改变抗体溶液中离子强度以减少乳光/聚集物
阅读：801发布：2020-05-19
专利汇可以提供改变抗体溶液中离子强度以减少乳光/聚集物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了通过改变 蛋白质 制剂的离子强度减小该制剂的乳光外观的方法，以及乳光降低的浓缩蛋白质的组合物，例如，药物组合物。也公开了在所选的步骤监测和/或降低盐浓度的纯化方法。，下面是改变抗体溶液中离子强度以减少乳光/聚集物专利的具体信息内容。
1.降低抗体制剂的乳光的方法，该方法包括：改变抗体制剂中离子强 度与抗体浓度的比例使得抗体制剂的乳光外观降低，其中该抗体制剂在改 变离子强度前在约100mg/ml的药学有效浓度下显示出大于约2欧洲药典 标准的乳光。
2.减少抗体制剂中高分子量种类的形成的方法，该方法包括：改变抗 体制剂中离子强度与抗体浓度的比例使得该蛋白质制剂中高分子量种类 减少。
3.权利要求1或2的方法，其中所述抗体制剂包含人抗体、人源化抗 体、CDR移植的抗体或体外产生的抗体，或其抗原结合片段。
4.权利要求1或2的方法，其中所述抗体制剂包含IgG1或IgG4重 链恒定区。
5.权利要求1或2的方法，其中所述抗体制剂包含抗GDF8抗体。
6.权利要求1或2的方法，其中所述抗体制剂的抗体在约50到200 mM的盐浓度内具有负的第二维里系数。
7.权利要求6的方法，其中在含有100mM氯化钠的抗体制剂中所述 抗体的第二维里系数为约-1到-10 x 10-3，或约-1到-10 x 10-4mol-mg/g2。
8.权利要求1或2的方法，其中所述抗体制剂的抗体在约50到200 mM的盐浓度内具有正的维里系数。
9.权利要求8的方法，其中在含有100mM氯化钠的抗体制剂中所述 抗体的第二维里系数为约1到10 x 10-4或约1到10 x 10-3mol-mg/g2。
10.权利要求1到9任一项的方法，其中在实施该方法之前和/或之后， 所述抗体以约5到300mg/ml的浓度存在于抗体制剂中。
11.权利要求1到10任一项的方法，其中通过降低抗体制剂中存在的 盐的浓度来降低该抗体制剂的离子强度。
12.权利要求11的方法，其中通过降低抗体制剂中存在的盐的浓度降 低该抗体制剂的离子强度，其中所述制剂中存在的盐选自氯化钠、氯化钙、 氯化镁和磷酸钠。
13.权利要求11的方法，其中通过降低抗体制剂中存在的盐的浓度降 低该抗体制剂的离子强度，其中盐的浓度降低到比乳光制剂中的浓度低至 少约2、3、5、10或100倍。
14.权利要求11的方法，其中通过用第二种盐替换第一种盐改变抗体 制剂的离子强度，其中第一种盐是NaCl，第二种盐选自NaHPO4、MgCl2 和CaCl2。
15.权利要求11的方法，其中通过用第二种盐替换第一种盐改变抗体 制剂的离子强度，其中第一种盐是NaHPO4，第二种盐选自MgCl2和CaCl2。
16.权利要求1到10任一项的方法，其中通过超滤或透析改变抗体制 剂的离子强度。
17.权利要求1到10任一项的方法，其还包括：
评估抗体制剂的乳光；或
测定抗体制剂中的盐浓度；其中通过包括下列一种或多种的方法改变 抗体制剂的离子强度：应用一种或多种过滤方法或在纯化抗体的方法中降 低一个或多个步骤的盐浓度。
18.权利要求17的方法，其中所述纯化抗体的方法包括离心、过滤、 层析、冻干或重构的一种或多种。
19.权利要求1到10任一项的方法，其还包括评估所述抗体制剂的乳 光。
20.权利要求19的方法，其中通过评估溶液的浊度、评估第二维里系 数的改变，或评估高分子量种类形成的改变来检测抗体制剂的乳光。
21.权利要求20的方法，其中乳光降低到约2或1个欧洲药典标准或 更低。
22.权利要求20的方法，其中第二维里系数从约-1到-10 x 10-3改变为 约-1到-10 x 10-4。
23.权利要求20的方法，其中高分子量种类的量减少约2、3、4、5、 6、7、8、9、10、50或100倍。
24.减少抗体制剂中高分子量种类的形成的方法，该方法包括改变抗 体制剂中离子强度与抗体浓度的比例使得蛋白质制剂中高分子量种类的 形成减少，其中该制剂中的抗体在100mM氯化钠溶液中具有负的维里系 数。
25.提高抗体制剂的纯化方法的效率的方法，该方法包括：
(任选)评估蛋白质制剂在一种或多种盐浓度下是否形成乳光溶液；
改变该制剂中离子强度与抗体浓度的比例使得抗体制剂中高分子量 种类减少，从而提高抗体制剂的纯化方法的效率，
其中通过下列一种或多种改变该溶液的离子强度：应用一种或多种过 滤方法，用较低的乳光诱导剂置换蛋白质制剂中使用的盐，或降低纯化方 法中一个或多个步骤的离子强度。
26.改善抗体的生产的方法，该方法包括：
回收第一种抗体溶液；和
评估第一种抗体溶液中乳光水平或高分子量种类的存在；
其中(a)如果乳光或高分子量种类的水平等于或小于预定水平，那么选 择所述第一种抗体溶液用于抗体产物；或(b)如果乳光或高分子量种类 的水平大于预定水平，那么选择具有第二种离子强度的第二种抗体溶液。
27.权利要求26的方法，其还包括重复评估步骤直到溶液中的乳光水 平等于或小于预定水平。
28.权利要求26或27的方法，其中通过选自下列一种或多种的蛋白 质纯化方法回收抗体溶液：从基质洗脱抗体、回收透析的溶液或其他滤液、 溶解干燥制剂，或层析方法。
29.权利要求28的方法，其中通过层析方法回收抗体溶液并且层析方 法选自A蛋白层析、亲和层析、疏水相互作用层析、固定化金属亲和层析、 大小排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过滤、阴离子交换层析、羟基磷灰 石层析和阳离子交换层析。
30.权利要求26到29任一项的方法，其中抗体溶液的预定水平具有 约2的浊度值。
31.确定抗体制剂具有乳光外观倾向的方法，该方法包括：
(任选)鉴定抗体为具有自身聚集的倾向；
提供抗体制剂的一个或多个样品；和
检测当升高所述一个或多个样品中盐浓度时高分子量种类的形成，其 中升高盐浓度时高分子量种类形成的增加表明制剂中抗体具有乳光外观 的倾向增加。
32.评估抗体样品的乳光的方法，该方法包括：
提供抗体样品；
测定在一种或多种盐浓度下的浊度或高分子量种类的存在；和
提供抗体样品中乳光的水平作为一种或多种盐浓度下浊度或高分子 量种类的存在的函数的报告。
33.通过权利要求1、2、25或26任一项的方法产生的抗体制剂。
34.可药用抗体制剂，其在少于约50mM NaCl中包含至少约50 mg/ml浓度的抗体。
相关申请参考
本申请要求2006年10月12日提交的美国申请序号60/851,651的优先 权，将其内容完整引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及减少蛋白质制剂乳光的方法，以及具有减少的乳光的浓缩 蛋白质制剂的组合物，例如，药物组合物。
背景
在过去20年里，蛋白质，包括抗体已经被用于药物疗法。为了实现高 治疗剂量，通常以高浓度配制抗体(约10mg/ml到100mg/ml或更高) (Brekke，O.H.和Sandlie，I.(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2：52-62)。某些 蛋白质施用方式通常需要高度浓缩的蛋白质制剂。例如，治疗性抗体的皮 下施用通常以大于约100mg/ml的浓度配制。这些浓缩的蛋白质制剂的一 些在高浓度时产生乳白色外观，其是一种通常被称作乳光的性质 (Schellekens，H.(2002)Nat.Rev.Drug Discov.1：457-462)。
浓缩的蛋白质溶液中乳光外观可以由多种因素引起，包括蛋白质浓 度、它在瑞利散射中的效应、温度、溶质-溶质相互作用的性质，等等。 当蛋白质容易发生乳光时，随着蛋白质浓度的升高，乳光外观通常更明显。 乳光溶液与聚集的蛋白质溶液的相似性已经在其丧失蛋白质活性和在药 物制剂中可能引起免疫原性方面引起了关注(Pinckard等人(1967)Clin Exp.Immunol.2：331-340；Robbins等人(1987)Diabetes 36：838-845； Cleland等人(1993)Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377)。
从而，需要开发具有降低的乳光的高度浓缩的治疗性蛋白质，例如， 治疗性抗体的制剂。
概述
本发明至少部分基于如下发现：降低抗体制剂中的盐(如氯化钠)浓 度减少了制剂的乳光外观和/或制剂中高分子量种类的形成。从而，公开了 例如通过改变制剂的离子强度减少蛋白质(如抗体)制剂的乳光外观的方 法，以及具有降低的乳光的浓缩蛋白质的组合物，如药物组合物。也公开 了纯化方法，其在纯化方法中所选的步骤中监测和/或降低盐浓度。
因此，一方面，本发明描述了减少蛋白质制剂，如抗体制剂(例如， 包括蛋白质，如抗体的溶液)的乳光或者减少高分子量种类的量的方法。 该方法包括改变，例如减小或增加制剂的离子强度使得蛋白质制剂的乳光 外观和/或高分子量种类的量减少和/或消除。在实施方案中，蛋白质制剂 中离子强度与蛋白质浓度(例如，抗体浓度)的比例被修改或改变，例如， 减小或增加，使得蛋白质制剂的乳光外观和/或高分子量种类的量被减少和 /或消除。在实施方案中，在药物有效浓度下，例如，对于抗体制剂，在约 5、10、25、50、75、100、125、150mg/ml的浓度下，蛋白质制剂在减小 离子强度前显示出不想要的乳光和/或高分子量种类(例如，浊度大于约1、 2、3、4或5或更高的欧洲药典标准和/或高分子量种类的百分比对应于蛋 白质制剂的约2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％或更高的质量百 分数)。
在实施方案中，制剂中的蛋白质是分泌型蛋白质，例如，抗体、抗体 的抗原结合片段、结合结构域-免疫球蛋白融合物(例如，SMIPTM)、可 溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶，或者凝血因子，如下 文更详细描述。在其中蛋白质是抗体的实施方案中，它可以包括至少一条 并且优选两条全长重链，和至少一条并且优选两条轻链。如本文使用的术 语“抗体”包括抗体片段或可变分子，如抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、 Fv、单链Fv片段、和重链片段(例如，驼科(camelid)VHH)。抗体可 以是单克隆抗体或单特异性抗体。抗体也可以是人、人源化的、嵌合的、 CDR移植的，或者体外产生的抗体。在其他实施方案中，抗体具有选自 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在另一实施方案中，抗体具有 选自例如κ或λ的轻链。在一个实施方案中，恒定区被改变，例如，突变， 以改变抗体的性质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗 体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能，或者补体功能)。通常，抗 体特异结合预定抗原，例如，与病症(如神经变性、代谢、炎性、自身免 疫和/或恶性病症)有关的抗原。可以用于本发明方法的示例性抗体包括， 但不限于，抗Aβ肽、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-22 (IL-22)、5T4和生长和分化因子-8(GDF-8)的抗体。在实施方案中，抗体 是抗GDF-8抗体，例如，Myo-029。
在实施方案中，在较高蛋白质和/或盐浓度下的蛋白质自身聚集物例如 在高盐制剂(例如，具有约50到200mM盐浓度(例如，约100到150mM 盐)的制剂)中具有负的第二维里系数。例如，在含有例如150mM氯化钠 的制剂中，蛋白质具有约-1 x 10-1到-1、约-1 x 10-2到-10 x 10-2、约-1 x 10-3 到-10 x 10-3、约-1 x 10-4到-10 x 10-4、约-1 x 10-5到-10 x 10-5mol-mg/g2的第 二维里系数。在其他实施方案中，在含有例如150mM氯化钠的制剂中， 蛋白质具有正的维里系数，例如约1 x 10-5到10 x 10-5、约1 x 10-4到10 x 10-4、约1 x 10-3到10 x 10-3、约1 x 10-2到10 x 10-2mol-mg/g2。在其中蛋 白质是抗体或其片段的实施方案中，在实施本发明方法之前和/或之后，抗 体以约0.1到约1,000mg/ml，通常约0.5到约500、约1到400、约5到 300、约10到250、约15到200、约20到150、约50到100mg/ml的浓 度存在。
在实施方案中，通过降低制剂中存在的盐的浓度，和/或通过用诱导较 少乳光的盐替换用于制剂中的盐，改变，例如降低蛋白质制剂的离子强度。 制剂中的盐可以选自下列一种或多种：例如，氯化钠、氯化钙、氯化镁或 磷酸钠。制剂中的盐浓度可以降低到较低浓度，例如，比乳光制剂中的浓 度低至少约2、3、5、10或100倍的浓度。例如，可以将蛋白质制剂中的 盐(例如氯化钠)浓度降低到小于约300mM，通常小于约200、150、100、 75、50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2、1或0mM。例如，通过 应用选自：超滤或透析的一种或多种过滤方法可以改变，例如降低蛋白质 制剂中的盐浓度。备选或额外地，通过将一种或多种第一类盐(例如，高 乳光诱导剂)用一种或多种第二类盐(例如，较低乳光诱导剂)替换，改 变(例如，降低或升高)蛋白质制剂的离子强度。下面的示例性盐根据在 抗体制剂中的乳光诱导水平，以从高到低乳光诱导剂的顺序排列：氯化钠 (NaCl)、磷酸钠(NaHPO4)、氯化镁(MgCl2)和氯化钙(CaCl2)。相应地，在 实施方案中，第一类盐是NaCl，并且用选自例如NaHPO4、MgCl2、或 CaCl2的一种或多种的第二类盐替换；第一类盐是NaHPO4，并且用选自 例如MgCl2或CaCl2的一种或多种的第二类盐替换；第一类盐是MgCl2，并 且用第二类盐CaCl2替换。在实施方案中，通过例如经透析或超滤除去第 一类盐并向蛋白质制剂加入第二类盐，在蛋白质制剂中用第二类盐替换第 一类盐。在实施方案中，第二类盐的浓度大于第一类盐的浓度。在实施方 案中，第二类盐的浓度等于第一类盐的浓度。在其他实施方案中，第二类 盐的浓度小于第一类盐的浓度。
在其他实施方案中，在制备和/或纯化蛋白质的方法中，例如，通过降 低所用的高乳光诱导剂的浓度，改变，例如降低或升高了蛋白质制剂的离 子强度。实施方案包括：(i)(任选地)评估在一种或多种蛋白质和/或盐浓 度下，蛋白质制剂是否形成乳光溶液；(ii)(任选地)提供蛋白质制剂中的 盐浓度；和/或(iii)改变，例如，减小蛋白质制剂的离子强度(例如，改变 离子强度与蛋白质制剂中蛋白质浓度的比例)。如需要，可以重复和/或以 任何顺序进行步骤(ii)和/或(iii)。通过检测含有不同浓度蛋白质和/或盐的一 个或多个样品中的乳光和/或高分子量种类的存在可以进行步骤(i)，如本文 的实施例中所述。例如，通过应用本文所述的一个或多种过滤方法可以改 变，如降低蛋白质制剂的离子强度。备选或额外地，通过在制备和/或纯化 蛋白质的方法中的一个或多个步骤中降低离子强度，例如盐浓度可以降低 蛋白质制剂的离子强度。制备和/或纯化蛋白质的方法中离子强度的此类降 低可以通过降低用于一个或多个步骤的盐的浓度来实现。在其他实施方案 中，通过将一个或多个步骤中使用的盐用较低乳光诱导剂替换来改变离子 强度。在一些实施方案中，制剂中的蛋白质被重组制备，例如，使用重组 技术表达为例如细胞结合的、可溶性或分泌性蛋白质。在此类实施方案中， 蛋白质被重组宿主表达并与重组宿主分离(例如，分泌到培养基中并例如， 通过离心或过滤分离)。通过本领域已知的方法进一步纯化分离的蛋白质， 所述方法包括但不限于，A蛋白层析、亲和层析、疏水相互作用层析、固 定化金属亲和层析、大小排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过滤、阴离子 交换层析、羟基磷灰石层析和/或阳离子交换层析。可以将蛋白质进一步冻 干和/或在缓冲液中重构。本发明的方法包括改变，例如，降低用于一个或 多个前述步骤中的溶液(例如，洗涤、上样、洗脱、重构溶液)的离子强 度，例如，盐浓度。
不被理论束缚，认为即使在应用过滤方法，如超滤和透析后，蛋白质 制剂中也存在残留量的盐。此类残留的盐量在本领域中被表征为“唐南效 应”(Miro，M等人(2004)Analytica Chimica Acta 512(2)：311-317)。认为此类 残留的盐量可以导致具有乳光外观的蛋白质制剂，尤其当制剂中的蛋白质 具有自身聚集的倾向时，例如，它具有负的维里系数时。从而，使用本文 公开的方法改变离子浓度对于蛋白质纯化技术可以具有广泛应用。
在实施方案中，通过评估溶液的浊度检测蛋白质制剂乳光的降低。例 如，蛋白质制剂的浊度降低到约5、4、3、2、1或更低的欧洲药典标准。
在其他实施方案中，通过评估蛋白质第二维里系数的改变测定蛋白质 制剂乳光的降低。例如，改变，如降低蛋白质制剂的离子强度后，检测到 蛋白质的第二维里系数的2、3、5、10或100倍改变，例如，增加或减少。 例如，维里系数从约1 x 10-2到1 x 10-3之间的任何地方改变(例如降低) 到约1 x 10-3到1 x 10-4之间的任何地方。
在其他实施方案中，通过测定高分子量种类的量来检测蛋白质制剂乳 光的降低。高分子量种类通常具有约104，更通常约105、106、107、108、109、 1010、1011、1012、1013，或更高的分子量。制剂中蛋白质种类的重量平均 分子量可以使用下列一种或多种检测：光散射技术，例如，静态和动态光 散射、不对称流场流分级法(asymmetric flow field flow fractionation)或 者SEC-HPLC，如下面实施例中所述。在实施方案中，高分子量种类的2、 3、4、5、6、7、8、9、10、50或100倍减少表明蛋白质制剂乳光的降低。 例如，高分子量种类的质量百分比从总蛋白质质量的约30到40％降低到 小于约5％，同时非聚集的蛋白质的质量百分比从总蛋白质质量的约60到 70％升高到约95％或更高(如通过动态光散射检测)。
另一方面，本发明描述了减少蛋白质(如抗体)制剂(例如，如本文 所述的蛋白质，如抗体制剂)中高分子量种类的形成和/或减少高分子量种 类的量的方法。该方法包括改变，如降低或升高制剂的离子强度(例如， 改变离子强度与蛋白质制剂中蛋白质浓度的比例)，使得蛋白质制剂中高 分子量种类的量被减少和/或消除。
在实施方案中，高分子量种类是蛋白质聚集体，其可以在降低蛋白质 和/或盐浓度时被基本上可逆地解离。高分子量种类通常具有约104kDa，更 通常，约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013kDa，或更高的分 子量。制剂中蛋白质种类的重量平均分子量可以使用下列一种或多种检 测：光散射技术，例如，静态和动态光散射、不对称流场流分级法或者 SEC-HPLC，如下面实施例中所述。在实施方案中，高分子量种类的2、3、 4、5、6、7、8、9、10、50或100倍减少表明蛋白质制剂乳光的降低。例 如，高分子量种类的质量百分比从总蛋白质质量的约30到40％降低到小 于约5％，同时非聚集的蛋白质的质量百分比从总蛋白质质量的约60到70 ％升高到约95％或更高(如通过动态光散射检测)。
在实施方案中，通过本文公开的方法实现制剂的离子强度的降低。
另一方面，本发明描述了提高蛋白质(如抗体)制剂(例如，本文公 开的蛋白质，如抗体制剂)的生产和/或纯化方法效率的方法。该方法包括： (i)(任选地)评估在一种或多种蛋白质和/或盐浓度下，蛋白质制剂是否形 成乳光溶液；(ii)改变，例如，减小蛋白质制剂的离子强度，使得蛋白质制 剂中高分子量种类的量被减少和/或消除。通过检测含有不同浓度蛋白质和 /或盐的一个或多个样品中的乳光和/或高分子量种类的存在可以进行步骤 (i)，如本文的实施例中所述。例如，通过应用本文所述的一个或多种过滤 方法；将蛋白质制剂中使用的盐用较低乳光诱导剂(如本文所述)替换； 和/或降低制备和/纯化蛋白质方法的一个或多个步骤的离子强度(如本文 所述)，可以改变，如降低蛋白质制剂的离子强度。
在再一个方面，本发明描述了改善蛋白质的生产，例如选择用于制备 抗体的方法中的盐或盐浓度的方法。该方法包括(i)回收抗体溶液(例如， 从基质洗脱抗体；回收透析的溶液或者其他滤液；和/或用具有第一种离子 强度(例如第一种盐浓度)的第一种溶液溶解干燥制剂，例如，冻干或者 干燥的制剂)；(ii)评估抗体溶液中乳光水平和/或高分子量种类的存在； 其中(a)如果乳光和/或高分子量种类的水平等于或小于预定水平，那么 选择所述抗体溶液用于抗体产物，例如，包括该抗体溶液的药物组合物； 或(b)如果乳光和/或高分子量种类的水平大于预定水平，那么选择具有 第二种(例如较低)离子强度(例如，第二种，如较低盐浓度)的第二种 溶液。如果需要，可以评估含有抗体的第二种溶液中乳光水平和/或高分子 量种类的存在，并且可以加入额外的溶液直到乳光水平达到(或小于)预 定水平。
在实施方案中，通过本领域已知的一种或多种蛋白质纯化方法回收抗 体溶液，所述方法包括，但不限于，A蛋白层析、亲和层析、疏水相互作 用层析、固定化金属亲和层析、大小排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过 滤、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析和/或阳离子交换层析。可以将蛋白 质进一步冻干和/或在缓冲液中重构。
在实施方案中，(第一种、第二种和额外的)抗体溶液的预定水平是 通常在药物有效浓度(例如，对于抗体制剂，为约5、10、25、50、75、 100、125或150mg/ml)下，具有大于约1、2、3、4、5或更高的欧洲药 典标准，通常约3的浊度值，和/或高分子量种类增加到蛋白质制剂的1％、 2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％或更高的质量百分数，通常约2 ％。
另一方面，本发明描述了抗体纯化方法或抗体制剂，其中结合到抗体 的残留盐浓度的量小于抗体被彻底透析，例如在0mM盐中透析后看到的 量。
另一方面，本发明描述了测定如本文所述的蛋白质(如抗体)制剂具 有乳光外观的倾向的方法。该方法包括：(i)(任选)例如通过测定表面蛋 白质电荷和/或第二维里系数来鉴定蛋白质为具有自身聚集的倾向；和/或 (ii)当分别升高和/或降低在溶液中含有所述蛋白质的一个或多个样品中蛋 白质和/或盐浓度时，检测高分子量种类的形成和/或消失。负的维里系数 和/或当升高盐和/或蛋白质浓度时高分子量种类的增加表明制剂中蛋白质 具有乳光外观的倾向增加。
在再一方面，本发明描述了评估蛋白质(如抗体)样品的乳光的方法。 该方法包括：提供蛋白质(如抗体)样品；在一种或多种(例如，至少两 种、三种或多种)盐(如NaCl)浓度下测定浊度和/或高分子量种类的存 在；提供关于蛋白质(如抗体)样品中乳光水平作为在一种或多种盐(如 NaCl)浓度下浊度和/或高分子量种类的存在的函数的报告。
在其他方面，具有降低的乳光的蛋白质(如抗体)制剂(以及包括本 文公开的蛋白质制剂的药物组合物和/或制剂)也在本发明范围内。在实施 方案中，通过本文描述的方法产生蛋白质制剂。
在其他实施方案中，与除去一种或多种高分子量种类(例如过滤或离 心步骤)前的高分子种类相比，蛋白质制剂包括至少70％、80％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高质量百分数的非聚集的种类(如通 过动态光散射检测)。在实施方案中，蛋白质制剂的离子强度的改变(例 如降低)引起与高分子量种类相比，非聚集蛋白质的百分比升高2、3、4、 5、6、7、8、9、10、50或100倍。
在再一方面，本发明描述了可药用抗体制剂，其包括在小于约50、40、 30、20、10、5或1mM盐(如NaCl)中浓度为至少约50、75、100、125 或150mg/ml的抗体，如人或人源化抗体。
另一方面，本发明描述了提供抗体制剂的方法，其包括：(i)提供抗体 溶液，如人或人源化抗体溶液，其在除去一种或多种高分子量种类，如过 滤或离心步骤之前具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或更高质量百分比的非聚集种类；(ii)进行一个或多个纯化步骤以提供 中间抗体溶液；和(iii)处理该中间溶液以提供抗体制剂，该抗体制剂具 有至少约50到150mg/ml的浓度和小于约5、4、3、2、1或更小的欧洲药 典标准的浊度。
根据优选实施方案的描述和权利要求书，其他方面、特征和优点将是 显而易见的。
附图简述
图1显示了暴露于增加的NaCl浓度的抗体M1(本文中也称作 “Myo-029”)溶液的图像(显示了视觉上可感知的乳光增加)。
图2显示了在0mM NaCl和100mM NaCl中抗体M1溶液的动态光 散射图。
图3显示了在100mM NaCl中抗体M1溶液的不对称流场流分级法。
图4显示了在100mM NaCl中抗体M1溶液的SEC-HPLC层析。
图5显示了从0mM NaCl透析到100mM NaCl并返回到0mM NaCl 的抗体M1溶液的图像(显示了随着盐浓度的改变，可见的可逆乳光)。
图6显示了抗体M1溶液的动态光散射图，显示了乳光种类的可逆形 成：(a)100mM NaCl，其从0mM NaCl透析，和(b)0mM NaCl，其从100 mM NaCl透析。
图7显示了随着增加NaCl浓度，抗体M2溶液的图像(没有显示视 觉上可感知的乳光增加)。
图8显示了在0mM NaCl和150mM NaCl中抗体M2溶液的动态光 散射图。
图9显示了在0mM NaCl和150mM NaCl中抗体M3溶液的动态光 散射图。
图10显示了在100mM NaCl下抗体M1的第二维里系数图。
图11显示了在100mM NaCl下抗体M2的第二维里系数图。
图12显示了含有不同盐的抗体M1溶液在1小时后显示乳光的图像。
图13显示了含有不同盐的抗体M1溶液在2周后显示乳光的图像。
图14显示了含有不同盐的抗体M1溶液的OD400nm对温度循环数 的图。
图15显示了含有不同盐的抗体M1溶液的高分子量百分比对盐浓度的 图。
图16显示了含有不同盐的抗体M1溶液的OD400nm对盐浓度的图。
图17显示了图16中所示的图的扩展区。
图18显示了20mM CaCl2中OD400nm对抗体M1浓度的图。
详述
本申请公开了通过改变制剂的离子强度减小蛋白质制剂的乳光外观 的方法，并且公开了具有降低的乳光的浓缩蛋白质的组合物，例如，药物 组合物。也公开了在所选的步骤监测和/或降低盐浓度的纯化方法。
在一个实施方案中，为三种抗体：抗体M1(本文中也称作“Myo-029”)、 抗体M2和抗体M3评估了盐浓度，即离子强度对浓缩的抗体制剂的乳光 外观的影响。如在所附实施例中更详细描述的，发现所有三种抗体在仅仅 10mM组氨酸中pH6.0下都含有相对少量的极大种类。该大种类太大而 不能使用SEC-HPLC柱分离。对于抗体M1，通过增加抗体制剂中氯化钠 的量增加离子强度增加了乳光，以及出现了液-液相分离(见例如图1- 4)。如在图5-6中对抗体M1所示，当除去盐时，乳光外观是可逆的。 使用不对称流场流分级法(aFFFF)为抗体M1观察到大种类，其后来使用 动态光散射技术得到证实(见图2)。尽管与抗体M1相比，抗体M2和 M3没有显示出通过视觉检查可检测的乳光的显著增加(见例如，图7)， 但是使用光散射技术为两种抗体都检测到高分子量种类(图8和9中显示)。
与抗体M3和抗体M2(它们都具有正的维里系数)相比，为抗体M1 计算的负的维里系数与抗体M1的聚集/结合倾向相一致(比较图10和图 11)。
本文所示的结果表明抗体研究的乳光外观主要是由于可逆的自缔合 作用，其受到增加离子强度的进一步诱导。因此，如本发明公开的，为了 降低浓缩的抗体制剂(尤其具有聚集倾向的抗体制剂)的乳光外观，抗体 制剂的离子强度应该从制剂降低和/或在加工方法中受到限制。
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在整个详述 部分给出。
术语“乳光”或“乳光外观”指在溶液(如蛋白质制剂)中检测的混浊度， 作为溶液中一种或多种组分(如蛋白质)的浓度和/或盐浓度的函数。通过 参考使用已知浊度的悬浮液产生的标准曲线可以计算混浊度。用于测定药 物组合物的混浊度的参考标准可以基于欧洲药典标准(欧洲药典，第四版， Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe(EDQM)， Strasbourg，法国)。根据欧洲药典标准，将澄清的溶液定义为具有小于或 等于参考悬浮液的浊度的溶液，所述参考悬浮液具有根据欧洲药典标准约 3的浊度。比浊浊度测量可以检测瑞利散射，在不存在缔合或非理想效应 时，瑞利散射通常随浓度线性改变。
例如，理想溶液行为符合下式：
KC/Rθ＝1/M
其中M是分子量，K是常数，Rθ是瑞利比(其组合了许多实验参数)， C是浓度。而非理想溶液可以使用下式描述：
KC/Rθ＝1/M+2BC+…
其中B是第二维里系数。为了得到M，将KC/Rθ外推到0角度和0 浓度。齐姆图将KC/Rθ置于纵坐标上并将sin2(θ/2)+kC置于横坐标上，其 中k是任意常数。从而，齐姆图允许在相同的图上进行KC/Rθ0角度和0 浓度外推。使用齐姆图，M和B分别是0角度线的截距和斜率。
术语“第二维里系数”是本领域公知的，指已占体积效应和分子间相互 作用的测量(Tessier，P.M.等人(2003)Current Opinion in Biotechnology 14(5)：512-516)。正的第二维里系数通常表明已占体积效应和分子间排斥作 用。相比，负的第二维里系数通常表明分子间吸引作用。这些分子内和分 子间相互作用的平衡决定了第二维里系数的符号和幅度。
术语“离子强度”指溶液中离子浓度。如果“I”是离子强度：
其中ci是离子i的摩尔浓度，zi是该离子的电荷，对溶液中的所有离 子进行总和(IUPAC Compendium of Chemical Terminology，第二版 (1997))。
如本文使用的术语“蛋白质”指可以作为一个单位发挥功能的一种或多 种多肽。如本文使用的术语“多肽”指通过肽键连接在一起的氨基酸的顺序 链。术语“多肽”用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域技术人员将理解 该术语不限于长链并且可以指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的 最小链。如果单一多肽作为一个单元发挥功能，那么术语“多肽”和“蛋白质” 可互换使用。术语蛋白质和多肽包括抗体、受体融合物、SMIPTM、生长 因子、细胞因子、凝血因子和酶，如下文详述。
术语“抗体”指任一免疫球蛋白或其片段，并且包括包含抗原结合部位 的任何肽或多肽。该术语包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、单 特异性抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人源化抗体、脱免疫抗体、 人抗体、驼科抗体、啮齿动物抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重 组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植的抗体，和体外产生的抗体。术语“抗 体”也包括抗体片段和变体分子，如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、 VHH，和保留抗原结合功能的其他抗体片段和变体分子。通常，此类片段 将包含抗原结合结构域。
术语“蛋白质制剂”指在溶液中含有至少一种蛋白质，如抗体的任何组 合物，当升高该制剂的离子强度时，其能够形成高分子量种类。蛋白质制 剂可以含有相同或不同的蛋白质，例如，具有不同结合特异性的抗体。
术语“高分子量种类”指至少两个蛋白质如抗体的缔合。在实施方案中， 蛋白质缔合导致形成单体蛋白质的更高级的聚集体。由于非共价(例如， 静电、范德华力)蛋白质-蛋白质相互作用可以引起缔合。当降低蛋白质 制剂的离子强度时，缔合通常是可逆的。蛋白质可以是相同或不同的，例 如，具有不同结合特异性的抗体。高分子量种类通常具有约104，更通常 约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013，或更高的分子量。
使用几种分析技术可以监测蛋白质形成高分子量种类的聚集，所述技 术包括但不限于，光密度、不对称流场流分级法、SEC-HPLC、静态光散 射，和动态光散射，如本文详述。
可以测量蛋白质样品的浊度为光密度(特定波长下的吸光度)。使用 分光光度法(例如，使用SpectraMax UV-Vis在400nm波长下)可以进行 光密度测量。关于怎样测量光密度的更详细描述，见例如，Eckhardt BM (1994)JPharm Sci Technol.48(2)：64-70。
不对称流场流分级法(AF4)是一种类型的不对称场流分级法。AF4是 能够快速分级分离和高分辨率表征多种颗粒，包括生物分子的方法 (Giddings，J.C.；Yang，F.J.；Myers，M.N.，Flow-field-flow fractionation：a versatile new separation method，193 Science 1244-1245(1976)；Giddings，J. C.；Yang，F.J.；Myers，M.N.，Theoretical and experimental characterization of flow field-flow fractionation，48 Anal.Chem.1126-1132(1976))。AF4能 够分离从几纳米到几微米的颗粒。场流分级法分离在薄的流体通道(与层 析分离柱相当)中发生。水性或有机溶剂携带样品通过该通道。由于低通 道高度，通过通道流动——对样品施加的第一种力是层状的。与通道流垂 直产生第二种力。在AF4中，流体通道的一侧是膜并且第二种力是流体穿 过通道通过膜流动。由于这两种力，在该系统中发生颗粒分离。首先，由 于通道内的层流导致的速度梯度引起通道中心的颗粒沿着通道更快地移 动并与更接近通道侧面的那些颗粒分离。其次，第二种力迫使样品朝向膜。 发生大小分离，因为较小的分子比较大的颗粒更快地朝着通道中心扩散并 且因此由于较快的溶剂朝着通道中心流动而导致所述较小的分子与较大 的颗粒分离。
缩写SEC-HPLC表示大小排阻层析-高效液相层析。SEC和HPLC 与组合SEC-HPLC分析技术都是公知的分析技术(Garnick，R.L.，Ross，M. J.，Du Mee，C.P.，Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，Ed.J. Swarbrick，J.C.，Boylan，Vol.1：253(Marcel Dekker，Inc.，New York， 1988))。不深入研究每种技术背后的理论，SEQ也称作凝胶渗透层析，基 于大小分离分子，这是由于分子能够沿着凝胶基质移动，HPLC基于扩散 系数分离分子，因为分子在高压下经过静止的介质移动。
静态和动态光散射是用于测量从溶剂/溶质系统散射的光图案的两种 不同的实验方法(Berne，B.和Pecora，R.Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry，Biology and Physics(Wiley，New York，1976))。静 态和动态光散射给出了互补的信息，并且为此原因，它们通常一起用于表 征溶液。
静态光散射涉及测量溶液中颗粒散射的激光的时间-平均强度的角 度依赖性。随着检测器角度而变，颗粒的大小和结构影响光散射强度。已 确定在低散射向量(scatter vector)和低浓度的限制下，散射强度的角度 分布变得独立于颗粒形状(Zimm，B.，Thescattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions，16 J.Chem.Phys.1093-9 (1948))。如上文讨论，通过外推(Kc/Rθ)到0角度和0浓度，可以估计一些 因素，包括平均分子量、回转半径和第二维里常数。
动态光散射涉及所发生的散射光强度的时间依赖性波动，因为溶液中 的颗粒(在该情况下为蛋白质)正经历随机的布朗运动。通过分析这些强 度波动，可以确定颗粒的扩散系数分布。然后可以将扩散系数分布用公知 的理论转化为大小分布。动态光散射的上限(upper sized limit)是依赖样 品密度的，即，颗粒必须能够移动，从而上限通常是颗粒沉降相比扩散过 程占优势的那一点。下限将依赖于与悬浮介质相比，样品产生的过量散射 光，以及其他因素，包括样品浓度、相对折射率、激光功率、激光波长、 检测器灵敏度等等。
蛋白质
在一些实施方案中，重组产生蛋白质制剂中的蛋白质。如本文所用的 术语“重组表达的蛋白质”和“重组蛋白”指从宿主细胞表达的多肽，所述宿 主细胞已经通过人的手操作以表达该多肽。在一些实施方案中，宿主细胞 是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该操作可以包括一种或多种遗传修 饰。例如，通过导入一种或多种编码待表达多肽的异源基因遗传修饰宿主 细胞。异源重组表达的多肽可以与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相 似。异源重组表达的多肽也可以是宿主细胞外源的，例如，与在宿主细胞 中正常表达的多肽异源。在一些实施方案中，异源重组表达的多肽是嵌合 的。例如，多肽的部分可以含有与宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似 的氨基酸序列，而其他部分含有宿主细胞外源的氨基酸序列。额外或备选 地，多肽可以含有来自都在宿主细胞中正常表达的两种或多种不同多肽的 氨基酸序列。此外，多肽可以含有来自都是宿主细胞外源的两种或多种多 肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过活化或上调一种或多种内源基 因遗传修饰宿主细胞。
显示出所希望程度的乳光和/或形成分子量种类的任何蛋白质都可以 根据本发明使用。例如，本发明可以用于降低任何药学或商业上相关的抗 体、受体、细胞因子、生长因子、酶、凝血因子、激素、调节因子、抗原、 结合剂等等的乳光。可以根据本发明分离的下面列表的蛋白质在性质上仅 仅是示例性的，并且不意在为限制性引用。本领域技术人员将理解任何蛋 白质可以根据本发明表达并且将能够根据需要选择待产生的具体蛋白质。
抗体和结合片段
抗体，也称作免疫球蛋白，是典型的四聚体糖基化蛋白质，由各约25 kDa的两条轻(L)链和各约50kDa的两条重(H)链组成。在抗体中可 以发现称作λ和κ的两种类型的轻链。取决于重链恒定结构域的氨基酸序 列，可以将免疫球蛋白分为五大类：A、D、E、G和M，并且这些的一些 可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和IgA2。每条轻链包括N-末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构 域(CL)。每条重链包括N-末端V结构域(VH)、三个或四个C结构 域(CH)和铰链区。与VH最接近的CH结构域被称作CH1。VH和VL 结构域由相对保守序列的四个区组成，这些区被称作构架区(FR1、FR2、 FR3和FR4)，其形成三个高变序列区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR 含有负责抗体与抗原的特异相互作用的多数残基。CDR被称作CDR1、 CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分被称作H1、H2和H3，而轻 链上的CDR成分被称作L1、L2和L3。CDR3通常是抗体结合部位内分 子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或者大于26个 氨基酸。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域公知的。抗体 结构综述见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，eds.Harlow等人，1988。本领域技术人员将认识到每个亚基结 构，例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构包含活性片段，例如， VH、VL或CDR亚基的结合抗原的部分，即抗原结合片段，或者例如， CH亚基的结合和/或活化例如Fc受体和/或补体的部分。CDR通常指 Kabat CDR，如Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services(1991)，eds.Kabat et al中所述。 表征抗原结合部位的另一标准是指如Chothia所述的高变环。见例如， Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等人 (1995)EMBOJ.14：4628-4638。再一个标准是Oxford Molecular的AbM 抗体建模软件所用的AbM定义。一般见，例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering J.ab Manual(Ed.：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag， Heidelberg)。关于Kabat CDR所述的实施方案可以备选地用关于Chothia 高变环或者关于AbM定义的环类似描述的关系实现。
在术语抗体的“抗原结合片段”内包括的结合片段的实例包括(i)Fab片 段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片 段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd 片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL 和VH结构域组成，(v)dAb片段，其由VH结构域组成；(vi)驼科或骆驼 化可变结构域，例如，VHH结构域；(vii)单链Fv(scFv)；和(viii)双特 异性抗体。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码， 但是它们可以用重组方法通过合成的接头连接，所述接头使得它们成为一 条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见 例如，Bird等人(1988)Science 242：423-26；Huston等人(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-83)。此类单链抗体也意在包括在术语抗体 的“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体 片段，并且以与完整抗体相同的方式评估片段的功能。
除了“双特异性”或“双功能”抗体外，将抗体理解为其每个结合位点是 相同的。“双特异性”或“双功能”抗体是人工杂合抗体，其具有两个不同的 重/轻链对和两个不同的结合位点。通过多种方法可以产生双特异性抗体， 所述方法包括杂交瘤的融合或者Fab′片段的连接。见例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J. Immunol.148，1547-1553(1992)。
本领域技术人员已知的许多方法可以用于得到抗体。例如，通过根据 已知的方法产生杂交瘤可以产生单克隆抗体。然后使用标准方法，如酶联 免疫吸附测定(ELISA)和表面等离振子共振(BIACORETM)分析筛选以这 种方式形成的杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异结合的抗体的一个或多 个杂交瘤。任一形式的特定抗原可以用作免疫原，例如，重组抗原、天然 存在的形式，其任何变体或片段，以及其抗原肽。
制备抗体的一个示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如，噬菌体 或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等人，美国专利号 5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809。
除了使用展示文库，特定抗原还可以用于免疫非人动物，例如，啮齿 动物，例如小鼠、仓鼠或者大鼠。在一个实施方案中，非人动物包括至少 部分人免疫球蛋白基因。例如，可能用人Ig基因座的大片段改造在小鼠抗 体产生中缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生和选择具有希望的 特异性的来自所述基因的抗原特异性单克隆抗体。见例如， XENOMOUSETM，Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21，US 2003-0070185，WO 96/34096(1996年10月31日公布)，和PCT申请号 PCT/US96/05928(1996年4月29日提交)。
在另一实施方案中，单克隆抗体从非人动物得到，然后进行改变，例 如，使用本领域已知的重组DNA技术可以产生人源化抗体、去免疫抗体、 嵌合抗体。已经描述了制备嵌合抗体的多种方法。见例如，Morrison等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452， 1985，Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人，美国专利号 4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公布EP171496；欧洲专利公布 0173494，英国专利GB2177096B。也可以产生人源化抗体，例如，使用表 达人重链和轻链基因但是不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因 的转基因小鼠。Winter描述了示例性CDR移植方法，其可以用于制备本 文所述的人源化抗体(美国专利号5,225,539)。具体人抗体的所有CDR可 以用非人CDR的至少一部分替换，或者仅仅一些CDR用非人CDR替换。 仅仅需要替换人源化抗体与预定抗原结合所需数目的CDR。
通过将不直接涉及抗原结合的Fv可变结构域的序列用来自人Fv可变 结构域的等同序列替换，可以产生人源化抗体。产生人源化抗体或其片段 的示例性方法由Morrison(1985)Science 229：1202-1207；by Oi等人 (1986)BioTechniques 4：214；和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762； US 5,859,205；和US 6,407,213提供。那些方法包括分离、操作和表达核酸 序列，所述核酸序列编码来自至少一个重或轻链的所有或部分免疫球蛋白 Fv可变结构域。此类核酸可以从产生抗预定靶标的抗体的杂交瘤(如上述) 以及从其他来源得到。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆 进合适的表达载体中。
在一些实施方案中，通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和 /或回复突变优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域 已知的几种技术的任一种制备(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，4：7279， 1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，并且可以根据PCT公 布WO92/06193或EP 0239400的教导制备。
通过WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法特异性缺失人T细 胞表位或“去免疫化”也可以修饰抗体。简言之，可以对抗体的重链和轻链 可变结构域分析结合MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如 WO 98/52976和WO 00/34317中定义)。为了检测潜在的T细胞表位， 可以应用称作“肽穿线”(peptide threading)的计算机建模方法，此外， 可以检索人MHC II类结合肽数据库中存在于VH和VL序列中的基序，如 WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序结合到18种主要MHC II 类DR同种异型的任一个，从而构成了潜在的T细胞表位。通过替代可变 结构域中少数氨基酸残基或者优选地，通过单个氨基酸替代可以消除所检 测到的潜在T细胞表位。通常，进行保守替代。通常，但并不是排他性地， 可以使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如公开于 Tomlinson，等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人 (1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；Chothia，D.等人(1992)J. Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。 V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson， I.A.等人编著，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)。 这些序列可以用作例如构架区和CDR的人序列来源。也可以使用共有的 人构架区，如U.S.6,300,064中所述。
在一些实施方案中，抗体可以含有改变的免疫球蛋白恒定区或Fc区。 例如，根据本文的教导产生的抗体可以更强烈或以更高特异性结合效应分 子，如补体和/或Fc受体，其可以控制抗体的一些免疫功能，如效应细胞 活性、裂解、补体介导的活性、抗体清除，和抗体半寿期。结合抗体(如 IgG抗体)的Fc区的典型的Fc受体包括，但不限于，FcγRI、FcγRII和 FcγRIII和FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接 的形式。Fc受体在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92，1991； Capel等人，Immunomethods 4：25-34，1994；和de Haas等人，J.Lab.Clin. Med.126：330-41，1995)中综述。
通过本发明方法可以分离的抗体的非限制性实例包括但不限于，抗 Aβ、IL-13、IL-22、GDF8和5T4的抗体。这些抗体的每一种在下文和所 附实施例中更详细描述。
抗-GDF8抗体
可以用于本发明方法的示例性抗体是抗GDF8抗体。术语“GDF-8”指 生长和分化因子8，并且合适时，指结构上或功能上与GDF-8相似的因子， 例如，BMP-11和属于TGF-β超家族的其他因子。该术语指GDF-8的全 长未加工的前体形式，以及翻译后切割得到的成熟的和前肽形式。该术语 也指GDF-8的任何片段和变体，所述片段和变体保留至少一些与成熟 GDF-8相关的生物活性，包括已经被改变的序列。公开了人GDF-8以及 许多其他脊椎动物物种(包括鼠、狒狒、牛、鸡)的GDF-8的氨基酸序列， 例如，U.S.04/0142382，US 02/0157125，和McPherron等人(1997)Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94：12457-12461)。抗GDF-8的中和性抗体的实例， 如Myo-029，公开于例如U.S.2004/0142382，并且在本文所附实施例全文中 引用。示例性疾病和病症包括肌肉和神经肌肉病症，如肌营养不良症(包括 进行性假肥大性肌营养不良)；肌萎缩侧索硬化；肌肉萎缩；器官萎缩；虚 弱；tunnel综合征；充血性阻塞性肺病；少肌症、恶病质，和其他肌肉消 耗综合征；脂肪组织病症(例如，肥胖症)；2型糖尿病；葡萄糖耐量降 低；代谢综合征(例如，X综合征)；创伤如灼伤或氮失调诱导的胰岛素 抗性；和骨退行性疾病(例如，骨关节炎和骨质疏松症)。
抗-Aβ抗体
按照本发明的教导可以实施抗Aβ抗体制剂的乳光的降低。术语“AB 抗体”、“Aβ抗体”、“抗Aβ抗体”，和“抗Aβ”在本文中可互换使用，指结 合APP、Aβ蛋白或者两者的一个或多个表位或抗原决定簇的抗体。示例 性表位或抗原决定簇可以发现于人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)内，但是 优选发现于APP的Aβ肽内。存在APP的多种同种型，例如，APP695、 APP751和APP770。根据APP770同种型的序列对APP内的氨基酸分配编号 (见例如GenBank检索号P05067)。Aβ(本文中也称作β淀粉状蛋白肽和 A beta)肽是APP的39-43个氨基酸的～4-kDa内部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、 Aβ42和Aβ43)。例如，Aβ40由APP的残基672-711组成，Aβ42由APP 的残基672-713组成。由于不同的分泌酶在体内或原位对APP的蛋白酶解 加工，Aβ被以40个氨基酸长的“短形式”和42-43个氨基酸长的“长形式” 发现。表位或抗原决定簇可以位于Aβ肽的N-末端并且包括Aβ的氨基酸 1-10内的残基，优选Aβ42的残基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-7、3-6或 3-7，或者位于Aβ的残基2-4、5、6、7、或8内，Aβ的残基3-5、6、7、 8或9或Aβ42的残基4-7、8、9或10内。“中心”表位或抗原决定簇位于 Aβ肽的中心或者中央部分并且包括Aβ的氨基酸16-24、16-23、16-22、 16-21、19-21、19-22、19-23或19-24内的残基。“C-末端”表位或者抗原决 定簇位于Aβ肽的C-末端并且包括Aβ的氨基酸33-40、33-41或33-42内 的残基。
在多种实施方案中，Aβ抗体是末端特异性的。如本文所用，术语“末 端特异性的”指特异结合Aβ肽的N-末端或C-末端残基但是当存在于包含 所述残基的较长的Aβ种类中或存在于APP中时不识别所述相同残基的抗 体。
在多种实施方案中，Aβ抗体是“C-末端特异性的”。如本文所用，术 语“C-末端特异性的”指抗体特异识别Aβ肽的自由C-末端。C末端特异性 Aβ抗体的实例包括这些：其识别在残基40处结束的Aβ肽，但是不识别 在残基41、42和/或43处结束的Aβ肽；识别在残基42处结束的Aβ肽， 但是不识别在残基40、41和/或43处结束的Aβ肽；等等。
在一个实施方案中，抗体可以是3D6抗体或其变体，或10D5抗体或 其变体，都描述于美国专利公开号2003/0165496A1，美国专利公开号 2004/0087777A1，国际专利公开号WO02/46237A3。3D6和10D5的描述也 可见例如国际专利公开号WO02/088306A2和国际专利公开号 WO02/088307A2。3D6是特异结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表 位，特别是残基1-5的单克隆抗体(mAb)。相比，10D5是特异结合位于 人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-6的mAb。在另一实 施方案中，抗体可以是12B4抗体或其变体，如美国专利公开号 20040082762A1和国际专利公开号WO03/077858A2中公开。12B4是特异 结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-7的mAb。 在再一个实施方案中，抗体可以是12A11抗体或其变体，如美国专利申请 号10/858,855和国际专利申请号PCT/US04/17514中所述。12A11是特异 结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-7的mAb。 在再一个实施方案中，抗体可以是266抗体，如美国专利申请号10/789,273 和国际专利申请号WO01/62801A2中所述。设计成特异结合位于人β淀粉 状蛋白肽中的C-末端表位以用于本发明的抗体包括，但不限于，如美国专 利号5,786,160中所述的369.2B。
在示例性实施方案中，抗体是选择性结合Aβ肽的人源化抗Aβ肽3D6 抗体。更特别地，将人源化抗Aβ肽3D6抗体设计成特异结合位于发现于 脑中斑块沉积物中(例如，在患有阿尔茨海默氏病的患者中)的人β淀粉 状蛋白1-40或1-42肽中的NH2-末端表位。
抗Aβ抗体可以用于治疗促淀粉状变疾病，尤其阿尔茨海默氏病。术 语“促淀粉状变疾病”包括与不溶性淀粉状蛋白纤丝的形成或沉积有关(或 引起)的任何疾病。示例性促淀粉状变疾病包括，但不限于，系统性淀粉 样变性、阿尔茨海默氏病、成年发作的糖尿病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、 额颞叶痴呆、和朊病毒相关的传播性海绵状脑病(人类中的库鲁病和克- 雅氏病和分别在绵羊和牛中的羊瘙痒症和BSE)。通过沉积的纤丝的多肽 组分的性质定义或表征不同的促淀粉状变疾病。例如，在患有阿尔茨海默 氏病的受试者或患者中，β淀粉状蛋白(例如，野生型、变体或截短的β 淀粉状蛋白)是淀粉状蛋白沉积物的特征性多肽组分。因此，阿尔茨海默 氏病是例如受试者或患者脑中“通过Aβ沉积物表征的疾病”或“与Aβ的沉 积物相关的疾病”的实例。术语“β淀粉状蛋白蛋白质”、“β淀粉状蛋白肽”、 “β淀粉状蛋白”、“Aβ”和“Aβ肽”在本文中可互换使用。
抗-5T4抗体
以前已经表征了5T4抗原(见例如，WO89/07947)。人5T4的完整核 酸序列是已知的(Myers等人(1994)J Biol Chem 169：9319-24和GenBank 检索号Z29083)。来自其他物种的5T4抗原的序列也是已知的，例如，鼠 5T4(WO00/29428)，犬5T4(WO01/36486)或猫5T4(US 05/0100958)。
人5T4是在癌中广泛表达的约72kDa的糖蛋白，但是在正常成年组 织中具有高度受限的表达模式。它似乎与结直肠癌和胃癌中的转移强烈相 关。5T4抗原的表达在乳腺癌和卵巢癌中以高频率发现(Starzynska等人 (1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10：479-84；Starzynska等人(1994) Br.J.Cancer 69：899-902；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer 66：867-9)。 已经提出5T4为标记物，对于肿瘤发展和转移潜力具有可能的机理涉及 (Carsberg等人(1996)Int J Cancer 68：84-92)。也提出将5T4用作免疫治 疗剂(见WO 00/29428)。5T4的抗原肽公开于例如US 05/0100958，将其 内容引入本文作为参考。
一些待决的申请一般涉及编码抗5T4单克隆抗体的核酸、其载体和宿 主细胞，例如美国申请公开号2003/0018004和2005/0032216。已经提交了 一般涉及人源化的抗5T4 H8单克隆抗体和其加利车霉素缀合物，以及使 用这些加利车霉素缀合物治疗的方法的临时专利申请(美国申请公开号 2006/0088522)。将所有这些申请的内容完整引入本文作为参考。
抗-IL13抗体
白介素-13(IL-13)是以前表征的细胞因子，由T淋巴细胞和肥大细胞 分泌(McKenzie等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3735-39；Bost等 人(1996)Immunology 87：663-41)。术语“IL-13”指白介素-13，包括IL-13 的全长未加工的前体形式，以及翻译后切割得到的成熟形式。该术语也指 IL-13的任何片段和变体，其保持至少一些与成熟IL-13相关的生物活性， 包括已经被改变的序列。术语“IL-13”包括人IL-13以及其他脊椎动物种 类。一些待决的申请公开了抗人和猴IL-13的抗体、IL-13肽、产生其的 载体和宿主细胞，例如，美国申请公开号2006/0063228A和2006/0073148。 将这些公开的内容完整引入本文作为参考。
IL-13与IL-4共有一些生物活性。例如，IL-4或IL-13可以在B细胞 中引起IgG同种型转换(Tomkinson等人(2001)J.Immunol. 166：5792-5800)。此外，已经报导了哮喘患者中细胞表面CD23和血清CD23 (sCD23)水平升高(Sanchez-Guererro等人(1994)Allergy 49：587-92； DiLorenzo等人(1999)Allergy Asthma Proc.20：119-25)。此外，IL-4或 IL-13可以上调B细胞和单核细胞上MHC II类和低亲和性IgE受体 (CD23)的表达，其导致增强的抗原呈递和受调节的巨噬细胞功能 (Tomkinson等人，同上)。这些观察提示IL-13在呼吸道嗜酸性细胞增多症 和呼吸道高反应性(AHR)的发展中是重要因素(Tomkinson等人，同上； Wills-Karp等人(1998)Science 282：2258-61)。因此，IL-13的抑制可用于 减轻许多炎性和/或变应性状况的病理，包括但不限于，呼吸病症，例如， 哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；涉及呼吸道炎症的其他状况、嗜酸性细 胞增多症、纤维质生成和过量黏液产生，例如，囊性纤维化和肺纤维化； 特异性病症，例如，特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎；皮肤的炎 性和/或自身免疫状况(例如，特异性皮炎)、胃肠器官的炎性和/或自身 免疫状况(例如，炎性肠疾病(IBD)，如溃疡性结肠炎和/或克隆病)、肝脏 的炎性和/或自身免疫状况(例如，肝硬化、肝细胞癌)；硬皮病；肿瘤或 癌症(例如，软组织或实体瘤)，如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤，例 如，霍奇金淋巴瘤；病毒感染(例如，来自HTLV-1)；其他器官的纤维化， 例如，肝脏纤维化(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒引起的纤维化)。
抗-IL22抗体
白介素-22(IL-22)是以前表征的II类细胞因子，其显示出与IL-10的 序列同源性。它的表达在T细胞中受到IL-9或ConA的上调(Dumoutier L. 等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(18)：10144-9)。研究已经表明应答 LPS施用，在体内诱导IL-22mRNA的表达，并且IL-22调节表明急性期 应答的参数(Dumoutier L.等人(2000)同上；Pittman D.等人(2001)Genes and Immunity 2：172)，并且通过使用中和性抗IL-22抗体降低IL-22活性 减轻了小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的炎性症状。从而，IL-22 拮抗剂，例如，中和性抗IL-22抗体和其片段可以用于在体内诱导免疫抑 制，例如，用于治疗自身免疫病症(例如，关节炎病症，如类风湿性关节 炎)；呼吸病症(例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD))；炎性状况，如 皮肤的(例如，银屑病)、心血管系统的(例如，动脉粥样硬化)、神经 系统的(例如，阿尔茨海默氏病)、肾的(例如，肾炎)、肝脏的(例如， 肝炎)和胰腺的炎性状况(例如，胰腺炎)。
术语“IL-22”指白介素-22，包括IL-22的全长未加工的前体形式，以 及翻译后切割得到的成熟形式。该术语也指IL-22的任何片段和变体，所 述片段和变体保留至少一些与成熟IL-22相关的生物活性，包括已经被改 变的序列。术语“IL-22”包括人IL-22以及其他脊椎动物种类。人和啮齿动 物IL-22的氨基酸和核苷酸序列，以及抗IL-22的抗体公开于例如美国申 请公开号2005-0042220和2005-0158760，和美国专利号6,939,545。将所有 这些出版物的内容完整引入本文作为参考。
小调节性免疫药物(SMIPTM)
本发明也可以应用于小调节性免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIPTM))。它通常指结合结构域-融合蛋白，其 包括结合结构域多肽，该多肽融合或连接到免疫球蛋白铰链或者铰链作用 区多肽，该铰链或者铰链作用区多肽又融合或连接到包含来自免疫球蛋白 重链的一个或多个天然或改造的恒定区的不同于CH1的区域，如IgG和 IgA的CH2和CH3区域，或者IgE的CH3和CH4区域(更完整的描述 见例如，Ledbetter，J.等人的U.S.05/0136049)。结合结构域-免疫球蛋白 融合蛋白可以还包括这样的区域，该区域包括天然或改造的免疫球蛋白重 链CH2恒定区多肽(或者对于完全或部分来自IgE的构建体的情况， CH3)，该CH2恒定区多肽融合或连接到铰链区多肽或者天然或改造的免 疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或者对于完全或部分来自IgE的构建体 的情况，CH4)，该CH3恒定区多肽融合或连接到CH2恒定区多肽(或 者对于完全或部分来自IgE的构建体的情况，CH3)。通常，此类结合结 构域-免疫球蛋白融合蛋白具有选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补 体固定和/或与靶标，如靶抗原的结合的至少一种免疫学活性。
可溶性受体和受体融合物
本发明也可以应用于可溶性受体或其片段。可溶性受体的实例包括受 体的细胞外结构域，如可溶性肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；EP 417,563，1991年3月20日公布；TNFR-2，EP417,014，1991年3月20日 公布；在Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)：1-7，1995-96中综述，将它 们各自完整引入本文作为参考)。在其他实施方案中，可溶性受体包括如 US 2003-0108549中所述的白介素-21受体(IL-21R)的细胞外结构域(将其 内容也引入本文作为参考)。
融合蛋白可以包括寻靶部分，例如，可溶性受体片段或配体、免疫球 蛋白链、Fc片段、多种同种型的重链恒定区，所述同种型包括：IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。例如，融合蛋白可以包括 受体的细胞外结构域，并且例如，融合到人免疫球蛋白Fc链(例如，人 IgG，例如，人IgG1或人IgG4，或者其突变形式)。在一个实施方案中， 人Fc序列已经从野生型序列的一个或多个氨基酸突变，例如，在残基254 和257处突变，以减小Fc受体结合。融合蛋白可以额外包括接头序列， 其连接第一个部分和第二个部分，例如，免疫球蛋白片段。例如，融合蛋 白可以包括肽接头，例如，约4到20，更优选5到10个氨基酸长的肽接 头；肽接头为8个氨基酸长。例如，融合蛋白可以包括具有式 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽接头，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。 在其他实施方案中，额外的氨基酸序列可以加入融合蛋白的N-或C-末端 以方便表达、立体柔性、检测和/或分离或纯化。
在一些实施方案中，可溶性受体融合物包含可溶性TNFR-Ig(例如， TNF受体的可溶性片段，所述受体如，p55或p75人TNF受体或其衍生 物，例如，75kd TNFR-IgG(例如，融合到人IgG1的235个氨基酸的Fc 部分的75kD TNF受体)。
通过标准重组DNA技术可以产生本发明的嵌合或融合蛋白。例如， 根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起， 例如，通过使用平末端或者交错末端用于连接，限制酶消化以提供合适的 末端，如合适，填平粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，并 进行酶促连接。在另一实施方案中，通过包括自动化DNA合成仪的常规 技术可以合成融合基因。备选地，使用锚定引物可以进行基因片段的PCR 扩增，所述引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，其可以随后 退火并再次扩增以产生嵌合基因序列(见，例如，Ausubel等人(eds.) Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。此外， 通过商业途径可以得到编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区) 的许多表达载体。免疫球蛋白融合多肽是本领域公知的并且描述于例如， 美国专利号5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和 5,455,165。
生长因子和细胞因子
已经表明另一类多肽可有效作为药物和/或商业活性剂，其可以希望地 根据本发明的教导产生，所述活性剂包括生长因子和其他信号分子，如细 胞因子。
生长因子通常是糖蛋白，其由细胞分泌并结合到和活化其他细胞上的 受体，在受体细胞中启动代谢或发育改变。哺乳动物生长因子和其他信号 分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生 生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGFs)，如aFGF和bFGF；转化 生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3) -IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、 CI)-8、和CD-19；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生 蛋白(BMP)；干扰素，如α、β、和γ干扰素；集落刺激因子(CSFs)，例如， M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(TLs)、例如，IL-1到IL-13(例如， IL-11)；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素 原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子 VIIIC、因子IX、组织因子和冯维勒布兰德(von Willebrands)因子；抗凝 血因子，如C蛋白；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如 尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶、造血生 长因子；脑啡肽酶；RANTES(活化时受调节，正常T细胞表达的和分泌 的(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted))；人巨 噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；副中肾管抑制物质；松弛素A链；松弛素B 链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子，如骨衍生神经营 养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)， 或者神经生长因子，如NGF-β。本领域技术人员将理解根据本发明方法和 本发明的组合物可以表达的其他生长因子或信号分子。
已经表明生长因子或其他信号分子的糖基化模式的特定改变对它们 的治疗性质具有显著影响。作为一个实例，治疗患有慢性贫血的患者的一 个常用方法是为他们提供频繁注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)以便加 强他们的血红细胞产生。已经开发了rHuEPO的类似物达依泊汀 (darbepoetin)α()，其比正常rHuEPO具有更长的持续时间。 达依泊汀α和rHuEPO之间的主要差异是存在两条额外的含有唾液酸的 N-连接的寡糖链。使用体外糖工程化已经完成了达依泊汀α的产生(见 Elliott等人，Nature Biotechnology 21(4)：414-21，2003，将其完整引入本文 作为参考)。Elliott等人使用体外诱变向rHuEPO多肽主链掺入额外的糖 基化位点，导致达依泊汀α类似物的表达。额外的寡糖链位于EPO受体 结合位点远端并且显然不干扰受体结合。然而，达依泊汀α的半寿期比 rHuEPO高3倍，导致更有效的治疗剂。
凝血因子
已经表明凝血因子有效作为药物和/或商业活性剂。B型血友病是这样 的病症，其中患者的血液不能凝固。从而，导致出血的任何小的伤口都是 潜在威胁生命的事件。例如，凝血因子IX(因子IX或“FIX”)是单链糖蛋 白，其缺乏导致B型血友病。FIX作为单链酶原合成，其通过释放活化肽 而被活化成两条链的丝氨酸蛋白酶(因子IXa)。因子IXa的催化结构域位 于重链中(见Chang等人，J.Clin.Invest.，100：4，1997，完整引入本文作为参 考)。FIX具有多个糖基化位点，包括N-连接的和O-连接的糖类。曾经 认为在丝氨酸61位的一个具体的O-连接的结构 (Sia-α2，3-Gal-β1，4-GlcNAc-β1，3-Fuc-α1-O-Ser)是FIX特有的但是从那以 后发现于一些其他分子上，包括哺乳动物和果蝇中的Notch蛋白(Maloney et al，Journal of Biol.Chem.，275(13)，2000)。细胞培养中中国仓鼠卵巢 (“CHO”)细胞产生的FIX在丝氨酸61寡糖链中显示出一定的变异性。这 些不同的糖形和其他潜在的糖形当施用于人或动物时可以具有不同的诱 导凝血的能力和/或在血液中具有不同的稳定性，导致效率较低的凝血。
A型血友病在临床上与B型血友病不能区分，由人类凝血因子VIII 中的缺陷引起，人类凝血因子VIII是另一种糖蛋白，其作为单链合成然后 被加工成两条链的活性形式。本发明也可以用于控制或改变凝血因子VIII 的糖基化模式以便调节它的凝血活性。根据本发明可以产生的其他凝血因 子包括组织因子和冯维勒布兰德(von Willebrands)因子。
酶
已经表明有效作为药物和/或商业活性剂并且可以根据本发明的教导 希望地产生的另一类多肽包括酶。酶可以是糖蛋白，其糖基化模式影响酶 活性。从而，本发明也可以用于在细胞培养物中产生酶，其中所产生的酶 具有更广泛或更希望的糖基化模式。
仅仅作为非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(GCR)的缺乏导致称作戈谢病 的状况，其由某些细胞的溶酶体中葡糖脑苷脂酶的积累引起。患有戈谢病 的受试者显示出一系列症状，包括脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减 少症和贫血。Friedman和Hayes表明在一级氨基酸序列中含有单个替代 的重组CR(rGCR)与天然存在的GCR相比显示出改变的糖基化模式，特 别是岩藻糖和N-乙酰葡糖胺残基的增加(见美国专利号5,549,892)。
Friedman和Hayes还表明该rGCR与天然存在的rGCR相比显示出 改善的药物代谢动力学性质。例如，比天然存在的GCR高约两倍的rGCR 靶向肝脏肝巨噬细胞。尽管这两种蛋白质的一级氨基酸序列仅在一个残基 处不同，但是Friedman和Hayes假定rGCR的改变的糖基化模式也影响 向肝巨噬细胞的靶向。
本领域技术人员将知道由于糖基化模式的改变而显示出改变的酶学、 药物代谢动力学和/或药物动力学性质的酶的其他已知的实例。
蛋白质的产生
产生本发明的蛋白质的重组方法是本领域已知的。通常将编码蛋白质 的核苷酸序列插入表达载体中用于导入宿主细胞，宿主细胞可以用于产生 希望量的经改变的抗体，其又提供了多肽。术语“载体”包括核酸构建体， 其通常包括核酸，例如，基因，并且还包括核酸复制、转录、稳定性和/ 或蛋白质表达或从宿主细胞分泌必需的最少元件。此类构建体可以作为染 色体外元件存在或者可以整合到宿主细胞的基因组中。
术语“表达载体”包括特定类型的载体，其中优化核酸构建体用于高水 平表达所希望的蛋白质产物。表达载体通常具有转录调节物质，如启动子 和增强子元件，其经优化用于在特定细胞类型中高水平转录和/或经优化使 得基于特定诱导剂的使用，表达是组成型的。表达载体还具有提供蛋白质 的适当和/或增强的翻译的序列。如本领域技术人员已知，此类载体可以容 易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。术语“表达盒”包括核酸构建 体，其含有基因并且除了该基因外还具有允许该基因在宿主细胞中正确和 /或增强表达的元件。为了产生抗体，可以将编码轻链和重链的核酸插入表 达载体中。此类序列可以存在于相同的核酸分子(例如，相同的表达载体) 中或者备选地，可以从单独的核酸分子(例如，单独的表达载体)表达。
术语“有效连接”包括并置，其中组分处于允许它们以预期的方式发挥 功能的关系中(例如，功能连接)。作为实例，有效连接到目的多核苷酸 的启动子/增强子连接到所述多核苷酸使得在活化启动子/增强子指导的表 达的条件下实现目的多核苷酸的表达。
表达载体通常可以在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA 的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、 潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或者新霉素抗性)以允许检测用 希望的DNA序列转化的那些细胞(见例如，Itakura等人，美国专利号 4,704,362)。除了免疫球蛋白DNA盒序列、插入序列和调节序列外，本发 明的重组表达载体还可以携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制 的序列(例如，复制原点)和选择标记基因。选择标记基因方便选择已经 导入载体的宿主细胞(见例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665 和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因为已经导入所述载体的宿主细 胞赋予对药物，如对G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记 基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用甲氨蝶 呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
一旦载体掺入了合适的宿主细胞中，就在适于核酸序列的高水平表达 的条件下保持宿主细胞，并收集和纯化希望的抗体。根据本发明可以利用 易于细胞培养和表达蛋白质或多肽的任何宿主细胞。在一些实施方案中， 宿主细胞是哺乳动物的。可用于本发明的哺乳动物细胞的非限制性实例包 括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC No：85110503)；人成视网膜细 胞(PER.C6，CruCell，Leiden，荷兰)；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7， ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞， Graham等人，J.Gen Virol.，36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，77：4216，1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol. Reprod.，23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾 细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)； 犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A， ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2， HB 8065)；小鼠卵巢肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather 等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68，1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和 人肝细胞瘤系(Hep G2)。
此外，表达多肽或蛋白质的任何数目的商业和非商业途径可获得的杂 交瘤细胞系可以用于本发明。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可以具 有不同的营养要求和/或可以需要不同的培养条件用于最优的生长和多肽 或蛋白质表达，并且如果需要将能够修改条件。
这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制原点、启动子和 增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))，和必要的加工信息位点， 如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。 优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病 毒、巨细胞病毒等等的启动子(见，例如，Co等人，(1992)J.Immunol. 148：1149)。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动 物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如来自如下的启动子和/或增强 子：FF-1a启动子和BGH多聚A、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/ 增强子)、猿猴病毒(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病 毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤。关于病毒调节元件和其序列的进一 步描述，见例如，Stinski的美国专利号5,168,062，Bell等人的美国专利号 4,510,245，Schaffner等人的美国专利号4,968,615。在示例性实施方案中， 抗体重链和轻链基因有效连接到增强子/启动子调节元件(例如，来自 SV40、CMV、腺病毒等等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或 者SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动基因的高水平转录。在 本发明的示例性实施方案中，构建体包括内部核糖体进入位点(IRES)以 在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明多肽。相容性IRES序列公开 于也引入本文的美国专利号6,193,980中。
备选地，编码序列可以掺入转基因中用于导入转基因动物的基因组中 并随后在转基因动物的奶中表达(见，例如，Deboer等人，US 5,741,957， Rosen，US 5,304,489，和Meade等人，US 5,849,992)。合适的转基因包括与 来自哺乳动物乳腺特异性基因如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子有 效连接的轻和/或重链的编码序列。
原核宿主细胞也适于产生本发明的抗体。大肠杆菌是尤其可用于克隆 本发明的多核苷酸(例如，DNA序列)的一种原核宿主。适于使用的其他 微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肠杆菌 科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属 (Salmonella)和沙雷氏菌属(Serratia)，和多种假单胞菌属(Pseudomonas) 物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其将通常含有与宿主细 胞相容的表达控制序列(例如，复制原点)。此外，将存在任一数目的多 种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰 胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子将通常任选与操纵 基因序列一起控制表达，并且具有核糖体结合序列等等，用于启动和完成 转录和翻译。
最通常使用载体在大肠杆菌中进行蛋白质在原核生物中的表达，所述 载体含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子。融合载 体向其中编码的抗体加入许多氨基酸，通常加入重组抗体的恒定区，而不 影响抗体的特异性或抗原识别。融合肽的氨基酸的加入可以为抗体增加额 外的功能，例如，作为标记(例如，表位标记，如myc或flag)。
其他微生物，如酵母，也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)是优 选的酵母宿主，如希望，使用具有表达控制序列(例如，启动子)、复制 原点、终止序列等等的合适载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶 和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素 (isocytochrome)C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
通过公知的方法可以将含有目的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编 码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所述方法取决于细胞 宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿 孔、脂转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主(一般见， Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)，为了所有目的将其完整引入本文作为参考)。 用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲 基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、电穿孔、和显微注射(一般见， Sambrook等人，同上)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到 受精的卵母细胞中，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞 的细胞核转移到去核的卵母细胞中。
当在单独的表达载体上克隆重链和轻链时，共转染载体以得到完整免 疫球蛋白的表达和装配。一旦表达，可以如本文所述的分离本发明的完整 抗体、它们的二聚体、单独轻链和重链或其他免疫球蛋白形式和/或根据本 文已知的方法进一步纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、 HPLC纯化、凝胶电泳等等(一般见Scopes，Protein Purification (Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于制药用途，至少约90到95％同质性 的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，98至99％或更高的同质性是最优选 的。
蛋白质纯化
希望分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质。在一些实施方案中，所 表达的蛋白质分泌到培养基中从而如通过离心或过滤除去细胞和其他固 体，作为纯化方法中的第一步。
在一些实施方案中，表达的蛋白质结合到宿主细胞表面。在此类实施 方案中，除去培养基并裂解表达多肽或蛋白质的宿主细胞作为纯化方法中 的第一步。通过本领域技术人员已知的任一种方法可以实现哺乳动物宿主 细胞的裂解，所述方法包括通过玻璃珠物理破裂和暴露于高pH条件。
通过标准方法可以分离和纯化蛋白质，所述方法包括，但不限于，层 析(例如，离子交换、亲和、大小排阻、和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、 离心，或者差别溶解度、乙醇沉淀或者通过任何其他可利用的用于纯化蛋 白质的技术(见例如，Scopes，Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition，Springer-Verlag，New York，1987；Higgins，S.J.and Hames， B.D.(eds.)，Protein Expression：A Practical Approach，Oxford Univ Press， 1999；and Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(eds.)，Guide to Protein Purification：Mcthods in Enzymology(Methods in Enzymology Series，Vol 182)，Academic Press，1997，都完整引入本文作为参考)。具体 对于免疫亲和层析，通过将蛋白质结合到亲和柱可以分离该蛋白质，所述 亲和柱包含针对该蛋白质产生并且附着到固定支持体的抗体。可以通过标 准重组技术将亲和标记如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或者谷胱甘肽S-转 移酶连接到蛋白质以允许通过穿过合适的亲和柱容易地纯化。可以在任一 或所有阶段加入蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑酶醛肽、胃蛋 白酶抑制剂或抑酶肽以便在纯化方法中减少或消除多肽或蛋白质的降解。 当细胞必须被裂解以便分离和纯化所表达的多肽或蛋白质时，蛋白酶抑制 剂是尤其有利的。
根据本发明的一些方法表达的蛋白质与它们生长在非本发明细胞培 养条件下相比将具有更广泛和/或修饰的糖基化模式。从而，可以在纯化步 骤利用的本发明的一个实际的益处是根据本发明的一些发明性方法和/或 组合物生长的糖蛋白上存在的额外的和/或修饰的糖残基可以赋予其不同 的生物活性性质，其与根据非发明性方法和/或组合物生长的糖蛋白相比， 可以由专业人员用于更容易地纯化糖蛋白，或者纯化至更高纯度。
本领域技术人员将理解确切的纯化技术可以取决于待纯化的多肽或 蛋白质的特征、待表达多肽或蛋白质的细胞的特征和/或用于生长细胞的培 养基的组成而变。
药物制剂
可以在可药用载体或赋形剂存在下将本发明的蛋白质制剂配制为药 物组合物。如本文所述的含有蛋白质制剂的组合物可以施用于受试者或者 可以首先配制用于通过任何可利用的途径递送，所述途径包括但不限于肠 胃外、静脉内、肌内、皮内、皮下、经口、口含、舌下、经鼻、支气管、 眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。本发明的药物组合物通常包 括从哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽或蛋白、递送试剂(例如，如上述的 阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、表面活性剂等等)与可药用载体的组合。 如本文所用，术语“可药用载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、 包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。补充性活性化合物 也可以掺入本发明的组合物中。例如，根据本发明产生的蛋白质或多肽可 以缀合到用于全身药物疗法的药物，如毒素、低分子量细胞毒性药物、生 物学应答改变剂，和放射性核素(见例如，Kunz等人，Calicheamicin derivative-carrier conjugates，US04/0082764 A1)。可用于制备根据本发明 的药物组合物的额外成分包括，例如，调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、 填充剂、助流剂、压缩助剂、黏合剂、片剂崩解剂、封装材料、乳化剂、 缓冲剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透 调节剂(osmo-regulators)，或其组合。
备选或额外地，根据本发明产生的蛋白质或多肽可以与一种或多种额 外的药学活性剂(同时或者顺序)组合施用。这些药学活性剂的示例性列表 可以见医师案头参考(Physicians’Desk Reference)第55版(Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，NJ，2001出版，引入本文作为参考)。对于 许多这些列出的活性剂，药物有效剂量和方案是本领域已知的；许多在医 师案头参考中给出。
固体药物组合物可以含有一种或多种固体载体，和任选地一种或多种 添加剂，如调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助 剂、黏合剂或片剂崩解剂或封装材料。合适的固体载体包括例如，磷酸钙、 硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡或者离子交换树脂，或者其组 合。在粉状药物组合物中，载体可以是细分的固体，其与细分的活性成分 混合。在片剂中，活性成分通常与具有必要的压缩性质以合适的比例混合， 并且任选与其他添加剂混合，并压制成所希望的形状和大小。
液体药物组合物可以含有根据本发明表达的多肽或蛋白质和一种或 多种液态载体以形成溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂、或加压的组 合物。可药用液态载体包括例如，水、有机溶剂、药学活性油或脂肪，或 者其组合。液态载体可以含有其他合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、 缓冲剂、防腐剂、增甜剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节 剂、稳定剂或渗透调节剂或者其组合。如果液体制剂预期用于儿科用途， 那么通常希望避免包括酒精或限制其用量。
适于经口或肠胃外施用的液态载体的实例包括水(任选含有添加剂， 如纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠)，醇或它们的衍生物(包括一元醇 或多元醇，如二醇)或油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施 用，载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。用于加压组合 物的液态载体可以是卤代烃或其他可药用喷射剂。
为无菌溶液剂或混悬剂的液体药物组合物可以肠胃外施用，例如，通 过肌内、腹膜内、硬膜外、鞘内、静脉内或皮下注射施用。用于经口或经 粘膜施用的药物组合物可以为液体或固体组合物的形式。
在一些实施方案中，将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。 用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可以包括下面的组分：无 菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇 或者其他合成的溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化 剂，如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如 乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。 可以用酸或碱，如盐酸或者氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂封装在 安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制造的多剂量瓶中。
适于注射使用的药物组合物通常包括无菌水溶液(其中水可溶的)或者 分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施 用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF， Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物将是无菌的 并且应该是流动的，达到容易注射的程度。有利地，某些药物制剂在生产 和保存条件下是稳定的并且必须保存以抗微生物如细菌和真菌的污染作 用。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，含有例如，水、乙醇、多元 醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，和其合适的混合物。例如， 通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通 过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂可 以实现防止微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸 酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在一些情况下，将有用的 是在组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。 通过在组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注 射组合物的吸收。
通过在合适的溶剂中以所需量掺入纯化的多肽或蛋白质与(如果需要) 上面列举的成分之一或者组合，接着通过过滤除菌，可以制备无菌注射溶 液。通常，通过在含有基本分散介质的无菌载体中掺入从哺乳动物细胞系 表达的纯化的多肽或蛋白质和来自上面列举的那些的所需其他成分可以 制备分散体。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，有利的制备 方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加上来自其以前无菌 过滤溶液的任何额外的所希望成分。
经口组合物一般包括惰性稀释剂或者可食用的载体。对于经口治疗施 用的目的，所纯化的多肽或蛋白质可以掺入赋形剂并以片剂、含片、或胶 囊剂，如明胶胶囊剂的形式使用。使用液体载体也可以制备用作例如漱口 水的经口组合物。可以包括药学上相容的黏合剂和/或佐剂物质作为组合物 的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片等等可以含有任一种下面的成分，或 者类似性质的化合物：黏合剂，如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂， 如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、Primogel或者玉米淀粉；润滑剂，如硬 脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；增甜剂，如蔗糖或糖精； 或者调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或者橙子调味剂。如果希望，此类制 剂可以是混合的可咀嚼的或液体制剂或者食物材料或液体，例如以方便施 用于儿童、施用于吞咽片剂的能力减弱的个体，或者施用于动物。用于经 口递送的制剂可以有利地掺入试剂以提高在胃肠道内的稳定性和/或增强 吸收。
对于通过吸入施用，包含从哺乳动物细胞系表达的蛋白质制剂和递送 试剂的发明性组合物也可以鼻内或通过吸入施用并且方便地以干粉吸入 器或者来自加压的容器、泵、泵式喷雾器(atomiser)、喷雾器或雾化器 的气雾剂喷雾的形式递送，使用或不使用合适的喷射剂，例如，二氯二氟 甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷，如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-五氟丙烷(HFA 227EATM)、二氧化碳或者其他合适 的气体。对于加压的气雾剂的情况，通过提供阀门以递送计量的，例如， 治疗有效量来确定剂量单位。本发明尤其设想使用鼻喷雾器、吸入器递送， 或直接递送到上呼吸道和/或下呼吸道。已经表明鼻内施用针对流感病毒产 生的DNA疫苗诱导CD8 T细胞应答，表明当通过该途径递送时，呼吸道 中的至少一些细胞可以摄入DNA，并且本发明的递送剂将增强细胞摄入。 根据一些实施方案，将包含从哺乳动物细胞系表达的纯化多肽和递送剂的 组合物配制为用于气雾剂施用的大孔颗粒。
经修饰的释放和脉冲式释放口服剂型可以含有作为释放速率修饰剂 的赋形剂，这些被包衣在装置体的上面和/或内部。释放速率修饰剂包括， 但不仅仅限于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤 维素、乙酸纤维素、聚氧乙烯、黄原胶、卡波姆、季胺基甲基丙烯酸酯共 聚物(ammonio methacrylate copolymer)、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡、石蜡、 纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸 共聚物和其混合物。经修饰的释放和脉冲式释放口服剂型可以含有一种释 放速率修饰赋形剂或其组合。释放速率修饰赋形剂可以存在于剂型内，即 基质内，和/或剂型上，即在表面或包衣上。
通过经粘膜或经皮方式可以进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用， 在制剂中使用适于待穿透的屏障的穿透剂。此类穿透剂是本领域公知的， 并且对于经粘膜施用，包括例如，去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通 过使用鼻喷雾器或栓剂也可以实现经粘膜施用。对于经粘膜施用，可以将 纯化的多肽或蛋白质和递送剂配制为合适的软膏剂，其含有悬浮或溶解在 例如具有如下一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体矿脂、 白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。备选地，可以 将它们配制为合适的洗剂或乳膏，悬浮或溶解在例如如下一种或多种的混 合物中：矿物油、失水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、失水山 梨醇聚氧乙烯(20)醚硬脂酸酯、鲸酯蜡、十六/十八醇、2-辛基十二烷 醇、苯甲醇和水。
备选地，化合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以以 凝胶剂、水凝胶、洗剂或其他甘油酯、溶液剂、霜剂、软膏剂或爽身粉的 形式局部应用。
在一些实施方案中，用载体制备组合物，所述载体将保护蛋白质免于 从身体快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。通常，可 以配制本发明的组合物用于立即、延迟、改变的、持续、脉冲或控释递送。 可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、 聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法将是本领域技 术人员显而易见的。合适的材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc通过商业途径获得。脂质体混悬剂(包括用抗病毒抗 原的单克隆抗体靶定受感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。这些 可以根据本领域技术人员已知的方法制备，如美国专利号4,522,811中所 述。
根据本发明产生的蛋白质也可以与环糊精组合使用。已知环糊精与某 些分子形成包含和非包含复合物。环糊精复合物的形成可以改变蛋白质或 多肽的溶解度、溶解速率、生物利用率和/或稳定性。环糊精复合物通常用 于多数剂型和施用途径。作为与蛋白质或多肽的直接复合作用的备选方 案，环糊精可以用作辅助添加剂，例如作为载体、溶剂或增溶剂。α、β和 γ环糊精是最常用的并且合适的实例描述于公开的国际专利申请 WO91/11172、WO94/02518和WO98/55148中。
在一些实施方案中，以单位剂型，如片剂或胶囊剂提供本发明的药物 组合物。为了容易施用和剂量的均一性，有利的是以单位剂型配制经口或 肠胃外组合物。在此类形式中，将组合物细分为含有合适量多肽或蛋白质 的单位剂量。单位剂型可以是包装的组合物，例如，包装的粉剂、小瓶、 安瓿、预填充的注射器或者含有液体的囊剂。单位剂型可以例如自身是胶 囊剂或片剂，或者它可以是合适数目的包装形式的任何此类组合物。如本 领域技术人员将认识到的，治疗有效单位剂量将取决于一些因素，包括例 如，施用方法、多肽或蛋白质的功效，和/或接受者的体重和药物组合物中 其他组分的特性。
蛋白质制剂，例如，含有其的药物组合物，可以以所需的不同间隔 和在不同时间期限内施用，如每周一次持续约1到10周、2到8周、约3 到7周、约4、5或6周等等。技术人员将理解某些因素可以影响有效治疗 受试者所需的剂量和时限，包括但不限于受试者的疾病或病症的严重性、 以前的治疗、一般健康状况和/或年龄，和存在的其他疾病。通常，用如本 文所述的多肽或蛋白质对受试者的治疗可以包括单一治疗，或者一系列治 疗。还理解合适的剂量可以取决于多肽或蛋白质的效力并且可以任选为具 体接受者定制，例如，通过施用增加的剂量直到实现预先选择的所希望的 应答。将理解任一具体动物受试者的特定剂量水平可以取决于多种因素， 包括使用的具体多肽或蛋白质的活性、受试者的年龄、体重、一般健康、 性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、任何药物组合，和待调节 的表达或活性的程度。
本发明包括使用本文所述的组合物治疗非人动物。因此，可以根据兽 医药理学和医学中已知的原理选择施用剂量和方法。教导可以见例如 Adams，R.(ed.)，Veterinary Pharmacology and Therapeutics，第八版， Iowa State University Press；ISBN：0813817439；2001。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或者分配器中。
下面的实施例是阐明性的并且不意在限制。
实施例
通过静态光散射、动态光散射和不对称流场流分级法评估在不同的盐 浓度，即不同的离子强度下的抗体M1-M3的溶液。
抗体溶液制备
通过在室温下透析到合适的含盐缓冲液过夜，进行两次缓冲液更换来 制备所有溶液。
仪器方法：
静态光散射
用静态光散射(SEC-MALS)测量抗体溶液的重量平均分子量。对于静 态光散射实验，将抗体溶液稀释到4mg/mL并将多个样品手工注射到仪器 中。使用来自Wyatt Technology的Mini Dawn仪器用静态光散射在多个 角度(45，90和135)下20℃下测量抗体溶液。90°的散射数据用于计算重量 平均分子量。完整数据集(多个角度)用于产生齐姆图，其用于计算分子 量和第二维里系数。
动态光散射
用动态光散射测量溶液中抗体的颗粒大小。使用Wyatt Technology的 DynaPro仪器在25℃ 90°角度下测量抗体溶液。
不对称流场流分级法
不对称流场流分级法(AF4)也用于测量溶液中抗体的颗粒大小。在 Wyatt Technology的Eclipse仪器上进行AF4测量。AF4分析参数如下： 温度20℃，运行缓冲液与透析缓冲液相同，10KDa截留膜(cutoff membrane)。
光密度
使用SpectraMax UV-Vis在400nm波长下测量蛋白质样品的浊度作为 表观光密度(特定波长下的吸光度)。
实施例1：IgG1抗体M1(Myo-029)的分析
取决于盐浓度，即离子强度，抗体M1溶液显示出大的乳光效应。图 1显示了在约20mg/mL蛋白质的浓度下，随着浓度从0mM NaCl升高到 150mM NaCl，乳光发生了视觉上可感知的改变。也通过动态光散射分析 了从0mM NaCl到100mM NaCl的抗体M1溶液，将样品稀释到约5 mg/mL。表1中显示了收集的数据。图1显示了暴露于渐增的NaCl浓度 下抗体M1(在本文中也称作“Myo-029”)溶液的图像(显示了视觉上可感知 的乳光增加)。
图2显示了0mM NaCl溶液和100mM NaCl抗体M1溶液的动态光 散射图，其数据包括在表1中。
表1：抗体M1的动态光散射数据
a25mM和50mM溶液显示出相分离，具有顶层和底层。两层都含有 抗体。
峰2和峰3种类的质量％的增加与图1中视觉上可感知的乳光的增加 相关。0mM NaCl溶液中峰3的存在表明对于抗体M1，即使在低盐浓度 下也存在少量乳光种类。
抗体M1(20mg/mL蛋白质)的100mM NaCl溶液的不对称流场流 分级法表明如图3中所示的大种类。对于抗体M1的类似的100mM NaCl 溶液，SEC-HPLC(稀释到3mg/mL的样品)不能区分任何大的种类，如 图4所示。
也检查了抗体M1的乳光效应的可逆性。将抗体M1溶液从0mM NaCl 透析到100mM NaCl，然后再透析到0mM NaCl。将抗体M1过夜透析到 100mM NaCl溶液(最初在无盐的溶液中)，然后100mM Na Cl下的少量 该物质过夜透析到无盐溶液中。图5显示了这三种抗体M1溶液的乳光的 视觉上可感知的改变。图6显示了乳光的100mM NaCl中间透析溶液以及 0mM NaCl最终透析溶液的动态光散射图。
这些数据表明抗体M1含有极大的种类，尽管在0mM NaCl下该种类 仅仅以相对少量存在，并且该大种类的浓度随着盐浓度升高而升高。数据 也表明使用不对称流场流分级法可以分辨该大种类，但是该大种类太大而 不能在SEC-HPLC柱上分辨，被柱床破坏或者在稀释时被破坏。幸运的 是，使用如所示的动态光散射可以分辨和分析该大种类。
实施例2：IgG1抗体M2的分析
抗体M2溶液在皮下抗体给药相关的浓度范围内不显示出大的乳光。 图7显示了在约20mg/mL蛋白质下，随着浓度从0mM NaCl升高到150 mM NaCl，乳光没有视觉上可察觉的改变。也通过动态光散射在约5mg/mL 蛋白质下分析了0mM NaCl和150mM NaCl的抗体M2溶液。表2中显 示了收集的动态光散射数据。图8显示了0mM NaCl溶液和150mM NaCl 抗体M2溶液的动态光散射图，其数据包括在表2中。
表2：抗体M2的动态光散射数据
a仅仅为了与表1比较而包括“峰2”。
这些数据表明在与皮下给药相关的浓度范围内，抗体M2没有可感知 量的乳光种类。实际上，峰3质量百分数仅仅在150mM NaCl水平升高到 0mM NaCl下抗体M的质量百分数水平。
实施例3：抗体M3的分析
在所评估的浓度范围内，抗体M3溶液不显示出大的乳光效应。通过 动态光散射在约5mg/mL下分析0mM NaCl和150mM NaCl的抗体M3 溶液。收集的动态光散射数据在表3显示。
图9显示了0mM NaCl溶液和150mM NaCl抗体M3溶液的动态光 散射图，其数据包括在表3中。
表3：抗体M3的动态光散射数据
a仅仅为了与表1比较而包括“峰2”。
这些数据表明在评估的浓度范围内，抗体M3没有可感知量的乳光种 类。实际上，峰3质量百分数仅仅在150mM NaCl水平升高到仅高于0mM NaCl下抗体M1的质量百分数水平。
实施例4：第二维里系数评估
用静态光散射测定实施例1-3中分析的抗体(抗体M1、抗体M2和 抗体M3)的分子量和第二维里系数(A2)。使用静态光散射和齐姆分析 可以进行第二维里系数测量。通过将多个稀释的蛋白质样品手工注入光散 射系统进行该实验。使用这些多个测量和精确的浓度，可以构建齐姆图。 这些数据在表4中显示。
表4：从静态光散射数据计算的分子量和第二维里系数数据
样品 MW(kDa) A2[mol-mL/g2] 抗体M1 (0mM NaCl) 131 -3.62x-4 抗体M1 (100mM NaCl) 130 -2.41x-3 抗体M2 (0mM NaCl) 149 3.29x-4 抗体M2 (150mM NaCl) 148 6.77x-4 抗体M3 (0mM NaCl) 181 2.05x-3 抗体M3 (150mM NaCl) 156 1.29x-3
第二维里系数数据表明与抗体M2和抗体M3相比，抗体M1的聚集/ 缔合倾向，即，负的第二维里系数，抗体M2和抗体M3具有正的维里系 数。图10显示了100mM NaCl下抗体M1的第二维里系数图，图11显示 了150mM NaCl下，从0.1到1.1mg/mL蛋白质的浓度范围内抗体M2的 第二维里系数图。这些数据表明第二维里系数可以用作具体抗体的乳光的 预测因子。
实施例5：盐特性和浓度对抗体M1中乳光的影响
为了评估盐特性对抗体M1的乳光的影响，进行了几个实验。
随时间的过去乳光随盐特性的改变：
制备了四种63mg/mL抗体M1溶液：没有盐的对照溶液，具有100mM NaHPO4的溶液，具有100mM NaCl的溶液，和具有100mM CaCl2的溶 液。然后让这些溶液在室温下静置1小时。1小时后这些溶液的图像在图 12中显示。如可以在图12中看出，1小时后乳光的顺序为NaCl>NaHPO4 >CaCl2。该图像也表明乳光不是仅仅与氯离子的存在有关，例如，NaHPO4 溶液发生了乳光。
然后将这些相同的溶液在2-8℃保持2周。两周后这些溶液的图像在 图13中显示。图13中所示的这些溶液的每一种显示了在2-8℃两周后的 胶凝作用并且发生了乳光。然而，胶凝作用和乳光的程度是依赖盐类型和 浓度的。乳光的顺序与1小时后的相同：NaCl>NaHPO4>CaCl2。也检 测了并且这次没有显示的是盐MgCl2，其满足如下顺序：
NaCll>NaHPO4>MgCl2>CaCl2。
乳光随盐特性和温度循环改变：
400nm下光密度的改变用于监测在温度循环期间盐特性对乳光的影 响。对于该实验，制备了四种40mg/mL抗体M1溶液：没有盐的对照溶 液，具有100mM NaHPO4的溶液，具有100mM NaCl的溶液，和具有 100mM CaCl2的溶液。这些溶液从2-8℃循环到室温，进行三个循环。每 个循环从2-8℃到室温并返回到2-8℃，需用24小时。在图14中显示了 OD400nm对循环数的图。例如，对于NaCl溶液，增加OD400nm值表 明增加形成二级结构。从而，图14中的数据表明液体和凝胶之间的循环可 能增加了乳光。
乳光随盐特性和浓度的改变：
对于盐浓度的改变，通过SEC-HPLC监测高分子量改变百分数。对 于该实验，制备0、5、10和20mM浓度的CaCl2、NaCl、MgCl2和NaHPO4 溶液。为每个样品测量高分子量物质百分数。图15中显示了高分子量百分 数对浓度的图。高分子量种类百分数对于除了CaCl2之外的每种盐都增加。
光密度随盐特性和浓度的改变：
400nm下的光密度改变用于监测盐特性和浓度对乳光的影响。对于该 实验，使用MgCl2、CaCl2和NaCl盐制备了一系列抗体M1溶液。在图 16中显示了OD400nm对盐浓度的图。图17显示了图16中数据的扩展区。 该数据表明高分子量种类在升高NaCl浓度时增加并且对于CaCl2和 MgCl2仅有轻微增加。
在20mM CaCl2中光密度相对于抗体M1浓度的改变：
最后，400nm下光密度的改变用于监测在20mM CaCl2溶液中改变 抗体M1浓度的影响。对于该实验，用20mM CaCl2制备了10、20、50、 60和75mg/mL的抗体M1溶液。在图18中显示了OD400nm对抗体M1 浓度的图。这些数据表明较高级结构随着升高抗体M1浓度而增加。
关于实施例5的所有数据进行了一些观察。乳光效果是以下面的方式 依赖于盐的：NaCl>Na2PO4>MgCl2>CaCl2。对于给定蛋白质浓度，随 着升高盐浓度，乳光将最初增加然后达到平稳状态或者下降。乳光随着蛋 白质浓度增加。所有评估的盐都在2-8℃胶凝了抗体M1并且胶凝作用的 时机是依赖于盐的并且似乎与乳光的水平相关。
用于本发明的抗体优选是抗体M1(在本文中也称作“Myo-029”)、抗 体M2和抗体M3。其中将根据本发明降低或减小抗体制剂(优选含有抗 体M1、抗体M2或抗体M3)的离子强度时，通常进行离子强度的降低或 减小使得离子强度与抗体浓度的比例减小。
将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献完整引入 本文作为参考。
其他实施方案在下面权利要求的范围内。
背景
在过去20年里，蛋白质，包括抗体已经被用于药物疗法。为了实现高 治疗剂量，通常以高浓度配制抗体(约10mg/ml到100mg/ml或更高) (Brekke，O.H.和Sandlie，I.(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2：52-62)。某些 蛋白质施用方式通常需要高度浓缩的蛋白质制剂。例如，治疗性抗体的皮 下施用通常以大于约100mg/ml的浓度配制。这些浓缩的蛋白质制剂的一 些在高浓度时产生乳白色外观，其是一种通常被称作乳光的性质 (Schellekens，H.(2002)Nat.Rev.Drug Discov.1：457-462)。
浓缩的蛋白质溶液中乳光外观可以由多种因素引起，包括蛋白质浓 度、它在瑞利散射中的效应、温度、溶质-溶质相互作用的性质，等等。 当蛋白质容易发生乳光时，随着蛋白质浓度的升高，乳光外观通常更明显。 乳光溶液与聚集的蛋白质溶液的相似性已经在其丧失蛋白质活性和在药 物制剂中可能引起免疫原性方面引起了关注(Pinckard等人(1967)Clin Exp.Immunol.2：331-340；Robbins等人(1987)Diabetes 36：838-845； Cleland等人(1993)Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377)。
从而，需要开发具有降低的乳光的高度浓缩的治疗性蛋白质，例如， 治疗性抗体的制剂。
概述
本发明至少部分基于如下发现：降低抗体制剂中的盐(如氯化钠)浓 度减少了制剂的乳光外观和/或制剂中高分子量种类的形成。从而，公开了 例如通过改变制剂的离子强度减少蛋白质(如抗体)制剂的乳光外观的方 法，以及具有降低的乳光的浓缩蛋白质的组合物，如药物组合物。也公开 了纯化方法，其在纯化方法中所选的步骤中监测和/或降低盐浓度。
因此，一方面，本发明描述了减少蛋白质制剂，如抗体制剂(例如， 包括蛋白质，如抗体的溶液)的乳光或者减少高分子量种类的量的方法。 该方法包括改变，例如减小或增加制剂的离子强度使得蛋白质制剂的乳光 外观和/或高分子量种类的量减少和/或消除。在实施方案中，蛋白质制剂 中离子强度与蛋白质浓度(例如，抗体浓度)的比例被修改或改变，例如， 减小或增加，使得蛋白质制剂的乳光外观和/或高分子量种类的量被减少和 /或消除。在实施方案中，在药物有效浓度下，例如，对于抗体制剂，在约 5、10、25、50、75、100、125、150mg/ml的浓度下，蛋白质制剂在减小 离子强度前显示出不想要的乳光和/或高分子量种类(例如，浊度大于约1、 2、3、4或5或更高的欧洲药典标准和/或高分子量种类的百分比对应于蛋 白质制剂的约2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％或更高的质量百 分数)。
在实施方案中，制剂中的蛋白质是分泌型蛋白质，例如，抗体、抗体 的抗原结合片段、结合结构域-免疫球蛋白融合物(例如，SMIPTM)、可 溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶，或者凝血因子，如下 文更详细描述。在其中蛋白质是抗体的实施方案中，它可以包括至少一条 并且优选两条全长重链，和至少一条并且优选两条轻链。如本文使用的术 语“抗体”包括抗体片段或可变分子，如抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、 Fv、单链Fv片段、和重链片段(例如，驼科(camelid)VHH)。抗体可 以是单克隆抗体或单特异性抗体。抗体也可以是人、人源化的、嵌合的、 CDR移植的，或者体外产生的抗体。在其他实施方案中，抗体具有选自 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在另一实施方案中，抗体具有 选自例如κ或λ的轻链。在一个实施方案中，恒定区被改变，例如，突变， 以改变抗体的性质(例如，增加或减少下列一个或多个：Fc受体结合、抗 体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能，或者补体功能)。通常，抗 体特异结合预定抗原，例如，与病症(如神经变性、代谢、炎性、自身免 疫和/或恶性病症)有关的抗原。可以用于本发明方法的示例性抗体包括， 但不限于，抗Aβ肽、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-22 (IL-22)、5T4和生长和分化因子-8(GDF-8)的抗体。在实施方案中，抗体 是抗GDF-8抗体，例如，Myo-029。
在实施方案中，在较高蛋白质和/或盐浓度下的蛋白质自身聚集物例如 在高盐制剂(例如，具有约50到200mM盐浓度(例如，约100到150mM 盐)的制剂)中具有负的第二维里系数。例如，在含有例如150mM氯化钠 的制剂中，蛋白质具有约-1 x 10-1到-1、约-1 x 10-2到-10 x 10-2、约-1 x 10-3 到-10 x 10-3、约-1 x 10-4到-10 x 10-4、约-1 x 10-5到-10 x 10-5mol-mg/g2的第 二维里系数。在其他实施方案中，在含有例如150mM氯化钠的制剂中， 蛋白质具有正的维里系数，例如约1 x 10-5到10 x 10-5、约1 x 10-4到10 x 10-4、约1 x 10-3到10 x 10-3、约1 x 10-2到10 x 10-2mol-mg/g2。在其中蛋 白质是抗体或其片段的实施方案中，在实施本发明方法之前和/或之后，抗 体以约0.1到约1,000mg/ml，通常约0.5到约500、约1到400、约5到 300、约10到250、约15到200、约20到150、约50到100mg/ml的浓 度存在。
在实施方案中，通过降低制剂中存在的盐的浓度，和/或通过用诱导较 少乳光的盐替换用于制剂中的盐，改变，例如降低蛋白质制剂的离子强度。 制剂中的盐可以选自下列一种或多种：例如，氯化钠、氯化钙、氯化镁或 磷酸钠。制剂中的盐浓度可以降低到较低浓度，例如，比乳光制剂中的浓 度低至少约2、3、5、10或100倍的浓度。例如，可以将蛋白质制剂中的 盐(例如氯化钠)浓度降低到小于约300mM，通常小于约200、150、100、 75、50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2、1或0mM。例如，通过 应用选自：超滤或透析的一种或多种过滤方法可以改变，例如降低蛋白质 制剂中的盐浓度。备选或额外地，通过将一种或多种第一类盐(例如，高 乳光诱导剂)用一种或多种第二类盐(例如，较低乳光诱导剂)替换，改 变(例如，降低或升高)蛋白质制剂的离子强度。下面的示例性盐根据在 抗体制剂中的乳光诱导水平，以从高到低乳光诱导剂的顺序排列：氯化钠 (NaCl)、磷酸钠(NaHPO4)、氯化镁(MgCl2)和氯化钙(CaCl2)。相应地，在 实施方案中，第一类盐是NaCl，并且用选自例如NaHPO4、MgCl2、或 CaCl2的一种或多种的第二类盐替换；第一类盐是NaHPO4，并且用选自 例如MgCl2或CaCl2的一种或多种的第二类盐替换；第一类盐是MgCl2，并 且用第二类盐CaCl2替换。在实施方案中，通过例如经透析或超滤除去第 一类盐并向蛋白质制剂加入第二类盐，在蛋白质制剂中用第二类盐替换第 一类盐。在实施方案中，第二类盐的浓度大于第一类盐的浓度。在实施方 案中，第二类盐的浓度等于第一类盐的浓度。在其他实施方案中，第二类 盐的浓度小于第一类盐的浓度。
在其他实施方案中，在制备和/或纯化蛋白质的方法中，例如，通过降 低所用的高乳光诱导剂的浓度，改变，例如降低或升高了蛋白质制剂的离 子强度。实施方案包括：(i)(任选地)评估在一种或多种蛋白质和/或盐浓 度下，蛋白质制剂是否形成乳光溶液；(ii)(任选地)提供蛋白质制剂中的 盐浓度；和/或(iii)改变，例如，减小蛋白质制剂的离子强度(例如，改变 离子强度与蛋白质制剂中蛋白质浓度的比例)。如需要，可以重复和/或以 任何顺序进行步骤(ii)和/或(iii)。通过检测含有不同浓度蛋白质和/或盐的一 个或多个样品中的乳光和/或高分子量种类的存在可以进行步骤(i)，如本文 的实施例中所述。例如，通过应用本文所述的一个或多种过滤方法可以改 变，如降低蛋白质制剂的离子强度。备选或额外地，通过在制备和/或纯化 蛋白质的方法中的一个或多个步骤中降低离子强度，例如盐浓度可以降低 蛋白质制剂的离子强度。制备和/或纯化蛋白质的方法中离子强度的此类降 低可以通过降低用于一个或多个步骤的盐的浓度来实现。在其他实施方案 中，通过将一个或多个步骤中使用的盐用较低乳光诱导剂替换来改变离子 强度。在一些实施方案中，制剂中的蛋白质被重组制备，例如，使用重组 技术表达为例如细胞结合的、可溶性或分泌性蛋白质。在此类实施方案中， 蛋白质被重组宿主表达并与重组宿主分离(例如，分泌到培养基中并例如， 通过离心或过滤分离)。通过本领域已知的方法进一步纯化分离的蛋白质， 所述方法包括但不限于，A蛋白层析、亲和层析、疏水相互作用层析、固 定化金属亲和层析、大小排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过滤、阴离子 交换层析、羟基磷灰石层析和/或阳离子交换层析。可以将蛋白质进一步冻 干和/或在缓冲液中重构。本发明的方法包括改变，例如，降低用于一个或 多个前述步骤中的溶液(例如，洗涤、上样、洗脱、重构溶液)的离子强 度，例如，盐浓度。
不被理论束缚，认为即使在应用过滤方法，如超滤和透析后，蛋白质 制剂中也存在残留量的盐。此类残留的盐量在本领域中被表征为“唐南效 应”(Miro，M等人(2004)Analytica Chimica Acta 512(2)：311-317)。认为此类 残留的盐量可以导致具有乳光外观的蛋白质制剂，尤其当制剂中的蛋白质 具有自身聚集的倾向时，例如，它具有负的维里系数时。从而，使用本文 公开的方法改变离子浓度对于蛋白质纯化技术可以具有广泛应用。
在实施方案中，通过评估溶液的浊度检测蛋白质制剂乳光的降低。例 如，蛋白质制剂的浊度降低到约5、4、3、2、1或更低的欧洲药典标准。
在其他实施方案中，通过评估蛋白质第二维里系数的改变测定蛋白质 制剂乳光的降低。例如，改变，如降低蛋白质制剂的离子强度后，检测到 蛋白质的第二维里系数的2、3、5、10或100倍改变，例如，增加或减少。 例如，维里系数从约1 x 10-2到1 x 10-3之间的任何地方改变(例如降低) 到约1 x 10-3到1 x 10-4之间的任何地方。
在其他实施方案中，通过测定高分子量种类的量来检测蛋白质制剂乳 光的降低。高分子量种类通常具有约104，更通常约105、106、107、108、109、 1010、1011、1012、1013，或更高的分子量。制剂中蛋白质种类的重量平均 分子量可以使用下列一种或多种检测：光散射技术，例如，静态和动态光 散射、不对称流场流分级法(asymmetric flow field flow fractionation)或 者SEC-HPLC，如下面实施例中所述。在实施方案中，高分子量种类的2、 3、4、5、6、7、8、9、10、50或100倍减少表明蛋白质制剂乳光的降低。 例如，高分子量种类的质量百分比从总蛋白质质量的约30到40％降低到 小于约5％，同时非聚集的蛋白质的质量百分比从总蛋白质质量的约60到 70％升高到约95％或更高(如通过动态光散射检测)。
另一方面，本发明描述了减少蛋白质(如抗体)制剂(例如，如本文 所述的蛋白质，如抗体制剂)中高分子量种类的形成和/或减少高分子量种 类的量的方法。该方法包括改变，如降低或升高制剂的离子强度(例如， 改变离子强度与蛋白质制剂中蛋白质浓度的比例)，使得蛋白质制剂中高 分子量种类的量被减少和/或消除。
在实施方案中，高分子量种类是蛋白质聚集体，其可以在降低蛋白质 和/或盐浓度时被基本上可逆地解离。高分子量种类通常具有约104kDa，更 通常，约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013kDa，或更高的分 子量。制剂中蛋白质种类的重量平均分子量可以使用下列一种或多种检 测：光散射技术，例如，静态和动态光散射、不对称流场流分级法或者 SEC-HPLC，如下面实施例中所述。在实施方案中，高分子量种类的2、3、 4、5、6、7、8、9、10、50或100倍减少表明蛋白质制剂乳光的降低。例 如，高分子量种类的质量百分比从总蛋白质质量的约30到40％降低到小 于约5％，同时非聚集的蛋白质的质量百分比从总蛋白质质量的约60到70 ％升高到约95％或更高(如通过动态光散射检测)。
在实施方案中，通过本文公开的方法实现制剂的离子强度的降低。
另一方面，本发明描述了提高蛋白质(如抗体)制剂(例如，本文公 开的蛋白质，如抗体制剂)的生产和/或纯化方法效率的方法。该方法包括： (i)(任选地)评估在一种或多种蛋白质和/或盐浓度下，蛋白质制剂是否形 成乳光溶液；(ii)改变，例如，减小蛋白质制剂的离子强度，使得蛋白质制 剂中高分子量种类的量被减少和/或消除。通过检测含有不同浓度蛋白质和 /或盐的一个或多个样品中的乳光和/或高分子量种类的存在可以进行步骤 (i)，如本文的实施例中所述。例如，通过应用本文所述的一个或多种过滤 方法；将蛋白质制剂中使用的盐用较低乳光诱导剂(如本文所述)替换； 和/或降低制备和/纯化蛋白质方法的一个或多个步骤的离子强度(如本文 所述)，可以改变，如降低蛋白质制剂的离子强度。
在再一个方面，本发明描述了改善蛋白质的生产，例如选择用于制备 抗体的方法中的盐或盐浓度的方法。该方法包括(i)回收抗体溶液(例如， 从基质洗脱抗体；回收透析的溶液或者其他滤液；和/或用具有第一种离子 强度(例如第一种盐浓度)的第一种溶液溶解干燥制剂，例如，冻干或者 干燥的制剂)；(ii)评估抗体溶液中乳光水平和/或高分子量种类的存在； 其中(a)如果乳光和/或高分子量种类的水平等于或小于预定水平，那么 选择所述抗体溶液用于抗体产物，例如，包括该抗体溶液的药物组合物； 或(b)如果乳光和/或高分子量种类的水平大于预定水平，那么选择具有 第二种(例如较低)离子强度(例如，第二种，如较低盐浓度)的第二种 溶液。如果需要，可以评估含有抗体的第二种溶液中乳光水平和/或高分子 量种类的存在，并且可以加入额外的溶液直到乳光水平达到(或小于)预 定水平。
在实施方案中，通过本领域已知的一种或多种蛋白质纯化方法回收抗 体溶液，所述方法包括，但不限于，A蛋白层析、亲和层析、疏水相互作 用层析、固定化金属亲和层析、大小排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过 滤、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析和/或阳离子交换层析。可以将蛋白 质进一步冻干和/或在缓冲液中重构。
在实施方案中，(第一种、第二种和额外的)抗体溶液的预定水平是 通常在药物有效浓度(例如，对于抗体制剂，为约5、10、25、50、75、 100、125或150mg/ml)下，具有大于约1、2、3、4、5或更高的欧洲药 典标准，通常约3的浊度值，和/或高分子量种类增加到蛋白质制剂的1％、 2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％或更高的质量百分数，通常约2 ％。
另一方面，本发明描述了抗体纯化方法或抗体制剂，其中结合到抗体 的残留盐浓度的量小于抗体被彻底透析，例如在0mM盐中透析后看到的 量。
另一方面，本发明描述了测定如本文所述的蛋白质(如抗体)制剂具 有乳光外观的倾向的方法。该方法包括：(i)(任选)例如通过测定表面蛋 白质电荷和/或第二维里系数来鉴定蛋白质为具有自身聚集的倾向；和/或 (ii)当分别升高和/或降低在溶液中含有所述蛋白质的一个或多个样品中蛋 白质和/或盐浓度时，检测高分子量种类的形成和/或消失。负的维里系数 和/或当升高盐和/或蛋白质浓度时高分子量种类的增加表明制剂中蛋白质 具有乳光外观的倾向增加。
在再一方面，本发明描述了评估蛋白质(如抗体)样品的乳光的方法。 该方法包括：提供蛋白质(如抗体)样品；在一种或多种(例如，至少两 种、三种或多种)盐(如NaCl)浓度下测定浊度和/或高分子量种类的存 在；提供关于蛋白质(如抗体)样品中乳光水平作为在一种或多种盐(如 NaCl)浓度下浊度和/或高分子量种类的存在的函数的报告。
在其他方面，具有降低的乳光的蛋白质(如抗体)制剂(以及包括本 文公开的蛋白质制剂的药物组合物和/或制剂)也在本发明范围内。在实施 方案中，通过本文描述的方法产生蛋白质制剂。
在其他实施方案中，与除去一种或多种高分子量种类(例如过滤或离 心步骤)前的高分子种类相比，蛋白质制剂包括至少70％、80％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高质量百分数的非聚集的种类(如通 过动态光散射检测)。在实施方案中，蛋白质制剂的离子强度的改变(例 如降低)引起与高分子量种类相比，非聚集蛋白质的百分比升高2、3、4、 5、6、7、8、9、10、50或100倍。
在再一方面，本发明描述了可药用抗体制剂，其包括在小于约50、40、 30、20、10、5或1mM盐(如NaCl)中浓度为至少约50、75、100、125 或150mg/ml的抗体，如人或人源化抗体。
另一方面，本发明描述了提供抗体制剂的方法，其包括：(i)提供抗体 溶液，如人或人源化抗体溶液，其在除去一种或多种高分子量种类，如过 滤或离心步骤之前具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或更高质量百分比的非聚集种类；(ii)进行一个或多个纯化步骤以提供 中间抗体溶液；和(iii)处理该中间溶液以提供抗体制剂，该抗体制剂具 有至少约50到150mg/ml的浓度和小于约5、4、3、2、1或更小的欧洲药 典标准的浊度。
根据优选实施方案的描述和权利要求书，其他方面、特征和优点将是 显而易见的。
附图简述
图1显示了暴露于增加的NaCl浓度的抗体M1(本文中也称作 “Myo-029”)溶液的图像(显示了视觉上可感知的乳光增加)。
图2显示了在0mM NaCl和100mM NaCl中抗体M1溶液的动态光 散射图。
图3显示了在100mM NaCl中抗体M1溶液的不对称流场流分级法。
图4显示了在100mM NaCl中抗体M1溶液的SEC-HPLC层析。
图5显示了从0mM NaCl透析到100mM NaCl并返回到0mM NaCl 的抗体M1溶液的图像(显示了随着盐浓度的改变，可见的可逆乳光)。
图6显示了抗体M1溶液的动态光散射图，显示了乳光种类的可逆形 成：(a)100mM NaCl，其从0mM NaCl透析，和(b)0mM NaCl，其从100 mM NaCl透析。
图7显示了随着增加NaCl浓度，抗体M2溶液的图像(没有显示视 觉上可感知的乳光增加)。
图8显示了在0mM NaCl和150mM NaCl中抗体M2溶液的动态光 散射图。
图9显示了在0mM NaCl和150mM NaCl中抗体M3溶液的动态光 散射图。
图10显示了在100mM NaCl下抗体M1的第二维里系数图。
图11显示了在100mM NaCl下抗体M2的第二维里系数图。
图12显示了含有不同盐的抗体M1溶液在1小时后显示乳光的图像。
图13显示了含有不同盐的抗体M1溶液在2周后显示乳光的图像。
图14显示了含有不同盐的抗体M1溶液的OD400nm对温度循环数 的图。
图15显示了含有不同盐的抗体M1溶液的高分子量百分比对盐浓度的 图。
图16显示了含有不同盐的抗体M1溶液的OD400nm对盐浓度的图。
图17显示了图16中所示的图的扩展区。
图18显示了20mM CaCl2中OD400nm对抗体M1浓度的图。
详述
本申请公开了通过改变制剂的离子强度减小蛋白质制剂的乳光外观 的方法，并且公开了具有降低的乳光的浓缩蛋白质的组合物，例如，药物 组合物。也公开了在所选的步骤监测和/或降低盐浓度的纯化方法。
在一个实施方案中，为三种抗体：抗体M1(本文中也称作“Myo-029”)、 抗体M2和抗体M3评估了盐浓度，即离子强度对浓缩的抗体制剂的乳光 外观的影响。如在所附实施例中更详细描述的，发现所有三种抗体在仅仅 10mM组氨酸中pH6.0下都含有相对少量的极大种类。该大种类太大而 不能使用SEC-HPLC柱分离。对于抗体M1，通过增加抗体制剂中氯化钠 的量增加离子强度增加了乳光，以及出现了液-液相分离(见例如图1- 4)。如在图5-6中对抗体M1所示，当除去盐时，乳光外观是可逆的。 使用不对称流场流分级法(aFFFF)为抗体M1观察到大种类，其后来使用 动态光散射技术得到证实(见图2)。尽管与抗体M1相比，抗体M2和 M3没有显示出通过视觉检查可检测的乳光的显著增加(见例如，图7)， 但是使用光散射技术为两种抗体都检测到高分子量种类(图8和9中显示)。
与抗体M3和抗体M2(它们都具有正的维里系数)相比，为抗体M1 计算的负的维里系数与抗体M1的聚集/结合倾向相一致(比较图10和图 11)。
本文所示的结果表明抗体研究的乳光外观主要是由于可逆的自缔合 作用，其受到增加离子强度的进一步诱导。因此，如本发明公开的，为了 降低浓缩的抗体制剂(尤其具有聚集倾向的抗体制剂)的乳光外观，抗体 制剂的离子强度应该从制剂降低和/或在加工方法中受到限制。
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。额外的定义在整个详述 部分给出。
术语“乳光”或“乳光外观”指在溶液(如蛋白质制剂)中检测的混浊度， 作为溶液中一种或多种组分(如蛋白质)的浓度和/或盐浓度的函数。通过 参考使用已知浊度的悬浮液产生的标准曲线可以计算混浊度。用于测定药 物组合物的混浊度的参考标准可以基于欧洲药典标准(欧洲药典，第四版， Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe(EDQM)， Strasbourg，法国)。根据欧洲药典标准，将澄清的溶液定义为具有小于或 等于参考悬浮液的浊度的溶液，所述参考悬浮液具有根据欧洲药典标准约 3的浊度。比浊浊度测量可以检测瑞利散射，在不存在缔合或非理想效应 时，瑞利散射通常随浓度线性改变。
例如，理想溶液行为符合下式：
KC/Rθ＝1/M
其中M是分子量，K是常数，Rθ是瑞利比(其组合了许多实验参数)， C是浓度。而非理想溶液可以使用下式描述：
KC/Rθ＝1/M+2BC+…
其中B是第二维里系数。为了得到M，将KC/Rθ外推到0角度和0 浓度。齐姆图将KC/Rθ置于纵坐标上并将sin2(θ/2)+kC置于横坐标上，其 中k是任意常数。从而，齐姆图允许在相同的图上进行KC/Rθ0角度和0 浓度外推。使用齐姆图，M和B分别是0角度线的截距和斜率。
术语“第二维里系数”是本领域公知的，指已占体积效应和分子间相互 作用的测量(Tessier，P.M.等人(2003)Current Opinion in Biotechnology 14(5)：512-516)。正的第二维里系数通常表明已占体积效应和分子间排斥作 用。相比，负的第二维里系数通常表明分子间吸引作用。这些分子内和分 子间相互作用的平衡决定了第二维里系数的符号和幅度。
术语“离子强度”指溶液中离子浓度。如果“I”是离子强度：
其中ci是离子i的摩尔浓度，zi是该离子的电荷，对溶液中的所有离 子进行总和(IUPAC Compendium of Chemical Terminology，第二版 (1997))。
如本文使用的术语“蛋白质”指可以作为一个单位发挥功能的一种或多 种多肽。如本文使用的术语“多肽”指通过肽键连接在一起的氨基酸的顺序 链。术语“多肽”用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域技术人员将理解 该术语不限于长链并且可以指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的 最小链。如果单一多肽作为一个单元发挥功能，那么术语“多肽”和“蛋白质” 可互换使用。术语蛋白质和多肽包括抗体、受体融合物、SMIPTM、生长 因子、细胞因子、凝血因子和酶，如下文详述。
术语“抗体”指任一免疫球蛋白或其片段，并且包括包含抗原结合部位 的任何肽或多肽。该术语包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、单 特异性抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人源化抗体、脱免疫抗体、 人抗体、驼科抗体、啮齿动物抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重 组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植的抗体，和体外产生的抗体。术语“抗 体”也包括抗体片段和变体分子，如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、 VHH，和保留抗原结合功能的其他抗体片段和变体分子。通常，此类片段 将包含抗原结合结构域。
术语“蛋白质制剂”指在溶液中含有至少一种蛋白质，如抗体的任何组 合物，当升高该制剂的离子强度时，其能够形成高分子量种类。蛋白质制 剂可以含有相同或不同的蛋白质，例如，具有不同结合特异性的抗体。
术语“高分子量种类”指至少两个蛋白质如抗体的缔合。在实施方案中， 蛋白质缔合导致形成单体蛋白质的更高级的聚集体。由于非共价(例如， 静电、范德华力)蛋白质-蛋白质相互作用可以引起缔合。当降低蛋白质 制剂的离子强度时，缔合通常是可逆的。蛋白质可以是相同或不同的，例 如，具有不同结合特异性的抗体。高分子量种类通常具有约104，更通常 约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013，或更高的分子量。
使用几种分析技术可以监测蛋白质形成高分子量种类的聚集，所述技 术包括但不限于，光密度、不对称流场流分级法、SEC-HPLC、静态光散 射，和动态光散射，如本文详述。
可以测量蛋白质样品的浊度为光密度(特定波长下的吸光度)。使用 分光光度法(例如，使用SpectraMax UV-Vis在400nm波长下)可以进行 光密度测量。关于怎样测量光密度的更详细描述，见例如，Eckhardt BM (1994)JPharm Sci Technol.48(2)：64-70。
不对称流场流分级法(AF4)是一种类型的不对称场流分级法。AF4是 能够快速分级分离和高分辨率表征多种颗粒，包括生物分子的方法 (Giddings，J.C.；Yang，F.J.；Myers，M.N.，Flow-field-flow fractionation：a versatile new separation method，193 Science 1244-1245(1976)；Giddings，J. C.；Yang，F.J.；Myers，M.N.，Theoretical and experimental characterization of flow field-flow fractionation，48 Anal.Chem.1126-1132(1976))。AF4能 够分离从几纳米到几微米的颗粒。场流分级法分离在薄的流体通道(与层 析分离柱相当)中发生。水性或有机溶剂携带样品通过该通道。由于低通 道高度，通过通道流动——对样品施加的第一种力是层状的。与通道流垂 直产生第二种力。在AF4中，流体通道的一侧是膜并且第二种力是流体穿 过通道通过膜流动。由于这两种力，在该系统中发生颗粒分离。首先，由 于通道内的层流导致的速度梯度引起通道中心的颗粒沿着通道更快地移 动并与更接近通道侧面的那些颗粒分离。其次，第二种力迫使样品朝向膜。 发生大小分离，因为较小的分子比较大的颗粒更快地朝着通道中心扩散并 且因此由于较快的溶剂朝着通道中心流动而导致所述较小的分子与较大 的颗粒分离。
缩写SEC-HPLC表示大小排阻层析-高效液相层析。SEC和HPLC 与组合SEC-HPLC分析技术都是公知的分析技术(Garnick，R.L.，Ross，M. J.，Du Mee，C.P.，Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，Ed.J. Swarbrick，J.C.，Boylan，Vol.1：253(Marcel Dekker，Inc.，New York， 1988))。不深入研究每种技术背后的理论，SEQ也称作凝胶渗透层析，基 于大小分离分子，这是由于分子能够沿着凝胶基质移动，HPLC基于扩散 系数分离分子，因为分子在高压下经过静止的介质移动。
静态和动态光散射是用于测量从溶剂/溶质系统散射的光图案的两种 不同的实验方法(Berne，B.和Pecora，R.Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry，Biology and Physics(Wiley，New York，1976))。静 态和动态光散射给出了互补的信息，并且为此原因，它们通常一起用于表 征溶液。
静态光散射涉及测量溶液中颗粒散射的激光的时间-平均强度的角 度依赖性。随着检测器角度而变，颗粒的大小和结构影响光散射强度。已 确定在低散射向量(scatter vector)和低浓度的限制下，散射强度的角度 分布变得独立于颗粒形状(Zimm，B.，Thescattering of light and the radial distribution function of high polymer solutions，16 J.Chem.Phys.1093-9 (1948))。如上文讨论，通过外推(Kc/Rθ)到0角度和0浓度，可以估计一些 因素，包括平均分子量、回转半径和第二维里常数。
动态光散射涉及所发生的散射光强度的时间依赖性波动，因为溶液中 的颗粒(在该情况下为蛋白质)正经历随机的布朗运动。通过分析这些强 度波动，可以确定颗粒的扩散系数分布。然后可以将扩散系数分布用公知 的理论转化为大小分布。动态光散射的上限(upper sized limit)是依赖样 品密度的，即，颗粒必须能够移动，从而上限通常是颗粒沉降相比扩散过 程占优势的那一点。下限将依赖于与悬浮介质相比，样品产生的过量散射 光，以及其他因素，包括样品浓度、相对折射率、激光功率、激光波长、 检测器灵敏度等等。
蛋白质
在一些实施方案中，重组产生蛋白质制剂中的蛋白质。如本文所用的 术语“重组表达的蛋白质”和“重组蛋白”指从宿主细胞表达的多肽，所述宿 主细胞已经通过人的手操作以表达该多肽。在一些实施方案中，宿主细胞 是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该操作可以包括一种或多种遗传修 饰。例如，通过导入一种或多种编码待表达多肽的异源基因遗传修饰宿主 细胞。异源重组表达的多肽可以与在宿主细胞中正常表达的多肽相同或相 似。异源重组表达的多肽也可以是宿主细胞外源的，例如，与在宿主细胞 中正常表达的多肽异源。在一些实施方案中，异源重组表达的多肽是嵌合 的。例如，多肽的部分可以含有与宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似 的氨基酸序列，而其他部分含有宿主细胞外源的氨基酸序列。额外或备选 地，多肽可以含有来自都在宿主细胞中正常表达的两种或多种不同多肽的 氨基酸序列。此外，多肽可以含有来自都是宿主细胞外源的两种或多种多 肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过活化或上调一种或多种内源基 因遗传修饰宿主细胞。
显示出所希望程度的乳光和/或形成分子量种类的任何蛋白质都可以 根据本发明使用。例如，本发明可以用于降低任何药学或商业上相关的抗 体、受体、细胞因子、生长因子、酶、凝血因子、激素、调节因子、抗原、 结合剂等等的乳光。可以根据本发明分离的下面列表的蛋白质在性质上仅 仅是示例性的，并且不意在为限制性引用。本领域技术人员将理解任何蛋 白质可以根据本发明表达并且将能够根据需要选择待产生的具体蛋白质。
抗体和结合片段
抗体，也称作免疫球蛋白，是典型的四聚体糖基化蛋白质，由各约25 kDa的两条轻(L)链和各约50kDa的两条重(H)链组成。在抗体中可 以发现称作λ和κ的两种类型的轻链。取决于重链恒定结构域的氨基酸序 列，可以将免疫球蛋白分为五大类：A、D、E、G和M，并且这些的一些 可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和IgA2。每条轻链包括N-末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构 域(CL)。每条重链包括N-末端V结构域(VH)、三个或四个C结构 域(CH)和铰链区。与VH最接近的CH结构域被称作CH1。VH和VL 结构域由相对保守序列的四个区组成，这些区被称作构架区(FR1、FR2、 FR3和FR4)，其形成三个高变序列区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR 含有负责抗体与抗原的特异相互作用的多数残基。CDR被称作CDR1、 CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分被称作H1、H2和H3，而轻 链上的CDR成分被称作L1、L2和L3。CDR3通常是抗体结合部位内分 子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或者大于26个 氨基酸。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域公知的。抗体 结构综述见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，eds.Harlow等人，1988。本领域技术人员将认识到每个亚基结 构，例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构包含活性片段，例如， VH、VL或CDR亚基的结合抗原的部分，即抗原结合片段，或者例如， CH亚基的结合和/或活化例如Fc受体和/或补体的部分。CDR通常指 Kabat CDR，如Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services(1991)，eds.Kabat et al中所述。 表征抗原结合部位的另一标准是指如Chothia所述的高变环。见例如， Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等人 (1995)EMBOJ.14：4628-4638。再一个标准是Oxford Molecular的AbM 抗体建模软件所用的AbM定义。一般见，例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering J.ab Manual(Ed.：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag， Heidelberg)。关于Kabat CDR所述的实施方案可以备选地用关于Chothia 高变环或者关于AbM定义的环类似描述的关系实现。
在术语抗体的“抗原结合片段”内包括的结合片段的实例包括(i)Fab片 段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片 段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd 片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL 和VH结构域组成，(v)dAb片段，其由VH结构域组成；(vi)驼科或骆驼 化可变结构域，例如，VHH结构域；(vii)单链Fv(scFv)；和(viii)双特 异性抗体。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码， 但是它们可以用重组方法通过合成的接头连接，所述接头使得它们成为一 条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见 例如，Bird等人(1988)Science 242：423-26；Huston等人(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-83)。此类单链抗体也意在包括在术语抗体 的“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体 片段，并且以与完整抗体相同的方式评估片段的功能。
除了“双特异性”或“双功能”抗体外，将抗体理解为其每个结合位点是 相同的。“双特异性”或“双功能”抗体是人工杂合抗体，其具有两个不同的 重/轻链对和两个不同的结合位点。通过多种方法可以产生双特异性抗体， 所述方法包括杂交瘤的融合或者Fab′片段的连接。见例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J. Immunol.148，1547-1553(1992)。
本领域技术人员已知的许多方法可以用于得到抗体。例如，通过根据 已知的方法产生杂交瘤可以产生单克隆抗体。然后使用标准方法，如酶联 免疫吸附测定(ELISA)和表面等离振子共振(BIACORETM)分析筛选以这 种方式形成的杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异结合的抗体的一个或多 个杂交瘤。任一形式的特定抗原可以用作免疫原，例如，重组抗原、天然 存在的形式，其任何变体或片段，以及其抗原肽。
制备抗体的一个示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如，噬菌体 或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等人，美国专利号 5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809。
除了使用展示文库，特定抗原还可以用于免疫非人动物，例如，啮齿 动物，例如小鼠、仓鼠或者大鼠。在一个实施方案中，非人动物包括至少 部分人免疫球蛋白基因。例如，可能用人Ig基因座的大片段改造在小鼠抗 体产生中缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生和选择具有希望的 特异性的来自所述基因的抗原特异性单克隆抗体。见例如， XENOMOUSETM，Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21，US 2003-0070185，WO 96/34096(1996年10月31日公布)，和PCT申请号 PCT/US96/05928(1996年4月29日提交)。
在另一实施方案中，单克隆抗体从非人动物得到，然后进行改变，例 如，使用本领域已知的重组DNA技术可以产生人源化抗体、去免疫抗体、 嵌合抗体。已经描述了制备嵌合抗体的多种方法。见例如，Morrison等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452， 1985，Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人，美国专利号 4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公布EP171496；欧洲专利公布 0173494，英国专利GB2177096B。也可以产生人源化抗体，例如，使用表 达人重链和轻链基因但是不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因 的转基因小鼠。Winter描述了示例性CDR移植方法，其可以用于制备本 文所述的人源化抗体(美国专利号5,225,539)。具体人抗体的所有CDR可 以用非人CDR的至少一部分替换，或者仅仅一些CDR用非人CDR替换。 仅仅需要替换人源化抗体与预定抗原结合所需数目的CDR。
通过将不直接涉及抗原结合的Fv可变结构域的序列用来自人Fv可变 结构域的等同序列替换，可以产生人源化抗体。产生人源化抗体或其片段 的示例性方法由Morrison(1985)Science 229：1202-1207；by Oi等人 (1986)BioTechniques 4：214；和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762； US 5,859,205；和US 6,407,213提供。那些方法包括分离、操作和表达核酸 序列，所述核酸序列编码来自至少一个重或轻链的所有或部分免疫球蛋白 Fv可变结构域。此类核酸可以从产生抗预定靶标的抗体的杂交瘤(如上述) 以及从其他来源得到。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆 进合适的表达载体中。
在一些实施方案中，通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和 /或回复突变优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域 已知的几种技术的任一种制备(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，4：7279， 1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，并且可以根据PCT公 布WO92/06193或EP 0239400的教导制备。
通过WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法特异性缺失人T细 胞表位或“去免疫化”也可以修饰抗体。简言之，可以对抗体的重链和轻链 可变结构域分析结合MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如 WO 98/52976和WO 00/34317中定义)。为了检测潜在的T细胞表位， 可以应用称作“肽穿线”(peptide threading)的计算机建模方法，此外， 可以检索人MHC II类结合肽数据库中存在于VH和VL序列中的基序，如 WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序结合到18种主要MHC II 类DR同种异型的任一个，从而构成了潜在的T细胞表位。通过替代可变 结构域中少数氨基酸残基或者优选地，通过单个氨基酸替代可以消除所检 测到的潜在T细胞表位。通常，进行保守替代。通常，但并不是排他性地， 可以使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如公开于 Tomlinson，等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人 (1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；Chothia，D.等人(1992)J. Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。 V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson， I.A.等人编著，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)。 这些序列可以用作例如构架区和CDR的人序列来源。也可以使用共有的 人构架区，如U.S.6,300,064中所述。
在一些实施方案中，抗体可以含有改变的免疫球蛋白恒定区或Fc区。 例如，根据本文的教导产生的抗体可以更强烈或以更高特异性结合效应分 子，如补体和/或Fc受体，其可以控制抗体的一些免疫功能，如效应细胞 活性、裂解、补体介导的活性、抗体清除，和抗体半寿期。结合抗体(如 IgG抗体)的Fc区的典型的Fc受体包括，但不限于，FcγRI、FcγRII和 FcγRIII和FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接 的形式。Fc受体在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92，1991； Capel等人，Immunomethods 4：25-34，1994；和de Haas等人，J.Lab.Clin. Med.126：330-41，1995)中综述。
通过本发明方法可以分离的抗体的非限制性实例包括但不限于，抗 Aβ、IL-13、IL-22、GDF8和5T4的抗体。这些抗体的每一种在下文和所 附实施例中更详细描述。
抗-GDF8抗体
可以用于本发明方法的示例性抗体是抗GDF8抗体。术语“GDF-8”指 生长和分化因子8，并且合适时，指结构上或功能上与GDF-8相似的因子， 例如，BMP-11和属于TGF-β超家族的其他因子。该术语指GDF-8的全 长未加工的前体形式，以及翻译后切割得到的成熟的和前肽形式。该术语 也指GDF-8的任何片段和变体，所述片段和变体保留至少一些与成熟 GDF-8相关的生物活性，包括已经被改变的序列。公开了人GDF-8以及 许多其他脊椎动物物种(包括鼠、狒狒、牛、鸡)的GDF-8的氨基酸序列， 例如，U.S.04/0142382，US 02/0157125，和McPherron等人(1997)Proc. Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94：12457-12461)。抗GDF-8的中和性抗体的实例， 如Myo-029，公开于例如U.S.2004/0142382，并且在本文所附实施例全文中 引用。示例性疾病和病症包括肌肉和神经肌肉病症，如肌营养不良症(包括 进行性假肥大性肌营养不良)；肌萎缩侧索硬化；肌肉萎缩；器官萎缩；虚 弱；tunnel综合征；充血性阻塞性肺病；少肌症、恶病质，和其他肌肉消 耗综合征；脂肪组织病症(例如，肥胖症)；2型糖尿病；葡萄糖耐量降 低；代谢综合征(例如，X综合征)；创伤如灼伤或氮失调诱导的胰岛素 抗性；和骨退行性疾病(例如，骨关节炎和骨质疏松症)。
抗-Aβ抗体
按照本发明的教导可以实施抗Aβ抗体制剂的乳光的降低。术语“AB 抗体”、“Aβ抗体”、“抗Aβ抗体”，和“抗Aβ”在本文中可互换使用，指结 合APP、Aβ蛋白或者两者的一个或多个表位或抗原决定簇的抗体。示例 性表位或抗原决定簇可以发现于人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)内，但是 优选发现于APP的Aβ肽内。存在APP的多种同种型，例如，APP695、 APP751和APP770。根据APP770同种型的序列对APP内的氨基酸分配编号 (见例如GenBank检索号P05067)。Aβ(本文中也称作β淀粉状蛋白肽和 A beta)肽是APP的39-43个氨基酸的～4-kDa内部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、 Aβ42和Aβ43)。例如，Aβ40由APP的残基672-711组成，Aβ42由APP 的残基672-713组成。由于不同的分泌酶在体内或原位对APP的蛋白酶解 加工，Aβ被以40个氨基酸长的“短形式”和42-43个氨基酸长的“长形式” 发现。表位或抗原决定簇可以位于Aβ肽的N-末端并且包括Aβ的氨基酸 1-10内的残基，优选Aβ42的残基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-7、3-6或 3-7，或者位于Aβ的残基2-4、5、6、7、或8内，Aβ的残基3-5、6、7、 8或9或Aβ42的残基4-7、8、9或10内。“中心”表位或抗原决定簇位于 Aβ肽的中心或者中央部分并且包括Aβ的氨基酸16-24、16-23、16-22、 16-21、19-21、19-22、19-23或19-24内的残基。“C-末端”表位或者抗原决 定簇位于Aβ肽的C-末端并且包括Aβ的氨基酸33-40、33-41或33-42内 的残基。
在多种实施方案中，Aβ抗体是末端特异性的。如本文所用，术语“末 端特异性的”指特异结合Aβ肽的N-末端或C-末端残基但是当存在于包含 所述残基的较长的Aβ种类中或存在于APP中时不识别所述相同残基的抗 体。
在多种实施方案中，Aβ抗体是“C-末端特异性的”。如本文所用，术 语“C-末端特异性的”指抗体特异识别Aβ肽的自由C-末端。C末端特异性 Aβ抗体的实例包括这些：其识别在残基40处结束的Aβ肽，但是不识别 在残基41、42和/或43处结束的Aβ肽；识别在残基42处结束的Aβ肽， 但是不识别在残基40、41和/或43处结束的Aβ肽；等等。
在一个实施方案中，抗体可以是3D6抗体或其变体，或10D5抗体或 其变体，都描述于美国专利公开号2003/0165496A1，美国专利公开号 2004/0087777A1，国际专利公开号WO02/46237A3。3D6和10D5的描述也 可见例如国际专利公开号WO02/088306A2和国际专利公开号 WO02/088307A2。3D6是特异结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表 位，特别是残基1-5的单克隆抗体(mAb)。相比，10D5是特异结合位于 人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-6的mAb。在另一实 施方案中，抗体可以是12B4抗体或其变体，如美国专利公开号 20040082762A1和国际专利公开号WO03/077858A2中公开。12B4是特异 结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-7的mAb。 在再一个实施方案中，抗体可以是12A11抗体或其变体，如美国专利申请 号10/858,855和国际专利申请号PCT/US04/17514中所述。12A11是特异 结合位于人β淀粉状蛋白肽中的N-末端表位，特别是残基3-7的mAb。 在再一个实施方案中，抗体可以是266抗体，如美国专利申请号10/789,273 和国际专利申请号WO01/62801A2中所述。设计成特异结合位于人β淀粉 状蛋白肽中的C-末端表位以用于本发明的抗体包括，但不限于，如美国专 利号5,786,160中所述的369.2B。
在示例性实施方案中，抗体是选择性结合Aβ肽的人源化抗Aβ肽3D6 抗体。更特别地，将人源化抗Aβ肽3D6抗体设计成特异结合位于发现于 脑中斑块沉积物中(例如，在患有阿尔茨海默氏病的患者中)的人β淀粉 状蛋白1-40或1-42肽中的NH2-末端表位。
抗Aβ抗体可以用于治疗促淀粉状变疾病，尤其阿尔茨海默氏病。术 语“促淀粉状变疾病”包括与不溶性淀粉状蛋白纤丝的形成或沉积有关(或 引起)的任何疾病。示例性促淀粉状变疾病包括，但不限于，系统性淀粉 样变性、阿尔茨海默氏病、成年发作的糖尿病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、 额颞叶痴呆、和朊病毒相关的传播性海绵状脑病(人类中的库鲁病和克- 雅氏病和分别在绵羊和牛中的羊瘙痒症和BSE)。通过沉积的纤丝的多肽 组分的性质定义或表征不同的促淀粉状变疾病。例如，在患有阿尔茨海默 氏病的受试者或患者中，β淀粉状蛋白(例如，野生型、变体或截短的β 淀粉状蛋白)是淀粉状蛋白沉积物的特征性多肽组分。因此，阿尔茨海默 氏病是例如受试者或患者脑中“通过Aβ沉积物表征的疾病”或“与Aβ的沉 积物相关的疾病”的实例。术语“β淀粉状蛋白蛋白质”、“β淀粉状蛋白肽”、 “β淀粉状蛋白”、“Aβ”和“Aβ肽”在本文中可互换使用。
抗-5T4抗体
以前已经表征了5T4抗原(见例如，WO89/07947)。人5T4的完整核 酸序列是已知的(Myers等人(1994)J Biol Chem 169：9319-24和GenBank 检索号Z29083)。来自其他物种的5T4抗原的序列也是已知的，例如，鼠 5T4(WO00/29428)，犬5T4(WO01/36486)或猫5T4(US 05/0100958)。
人5T4是在癌中广泛表达的约72kDa的糖蛋白，但是在正常成年组 织中具有高度受限的表达模式。它似乎与结直肠癌和胃癌中的转移强烈相 关。5T4抗原的表达在乳腺癌和卵巢癌中以高频率发现(Starzynska等人 (1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10：479-84；Starzynska等人(1994) Br.J.Cancer 69：899-902；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer 66：867-9)。 已经提出5T4为标记物，对于肿瘤发展和转移潜力具有可能的机理涉及 (Carsberg等人(1996)Int J Cancer 68：84-92)。也提出将5T4用作免疫治 疗剂(见WO 00/29428)。5T4的抗原肽公开于例如US 05/0100958，将其 内容引入本文作为参考。
一些待决的申请一般涉及编码抗5T4单克隆抗体的核酸、其载体和宿 主细胞，例如美国申请公开号2003/0018004和2005/0032216。已经提交了 一般涉及人源化的抗5T4 H8单克隆抗体和其加利车霉素缀合物，以及使 用这些加利车霉素缀合物治疗的方法的临时专利申请(美国申请公开号 2006/0088522)。将所有这些申请的内容完整引入本文作为参考。
抗-IL13抗体
白介素-13(IL-13)是以前表征的细胞因子，由T淋巴细胞和肥大细胞 分泌(McKenzie等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3735-39；Bost等 人(1996)Immunology 87：663-41)。术语“IL-13”指白介素-13，包括IL-13 的全长未加工的前体形式，以及翻译后切割得到的成熟形式。该术语也指 IL-13的任何片段和变体，其保持至少一些与成熟IL-13相关的生物活性， 包括已经被改变的序列。术语“IL-13”包括人IL-13以及其他脊椎动物种 类。一些待决的申请公开了抗人和猴IL-13的抗体、IL-13肽、产生其的 载体和宿主细胞，例如，美国申请公开号2006/0063228A和2006/0073148。 将这些公开的内容完整引入本文作为参考。
IL-13与IL-4共有一些生物活性。例如，IL-4或IL-13可以在B细胞 中引起IgG同种型转换(Tomkinson等人(2001)J.Immunol. 166：5792-5800)。此外，已经报导了哮喘患者中细胞表面CD23和血清CD23 (sCD23)水平升高(Sanchez-Guererro等人(1994)Allergy 49：587-92； DiLorenzo等人(1999)Allergy Asthma Proc.20：119-25)。此外，IL-4或 IL-13可以上调B细胞和单核细胞上MHC II类和低亲和性IgE受体 (CD23)的表达，其导致增强的抗原呈递和受调节的巨噬细胞功能 (Tomkinson等人，同上)。这些观察提示IL-13在呼吸道嗜酸性细胞增多症 和呼吸道高反应性(AHR)的发展中是重要因素(Tomkinson等人，同上； Wills-Karp等人(1998)Science 282：2258-61)。因此，IL-13的抑制可用于 减轻许多炎性和/或变应性状况的病理，包括但不限于，呼吸病症，例如， 哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；涉及呼吸道炎症的其他状况、嗜酸性细 胞增多症、纤维质生成和过量黏液产生，例如，囊性纤维化和肺纤维化； 特异性病症，例如，特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎；皮肤的炎 性和/或自身免疫状况(例如，特异性皮炎)、胃肠器官的炎性和/或自身 免疫状况(例如，炎性肠疾病(IBD)，如溃疡性结肠炎和/或克隆病)、肝脏 的炎性和/或自身免疫状况(例如，肝硬化、肝细胞癌)；硬皮病；肿瘤或 癌症(例如，软组织或实体瘤)，如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤，例 如，霍奇金淋巴瘤；病毒感染(例如，来自HTLV-1)；其他器官的纤维化， 例如，肝脏纤维化(例如，乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒引起的纤维化)。
抗-IL22抗体
白介素-22(IL-22)是以前表征的II类细胞因子，其显示出与IL-10的 序列同源性。它的表达在T细胞中受到IL-9或ConA的上调(Dumoutier L. 等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(18)：10144-9)。研究已经表明应答 LPS施用，在体内诱导IL-22mRNA的表达，并且IL-22调节表明急性期 应答的参数(Dumoutier L.等人(2000)同上；Pittman D.等人(2001)Genes and Immunity 2：172)，并且通过使用中和性抗IL-22抗体降低IL-22活性 减轻了小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的炎性症状。从而，IL-22 拮抗剂，例如，中和性抗IL-22抗体和其片段可以用于在体内诱导免疫抑 制，例如，用于治疗自身免疫病症(例如，关节炎病症，如类风湿性关节 炎)；呼吸病症(例如，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD))；炎性状况，如 皮肤的(例如，银屑病)、心血管系统的(例如，动脉粥样硬化)、神经 系统的(例如，阿尔茨海默氏病)、肾的(例如，肾炎)、肝脏的(例如， 肝炎)和胰腺的炎性状况(例如，胰腺炎)。
术语“IL-22”指白介素-22，包括IL-22的全长未加工的前体形式，以 及翻译后切割得到的成熟形式。该术语也指IL-22的任何片段和变体，所 述片段和变体保留至少一些与成熟IL-22相关的生物活性，包括已经被改 变的序列。术语“IL-22”包括人IL-22以及其他脊椎动物种类。人和啮齿动 物IL-22的氨基酸和核苷酸序列，以及抗IL-22的抗体公开于例如美国申 请公开号2005-0042220和2005-0158760，和美国专利号6,939,545。将所有 这些出版物的内容完整引入本文作为参考。
小调节性免疫药物(SMIPTM)
本发明也可以应用于小调节性免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIPTM))。它通常指结合结构域-融合蛋白，其 包括结合结构域多肽，该多肽融合或连接到免疫球蛋白铰链或者铰链作用 区多肽，该铰链或者铰链作用区多肽又融合或连接到包含来自免疫球蛋白 重链的一个或多个天然或改造的恒定区的不同于CH1的区域，如IgG和 IgA的CH2和CH3区域，或者IgE的CH3和CH4区域(更完整的描述 见例如，Ledbetter，J.等人的U.S.05/0136049)。结合结构域-免疫球蛋白 融合蛋白可以还包括这样的区域，该区域包括天然或改造的免疫球蛋白重 链CH2恒定区多肽(或者对于完全或部分来自IgE的构建体的情况， CH3)，该CH2恒定区多肽融合或连接到铰链区多肽或者天然或改造的免 疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或者对于完全或部分来自IgE的构建体 的情况，CH4)，该CH3恒定区多肽融合或连接到CH2恒定区多肽(或 者对于完全或部分来自IgE的构建体的情况，CH3)。通常，此类结合结 构域-免疫球蛋白融合蛋白具有选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补 体固定和/或与靶标，如靶抗原的结合的至少一种免疫学活性。
可溶性受体和受体融合物
本发明也可以应用于可溶性受体或其片段。可溶性受体的实例包括受 体的细胞外结构域，如可溶性肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；EP 417,563，1991年3月20日公布；TNFR-2，EP417,014，1991年3月20日 公布；在Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)：1-7，1995-96中综述，将它 们各自完整引入本文作为参考)。在其他实施方案中，可溶性受体包括如 US 2003-0108549中所述的白介素-21受体(IL-21R)的细胞外结构域(将其 内容也引入本文作为参考)。
融合蛋白可以包括寻靶部分，例如，可溶性受体片段或配体、免疫球 蛋白链、Fc片段、多种同种型的重链恒定区，所述同种型包括：IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。例如，融合蛋白可以包括 受体的细胞外结构域，并且例如，融合到人免疫球蛋白Fc链(例如，人 IgG，例如，人IgG1或人IgG4，或者其突变形式)。在一个实施方案中， 人Fc序列已经从野生型序列的一个或多个氨基酸突变，例如，在残基254 和257处突变，以减小Fc受体结合。融合蛋白可以额外包括接头序列， 其连接第一个部分和第二个部分，例如，免疫球蛋白片段。例如，融合蛋 白可以包括肽接头，例如，约4到20，更优选5到10个氨基酸长的肽接 头；肽接头为8个氨基酸长。例如，融合蛋白可以包括具有式 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽接头，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。 在其他实施方案中，额外的氨基酸序列可以加入融合蛋白的N-或C-末端 以方便表达、立体柔性、检测和/或分离或纯化。
在一些实施方案中，可溶性受体融合物包含可溶性TNFR-Ig(例如， TNF受体的可溶性片段，所述受体如，p55或p75人TNF受体或其衍生 物，例如，75kd TNFR-IgG(例如，融合到人IgG1的235个氨基酸的Fc 部分的75kD TNF受体)。
通过标准重组DNA技术可以产生本发明的嵌合或融合蛋白。例如， 根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起， 例如，通过使用平末端或者交错末端用于连接，限制酶消化以提供合适的 末端，如合适，填平粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，并 进行酶促连接。在另一实施方案中，通过包括自动化DNA合成仪的常规 技术可以合成融合基因。备选地，使用锚定引物可以进行基因片段的PCR 扩增，所述引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，其可以随后 退火并再次扩增以产生嵌合基因序列(见，例如，Ausubel等人(eds.) Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。此外， 通过商业途径可以得到编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区) 的许多表达载体。免疫球蛋白融合多肽是本领域公知的并且描述于例如， 美国专利号5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和 5,455,165。
生长因子和细胞因子
已经表明另一类多肽可有效作为药物和/或商业活性剂，其可以希望地 根据本发明的教导产生，所述活性剂包括生长因子和其他信号分子，如细 胞因子。
生长因子通常是糖蛋白，其由细胞分泌并结合到和活化其他细胞上的 受体，在受体细胞中启动代谢或发育改变。哺乳动物生长因子和其他信号 分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生 生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGFs)，如aFGF和bFGF；转化 生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3) -IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、 CI)-8、和CD-19；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生 蛋白(BMP)；干扰素，如α、β、和γ干扰素；集落刺激因子(CSFs)，例如， M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(TLs)、例如，IL-1到IL-13(例如， IL-11)；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素 原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子 VIIIC、因子IX、组织因子和冯维勒布兰德(von Willebrands)因子；抗凝 血因子，如C蛋白；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如 尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶、造血生 长因子；脑啡肽酶；RANTES(活化时受调节，正常T细胞表达的和分泌 的(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted))；人巨 噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；副中肾管抑制物质；松弛素A链；松弛素B 链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子，如骨衍生神经营 养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)， 或者神经生长因子，如NGF-β。本领域技术人员将理解根据本发明方法和 本发明的组合物可以表达的其他生长因子或信号分子。
已经表明生长因子或其他信号分子的糖基化模式的特定改变对它们 的治疗性质具有显著影响。作为一个实例，治疗患有慢性贫血的患者的一 个常用方法是为他们提供频繁注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)以便加 强他们的血红细胞产生。已经开发了rHuEPO的类似物达依泊汀 (darbepoetin)α()，其比正常rHuEPO具有更长的持续时间。 达依泊汀α和rHuEPO之间的主要差异是存在两条额外的含有唾液酸的 N-连接的寡糖链。使用体外糖工程化已经完成了达依泊汀α的产生(见 Elliott等人，Nature Biotechnology 21(4)：414-21，2003，将其完整引入本文 作为参考)。Elliott等人使用体外诱变向rHuEPO多肽主链掺入额外的糖 基化位点，导致达依泊汀α类似物的表达。额外的寡糖链位于EPO受体 结合位点远端并且显然不干扰受体结合。然而，达依泊汀α的半寿期比 rHuEPO高3倍，导致更有效的治疗剂。
凝血因子
已经表明凝血因子有效作为药物和/或商业活性剂。B型血友病是这样 的病症，其中患者的血液不能凝固。从而，导致出血的任何小的伤口都是 潜在威胁生命的事件。例如，凝血因子IX(因子IX或“FIX”)是单链糖蛋 白，其缺乏导致B型血友病。FIX作为单链酶原合成，其通过释放活化肽 而被活化成两条链的丝氨酸蛋白酶(因子IXa)。因子IXa的催化结构域位 于重链中(见Chang等人，J.Clin.Invest.，100：4，1997，完整引入本文作为参 考)。FIX具有多个糖基化位点，包括N-连接的和O-连接的糖类。曾经 认为在丝氨酸61位的一个具体的O-连接的结构 (Sia-α2，3-Gal-β1，4-GlcNAc-β1，3-Fuc-α1-O-Ser)是FIX特有的但是从那以 后发现于一些其他分子上，包括哺乳动物和果蝇中的Notch蛋白(Maloney et al，Journal of Biol.Chem.，275(13)，2000)。细胞培养中中国仓鼠卵巢 (“CHO”)细胞产生的FIX在丝氨酸61寡糖链中显示出一定的变异性。这 些不同的糖形和其他潜在的糖形当施用于人或动物时可以具有不同的诱 导凝血的能力和/或在血液中具有不同的稳定性，导致效率较低的凝血。
A型血友病在临床上与B型血友病不能区分，由人类凝血因子VIII 中的缺陷引起，人类凝血因子VIII是另一种糖蛋白，其作为单链合成然后 被加工成两条链的活性形式。本发明也可以用于控制或改变凝血因子VIII 的糖基化模式以便调节它的凝血活性。根据本发明可以产生的其他凝血因 子包括组织因子和冯维勒布兰德(von Willebrands)因子。
酶
已经表明有效作为药物和/或商业活性剂并且可以根据本发明的教导 希望地产生的另一类多肽包括酶。酶可以是糖蛋白，其糖基化模式影响酶 活性。从而，本发明也可以用于在细胞培养物中产生酶，其中所产生的酶 具有更广泛或更希望的糖基化模式。
仅仅作为非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(GCR)的缺乏导致称作戈谢病 的状况，其由某些细胞的溶酶体中葡糖脑苷脂酶的积累引起。患有戈谢病 的受试者显示出一系列症状，包括脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减 少症和贫血。Friedman和Hayes表明在一级氨基酸序列中含有单个替代 的重组CR(rGCR)与天然存在的GCR相比显示出改变的糖基化模式，特 别是岩藻糖和N-乙酰葡糖胺残基的增加(见美国专利号5,549,892)。
Friedman和Hayes还表明该rGCR与天然存在的rGCR相比显示出 改善的药物代谢动力学性质。例如，比天然存在的GCR高约两倍的rGCR 靶向肝脏肝巨噬细胞。尽管这两种蛋白质的一级氨基酸序列仅在一个残基 处不同，但是Friedman和Hayes假定rGCR的改变的糖基化模式也影响 向肝巨噬细胞的靶向。
本领域技术人员将知道由于糖基化模式的改变而显示出改变的酶学、 药物代谢动力学和/或药物动力学性质的酶的其他已知的实例。
蛋白质的产生
产生本发明的蛋白质的重组方法是本领域已知的。通常将编码蛋白质 的核苷酸序列插入表达载体中用于导入宿主细胞，宿主细胞可以用于产生 希望量的经改变的抗体，其又提供了多肽。术语“载体”包括核酸构建体， 其通常包括核酸，例如，基因，并且还包括核酸复制、转录、稳定性和/ 或蛋白质表达或从宿主细胞分泌必需的最少元件。此类构建体可以作为染 色体外元件存在或者可以整合到宿主细胞的基因组中。
术语“表达载体”包括特定类型的载体，其中优化核酸构建体用于高水 平表达所希望的蛋白质产物。表达载体通常具有转录调节物质，如启动子 和增强子元件，其经优化用于在特定细胞类型中高水平转录和/或经优化使 得基于特定诱导剂的使用，表达是组成型的。表达载体还具有提供蛋白质 的适当和/或增强的翻译的序列。如本领域技术人员已知，此类载体可以容 易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。术语“表达盒”包括核酸构建 体，其含有基因并且除了该基因外还具有允许该基因在宿主细胞中正确和 /或增强表达的元件。为了产生抗体，可以将编码轻链和重链的核酸插入表 达载体中。此类序列可以存在于相同的核酸分子(例如，相同的表达载体) 中或者备选地，可以从单独的核酸分子(例如，单独的表达载体)表达。
术语“有效连接”包括并置，其中组分处于允许它们以预期的方式发挥 功能的关系中(例如，功能连接)。作为实例，有效连接到目的多核苷酸 的启动子/增强子连接到所述多核苷酸使得在活化启动子/增强子指导的表 达的条件下实现目的多核苷酸的表达。
表达载体通常可以在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA 的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、 潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或者新霉素抗性)以允许检测用 希望的DNA序列转化的那些细胞(见例如，Itakura等人，美国专利号 4,704,362)。除了免疫球蛋白DNA盒序列、插入序列和调节序列外，本发 明的重组表达载体还可以携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制 的序列(例如，复制原点)和选择标记基因。选择标记基因方便选择已经 导入载体的宿主细胞(见例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665 和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因为已经导入所述载体的宿主细 胞赋予对药物，如对G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记 基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用甲氨蝶 呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
一旦载体掺入了合适的宿主细胞中，就在适于核酸序列的高水平表达 的条件下保持宿主细胞，并收集和纯化希望的抗体。根据本发明可以利用 易于细胞培养和表达蛋白质或多肽的任何宿主细胞。在一些实施方案中， 宿主细胞是哺乳动物的。可用于本发明的哺乳动物细胞的非限制性实例包 括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC No：85110503)；人成视网膜细 胞(PER.C6，CruCell，Leiden，荷兰)；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7， ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞， Graham等人，J.Gen Virol.，36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，77：4216，1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol. Reprod.，23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾 细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)； 犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A， ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2， HB 8065)；小鼠卵巢肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather 等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68，1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和 人肝细胞瘤系(Hep G2)。
此外，表达多肽或蛋白质的任何数目的商业和非商业途径可获得的杂 交瘤细胞系可以用于本发明。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可以具 有不同的营养要求和/或可以需要不同的培养条件用于最优的生长和多肽 或蛋白质表达，并且如果需要将能够修改条件。
这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制原点、启动子和 增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))，和必要的加工信息位点， 如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。 优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病 毒、巨细胞病毒等等的启动子(见，例如，Co等人，(1992)J.Immunol. 148：1149)。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动 物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如来自如下的启动子和/或增强 子：FF-1a启动子和BGH多聚A、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/ 增强子)、猿猴病毒(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病 毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤。关于病毒调节元件和其序列的进一 步描述，见例如，Stinski的美国专利号5,168,062，Bell等人的美国专利号 4,510,245，Schaffner等人的美国专利号4,968,615。在示例性实施方案中， 抗体重链和轻链基因有效连接到增强子/启动子调节元件(例如，来自 SV40、CMV、腺病毒等等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或 者SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动基因的高水平转录。在 本发明的示例性实施方案中，构建体包括内部核糖体进入位点(IRES)以 在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明多肽。相容性IRES序列公开 于也引入本文的美国专利号6,193,980中。
备选地，编码序列可以掺入转基因中用于导入转基因动物的基因组中 并随后在转基因动物的奶中表达(见，例如，Deboer等人，US 5,741,957， Rosen，US 5,304,489，和Meade等人，US 5,849,992)。合适的转基因包括与 来自哺乳动物乳腺特异性基因如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子有 效连接的轻和/或重链的编码序列。
原核宿主细胞也适于产生本发明的抗体。大肠杆菌是尤其可用于克隆 本发明的多核苷酸(例如，DNA序列)的一种原核宿主。适于使用的其他 微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肠杆菌 科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属 (Salmonella)和沙雷氏菌属(Serratia)，和多种假单胞菌属(Pseudomonas) 物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其将通常含有与宿主细 胞相容的表达控制序列(例如，复制原点)。此外，将存在任一数目的多 种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰 胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子将通常任选与操纵 基因序列一起控制表达，并且具有核糖体结合序列等等，用于启动和完成 转录和翻译。
最通常使用载体在大肠杆菌中进行蛋白质在原核生物中的表达，所述 载体含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子。融合载 体向其中编码的抗体加入许多氨基酸，通常加入重组抗体的恒定区，而不 影响抗体的特异性或抗原识别。融合肽的氨基酸的加入可以为抗体增加额 外的功能，例如，作为标记(例如，表位标记，如myc或flag)。
其他微生物，如酵母，也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)是优 选的酵母宿主，如希望，使用具有表达控制序列(例如，启动子)、复制 原点、终止序列等等的合适载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶 和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素 (isocytochrome)C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
通过公知的方法可以将含有目的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编 码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所述方法取决于细胞 宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿 孔、脂转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主(一般见， Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)，为了所有目的将其完整引入本文作为参考)。 用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲 基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、电穿孔、和显微注射(一般见， Sambrook等人，同上)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到 受精的卵母细胞中，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞 的细胞核转移到去核的卵母细胞中。
当在单独的表达载体上克隆重链和轻链时，共转染载体以得到完整免 疫球蛋白的表达和装配。一旦表达，可以如本文所述的分离本发明的完整 抗体、它们的二聚体、单独轻链和重链或其他免疫球蛋白形式和/或根据本 文已知的方法进一步纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、 HPLC纯化、凝胶电泳等等(一般见Scopes，Protein Purification (Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于制药用途，至少约90到95％同质性 的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，98至99％或更高的同质性是最优选 的。
蛋白质纯化
希望分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质。在一些实施方案中，所 表达的蛋白质分泌到培养基中从而如通过离心或过滤除去细胞和其他固 体，作为纯化方法中的第一步。
在一些实施方案中，表达的蛋白质结合到宿主细胞表面。在此类实施 方案中，除去培养基并裂解表达多肽或蛋白质的宿主细胞作为纯化方法中 的第一步。通过本领域技术人员已知的任一种方法可以实现哺乳动物宿主 细胞的裂解，所述方法包括通过玻璃珠物理破裂和暴露于高pH条件。
通过标准方法可以分离和纯化蛋白质，所述方法包括，但不限于，层 析(例如，离子交换、亲和、大小排阻、和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、 离心，或者差别溶解度、乙醇沉淀或者通过任何其他可利用的用于纯化蛋 白质的技术(见例如，Scopes，Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition，Springer-Verlag，New York，1987；Higgins，S.J.and Hames， B.D.(eds.)，Protein Expression：A Practical Approach，Oxford Univ Press， 1999；and Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(eds.)，Guide to Protein Purification：Mcthods in Enzymology(Methods in Enzymology Series，Vol 182)，Academic Press，1997，都完整引入本文作为参考)。具体 对于免疫亲和层析，通过将蛋白质结合到亲和柱可以分离该蛋白质，所述 亲和柱包含针对该蛋白质产生并且附着到固定支持体的抗体。可以通过标 准重组技术将亲和标记如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或者谷胱甘肽S-转 移酶连接到蛋白质以允许通过穿过合适的亲和柱容易地纯化。可以在任一 或所有阶段加入蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑酶醛肽、胃蛋 白酶抑制剂或抑酶肽以便在纯化方法中减少或消除多肽或蛋白质的降解。 当细胞必须被裂解以便分离和纯化所表达的多肽或蛋白质时，蛋白酶抑制 剂是尤其有利的。
根据本发明的一些方法表达的蛋白质与它们生长在非本发明细胞培 养条件下相比将具有更广泛和/或修饰的糖基化模式。从而，可以在纯化步 骤利用的本发明的一个实际的益处是根据本发明的一些发明性方法和/或 组合物生长的糖蛋白上存在的额外的和/或修饰的糖残基可以赋予其不同 的生物活性性质，其与根据非发明性方法和/或组合物生长的糖蛋白相比， 可以由专业人员用于更容易地纯化糖蛋白，或者纯化至更高纯度。
本领域技术人员将理解确切的纯化技术可以取决于待纯化的多肽或 蛋白质的特征、待表达多肽或蛋白质的细胞的特征和/或用于生长细胞的培 养基的组成而变。
药物制剂
可以在可药用载体或赋形剂存在下将本发明的蛋白质制剂配制为药 物组合物。如本文所述的含有蛋白质制剂的组合物可以施用于受试者或者 可以首先配制用于通过任何可利用的途径递送，所述途径包括但不限于肠 胃外、静脉内、肌内、皮内、皮下、经口、口含、舌下、经鼻、支气管、 眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。本发明的药物组合物通常包 括从哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽或蛋白、递送试剂(例如，如上述的 阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、表面活性剂等等)与可药用载体的组合。 如本文所用，术语“可药用载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、 包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。补充性活性化合物 也可以掺入本发明的组合物中。例如，根据本发明产生的蛋白质或多肽可 以缀合到用于全身药物疗法的药物，如毒素、低分子量细胞毒性药物、生 物学应答改变剂，和放射性核素(见例如，Kunz等人，Calicheamicin derivative-carrier conjugates，US04/0082764 A1)。可用于制备根据本发明 的药物组合物的额外成分包括，例如，调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、 填充剂、助流剂、压缩助剂、黏合剂、片剂崩解剂、封装材料、乳化剂、 缓冲剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透 调节剂(osmo-regulators)，或其组合。
备选或额外地，根据本发明产生的蛋白质或多肽可以与一种或多种额 外的药学活性剂(同时或者顺序)组合施用。这些药学活性剂的示例性列表 可以见医师案头参考(Physicians’Desk Reference)第55版(Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，NJ，2001出版，引入本文作为参考)。对于 许多这些列出的活性剂，药物有效剂量和方案是本领域已知的；许多在医 师案头参考中给出。
固体药物组合物可以含有一种或多种固体载体，和任选地一种或多种 添加剂，如调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩助 剂、黏合剂或片剂崩解剂或封装材料。合适的固体载体包括例如，磷酸钙、 硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡或者离子交换树脂，或者其组 合。在粉状药物组合物中，载体可以是细分的固体，其与细分的活性成分 混合。在片剂中，活性成分通常与具有必要的压缩性质以合适的比例混合， 并且任选与其他添加剂混合，并压制成所希望的形状和大小。
液体药物组合物可以含有根据本发明表达的多肽或蛋白质和一种或 多种液态载体以形成溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂、或加压的组 合物。可药用液态载体包括例如，水、有机溶剂、药学活性油或脂肪，或 者其组合。液态载体可以含有其他合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、 缓冲剂、防腐剂、增甜剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节 剂、稳定剂或渗透调节剂或者其组合。如果液体制剂预期用于儿科用途， 那么通常希望避免包括酒精或限制其用量。
适于经口或肠胃外施用的液态载体的实例包括水(任选含有添加剂， 如纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠)，醇或它们的衍生物(包括一元醇 或多元醇，如二醇)或油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施 用，载体也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。用于加压组合 物的液态载体可以是卤代烃或其他可药用喷射剂。
为无菌溶液剂或混悬剂的液体药物组合物可以肠胃外施用，例如，通 过肌内、腹膜内、硬膜外、鞘内、静脉内或皮下注射施用。用于经口或经 粘膜施用的药物组合物可以为液体或固体组合物的形式。
在一些实施方案中，将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。 用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可以包括下面的组分：无 菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇 或者其他合成的溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化 剂，如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如 乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。 可以用酸或碱，如盐酸或者氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂封装在 安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制造的多剂量瓶中。
适于注射使用的药物组合物通常包括无菌水溶液(其中水可溶的)或者 分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施 用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF， Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物将是无菌的 并且应该是流动的，达到容易注射的程度。有利地，某些药物制剂在生产 和保存条件下是稳定的并且必须保存以抗微生物如细菌和真菌的污染作 用。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，含有例如，水、乙醇、多元 醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，和其合适的混合物。例如， 通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通 过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂可 以实现防止微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸 酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在一些情况下，将有用的 是在组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。 通过在组合物中包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注 射组合物的吸收。
通过在合适的溶剂中以所需量掺入纯化的多肽或蛋白质与(如果需要) 上面列举的成分之一或者组合，接着通过过滤除菌，可以制备无菌注射溶 液。通常，通过在含有基本分散介质的无菌载体中掺入从哺乳动物细胞系 表达的纯化的多肽或蛋白质和来自上面列举的那些的所需其他成分可以 制备分散体。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，有利的制备 方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉末加上来自其以前无菌 过滤溶液的任何额外的所希望成分。
经口组合物一般包括惰性稀释剂或者可食用的载体。对于经口治疗施 用的目的，所纯化的多肽或蛋白质可以掺入赋形剂并以片剂、含片、或胶 囊剂，如明胶胶囊剂的形式使用。使用液体载体也可以制备用作例如漱口 水的经口组合物。可以包括药学上相容的黏合剂和/或佐剂物质作为组合物 的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片等等可以含有任一种下面的成分，或 者类似性质的化合物：黏合剂，如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂， 如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、Primogel或者玉米淀粉；润滑剂，如硬 脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；增甜剂，如蔗糖或糖精； 或者调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或者橙子调味剂。如果希望，此类制 剂可以是混合的可咀嚼的或液体制剂或者食物材料或液体，例如以方便施 用于儿童、施用于吞咽片剂的能力减弱的个体，或者施用于动物。用于经 口递送的制剂可以有利地掺入试剂以提高在胃肠道内的稳定性和/或增强 吸收。
对于通过吸入施用，包含从哺乳动物细胞系表达的蛋白质制剂和递送 试剂的发明性组合物也可以鼻内或通过吸入施用并且方便地以干粉吸入 器或者来自加压的容器、泵、泵式喷雾器(atomiser)、喷雾器或雾化器 的气雾剂喷雾的形式递送，使用或不使用合适的喷射剂，例如，二氯二氟 甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷，如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-五氟丙烷(HFA 227EATM)、二氧化碳或者其他合适 的气体。对于加压的气雾剂的情况，通过提供阀门以递送计量的，例如， 治疗有效量来确定剂量单位。本发明尤其设想使用鼻喷雾器、吸入器递送， 或直接递送到上呼吸道和/或下呼吸道。已经表明鼻内施用针对流感病毒产 生的DNA疫苗诱导CD8 T细胞应答，表明当通过该途径递送时，呼吸道 中的至少一些细胞可以摄入DNA，并且本发明的递送剂将增强细胞摄入。 根据一些实施方案，将包含从哺乳动物细胞系表达的纯化多肽和递送剂的 组合物配制为用于气雾剂施用的大孔颗粒。
经修饰的释放和脉冲式释放口服剂型可以含有作为释放速率修饰剂 的赋形剂，这些被包衣在装置体的上面和/或内部。释放速率修饰剂包括， 但不仅仅限于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤 维素、乙酸纤维素、聚氧乙烯、黄原胶、卡波姆、季胺基甲基丙烯酸酯共 聚物(ammonio methacrylate copolymer)、氢化蓖麻油、巴西棕榈蜡、石蜡、 纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸 共聚物和其混合物。经修饰的释放和脉冲式释放口服剂型可以含有一种释 放速率修饰赋形剂或其组合。释放速率修饰赋形剂可以存在于剂型内，即 基质内，和/或剂型上，即在表面或包衣上。
通过经粘膜或经皮方式可以进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用， 在制剂中使用适于待穿透的屏障的穿透剂。此类穿透剂是本领域公知的， 并且对于经粘膜施用，包括例如，去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通 过使用鼻喷雾器或栓剂也可以实现经粘膜施用。对于经粘膜施用，可以将 纯化的多肽或蛋白质和递送剂配制为合适的软膏剂，其含有悬浮或溶解在 例如具有如下一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体矿脂、 白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。备选地，可以 将它们配制为合适的洗剂或乳膏，悬浮或溶解在例如如下一种或多种的混 合物中：矿物油、失水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、失水山 梨醇聚氧乙烯(20)醚硬脂酸酯、鲸酯蜡、十六/十八醇、2-辛基十二烷 醇、苯甲醇和水。
备选地，化合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以以 凝胶剂、水凝胶、洗剂或其他甘油酯、溶液剂、霜剂、软膏剂或爽身粉的 形式局部应用。
在一些实施方案中，用载体制备组合物，所述载体将保护蛋白质免于 从身体快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。通常，可 以配制本发明的组合物用于立即、延迟、改变的、持续、脉冲或控释递送。 可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、 聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法将是本领域技 术人员显而易见的。合适的材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc通过商业途径获得。脂质体混悬剂(包括用抗病毒抗 原的单克隆抗体靶定受感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。这些 可以根据本领域技术人员已知的方法制备，如美国专利号4,522,811中所 述。
根据本发明产生的蛋白质也可以与环糊精组合使用。已知环糊精与某 些分子形成包含和非包含复合物。环糊精复合物的形成可以改变蛋白质或 多肽的溶解度、溶解速率、生物利用率和/或稳定性。环糊精复合物通常用 于多数剂型和施用途径。作为与蛋白质或多肽的直接复合作用的备选方 案，环糊精可以用作辅助添加剂，例如作为载体、溶剂或增溶剂。α、β和 γ环糊精是最常用的并且合适的实例描述于公开的国际专利申请 WO91/11172、WO94/02518和WO98/55148中。
在一些实施方案中，以单位剂型，如片剂或胶囊剂提供本发明的药物 组合物。为了容易施用和剂量的均一性，有利的是以单位剂型配制经口或 肠胃外组合物。在此类形式中，将组合物细分为含有合适量多肽或蛋白质 的单位剂量。单位剂型可以是包装的组合物，例如，包装的粉剂、小瓶、 安瓿、预填充的注射器或者含有液体的囊剂。单位剂型可以例如自身是胶 囊剂或片剂，或者它可以是合适数目的包装形式的任何此类组合物。如本 领域技术人员将认识到的，治疗有效单位剂量将取决于一些因素，包括例 如，施用方法、多肽或蛋白质的功效，和/或接受者的体重和药物组合物中 其他组分的特性。
蛋白质制剂，例如，含有其的药物组合物，可以以所需的不同间隔 和在不同时间期限内施用，如每周一次持续约1到10周、2到8周、约3 到7周、约4、5或6周等等。技术人员将理解某些因素可以影响有效治疗 受试者所需的剂量和时限，包括但不限于受试者的疾病或病症的严重性、 以前的治疗、一般健康状况和/或年龄，和存在的其他疾病。通常，用如本 文所述的多肽或蛋白质对受试者的治疗可以包括单一治疗，或者一系列治 疗。还理解合适的剂量可以取决于多肽或蛋白质的效力并且可以任选为具 体接受者定制，例如，通过施用增加的剂量直到实现预先选择的所希望的 应答。将理解任一具体动物受试者的特定剂量水平可以取决于多种因素， 包括使用的具体多肽或蛋白质的活性、受试者的年龄、体重、一般健康、 性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、任何药物组合，和待调节 的表达或活性的程度。
本发明包括使用本文所述的组合物治疗非人动物。因此，可以根据兽 医药理学和医学中已知的原理选择施用剂量和方法。教导可以见例如 Adams，R.(ed.)，Veterinary Pharmacology and Therapeutics，第八版， Iowa State University Press；ISBN：0813817439；2001。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或者分配器中。
下面的实施例是阐明性的并且不意在限制。
实施例
通过静态光散射、动态光散射和不对称流场流分级法评估在不同的盐 浓度，即不同的离子强度下的抗体M1-M3的溶液。
抗体溶液制备
通过在室温下透析到合适的含盐缓冲液过夜，进行两次缓冲液更换来 制备所有溶液。
仪器方法：
静态光散射
用静态光散射(SEC-MALS)测量抗体溶液的重量平均分子量。对于静 态光散射实验，将抗体溶液稀释到4mg/mL并将多个样品手工注射到仪器 中。使用来自Wyatt Technology的Mini Dawn仪器用静态光散射在多个 角度(45，90和135)下20℃下测量抗体溶液。90°的散射数据用于计算重量 平均分子量。完整数据集(多个角度)用于产生齐姆图，其用于计算分子 量和第二维里系数。
动态光散射
用动态光散射测量溶液中抗体的颗粒大小。使用Wyatt Technology的 DynaPro仪器在25℃ 90°角度下测量抗体溶液。
不对称流场流分级法
不对称流场流分级法(AF4)也用于测量溶液中抗体的颗粒大小。在 Wyatt Technology的Eclipse仪器上进行AF4测量。AF4分析参数如下： 温度20℃，运行缓冲液与透析缓冲液相同，10KDa截留膜(cutoff membrane)。
光密度
使用SpectraMax UV-Vis在400nm波长下测量蛋白质样品的浊度作为 表观光密度(特定波长下的吸光度)。
实施例1：IgG1抗体M1(Myo-029)的分析
取决于盐浓度，即离子强度，抗体M1溶液显示出大的乳光效应。图 1显示了在约20mg/mL蛋白质的浓度下，随着浓度从0mM NaCl升高到 150mM NaCl，乳光发生了视觉上可感知的改变。也通过动态光散射分析 了从0mM NaCl到100mM NaCl的抗体M1溶液，将样品稀释到约5 mg/mL。表1中显示了收集的数据。图1显示了暴露于渐增的NaCl浓度 下抗体M1(在本文中也称作“Myo-029”)溶液的图像(显示了视觉上可感知 的乳光增加)。
图2显示了0mM NaCl溶液和100mM NaCl抗体M1溶液的动态光 散射图，其数据包括在表1中。
表1：抗体M1的动态光散射数据
a25mM和50mM溶液显示出相分离，具有顶层和底层。两层都含有 抗体。
峰2和峰3种类的质量％的增加与图1中视觉上可感知的乳光的增加 相关。0mM NaCl溶液中峰3的存在表明对于抗体M1，即使在低盐浓度 下也存在少量乳光种类。
抗体M1(20mg/mL蛋白质)的100mM NaCl溶液的不对称流场流 分级法表明如图3中所示的大种类。对于抗体M1的类似的100mM NaCl 溶液，SEC-HPLC(稀释到3mg/mL的样品)不能区分任何大的种类，如 图4所示。
也检查了抗体M1的乳光效应的可逆性。将抗体M1溶液从0mM NaCl 透析到100mM NaCl，然后再透析到0mM NaCl。将抗体M1过夜透析到 100mM NaCl溶液(最初在无盐的溶液中)，然后100mM Na Cl下的少量 该物质过夜透析到无盐溶液中。图5显示了这三种抗体M1溶液的乳光的 视觉上可感知的改变。图6显示了乳光的100mM NaCl中间透析溶液以及 0mM NaCl最终透析溶液的动态光散射图。
这些数据表明抗体M1含有极大的种类，尽管在0mM NaCl下该种类 仅仅以相对少量存在，并且该大种类的浓度随着盐浓度升高而升高。数据 也表明使用不对称流场流分级法可以分辨该大种类，但是该大种类太大而 不能在SEC-HPLC柱上分辨，被柱床破坏或者在稀释时被破坏。幸运的 是，使用如所示的动态光散射可以分辨和分析该大种类。
实施例2：IgG1抗体M2的分析
抗体M2溶液在皮下抗体给药相关的浓度范围内不显示出大的乳光。 图7显示了在约20mg/mL蛋白质下，随着浓度从0mM NaCl升高到150 mM NaCl，乳光没有视觉上可察觉的改变。也通过动态光散射在约5mg/mL 蛋白质下分析了0mM NaCl和150mM NaCl的抗体M2溶液。表2中显 示了收集的动态光散射数据。图8显示了0mM NaCl溶液和150mM NaCl 抗体M2溶液的动态光散射图，其数据包括在表2中。
表2：抗体M2的动态光散射数据
a仅仅为了与表1比较而包括“峰2”。
这些数据表明在与皮下给药相关的浓度范围内，抗体M2没有可感知 量的乳光种类。实际上，峰3质量百分数仅仅在150mM NaCl水平升高到 0mM NaCl下抗体M的质量百分数水平。
实施例3：抗体M3的分析
在所评估的浓度范围内，抗体M3溶液不显示出大的乳光效应。通过 动态光散射在约5mg/mL下分析0mM NaCl和150mM NaCl的抗体M3 溶液。收集的动态光散射数据在表3显示。
图9显示了0mM NaCl溶液和150mM NaCl抗体M3溶液的动态光 散射图，其数据包括在表3中。
表3：抗体M3的动态光散射数据
a仅仅为了与表1比较而包括“峰2”。
这些数据表明在评估的浓度范围内，抗体M3没有可感知量的乳光种 类。实际上，峰3质量百分数仅仅在150mM NaCl水平升高到仅高于0mM NaCl下抗体M1的质量百分数水平。
实施例4：第二维里系数评估
用静态光散射测定实施例1-3中分析的抗体(抗体M1、抗体M2和 抗体M3)的分子量和第二维里系数(A2)。使用静态光散射和齐姆分析 可以进行第二维里系数测量。通过将多个稀释的蛋白质样品手工注入光散 射系统进行该实验。使用这些多个测量和精确的浓度，可以构建齐姆图。 这些数据在表4中显示。
表4：从静态光散射数据计算的分子量和第二维里系数数据
样品 MW(kDa) A2[mol-mL/g2] 抗体M1 (0mM NaCl) 131 -3.62x-4 抗体M1 (100mM NaCl) 130 -2.41x-3 抗体M2 (0mM NaCl) 149 3.29x-4 抗体M2 (150mM NaCl) 148 6.77x-4 抗体M3 (0mM NaCl) 181 2.05x-3 抗体M3 (150mM NaCl) 156 1.29x-3
第二维里系数数据表明与抗体M2和抗体M3相比，抗体M1的聚集/ 缔合倾向，即，负的第二维里系数，抗体M2和抗体M3具有正的维里系 数。图10显示了100mM NaCl下抗体M1的第二维里系数图，图11显示 了150mM NaCl下，从0.1到1.1mg/mL蛋白质的浓度范围内抗体M2的 第二维里系数图。这些数据表明第二维里系数可以用作具体抗体的乳光的 预测因子。
实施例5：盐特性和浓度对抗体M1中乳光的影响
为了评估盐特性对抗体M1的乳光的影响，进行了几个实验。
随时间的过去乳光随盐特性的改变：
制备了四种63mg/mL抗体M1溶液：没有盐的对照溶液，具有100mM NaHPO4的溶液，具有100mM NaCl的溶液，和具有100mM CaCl2的溶 液。然后让这些溶液在室温下静置1小时。1小时后这些溶液的图像在图 12中显示。如可以在图12中看出，1小时后乳光的顺序为NaCl>NaHPO4 >CaCl2。该图像也表明乳光不是仅仅与氯离子的存在有关，例如，NaHPO4 溶液发生了乳光。
然后将这些相同的溶液在2-8℃保持2周。两周后这些溶液的图像在 图13中显示。图13中所示的这些溶液的每一种显示了在2-8℃两周后的 胶凝作用并且发生了乳光。然而，胶凝作用和乳光的程度是依赖盐类型和 浓度的。乳光的顺序与1小时后的相同：NaCl>NaHPO4>CaCl2。也检 测了并且这次没有显示的是盐MgCl2，其满足如下顺序：
NaCll>NaHPO4>MgCl2>CaCl2。
乳光随盐特性和温度循环改变：
400nm下光密度的改变用于监测在温度循环期间盐特性对乳光的影 响。对于该实验，制备了四种40mg/mL抗体M1溶液：没有盐的对照溶 液，具有100mM NaHPO4的溶液，具有100mM NaCl的溶液，和具有 100mM CaCl2的溶液。这些溶液从2-8℃循环到室温，进行三个循环。每 个循环从2-8℃到室温并返回到2-8℃，需用24小时。在图14中显示了 OD400nm对循环数的图。例如，对于NaCl溶液，增加OD400nm值表 明增加形成二级结构。从而，图14中的数据表明液体和凝胶之间的循环可 能增加了乳光。
乳光随盐特性和浓度的改变：
对于盐浓度的改变，通过SEC-HPLC监测高分子量改变百分数。对 于该实验，制备0、5、10和20mM浓度的CaCl2、NaCl、MgCl2和NaHPO4 溶液。为每个样品测量高分子量物质百分数。图15中显示了高分子量百分 数对浓度的图。高分子量种类百分数对于除了CaCl2之外的每种盐都增加。
光密度随盐特性和浓度的改变：
400nm下的光密度改变用于监测盐特性和浓度对乳光的影响。对于该 实验，使用MgCl2、CaCl2和NaCl盐制备了一系列抗体M1溶液。在图 16中显示了OD400nm对盐浓度的图。图17显示了图16中数据的扩展区。 该数据表明高分子量种类在升高NaCl浓度时增加并且对于CaCl2和 MgCl2仅有轻微增加。
在20mM CaCl2中光密度相对于抗体M1浓度的改变：
最后，400nm下光密度的改变用于监测在20mM CaCl2溶液中改变 抗体M1浓度的影响。对于该实验，用20mM CaCl2制备了10、20、50、 60和75mg/mL的抗体M1溶液。在图18中显示了OD400nm对抗体M1 浓度的图。这些数据表明较高级结构随着升高抗体M1浓度而增加。
关于实施例5的所有数据进行了一些观察。乳光效果是以下面的方式 依赖于盐的：NaCl>Na2PO4>MgCl2>CaCl2。对于给定蛋白质浓度，随 着升高盐浓度，乳光将最初增加然后达到平稳状态或者下降。乳光随着蛋 白质浓度增加。所有评估的盐都在2-8℃胶凝了抗体M1并且胶凝作用的 时机是依赖于盐的并且似乎与乳光的水平相关。
用于本发明的抗体优选是抗体M1(在本文中也称作“Myo-029”)、抗 体M2和抗体M3。其中将根据本发明降低或减小抗体制剂(优选含有抗 体M1、抗体M2或抗体M3)的离子强度时，通常进行离子强度的降低或 减小使得离子强度与抗体浓度的比例减小。
将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献完整引入 本文作为参考。
其他实施方案在下面权利要求的范围内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 金属氧化物和金属硫属化物以及混合金属氧化物与硫属化物的热力学溶液 | 2020-05-14 | 378 |
| 一种检测真菌多糖的方法 | 2020-06-03 | 389 |
| 陶瓷浆组合物及其制造方法 | 2020-05-29 | 569 |
| 一种检测真菌多糖的方法 | 2020-05-31 | 156 |
| 一种制备炭黑的风-燃比的控制方法及系统 | 2020-05-22 | 356 |
| 一种适用于80K-400K温区的相平衡测量装置 | 2020-05-11 | 229 |
| 一种气枪子波模拟方法 | 2020-05-13 | 991 |
| 改变抗体溶液中离子强度以减少乳光/聚集物 | 2020-05-19 | 801 |
| 确定样品扩散特性的方法和装置 | 2020-06-01 | 651 |
| 聚酰亚胺薄膜 | 2020-05-24 | 945 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈