合物给予虾6周，然后将具有相同重量(平均重量：4.52g)的虾置于4个重复中，每组96只虾。病毒的接种浓度为8.3×103个拷4
贝/μL，并使用注射器用50μL病毒肌内接种每只虾。每只虾的最终接种浓度为4.1×10个拷贝/μL。病毒接种后两天，虾被感染弧菌菌株。
贝/μL，并使用注射器用50μL病毒肌内接种每只虾。每只虾的最终接种浓度为4.1×10个拷贝/μL。病毒接种后两天，虾被感染弧菌菌株。
[0230] 使用TSB+培养基在30℃下、以150rpm培养细菌24小时，并将1.3×105CFU/mL浓度的副溶血弧菌的悬浮液浸渍每箱。浸渍后，每小时确认虾的死亡率及其游动状态。一天三次(在8:30、13:30和18:30时)，以受限方式，分剂量给予测试饲料(鱼体重的10％至12％)，并观察死亡程度7天。结果显示在下表14中。
[0231] [表14]
[0232]
[0233] 如表14中所示，在对于虾的副溶血弧菌和白斑综合征病毒的侵袭测试中，提供有包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的实施例5和6的饲料组合物的BS+BP+BL组1和2显示比对照组1(向对照组1给予比较实施例1的饲料组合物)和BS组4(向BS组4给予比较实施例4的饲料组合物)更高的存活率。
[0234] 基于上述实施例，根据本公开的包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的饲料组合物可以提高白腿虾的生长、饲料效率、消化率、培养水的质量和非特异性免疫力。此外，预期本公开能够生产高蛋白的白腿虾，从而可以提高虾的适销性。
[0235] 保藏号
[0236] 保藏机构：韩国微生物保藏中心(国际保藏机构(International Depositary Authority))
[0237] 保藏号：KCCM11143P
[0238] 保藏日期：20101214
[0239] 保藏号：KCCM11144P
[0240] 保藏日期：20101214
[0241] 保藏号：KCCM11270P
[0242] 保藏日期：20120322
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