包括CDK抑制剂和顺铂的联合
阅读：720发布：2020-05-13
专利汇可以提供包括CDK抑制剂和顺铂的联合专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的第一方面涉及包括CDK 抑制剂 和 顺铂 的联合。本发明的第二方面涉及包括CDK抑制剂和顺铂的药物制品，作为在 治疗 中同时、依次或分别使用的联合制剂。本发明的第三方面涉及治疗增殖性 疾病 的方法，所述方法包括同时、依次或分别地为患者 给药 CDK抑制剂和顺铂。，下面是包括CDK抑制剂和顺铂的联合专利的具体信息内容。
1.一种联合，包括CDK抑制剂和顺铂。
2.根据权利要求1所述的联合，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4 的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的联合，其中CDK抑制剂选自roscovitine、 purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
4.根据任一前述权利要求所述的联合，其中CDK抑制剂为roscovitine。
5.一种药物组合物，包括根据任一前述权利要求所述的联合和药物可 接受载体、稀释剂或赋形剂。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的联合在制备治疗增殖性疾病的 药物中的用途。
7.一种药物制品，包括CDK抑制剂和顺铂，作为在治疗中同时、依 次或分别使用的联合制剂。
8.根据权利要求7所述的药物制品，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4 的抑制剂。
9.根据权利要求7或8所述的药物制品，其中CDK抑制剂选自 roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的药物制品，其中CDK抑制剂 为roscovitine。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的药物制品，用于在治疗中分 别或依次使用，其中依次给药顺铂和CDK抑制剂。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的药物制品，以包括药物可接 受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式存在。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的药物制品，用于治疗增殖性 疾病。
14.根据权利要求13所述的药物制品，其中增殖性疾病为癌症。
15.根据权利要求14所述的药物制品，其中癌症为前列腺癌或间皮瘤。
16.根据权利要求15所述的药物制品，其中间皮瘤为肺癌。
17.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地为 患者给药CDK抑制剂和顺铂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4 的抑制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中CDK抑制剂选自roscovitine、 purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
20.根据权利要求19所述的方法，其中CDK抑制剂为roscovitine。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中相对于单独成分， 分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和顺铂。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中相对于单独成分， 分别给药亚治疗量的CDK抑制剂和顺铂。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中增殖性疾病为癌 症。
24.根据权利要求23所述的方法，其中癌症为前列腺癌或间皮瘤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中癌症为肺癌。
26.CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治 疗包括同时、依次或分别地为患者给药CDK抑制剂和顺铂。
27.CDK抑制剂和顺铂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
28.CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药 物用于与顺铂联合治疗。
29.顺铂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述药物用于与 CDK抑制剂联合治疗。
发明领域
发明背景
哺乳动物细胞周期的启动、进行和结束受对细胞生长至关重要的各种细 胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物的调控。这些复合物包括至少一种催化 亚基(CDK自身)和一种调节亚基(细胞周期蛋白)。对细胞周期调控的一些比 较重要的复合物包括细胞周期蛋白A(CDK1-也称为cdc2，和CDK2)、细胞 周期蛋白B1-B3(CDK1)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白 D1-D3(CDK2，CDK4，CDK5，CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期 蛋白K和T(CDK9)和细胞周期蛋白H(CDK7)。这些复合物中的每一种涉及 细胞周期的特定期。
通过与其它蛋白的短暂缔合以及它们细胞内定位的变化，CDK的活性 在翻译后被调节。肿瘤发展与基因改变和CDK及其调节剂的下调密切相关， 这表明CDK抑制剂可为有用的抗癌治疗药。实际上，早期结果表明转化细 胞和正常细胞在它们对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求上有差别，因而 有可能开发出新的抗肿瘤药，没有常规细胞毒性和细胞抑制药物所观察到 的常见宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或去激活特定蛋白，包括例如成视网 膜细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的成分。由CDK 介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酰-转移反应。已发现几类 化合物(在例如N.Gray，L.D étivaud，C.Doerig，L.Meijer，Curr.Med.Chem. 1999，6，859中有总结)因由于CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖性 能。
Roscovitine为化合物6-苄氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羟基乙基氨基]-9-异丙基 嘌呤。Roscovitine已被证实为细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是CDK2的有 效抑制剂。这种化合物当前正被开发成抗癌药。CDK抑制剂被认为阻断了 细胞周期G2/M期的细胞途径。
众所周知，本领域中经常联合给予活性药剂以使治疗方案最佳。
例如，文献报道联合长春瑞宾和顺铂能提高晚期非小细胞肺癌患者的存 活率超过单独利用顺铂得到的存活率[Oncology News International，第7卷 第11期，1998年11月]。其它研究报道了使用紫杉醇和顺铂的联合治疗晚 期卵巢癌[Trent Institute for Health Services Research，Universities of Leicester，Nottingham and Sheffield，1997，Guidance Note 97/05]，和顺铂和 肾上腺素的联合治疗原发性肝癌[Oncology，第14卷第1期，2000年1月]。 联合治疗的其它例子包括使用顺铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗局部头颈癌 [Hunis等人；Proc.Annu.Meet.Am.Soc.Clin.Oncol；13：A921，1994]，和 使用顺铂与拓优得(tomudex)、左亚叶酸和5-FU治疗局部晚期或转移性头颈 癌[Caponigro等人；Proceedings of the 1999 AACR NCI EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics，作为Clinical Cancer Research的增刊出版，第5卷，1999年11月，ISSN 1078-0432]。
本发明设法提供已知药剂的新型联合，该联合尤其适于治疗增殖性疾 病，尤其是癌症。更具体地，本发明集中于与联合使用特定药剂有关的令 人惊奇和出乎意料的效果。
发明概述
第一方面，本发明提供包括CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物 的联合。
第二方面提供包括根据本发明的联合与药物可接受载体、稀释剂或赋形 剂混合的药物组合物。
第三方面涉及根据本发明的联合在制备治疗增殖性疾病的药物中的用 途。
第四方面涉及包括CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物的药物制 品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
第五方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别 为患者给药CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物。
第六方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其 中所述治疗包括同时、依次或分别为患者给药CDK抑制剂和顺铂或其衍生 物或前体药物。
第七方面涉及CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物在制备治疗增 殖性疾病的药物中的用途。
第八方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其 中所述药物用于与顺铂或其衍生物或前体药物的联合治疗。
第九方面涉及顺铂或其衍生物或前体药物在制备治疗增殖性疾病的药 物中的用途，其中所述药物用于与CDK抑制剂的联合治疗。
详细描述
药物联合的效果本质上是不可预料的，经常存在一种药物部分或完全抑 制另一种药物的效果的倾向。本发明基于令人惊奇的发现，即同时、分别 或依次联合给药顺铂和roscovitine不会导致两种药剂之间的任何有害相互 作用。出人意料的这种拮抗相互作用的缺乏对临床应用至关重要。
在优选的实施方案中，与分别给药的任何一种药物相比，顺铂和 roscovitine的联合能产生增强的效果。这种发现的令人惊奇特性与根据现有 技术预料的大不相同。
下面阐述的优选实施方案适用于本发明的所有上述方面。
化合物顺-二氨二氯铂(II)，通常称为顺铂或顺-DDP，是已知的在临床尤 其睾丸癌治疗中广泛使用的抗癌药。分子结构相对简单，由处于顺式位置 的两个氯配体和两个NH3配体组成，形成环绕中心铂原子的四角形(正方形) 平面结构。顺铂以电中性、四配位铂络合物的形式存在。但是，研究表明 二水合(活化)形式促进与DNA的结合。
通常以无菌盐水溶液的形式静脉给药顺铂到血流中。由于血流中氯化物 浓度高，因此药物完整保持其中性形式。然后其通过扩散进入细胞，在那 里由于细胞内氯化物浓度低很多而发生水解。水解将中性分子转变成活化 水合络合物，其中两个氯化物配体都被水分子替代产生带正电荷的物种。 活化形式为双官能亲电子剂，其能与DNA碱基对发生亲核取代。
顺铂具有类似于双官能烷化剂的生物化学性质，在DNA中产生链间、 链内和单官能加合物交联。最普遍的形式是1，2-链内交联。在这种加合物中， 铂共价地结合到相邻嘌呤碱的N7位上。因此，DNA未解旋并向大沟弯曲。 其它铂-DNA加合物包括单官能和1，3-和更长范围的链内、链间和蛋白质 -DNA更联。
研究表明大多数加合物涉及鸟嘌呤残基，因为这些提供了氢与胞嘧啶键 合的三个位点，从而与腺嘌呤和胸腺嘧啶之间可能的两个氢键相比能产生 更大的稳定性。顺铂-DNA加合物的形成使DNA结构扭曲，这又导致复制 和转录的中断。另外，顺铂-DNA加合物的形成通过阻断和减缓修复蛋白， 或消极地改变核苷酸剪切修复(NER)蛋白尤其是XPA的功能来破坏细胞修 复自身的能力。
CDK抑制剂优选为CDK2和/或CDK4的抑制剂。CDK抑制剂更优选 选自Roscovitine、Purvalanol A、Purvalanol B、奥罗莫星和其它2，6，9-三取 代的嘌呤，如WO 97/20842、WO 98/05335(CV Therapeutics)、WO 99/07705(Regents ofthe University of California)中所述。CDK抑制剂甚至更 优选选自Roscovitine和Purvalanol A。还更优选地，CDK抑制剂为 Roscovitine。
本文使用的术语“增殖性疾病”在广泛意义上包括任何需要控制细胞周 期的疾病，例如心血管疾病如再狭窄和心脏病、自身免疫性疾病如肾小球 肾炎和类风湿性关节炎、皮肤病如牛皮癣、抗炎性、抗真菌、抗寄生虫疾 病如疟疾、气肿和脱发病。在这些疾病中，本发明的化合物可按照需要在 所需的细胞内诱导凋亡或保持停滞。优选地，增殖性疾病为癌症或白血病， 更优选为癌症。
在一种优选实施方案中，癌症为睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、头颈 癌、胃癌、食道癌、子宫癌、淋巴瘤癌、肉瘤癌、黑素瘤癌、间皮瘤癌或 前列腺癌。
在更优选的实施方案中，癌症为肺癌。
在另一尤其优选的实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。还更优 选地，癌症为IIIB/IV期非小细胞肺癌。
在尤其优选的实施方案中，本发明涉及上文所述的联合在治疗CDK依 赖性或敏感性疾病中的应用。CDK依赖性疾病与一种或多种CDK酶的超过 正常活性水平有关。这类疾病优选与CDK2和/或CDK4的异常活性水平有 关。CDK敏感性疾病为CDK水平的失常不是主因而是下游初级异谢失常导 致的疾病。在这种情况下，CDK2和/或CDK4被认为是敏感性代谢途径的 一部分，CDK抑制剂可因此在治疗这类疾病中有活性。这类疾病优选癌症 或白血病。
本文使用的术语“药物制备”包括本发明的成分除了用于这类药物制备 的任意阶段外还有直接作为药物的应用。
如上所述，本发明的一个方面涉及包括CDK抑制剂和顺铂的药物制品， 作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
本文中使用的“同时”是指同时地给药两种药剂。
本文中使用的术语“依次”是指在时限内在为患者给药联合制剂中的一 种成分后为其给药另一种成分，以致于它们均在同一时限内起治疗作用。 因此，依次给药可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时内给药 另一种药剂，只要第一种给药药剂的循环半衰期能使二者同时以治疗有效 量存在即可。给药成分间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用 和它们各自的半衰期而改变。
本文使用的术语“分别”是指给药一种药剂和另一种药剂之间的间隔是 明显的，即当给药第二种药剂时，在血流中可不再存在治疗有效量的第一 种给药药剂。
在本发明的一种优选实施方案中，与顺铂依次或分别地给药CDK抑制 剂。
在一种优选实施方案中，在CDK抑制剂前给药顺铂。优选地，在CDK 抑制剂前至少1小时给药顺铂，还更优选在CDK抑制剂前至少24小时。
在另一种优选实施方案中，在顺铂前给药CDK抑制剂。优选地，在顺 铂前至少4小时给药CDK抑制剂，还更优选在顺铂前至少72小时。
在另一种优选实施方案中，同时给药CDK抑制剂和顺铂。
在一种优选实施方案中，对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK 抑制剂和顺铂；换句话说，即使不是以联合给药的方式，CDK抑制剂和顺 铂也是以治疗有效量给药。
在另一种优选实施方案中，对于单独成分，分别给药亚治疗量 (sub-therapeutic amount)的CDK抑制剂和顺铂；换句话说，如果不是联合给 药给药， CDK抑制剂和顺铂不是以治疗有效量给药。
优选地，顺铂和CDK抑制剂以协同方式相互作用。本文使用的术语“协 同”是指顺铂和CDK抑制剂在联合使用时能产生比由两种组分的单独效应 相加预料到的效应更大的效应。有利地，协同相互作用可允许较低剂量的 每种组分被给药于患者，从而降低化疗的毒性，同时产生和/或保持相同的 疗效。因此，在尤其优选的实施方案中，可以亚治疗量给药每种组分。
在所附实施例中详细描述了支持协同相互作用的证据。
盐/酯
本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。
本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱加成盐。合适 药物盐的综述可见Berge等人的J.Pharm Sci， 66，1-19(1977)。盐为与例如以 下酸形成的盐：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机 羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸； 饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、 邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基 乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳 基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包 括羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如 乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、 富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙 酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳 基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如 氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤 代)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体
本发明还适当地包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技 术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的 化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变 异构体。
立体异构体和几何异构体
本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如 它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以二种或多种立体 异构和/或几何形式存在。本发明包括这些抑制剂药剂所有的单独立体异构 体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些 形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。
本发明还包括药剂或其药物可接受盐的所有合适的同位素变体。本发明 药剂或其药物可接受盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同 原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物 质。可被掺入到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、 氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、 31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和其药物可接受盐的一些同位素变体，例如 结合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研 究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性 而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的代谢稳定性而提 供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一 些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制 备本发明药剂和其药物可接受盐的同位素变体。
溶剂合物
本发明还包括本发明药剂的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括 这些形式。
多晶型物
本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的 药剂。众所周知，在药物工业中可通过稍微改变这种化合物合成制备中所 用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离得到化合物的任意这类形式。
前体药物
本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个 或多个适当基团已被修饰以使在对人或哺乳动物对象给药后所述的修饰可 被逆转的化合物。虽然为了实现体内逆转可与这种前体药物一起给药第二 种药剂，但通常通过在这类对象中天然存在的酶实现这种逆转。这类修饰 的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其 它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
给药
可使本发明的药物组合物适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜 内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、膀胱内、鼻、口腔 或舌下给药途径。
对于口服给药，特别利用压缩片剂、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂 和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有 效成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可经静脉内、动脉内、鞘内、膀胱 内、皮下、皮内、腹膜内或肌内给药，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发 明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳 膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉(dusting poeder)的形式。
经皮给药的替代方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分掺入到由聚 乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效 成分掺入到由白蜡或白色软石蜡基质与所需要的稳定剂和防腐剂共同组成 的软膏内。
可注射形式每剂可包含10-1000mg、优选10-500mg的有效成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量或单元剂量的多重单位或 亚单位的形式的离散部分。
在一种特别优选的实施方案中，静脉内给药本发明的联合或药物组合 物。
剂量
本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定对患者给药的本 发明的组合物的适宜剂量。典型地，医师会确定对个体患者最适合的实际 剂量，并且根据各种因素进行调整，包括使用的具体化合物的活性、化合 物的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、 给药方式和时间、排泄速度、药物联合、特定病症的严重程度和个体正接 受的治疗。本文公开的剂量为一般情况的示例。当然也可有有益的较高或 较低剂量范围个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，可以0.1-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg体重，更优选 2-20mg/kg体重的剂量给药所述药剂。
指导性地，按照医师指导，顺铂一般地以50-100mg/m2体表面积的单一 剂量进行给药，每21-28天静脉内缓慢给药，或者在每21-28天内以 15-20mg/m2体表面积的剂量，每日静脉内缓慢给药，连续5天。施用的剂 量和给药频率一般根据患者的一般体格状况和引起的副作用的严重程度， 尤其是引起造血、神经系统和肾系统的那些副作用的严重程度进行调整。
roscovitine一般以约0.05-约5g/天，优选约0.4-约3g/天给药。roscovitine 优选以片剂或胶囊的形式口服给药。roscovitine的总日剂量可作为单次剂量 给药，或以分散剂量每天给药2、3或4次。
优选地，以0.4-3g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。然后，按认 为最合适的方式以上述适宜剂量给药顺铂。优选地，在给药roscovitine至少 24小时后给药顺铂。
通过实施例并结合以下图进一步描述本发明，其中：
图1A显示了roscovitine联合顺铂在人胸膜间皮瘤(pleuramesothelioma) 异种移植物PXF 1118中的抗癌效力；图1B显示了roscovitine联合顺铂在 人肺癌异种移植物LXFA 629中的抗癌效力。
实施例
使用单层分析测定roscovitine单独和联合顺铂对PC-3前列腺细胞系的 生长抑制活性，和使用肿瘤干细胞分析测定roscovitine单独和联合顺铂对人 胸膜间皮瘤异种移植物PXF 1118和人肺癌异种移植物LXFA 629的生长抑 制活性。
方法和材料
化合物
在DMSO中制备CDK抑制剂(例如roscovitine)的储备溶液并在-20℃下 储存等分试样。使用前即刻在培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium； Life Technologies，Karlsruhe)中制备最终的稀释液。
产克隆分析
由人肿癌异种移植物制备单细胞悬浮液
在无菌条件下切出胸腺发育不全的裸小鼠(NMRI，Naval Medical Research Institute，USA，nu/nu株，得自我们自己的饲养设施)中在皮下连 续传代生长的固体人肿瘤异种移植物，机械分解，随后用酶混合物在37℃ 下孵育30分钟，其中酶混合物由胶原酶(41U/ml，Sigma)、DNAseI(125U/ml， Roche)、透明质酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(Dispase)II(1.0U/ml，Roche) 在RPMI 1640-培养基(Life Technologies)中组成。使细胞通过200μm和50μm 筛的筛，并用无菌PBS缓冲液(Life Technologies)洗涤两次。利用台盼蓝排 斥实验在Neubauer血细胞计数计上测定活细胞的百分比。
培养方法
布根据Hamburger & Salmon[Alley，M.C.，Uhi，C.B.& M.M.Lieber，1982] 介绍的改性双层软琼脂分析以24孔形式上进行产克隆分析(clonogenic assay)。通过使用可代谢的四唑盐改进软琼脂集落形成分析中药物细胞毒性 的检测。Life Sci.31：3071-3078]。底层由0.2ml/孔的Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(补充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)庆大霉素)和 0.75％(w/v)琼脂组成。向补充有0.4％(w/v)琼脂的0.2ml相同培养基中加入 4·104-8·104个细胞，并以24多孔皿形式接种到底层上。通过在0.2ml培养 基中连续暴露(药物覆层)施用细胞抑制药。每个皿包括含有溶媒的6个对照 孔，和6个浓度的三重的药物处理组。在37℃下和有7.5％CO2的湿度气氛 中孵育培养物8-20天，使用倒置显微镜密切监视集落生长。在此期间，体 外肿瘤生长导致直径＞50μm的集落形成。在最大集落形成时，用自动图象 分析系统(OMNICONFASIV，Biosys GmbH)进行计数。在评价前24小时， 用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物的无菌水溶液(1mg/ml， 100μl/孔)[i]染色活集落。
如果满足下面的质量控制标准，则认为分析完全可评价：
-24多孔板的对照组孔中的平均集落数≥20个集落且集落直径＞50μm
-阳性参考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(在1000μg/ml中毒剂量时)必须实现 ＜20％对照的集落存活率
-第0或2天上的初始板计数＜20％的最终对照组计数
-对照组中的变异系数≤50％
数据评价
用存活率百分数表示药物效应，通过比较处理板中的平均集落数和未处 理对照的平均集落计数得到(相对集落计数用试验组对对照组值表示，T/C 值[％])：
IC50和IC70值，分别是抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成 需要的药物浓度，通过绘制化合物浓度对相对集落计数的曲线确定。根据 下式计算平均IC50和IC70值；
平均
其中x为特异性肿瘤模型，n为研究的肿瘤模型总数。如果在试验的剂量范 围内不能确定IC50或IC70值，则使用研究的最低或最高浓度用于计算。
在均值图形分析(IC曲线)中，在个别肿瘤类型中得到的试验化合物的 IC70值分布以相对于对全部试验肿瘤的得到的平均IC70值给出。个别IC70 值表示为对数坐标轴中的条(bar)。条左边显示低于平均值的IC70值(代表较 敏感的肿瘤模型)，条右边显示较高的值(代表有相当抗性的肿瘤模型)。因 此IC曲线反映了化合物抗增殖图的指纹。
试验过程：roscovitine与标准药剂的联合
细胞系
下面表1中显示了6种人肿瘤细胞系的特征。
表1：用于试验roscovitine与标准药剂联合的细胞系 肿瘤形成类型 细胞系 裸鼠中 的组织学 倍增时间 [小时] 体内肿瘤 结肠 肺，NSC 前列腺 DLD1 HT29 LXFA 629L 22RV1 DU145 PC3M adeno ca pd adeno ca 腺癌 nd adeno ca pd adeno ca nd 23 31 40 nd nd 是 是 是 是 是 是
ud＝未分化，pd＝分化不足，md＝中度分化，
wd＝充分分化，mm＝恶性黑素瘤；ND＝未测定
肺癌细胞系LXFA 629L由人肿瘤异种移植物建立，如Roth等人1999 年所述[Roth T，Burger AM，Dengler W，Willmann H，Fiebig HH.Human tumor cell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models for anticancer drug screening.In：Fiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54：145-156]。 Fiebig等人于1992年描述了供体异种移植物源[Fiebig HH，Dengler WA， Roth T.Human tumor xenografts：Predictivity，characterization，and discovery of new anticancer agents.In：Fiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54：29-50]。
细胞系DLD1和HT29(结肠)以及前列腺癌DU145和PC3M得自US-NCI (National Cancer Institute，USA)。
前列腺癌22RV1购自American Type Culture Collection(ATCC)。
按常规每周传代细胞1次或2次。在培养物中保持它们不超过20次传 代。在补充有10％胎牛血清(Sigma，Deisenhofen，Germany)和0.1％庆大霉 素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中于37 ℃下和湿度气氛(95％空气，5％CO2)中培育所有细胞。
细胞增殖分析
使用改性碘化丙啶(propidium iodide)分析评定roscovitine对人肿瘤细胞 系生长的影响[Dengler WA，Schulte J，Berger DP等人(1995).Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay. Anti-Cancer Drugs 1995，6：522-532]。简单地说，通过胰蛋白酶化从指数 生长期培养物中富集细胞，计数并以与细胞系有关的细胞密度(5-12.000活 细胞/孔)接种在96孔平底微量滴定板中。在24小时使细胞重新开始指数生 长的恢复期后，向孔中加入20μl培养基(每板3个对照孔)或包含各种浓度 的试验制品No.1(标准药剂)的培养基。每种浓度一式三份接种。在每个板上， 在微量滴定板的4个区域4次施加5种浓度的试验制品No.1。区域1用于 单独的试验制品No.1，在区域2-4，在3个不同的时间点分别施加试验制品 No.2(roscovitine)。在试验制品连续暴露4天后，用200μl碘化丙啶(PI)水溶 液(7μg/ml)代替有或没有药物的细胞培养基。由于PI只通过渗漏的或细胞溶 解的细胞膜，因此可染色并测量死细胞的DNA，而活细胞不能被染色。为 测量活细胞的比例，通过冷冻板引起全部细胞死亡使细胞透过。在解冻板 后，然后使用Cytofluor 4000微量培养板读数器(激发530nm，发射620nm) 测量荧光，给出与总细胞数的直接关系。生长抑制率表示为处理的/对照 ×100％T/C)，通过绘制化合物浓度对细胞存活率的曲线确定每种联合的 IC50、IC70和IC90值。
结果
在加入顺铂前(-6小时、-4小时、-2小时)、同时(0小时)或后(+2小时、 +4小时、+6小时、+24小时)向细胞中加入roscovitine。Roscovitine联合顺 铂在PCM3中的抗肿瘤活性示于下面的表2。roscovitine以20μM的剂量水 平加入。
表2 PRCL PCM3 -6小时 -4小时 -2小时 0小时 +2小时 +4小时 +6小时 +24小时 - - + +，++ + - + + - - + - + + + + + - - -，- - - - -
-没有协同作用；+弱协同作用；++协同作用
roscovitine联合顺铂在人胸膜间皮瘤异种移植物PXF 1118中的抗癌效 力示于图1A。图1B显示了roscovitine联合顺铂在人肺癌异种移植物LXFA 629中的抗癌效力。
结果表明，与单独给药任何一种药物相比，联合给药顺铂和Roscovitine 能产生最大效应。这种效应表明了两种成分之间的协同相互作用。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本 领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方案 描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不应该不适当地限制至这种具 体实施方案。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上 述方式的各种改变都被本发明覆盖。
通过与其它蛋白的短暂缔合以及它们细胞内定位的变化，CDK的活性 在翻译后被调节。肿瘤发展与基因改变和CDK及其调节剂的下调密切相关， 这表明CDK抑制剂可为有用的抗癌治疗药。实际上，早期结果表明转化细 胞和正常细胞在它们对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求上有差别，因而 有可能开发出新的抗肿瘤药，没有常规细胞毒性和细胞抑制药物所观察到 的常见宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或去激活特定蛋白，包括例如成视网 膜细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的成分。由CDK 介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酰-转移反应。已发现几类 化合物(在例如N.Gray，L.D étivaud，C.Doerig，L.Meijer，Curr.Med.Chem. 1999，6，859中有总结)因由于CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖性 能。
Roscovitine为化合物6-苄氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羟基乙基氨基]-9-异丙基 嘌呤。Roscovitine已被证实为细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是CDK2的有 效抑制剂。这种化合物当前正被开发成抗癌药。CDK抑制剂被认为阻断了 细胞周期G2/M期的细胞途径。
众所周知，本领域中经常联合给予活性药剂以使治疗方案最佳。
例如，文献报道联合长春瑞宾和顺铂能提高晚期非小细胞肺癌患者的存 活率超过单独利用顺铂得到的存活率[Oncology News International，第7卷 第11期，1998年11月]。其它研究报道了使用紫杉醇和顺铂的联合治疗晚 期卵巢癌[Trent Institute for Health Services Research，Universities of Leicester，Nottingham and Sheffield，1997，Guidance Note 97/05]，和顺铂和 肾上腺素的联合治疗原发性肝癌[Oncology，第14卷第1期，2000年1月]。 联合治疗的其它例子包括使用顺铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗局部头颈癌 [Hunis等人；Proc.Annu.Meet.Am.Soc.Clin.Oncol；13：A921，1994]，和 使用顺铂与拓优得(tomudex)、左亚叶酸和5-FU治疗局部晚期或转移性头颈 癌[Caponigro等人；Proceedings of the 1999 AACR NCI EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics，作为Clinical Cancer Research的增刊出版，第5卷，1999年11月，ISSN 1078-0432]。
本发明设法提供已知药剂的新型联合，该联合尤其适于治疗增殖性疾 病，尤其是癌症。更具体地，本发明集中于与联合使用特定药剂有关的令 人惊奇和出乎意料的效果。
发明概述
第一方面，本发明提供包括CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物 的联合。
第二方面提供包括根据本发明的联合与药物可接受载体、稀释剂或赋形 剂混合的药物组合物。
第三方面涉及根据本发明的联合在制备治疗增殖性疾病的药物中的用 途。
第四方面涉及包括CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物的药物制 品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
第五方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别 为患者给药CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物。
第六方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其 中所述治疗包括同时、依次或分别为患者给药CDK抑制剂和顺铂或其衍生 物或前体药物。
第七方面涉及CDK抑制剂和顺铂或其衍生物或前体药物在制备治疗增 殖性疾病的药物中的用途。
第八方面涉及CDK抑制剂在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途，其 中所述药物用于与顺铂或其衍生物或前体药物的联合治疗。
第九方面涉及顺铂或其衍生物或前体药物在制备治疗增殖性疾病的药 物中的用途，其中所述药物用于与CDK抑制剂的联合治疗。
详细描述
药物联合的效果本质上是不可预料的，经常存在一种药物部分或完全抑 制另一种药物的效果的倾向。本发明基于令人惊奇的发现，即同时、分别 或依次联合给药顺铂和roscovitine不会导致两种药剂之间的任何有害相互 作用。出人意料的这种拮抗相互作用的缺乏对临床应用至关重要。
在优选的实施方案中，与分别给药的任何一种药物相比，顺铂和 roscovitine的联合能产生增强的效果。这种发现的令人惊奇特性与根据现有 技术预料的大不相同。
下面阐述的优选实施方案适用于本发明的所有上述方面。
化合物顺-二氨二氯铂(II)，通常称为顺铂或顺-DDP，是已知的在临床尤 其睾丸癌治疗中广泛使用的抗癌药。分子结构相对简单，由处于顺式位置 的两个氯配体和两个NH3配体组成，形成环绕中心铂原子的四角形(正方形) 平面结构。顺铂以电中性、四配位铂络合物的形式存在。但是，研究表明 二水合(活化)形式促进与DNA的结合。
通常以无菌盐水溶液的形式静脉给药顺铂到血流中。由于血流中氯化物 浓度高，因此药物完整保持其中性形式。然后其通过扩散进入细胞，在那 里由于细胞内氯化物浓度低很多而发生水解。水解将中性分子转变成活化 水合络合物，其中两个氯化物配体都被水分子替代产生带正电荷的物种。 活化形式为双官能亲电子剂，其能与DNA碱基对发生亲核取代。
顺铂具有类似于双官能烷化剂的生物化学性质，在DNA中产生链间、 链内和单官能加合物交联。最普遍的形式是1，2-链内交联。在这种加合物中， 铂共价地结合到相邻嘌呤碱的N7位上。因此，DNA未解旋并向大沟弯曲。 其它铂-DNA加合物包括单官能和1，3-和更长范围的链内、链间和蛋白质 -DNA更联。
研究表明大多数加合物涉及鸟嘌呤残基，因为这些提供了氢与胞嘧啶键 合的三个位点，从而与腺嘌呤和胸腺嘧啶之间可能的两个氢键相比能产生 更大的稳定性。顺铂-DNA加合物的形成使DNA结构扭曲，这又导致复制 和转录的中断。另外，顺铂-DNA加合物的形成通过阻断和减缓修复蛋白， 或消极地改变核苷酸剪切修复(NER)蛋白尤其是XPA的功能来破坏细胞修 复自身的能力。
CDK抑制剂优选为CDK2和/或CDK4的抑制剂。CDK抑制剂更优选 选自Roscovitine、Purvalanol A、Purvalanol B、奥罗莫星和其它2，6，9-三取 代的嘌呤，如WO 97/20842、WO 98/05335(CV Therapeutics)、WO 99/07705(Regents ofthe University of California)中所述。CDK抑制剂甚至更 优选选自Roscovitine和Purvalanol A。还更优选地，CDK抑制剂为 Roscovitine。
本文使用的术语“增殖性疾病”在广泛意义上包括任何需要控制细胞周 期的疾病，例如心血管疾病如再狭窄和心脏病、自身免疫性疾病如肾小球 肾炎和类风湿性关节炎、皮肤病如牛皮癣、抗炎性、抗真菌、抗寄生虫疾 病如疟疾、气肿和脱发病。在这些疾病中，本发明的化合物可按照需要在 所需的细胞内诱导凋亡或保持停滞。优选地，增殖性疾病为癌症或白血病， 更优选为癌症。
在一种优选实施方案中，癌症为睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、头颈 癌、胃癌、食道癌、子宫癌、淋巴瘤癌、肉瘤癌、黑素瘤癌、间皮瘤癌或 前列腺癌。
在更优选的实施方案中，癌症为肺癌。
在另一尤其优选的实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。还更优 选地，癌症为IIIB/IV期非小细胞肺癌。
在尤其优选的实施方案中，本发明涉及上文所述的联合在治疗CDK依 赖性或敏感性疾病中的应用。CDK依赖性疾病与一种或多种CDK酶的超过 正常活性水平有关。这类疾病优选与CDK2和/或CDK4的异常活性水平有 关。CDK敏感性疾病为CDK水平的失常不是主因而是下游初级异谢失常导 致的疾病。在这种情况下，CDK2和/或CDK4被认为是敏感性代谢途径的 一部分，CDK抑制剂可因此在治疗这类疾病中有活性。这类疾病优选癌症 或白血病。
本文使用的术语“药物制备”包括本发明的成分除了用于这类药物制备 的任意阶段外还有直接作为药物的应用。
如上所述，本发明的一个方面涉及包括CDK抑制剂和顺铂的药物制品， 作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
本文中使用的“同时”是指同时地给药两种药剂。
本文中使用的术语“依次”是指在时限内在为患者给药联合制剂中的一 种成分后为其给药另一种成分，以致于它们均在同一时限内起治疗作用。 因此，依次给药可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时内给药 另一种药剂，只要第一种给药药剂的循环半衰期能使二者同时以治疗有效 量存在即可。给药成分间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用 和它们各自的半衰期而改变。
本文使用的术语“分别”是指给药一种药剂和另一种药剂之间的间隔是 明显的，即当给药第二种药剂时，在血流中可不再存在治疗有效量的第一 种给药药剂。
在本发明的一种优选实施方案中，与顺铂依次或分别地给药CDK抑制 剂。
在一种优选实施方案中，在CDK抑制剂前给药顺铂。优选地，在CDK 抑制剂前至少1小时给药顺铂，还更优选在CDK抑制剂前至少24小时。
在另一种优选实施方案中，在顺铂前给药CDK抑制剂。优选地，在顺 铂前至少4小时给药CDK抑制剂，还更优选在顺铂前至少72小时。
在另一种优选实施方案中，同时给药CDK抑制剂和顺铂。
在一种优选实施方案中，对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK 抑制剂和顺铂；换句话说，即使不是以联合给药的方式，CDK抑制剂和顺 铂也是以治疗有效量给药。
在另一种优选实施方案中，对于单独成分，分别给药亚治疗量 (sub-therapeutic amount)的CDK抑制剂和顺铂；换句话说，如果不是联合给 药给药， CDK抑制剂和顺铂不是以治疗有效量给药。
优选地，顺铂和CDK抑制剂以协同方式相互作用。本文使用的术语“协 同”是指顺铂和CDK抑制剂在联合使用时能产生比由两种组分的单独效应 相加预料到的效应更大的效应。有利地，协同相互作用可允许较低剂量的 每种组分被给药于患者，从而降低化疗的毒性，同时产生和/或保持相同的 疗效。因此，在尤其优选的实施方案中，可以亚治疗量给药每种组分。
在所附实施例中详细描述了支持协同相互作用的证据。
盐/酯
本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。
本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱加成盐。合适 药物盐的综述可见Berge等人的J.Pharm Sci， 66，1-19(1977)。盐为与例如以 下酸形成的盐：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机 羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸； 饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、 邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基 乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳 基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包 括羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如 乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、 富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙 酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳 基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如 氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤 代)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体
本发明还适当地包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技 术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的 化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变 异构体。
立体异构体和几何异构体
本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如 它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以二种或多种立体 异构和/或几何形式存在。本发明包括这些抑制剂药剂所有的单独立体异构 体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些 形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。
本发明还包括药剂或其药物可接受盐的所有合适的同位素变体。本发明 药剂或其药物可接受盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同 原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物 质。可被掺入到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、 氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、 31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和其药物可接受盐的一些同位素变体，例如 结合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研 究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性 而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的代谢稳定性而提 供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一 些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制 备本发明药剂和其药物可接受盐的同位素变体。
溶剂合物
本发明还包括本发明药剂的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括 这些形式。
多晶型物
本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的 药剂。众所周知，在药物工业中可通过稍微改变这种化合物合成制备中所 用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离得到化合物的任意这类形式。
前体药物
本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个 或多个适当基团已被修饰以使在对人或哺乳动物对象给药后所述的修饰可 被逆转的化合物。虽然为了实现体内逆转可与这种前体药物一起给药第二 种药剂，但通常通过在这类对象中天然存在的酶实现这种逆转。这类修饰 的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其 它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
给药
可使本发明的药物组合物适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜 内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、膀胱内、鼻、口腔 或舌下给药途径。
对于口服给药，特别利用压缩片剂、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂 和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有 效成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可经静脉内、动脉内、鞘内、膀胱 内、皮下、皮内、腹膜内或肌内给药，并由无菌或可灭菌溶液制备。本发 明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳 膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉(dusting poeder)的形式。
经皮给药的替代方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分掺入到由聚 乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效 成分掺入到由白蜡或白色软石蜡基质与所需要的稳定剂和防腐剂共同组成 的软膏内。
可注射形式每剂可包含10-1000mg、优选10-500mg的有效成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量或单元剂量的多重单位或 亚单位的形式的离散部分。
在一种特别优选的实施方案中，静脉内给药本发明的联合或药物组合 物。
剂量
本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定对患者给药的本 发明的组合物的适宜剂量。典型地，医师会确定对个体患者最适合的实际 剂量，并且根据各种因素进行调整，包括使用的具体化合物的活性、化合 物的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、 给药方式和时间、排泄速度、药物联合、特定病症的严重程度和个体正接 受的治疗。本文公开的剂量为一般情况的示例。当然也可有有益的较高或 较低剂量范围个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，可以0.1-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg体重，更优选 2-20mg/kg体重的剂量给药所述药剂。
指导性地，按照医师指导，顺铂一般地以50-100mg/m2体表面积的单一 剂量进行给药，每21-28天静脉内缓慢给药，或者在每21-28天内以 15-20mg/m2体表面积的剂量，每日静脉内缓慢给药，连续5天。施用的剂 量和给药频率一般根据患者的一般体格状况和引起的副作用的严重程度， 尤其是引起造血、神经系统和肾系统的那些副作用的严重程度进行调整。
roscovitine一般以约0.05-约5g/天，优选约0.4-约3g/天给药。roscovitine 优选以片剂或胶囊的形式口服给药。roscovitine的总日剂量可作为单次剂量 给药，或以分散剂量每天给药2、3或4次。
优选地，以0.4-3g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。然后，按认 为最合适的方式以上述适宜剂量给药顺铂。优选地，在给药roscovitine至少 24小时后给药顺铂。
通过实施例并结合以下图进一步描述本发明，其中：
图1A显示了roscovitine联合顺铂在人胸膜间皮瘤(pleuramesothelioma) 异种移植物PXF 1118中的抗癌效力；图1B显示了roscovitine联合顺铂在 人肺癌异种移植物LXFA 629中的抗癌效力。
实施例
使用单层分析测定roscovitine单独和联合顺铂对PC-3前列腺细胞系的 生长抑制活性，和使用肿瘤干细胞分析测定roscovitine单独和联合顺铂对人 胸膜间皮瘤异种移植物PXF 1118和人肺癌异种移植物LXFA 629的生长抑 制活性。
方法和材料
化合物
在DMSO中制备CDK抑制剂(例如roscovitine)的储备溶液并在-20℃下 储存等分试样。使用前即刻在培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium； Life Technologies，Karlsruhe)中制备最终的稀释液。
产克隆分析
由人肿癌异种移植物制备单细胞悬浮液
在无菌条件下切出胸腺发育不全的裸小鼠(NMRI，Naval Medical Research Institute，USA，nu/nu株，得自我们自己的饲养设施)中在皮下连 续传代生长的固体人肿瘤异种移植物，机械分解，随后用酶混合物在37℃ 下孵育30分钟，其中酶混合物由胶原酶(41U/ml，Sigma)、DNAseI(125U/ml， Roche)、透明质酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(Dispase)II(1.0U/ml，Roche) 在RPMI 1640-培养基(Life Technologies)中组成。使细胞通过200μm和50μm 筛的筛，并用无菌PBS缓冲液(Life Technologies)洗涤两次。利用台盼蓝排 斥实验在Neubauer血细胞计数计上测定活细胞的百分比。
培养方法
布根据Hamburger & Salmon[Alley，M.C.，Uhi，C.B.& M.M.Lieber，1982] 介绍的改性双层软琼脂分析以24孔形式上进行产克隆分析(clonogenic assay)。通过使用可代谢的四唑盐改进软琼脂集落形成分析中药物细胞毒性 的检测。Life Sci.31：3071-3078]。底层由0.2ml/孔的Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(补充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)庆大霉素)和 0.75％(w/v)琼脂组成。向补充有0.4％(w/v)琼脂的0.2ml相同培养基中加入 4·104-8·104个细胞，并以24多孔皿形式接种到底层上。通过在0.2ml培养 基中连续暴露(药物覆层)施用细胞抑制药。每个皿包括含有溶媒的6个对照 孔，和6个浓度的三重的药物处理组。在37℃下和有7.5％CO2的湿度气氛 中孵育培养物8-20天，使用倒置显微镜密切监视集落生长。在此期间，体 外肿瘤生长导致直径＞50μm的集落形成。在最大集落形成时，用自动图象 分析系统(OMNICONFASIV，Biosys GmbH)进行计数。在评价前24小时， 用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物的无菌水溶液(1mg/ml， 100μl/孔)[i]染色活集落。
如果满足下面的质量控制标准，则认为分析完全可评价：
-24多孔板的对照组孔中的平均集落数≥20个集落且集落直径＞50μm
-阳性参考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(在1000μg/ml中毒剂量时)必须实现 ＜20％对照的集落存活率
-第0或2天上的初始板计数＜20％的最终对照组计数
-对照组中的变异系数≤50％
数据评价
用存活率百分数表示药物效应，通过比较处理板中的平均集落数和未处 理对照的平均集落计数得到(相对集落计数用试验组对对照组值表示，T/C 值[％])：
IC50和IC70值，分别是抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成 需要的药物浓度，通过绘制化合物浓度对相对集落计数的曲线确定。根据 下式计算平均IC50和IC70值；
平均
其中x为特异性肿瘤模型，n为研究的肿瘤模型总数。如果在试验的剂量范 围内不能确定IC50或IC70值，则使用研究的最低或最高浓度用于计算。
在均值图形分析(IC曲线)中，在个别肿瘤类型中得到的试验化合物的 IC70值分布以相对于对全部试验肿瘤的得到的平均IC70值给出。个别IC70 值表示为对数坐标轴中的条(bar)。条左边显示低于平均值的IC70值(代表较 敏感的肿瘤模型)，条右边显示较高的值(代表有相当抗性的肿瘤模型)。因 此IC曲线反映了化合物抗增殖图的指纹。
试验过程：roscovitine与标准药剂的联合
细胞系
下面表1中显示了6种人肿瘤细胞系的特征。
表1：用于试验roscovitine与标准药剂联合的细胞系 肿瘤形成类型 细胞系 裸鼠中 的组织学 倍增时间 [小时] 体内肿瘤 结肠 肺，NSC 前列腺 DLD1 HT29 LXFA 629L 22RV1 DU145 PC3M adeno ca pd adeno ca 腺癌 nd adeno ca pd adeno ca nd 23 31 40 nd nd 是 是 是 是 是 是
ud＝未分化，pd＝分化不足，md＝中度分化，
wd＝充分分化，mm＝恶性黑素瘤；ND＝未测定
肺癌细胞系LXFA 629L由人肿瘤异种移植物建立，如Roth等人1999 年所述[Roth T，Burger AM，Dengler W，Willmann H，Fiebig HH.Human tumor cell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models for anticancer drug screening.In：Fiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54：145-156]。 Fiebig等人于1992年描述了供体异种移植物源[Fiebig HH，Dengler WA， Roth T.Human tumor xenografts：Predictivity，characterization，and discovery of new anticancer agents.In：Fiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54：29-50]。
细胞系DLD1和HT29(结肠)以及前列腺癌DU145和PC3M得自US-NCI (National Cancer Institute，USA)。
前列腺癌22RV1购自American Type Culture Collection(ATCC)。
按常规每周传代细胞1次或2次。在培养物中保持它们不超过20次传 代。在补充有10％胎牛血清(Sigma，Deisenhofen，Germany)和0.1％庆大霉 素(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中于37 ℃下和湿度气氛(95％空气，5％CO2)中培育所有细胞。
细胞增殖分析
使用改性碘化丙啶(propidium iodide)分析评定roscovitine对人肿瘤细胞 系生长的影响[Dengler WA，Schulte J，Berger DP等人(1995).Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay. Anti-Cancer Drugs 1995，6：522-532]。简单地说，通过胰蛋白酶化从指数 生长期培养物中富集细胞，计数并以与细胞系有关的细胞密度(5-12.000活 细胞/孔)接种在96孔平底微量滴定板中。在24小时使细胞重新开始指数生 长的恢复期后，向孔中加入20μl培养基(每板3个对照孔)或包含各种浓度 的试验制品No.1(标准药剂)的培养基。每种浓度一式三份接种。在每个板上， 在微量滴定板的4个区域4次施加5种浓度的试验制品No.1。区域1用于 单独的试验制品No.1，在区域2-4，在3个不同的时间点分别施加试验制品 No.2(roscovitine)。在试验制品连续暴露4天后，用200μl碘化丙啶(PI)水溶 液(7μg/ml)代替有或没有药物的细胞培养基。由于PI只通过渗漏的或细胞溶 解的细胞膜，因此可染色并测量死细胞的DNA，而活细胞不能被染色。为 测量活细胞的比例，通过冷冻板引起全部细胞死亡使细胞透过。在解冻板 后，然后使用Cytofluor 4000微量培养板读数器(激发530nm，发射620nm) 测量荧光，给出与总细胞数的直接关系。生长抑制率表示为处理的/对照 ×100％T/C)，通过绘制化合物浓度对细胞存活率的曲线确定每种联合的 IC50、IC70和IC90值。
结果
在加入顺铂前(-6小时、-4小时、-2小时)、同时(0小时)或后(+2小时、 +4小时、+6小时、+24小时)向细胞中加入roscovitine。Roscovitine联合顺 铂在PCM3中的抗肿瘤活性示于下面的表2。roscovitine以20μM的剂量水 平加入。
表2 PRCL PCM3 -6小时 -4小时 -2小时 0小时 +2小时 +4小时 +6小时 +24小时 - - + +，++ + - + + - - + - + + + + + - - -，- - - - -
-没有协同作用；+弱协同作用；++协同作用
roscovitine联合顺铂在人胸膜间皮瘤异种移植物PXF 1118中的抗癌效 力示于图1A。图1B显示了roscovitine联合顺铂在人肺癌异种移植物LXFA 629中的抗癌效力。
结果表明，与单独给药任何一种药物相比，联合给药顺铂和Roscovitine 能产生最大效应。这种效应表明了两种成分之间的协同相互作用。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本 领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方案 描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不应该不适当地限制至这种具 体实施方案。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上 述方式的各种改变都被本发明覆盖。
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