技术领域

本发明涉及源自白斑综合征病毒的蛋白质，编码上述蛋白质的核 酸序列，以及所述蛋白质在制备用于预防和/或治疗甲壳动物白斑综合 征(White Spot Sydrone)的疫苗中的应用。

                      背景技术

白斑综合征病毒(WSSV)在东南亚大部分地区的虾中是一个主要的 病毒性疾病。该病毒在甲壳动物中有很宽的宿主范围(Flegel，1997)， 而且在各个隔离群之间只有很小的遗传变异(Lo等，1999)。电子显微 镜术(EM)研究显示病毒颗粒有包膜，呈杆状到弹头样外观，长度大约 275nm，宽大约120nm，在一端有一个尾样附件。失去包膜的核壳 呈交叉网格型外观，大小约300nm×70nm(Wongteerasupaya 等，1995)。这个病毒颗粒的形态学，它的核定位和它的形态发生学令 人想起昆虫中的杆状病毒(Durand等，1997)。本来白斑综合征病毒被 分类作为杆状病毒科的一个未指定成员(Francki等，1991)，因此该病 毒曾经被称做系统性外中胚层杆状病毒(SEMBV)或白斑杆状病毒 (WSBV)。目前由于缺乏分子数据，白斑综合征病毒不再被纳入这个科 (Murphy等，1995)。限制性核酸内切酶分析显示其病毒的双链DNA大 小超过200kb(Yang等，1997)。

白斑综合征病毒的暴发在东南亚的养殖虾中会引起虾群的大规模 死亡。该疾病的特征是虾的甲壳、附肢和角皮出现白斑，肝胰腺呈淡 红色。被感染的虾显示嗜睡、进食迅速减少等征候，在3到5天内这 些虾就会死亡。白斑综合征病毒的暴发导致虾养殖工业的严重损失， 因而强烈需要一种能对白斑综合征病毒的感染具有保护作用的疫苗。 能在这样的疫苗中使用的白斑综合征病毒主要结构蛋白质的鉴定和表 征能够为发展这种疫苗提供方法。

                    本发明的公开

四种主要白斑综合征病毒蛋白质VP28(28kDa)、VP26(26kDa)、 VP24(24kDa)和VP19(19kDa)已经被鉴定出来，其分子量是根据它们 在考马斯亮蓝染色的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)中的迁移率来估计的。VP26和VP24是核壳蛋白质，而VP28和 Vp19是包膜蛋白质。白斑综合征病毒蛋白质的氨基端(N端)氨基酸 残基已通过蛋白质测序获得，并用来鉴定白斑综合征病毒基因组上的 那些基因(分别是vp28，vp26，vp24，vp19)。如图2b所述，vp26的 可读框(ORF)包含555个核苷酸(SEQ ID No：1)，推导的VP26氨基酸 序列含有184个氨基酸残基(SEQ ID No：3)，也一同描述在图2b中。 vp26的一个第二个可读框包含612个核苷酸，显示于SEQ ID No：9， 推导出其氨基酸序列含有204个氨基酸残基，它被单独描述为SEQ ID No：10。vp28的可读框包含615个核苷酸(SEQ ID No：2)，在图2c中 与被推导出的氨基酸序列(SEQ ID No：4)一起被描述。被推导出的 VP28的氨基酸序列含有204个氨基酸。VP26和VP28都含有一个位 于N端的假定的穿膜区和许多假定的N-和O-糖基化位点。vp26和 vp28基因的可读框分别编码理论大小为20kDa和22kDa的蛋白 质。VP26和VP28的理论上的氨基酸序列被直接的蛋白质测序确认。 VP26和VP28理论上的大小与根据它们在考马斯亮蓝染色的十二烷基 磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的迁移率而测得的大小 相差6kDa，这个大小差异可以被翻译后修饰作用：例如糖基化、磷酸 化等来解释。VP24的N末端氨基酸序列和VP19的部分氨基酸序列分 别被描述为SEQ ID No：5和6。vp24的完整可读框包含627个核苷酸， 描述于SEQ ID No：11，与被推导出的VP24氨基酸序列一起被描述； 推导出的VP24氨基酸序列有208个残基，单独描述于SEQ ID No：12。 四个蛋白质和它们各自的核苷酸序列是白斑综合征病毒所特有的。

本发明首次提供了构建重组疫苗的方法，用于保护甲壳动物抵抗 白斑综合征病毒的感染。已经被鉴定和定性描述过的四种白斑综合征 病毒主要蛋白质VP28，VP26，VP24和VP19被发现很适合用来制备 亚单位疫苗，用于保护甲壳动物抵抗白斑综合征病毒的感染。通过使 用重组工艺技术，本发明的核苷酸序列的克隆和特异性可以用于生产 白斑综合征病毒的这些结构蛋白质。这样，就能获得重组的白斑综合 征病毒结构蛋白，并基本上去除其他的白斑综合征病毒蛋白质。这种分 离的白斑综合征病毒结构蛋白质能用来制造亚单位疫苗，以保护甲壳 动物抵抗白斑综合征病毒的感染。可供选择的是，将编码白斑综合征 病毒结构蛋白的核苷酸序列用来制备载体疫苗，用于保护甲壳动物抵 抗白斑综合征病毒感染。而且，本发明的核苷酸序列也能用于诊断目 的，例如检测本地是否存在白斑综合征病毒。此外，本发明的白斑综合 征病毒蛋白质还能用来制备白斑综合征病毒特异性抗体。这些抗体能 用来制备白斑综合征病毒疫苗，为甲壳动物提供被动免疫。该抗体也 能用于诊断目的，例如检测白斑综合征病毒在甲壳动物中或在本地是 否存在。

因此，本发明的第一目的是提供白斑综合征病毒的结构蛋白质。 更明确地说，本发明提供结构蛋白质VP24，VP26，VP28和VP19。本 发明特别提供含有如图2b(SEQ ID No：3)所示氨基酸序列或其衍生序 列(例如SEQ ID No：10)的VP26蛋白质，以及含有如图2c(SEQ ID No：4) 所示的氨基酸序列或其衍生序列的VP28。本发明进一步提供含有如 SEQ ID No：5所示的N末端氨基酸序列MHMWGVYAAILAGLTLIL VVISIVVTNIELNKKLDKKDK或其衍生序列的VP24蛋白质，以及含有SEQ ID No：6所示的部分氨基酸序列IVLISI(G/V)ILVLAVMNV(P/A/T)MG PKKDS或其衍生序列的VP19蛋白质。优选VP24蛋白质具有如SEQ ID No：12所示的氨基酸序列或由此衍生的序列。必须认识到，那些含 有SEQ ID No：3，4，5，6，10或12中所述氨基酸序列的衍生序列的蛋 白质也在本发明的范围之内。为了本发明的目的，蛋白质氨基酸序列 的衍生物被理解为是与SEQ ID No：3，4，10或12所描述的氨基酸序 列或SEQ ID No：5或6所描述的部分氨基酸序列相比，包含了变更的 氨基酸序列，而上述的变更不影响该蛋白质的抗原性或免疫原性。为 了本发明的目的，本发明所说的蛋白质抗原性应被理解为是该蛋白质 诱发可以识别所述白斑综合征病毒蛋白质和/或与该蛋白质反应的抗 体的能力。而免疫原性应被理解为是该蛋白质在甲壳动物中诱发保护 反应，对抗白斑综合征病毒感染的能力。

依照本发明，可在序列中发生的变更可以是由于例如整个序列中 一个或多个氨基酸的保守氨基酸替代，缺失，插入，倒位或添加所造 成的。  被认为并不改变免疫特性的氨基酸替代已经被人描述过了。相 关氨基酸之间的氨基酸置换或在进化过程中频繁发生的替代尤其是发 生在：丝氨酸/丙氨酸，丝氨酸/甘氨酸，天冬氨酸/甘氨酸，天冬氨酸/ 天冬酰胺，异亮氨酸/缬氨酸之间(见Dayhof，M.D.，蛋白质序列与结构 图谱(Atlas of protein sequence structure)，Nat.Biomed.Res. Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。以此信息为基础， Lipman和Pearson发展出用于迅速和敏感的蛋白质比较(Science，1985， 第227卷，1435-1441)以及判定具有序列同源性的蛋白质和多肽之间的 功能相似性的方法。有几个计算机程序，例如FASTA，TFASTA，BLAST 以及一些类似程序，可用于判定具有给定氨基酸序列的蛋白质或多肽 和其衍生物之间的序列同源性。序列之间的最佳匹配区能自动地被这 些程序确定。因此根据本发明的衍生蛋白质仍然有能力诱生可识别白 斑综合征病毒结构蛋白质，并与之发生反应的抗体；或有能力在接受 过接种的甲壳动物中诱发保护性反应，保护他们抵抗白斑综合征病毒 的感染。依照本发明，可以被使用的其他衍生蛋白质是白斑综合征病 毒蛋白质的片段，条件是所述片段仍然能诱生可识别白斑综合征病毒 结构蛋白质并与之发生反应的抗体，或能在接受过接种的甲壳动物中 诱发保护性反应，保护他们抵抗白斑综合征病毒的感染。

第二方面，本发明提供编码一个或多个白斑综合征病毒结构蛋白 质的核酸序列。更优选本发明提供分别编码主要结构蛋白质VP24、 VP26、VP28和/或VP19的核酸序列。本发明特别提供SEQ ID No：1或 9、SEQ ID No：2或SEQ ID No：11中描述的vp26，vp28和vp24的核 酸序列，它们分别编码VP26，VP28和VP24。这些各自的核苷酸序列 起始于编码推导出的氨基酸序列第一个甲硫氨酸残基的密码子ATG， 直到编码羧基端(C末端)氨基酸残基的密码子为止。为了本发明的 目的，必须认识到那些与SEQ ID No：1，2，9或11中描述的核苷酸 序列具有序列同源性的核苷酸序列也在本发明的范围之内。就本发明 而言，本发明所指的序列同源性可考虑为至少70％，优选75％，更优选 80％，甚至更优选85％。高度优选的序列是那些与SEQ ID No：1，2，9或 11所描述的序列的同源性为至少90％，更优选95％的核酸序列。

就本发明而言，序列同源性是通过把目的核苷酸序列与SEQ ID No：1，SEQ ID No：2或SEQ ID No：11所述序列的相应部分进行比较而 得出的。就本发明而言，这个序列同源性百分率被定义为被比较的序 列之间的相同核苷酸的百分率。序列同源性可以由例如BLAST N等计 算机程序确定，这些程序能自动地判定最佳的匹配区。

依照本发明具有序列同源性的核酸序列可以通过常规的克隆和杂 交技术，使用SEQ ID No：1，2，11或9描述的核酸序列之一或该序列的 片段，很容易地从密切相关的白斑综合征病毒株中分离出来。为此目 的，杂交应在严格的条件下完成，优选在高度严格条件下完成。严格的 杂交条件应被理解为指的是洗涤条件为1xSSC溶液，0.1％SDS，温 度65℃；高度严格条件指的是洗涤条件中SSC浓度降低趋向0.3xSSC。 这个具体信息不应该被如此狭隘地解释以致需要排除错误鉴定的碱 基。本文公开的具体序列可以很容易地被用来分离来自其他毒株的同 源核苷酸序列。

与SEQ ID No：1，2或11所描述的核酸序列之一具有同源性的核 酸序列可编码如下蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No：3，4， 10，12所描述的氨基酸序列之一或SEQ ID No：5或6所描述的部分氨 基酸序列之一相比，包含了变更，然而所说的变更并不影响上述蛋白 质的抗原性和免疫原性。编码VP26蛋白质的一个同源核苷酸序列的例 子就是SEQ ID No：9所描述的核苷酸序列，它所编码的VP26蛋白质与 SEQ ID No：3所描述的氨基酸序列相比，包含有某些变更。

本发明的白斑综合征病毒蛋白质可以经由标准的生物化学分离和 纯化方法获得，或者它们也可经由一般的重组技术而制备。本发明的 核苷酸序列特别适合用于基本上没有其他白斑综合征病毒蛋白质的白 斑综合征病毒结构蛋白质的重组生产。该核苷酸序列被整合进能够表 达该蛋白质的合适表达载体之内，用上述表达载体转化合适的宿主细 胞，在一种合适的培养基中培养该宿主细胞。所表达的蛋白质可以从 细胞或培养基中分离和纯化。合适的表达载体是包含复制和表达必须 的调控区的那些质粒、粘粒、病毒、YAC’s(酵母人工染色体)及其他 载体。表达载体能被带到一种宿主细胞中进行表达。合适的宿主细胞 有，例如细菌，酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。这种表达技术在 本领域已经广为人知(Sambrooke等，分子克隆：实验室手册 (Molecular Cloning：a laboratory Manual)，冷泉港实验室出版 社，冷泉港，1989；King和Possee，1992)。

第三方面，本发明提供疫苗，其含有白斑综合征病毒毒粒的结构 蛋白质VP24、VP26、VP28或VP19中的一种或多种，以及药学上可接 受的载体。更明确地说，本发明的这种疫苗包含白斑综合征病毒毒粒 蛋白质VP24、VP26、VP28或VP19，或二者或更多种上述蛋白质的组 合。优选地，本发明的这种疫苗含有VP24，而这种VP24蛋白质含有 SEQ ID No：12中描述的氨基酸序列，或者SEQ ID No：5中描述的N 末端氨基酸序列，或者上述两种序列的衍生序列；或者这种疫苗含有 VP26，而这种VP26蛋白质含有SEQ ID No：3或者SEQ ID No：10中描 述的氨基酸序列，或者上述任意一种序列的衍生序列；或者这种疫苗 含有VP28，而这种VP28蛋白质含有SEQ ID No：4中描述的氨基酸序 列或者该序列的衍生序列；或者这种疫苗含有VP19，而这种VP19蛋 白质含有SEQ ID No：6中描述的N端氨基酸序列或者该序列的衍生序 列；或者这种疫苗含有所述蛋白质中二种或更多种蛋白的组合。更优 选的是本发明的这种疫苗包含白斑综合征病毒蛋白质VP26和VP28， 以及任选的VP24。

除此之外，本发明的核酸序列可以被用来制造载体疫苗(vector vaccine)，对甲壳动物进行接种，以对抗白斑综合征病毒的感染。载 体疫苗应被理解为是一种经过改造的、活的减毒细菌或病毒疫苗，以 致它们的遗传物质中含有一个或多个插入的异源核苷酸序列。这些所 谓的载体细菌或病毒能够共表达由被插入的核苷酸所编码的异源蛋白 质。因此，第四方面，本发明提供一种含有活的减毒细菌或病毒，以及 药学上可接受的载体的载体疫苗，其中所说的细菌或者病毒已经被改 造过，以致它们的遗传物质中含有一个或多个本发明的核苷酸序列。

本发明的疫苗能用来保护甲壳动物，例如虾：包括但并不仅限于 来自对虾科(Penaeidae)的成员，例如斑节对虾(P.monodon)、南美 白对虾(P.vannamei)，中国对虾(P.chinensis)，墨吉对虾 (P.merguensis)、或新对虾属的种(Metapeaeus spp.)；对虾：包括 但并不仅限于来自长臂虾科(Palaemonidae)的成员，例如沼虾属的种 (Macrobrachium spp.)，或长臂虾属的种(Palaemon spp.)；龙 虾：包括但不仅限于来自龙虾科(Palinuridae)和海螯虾科 (Nephropidae)的成员，举例来说，如(Calinectes spp.)、Palinurus spp.，龙虾属的种(Panuliris spp.)，或螯龙虾属的种(Homarus spp.)；蝲蛄：包括但并不仅限于来自河虾科(Astacidae)的成员， 例如Astacus spp.，Procambarus spp.，和Oronectes spp.；以及 蟹：包括但并不仅限于来自黄道蟹科(Cancridae)和梭子蟹科 (Portuidae)的成员，例如：黄道蟹属的种(Cancer spp.)，Callinectes spp.，Carcinus spp.以及梭子蟹属的种 (Portunus spp.)。

本发明的疫苗可以依照那些对本领域专业人员而言已经广为人知 的技术来制备，例如在下文中被描述过的技术：Remington药物科学 (Remingtong′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990)， 编者：A.R.Gennaro等，第72章，第1389-1404页，费城药剂学和科学 学院。

本发明的疫苗含有有效量的一种或多种本发明蛋白质、载体细菌 或病毒，和药学上可接受的载体。在此所使用的术语“有效”被定义为 足以在甲壳动物中诱发保护性反应的量。载体或蛋白质的量将依赖于 所使用载体或蛋白质的类型、给药途径、给药时间、接受接种的动物 种类、以及年龄、一般健康状况、温度和饮食情况。

大体上，每只动物可以使用的剂量为0.01到1000μg蛋白质，优 选0.5到500μg，更优选0.1到100μg。如果使用病毒载体疫苗，大 体上每只动物可以使用的剂量为103到108pfu(噬斑形成单位)。

本发明所指的适合在本发明的疫苗中使用的药学上可接受的载体 是无菌并且生理学上相容的，例如：无菌水、盐水、水性缓冲液例如 碱金属磷酸盐(例如PBS)、醇、多元醇等。除此之外本发明的疫苗可 能包含其它添加剂，例如佐剂，稳定剂，抗氧化剂，防腐剂和其他添 加剂。

合适的佐剂包括但并不仅限于铝盐或凝胶，卡波姆(carbomers)， 非离子嵌段共聚物，维生素E，monophospheryllipid A，胞壁酰二 肽，油乳剂，葡聚糖，细胞因子，皂角甙例如Quil A，以及其他类似 物。佐剂的添加量依赖于该佐剂本身的性质。

适合在本发明的疫苗中使用的稳定剂包括但并不仅限于糖类：例 如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖；蛋白质类：例如白 蛋白或酪蛋白；以及缓冲液如碱性磷酸盐。

合适的防腐剂包括，硫柳汞和乙汞硫代水杨酸及其他。

本发明的疫苗可经由注射，浸渍，浸浴，喷雾或气溶胶，或口服 给药。对甲壳动物而言，优选的方式是疫苗经由浸渍或口服给药，尤其 是在商业性水产养殖场。

就口服给药方式而言，疫苗优选和合适的载体混合后口服给药， 例如，与纤维素、食物或可代谢的物质，如α纤维素或蔬菜或动物来 源的不同的油类混合。本发明的疫苗特别优选的食物载体是活饲料生 物，它们可以将疫苗装入自己体内，合适的活饲料生物包括但并不仅 限于类似浮游生物的非选择性滤食动物，优选的是轮形动物、Artemia 的成员等。高度优选盐水虾Artemia sp.。

通过使用本领域专业人员已知的一般技术，本发明的蛋白质可以 用来制备抗体。优选这些蛋白质被用来生产特异性单克隆抗体。本发 明抗体可以按照标准的技术制备。那些将蛋白质免疫动物，例如老鼠， 以及选择产生该蛋白质特异性单克隆抗体的杂交瘤的操作步骤在本领 域中已经广为人知(见：例如Cligan等(编辑)，免疫学当前方法 (current protocols in immunology)，1992；Kohler和Milstein，Nature 256，第495-497页，1975；Steenbakkers等，Mol.Biol.Rep.19，第 125-134页，1994)。获得的抗体可以用于诊断学，在当地检测白斑 综合征病毒，或在甲壳动物中检测白斑综合征病毒的存在。本发明的 核苷酸序列也适合用于诊断。上述的序列或其片段能用于例如PCR技 术方面，在当地或在甲壳动物中检测白斑综合征病毒的存在。因此， 另一方面，本发明还提供诊断试剂盒，其中包含本发明的一种或多种 核苷酸序列或抗体。

本发明所诱生的抗VP28，VP26，VP24和VP19蛋白质的抗体可以 进一步用来为甲壳动物的被动免疫制造抗体疫苗。因此，在另一方面， 本发明提供被动免疫疫苗以对抗白斑综合征病毒，上述的疫苗含有抗 VP28，VP26，VP24或VP19，或上述任意二种或多种蛋白质的组合的抗 体。这样的疫苗可以使用如上所述的标准技术进行制备。优选制备通 过口服给药的抗体疫苗，其中，抗体和可食用的载体例如鱼饲料混合。 更优选的是这种疫苗是由鸡蛋中制备的抗体(IgY抗体)制备的。

下列实施例是用来举例说明本发明而不应该被解释成是以任何方 式限制本发明。

                      附图说明

图1

白斑综合征病毒蛋白质。(A)负染的完整病毒颗粒的透射电子显 微镜(TEM)照片。(B)负染的白斑综合征病毒核壳的透射电子显微镜 照片。(C)纯化的白斑综合征病毒15％考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。 泳道1：低分子量蛋白质标准。泳道2：来自未感染虾的纯化“白斑综 合征病毒颗粒”。泳道3：纯化的白斑综合征病毒颗粒。泳道4：纯化 的白斑综合征病毒核壳。

图2

白斑综合征病毒VP26和VP28的核苷酸序列。(A)VP26和VP28在 白斑综合征病毒基因组片段上的定位。(B)VP26和(C)VP28的核苷酸和 蛋白质序列。vp26和vp28各自的可读框，从编码推导出的氨基酸序 列第一个甲硫氨酸残基的ATG密码子开始。N末端氨基酸序列用粗体 字表示；推测的N-糖基化位点的位置被用下划线表示，推测的O-糖基 化位点用双重的下划线表示。VP28的简并引物位置的核苷酸序列用斜 体字表示。

图3

(A)VP26和(B)VP28的疏水图。

图4

白斑综合征病毒结构蛋白质在昆虫细胞中的杆状病毒表达，15％ SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹法(Western印迹法)分析。(A)Sf21细 胞提取物的考马斯染色凝胶。泳道1：低分子量蛋白质标准。泳道2： 模拟感染。泳道3：AcMNPV-wt(野生型)感染。泳道4：AcMNPV-GFP 感染。泳道5：AcMNPV-WSSVvp26感染。泳道6：AcMNPV-WSSVvp28 感染。泳道7：白斑综合征病毒。(B)使用抗纯化的白斑综合征病毒 的多克隆抗体的蛋白质印迹。

图5

抗结构蛋白VP28的抗血清对虾体内白斑综合征病毒的中和。阴性 对照：接受NaCl溶液的虾。阳性对照：接受白斑综合征病毒但未接受 抗血清的虾。免疫前血清：接受白斑综合征病毒和免疫前血清的虾。 VP28抗血清：接受病毒和抗VP28抗血清的虾。

图6

给虾接种白斑综合征病毒蛋白质。阴性对照：只接受NaCl溶液的 虾。阳性对照：接受NaCl溶液和白斑综合征病毒的虾。组3：用VP24 进行接种的虾。组4：用VP26c进行接种的虾。组5：用VP28进行接 种的虾。组6：用VP24，VP26c和VP28的混合物进行接种的虾。

                     实施例

方法

白斑综合征病毒的制备和纯化

在本研究中使用的病毒是从泰国的受感染的斑节对虾(Penaeus monodon)中分离出来的。受感染组织在TN缓冲液(20mM Tris-HCl， 400mM NaCl，PH值7.4)中被匀浆化，在以1,700xg离心沉淀10分 钟之后，过滤上清液(0.45μM过滤器)。滤液被肌肉注射进健康的斑 节对虾体内开始感染，注射部位在第四腹节外侧区。4天后，从垂死 的虾体内提取血淋巴，与作为抗凝剂的改良Alsever溶液(Rodriguez 等，1995)混合。在用TNE(20mM Tris-HCL，400mM NaCl，5mM EDTA，PH 值7.4)溶液稀释之后，在4℃以1,700xg速度离心10分钟，将血 淋巴与血细胞相互分离。将病毒颗粒在4℃以45,000xg离心沉淀1小 时，沉淀物用TN溶液重新悬浮。

用Nonidet P40(NP40)处理病毒颗粒，去除病毒包膜。在病毒 溶液中加入1％的NP40，室温下处理30分钟并轻微振荡。核壳在4℃ 以80,000xg离心沉淀30分钟，沉淀物用TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH值7.5)溶液溶解。

病毒颗粒的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

为进行蛋白质分析，在15％SDS-PAGE凝胶中对白斑综合征病毒的 病毒颗粒制品(有包膜的病毒颗粒，核壳和阴性对照)进行分析。使用 考马斯亮蓝染色法使蛋白质在SDS-PAGE凝胶中显色。

电子显微镜检查

为进行透射电子显微镜检查(TEM)，病毒悬液被负载在透明塑胶 (Formvar)包被的，碳稳定的镍载网(400网孔)上，用磷钨酸做负染 (2％PTA)，样本用Philips CM12电子显微镜观察。

核酸纯化

将纯化的病毒颗粒在45℃用蛋白酶K(0.2mg/ml)和十二烷基肌 氨酸钠(1％)处理3小时，分离病毒DNA。继而用酚/氯仿抽提，用TE溶 液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH值7.5)进行透析。纯化和浓缩后 的DNA用带有标准的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

质粒构建

白斑综合征病毒亚基因组片段被克隆到pBluescript SK +(Stratagene公司)质粒之内，并被使用标准的技术(Sambrook 等，1989)转化进大肠杆菌(E.coli)DH5α体内。DNA的分离，限制性 内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳和菌落转移是依照标准的程序进行的 (Sambrook等，1989)。聚合酶链反应(PCR)是使用自设合成引物来进 行的。编码VP28 N末端的DNA是从白斑综合征病毒总DNA中用PCR 方法扩增出来的，使用的引物是以VP28的N末端氨基酸序列为基础的 简并性引物。所使用的正向引物是5’CAGAATTCTCDATNGTYTTNGTNAC 3’(SEQ ID No：7)，反向引物是有EcoRI位点(斜体字)的5’ CAGAATTCATGGAYYTNWSNTTYAC 3’(SEQ ID No：8)(D＝A，T或G；N＝A，C， G或T；Y＝C或T；W＝A或T；S＝C或G)。VP24的N末端序列是从白 斑综合征病毒总DNA中用PCR方法扩增出来的，使用的引物是一套以 VP24的N末端氨基酸序列为基础的简并性引物。5’ CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3’(SEQ ID No：13)被用做正向引物，而 5’CAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3’(SEQ ID No：14)作为反向引物， 两者均包含EcoRI位点(斜体字)。

DNA测序和计算机分析

要测序的质粒DNA经由QIAprep Miniprep系统或JETstar质粒 纯化系统(Qiagen公司)被纯化。测序采用通用的pBluescript正向和 反向核苷酸引物，以及订制合成的引物以两条链进行。使用Applied Biosytems自动化DNA测序仪(Eurogentec，比利时)进行自动测序。

读出的序列用UWGCG计算机程序进行分析(版本10.0)。使用 FASTA，TFASTA(Pearson &Lipman，1988)和BLAST(Altschul等，1997) 程序将DNA和推导出的氨基酸序列与更新过的GenBank/EMBL， SWISSPORT和PIR数据库进行比较。

细胞和病毒

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf-AE-21)细胞(Vaughn 等，1977)被培养在补充了10％胎牛血清(FCS)的Grace’s昆虫培养基 (GIBCO BR公司)中。苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)(Smith 和Summers，1982)的E2-株被当作野生型(wt)病毒使用。常规的细胞维 持培养和病毒感染步骤是依照已经出版的操作步骤进行的(Smith和 Summers，1987；King和Possee，1992)。

重组体改造

Bac-to-Bac系统(GIBCO BRL公司)在昆虫细胞中被用来过量表达 白斑综合征病毒VP24(SEQ ID No：12)、VP26(SEQ ID No：3)、VP26c(SEQ ID No：10)和VP28(SEQ ID No：4)。为了在昆虫细胞感染后容易检测和 滴定Bac-to-Bac重组体，绿色荧光蛋白(GFP)基因被引入 pFastBac-DUAL载体p10启动子的下游。GFP基因来自pVL92GFP质粒 (Reilander等，1996)，是将该质粒用Xba I和Kpn I消化之后得到的。 700bp包含GFP的片段被琼脂糖凝胶电泳和GlassMAX纯化方法(GIBCO BRL)分离，使用DNA聚合酶钝化其末端，插入pFastBac-DUAL质粒p10 启动子的下游多克隆区II的Sma l位点。所得到的质粒被命名为 pFastBac-D/GFP，在它的多角体蛋白启动子的下游有一个供外源基因 插入的I区。只表达受p10启动子调控的GFP的重组病毒依照 Bac-to-Bac系统程序(GIBCO BRL)构建完成，该病毒被称为 AcMNPV-GFP。

对含有据推测是完整的vp26(SEQ ID No：1)和vp28(SEQ ID No：2) 可读框(ORFs)的白斑综合征病毒质粒进行PCR扩增反应，在ORFs 的3’端引进一个BamH I位点，在ORFs的5’端引入一个Hind III位 点。vp26(SEQ ID No：1)和vp28(SEQ ID No：2)首先被克隆到pET28a 载体(Novagen公司)之内，用BamHI和Not I酶切割，将其插入质粒 pFastBac-D/GFP的多角体蛋白启动子的下游。获得的质粒被分别命名 为pFastBac-D/G-vp26和pFastBac-D/G-vp28。vp26c(SEQ ID No：9) 和vp24(SEQ ID No：11)也从含有推测的可读框(ORFs)的质粒中经由 PCR扩增出来，并通过引物在ORFs的5’端引进一个BamH I位点，在 ORFs的3’端引入一个EcoR I位点。经消化后，vp26c(SEQ ID No：9) 和vp24(SEQ ID No：11)的可读框被插入pFastBac-D/GFP质粒多角体 蛋白启动子的下游，获得质粒pFastBac-D/G-vp26c和 pFastBac-D/G-vp24。能从p10启动子表达GFP和从多角体蛋白启动 子表达VP24(SEQ ID No：12)，VP26(SEQ ID No：3)，vp26c(SEQ ID No：10) 或VP28(SEQ ID No：4)的重组病毒依照Bac-to-Bac系统程序(GIBCO BRL)构建完成，分别被命名为AcMNPV-WSSVvp24，AcMNPV-WSSVvp26， AcMNPV-WSSVvp26c和AcMNPV-WSSVvp28。

SDS-PAGE，蛋白质序列分析和免疫印迹法

将受野生型苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)以及重组的表 达异源性蛋白质(GFP，VP26，VP28)的AcMNPV感染的昆虫细胞在15％ SDS-PAGE凝胶中分析。使用考马斯亮蓝染色法使蛋白质着色而可见。 半干印迹可以在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)(PVDF) 膜(Bio-Rad公司)上进行，使用的是CAPS缓冲液(10mM CAPS在10％ 甲醇中)；或在ImmobilonTM-P(Millipore公司)膜上进行，使用Tris- 甘氨酸缓冲液(25mM Tris碱，192mM甘氨酸，10％(v/v)甲醇，PH值 8.3)。使用考马斯亮蓝染色法使蛋白质在PVDF膜上显色。来自白斑综 合征病毒病毒颗粒标本的主要蛋白质带从滤膜上被切下并进行N末端 序列测定(ProSeq公司，麻萨诸塞州)。

Immobulon-P膜在TBS溶液(0.2M NaCl，50mM Tris-HCL，PH值 7.4)中用2％低脂奶粉(Campina公司，荷兰)封闭。免疫检测是通过下 面的步骤来进行的：室温下，在含有0.2％低脂奶粉的TBS中将印迹 与1∶2000稀释的多克隆兔抗白斑综合征病毒血清(来自P.C.Loh教授 的惠赠，檀香山大学，夏威夷)一起孵育1小时。然后，用1∶2000稀 释的，结合了辣根过氧化物酶(Amersham公司)的抗兔抗体与之结合， 使用“增强的化学发光-光检测试剂盒”(Amersham公司)进行检测。

VP28多克隆抗体

白斑综合征病毒主要的包膜结构蛋白VP28在昆虫细胞中被杆状病毒 AcMNPV-WSSVvp28所表达，使用Prepcell(Biorad公司)和分段收集 器进行纯化。包含VP28的部份被收集和浓缩。将纯化的VP28蛋白质 注射进兔子以制备多克隆抗体。用纯化的白斑综合征病毒颗粒对抗体 进行蛋白质印迹法测试，抗体对来自白斑综合征病毒毒粒的VP28反 应良好。将这个VP28抗毒血清用于白斑综合征病毒中和实验中。

白斑综合征病毒原种

白斑综合征病毒(WSSV)病毒原种是从蝲蛄Procambarus clarkii 的血淋巴中提纯出来的，它在一周以前被肌肉注射了低浓度的白斑综 合征病毒。血淋巴经由连续蔗糖梯度离心而纯化，吸出病毒条带。病 毒在被沉淀后，又在TE溶液(PH值7.5)中被重新溶解。病毒原种被 保存在-70℃直到在实验中使用。

蛋白质接种

白斑综合征病毒主要的包膜结构蛋白质VP28(SEQ ID No：4)和核 壳蛋白质VP26c(SEQ ID No：10)和VP24(SEQ ID No：12)在昆虫细胞中 用杆状病毒AcMNPV-WSSVvp28、AcMNPV-WSSVvp26c和 AcMNPV-WSSVvp24表达，这些病毒从P10启动子表达GFP，从多角体蛋 白启动子表达白斑综合征病毒结构蛋白。感染3天后，收获受感染的 昆虫细胞，并用超声波打碎细胞。上清液用来接种斑节对虾 (P.monodon)。

实验中使用6组虾： 组别 组名 接种 加强免疫 攻击 各组虾的个数 1 阴性对照 330mM NaCl 330mM NaCl 330mM NaCl 10 2 阳性对照 330mM NaCl 330mM NaCl WSSV 10 3 VP28 VP28 VP28 WSSV 15 4 VP26c VP26c VP26c WSSV 15 5 VP24 VP24 VP24 WSSV 15 6 混合物(MIX) 混合物 混合物 WSSV 15

在“混合物”中，等体积的VP28，VP26c和VP24溶液在注射之前 混合。接种疫苗后5天，对这些虾进行加强注射。二天之后用白斑综合 征病毒(病毒原种，见中和实验)注射攻击。注射后，对这些虾进行6天 的监测，死虾经电子显微镜检查白斑综合征病毒是否存在。

结果

分离白斑综合征病毒蛋白质用于测序

使用纯化的病毒制剂并以肌内注射的方式感染斑节对虾。在感染 后四天，从受白斑综合征病毒感染的动物的血淋巴中分离病毒。从未 受感染的虾体内提取血淋巴作为阴性对照。这些标本被用来进行电子 显微镜检查，分析白斑综合征病毒毒粒的存在和纯度。在未受感染动 物的样品中，没有观察到病毒颗粒，但是在受感染动物的样品中，观察 到许多主要包膜的病毒颗粒(图1a)。用NP40处理后，病毒的包膜被 从病毒颗粒上去除，剩下纯的核壳(图1b)。该核壳具有白斑综合征病 毒核壳所特有的表面分节的外观特性(Durand等，1997)。有包膜的病 毒颗粒的蛋白质和核壳蛋白质可以被SDS-PAGE分开(图1c)。病毒颗 粒中的四个主要的多肽可以根据它们的表观分子量而识别出来，它们 的表观分子量分别是28(VP28)，26(VP26)，24(VP24)，和19 kDa(VP19)。数个较不明显的带也被观察到，其中大约六个带位于30 到65kDa之间，至少七个弱的蛋白质带位于86kDa到130kDa的范 围之内。来自血淋巴的三个主要的蛋白质带也与病毒颗粒一起被纯化， 位于67kDa到78kDa之间。在这个区域中的较小的蛋白质带不能在 这个凝胶中被观察到(图1)。其大小代表着主要的白斑综合征病毒蛋 白质VP28和VP19的蛋白条带在包含纯化核壳的泳道(图1c)中并不存 在，如此看来它们像是起源于病毒的包膜或间层。VP26和VP24在核 壳和病毒颗粒的泳道上都存在，表示它们起源于核壳。

SDS-PAGE凝胶上的内容物通过半干印迹的方法被转移到一个聚 偏二氟乙烯(PVDF)膜上，主要的病毒蛋白质带被切下和测序。VP28和 VP26中有超过40个氨基酸被从N端测序(分别显示在图2b和2c中， 用粗体字显示)。VP26的N末端序列包含了 MEFGNLTNLDVAIIAILSIAIIALIVIMVIMIVFNTRVGRSVVAN。VP28 N末端测 序得出的氨基酸序列是 MDLSFTLSVVSAILAITAVIAVFIVIFRYHNTVTKTIEtHsD，其中39位的苏氨酸 和41位的丝氨酸是不确定的。这两个N末端序列都是疏水的(图3)。 经由N末端肽测序所获得的VP24 N末端氨基酸序列是 MHMWGVYAAILAGLTLILVVISIVVTNIELNKKLDKKDK(SEQ ID No：5)。VP19的 N末端被发现是封闭的，由CNBr消化N末端封闭肽所获得的VP19的 部分内部序列是IVLISI(G/V)ILVLAVMNV(P/A/T)MGPKKDS(SEQ ID No：6)。 在VP19不完全的序列中，第7位氨基酸残基可能是G或V，第17位可 能是P，A或T残基。

24kDa蛋白质基因的定位和序列

根据VP24 N末端蛋白质序列，发展出了一组简并的PCR引物，正 向引物是5’CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3’(SEQ ID No：13)，而反向 引物则是5’CAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3’(SEQ ID No：14)， 两者都包含EcoRI位点(斜体字)。使用白斑综合征病毒基因组DNA为 模板进行PCR扩增。获得了一个133bp长的片段，并经由2％琼脂糖凝 胶纯化之后，插入pBluescript SK+质粒中并测序。这种PCR产品的序 列与白斑综合征病毒VP24的N末端蛋白质序列(SEQ ID No：5)相吻合， 从而在白斑综合征病毒质粒文库筛选实验中被作为探针使用 (Sambrook等，1989)，用来识别VP24完整的可读框。一个能与这个片 段进行杂交的18kbp BamHI片段被挑选出来进行进一步的分析。

包含627个核苷酸的完整vp24可读框和这个基因的启动子区域在 18kbp BamHI片段上被发现。翻译的起始密码子处于有利的区域 (AAAATGC)中，可以有效地起始真核翻译(Kozak，1989)。在启动子区域 中，排列着一段A/T富集序列，但是没有发现共有序列TATA盒。 polyA信号与翻译中止密码子重叠。vp24可读框(SEQ ID No：11)编码 一段208个氨基酸(SEQ ID No：12)的推导出的蛋白质，其中氨基酸序 列包含经实验证实的VP24 N末端序列(SEQ ID No：5)。VP24的理论 大小有23kDa，等电点8.7。在VP24里面发现有四个可能的N-糖基 化位点(N-{P}-[ST]-{P})，一个O-糖基化位点(Hansen等，1998)和9 个可能的磷酸化位点([ST]-X-X-[DE]或[ST-X-[RK])。但是不知道是否 其中任何一个修饰确实发生过。在VP24中没有发现其他存在于 PROSITE据库中的基序。208个氨基酸的计算机分析显示在VP24的N 末端存在一个强疏水区，包括一段推测的由第6到第25个氨基酸形成 的跨膜α-螺旋。Gamier等人(1978)的算法还预测在该蛋白质中存在数 个其他的α-螺旋和β-片层。

26kDa蛋白质基因的定位和序列

部分Hind III和BamH I白斑综合征病毒基因组文库被构建于 pBluescript-SK+质粒中(van Hulten等，2000)，从许多白斑综合征 病毒片段中获得末端的核苷酸序列。编码VP26的N末端序列的核苷酸 序列存在于6kb BamHI片段的近末端(图2a)。围绕甲硫氨酸起始密 码子的序列(AAAATGG)与Kozak规则中有关真核翻译的有效起始的描 述相吻合(Kozak，1989)。VP26的非翻译引导序列只有49个核苷酸可 以被判定，一直伸展到末端BamH I位点(图2a)。

6kb BamHI片段包含了一个555nt的可读框，包括那些编码VP26 N末端氨基酸的序列(图2b)，polyA信号存在于VP26的翻译终止密码 子下游94个核苷酸(nt)处。此可读框(VP26)编码一个含有184个氨基 酸的蛋白质，理论大小为20kDa。这个推导出的蛋白质是碱性的，等 电点为9.4。存在三个可能的N-糖基化位点(N-{P}-[ST]-{P})，以 及三个使用NetOglyc程序推测出的O-糖基化位点(图2b)(Hansen 等，1998)。发现了十三个可能的磷酸化位点([ST]-X-X-[DE]或 [ST]-X-[RK])，但是没有发现其他存在于PROSITE数据库中的基序。 VP26的184氨基酸的疏水性分析显示一个强的疏水区域存在于该蛋白 质的N端(图3a)。这个区域包含了一个推测的、由第12到第34位氨 基酸构成的、呈α-螺旋形式的跨膜锚钩。锚钩的后面是一个含有两个 精氨酸的带正电荷区，这暗示其羧基端是朝向细胞质一侧的 (Sonnhammer等，1998)。除α-螺旋外，在这个跨膜区内，根据Gamier 等(1978)发现的法则，发现从第127位到第141位有一个潜在的β-片 层。在该蛋白质中只有一个半胱氨酸，显示其不能在内部蛋白质之间形 成二硫键交联。这个半胱氨酸位于蛋白质的C末端部分，在VP28中也 是如此。

28kDa蛋白质基因的定位和序列

从白斑综合征病毒末端片段序列翻译得不到VP28的氨基酸序列。 根据这个多肽的N末端序列发展出一套简并引物。正向引物是 5’CAGAATTCTCDATNGTYTTNGTNAC 3’(SEQ ID No：7)，而反向引物是 有EcoRI位点(斜体字)的5’CAGAATTCATGGAYYTNWSNTTYAC 3’(SEQ ID No：8)。序列上的引物定位如图2c所示。使用白斑综合征病毒DNA作 为模板进行PCR扩增。获得一个128bp长的片段，并且该序列经过 2.5％琼脂糖凝胶纯化以后，被克隆到pBluescript SK+质粒之内并进行 测序。该核苷酸序列编码白斑综合征病毒VP28的N末端蛋白质序列， 这个128bp片段还被用在菌落筛选实验中，作为探针来对数个白斑综 合征病毒质粒文库进行鉴定(Sambrook等，1989)。一个3kb Hind III 片段由于能与这个片段进行杂交而被留做进一步分析。

612nt的完整可读框(vp28)和这个基因的启动子区域在这个3 kb Hind III片段上被发现(图2c)。甲硫氨酸起始密码子(GTCATGG) 处于有利的环境中，可以有效地起始真核翻译(Kozak，1989)。在启动 子区域中，排列着一段A/T富集序列，但是没有发现共有的TATA盒。 polyA信号位于翻译终止密码子下游55核苷酸处。这个可读框编码一 个含有204个氨基酸的推测蛋白质，包括N末端测序的氨基酸在内。这 个酸性的蛋白质的理论上的大小是22kDa，等电点4.6。发现有五个 潜在的N-糖基化位点(N-{P}-[ST]-{P})，二个O-糖基化位点(Hansen 等，1998)(图2c)和9个潜在的磷酸化位点([ST]-X-X-[Pe]或 [ST]-X-[RK])。(在VP28中没有发现其他存在于PROSITE数据库中的 基序。

计算机分析显示这个204个氨基酸的蛋白质在其N端有一个强疏 水区(图3b)，包括一个推测的、由第9到第27位氨基酸形成的穿膜α -螺旋序列。和VP26一样，穿膜锚钩的后面是一个带正电荷区，这暗 示该蛋白质可能具有由外向内的方向。在序列的C末端部分发现了另 外的一个疏水区，它可能组成一个穿膜序列。然而，Gamier等的算法 (1978)没有预测出在VP28的这个位置存在α-螺旋。该算法预测在89 到99位氨基酸处存在另一个α-螺旋，但是该蛋白没有β-片层。和VP26 一样，在VP28中也只有一个半胱氨酸，这个半胱氨酸位于蛋白质的C 末端部分。

重组的vp24，vp26和vp28的表达和分析。

采用Bac-to-Bac系统(GIBCO BRL)在昆虫的细胞中制备能够表达 推导的白斑综合征病毒颗粒蛋白质VP24，VP26，VP26c和VP28的重组 杆状病毒。vp24，vp26，vp26c和vp28基因(分别是SEQ ID No：11， SEQ ID No：1，SEQ ID No：9和SEQ ID No：2)被克隆到pFastBac-D/GFP 质粒的多角体蛋白启动子的下游，该质粒包含一个位于p10启动子的 下游的GFP基因。从pFastBac-D/GFP(对照)质粒以及分别带有vp24， vp26，vp26c和vp28基因的质粒中产生重组病毒，这些重组病毒分别 被命名为AcMNPV-GFP，AcMNPV-WSSVvp24，AcMNPV-WSSVvp26， AcMNPV-WSSVvp26c和AcMNPV-WSSVvp28。所有的重组病毒都受p10启 动子调控表达GFP；后四者还在多角体蛋白启动子的调控下分别表达 VP24(SEQ ID No：12)，VP26(SEQ ID No：3)，VP26c(SEQ ID No：10) 和VP28(SEQ ID No：4)。

受AcMNPV-wt，AcMNPV-GFP，AcMNPV-WSSVvp26和AcMNPV- WSSVvp28感染的Sf21细胞的提取物在15％SDS-PAGE凝胶中进行分析。 在受野生型AcMNPV感染的细胞中(图4a，泳道3)可见一条32kDa的带， 它代表多角体蛋白。在那些含有被AcMNPV-GFP感染的细胞的提取物 (泳道4)，以及被表达白斑综合征病毒蛋白质的重组病毒感染的细胞 的提取物(泳道5和6)的泳道中，可以观察到一个大约29kDa的GFP蛋 白质带。受AcMNPV-GFP感染的细胞中的GFP的表达，比那些受同时从 多角体蛋白启动子表达白斑综合征病毒蛋白质(泳道5和6)的杆状病 毒感染的细胞中的GFP表达要高。用紫外线照射那些受不同的AcMNPV 重组病毒感染的细胞后，这很容易观察到，其中：受AcMNPV-GFP感 染的细胞的GFP萤光是最强的(资料未显示)。由多角体蛋白启动子调 控的白斑综合征病毒蛋白质的表达与由p10启动子调控的GFP的表达 相比，前者明要高(泳道5和6)。在受AcMNPV-WSSVvp26感染的细胞 提取物中，可以观察到一个21kDa蛋白质的强表达，它很有可能代表 白斑综合征病毒的VP26(泳道5)。在受AcMNPV-WSSVvp28感染的细胞 中可观察到28kDa蛋白质的强表达(泳道6)。在这些凝胶中，通过使 用抗GFP抗血清，GFP的位置被蛋白质印迹分析所确认(数据未显示)。

用野生型和重组的AcMNPV感染Sf21细胞，取样在SDS-PAGE凝胶 中电泳，然后进行蛋白质印迹分析。一种抗白斑综合征病毒毒粒的多 克隆抗体被用来检测重组的VP26和VP28(图4b)。VP26和VP28都在 这些细胞提取物中被很好地检测到。VP26在分子量为21kDa的位置 处被检测到，这与考马斯亮蓝染色凝胶结果相符(图4a，泳道5；图4b， 泳道5)。重组VP28与来自白斑综合征病毒颗粒的VP28在凝胶上移动 到同一位置，该位置所代表的分子量明显高于这个蛋白质的理论大小 22kDa。就象从这些样品的非常低的本底反应所能观察出来的那样， 该多克隆抗体没有与昆虫细胞(泳道2)或杆状病毒(泳道3和4)的蛋白 质发生较多的交叉反应。

将受AcMNPV-WSSVvp26c以及AcMNPV-WSSVvp24感染的Sf21细胞 的提取物在15％SDS-PAGE凝胶中进行分析。一个低分子量标准和纯化 的白斑综合征病毒颗粒也在相同的凝胶中分析。在含有受AcMNPV- WSSVvp26c以及AcMNPV-WSSVvp24感染的细胞的泳道中，可以观察到 一个29kDa的弱带，它代表GFP，在受感染的细胞经紫外线照射之后 可以很清楚地被观察到。此外在含有受AcMNPV-WSSVvp26c感染的细胞 的泳道中，可以观察到一个26kDa的强表达带，与在白斑综合征病毒 颗粒中的26kDa带出现在凝胶中的相同位置。在包含受 AcMNPV-WSSVvp24感染的细胞的泳道，可以观察到一个清晰的24kDa 带，与白斑综合征病毒颗粒所具有的24kDa蛋白质的位置相一致。为 了证明在受AcMNPV-WSSVvp26c感染的细胞中的26kDa带，和在受 AcMNPV-WSSVvp24感染的细胞中的24kDa带，与在白斑综合征病毒颗 粒中的26kDa和24kDa蛋白质相一致，使用抗白斑综合征病毒颗粒的 一个多克隆抗体对这个凝胶进行蛋白印迹分析。在受 AcMNPV-WSSVvp26c感染的细胞中的26kDa带，以及在受 AcMNPV-WSSVvp24感染的细胞中的24kDa带都被很好地检测到了。

VP26和VP28的相关性

以GenBank/EMBL，SWISSPORT和PIR数据库为基础，使用FASTA， TFASTA和BLAST程序，对白斑综合征病毒的VP24，VP26，VP26c和 VP28进行了同源性搜索。没有发现它们与存储在GenBank中的序列有 明显的同源关系，它们既不与杆状病毒包膜或衣壳蛋白质有同源关系， 也不与来自其他的大的DNA病毒的结构蛋白质有同源关系。

中和实验

病毒原种的滴度从滴定实验中获得。病毒原种被稀释1×107到5 ×1011倍，在每个稀释度，都要取该稀释度的病毒液给10只虾(斑节 对虾，3-4个月大)进行肌内注射，每只注射10μl。白斑综合征病毒 原种的1×108倍稀释液在7到12天后可引起50％的虾死亡。在进一 步的实验中将会用到这个稀释度。

4群虾用于中和实验： 组别 组名 注射 每组中虾的个数  1 阴性对照 330mM NaCl 10  2 阳性对照 WSSV 10  3 免疫前血清 WSSV+免疫前血清 15  4 VP28抗血清 WSSV+VP28抗血清 15

给每只虾注射的病毒的总量在所有的组中都是恒定不变的，都等 于10μl的病毒原种的1×108倍稀释液。组3中的血清浓度和组4 是相同的(每次注射都含有1ul的白斑综合征病毒和9ul血清)。在注 射之后，虾被监视4个星期，死虾要经过电子显微镜检查以确定白斑 综合征病毒的存在。结果如图5所示。

在组1，即阴性对照组中，没有一只虾因感染白斑综合征病毒而 死亡，因此死亡率是0％。在阳性对照(组2)中，在23天之后，死亡率 达到100％。免疫前血清(在兔子被注射VP28蛋白质之前采集的血清) 加入白斑综合征病毒的组(组3)，在25天内死亡率达到100％。VP28 抗毒血清加入白斑综合征病毒的组(组4)，所有的虾都活着，死亡率为 0％。这些结果显示VP28抗毒血清在斑节对虾中能够中和白斑综合征病 毒的感染。

蛋白质免疫接种

用5μl(初次接种)和10ul(加强免疫)不同的蛋白质溶液对组 3-6进行免疫接种。免疫接种时，组3接受了2.5μg VP28蛋白质， 组4接受了3.6μg VP26c蛋白质，组5接受了0.7μg VP24蛋白质。 组6接受了由等体积的VP28，VP26c以及VP24溶液所组成的混合物， 总共2.7ug蛋白质。加强免疫时，这些虾所接受的蛋白质的量就更高 了：组3为9.6ug VP28蛋白质，组4为5.7ug VP26c蛋白质，组5为 5.9ug VP24蛋白质，组6为合计7.1ug的混合蛋白质。所有这些组 里的虾都被注射了10ul 1×108倍稀释的白斑综合征病毒原种溶液。

免疫接种的结果如图6所示。在组1，即阴性对照组中，没有一 只虾因感染白斑综合征病毒而死亡，因此死亡率是0％。在组2中，在 注射后1天，虾就因为感染白斑综合征病毒而开始死亡，并且死亡率 在不断增加。虽然这些虾所接受的白斑综合征病毒的剂量与中和实验 中的虾所接受的剂量完全相同，但是组2中的虾更早地开始死亡。这 或许是由于本实验进行多次注射而引起对虾的压力所造成的结果。在 组3-5(虾分别被接种了VP24，VP26c和VP28)中的死亡率被延迟，在 组6(虾被接种了VP24，VP26c和VP28的混合物)中，没有一只虾因为 感染白斑综合征病毒而死亡，因此死亡率是0％。对在接种中使用的各 蛋白质的剂量进行优化也会增强抗白斑综合征病毒感染的保护效果。

参考文献

Altschul，S.，Madden，T.，Schaffer，A..Zhang，J.，Zhang，Z.， Miller，W.，和Lipman，D.(1997).Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一 代蛋白质数据库搜索程序.Nucleic Acids Res.25，3389-3402. Durand，S.，Lightner，D.V.，Redman，R.M.，和Bonami，J.R.(1997). 白斑综合征杆状病毒的超微结构和形态发生学。Diseases Aquat. Organisms 29，205-211.

Flegel，T.W.(1997).泰国黑虎虾(斑节对虾)(Penaeus monodon)的 主要病毒性疾病。World J.Microbiol.Biotechnol.13，433-442. Francki，R.I.B.，Fauquet，C.M.，Knudson，D.L，和Brown，F. (1991).“病毒的分类和命名：国际病毒分类学委员会第五次报告” Springer-Verlag，New York.

Gamier，J.，Osguthorpe，D.J.和Robson，B.(1978)预测球蛋白的二级 结构的单一方法精确性和实施的分析。J.Mol.Biol.120，97-120.

Hansen，J.E.，Lund，O.，Tolstrup，N.，Gooley，A.A.，Williams，K. L，和Brunak，S.(1998).NetOglyc：根据序列上下文和表面易接近性预 测粘蛋白型O-糖基化位点。Glycoconj J.15，115-130.

King，L.A.，和Possee，R.D.(1992).″杆状病毒表达系统.″Chapman & Hall，London.

Kozak，M.(1989).翻译的扫描模型：一个更新.J.Cell Biol.108， 229-241.

Lo，C.F.，Hsu，H.C.，Tsai，M.F.，Ho，C.H.，Peng，S.E.，Kou，G. H.，和Lightner，D.V.(1999).虾白斑综合征病毒的不同地区临床样本 的特殊基因组片断分析.Diseases Aquat.Organisms..

Murphy，F.A.，Fauquet，C.M.，Bishop，D.H.L.，Ghabrial，S.A.， Jarvis，A.W.，Martelli，G.P.，Mayo，M.A.，和Summers，M.D.(1995). ″病毒的分类和命名：国际病毒分类学委员会第六次报告″.Virus Taxonomy Springer-Verlag，New York.

Pearson，W.R.，和Lipman，D.J.(1988).改良的生物学序列分析工具。 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448.

Reilander，H.，Haase，W.，和Maul，G.(1996).维多利亚多管水母绿色 荧光蛋白在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统的功能性表达.Biochem. Biophys.Res.Commun.219，14-20.

Rodriguez，J.，Boulo，V.，Mialhe，E.，和Bachere，E.(1995).由单克 隆抗体检定的虾血细胞和血浆成分的特点J.Cell Sci.108，1043-1050.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989).″分子克隆： 实验室手册″第二版.Cold Spring Harbor Laboratory，New York Smith，G.E.，和Summers，M.D.(1978).杆状病毒基因组的限制性核酸 内切酶分析。Virology 89，517-527

Sonnhammer，E.L.L.，von Heijne，G.和Krogh，A.(1998)一个预 测蛋白质序列中的穿膜螺旋的隐藏的马尔可夫模型.In Proc.Sixth Int.Conf.on Intelligent Systems for Molecular Biology(J. Glasgow et.al，Eds)，p.175-182，AAAI Press.

van Hulten，M.C.W.，Tsai，M.-F.，Schipper，C.A.，Lo，C.-F.， Kou，G.-H.，和Vlak，J.M.(2000).含有核糖核酸还原酶和重复序 列的虾白斑综合征病毒的基因组片段分析.Journal of General Virology，8l，307-316.

Van Hulten，M.C.W.，Westenberg，M.，Goodall，S.D.& Vlak，J. M.(2000).两个主要的虾白斑综合征病毒颗粒蛋白质基因的鉴定。 Virology 266，227-236.

Vaughn，J.L.，Goodwin，R.H.，Tompkins，G.J.，和McCawiey，P.W. (1977).来自昆虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(鳞翅目夜 蛾科)的两个细胞系的建立.In Vitro 13，213-7.，. Wonteerasupaya，C.，Vickers，J.E.，Sriurairatana，S.，Nash，G. L.，Akarajamorn，A.，Boonsaeng，V.，Panyim，S.，Tassanakajon， A.，Withyachumnarnkul，B.，和Flegel，T.W.(1995).一种出现 在外胚层和中胚层来源的细胞中并在黑虎虾(斑节对虾)中引起很高 死亡率的非闭塞性系统性杆状病毒。Diseases Aquat.Organisms 21，69-77.

Yang，F.，Wang，W.，Chen，R.Z.，和Xu，X.(1997).一种简单和有 效的纯化对虾杆状病毒DNA的方法。J.Virol.Meth.67，1-4.

                              序列表

<110>Akzo Nobel NV

<120>源自白斑综合征病毒的蛋白质及其应用

<130>1999484BI

<140>

<141>

<150>EP 99202545.2

<151>1999-08-03

<150>EP 00200248.3

<151>2000-01-24

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>555

<212>DNA

<213>白斑综合征病毒

<400>1

atggaatttg gcaacctaac aaacctggac gttgcaatta ttgcaatctt gtccattgca  60

atcattgctc taatcgttat catggttata atgattgtat tcaacacacg tgttggaaga  120

agcgtcgtcg ctaattatga tcagatgatg cgagtcccaa ttcaaagaag ggcaaaggta  180

atgtcaattc gtggagagag gtcctacaat actcctcttg gaaaggtggc catgaagaat  240

ggtctctccg ataaggacat gaaggatgtt tctgctgatc ttgtcatctc taccgtcaca  300

gccccaagga ctgatcccgc tggcactggg gccgagaact ctaacatgac tttgaagatc  360

ctcaacaaca ctggcgtcga tctcttgatc aacgacatta ctgttcggcc aactgttatt  420

gcaggaaaca ttaagggaaa tactatgtcg aacacttact tctcgagcaa ggacattaaa  480

tcttcatctt caaaaattac cctcattgac gtgtgcagca aatttgaaga cgcgcagcct  540

tcgaagctac aatga                                                   555

<210>2

<211>615

<212>DNA

<213>白斑综合征病毒

<400>2

atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt  60

gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac  120

acagacaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt  180

ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc  240

aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc  300

actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga  360

acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg  420

ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc  480

gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca  540

attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc  600

actgagaccg agtaa                                                   615

<210>3

<211>184

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<400>3

Met Glu Phe Gly Asn Leu Thr Asn Leu Asp Val Ala Ile Ile Ala Ile

  1               5                  10                  15

Leu Ser Ile Ala Ile Ile Ala Leu Ile Val Ile Met Val Ile Met Ile

             20                  25                  30

Val Phe Asn Thr Arg Val Gly Arg Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gln

         35                  40                  45

Met Met Arg Val Pro Ile Gln Arg Arg Ala Lys Val Met Ser Ile Arg

     50                  55                  60

Gly Glu Arg Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys Asn

 65                  70                  75                  80

Gly Leu Ser Asp Lys Asp Met Lys Asp Val Ser Ala Asp Leu Val Ile

                 85                  90                  95

Ser Thr Val Thr Ala Pro Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu

            100                 105                 110

Asn Ser Asn Met Thr Leu Lys Ile Leu Asn Asn Thr Gly Val Asp Leu

        115                 120                 125

Leu Ile Asn Asp Ile Thr Val Arg Pro Thr Val Ile Ala Gly Asn Ile

    130                 135                 140

Lys Gly Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Ile Lys

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ser Ser Lys Ile Thr Leu Ile Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu

                165                 170                 175

Asp Ala Gln Pro Ser Lys Leu Gln

            180

<210>4

<211>204

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<400>4

Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile

  1               5                  10                  15

Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr

             20                  25                  30

Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met

         35                  40                  45

Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr

     50                  55                  60

Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile

 65                  70                  75                  80

Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala

                 85                  90                  95

Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val

            100                 105                 110

Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr

        115                 120                 125

Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn

    130                 135                 140

Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro

145                 150                 155                 160

Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met

            180                 185                 190

Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu

        195                 200

<210>5

<211>39

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<400>5

Met His Met Trp Gly Val Tyr Ala Ala Ile Leu Ala Gly Leu Thr Leu

  1               5                  10                  15

Ile Leu Val Val Ile Ser Ile Val Val Thr Asn Ile Glu Leu Asn Lys

             20                  25                  30

Lys Leu Asp Lys Lys Asp Lys

         35

<210>6

<211>24

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<220>

<221>UNSURE

<222>(7)

<223>Xaa＝Gly或Val

<220>

<221>UNSURE

<222>(17)

<223>Xaa＝Pro或Ala或Thr

<400>6

Ile Val Leu Ile Ser Ile Xaa Ile Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val

  1               5                  10                  15

Xaa Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser

             20

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物序列

<400>7

cagaattctc datngtyttn gtnac                                        25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物序列

<400>8

cagaattcat ggayytnwsn ttyac                                        25

<210>9

<211>615

<212>DNA

<213>白斑综合征病毒

<400>9

atggaatttg gcaacctaac aaacctggac gttgcaatta ttgcaatctt gtccattgca  60

atcattgctc taatcgttat catggttata atgattgtat tcaacacacg tgttggaaga  120

agcgtcgtcg ctaattatga tcagatgatg cgagtcccaa ttcaaagaag ggcaaaggta  180

atgtcaattc gtggagagag gtcctacaat actcctcttg gaaaggtggc catgaagaat  240

ggtctctccg ataaggacat gaaggatgtt tctgctgatc ttgtcatctc taccgtcaca  300

gccccaagga ctgatcccgc tggcactggg gccgagaact ctaacatgac tttgaagatc  360

ctcaacaaca ctggcgtcga tctcttgatc aacgacatta ctgttcggcc aactgttatt  420

gcaggaaaca ttaagggaaa tactatgtcg aacacttact tctcgagcaa ggacattaaa  480

tcttcatctt caaaaattac cctcattgac gtgtgcagca aatttgaaga cggcgcagcc  540

ttcgaagcta caatgaacat tggattcacc tccaagaatg tgatcgatat caaggacgaa  600

atcaagaaga agtaa                                                   615

<210>10

<211>204

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<220>

<223>人工序列描述：引物；n是脱氧肌苷

<400>10

Met Glu Phe Gly Asn Leu Thr Asn Leu Asp Val Ala Ile Ile Ala Ile

  1               5                  10                  15

Leu Ser Ile Ala Ile Ile Ala Leu Ile Val Ile Met Val Ile Met Ile

             20                  25                  30

Val Phe Asn Thr Arg Val Gly Arg Ser Val Val Ala Asn Tyr Asp Gln

         35                  40                  45

Met Met Arg Val Pro Ile Gln Arg Arg Ala Lys Val Met Ser Ile Arg

     50                  55                  60

Gly Glu Arg Ser Tyr Asn Thr Pro Leu Gly Lys Val Ala Met Lys Asn

 65                  70                  75                  80

Gly Leu Ser Asp Lys Asp Met Lys Asp Val Ser Ala Asp Leu Val Ile

                 85                  90                  95

Ser Thr Val Thr Ala Pro Arg Thr Asp Pro Ala Gly Thr Gly Ala Glu

            100                 105                 110

Asn Ser Asn Met Thr Leu Lys Ile Leu Asn Asn Thr Gly Val Asp Leu

        115                 120                 125

Leu Ile Asn Asp Ile Thr Val Arg Pro Thr Val Ile Ala Gly Asn Ile

    130                 135                 140

Lys Gly Asn Thr Met Ser Asn Thr Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Ile Lys

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ser Ser Lys Ile Thr Leu Ile Asp Val Cys Ser Lys Phe Glu

                165                 170                 175

Asp Gly Ala Ala Phe Glu Ala Thr Met Asn Ile Gly Phe Thr Ser Lys

            180                 185                 190

Asn Val Ile Asp Ile Lys Asp Glu Ile Lys Lys Lvs

        195                 200

<210>11

<211>627

<212>DNA

<213>白斑综合征病毒

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

atgcacatgt ggggggttta cgccgctata ctggcgggtt tgacattgat actcgtggtt  60

atatctatag ttgtaaccaa catagaactt aacaagaaat tggacaagaa ggataaagac  120

gcctaccctg ttgaatctga aataataaac ttgaccatta acggtgttgc tagaggaaac  180

cactttaact ttgtaaacgg cacattacaa accaggaact atggaaaggt atatgtagct  240

ggccaaggaa cgtccgattc tgaactggta aaaaagaaag gagacataat cctcacatct  300

ttacttggag acggagacca cacactaaat gtaaacaaag ccgaatctaa agaattagaa  360

ttgtatgcaa gagtatacaa taatacaaag agggatataa cagtggactc tgtttcactg  420

tctccaggtc taaatgctac aggaagggaa ttttcagcta acaaatttgt attatatttc  480

aaaccaacag ttttgaagaa aaataggatc aacacacttg tgtttggagc aacgtttgac  540

gaagacatcg atgatacaaa taggcattat ctgttaagta tgcgattttc tcctggcaat  600

gatctgttta aggttgggga aaaataa                                      627

<210>12

<211>208

<212>PRT

<213>白斑综合征病毒

<400>12

Met His Met Trp Gly Val Tyr Ala Ala Ile Leu Ala Gly Leu Thr Leu

  1               5                  10                  15

Ile Leu Val Val Ile Ser Ile Val Val Thr Asn Ile Glu Leu Asn Lys

             20                  25                  30

Lys Leu Asp Lys Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Pro Val Glu Ser Glu Ile

         35                  40                  45

Ile Asn Leu Thr Ile Asn Gly Val Ala Arg Gly Asn His Phe Asn Phe

     50                  55                  60

Val Asn Gly Thr Leu Gln Thr Arg Asn Tyr Gly Lys Val Tyr Val Ala

 65                  70                  75                  80

Gly Gln Gly Thr Ser Asp Ser Glu Leu Val Lys Lys Lys Gly Asp Ile

                 85                  90                  95

Ile Leu Thr Ser Leu Leu Gly Asp Gly Asp His Thr Leu Asn Val Asn

            100                 105                 110

Lys Ala Glu Ser Lys Glu Leu Glu Leu Tyr Ala Arg Val Tyr Asn Asn

        115                 120                 125

Thr Lys Arg Asp Ile Thr Val Asp Ser Val Ser Leu Ser Pro Gly Leu

    130                 135                 140

Asn Ala Thr Gly Arg Glu Phe Ser Ala Asn Lys Phe Val Leu Tyr Phe

145                 150                 155                 160

Lys Pro Thr Val Leu Lys Lys Asn Arg Ile Asn Thr Leu Val Phe Gly

                165                 170                 175

Ala Thr Phe Asp Glu Asp Ile Asp Asp Thr Asn Arg His Tyr Leu Leu

            180                 185                 190

Ser Met Arg Phe Ser Pro Gly Asn Asp Leu Phe Lys Val Gly Glu Lys

        195                 200                 205

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>13

cagaattcat gcayatgtgg ggngt                                        25

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物；n是脱氧肌苷

<400>14

cagaattcyt trtcyttytt rtcnarytt                                    29