MDM2癌基因最初被克隆为murine double-minute染色体上的放大因子； 被编码的主要癌蛋白被定义为MDM2，另外已知人类等价蛋白就是HDM2 [Zhang，Wang H；Curr.Pharmaceut.Design 2000；6：393-416]。目前已经很好地 确立了HDM2与人类癌症之间的关系。由于基因放大或者转录或翻录增加 使得HDM2在各种肿瘤中被过分表达[Momand J，Jung D，Wilczynski S， Niland J；Nucleic Acids Res.1998；26：3453-3459]。
灭活p53肿瘤抑制蛋白是人肿瘤形成过程中频繁出现的情形[Lane DP， Lain S；Trends Molec.Med.2002；8：S38-S42.]。灭活除了归因于突变缺损以 外，它还可能是由例如结合HDM2而引起的。HDM2和p53在体内或体外 的相互作用使得由p53介导的转活化作用受到抑制。由于p53肿瘤抑制因子 影响络合作用，因此HDM2/p53络合物(complexes)的形成更倾向于通过核质 转化形成。HDM2通过与p53的N-末端活化区域结合形成负自身调节环， 从而抑制p53的功能并促进p53的蛋白酶降解。干扰这个调节环可用于增加 细胞中活性p53的浓度。
借助于一系列重复的合成肽确定了HDM2在p53上的结合位置[Picksley SM，Voijtesek B，Sparks A，Lane DP；Oncogene 1994；9：2523-2529]，并且被绘 制成序列18TFSDLW23。尽管含有该序列的更长链肽也是p53/HDM2络合物 形成的强效抑制剂，但是六肽p53(18-23)本身具有很低的亲和性[Bttger A， Bttger V，Garcia-Echeverria C，Chène P，Hochkeppel HK，Sampson W，Ang K， Howard SF，Picksley SM，Lane DP；J.Molec.Biol.1997；269：744-756]。
对由噬菌体所显示的肽库进行筛选也显示了含有HDM2结合基序的序 列[Bttger V，Bttger A，Howard SF，Picksley SM，Chene P，Garcia-Echeverria C， Hochkeppel HK，Lane DP；Oncogene 1996；13：2141-2147]。其中起始的12链 肽MPRFMDYWEGLN具有低于微摩尔级的亲和性，比相应的野生型p53衍 生肽16QETFSDLWKLLF27效果更强28倍。取代和切断研究显示，8链肽 FMDYWEGL是对HDM2具有微摩尔级亲和性的最低活性序列[Bttger A等 人，同上]。在相应的p53序列的已知结合模型基础之上[Kussie PH，Gorina S， Marechal V，Elenbaas B，Moreau J，Levine AJ，Pavletich NP；Science 1996；274： 948-953]，通过引入α，α-二取代氨基酸残基α-氨基异丁(Aib)酸和1-氨基环丙 烷羧酸(Ac3c)分别替代Asp和Gly残基，建立了这种肽的螺旋结构。分子模 型显示，Tyr侧链对HDM2 Lys94残基的ε-氨基具有亲和性，而二氧磷基甲基 苯丙氨酸(Pmp)残基可用于替代Tyr。所得到的肽的效果大约更高7倍，这表 明在膦酸酯和氨基之间建立盐桥的假想在实践中是具有可操作性的。最后， 检查Trp23的结合袋(pocket)显示其并未被完全占满，这表明在吲哚6-位上的 取代基可以增强亲和性。事实也是如此，从而由此可以达到获得足够的效果 的目的。因此由野生型p53 12链序列出发，亲和性增加＞1,700倍。
p53/HDM2络合物的这种晶体结构以及上述所讨论的肽优化工作表明， p53和HDM2的疏水性裂隙(cleft)之间的主要连接仅仅在于三个p53残基 (Phe19、Trp23、以及Leu26)。所讨论的三个侧链的分子量达到大约300Da， 这表明使用非肽小分子调节p53/HDM2之间的蛋白质-蛋白质相互作用是可 行的。这种假设的正确性已经在一定程度上被证实。
对各种微生物提取液进行筛选以找出p53/HDM2相互作用的抑制剂，结 果证实一种被称作chlorofusin的真菌代谢物是微摩尔级的抑制剂[Duncan SJ， Grueschow S，Williams DH，McNicholas C，Purewal R，Hajek M，Gerlitz M， Martin S，Wrigley SK，Moore M；J.Am.Chem.Soc.2001；123：554-560]。一直 以来都知道查耳酮(1，3-二苯基-2-丙烯-1-酮)具有抗肿瘤活性[De Vincenzo R， Ferlini C，Distefano M，Gaggini C，Riva A，Bombardelli E，Morazzoni P，Valenti P，Belluti F，Ranelletti FO，Mancuso S，Scambia G；Cancer Chemotherapy Pharmacol.2000；46：305-312]。某些查耳酮衍生物，特别是被称作“B-1”的化 合物{4-[3-(3，4-二氯-苯基)-丙烯酰基]-苯氧基}-乙酸及其某些类似物对于 p53/HDM2络合物的抑制具有高微摩尔级的亲和性[Stoll R，Renner C，Hansen S，Palme S，Klein C，Belling A，Zeslawski W，Kamionka M，Rehm T，Muehlhahn P，Schumacher R，Hesse F，Kaluza B，Voelter W，Engh RA，Holak TA； Biochemistry 2001；40：336-344]。应用多维NMR技术，已经找到证据证明查 耳酮衍生物直接结合于HDM2的p53结合裂隙的Trp23-结合袋的亚位。
最后，由p53-衍生化的HDM2-结合肽出发进行肽模拟设计得到乙酰基 色氨酰基哌嗪叠氮化物(acyltryptophanylpiperazides)，它是具有低微摩尔级亲 和性的p53/HDM2拮抗剂[Luke RWA，Hudson K，Hayward CF，Fielding C， Cotton R，Best R，Giles MB，Veldman MH，Griffiths LA，Jewsbury PJ，Breeze AL，Embrey KJ；Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.1999；40：#4099；Luke RWA， Jewsbury PJ，Cotton R；PCT Int.Patent Appl.Publ.WO 00/15657；Zeneca Ltd.， UK，2000]。
本发明目的在于提供一类可用于治疗癌症以及其它增殖性疾病的治疗 剂。
发明概述
本发明第一方面涉及通式I化合物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中 的用途，

其中
W是C1-5支链或直链亚烷基或C2-5亚链烯基；
n是0或l；
R1是H、C1-8支链或直链烷基、C2-8链烯基、或者芳基或芳烷基，其每 个任选被一个或多个卤素或CF3基团取代；
Ar1是
或 或 或
其中
X是S、O、NH或NR’，其中R’是C1-3烷基；
Y是CH或N；
E是N或CR4；
R2、R3、R4、以及R14-16各自独立地是(A)pB，其中A是C1-3烷基，p是 0或1，B是H、卤素、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、 SO2NH2、NHAra、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Arc、SO2Re、CF3、CN、COOH、 COORf、CONH2、COONHArd、CONHRg、COAre、CORh、S(CO)Rs、ORt、 OArf、任选含有一个或多个杂原子的脂环基，其任选被一个或多个OH、 CORu、卤素或CF3基团取代、或任选被一个或多个C1-5烷基、卤素、SRi或 CF3基团取代的杂芳基；或者
R2和R3连接形成任选含有一个或多个杂原子的饱和或不饱和环系，其 任选被一个或多个卤素、OH或CF3基团取代；
Ara-f各自独立地是芳基，其任选被一个或多个C1-5烷基、卤素或CF3基 团取代；
Ra-i、Rs、Rt和Ru各自独立地是C1-5烷基，其任选被一个或多个烷氧基、 卤素或CF3基团取代；
条件是，R2、R3和R4中至少一个不是H；
Ar2是
或 或
其中
Z是S、O、NH或NR”，其中R”是C1-3烷基；
R5、R6、R7、R8以及R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-3烷基，q是 0或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHArg、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHArh、SO2NHRm、SO2Ari、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHArj、CONHRq、ORv、COArk或CORr；
Rj-r、Rv各自独立地是C1-5烷基；
Arg-k各自独立地是芳基；
条件是，取代基R5、R6、R7、R8以及R9中至少一个不是H；
R10、R11、R12和R13各自独立地是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2或者CF3。
本发明第二方面涉及上文所定义的化合物在治疗增殖性疾病中的用途。
本发明第三方面涉及下文更具体描述的通式Ia、Ib、Ic和Id化合物。
本发明第四方面涉及一种药物组合物，它含有与一种或多种可药用稀释 剂、赋形剂或载体混合的本发明化合物。
本发明第五方面涉及本发明化合物在测定对HDM2结合力的方法中的 应用。
本发明第六方面提供了一种检测配体对HDM2结合力的方法，所述方 法包括下述步骤：
(i)在p53衍生肽存在下，使配体与HDM2接触；和
(ii)检测在HDM2和所述p53衍生肽之间的相互作用所出现的任意变化；
其中所述配体是根据本发明的化合物。
本发明第七方面涉及一种并用药物(combination)，它含有至少一种本发 明的化合物和至少一种细胞毒素剂。
本发明第八方面涉及一种药物组合物，它含有与可药用稀释剂、赋形剂 或载体混合的至少一种本发明化合物、以及一种或多种细胞毒素剂。
本发明第九方面提供了一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向患 者施用至少一种本发明的化合物，另外在给药之前、同时或者之后还施用一 种或多种其它的细胞毒素剂。
本发明第十方面涉及一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者 施用至少一种本发明的化合物，另外在给药之前、同时或者之后还结合使用 放射治疗。
详细描述
如上所述，本发明第一方面涉及如上文所定义的通式I化合物在制备用 于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
本文所使用的短语“药物制备”除了指本发明化合物在用于鉴定其它药 物的筛选程序中或者在制备这类药物的任意情形中的应用之外，还包括其直 接作为药物的应用。这类筛选程序可以例如包括测定对HDM2结合力的方 法，它用来测定候选物质是否能够模拟通式I化合物的活性。
本发明涉及在增殖性疾病的治疗中作为治疗剂的双芳基磺酰胺。
在一实施优选实施方案中，Ar1是
或
Ar2是

优选地，X是S，E是CR4，或者X是S，E是N。
在另一优选实施方案中，Ar1是

Ar2是

优选Z是N。
在另一优选实施方案中，Ar1是

Ar2是

在另一优选实施方案中，Ar1是

Ar2是

优选Z是N。
在又一优选实施方案中，Ar1是

Ar2是

优选R14-16都是H。
在另一优选实施方案中，Ar1是

Ar2是

对于所有的上述方案，优选地
-R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-5烷基，p是0或1，B 是H、F、Cl、Br、I、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、 SO2NH2、NHPh、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Ph、SO2Re、CF3、CN、COOH、 COORf、CONH2、COONHPh、CONHRg、S(CO)Rs、ORt、OArf、COPh、CORh、 每个可任选被一个或多个OH或CORu基团取代的吗啉代基、哌嗪子基 (piperazino)或哌啶子基、或者选自吡啶基、嘧啶基、噁唑基、噻唑基和吡唑 基的杂芳基，其中每个任选被一个或多个C1-5烷基、卤素、SRi或CF3基团 取代，或者R2和R3一起形成饱和6-元环或不饱和5-元环，其中每个任选含 有一个或多个杂原子；以及
-R5、R6、R7、R8、以及R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-5烷基， q是0或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHPh、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHPh、SO2NHRm、SO2Ph、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHPh、CONHRq、ORv、COPh或CORr。
更优选地，R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-5烷基，p是 0或1，B是H、F、Cl、Br、I、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、 SO3H、SO2NH2、NHPh、SO2NHPh、SO2NHRd、SO2Ph、SO2Re、CF3、CN、 COOH、COORf、CONH2、COONHPh、CONHRg、S(CO)Rs、ORt、OArf、 COPh、CORh、吡啶基、嘧啶基、2-甲硫基嘧啶-5-基、噁唑-2-基、噻唑-2- 基、1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、吗啉-4-基、4-乙酰基-哌嗪-1-基、3- 羟基-哌啶-1-基，或者R2和R3一起形成
-OCH2CH2O-
-N-S-N-或
任选被一个或多个卤素取代的苯基。
进一步更优选地，R2、R3和R4各自独立地是H、卤素、NO2、SO2Ph、 S(CO)Me、COOH、COOEt、OPh、OMe、NHCH2CH2OMe、1-甲基-5-三氟 甲基-1H-吡唑-4-基、2-甲硫基嘧啶-5-基、N-(4-氟苯基)亚磺酰氨基、N-(4-三 氟甲基-苯基)-亚磺酰氨基、噁唑-2-基、C1-5烷基、NH2、吗啉-4-基、4-乙酰 基-哌嗪-1-基、3-羟基-哌啶-1-基，或者R2和R3一起形成
-OCH2CH2O-
-N-S-N-或
任选被一个或多个卤素取代的苯基。
在一特别优选的实施方案中，Ar1是

X是S或N，优选S；
R2、R3和R4各自独立地是C1-5烷基、S(CO)Me、COOH、NHCH2CH2OMe、 COOEt、H、卤素、NO2、SO2Ph、SO2NH-(4-氯苯基)、1-甲基-5-三氟甲基-1H- 吡唑-4-基、吗啉-4-基、2-甲硫基嘧啶-5-基、N-(4-氟苯基)亚磺酰氨基、N-(4- 三氟甲基-苯基)-亚磺酰氨基、3-羟基-哌啶-1-基、吡啶-2-基；或者R2和R3 形成任选被一个或多个卤素取代的苯基。
对于该实施方案更优选的是
-R2是卤素、SO2Ph、NO2、Et、SOMe、吗啉-4-基、NHCH2CH2OMe、 3-羟基-哌啶-1-基、1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基或2-甲硫基-嘧啶-5-基；
-R3是卤素、SO2NH-(4-氯苯基)、H、NO2、N-(4-氟苯基)亚磺酰氨基或 N-(4-三氟甲基-苯基)-亚磺酰氨基；以及
-R4是H。
在另一特别优选的实施方案中，Ar1是

Y是CH或N；以及
R2、R3和R4各自独立地是H、OH、COOH、CF3、OPh、OMe、NO2、 4-乙酰基-哌嗪-1-基、NH2、卤素、吡唑-1-基、噁唑-2-基或C1-5烷基，或者 R2和R3一起形成-OCH2CH2O-或-N-S-N-。
对于该实施方案更优选的是
当Y是CH时
-R2是H、NO2或Cl；
-R3是NO2、NH2、Cl、CF3、COOH、4-乙酰基-哌嗪-1-基；以及
-R4是H、Cl、噁唑-2-基、OH、NO2、NH2、OMe或Me；或者
当Y是N时
-R2是H；
-R3是Br；
-R4是Cl或OPh。
在本发明另一优选实施方案中，Ar1是

R2和R4是C1-5烷基，R3是COOH或COOEt。
在一优选实施方案中，
-R5、R6、R7、R8和R9各自独立地是H、卤素、OMe、NO2、C1-5烷基、 CF3或者OH；以及
-R10、R11、R12和R13都是H。
进一步优选的是
-R5是H、C1-5烷基、或卤素；
-R6是H、卤素、NO2、或CF3；
-R7是H、卤素、OMe、NO2、OH或CF3；
-R8是H、卤素或CF3；
-R9是H。
在本发明一优选实施方案中，
-W是CH2、CH2CH2或CH(CH3)CH2；以及
-R1是H、CH2Ph、CH2CH(Me)2、3-(三氟甲基)苄基、或Me。
在本发明第一方面的特别优选实施方案中，通式I化合物是选自下面的 化合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[1]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)-酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
4-溴-5-氯噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[4]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[8]；
5-氯噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[9]；
5-氯噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[10]；
5-氯噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[11]；
5-(2-甲硫基-嘧啶-5-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)-酰胺[12]；
4-噁唑-2-基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[13]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺[14]；
4-溴-5-氯噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[15]；
5-溴噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[16]；
5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[17]；
5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[18]；
N-(4-氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[19]；
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[20]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-硝基苯磺酰胺[21]；
N-(2，4-二氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[22]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[23]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[24]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[25]；
5-氯噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[26]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[27]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[28]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-氯-3-硝基苯磺酰胺[29]；
4-氯-N-(3，4-二氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[30]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)- 酰胺[31]；
5-氯噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氟苯基)-酰胺][32]；
5-氯噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-三氟甲基-苯基)-酰胺][33]；
4-甲基-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[34]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[35]；
3-氨基-4-甲基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[36]；
N-(4-氯苯基)-4-甲基-3-硝基苯磺酰胺[37]；
4-氯-N-(4-氯苯基)-3-硝基-苯磺酰胺[38]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)-酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)-酰胺[40]；
5-溴-6-氯吡啶-3-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[41]；
5-溴-6-氯吡啶-3-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[42]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基- 苯基)酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
4-氯-N-(3，5-二氯苯基)-3-硝基-苯磺酰胺[47]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯基)酰胺[50]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-甲酰胺[51]；以及
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基苄基)酰胺[52]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-异丁基-酰胺[58]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(1H-苯并咪唑-2-基)-酰胺[59]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(6-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[60]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]； 
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
5-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[68]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][70]；
5-乙基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[71]；
硫代乙酸S-[5-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3-硝基-噻吩-2-基]酯[72]；
5-甲基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[73]；
5-甲基-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][74]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)- 酰胺[75]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[76]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[77]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-3-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基- 苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[78]；
5-吗啉-4-基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[79]；
5-(2-甲氧基-乙基氨基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[80]；
4-氯-N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-3-硝基-苯磺酰胺[81]；
N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺[82]；
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]；
6-氯-咪唑并[2，1-b]噻唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[84]；
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷(dioxine)-6-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺 [85]；
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷-6-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺 [86]；
6-苯氧基-吡啶-3-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[87]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(4-氯-3-硝基-苯基)-酰胺[88]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-吡唑-1-基-苯磺酰胺[89]；
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯[90]；
4-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸[91]；
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸[92]；
2-(4-氯-苯基氨磺酰基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯[93]；
3，5-二氯-N-(4-氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺[94]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3，5-二氯-4-羟基-苯磺酰胺[95]；
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺[96]；
N-(4-氯-苯基)-4-硝基-苯-磺酰胺[97]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺[98]；
4-氨基-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-苯磺酰胺[99]；
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺[100]；
3，5-二氯-N-(3，5-二氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺[101]；
4-氨基-3-氯-N-(4-氯-苯基)-苯磺酰胺[102]；
3-氯-N-(4-氯-苯基)-4-甲氧基-苯磺酰胺[103]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-4-甲氧基-苯-磺酰胺[104]；
N-(3-氯-4-硝基-苯基)-3，5-双-三氟甲基-苯磺酰胺[105]；
3-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺 [106]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2-硝基-苯磺酰胺[107]；
3-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-苯甲酸[108]；
3，5-二氯-N-(4-氯-苯甲基)-4-羟基-苯磺酰胺[109]；
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯甲基)-苯磺酰胺[110]；
3，5-二氯-4-羟基-N-[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-苯磺酰胺[111]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[112]；
N-(3，5-二氯-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺[113]；
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[114]；
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[115]；
5-溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[116]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[117]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(2，4-二氯-苯基)-酰胺[118]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[119]；
苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[120]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[121]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[122]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[123]；
5-吡啶-2-基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[124]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[125]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[126]；
3，5-二氯-N-(4-氟-苯甲基)-4-羟基-苯磺酰胺[127]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2，6-二氯-苯磺酰胺[128]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-2-甲基-苯基)-酰胺[129]；
5-(3-羟基-哌啶-1-基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[130]；以及
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-硝基-苯基)-酰胺[131]。
在进一步优选的实施方案中，通式I化合物是根据其抑制人类肿瘤细胞 体内增殖活性(使用实施例5中描述的标准72-h MTT测定法)所具有的IC50 值等于或小于20μM来进行选择的。
在特别优选的实施方案中，该化合物是选自下面的化合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯-磺酰胺[35]；
4-氯-N-(4-氯苯基)-3-硝基苯-磺酰胺[38]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)酰胺[40]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基) 酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
4-氯-N-(3，5-二氯苯基)-3-硝基-苯磺酰胺[47]；5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸 [2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)甲酰胺[51]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)-酰 胺[75]；以及
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]。
更加优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[5]、[6]、[7]、 [35]、[39]、[40]、[44]-[46]、[48]、[49]、[53]-[57]、[61]、[63]、[65]-[67]、 [75]以及[83]。
尤其更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[5]、[6]、 [39]、[40]、[46]、[48]、[49]、[53]、[56]、[57]、[61]、[63]、[66]以及[83]。
进一步更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[46]、[49]、 [61]、[63]以及[83]。
在另一优选实施方案中，通式I化合物是根据其抑制p53-HDM2相互作 用(使用实施例3中描述的竞争性p53-衍生肽-HDM2结合力测定方法)所具有 的IC50值等于或小于200μM来进行选择的。
因此，在本发明特别优选的实施方案中，通式I化合物是选自下面的化 合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
5-氯噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[9]；5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基- 苯基)酰胺[18]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[23]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[27]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[28]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-氯-3-硝基苯-磺酰胺[29]；5-氯噻吩-2，4-二磺 酸双-[(4-三氟甲基-苯基)酰胺][33]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯-磺酰胺[35]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)酰胺[40]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基) 酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯基)酰胺[50]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)甲酰胺[51]；以及
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基(4-三氟甲基-苯甲基)酰胺[52]
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(1H-苯并咪唑-2-基)-酰胺[59]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(6-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[60]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][70]；
硫代乙酸S-[5-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3-硝基-噻吩-2-基]酯[72]；
5-甲基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[73]；
5-甲基-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][74]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)- 酰胺[75]；
5-(2-甲氧基-乙基氨基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[80]；
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(4-氯-3-硝基-苯基)-酰胺[88]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-4-甲氧基-苯-磺酰胺[104]；
N-(3-氯-4-硝基-苯基)-3，5-双-三氟甲基-苯磺酰胺[105]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[112]；
5-溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[116]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[117]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[119]；
苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[120]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[122]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[125]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[126]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2，6-二氯-苯磺酰胺[128]；
5-(3-羟基-哌啶-1-基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[130]；以及
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-硝基-苯基)-酰胺[131]。
更加优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[6]、[7]、[33]、 [39]、[40]、[44]-[46]、[48]-[57]、[59]-[61]、[63]、[65]-[67]、[72]、[75]、[130] 以及[131]。
尤其更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[7]、[45]、[46]、 [50]-[53]、[65]-[67]、[72]以及[75]。
进一步更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[50]、[51]、[65]、 [67]以及[75]。
本发明另一优选实施方案涉及通式Ic化合物在制备用于治疗增殖性疾 病的药物中的用途，

其中
W是C1-5支链或直链烷基或者C2-5链烯基；
n是0或1；
R1是H、C1-8支链或直链烷基、C2-8链烯基、或者芳基或芳烷基；
Ar1是
或
其中
X是S、O、NH或NR’，其中R’是C1-3烷基；
Y是CH或N；
R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-3烷基，p是0或1，B是 H、卤素、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、SO2NH2、 NHAra、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Arc、SO2Re、CF3、CN、COOH、COORf、 CONH2、COONHArd、CONHRg、COAre、CORh、或者任选被一个或多个 C1-5烷基、卤素、SRi或CF3基团取代的杂芳基；
Ara-e各自独立地是任选被一个或多个C1-5烷基、卤素或CF3基团取代的 芳基；
Ra-i各自独立地是C1-5烷基；
条件是，R2、R3和R4中至少一个不是H；
Ar2是
或
其中
Z是S、O、NH或NR”，其中R”是C1-3烷基；
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-3烷基，q是0 或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHAr、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHAr、SO2NHRm、SO2Ar、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHAr、CONHRq、COAr或者CORr；
Ri-r各自独立地是C1-5烷基；
条件是，取代基R5、R6、R7、R8和R9中的至少一个不是H；
R10、R11、R12和R13各自独立地是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2或CF3。
在一优选实施方案中，Ar1是

在另一优选实施方案中，Ar1是

在一优选实施方案中，Ar2是

在另一优选实施方案中，Ar2是

在一优选实施方案中，Ar1是

并且Ar2是

优选地，
-R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-5烷基，p是0或1，B 是H、F、Cl、Br、I、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、 SO2NH2、NHPh、SO2NHAr、SO2NHRd、SO2Ph、SO2Re、CF3、CN、COOH、 COORf、CONH2、COONHPh、CONHRg、COPh、CORh、或者选自吡啶基、 嘧啶基、噁唑基、噻唑基和吡唑基的杂芳基，其中的每个可以任选被一个或 多个C1-5烷基、卤素、SRi或CF3基团取代；以及
-R5、R6、R7、R8、和R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-5烷基，q 是0或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHPh、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHPh、SO2NHR、SO2Ph、SO2Rm、CF3、CN、COOH、 COORn、CONH2、CONHPh、CONHRp、COPh或CORq。
更优选地，R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-5烷基，p是 0或1，B是H、F、Cl、Br、I、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、 SO3H、SO2NH2、NHPh、SO2NHPh、SO2NHRd、SO2Ph、SO2Re、CF3、CN、 COOH、COORf、CONH2、COONHPh、CONHRg、COPh、CORh、吡啶基、 嘧啶基、2-甲硫基嘧啶-5-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、或者1-甲基-5-三氟甲 基-1H-吡唑-4-基。
进一步更优选地，R2、R3和R4各自独立地是H、卤素、NO2、SO2Ph、 1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、2-甲硫基嘧啶-5-基、N-(4-氟苯基)亚磺酰 氨基，N-(4-三氟甲基-苯基)-亚磺酰氨基、噁唑-2-基、C1-5烷基或者NH2。
在一优选实施方案中，Ar1是

X是S；
R2、R3和R4各自独立地是H、卤素、NO2、SO2Ph、1-甲基-5-三氟甲基 -1H-吡唑-4-基、2-甲硫基嘧啶-5-基、N-(4-氟苯基)亚磺酰氨基或N-(4-三氟甲 基-苯基)-亚磺酰氨基。
优选地，
-R2是卤素、SO2Ph、1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基或2-甲硫基-嘧 啶-5-基；
-R3是卤素、H、NO2、N-(4-氟苯基)亚磺酰氨基或N-(4-三氟甲基-苯基)- 亚磺酰氨基；以及
-R4是H。
更优选地，Ar1是

Y是CH或N；以及
R2、R3和R4各自独立地是H、NO2、NH2、卤素、噁唑-2-基或C1-5烷基。
更优选地，
当Y是CH时，
-R2是H；
-R3是NO2或NH2；以及
-R4是H、Cl、噁唑-2-基或Me；或者
当Y是N时
-R2是H；
-R3是Br；
-R4是Cl。
优选地，
-R5、R6、R7、R8和R9各自独立地是H、卤素、CF3或OH；以及
-R10、R11、R12和R13都是H。
更优选地，
-R5是H或卤素；
-R6是H、卤素或CF3；
-R7是H、卤素、OH或CF3；
-R9是H。
优选地，
-W是CH2、CH2CH2或CH(CH3)CH2；以及
-R1是H或Me。
医疗用途
已经发现本发明的化合物具有抗增殖活性，因而认为其可用于治疗增殖 性疾病例如癌症、白血病或者其它与细胞任意增殖相关的疾病例如牛皮癣和 再狭窄。
如上所述，证明本发明所述的抗增殖活性效果可以通过例如使用任意一 种细胞系AGS、H1299或SJSA-1测试其在体内完整细胞分析中抑制细胞增 殖的能力，或者通过在适合的分析试验中测示其所显示出的对HDM2和p53 之间相互作用的抑制能力。这些分析测试包括评价其效能的方法将在下面的 实施例中给以更详细的描述。利用这样的测试方法可以确定化合物是否具有 本发明含义上的抗增殖活性。
因此，本发明一方面涉及一种或多种本发明化合物在治疗增殖性疾病中 的用途。
本文所使用的术语“增殖性疾病”广义上包括任意一种需要控制细胞周 期的疾病，例如心血管疾病例如再狭窄和心肌症、自身免疫疾病例如肾小球 肾炎和类风湿性关节炎、皮肤学疾病例如牛皮癣、抗炎、抗真菌、抗寄生物 疾病例如疟疾、肺气肿和脱发。在这些疾病中，本发明化合物在目标细胞中 可以如所希望的那样诱导细胞凋亡或者维持停滞(stasis)。该增殖性疾病优选 为癌症或白血病。
在本发明一优选实施方案中，本发明化合物按照足以调节HDM2和p53 之间的相互作用的用量施用。
进一步更优选的是，本发明化合物按照足以抑制HDM2和p53之间的 相互作用的用量施用。
本领域已知HDM2通过结合p53的N-末端激活区域与p53形成负自身 调节环，从而抑制p53功能同时加快p53的蛋白质降解。对该调节环的干扰 作用可用于增加活性p53在细胞中的浓度。因此，在野生型p53肿瘤细胞中， 活性p53的平衡浓度可以通过拮抗HDM2和p53之间的相互作用来增加。 这将导致在这类肿瘤细胞中由p53介导的促凋亡和抗增殖活性效果得到恢 复。在对p53功能增加敏感的肿瘤型细胞中[Hansen R，Reddel R，Braithwaite A；Oncogene 1995；11：2535-2545]，据期望本发明的化合物足以诱导细胞凋 亡。
HDM2对p53的这种负调节作用可以限制目前所使用的DNA破坏剂(化 学疗法和放射疗法)活化p53的数量级，从而限制其治疗效果。因此，如果 HDM2对p53的反馈抑制作用被阻断，功能化p53水平的增加将会通过使导 致细胞凋亡的野生型p53功能得以恢复和/或通过逆转与p53相关的耐药性而 增强这类药物的治疗效果。由此说明，同时结合HDM2抑制作用[Wang H， Zeng X，Oliver P，Le LP，Chen J，Chen L，Zhou W，Agrawal S，Zhang R；Int.J. Oncol.1999；15：653-660]和DNA体内破坏疗法可以导致协同地抗肿瘤效果。 因此，本发明化合物在对化学疗法和放射疗法敏感的肿瘤细胞中也有治疗应 用。
评价HDM2的致瘤能力不仅通过其抑制p53的能力，还通过其调节其 它肿瘤抑制蛋白质的能力，特别是视网膜母细胞肿瘤蛋白pRb以及与E2F1 十分相关的转录因子。
因此，在本发明更优选的实施方案中，本发明化合物按照足以调节 HDM2和E2F转录因子之间的相互作用的用量施用。
进一步更优选的是，本发明化合物按照足以抑制HDM2和E2F转录因 子之间的相互作用的用量施用。
已经表明，HDM2直接与pRb调节转录因子E2F1/DP1相互作用[Martin K，Trouche D，Hagemeier C，Sorensen TS，La Thangue NB，Kouzarides T； Nature 1995；375：691-694]，后者可以自身调节活化能力。因此，HDM2的过 度表达增加了由E2F1介导的转活化作用[Daujat S，Neel H，Piette J；Trends Genet，2001；17：459-464]。在没有p53的情况下，HDM2通过倾向于杂二聚 物降解来抑制E2F1/DP1的促凋亡活性[Kowalik TF，Degregori J，Leone G， Jakoi L，Nevins JR；Cell Growth Differ.1998；9：113-118]。然而，HDM2同时 仍然与E2F1/DP1共同作用以刺激DNA的合成。上述完全对立的观察结果 与这样的说法相一致，那就是肿瘤细胞中的高E2F1/DP1水平是通过HDM2 降低至适合于G1-S相转换的适当水平[Loughran O，La Thangue NB；Mol.Cell. Biol.2000；20：2186-2197]。在某些情形下，HDM2的抗凋亡和生长促进活性 看起来都是集中在单一目标E2F1上，E2F1对于HDM2的p53依赖型致瘤 活性可能是相当关键的[Daujat S等人，同上]。E2F1的区域(氨基酸390至 406)显示出与p53的HDM2结合区域相当惊人的相似性。由于HDM2与p53 和E2F1的相互作用都定位于HDM2上的相同结合位置，因此可以预料到， HDM2/p53拮抗剂例如本发明的化合物不仅会活化细胞p53，同时还会抑制 E2F1活性，这在肿瘤细胞中与通常情况是相反的。另外，还可以预料到本 发明的化合物在肿瘤细胞中显示出抗增殖活性，即使这类细胞中缺乏功能化 的p53。
化合物
本发明另一方面涉及通式Ia的化合物

其中
W是C1-5支链或直链亚烷基或C2-5亚链烯基；
n是0或1；
R1是H、C1-8支链或直链烷基、C2-8链烯基、或者芳基或芳烷基，其每 个可任选被一个或多个卤素或CF3基团取代；
Ar1是
或 或 或
其中
X是O、NH或NR’，其中R’是C1-3烷基；
E是N或CR4；
Y是N；
R2、R3、R4、以及R14-16各自独立地是(A)pB，其中A是C1-3烷基，p是 0或1，B是H、卤素、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、 SO2NH2、NHAra、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Arc、SO2Re、CF3、CN、COOH、 COORf、CONH2、COONHArd、CONHRg、COAre、CORh、S(CO)Rs、ORt、 OArf、任选含有一个或多个杂原子的脂环基，其任选被一个或多个OH、 CORu、卤素或CF3基团取代、或任选被一个或多个C1-5烷基、卤素、SRi或 CF3基团取代的杂芳基；或者
R2和R3连接形成任选含有一个或多个杂原子的饱和或不饱和环系，其 任选被一个或多个卤素、OH或CF3基团取代；
Ara-f各自独立地是芳基，其任选被一个或多个C1-5烷基、卤素或CF3基 团取代；
Ra-i、Rs、Rt和Ru各自独立地是C1-5烷基，其任选被一个或多个烷氧基、 卤素或CF3基团取代；
条件是，R2、R3和R4中至少一个不是H；
Ar2是
或 或
其中
Z是S、O、NH或NR”，其中R”是C1-3烷基；
R5、R6、R7、R8以及R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-3烷基，q是 0或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHArg、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHArh、SO2NHRm、SO2Ari、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHArj、CONHRq、ORv、COArk或CORr；
Rj-r、Rv各自独立地是C1-5烷基；
Arg-k各自独立地是芳基；
条件是，取代基R5、R6、R7、R8以及R9中至少一个不是H；
R10、R11、R12和R13各自独立地是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2或者CF3；
条件是，所述化合物不是5-[(4-氯苯基)氨基]磺酰基-2-呋喃羧酸。
本发明另一方面涉及通式Ib化合物，

其中
W是C1-5支链或直链亚烷基或C2-5亚链烯基；
n是0或1；
R1是H、C1-8支链或直链烷基、C2-8链烯基、或者芳基或芳烷基，其中 的每个可以任选被一个或多个卤素或CF3基团取代；
Ar1是
或
其中
X是S、O、NH或NR’，其中R’是C1-3烷基；
E是N或CR4；
Y是CH或N；
R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-3烷基，p是0或1，B 是H、卤素、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、SO2NH2、 NHAra、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Arc、SO2Re、CF3、CN、COOH、COORf、 CONH2、COONHArd、CONHRg、COAre、CORh、S(CO)Rs、ORt、OArf、任 选含有一个或多个杂原子的脂环基，其任选被一个或多个OH、CORu、卤 素或CF3基团取代、或者任选被一个或多个C1-5烷基、卤素、SRi或CF3基 团取代的杂芳基；或者
R2和R3连接形成任选含有一个或多个杂原子的饱和或不饱和环系，其 任选被一个或多个卤素、OH或CF3基团取代；
Ara-f各自独立地是芳基，其任选被一个或多个C1-5烷基、卤素或CF3基 团取代；
Ra-i、Rs、Rt和Ru各自独立地是C1-5烷基，其任选被一个或多个烷氧基、 卤素或CF3基团取代；
条件是，R2、R3和R4中至少一个不是H；
Ar2是
或
其中
Z是S、O、NH或NR”，其中R”是C1-3烷基；
R5、R6、R7、R8以及R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-3烷基，q是 0或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHArg、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHArh、SO2NHRm、SO2Ari、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHArj、CONHRq、ORv、COArk或CORr；
Rj-r、Rv各自独立地是C1-5烷基；
Arg-k各自独立地是芳基；
条件是，取代基R5、R6、R7、R8以及R9中至少一个不是H；
R10、R11、R12和R13各自独立地是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2或者CF3。
本发明另一方面涉及通式Id化合物，

其中
W是C1-5支链或直链烷基或C2-5链烯基；
n是0或1；
R1是H、C1-8支链或直链烷基、C2-8链烯基、或者芳基或芳烷基；
Ar1是
或
其中
X是O、NH或NR’，其中R’是C1-3烷基；
Y是CH或N；
R2、R3和R4各自独立地是(A)pB，其中A是C1-3烷基，p是0或1，B 是H、卤素、C1-5烷基、NO2、OH、NH2、NHRa、NRbRc、SO3H、SO2NH2、 NHAra、SO2NHArb、SO2NHRd、SO2Arc、SO2Re、CF3、CN、COOH、COORf、 CONH2、COONHArd、CONHRg、COAre、CORh、或者任选被一个或多个 C1-5烷基、卤素、SRi或CF3基团取代的杂芳基；
Ra-i各自独立地是C1-5烷基；
条件是，R2、R3和R4中的至少一个不是H；
Ar2是
或
其中
Z是S、O、NH或NR”，其中R”是C1-3烷基；
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地是(L)qM，其中L是C1-3烷基，q是0 或1，M是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2、NHAr、NHRj、NRkRl、 SO3H、SO2NH2、SO2NHAr、SO2NHRm、SO2Ar、SO2Rn、CF3、CN、COOH、 COORp、CONH2、CONHAr、CONHRq、COAr或者CORr；
Ri-r各自独立地是C1-5烷基；
条件是，取代基R5、R6、R7、R8和R9中的至少一个不是H；
R10、R11、R12和R13各自独立地是H、C1-5烷基、卤素、NO2、OH、NH2或CF3；
条件是，所述化合物不是
5-[(4-氯苯基)氨基]磺酰基-2-呋喃羧酸；
N-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-4-氯-3-硝基苯磺酰胺；
2，6-二氯-N-[4-氯-3-(3-二乙氨基丙基)-苯基]4-三氟甲基苯-磺酰胺；或
2，6-二氯-N-[4-氯-3-(3-二甲氨基丙基)-苯基]4-三氟甲基苯-磺酰胺。
关于通式1a、1b和1d的化合物的优选实施方案与上面通式I化合物的 定义相同。
本发明另一方面涉及选自下面的化合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[1]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)-酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
4-溴-5-氯噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[4]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[8]；
5-氯噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[11]；
5-(2-甲硫基-嘧啶-5-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)-酰胺[12]；
4-噁唑-2-基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[13]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺[14]；
4-溴-5-氯噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[15]；
5-溴噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[16]；
5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[17]；
5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[18]；
N-(4-氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[19]；
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[20]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-硝基苯磺酰胺[21]；
N-(2，4-二氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[22]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[23]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[24]；
5-苯磺酰基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[25]；
5-氯噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[26]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[27]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[28]；
4-氯-N-(3，4-二氯苯基)-3-硝基苯磺酰胺[30]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)- 酰胺[31]；
5-氯噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氟苯基)-酰胺][32]；
5-氯噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-三氟甲基-苯基)-酰胺][33]；
4-甲基-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[34]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[35]；
3-氨基-4-甲基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯磺酰胺[36]；
N-(4-氯苯基)-4-甲基-3-硝基苯磺酰胺[37]；
4-氯-N-(4-氯苯基)-3-硝基-苯磺酰胺[38]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)-酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)-酰胺[40]；
5-溴-6-氯吡啶-3-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[41]；
5-溴-6-氯吡啶-3-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[42]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基- 苯基)酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
4-氯-N-(3，5-二氯苯基)-3-硝基-苯磺酰胺[47]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯基)酰胺[50]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-甲酰胺[51]；以及
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基苯甲基)酰胺[52]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-异丁基-酰胺[58]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(1H-苯并咪唑-2-基)-酰胺[59]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(6-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[60]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯基酰胺[62]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲酰胺[64]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
5-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[68]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][70]；
5-乙基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[71]；
硫代乙酸S-[5-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3-硝基-噻吩-2-基]酯[72]；
5-甲基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[73]；
5-甲基-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][74]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)- 酰胺[75]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[76]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[77]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-3-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基- 苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[78]；
5-吗啉-4-基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[79]；
5-(2-甲氧基-乙基氨基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[80]；
4-氯-N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-3-硝基-苯磺酰胺[81]；
N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺[82]；
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]；
6-氯-咪唑并[2，1-b]噻唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[84]；
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷-6-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[85]；
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷-6-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺 [86]；
6-苯氧基-吡啶-3-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[87]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(4-氯-3-硝基-苯基)-酰胺[88]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-吡唑-1-基-苯磺酰胺[89]；
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯[90]；
4-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸[91]；
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸[92]；
2-(4-氯-苯基氨磺酰基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯[93]；
3，5-二氯-N-(4-氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺[94]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3，5-二氯-4-羟基-苯磺酰胺[95]；
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺[96]；
N-(4-氯-苯基)-4-硝基-苯-磺酰胺[97]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺[98]；
4-氨基-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-苯磺酰胺[99]；
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺[100]；
3，5-二氯-N-(3，5-二氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺[101]；
4-氨基-3-氯-N-(4-氯-苯基)-苯磺酰胺[102]；
3-氯-N-(4-氯-苯基)-4-甲氧基-苯磺酰胺[103]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-4-甲氧基-苯-磺酰胺[104]；
N-(3-氯-4-硝基-苯基)-3，5-双-三氟甲基-苯磺酰胺[105]；
3-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺 [106]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2-硝基-苯磺酰胺[107]；
3-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-苯甲酸[108]；
3，5-二氯-N-(4-氯-苯甲基)-4-羟基-苯磺酰胺[109]；
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯甲基)-苯磺酰胺[110]；
3，5-二氯-4-羟基-N-[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-苯磺酰胺[111]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[112]；
N-(3，5-二氯-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺[113]；
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[114]；
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[115]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[117]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(2，4-二氯-苯基)-酰胺[118]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[119]；
苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[120]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[121]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[122]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[123]；
5-吡啶-2-基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[124]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[125]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[126]；
3，5-二氯-N-(4-氟-苯甲基)-4-羟基-苯磺酰胺[127]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2，6-二氯-苯磺酰胺[128]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-2-甲基-苯基)-酰胺[129]；
5-(3-羟基-哌啶-1-基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[130]；以及
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-硝基-苯基)-酰胺[131]。
优选的化合物是选自下面的化合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯-磺酰胺[35]；
4-氯-N-(4-氯苯基)-3-硝基苯-磺酰胺[38]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)酰胺[40]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基) 酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)甲酰胺[51]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲酰胺[64]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)-酰 胺[75]；以及
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]。
更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[5]、[6]、[7]、 [35]、[39]、[40]、[44]-[46]、[48]、[49]、[53]-[57]、[61]、[63]-[67]、[75]以 及[83]。
尤其更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[5]、[6]、 [39]、[40]、[46]、[48]、[49]、[53]、[56]、[57]、[61]、[63]、[64]、[66]以及 [83]。
进一步更优选的通式I化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[46]、[49]、 [61]、[63]和[83]。
在另一优选的实施方案中，本发明化合物是选自下面的化合物：
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)酰胺[2]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)酰胺[3]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-羟基苯基)酰胺[5]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[6]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氟苯基)甲酰胺[7]；
5-溴噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[18]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)酰胺[23]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)酰胺[27]；
4，5-二溴噻吩-2-磺酸(3，4-二氯苯基)酰胺[28]；
5-氯噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-三氟甲基-苯基)酰胺][33]；
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)苯-磺酰胺[35]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氯苯基)酰胺[39]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-二氟苯基)酰胺[40]；
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基) 酰胺[43]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)酰胺[44]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-氟苯甲酰胺[45]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸4-三氟甲基苯甲酰胺[46]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]酰胺[48]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基乙基]酰胺[49]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯基)酰胺[50]；
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸(4-氯苯基)甲酰胺[51]；以及
5-氯-4-硝基噻吩-2-磺酸甲基(4-三氟甲基-苯甲基)酰胺[52]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺[53]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺[54]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺[55]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺[56]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺[57]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(1H-苯并咪唑-2-基)-酰胺[59]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(6-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺[60]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺[61]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯酰胺[62]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺[63]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲酰胺[64]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺[65]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺[66]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺[67]；
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[69]；
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][70]；
硫代乙酸S-[5-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3-硝基-噻吩-2-基]酯[72]；
5-甲基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[73]；
5-甲基-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺][74]；
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基-苯甲基)- 酰胺[75]；
5-(2-甲氧基-乙基氨基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[80]；
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺[83]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(4-氯-3-硝基-苯基)-酰胺[88]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-4-甲氧基-苯-磺酰胺[104]；
N-(3-氯-4-硝基-苯基)-3，5-双-三氟甲基-苯磺酰胺[105]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺[112]；
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[117]；
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[119]；
苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[120]；
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺[122]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[125]；
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺[126]；
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2，6-二氯-苯磺酰胺[128]；
5-(3-羟基-哌啶-1-基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺[130]；以及
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-硝基-苯基)-酰胺[131]。
更优选的化合物是选自下面的化合物：[2]、[3]、[6]、[7]、[33]、[39]、 [40]、[44]-[46]、[48]-[57]、[59]-[67]、[72]、[75]、[130]以及[131]。
尤其更优选的化合物是选自下面的化合物：[7]、[45]、[46]、[50]-[53]、 [64]-[67]、[72]以及[75]。
进一步更优选的化合物是选自下面的化合物：[50]、[51]、[65]、[67]和 [75]。
本发明还涉及上述化合物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
药物组合物
本发明第四方面涉及一种药物组合物，它含有与一种或多种可药用稀释 剂、赋形剂或载体混合的如所述第一方面和第三方面所定义的通式I化合物。 即使本发明的化合物(包括其可药用盐、酯以及可药用溶剂化物)可以单独施 用，但是通常它们与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是用于人的 治疗。该药物组合物可以以人药或兽药的形式用于人或动物。
这类适合用于本文所描述的各种不同形式的药物组合物的赋形剂实例 可以参见由A Wade和PJ Weller编著的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第二版，(1994)。
适合于医疗应用的可接受载体或稀释剂是药物领域众所周知的，其描述 在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司(A.R.Gennaro编 著.1985)。
适宜载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘 露醇、山梨醇等。适宜稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
对药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据所希望的给药方式和常规 药物操作经验。药物组合物除了可以含有载体、赋形剂或稀释剂之外，还可 以含有任意适宜的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、助溶剂。
适宜粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖类例如葡萄糖、无水乳糖、 自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶例如阿拉伯树胶、 西黄芪胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
适宜润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸 钠、氯化钠等。
药物组合物中可以含有防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实 例包括苯甲酸钠、山梨酸以及对-羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和助 悬剂。
盐/酯
本发明化合物可以以盐或酯的形式存在，特别是可药用盐或酯。
本发明化合物的可药用盐包括其适宜的酸加成盐或碱式盐。有关适宜的 可药用盐的综述可以参见Berge等人，J Pham Sci， 66，1-19(1977)。可以与例 如下面的物质形成盐：强的无机酸，例如无机酸如硫酸、磷酸或盐酸；强的 有机羧酸，例如未被取代或被取代(例如被卤素取代)的具有1-4个碳原子的 烷基羧酸如乙酸；饱和或不饱和二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马 来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或四酞酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗 坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨 酸或谷氨酸；苯甲酸；或者有机磺酸，例如未被取代或被取代(例如被卤素 取代)的(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸如甲磺酸或对甲苯磺酸。
使用有机酸或醇/氢氧化物可以形成酯，这取决于被酯化的官能团。有机 酸包括羧酸，例如未被取代或被取代(例如被卤素取代)的具有1-12个碳原子 的烷基羧酸如乙酸；饱和或不饱和二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、 马来酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸或四酞酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟 基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸；或者有机磺酸，例如未被取代或被取代(例如被卤素取代)的(C1-C4)- 烷基-或芳基-磺酸如甲磺酸或对甲苯磺酸。适宜的氢氧化物包括无机氢氧化 物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未被取代或被 取代(例如被卤素取代)的具有1-12个碳原子的烷醇。
对映异构体/互变异构体
在前面所讨论的本发明各个方面中，本发明包括适宜的本发明化合物所 有的对映异构体和互变异构体在内。本领域技术人员可以识别出那些具有光 学特性(一个或多个手性碳原子)或互变异构特性的化合物。相应的对映异构 体和/或互变异构体可以按照本领域已知的方法分离/制备。
立体和几何异构体
某些本发明化合物可能存在立体异构体和/或几何异构体-例如它们可能 具有一个或多个不对称和/或几何中心，因而可能存在两种或更多种立体异构 和/或几何异构形式。本发明对这些化合物的所有单独立体异构体和几何异构 体、以及它们的混合物的应用进行了预期。在权利要求书中所使用的术语均 包括上述形式，只要所述形式仍然具有适宜的功能活性(虽然不必达到相同 的程度)。
本发明还包括这些化合物或其可药用盐的所有适宜的同位素变化。将本 发明化合物或其可药用盐的同位素变化定义为其中至少一个原子被具有相 同原子序数但是原子质量不同于自然界通常发现的原子质量的原子所取代。 可并入本发明化合物或其可药用盐的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、 硫、氟以及氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、 35S、18F和36Cl。本发明化合物或其可药用盐的某些同位素变化，例如那些 合并有具有放射活性的同位素如3H或14C的同位素变化，可用于药物和/或 底物组织分布研究。含氚即3H、和碳-14即14C的同位素由于易于制备和检 测因而尤其优选。另外，被同位素例如氘即2H取代，由于更高的代谢稳定 性从而可以。提供某些治疗优势，例如延长体内半衰期或降低所需剂量，因此 在某些情形下可能优选这种情况。本发明所述的本发明化合物及其可药用盐 的各种同位素变化通常可以按照常规方法使用适宜试剂的适宜同位素变化 制备得到。
溶剂化物
本发明还包括本发明化合物的溶剂化物的用途。权利要求书中所使用的 术语包括这些形式在内。
多晶型物
此外，本发明还涉及本发明化合物的各种晶型、多晶型以及无水/含水形 式。在制药工业领域应该很容易理解，那就是这类化合物通过稍微改变纯化 方法和/或其合成制备过程中所使用的分离溶剂，就可以分离得到其任意一种 上述形式。
前药
本发明另外还包括本发明化合物的前药形式。前药通常是指其中一个或 多个适宜基团被结构修饰过的化合物，这种结构修饰在被给药至人或哺乳动 物客体之后可以发生逆转。这种逆转通常是通过天然存在于这类客体中的酶 来完成，当然为了在体内完成这种逆转也可以与前药一起同时服用第二药 物。这种结构修饰的实例包括酯化(例如上文所述的任意一种情形)，其中逆 转可以通过酯酶等来完成。其它的此类体系对于本领域技术人员而言也是众 所周知的。
给药方法
本发明的药物组合物适合口服给药、直肠给药、阴道给药、肠胃外给药、 肌肉给药、腹膜内给药、动脉内给药、膜内给药、支气管内给药、皮下给药、 皮内给药、静脉内给药、鼻腔给药、口腔给药或者舌下给药。
对于口服给药，优选使用的是制成压制片剂、丸剂、片剂、gellules、滴 剂、以及胶囊剂。这些组合物每个剂量优选含有1-250mg、更优选含有10-100 mg活性成分。
其它的给药形式包括溶液剂或乳剂，它们可以通过静脉内、动脉内、鞘 内、皮下、皮内、腹膜内或者肌肉内注射给药，并且可以由无菌或灭菌溶液 制备得到。本发明的药物组合物还可以是栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、 洗剂、软膏剂、乳膏、凝胶剂、喷雾剂、溶液剂或者扑粉的形式。
经皮给药的替代方式就是使用皮肤贴片(skin patch)。例如，可以将活性 成分合并入由聚乙二醇的含水乳液或者液体石蜡组成的乳膏中。还可以将活 性成分按照1-10重量％的浓度合并入软膏中，该软膏由白蜡或者混合有所需 稳定剂和防腐剂的白色软石蜡基质组成。
可注射制剂每个剂量可含有10-1000mg、优选含有10-250mg活性成分。
可以将组合物制成单位剂量形式，也就是含有单位剂量的单个部分或者 是单位剂量的多单元或亚单元形式。
剂量
本领域普通技术人员未经过度试验完全可以很容易确定施用给客体的 任意一种即时组合物的适宜剂量。典型的是，医生可以确定最适合用于个体 患者的实际剂量，其取决于各种因素包括所使用具体化合物的活性、该化合 物的代谢稳定性和作用时间长短、年龄、体重、身体概况、性别、饮食、给 药方式和时间、排泄速度、联合用药情况、具体症状的严重程度、以及该个 体正在接受的治疗情况。本文所述的剂量可被解释成一般情形下使用的剂 量。当然出现某些更高或者更低剂量范围的个别情形也是应该的，其也落入 本发明的范围之内。
根据需要，本发明药物可以按照0.01-30mg/kg体重的剂量给药，例如 0.1-10mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重。
在示例性实施方案中，为了治疗恶性肿瘤向患者施用一个或多个10-150 mg/天的剂量。
并用药物
本发明另一方面还涉及含有至少一种上述的本发明化合物和至少一种 细胞毒素剂的并用药物。
优选这种并用药物是协同并用。因此优选本发明化合物能够与一种或多 种其它细胞毒素剂产生协同相互作用，例如增强其它药物的细胞毒素活性。
在一优选实施方案中，细胞毒素剂是化学治疗剂。
在特别优选的实施方案中，该化学治疗剂是顺铂或依托泊苷。进一步优 选地，本发明化合物具有化学致敏活性，例如通过协同作用增强顺铂和依托 泊苷的细胞毒素活性。换句话说，本发明化合物和细胞毒素剂的这种联合作 用产生了比通过每种成分的单独活性相叠加的期望值更高的活性。在后文实 施例中将会进一步具体描述这种协同效应。
本发明另一方面涉及含有与可药用稀释剂、赋形剂或载体相混合的至少 一种上述的本发明化合物、以及一种或多种细胞毒素剂。
在特别优选的实施方案中，联合施用一种或多种本发明的化合物和一种 或多种其它的抗癌剂，例如市场上可得到的已有抗癌药物。在这种情形中， 在施用本发明化合物之前、同时或者之后还可以施用一种或多种其它的抗癌 药物。
因此，本发明一方面在于提供一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包 括向患者施用至少一种上述的本发明化合物，另外在给药之前、同时或者之 后还施用一种或多种其它的细胞毒素剂。
抗癌药物通常是联合使用时更有效。特别是为了避免主要毒性反应、作 用机理和耐药性机理的重复叠加，需要进行联合治疗。此外，为了在最短的 时间间隔内以最大耐受剂量服用最多的药物也需要进行联合用药。并用化学 治疗药物的主要优势在于它可以通过生物化学作用促进附加或可能的协同 作用，并且它还可以在早期癌细胞中降低耐药性出现的几率，而耐药性的出 现几率与最初使用单一药物进行的化学治疗有关。通过服用甲酰四氢叶酸以 增强5-氟尿嘧啶的活性细胞内代谢产物与其靶点胸苷酸合酶的结合，从而使 其细胞毒素活性得到提高，上述实例也阐释了在选择药物并用时如何利用各 种生物化学相互作用。
很多不同的联合疗法被用于当前癌症和白血病的治疗中。有关临床实践 更深入的综述可以参见E.E.Vokes和H.M.Golomb编著的″Oncologic Therapies″，由Springer出版。
通过对测试化合物以及现有药物或者在特定癌症的治疗初期或在来自 于该类型癌症的细胞系中被认为具有重要价值的药物进行研究，可以寻求到 有益的并用药物。上述过程还可用于确定药物服用的先后顺序，也就是确定 在之前、同时还是在之后进行给药。这样的给药方案可能是本文所描述的所 有周期活性药物的共有特征之一。
本发明化合物还可以与放射治疗进行联合应用。因此，本发明另一方面 在于提供一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者施用至少一种上 述的通式I化合物，另外在给药之前、同时或者之后结合使用放射治疗。
测定方法
本发明第五方面涉及上述第一方面所定义的通式I化合物在测定对 HDM2结合力的方法中的用途。
优选地，该测定方法能够识别出可以影响HDM2对p53和/或E2F相互 作用的候选化合物。
进一步更优选地，该测定方法能够识别出可以抑制HDM2与p53和/或 E2F之间相互作用的候选化合物。
尤其优选地，该测定方法是竞争性结合测定方法。
优选地，该竞争性结合测定方法包括在p53衍生肽存在下，使本发明上 述第一方面所定义的通式I化合物与HDM2接触，然后检测在HDM2和所 述p53衍生肽之间的相互作用中所出现的任意变化。
在特别优选的实施方案中，所述p53衍生肽是荧光标记或者生物素化的 p53衍生肽。
本发明第六方面提供了一种检测配体对HDM2结合力的方法，所述方 法包括下述步骤：
(i)在p53衍生肽存在下，使配体与HDM2接触；并
(ii)检测在HDM2和所述p53衍生肽之间的相互作用中所出现的任意变 化；
其中所述配体是根据本发明上述第一方面的化合物。
本发明一方面涉及一种包括下述步骤的方法：
(a)完成上文所述的测定方法；
(b)识别出能够结合配体结合区域的一种或多种配体；和
(c)制备一定量的所述一种或多种配体。
本发明另一方面提供了包括下述步骤的方法：
(a)完成上文所述的测定方法；
(b)识别出能够结合配体结合区域的一种或多种配体；然后
(c)制备含有所述一种或多种配体的药物组合物。
本发明另一方面提供了包括下述步骤的方法：
(a)完成上文所述的测定方法；
(b)识别出能够结合配体结合区域的一种或多种配体；
(c)对所述一种或多种能够结合配体结合区域的配体进行修饰；
(d)完成上文所述的测定方法；
(e)任选制备含有所述一种或多种配体的药物组合物。
本发明还涉及通过上文所述方法识别出来的配体。
本发明再一方面涉及含有通过上文所述方法识别出来的配体的药物组 合物。
本发明另一方面涉及通过上文所述方法识别出来的配体在制备用于治 疗增殖性疾病的药物组合物中的用途。
优选地，所述候选化合物是通过对本发明化合物进行常规SAR修饰而 得到的。
本文所使用的术语“常规SAR修饰”是指本领域已知的通过化学衍生手 段而对给定化合物进行变型的常规方法。
上述方法还可用于筛选可用作HDM2和p53之间相互作用的抑制剂的 配体。
化学合成
本发明化合物可以按照本领域已知的方法制备。特别地，可以使用芳基 磺酰基卤化物与芳基胺之间的缩合反应。通过在该反应中使用芳基仲胺或者 通过将伯双芳基酰胺前体烷基化可以得到N-取代的双芳基磺酰胺。利用烷 基或芳烷基卤化物通过磺酰基氨基脱卤化反应或者利用烷基或芳烷基卤化 物通过例如Tsunoda反应[Tsunoda T，Otsuka J，Yamamiya Y，Ito S；Chem.Lett. 1994：539-542]可以完成烷基化。许多含有噻吩磺酰基官能团的本发明双芳基 磺酰胺以及用于磺酰胺缩合反应的适宜噻吩磺酰基卤化物前体可以按照 [Cremlyn RJ，Goulding KH，Swinbourne FJ，Yung K-M；Phosphorus Sulfur 1981； 10：111-119；Obafemi CA；Phosphorus Sulfur 1982；13：119-131.]所描述的方法 制备。
通过下面的非限制性实施例同时参照下面的附图对本发明进行进一步 描述，其中：
图1示出了化合物2或DNA破坏诱导剂在HDM2途径中的关键蛋白水 平上和细胞系范围内的细胞形态学方面的作用。更具体地说，图1示出了： (A)化合物2或依托泊苷对于AGS细胞中的细胞凋亡蛋白的诱导活性。AGS 使用5倍[IC50]值的化合物2或依托泊苷处理，然后在指定的时间点上收集。 通过SDS-PAGE分离出等量的细胞溶菌液，然后利用所述抗体通过免疫印迹 法进行分析。对细胞圆形化(cell rounding)程度的评价是在各自电泳泳道(lane) 的上方进行的。箭头符号表示PARP的85-kDa分解产物(代表细胞凋亡)的位 置。(B)化合物2在AGS细胞(野生型53)的细胞周期性蛋白水平上的作用。 AGS细胞使用5倍[IC50]值的化合物2或依托泊苷处理，然后在指定的时间 点上收集。通过SDS-PAGE分离出等量的细胞溶菌液，然后利用所述抗体通 过免疫印迹法进行分析。对细胞圆形化程度的评价是在各自电泳泳道的上方 进行的。(C)阴性对照化合物(参考实施例10)、化合物2、顺铂、以及茴香霉 素在MCF7细胞中的关键蛋白水平上的作用。MCF7细胞使用13.5μM的阴 性对照化合物或者5倍[IC50]值的化合物2处理。顺铂和茴香霉素(一种转录 抑制剂)分别为50μM或37μM。在不同时间点上收获细胞；然后制备得到 溶菌液并通过SDS-PAGE分离，再用免疫印迹法分析。这里示出了被检测到 的蛋白质。评价了圆形化或移动细胞的程度以及活细胞的百分比。(D)化合 物2或依托泊苷在蛋白质水平上和H1299细胞(p53裸细胞)的细胞形态学方 面的作用。H1299使用5倍[IC50]值的化合物2或依托泊苷处理，然后在指定 的时间点上收集。通过SDS-PAGE分离出等量的细胞溶菌液，然后利用所述 抗体通过免疫印迹法进行分析。对细胞圆形化程度的评价是在各自电泳泳道 的上方进行的。(E)5倍[IC50]值的化合物2在SJSA1细胞(过度表达HDM2) 的细胞周期蛋白水平上的作用。SJSA1细胞使用5倍[IC50]值的化合物2处理， 然后在指定的时间点上收集。通过SDS-PAGE分离出等量的细胞溶菌液，然 后利用一系列抗体通过免疫印迹法进行分析。对细胞圆形化程度的评价是在 各自电泳泳道的上方进行的。
图2示出了化合物49对于AGS、SJSA1和H1299细胞的作用。每种细 胞系使用5倍[IC50]值的化合物处理，然后在指定的时间点上收集。通过 SDS-PAGE分离出等量的细胞溶菌液，然后利用所述抗体通过免疫印迹法进 行分析。对细胞圆形化程度的评价是在各自电泳泳道的上方进行的。箭头符 号表示PARP的85-kDa裂解产物(代表细胞凋亡)的位置。
图3示出了化合物2在MCF7和H1299细胞的形态学和细胞存活率方 面的作用。细胞使用5倍[IC50]值的化合物2处理，然后在不同时间点上收 集。在细胞被胰蛋白酶化之前计算圆形细胞的百分比，然后利用锥虫蓝计算 细胞存活率。
图4示出了化合物68和69对于MCF7细胞和H1299细胞的作用。更 具体地说：(A)将MCF7细胞使用5倍[IC50]值的化合物69以及相同浓度的 68处理，然后在指定的时间点上收集。通过SDS-PAGE分离出等量的细胞 溶菌液，然后利用各种抗体通过免疫印迹法进行分析。对细胞圆形化程度的 评价是在各自电泳泳道的上方进行的。箭头符号表示PARP的85-kDa裂解 产物(代表细胞凋亡)的位置。(B)将H1299细胞使用5倍[IC50]值的化合物69 和相同浓度的68处理，然后在指定的时间点上收集并分析。
图5示出了化合物2和顺铂在MCF7和H1299细胞的细胞周期分布性 方面的作用。细胞未经处理，或者使用5倍[IC50]值的化合物2或顺铂处理， 然后在指定的时间点上收集。细胞用碘化丙啶(propidium iodide)染色，并使 用流式细胞测定器测定细胞周期位置。
图6示出了化合物2在AGS和H1299细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶(caspase)活化方面的作用。更具体地说：(A)将细胞使用3倍[IC50]值 的化合物2或顺铂处理，然后在指定的时间点上收集。制备得到细胞溶菌液， 利用caspACE测定方法测定出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性，然后将 数值描在图上。(B)将细胞使用5倍[IC50]值的化合物2或顺铂处理，然后在 指定的时间点上收集。AGS细胞还用化合物2在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂Z-VAD.fmk存在下进行培养。制备得到细胞溶菌液，利用 caspACE测定方法测定出天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性，然后将数值 描在图上。
图7示出了HDM2和HDMX siRNA在MCF7细胞的p53和E2F-1水平 上的作用。更具体地说：(A)MCF7细胞未经处理(电泳泳道1-3)模拟转染(电 泳泳道4-6)，使用g13对照siRNA(电泳泳道7-9)、HDM2 siRNA 1403(电泳 泳道10-12)、或HDM2 siRNA 1403和1404(电泳泳道13-15)转染。每隔24 小时重复上述操作。每次转染24小时之后收集细胞，这样这些细胞就被转 染一次、两次、或者三次，然后通过Western印迹法分析。(B)MCF7细胞未 经处理(电泳泳道1-3)模拟转染(电泳泳道4-6)，使用g13对照siRNA(电泳泳 道7-9)、HDM2 siRNA 1403(电泳泳道10-12)、HDMX siRNA(电泳泳道13-15) 或HDM2和HDMX siRNA(电泳泳道16-18)转染。在第24、48、和72小时 收集细胞，然后通过Western印迹法分析。
实施例
概述
使用Vydac 218TP54柱(C18反相固定相；4.5×250mm柱)、用所述的线性 梯度的乙腈水溶液(含有0.1％CF3COOH)以1mL/min的速度洗脱，然后再无 梯度洗脱，这样测得HPLC保留时间(tR)。HPLC方法B是指下面的方法： Supercosil ABZ+Plus柱(21.2×250mm)，使用5-95％的线性梯度的乙腈水溶液 以20mL/min的速度洗脱10分钟，然后再无梯度洗脱。使用了UV监视器(254 nm)。除非另有说明，所有的纯化操作均是使用硅胶60A(粒径为35-70微米)、 己烷/EtOAc(4∶1)洗脱来完成的。薄层色谱(TLC)是使用预先涂覆有0.2mm硅 胶60 F254的铝片完成的。1H NMR光谱是使用各种不同的装置记录的。化学 位移使用TMS为标准，以ppm给出的，耦合常数(J)单位为Hz。质谱是在正离 子或负离子电喷雾条件下记录的。
实施例1
制备伯双芳基磺酰胺的一般方法
将适宜的磺酰基氯化物(1.0mol当量)悬浮在二氯甲烷中。悬浮液冷却至 0℃。反应混合物在搅拌的同时，加入适宜的氨基组分(适宜的如苯胺、苄基 胺等)(1.1mol当量)和吡啶(1.5mol当量)。反应混合物慢慢温热至室温。继续 搅拌直到TLC[庚烷∶乙酸乙酯(2∶1)]表明反应进行完全。分离产物，按照下面 的步骤纯化：将反应混合物用二氯甲烷稀释，然后连续用稀盐酸水溶液、饱 和NaHCO3水溶液、水以及盐水洗涤。有机部分用MgSO4干燥，减压下浓 缩得到粗产物磺酰胺。柱色谱处理[柱(Isolute SI；Jones Chromatography)，庚 烷∶乙酸乙酯(12∶1→3∶1)]得到所需的双芳基磺酰胺。
按照上述方法制备得到本发明的伯双芳基磺酰胺化合物。代表化合物的 具体解析结果如下所示：
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺2。TLC RF＝0.72(庚烷∶乙酸乙 酯，2∶1)；HPLC tR 17.08分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.64(1H， br s，NH)，7.05(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.27(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.84(1H，s，噻吩 -H)；MS 352.94(M-H)-，C10H6Cl2N2O4S2＝353.20。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氟-苯基)-酰胺3。TLC RF＝0.35(庚烷∶乙酸乙 酯，2∶1)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.83(1H，br s，NH)，6.99(2H，t，J8.5，9.0，Ph-H)， 7.10(2H，dd，J8.5，9.0Ph-H)，7.82(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺6。TLC RF＝0.45(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；1H NMR(CD3OD)δ：7.37(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.62(2H，d，J8.5， Ph-H)，8.01(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺8。TLC RF＝0.44(己烷∶EtOAc， 4∶1)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.86(d，1H，J4.1，噻吩-H)，6.95(s，1H，NH)，7.24(d， 2H，J8.4，Ph-H)，7.36(d，1H，J4.1，噻吩-H)，7.57(d，2H，J8.4，Ph-H)；MS 341[M]+，C11H7ClF3NO2S2＝341.76。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺9。HPLC tR 7.48分钟 (方法B)；MS 532.1(M-H)-79Br81Br，C12H5Br2F6NO2S2＝533.10。
5-氯-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺10。HPLC tR 8.45分钟(方法B)；MS 306.1(M-H)-35Cl2，C10H7Cl2NO2S2＝308.20。
5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺11。HPLC tR 7.31分钟(方 法B)；)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.85(d，1H，J4.1，噻吩-H)，7.31(s，1H，NH)， 7.34(d，1H，J4.1，噻吩-H)，7.54(s，2H，Ph-H)，7.60(s，1H，Ph-H)；MS 408.0(M-H)-35Cl，C12H6ClF6NO2S2＝409.76。
5-(2-甲硫基-嘧啶-5-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺12。HPLC tR 9.01分钟(方法B)；MS 429.9(M-H)-35Cl2，Cl5H11Cl2N3O2S3＝432.3677。
4-噁唑-2-基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺13。HPLC tR 9.02分钟(方法 B)；MS 367.1(M-H)-，C16H11F3N2O3S＝368.33。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺14。HPLC tR 9.13分钟 (方法B)；MS 435.1(M-H)-，C17H10F6N2O3S＝436.33。
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺15。HPLC tR 8.25分钟 (方法B)；MS 419.9(M-H)-81Br35Cl，C11H6BrClF3NO2S2＝420.65。
5-溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺16。HPLC tR 9.57分钟(方法B)；MS 352.0(M-H)-81Br35Cl，C10H7BrClNO2S2＝352.66。
5-溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺17。HPLC tR 9.11分钟(方法B)； MS 385.8(M-H)-81Br35Cl2，C10H6BrCl2NO2S2＝387.10。
5-溴-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺18。HPLC tR 8.07分钟(方 法B)；MS 453.9(M-H)-81Br，C12H6BrF6NO2S2＝454.21。
N-(4-氯-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺19。HPLC tR 9.06分钟(方法B)；MS 311.0(M-H)-35Cl，C12H9ClN2O4S＝312.73。
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺20。MS 345.0(M-H)-， C13H9F3N2O4S＝346.28。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺21。MS 413.0(M-H)-， C14H8F6N2O4S＝414.29。
N-(2，4-二氯-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺22。MS 344.8(M-H)-35Cl2， C12H8Cl2N2O4S＝347.17。
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺23。MS 446.0(M-H)-， C17H12F3NO4S3＝447.47。
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺24。MS 411.9(M-H)-35Cl， C16H12ClNO4S3＝413.92。
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺25。MS 446.0(M-H)-35Cl2， C16H11Cl2NO4S3＝448.36。
5-氯-噻吩-2-磺酸(3，4-二氯-苯基)-酰胺26。MS 339.8[M-H]-35Cl3， C10H6Cl3NO2S2＝342.65。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯基)-酰胺27。1H NMR(CDCl3)δ： 6.69(s，1H，NH)，7.26(s，1H，Ph-H)，7.28(m，1H，Ph-H)，7.33(s，1H，噻吩-H)， 7.42(d，2H，J4.2，Ph-H)；MS 463.8(M-H)-79Br81Br，C11H6Br2F3NO2S2＝ 465.10。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，4-二氯-苯基)-酰胺28。MS 465.7(M-H)- 81Br79Br37Cl35Cl2，C10H5Br2Cl2NO2S2＝466.00。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺29。TLC RF＝0.78(庚 烷∶乙酸乙酯，2∶1)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.53(3H，s，Ph-H)，7.60(1H，d，J8.5， Ph-H)，7.85(1H，m，Ph-H)8.30(1H，s，Ph-H)；MS 447.0(M-H)-35Cl， C14H7ClF6N2O4S＝448.72。
4-氯-N-(3，4-二氯-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺30。MS 380.9(M-H)-37Cl35Cl2， C12H7Cl3N2O4S＝381.62。
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基苯基)-酰 胺31。TLC RF＝0.39(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 22.14分钟(10-70％，20 分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：3.915(3H，s，NCH3)，6.60(1H，s，二唑-H)，7.06(1 H，d，J3.5，噻吩-H)，7.11(1H，br s，NH)，7.23(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.52(3H，m， Ph-H & 噻吩-H)；MS 456.24(M+H)+，C16H11F6N3O2S2＝455.40。
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氟-苯基)-酰胺]32。HPLC tR 19.68分钟 (10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3)δ：6.88(4H，m，Ph-H)，6.97(4H，m，Ph-H)， 7.47(1H，s，噻吩-H)；MS 462.95(M-2H)-，C16H11ClF2N2O4S3＝464.92。
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-三氟甲基-苯基)-酰胺]33。HPLC tR 22.54分 钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3)δ：7.09(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.14(2H，d，J 8.5，Ph-H)，7.40(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.46(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.66(1H，s，噻吩 -H)；MS 562.88(M-2H)-，C18H11ClF6N2O4S3＝564.93。
4-甲基-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺34。HPLC tR 20.32分钟 (10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3)δ：2.90(3H，s，CH3)，7.15(2H，d，J8.0， Ph-H)，7.38(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.41(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.81(1H，d，J8.5， Ph-H)，8.38(1H，s，Ph-H)；MS 359.11(M-H)-，C14H11F3N2O4S＝360.31。
4-氯-3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺35。TLC RF＝0.40(庚烷∶乙 酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 15.45分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.16(2 H，d，J8.5，Ph-H)，7.43(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.57(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.83(1H， dd，J8.5，8.5，Ph-H)，8.29(1H，d，J2.5，Ph-H)。
3-氨基-4-甲基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺36。HPLC tR 17.14分钟 (10-70％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.07(3H，s，CH3)，7.00(3H，m，Ph-H)， 7.11(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.37(2H，d，J8.0，Ph-H)；MS 329.15(M-H)-， C14H13F3N2O2S＝330.33。
N-(4-氯-苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺37。1H NMR(CDCl3.)δ：2.58(3H， s，CH3)，6.72(1H，br s，NH)，6.96(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.17(2H，d，J8.0，Ph-H)， 7.39(1H，d，J8.0，Ph-H)，7.74(1H，d，J8.0，Ph-H)，8.31(1H，s，Ph-H)。
4-氯-N-(4-氯-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺38。1H NMR(CDCl3.)δ：6.74(1H，br s，NH)，6.98(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.19(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.57(1H，d，J8.0， Ph-H)，7.71(1H，d，J8.0，Ph-H)，8.20(1H，s，Ph-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺39。TLC RF＝0.75(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；HPLC 18.83分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ： 6.97(1H，br s，NH)，7.05(2H，m，Ph-H)，7.17(1H，m，Ph-H)，7.92(1H，s，噻吩 -H).MS 386.84(M-H)-，C10H5Cl3N2O4S2＝387.65。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3，5-二氟-苯基)-酰胺40。HPLC tR 16.59分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.63(1H，m，Ph-H)，6.70(2H，m，Ph-H)， 7.01(1H，br s，NH)，7.93(1H，s，噻吩-H).MS 353.96(M-H)-，C10H5ClF2N2O4S2＝354.74。
5-溴-6-氯-吡啶-3-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺41。TLC RF＝0.75(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 21.09分钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ： 7.17(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.47(2H，d，J8.5，Ph-H)，8.23(1H，m，吡啶-H)， 8.62(1H，m，吡啶-H)；MS 414.88(M-H)-，C12H7BrClF3N2O2S＝415.61。
5-溴-6-氯-吡啶-3-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺42。HPLC tR 23.17 分钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3)δ：7.54(3H，s，Ph-H)，8.26(1H，m，吡 啶-H)，8.65(1H，m，吡啶-H)；MS 482.80(M-H)-，C13H6BrClF6N2O2S＝483.61。
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯 基)-酰胺43。TLC RF＝0.63(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；1H NMR(CD3OD)δ：3.97(3 H，s，NCH3)，6.82(1H，s，二唑-H)，7.37(1H，dd，J4.0，4.0，噻吩-H)，7.64(1H， dd，J4.0，4.0，噻吩-H)，7.68(1H，s，Ph-H)，7.73(2H，s，Ph-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺44。HPLC tR 19.49 分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.19(1H，s，Ph-H)，7.58(2H，s， Ph-H)，7.67(1H，br s，NH)，7.95(1H，s，噻吩-H)；MS 452.51(M-2H)-， C12H5ClF6N2O4S2＝454.75。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氟-苯甲酰胺45。HPLC tR 15.89分钟(20-80％， 20分钟)；TLC RF＝0.64(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.20(2H，d， J6.0，ArCH2)，6.95(2H，t，J8.5，Ph-H)，7.17(2H，dd，J8.5，8.5，Ph-H)，7.82(1H， s，噻吩-H)；MS 348.96(M-2H)-，C11H8ClFN2O4S2＝350.78。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-三氟甲基-苯甲酰胺46。TLC RF＝0.71(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 15.16分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ： 4.30(2H，d，J6.0，ArCH2)，5.08(1H，br s，NH)，7.34(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.54(2 H，d，J8.0，Ph-H)，7.86(1H，s，噻吩-H)；MS 398.91(M-2H)-， C12H8ClF3N2O4S2＝400.78。
4-氯-N-(3，5-二氯-苯基)-3-硝基-苯磺酰胺47。HPLC tR 18.64分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.98(2H，m，Ph-H)，7.01(1H，m，Ph-H)， 7.60(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.84(1H，dd J2.0，8.5，Ph-H)，8.27(1H，d，J2.0，Ph-H)； MS 380.91(M-H)-，C12H7Cl3N2O4S＝381.62。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺48。TLC RF＝ 0.44(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 13.48分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.91(2H，t，J6.5，CH2)，3.43(2H，t，J6.5，CH2)，6.89(1H，t， J8.0，吲哚-H)，6.97(1H，t，J8.0，吲哚-H)，7.01(1H，s，吲哚-H)，7.23(1H，d，J 8.0，吲哚-H)，7.38(1H，d，J8.0，Ar)，7.47(1H，s，噻吩-H)；MS 384.21(M-H)-， C14H12ClN3O4S2＝385.85。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基-乙基]-酰胺49。TLC RF＝0.49(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 13.48分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：1.40(3H，d，J6.5，CHCH3)，2.58(1H，dd，J10.5，10.5，CH2)， 2.96(1H，dd，J3.5，3.5，CH2)，3.64(1H，m，CHCH3)，6.91(2H，m，吲哚-H)， 7.04(1H，t，J8.0，7.0，吲哚-H)，7.17(1H，d，J8.0，吲哚-H)，7.25(2H，m，吲哚 -H&噻吩-H)，8.105(1H，br s，NH)；MS 398.63(M-H)-，C15H14ClN3O4S2＝ 399.87。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氯-苯甲酰胺54。HPLC tR 18.14分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.20(2H，d，J6.0，ArCH2)，5.16(1H，br s， NH)，7.07(2H，s，Ph-H)，7.23(1H，s，Ph-H)，7.84(1H，s，噻吩-H)；MS 400.86(M-H)-，C11H7Cl3N2O4S2＝401.67。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸3，5-二氟-苯甲酰胺55。HPLC tR 16.42分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.21(2H，d，J6.0，ArCH2)，5.20(1H，br s， NH)，6.69(1H，m，Ph-H)，6.75(2H，m，Ph-H)，7.87(1H，s，噻吩-H).MS 367.16(M-H)-，C11H7ClF2N2O4S2＝368.77。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸4-氯-苯甲酰胺56。HPLC tR 16.82分钟(20-80％， 20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.20(2H，d，J6.0，ArCH2)，5.13(1H，br s，NH)， 7.07(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.23(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.82(1H，s，噻吩-H)；MS 366.95(M-H)-，C11H8Cl2N2O4S2＝367.23。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[1-(4-氟-苯基)-乙基]-酰胺57。HPLC tR 16.25 分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：1.45(3H，d，J7.0，CH3)，4.54(1H， m，PhCH)，5.18(1H，br s，NH)，6.90(2H，m，Ph-H)，7.10(2H，m，Ph-H)，7.55(1H， s，噻吩-H)；MS 363.18(M-H)-，C12H10ClFN2O4S2＝364.80。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-异丁基-酰胺58。HPLC tR 20.04分 钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：0.85(6H，d，J7.0，CH3)，1.53(1H，m， CH(CH3)2)，5.18(2H，d，J7.5，NCH2)，7.08(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.26(2H，d，J 8.5，Ph-H)，7.61(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(1H-苯并咪唑-2-基)-酰胺59。HPLC tR 17.89分 钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.10(1H，t，J8.0，苯并咪唑-5/6)， 7.23(2H，m，苯并咪唑-4/7&5/6)，7.63(1H，d，J8.5，苯并咪唑-4/7)，8.15(1H， s，噻吩-H)；MS 359.03(M+H)+，C11H7ClN4O4S2＝358.78。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(6-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺60。HPLC tR 23.16分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.91(2H，t，J6.5，CH2)，3.38(2 H，t，J6.5，CH2)，4.70(1H，br s，NH)，6.89(1H，t，J8.0，吲哚-H)，6.95(2H，m， 吲哚-H)，7.23(2H，m，吲哚-H)，7.59(1H，s，噻吩-H)，8.06(1H，br s，吲哚 -NH)；MS 419.94(M-H)-，C14H11Cl2N3O4S2＝420.29。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-甲氧基-苯基)-酰胺61。HPLC tR 12.81分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：3.70(3H，s，OMe)，6.88(2H，d，J8.5， Ph-H)，7.07(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.82(1H，s，噻吩-H)；MS 349.26(M+H)+， C11H9ClN2O5S2＝348.78。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯酰胺62。HPLC tR 15.36分钟(20-80％，20分 钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.66(1H，s，NH)，7.10(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.20(1H，m， Ph-H)，7.28(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.82(1H，s，噻吩-H)；MS 317.22(M-H)-， C10H7ClN2O4S2＝318.76。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸对甲苯酰胺63。HPLC tR 16.59分钟(20-80％，20 分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.27(3H，s，CH3)，6.54(1H，br s，NH)，6.98(2H，d，J 7.5，Ph-H)，7.08(2H，d，J7.5，Ph-H)，7.79(1H，s，噻吩-H)；MS 331.24(M-H)-， C11H9ClN2O4S2＝332.78。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲酰胺64。HPLC tR 15.73分钟(20-80％，20 分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.24(2H，d，J5.5，CH2)，5.05(1H，br s，NH)，7.16(2 H，m，Ph-H)，7.24(3H，m，Ph-H)，7.76(1H，s，噻吩-H)；MS 331.04(M-H)-， C11H9ClN2O4S2＝332.78。
5-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺68。HPLC tR 22.61分钟(0-60％，20 分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.11(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.32(2H，d，J9.0，Ph-H)， 7.38(1H，d，J6.0，噻吩3/4)，7.95(1H，d，J6.0，噻吩3/4)；MS 317.02(M-H)-， C10H7ClN2O4S2＝318.76。
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺69。HPLC tR 21.86分钟(0-60％，20 分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.11(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.32(2H，d，J9.0，Ph-H)， 8.00(1H，s，噻吩3/5)，8.43(1H，s，噻吩3/5).MS 317.08(M-H)-， C10H7ClN2O4S2＝318.76。
5-氯-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺]70。HPLC tR 19.66分钟 (0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.96(4H，d，J8.0，Ph-H)，7.04(1H，m， NH)，7.19(5H，m，Ph-H&NH)，7.57(1H，s，噻吩-H).MS 496.83(M-H)-， C16H11Cl3N2O4S3＝497.83。
5-乙基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺71。HPLC tR 17.41分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：1.36(3H，t，J7.0，CH2CH3)，3.28(2H，dd， J7.0，7.0，CH2H3)，6.65(1H，br s，NH)，7.10(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.30(2H，d，J 8.0，Ph-H)，7.96(1H，s，噻吩-H)；MS 345.05(M-H)-，C12H11ClN2O4S2＝346.81。
硫代乙酸S-[5-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3-硝基-噻吩-2-基]酯72。HPLC tR 21.56分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.59(3H，s，CH3)，7.15(2H， d，J8.5，Ph-H)，7.28(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.91(1H，s，噻吩-H)；MS 391.15(M-H)-，C12H9ClN2O5S3＝392.86。
5-甲基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺73。HPLC tR 17.95分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.66(3H，s，CH3)，7.13(2H，d，J8.0， Ph-H)，7.32(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.70(1H，s，噻吩-H)；MS 333.50(M-H)-， C11H9ClN2O4S2＝332.78。
5-甲基-噻吩-2，4-二磺酸双-[(4-氯-苯基)-酰胺]74。HPLC tR 22.19分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.31(3H，s，CH3)，7.01(2H，d，J8.0， Ph-H)，7.10(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.26(4H，m，Ph-H)，7.81(1H，s，噻吩-H)；MS 476.94(M-H)-，C17H14Cl2N2O4S3＝477.41。
4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺76。HPLC tR 15.99分钟 (20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.28(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.53(2H，d，J 8.5，Ph-H)，8.03(1H，s，噻吩3/5)，8.41(1H，s，噻吩3/5)；MS 351.18(M-H)-， C11H7F3N2O4S2＝352.31。
4-硝基-噻吩-2-磺酸[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-酰胺77。HPLC tR 14.01分 钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.97(2H，t，J6.5，CH2)，3.41(2H，t，J 6.5，CH2)，7.01(2H，m，吲哚-H)，7.13(1H，t，J7.5，吲哚-H)，7.30(1H，d，J7.5， 吲哚-H)，7.38(1H，d，J7.5，吲哚-H)，7.75(1H，s，噻吩3/5)，8.16(1H，s，噻吩 3/5)；MS 350.24(M-H)-，C14H13N3O4S2＝351.40。
5-吗啉-4-基-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺79。HPLC tR 18.52分 钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：3.33(4H，t，J5.0，吗啉-H)，3.88(4H， t，J5.0，吗啉-H)，7.03(1H，br s，NH)，7.13(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.29(2H，d，J 8.0，Ph-H)，7.91(1H，s，噻吩-H)；MS 404.26(M+H)+，C14H14ClN3O5S2＝ 403.86。
5-(2-甲氧基-乙基氨基)-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺80。HPLC tR 18.38分钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：3.33(3H，s，OMe)，3.37(2 H，t，J5.5，CH2)，3.58(2H，t，J5.5，CH2)，7.06(2H，d，J7.0，Ph-H)，7.21(2H，d，J 7.0，Ph-H)，7.33(1H，br s，NH)，7.70(1H，s，噻吩-H)，8.47(1H，br s，NH)；MS 390.21(M-H)-，C13H14ClN3O5S2＝391.85。
4-氯-N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-3-硝基-苯磺酰胺81。HPLC tR 16.63分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.83(2H，t，J6.0，CH2)，3.29(2 H，t，J6.0，CH2)，6.54(1H，br s，NH)，6.90(2H，m，吲哚-H)，7.23(2H，m，吲哚 -H)，7.34(1H，dd，J1.5，8.0，Ph-H)，7.62(1H，dd，J1.5，8.0，Ph-H)，8.15(1H，d，J 1.5，Ph-H)，9.54(1H，br s，吲哚NH)；MS 412.19(M-2H)-，C16H13Cl2N3O4S＝ 414.26。
N-[2-(5-氯-1H-吲哚-3-基)-乙基]-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺82。HPLC tR 16.25分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.73(3H，s，CH3)，2.82(2H，t， J6.0，CH2)，3.22(2H，t，J6.0，CH2)，6.86(1H，m，吲哚-H)，6.91(1H，s，吲哚-H)， 7.15(2H，m，吲哚-H)，7.20(1H，m，Ph-H)，7.63(1H，dd，J2.0，8.0，Ph-H)， 8.13(1H，d，J2.0，Ph-H)；MS 392.03(M-H)-，C17H16ClN3O4S＝393.85。
N-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-3-硝基-苯磺酰胺83。HPLC tR 17.55分钟 (0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：7.07(1H，t，J8.0，Ph-H)，7.16(1H，t，J 8.0，Ph-H)，7.22(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.64(2H，d，J7.5，Ph-H)，7.97(1H，dd，J 2.5，9.0，Ph-H)，8.42(1H，d，J2.5，NH)；MS 351.25(M-H)-，C13H9ClN4O4S＝ 352.75。
6-氯-咪唑并[2，1-b]噻唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺84。HPLC tR 24.09分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：3.40(1H，br s，NH)，7.10(1H， d，J4.5，噻唑-H)，7.54(1H，s，Ph-H)，7.56(2H，s，Ph-H)，7.90(1H，d，J4.5，噻 唑-H)；MS 447.86(M-2H)-，C13H6ClF6N3O2S2＝449.78。
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷-6-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺85。HPLC tR 21.20分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.27(4H，m，CH2)，6.88(1H，d， J8.0，Ph-H)，7.04(3H，m，Ph-H)，7.19(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.25(1H，m，Ph-H)， 7.31(1H，br s，NH)；MS 326.11(M+H)+，C14H12ClNO4S＝325.77。
2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烷-6-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺 86。HPLC tR 24.58分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.21(4H，m，CH2)， 6.86(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.27(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.30(1H，d，J2.0，Ph-H)， 7.47(2H，s，Ph-H)，7.50(1H，s，Ph-H)，7.56(1H，br-s，NH)；MS 425.9(M-2H)-， C16H11F6NO4S＝427.32。
6-苯氧基-吡啶-3-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺87。HPLC tR 23.20分钟(10-70％， 20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.99(1H，d，J8.5，Ph-H)，7.11(2H，d，J8.5，Ph-H)， 7.26(1H，m，Ph-H)，7.41(2H，m，Ph-H)，7.57(3H，m，Ph-H)，7.63(1H，s，Ph-H)， 8.03(1H，d，J8.5，Ph-H)，8.57(1H，br s，NH)；MS 463.90(M+2H)+， C17H13ClN2O3S＝360.82。
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(4-氯-3-硝基-苯基)-酰胺88。HPLC tR 22.79分钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.55(3H，s，CH3)，7.38(2H， m，Ph-H)，7.42(1H，d，J8.0，Ph-H)，7.66(1H，s，Ph-H)，7.69(1H，d，J9.0，Ph-H)， 7.73(1H，s，Ph-H)；MS 416.91(M-H)-，C15H10Cl2N2O4S2＝417.29。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-吡唑-1-基-苯磺酰胺89。HPLC tR 21.58分 钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CD3OD)δ：6.53(1H，s，Ph-H)，7.57(1H，s， Ph-H)，7.65(2H，s，Ph-H)，7.73(1H，s，Ph-H)，7.92(4H，s，Ph-H)，8.28(1H，s， Ph-H)；MS 434.03(M-H)-，C17H11F6N3O2S＝435.34。
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙基酯90。HPLC tR 20.99分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：1.32(3H，t，J7.0，CH2CH3)， 2.30(3H，s，CH3)，2.40(3H，s，CH3)，4.26(2H，dd，J7.0，7.0，CH2CH3)，7.01(2H， d，J9.0，Ph-H)，7.20(2H，d，J9.0，Ph-H)；MS 355.03(M-H)-，C15H17ClN2O4S＝ 356.83。
4-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸91。 HPLC tR 23.28分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.42(3H，s，CH3)， 2.47(3H，s，CH3)，7.45(3H，s，Ph-H)，10.35(1H，br s，COOH)；MS 428.98(M-H)-，C15H12F6N2O4S＝430.32。
4-(4-氯-苯基氨磺酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸92。HPLC tR 19.59 分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.37(3H，s，CH3)，2.45(3H，s，CH3)， 6.99(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.07(1H，br s，NH)，7.21(2H，d，J8.5，Ph-H)，9.47(1H， br s，COOH)；MS 327.26(M-H)-，C13H13ClN2O4S＝328.77。
2-(4-氯-苯基氨磺酰基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯93。HPLC tR 21.74分钟 (10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：1.26(3H，t，J7.5，CH2CH3)，2.47(3H，s， CH3)，4.21(2H，dd，J7.5，CH2CH3)，7.21(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.28(2H，d，J8.0， Ph-H)。
3，5-二氯-N-(4-氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺94。HPLC tR 21.65分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：6.67(1H，s，OH)，7.06(2H，d，ArH，J 8.9)，7.21(2H，d，ArH，J8.9)，7.72(2H，s，ArH)，8.30(1H，s，NH)；MS 352.01(M-H)-，C12H8Cl3NO3S＝352.62。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3，5-二氯-4-羟基-苯磺酰胺95。HPLC tR 24.06 分钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.8(2H，d，ArH，J8.7)，7.68(1H，s， ArH，)，7.67(2H，s，ArH)；MS 454.81(M)，C14H7Cl2F6NO3S＝454.17。
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺96。HPLC tR 22.46分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.28(2H，d，ArH，J8.7)，7.56(2H，d， ArH，J8.7)，7.67(2H，s，ArH)；MS 386.06(M)，C13H8Cl2F3NO3S＝386.17。
N-(4-氯-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺97。HPLC tR 12.24分钟(10-60％，20分 钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.08(2H，d，ArH，J8.8)，7.23(2H，d，ArH，J8.8)， 7.96(2H，d，ArH，J8.8)，8.32(2H，d，ArH，J 8.8).MS 311.33(M-1)-， C12H9ClN2O4S＝312.73。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺98。HPLC tR 15.36分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.65(1H，s，ArH，)，7.66(2H，s，ArH)， 8.06(2H，d，ArH，J9.0)8.39(2H，d，ArH，J9.0)；MS 413.43(M-1)-， C14H8F6N2O4S＝414.28。
4-氨基-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-苯磺酰胺99。HPLC tR 18.38分 钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：6.78(1H，d，ArH，J7.8)，7.41(1H，d， ArH，J7.8)，7.56(1H，s，ArH)，7.62(2H，s，ArH)，7.72(1H，s，ArH)；MS 419.77(M+H)+，C14H9ClF6N2O2S＝418.74。
3-硝基-N-(4-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺100。HPLC tR 23.04分钟(10-60％， 20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：7.30(2H，d，ArH，J8.3)，7.63(2H，d，ArH，J 8.3)，8.06(2H，d，ArH，J8.8)，8.38(2H，d，ArH，J8.8)，11.17(1H，s，NH)；MS 345.05(M-H)-，C13H9F3N2O4S＝346.28。
3，5-二氯-N-(3，5-二氯-苯基)-4-羟基-苯磺酰胺101。HPLC tR 16.69分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD)δ：7.08(2H，s，ArH)，7.30(1H，s，ArH)， 7.71(2H，s，ArH)；MS 383.77(M-H)-，C12H7Cl4NO3S＝384.89。
4-氨基-3-氯-N-(4-氯-苯基)-苯磺酰胺102。HPLC tR 14.17分钟(10-60％， 20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：6.75(1H，d，ArH，J8.3)，7.07，(2H，d，ArH，J8.8)， 7.28(2H，d ArH，J8.3)，7.32(1H，d，ArH，J8.8)，7.49(1H，s，ArH)；MS 317.43(M)，C12H10Cl2N2O2S＝317.19。
3-氯-N-(4-氯-苯基)-4-甲氧基-苯磺酰胺103。HPLC tR 16.65分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：3.31(3H，s，OCH3)，7.08(2H，d，ArH， J8.3)，7.27(1H，d，ArH，J8.8)，7.30(2H，d，ArH，J8.3)，7.64(1H，d，ArH，J8.8)， 7.74，(1H，s，ArH)，10.35，(1H，s，NH)；MS 332.02(M)，C13H11Cl2NO3S＝332.20。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-3-氯-4-甲氧基-苯磺酰胺104。HPLC tR 19.21 分钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：3.30(3H，s，OCH3)，7.31(1H，d， ArH，J8.8)，7.65(2H，s，ArH)，7.73(1H，dd，ArH，J8.8，2.4)，7.77(1H，s，ArH)， 7.80(1H，d，ArH，J2.4)，11.12(1H，s，NH)；MS 433.98(M)，C15H10ClF6NO3S＝ 433.75。
N-(3-氯-4-硝基-苯基)-3，5-双-三氟甲基-苯磺酰胺105。HPLC tR 19.56分 钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：7.38(1H，dd，ArH，J8.8，2.4)， 7.66(1H，d，ArH，J8.8)，7.76(1H，d，ArH，J2.4)，8.34(2H，s，ArH)，8.51(1H，s， ArH)，11.12(1H，s，NH)；MS 448.84(M)，C14H7ClF6N2O4S＝448.73。
3-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-4-硝基-苯磺酰胺 106。HPLC tR 22.57分钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.15(3H，s， CH3)，3.20(4H，m，CH2)，3.68(2H，m，CH2)，3.84(2H，m，CH2)，7.12(2H，m， ArH)，7.46(1H，s，ArH)，8.26(1H，s，ArH)，8.38(2H，s，ArH)；MS 540.09(M)， C20H18F6N4O5S＝540.44。
N-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-2-硝基-苯磺酰胺107。HPLC tR 16.25分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(DMSO-d6)δ：7.58(2H，s，ArH)，7.82(1H，d，ArH， J8.6)，7.88(1H，dd，ArH，J8.6，8.6)，8.13(1H，dd，ArH，J8.6，8.6)，8.37(1H，s， ArH)，8.38(1H，d，ArH，J8.6)，11.60(1H，s，NH)；MS 414.85(M)，C14H8F6N2O4S＝414.28。
3-(3，5-双-三氟甲基-苯基氨磺酰基)-苯甲酸108。HPLC tR 22.39分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：7.57(2H，s，ArH)，7.62(2H，s，ArH)， 7.67(1H，dd，ArH，J7.8，7.8)，7.97(1H，dd，ArH，J7.8，1.0)，8.12(1H，dd，ArH，J 7.8，1.0)，8.30(1H，d，ArH，J1.0)；MS 411.99(M-2H)-，C15H9F6NO4S＝413.29。
3，5-二氯-N-(4-氯-苯甲基)-4-羟基-苯磺酰胺109。HPLC tR 24.04分钟 (10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：4.16(2H，s，CH2)，7.97(2H，d，ArH)，J 8.8)，8.81(2H，s，ArH)8.39(2H，d，ArH，J8.8)；MS 365.26(M-H)-， C13H10Cl3NO3S＝366.65。
3，5-二氯-4-羟基-N-(4-三氟甲基-苯甲基)-苯磺酰胺110。HPLC tR 23.61 分钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：4.24(2H，s，CH2)，7.32(2H，d， ArH，J8.7)，7.54(2H，d，ArH，J8.7)，7.81(2H，s，ArH)；MS400.19(M)， C14H10Cl2F3NO3S＝400.20。
3，5-二氯-4-羟基-N-[2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-苯磺酰胺111。HPLC tR 16.56分钟(10-60％，20分钟)；1H NMR(CD3OD.)δ：2.95(2H，d，CH2，J7.2)， 3.32(2H，s，CH2，J7.2)，6.99(1H，s，ArH)，7.06(1H，dd，ArH，J8.1，8.1)，7.17(1 H，dd，ArH，J8.1，8.1)，7.33(1H，d，ArH，J8.1)，7.39(1H，d，ArH，J8.1)，7.50(2 H，s，ArH)；MS 382.82(M-2H)-，C16H14Cl2N2O3S＝385.27。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺112。HPLC tR 8.21分钟(方法 B)；MS 463.9(M-H)-79Br81Br35Cl2，C10H5Br2Cl2NO2S2＝466.00。
N-(3，5-二氯-苯基)-4-噁唑-2-基-苯磺酰胺113。HPLC tR 9.04分钟(方法 B)；MS 367.0(M-H)-35Cl2，C15H10Cl2N2O3S＝369.22。
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺114。HPLC tR 9.22 分钟(方法B)；MS 487.9(M-H)-81Br35Cl，C12H5BrClF6NO2S2＝488.65。
4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸(3，5-二氯-苯基)-酰胺115。HPLC tR 9.12分钟(方 法B)；MS 419.9(M-H)-81Br35Cl3，C10H5BrCl3NO2S2＝421.54。
5-溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺116。HPLC tR 8.28分钟(方法 B)；MS 385.9(M-H)-81Br，C11H7BrF3NO2S2＝386.21。
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺117。MS 514.2(M-H)-，C18H11F6NO4S3＝515.47。
5-苯磺酰基-噻吩-2-磺酸(2，4-二氯-苯基)-酰胺118。MS 446.0(M-H)-35Cl2， C16H11Cl2NO4S3＝448.36。
5-氯-3-甲基-苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺119。1H NMR(CDCl3)δ：2.51(s，3H，CH3)，7.40(dd，1H，J2.0，8.7，Ar-H)，7.51(s，1H， NH)，7.55(s，3H，Ar-H)，7.67(d，1H，J8.7，Ar-H)，7.69(s，1H，Ar-H)；MS(FAB 校正)472.97412(M)+35Cl，C17H10ClF6NO2S2＝472.9746。
苯并[b]噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺120。1H NMR(CDCl3)δ： 7.27(s，1H，NH)，7.45(m，5H，Ar-H)，7.83(m，1H，Ar-H)，8.06(m，1H，Ar-H)， 8.24(s，1H，Ar-H)；MS(FAB校正)426.0049(MH)+，C16H9F6NO2S2＝424.9979。
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺121。1H NMR(CDCl3)δ：6.83(s， 1H，NH)，7.00(m，2H，Ar-H)，7.16(m，2H，Ar-H)，7.79(dd，1H，J1.8，9.2，Ar-H)， 8.03(dd，1H，J0.7，9.2，Ar-H)，8.46(dd，J0.7，1.8，1H，Ar-H)；MS(FAB校 正)325.9821(MH)+，C12H8ClN3O2S2＝324.9746。
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺122。1H NMR(CDCl3)δ：7.43(s，1H，NH)，7.58(s，3H，Ar-H)，7.84(dd，1H，Ar-H)， 8.09(dd，1H，J1.8，9.2，Ar-H)，8.03(dd，1H，J0.7，9.2，Ar-H)，8.57(dd，J0.7，1.8， 1H，Ar-H)；MS(FAB校正)427.9960(MH)+，C14H7F6N3O2S2＝426.9884。
苯并[1，2，5]噻二唑-5-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺123。1H NMR(CDCl3)δ：7.19(d，2H，Ar-H)，7.44(m，3H，Ar-H&NH)，7.87(dd，1H，J 1.8，9.2，Ar-H)，8.06(dd，1H，J0.7，9.2，AR-H)，8.58(dd，J0.7，1.8，1H，Ar-H)； MS(FAB校正)360.0080(MH)+，C13H8F3N3O2S2＝359.0010。
5-吡啶-2-基-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯基)-酰胺124。1H NMR(CDCl3)δ：7.21(m，1H，吡啶-H)，7.40(d，1H，J4.0，噻吩-H)，7.54(s，3H， Ph-H)，7.55(d，1H，J4.0，噻吩-H)，7.61(m，1H，吡啶-H)，7.68(m，1H，吡啶 -H)，7.80(s，1H，NH)，8.51(m，1H，吡啶-H)；MS(FAB校正)453.0164(MH)+， C17H10F6N2O2S2＝452.0088。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-酰胺125。1H NMR(CDCl3)δ：6.91(s，1 H，NH)，7.04(d，2H，J6.7，Ph-H)，7.23(s，1H，噻吩-H)，7.24(d，2H，J6.7， Ph-H)；MS(FAB 校正)431.7963(MH)+81Br79Br35Cl，C10H6Br2ClNO2S2＝ 428.7895。
4，5-二溴-噻吩-2-磺酸(4-三氟甲基-苯基)-酰胺126。1H NMR(CDCl3)δ： 7.20(d，2H，J8.4，Ph-H)，7.33(s，1H，噻吩-H)，7.35(s，1H，NH)，7.53(d，2H，J 8.4，Ph-H)；MS(FAB校正)465.82122(MH)+79Br81Br，C11H6Br2F3NO2S2＝ 465.1040。
实施例2
制备N-烷基化的伯双芳基磺酰胺的一般方法
将实施例1的伯双芳基磺酰胺(1.0mol当量)溶解于无水丙酮中，溶液冷 却至0℃，然后慢慢加入三乙胺(5.0mol当量)。30分钟后，慢慢加入烷基化 试剂(烷基或芳烷基卤化物；5.0mol当量)，搅拌溶液直到TLC[庚烷∶乙酸乙酯 (2∶1)]表明反应完全。然后将反应混合物浓缩，用水稀释，乙酸乙酯萃取。萃 取液浓缩之后，残余物经柱色谱处理[柱(Isolute SI；Jones Chromatography)， 庚烷∶乙酸乙酯(12∶1→3∶1)]，得到所需的烷基化的磺酰胺。
按照上述方法制备本发明的N-烷基化的双芳基磺酰胺化合物。代表性化 合物的具体解析结果如下所示：
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氟-苯基)-甲基-酰胺7。TLC RF＝0.72(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；1H NMR(CDCl3.)δ：3.22(3H，s，NCH3)，7.02(2H，m， Ph-H)7.12(2H，m，Ph-H)，7.73(1H，d，J1.0，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯基)-酰胺50。1H NMR(CDCl3)δ：3.27(3H，s，NMe)，7.30(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.60(2H，d，J8.5， Ph-H)，7.75(1H，s，噻吩)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-甲基-酰胺51。TLC RF＝0.69(庚烷∶ 乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 18.49分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3)δ： 3.22(3H，s，NCH3)，7.08(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.29(2H，d，J9.0，Ph-H)，7.38(1H， s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸甲基-(4-三氟甲基-苯甲基)-酰胺52。TLC RF＝ 0.70(庚烷∶乙酸乙酯，2∶1)；HPLC tR 19.72分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：2.71(3H，s，NCH3)，4.25(2H，s，ArCH2)，7.39(2H，d，J8.0， Ph-H)，7.58(2H，d，J8.0，Ph-H)，7.91(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氟-苯甲基)-酰胺53。1H NMR(CDCl3.)δ：4.70(2H，s，CH2)，6.92(2H，m，Ph-H)，6.97(2H，m，Ph-H)， 7.14(2H，m，Ph-H)，7.19(3H，m，Ph-H)，7.75(1H，s，噻吩)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-氯-苯基)-酰胺65。HPLC tR 20.98分 钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.78(2H，s，CH2)，7.00(2H，m，Ph-H)， 7.20(2H，m，Ph-H)，7.26(5H，m，Ph-H)，7.76(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸苯甲基-(4-甲氧基-苯基)-酰胺66。HPLC tR 22.76分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：3.70(3H，s，OMe)，4.69(2H，s， CH2)，6.72(2H，d，J8.5，Ph-H)，6.89(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.19(5H，m，Ph-H)， 7.74(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(4-氯-苯基)-(3-三氟甲基-苄基)-酰胺67。HPLC tR 23.62分钟(0-60％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.77(2H，s，CH2)，6.95(2H， d，J8.5，Ph-H)，7.19(1H，s，Ph-H)，7.24(2H，d，J8.5，Ph-H)，7.37(3H，m，Ph-H)， 7.46(1H，m，Ph-H)，7.79(1H，s，噻吩-H)。
5-氯-4-硝基-噻吩-2-磺酸(3-三氟甲基-苯甲基)-(4-三氟甲基苯甲基)-酰胺 75。HPLC tR 22.73分钟(20-80％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.38(4H，s，CH2)， 7.19(3H，m，Ph-H)，7.30(2H，m，Ph-H)，7.45(3H，m，Ph-H)，7.80(1H，s，噻吩 -H)。
5-(1-甲基-5-三氟甲基-1H-吡唑-3-基)-噻吩-2-磺酸(3，5-双-三氟甲基-苯 基)-(3-三氟甲基-苯甲基)-酰胺78。HPLC tR 24.01分钟(10-70％，20分钟)；1H NMR(CDCl3.)δ：4.03(3H，s，NCH3)，4.92(2H，s，CH2)，6.73(1H，s，吡唑-H)， 7.23(1H，dd，J1.0，4.0，Ph-H)，7.26(1H，d，J1.0，Ph-H)，7.46(3H，m，Ph-H)， 7.55(2H，m，Ph-H)，7.59(1H，d，J7.5，Ph-H)，7.80(1H，s，Ph-H)；MS 682.08(M+H)+，C25H15F12N3O2S2＝681.52。
实施例3
荧光偏振竞争性结合测定
使用96-孔微量滴定法(Costar)完成该测定。将重组体HDM2(1.5μg/孔) 的TBS-BSA缓冲溶液(50mM Tris pH7.4、150mM NaCl、和0.1％BSA)在室 温下、在连续稀释的测试化合物存在下(在最终浓度为5％DMSO的TBS-BSA 缓冲溶液中)培养5分钟。向每个孔中加入荧光标记的p53衍生肽(荧光素 -Met-Pro-Arg-Phe-Met-Asp-Tyr-Trp-Glu-Gly-Leu-Asn-NH2，0.2μM)，然后滴定板在 室温下培养45分钟。测量该肽的荧光偏振现象(激发485nm，发射520nm)。 根据剂量-响应曲线计算出IC50值。
ELISA-类型竞争性结合测定
使用TBS/BSA(25mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05％Tween 20、 0.1％BSA)洗涤涂覆有Streptavidin的96孔板(Pierce Chemical Co.，St.Louis， MO，USA)。生物素化的p53衍生肽(生物素 -Ahx-Met-Pro-Arg-Phe-Met-Asp-Tyr-Trp-Glu-Gly-Leu-Asn-NH2)用25mM Tris-HCl、pH7.5稀释至1μM，其中等分部分加入至每个小孔中(0.1mL/孔)。 在室温下恒速振摇培养1小时之后，滴定板用TBS/BSA缓冲溶液充分洗涤。 将HDM2(50μL/孔，10μg/mL溶于TBS/BSA缓冲溶液中的储存溶液)和连续 稀释的(溶于TBS/BSA缓冲溶液)测试化合物(50μL/孔)混合，然后在室温下 培养30分钟。随后将反应混合物转移至涂覆有肽的streptavidin板中，在室 温下继续恒速振摇培养1小时。然后再将板用TBS/BSA缓冲溶液充分洗涤。 加入抗-HDM2抗体(SMP14 mAb，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz， CA，USA；0.1mL/孔、0.125μg/mL TBS/BSA缓冲稀释液)，并在室温下培养 1小时。再次洗涤之后，加入第二抗体(anti-mouse Ab，Sigma Cat.No.A 4789； 0.1mL/孔、1∶10,000 TBS/BSA缓冲稀释液)，在室温下培养1小时。充分洗 涤之后，加入TMB ELISA试剂(Pierce；0.1mL/孔)培养1分钟，通过加入2M H2SO4溶液(0.1mL/孔)以停止颜色反应。然后计算在450nm处的吸收值。根 据剂量响应曲线计算出IC50值。
实施例4
代表性双芳基磺酰胺化合物的初步筛选数据汇总在表1中。利用实施例 3所述的荧光素偏振竞争性HDM2结合测定方法。此外，还测定了这些化合 物对于具有不同基因组成的三种人类肿瘤细胞系的抗增殖活性。统计于表1 中的抗增殖性IC50值是使用标准72-h MTT细胞毒性测定方法[Haselsberger K， Peterson DC，Thomas DG，Darling JL；Anti Cancer Drugs 1996；7：331-338]测得 的。所用的细胞系如下：AGS，胃腺癌，野生型p53；H1299，大细胞肺癌，裸 p53，低HDM2；SJSA-1，原发性多病因骨癌，野生型p53，HDM2表达过度。
在相应的ELISA-型测定形式(实施例3)中还连续测试了在荧光素偏振竞 争性HDM2结合测定方法中具有活性的化合物。根据两种测定形式获得类 似的IC50值。总的来说，在双芳基磺酰胺的体内竞争性HDM2结合力和细 胞抗增殖活性之间观察到很好的相关性。因此，只有能够拮抗p53肽结合体 内HDM2的化合物才具有抗增殖活性。此外，化合物在体内的效力大小顺 序也与细胞分析结果很相似。上述结果清楚表明，观察到的抗增殖活性归因 于该双芳基磺酰胺调节细胞的HDM2功能所致。下面的事实也支持了这样 的结论，那就是通常其中HDM2过渡表达的细胞系(SJSA-1)比另外两种被测 试的细胞系对于活性双芳基磺酰胺测试化合物具有更低的敏感性。通过调节 HDM2，在缺乏功能化p53的肿瘤细胞中也可以获得抗增殖活性的事实可以 这样来解释，那就是p53-/-细胞系H1299对测试化合物具有与另外两种具有 正常p53的细胞系类似的响应性。
实施例5
应用标准72-h MTT细胞毒素测定方法[Haselsberger K等人，同上]，将 代表性双芳基磺酰胺化合物在具有变形(transform)和非变形人类细胞系的滴 定板上进行了测试。其结果汇总在表2中。
可以看出，化合物2、3、6、和7对于变形细胞系的抗增殖活性比对于 非变形细胞系的抗增殖活性高3-4倍。此外，这些化合物对抗癌症的平均效 力也高于对肉瘤细胞系的平均效力，这与对照化合物roscovitine相反，该对 照化合物是通过不同机理也就是抑制细胞周期蛋白依赖型激酶而产生抗增 殖活性[Wang S，McClue SJ，Ferguson JR，Hull JD，Stokes S，Parsons S， Westwood R，Fischer PM；Tetrahedron：Asymmetry 2001；12：2891-2894]。这种 不同的选择性进一步表明双芳基磺酰胺可以调节细胞的HDM2功能。已知 HDM2放大现象通常在软组织肉瘤和骨肉瘤中尤其普遍[Momand J等人，同 上；Bartel F，Meye A，Wurl P，Kappler M，Bache M，Lautenschlager C， Grunbaum U，Schmidt H，Taubert H；Int.J.Cancer 2001；95：168-175]。
实施例6
p53报道基因(reporter gene)测试
进行可以同时评价细胞存活率和p53响应的二重测试。将U2OS衍生细 胞系稳定地用p53响应元件(response element)转染，生成荧光素酶报道基因。 用于该目的的这种基因表达盒式结构先前已有描述[Zhu J，Gao B，Zhao J， Balmain A；Cancer Gene Ther.2000；7：4-12]。在将细胞接种到96孔组织培养 板之后，用测试化合物处理，然后培养一定时间，使用细胞增殖试剂 WST-1(Roche Molecular Biochemicals)测量细胞存活率。使用Bright-GloTM荧 光素酶分析系统(Promega)测试荧光素酶活性。使用由细胞存活率分析方法得 到的数据来标准化(normalise)由荧光素酶分析方法得到的数据。分析方法先 前已有描述[Krausz E，Watt K，Cummings L，Baxter C，Blake DG；Biochemica 2001：26-27]。
E2F报道基因测试
使用与上述p53报道分析系统相类似的系统，除了该系统被设计为对 E2F转录因子而不是对p53响应之外。将A549衍生细胞系稳定地用E2F响 应元件转染，生成荧光素酶报道基因。所使用的基因表达盒式结构来自 Clontech(MercuryTM Cell Cycle Profiling System)。按照上述方法进行测试。
实施例7
在实施例6描述的p53基因报道分析试验中对代表性的双芳基磺酰胺进 行了测试。其结果汇总在表3中。
先前已经报道过，p53衍生优化的细胞渗透性肽(上表中的阳性对照肽) 能够通过抑制HDM2/p53相互作用来活化肿瘤细胞中的p53途径[Chène P， Fuchs J，Bohn J，García-Echeverría C，Furet P，Fabbro D；J.Molec.Biol.2000； 299：245-253]。我们的结果证实了该发现(参见上文)。此外，代表性的双芳 基磺酰胺在相同的测试系统中还显著地诱导了p53响应荧光素酶活性。通常 发现在体内竞争性HDM2结合测试中不具有活性的化合物也不具有诱导细 胞p53的这种能力。例如，边缘活性(marginally active)化合物4的作用效果 比更具活性的化合物微弱得多。双芳基磺酰胺确实能够活化细胞p53转活活 性的事实证实了它们可以调节细胞HDM2活性。
实施例8
在实施例6描述的E2F基因报道分析试验中对代表性的双芳基磺酰胺进 行了测试。其结果汇总在表4中。
只有具有HDM2拮抗剂活性的双芳基磺酰胺才能够反向调节基因报道 分析试验中的E2F转录活性。不管是否使用了不同步的细胞群体或者同步处 于G1/S晚期的细胞，均可以观察到这种活性[Ji C，Marnett LJ，Pietenpol JA； Oncogene 1997；15：2749-2753]。双芳基磺酰胺确实能够抑制E2F转录活性的 事实证实了它们可以调节细胞HDM2/E2F的相互作用。
实施例9
已经充分认识到，放射治疗和目前最通用的化学治疗方式会引起严重的 基因损伤，同时还会诱导p53依赖型细胞凋亡生物途径，这就决定了这种肿 瘤抑制蛋白在癌症治疗方面的重要作用。另一方面，HDM2作为p53的转录 产物和负调节物可以使p53不稳定化同时还可以消除其促凋亡功能。 p53-HDM2负反馈圈的抑制剂(例如破坏p53-HDM2络合物的化合物)被期望 能够与细胞毒素剂一起协同用于诱导p53以及接下来的细胞凋亡。为了研究 该假设，我们使用了已知可以诱导p53和细胞凋亡的三种细胞系作为模型系 统：AGS(胃腺癌，野生型p53)、H1299(结肠腺癌，裸p53)和SJSA-1(骨肉瘤， 野生型p53，HDM2过度表达)以及两种细胞毒素剂：顺铂(DNA烷基化试剂) 和依托泊苷(拓扑异构酶抑制剂)。作为HDM2-p53相互作用的抑制剂的代表 性双芳基磺酰胺，化合物2是按照每种细胞系所测得的抗增殖IC50浓度使用 的，也就是分别为1、5和15μM。联合治疗方案包括在施用顺铂或依托泊 苷的同时、之前6小时或者之后6小时还向细胞中加入2。这两种化学治疗 药物都是按照浓度范围为100-0.19μM使用的。在总共培养72小时之后， 使用标准MTT分析方法测量在有或没有HDM2-p53抑制剂存在的条件下依 托泊苷和顺铂的细胞毒素活性。顺铂的细胞毒性结果如表5所示。
化合物2增强了顺铂对所用三种细胞系的细胞毒素活性。当2在使用顺 铂进行治疗之前加入，此时的协同效应是最高的，在AGS、H1299和SJSA-1 细胞中效力分别增加18.5、16和357倍。
当化合物与依托泊苷联合使用时，也观察2的类似协同效应。其结果如 表6所示。
在存在2的情况下，依托泊苷的细胞毒素活性显著增强，并且当该 HDM2-p53相互作用的抑制剂在依托泊苷之前6小时加入的话，此时达到最 高效应。依托泊苷在预先使用2进行治疗后的AGS、H1299和SJSA-1细胞 中的IC50计算值比没有使用2的情况低3.5、25和726倍。
双芳基磺酰胺和细胞毒素剂的协同效应在SJSA-1细胞中是最高的。该 结果可以推断为SJSA-1细胞过度表达HDM2，这表明DNA破坏诱导的p53 可以脱稳定化从而使得细胞毒素剂的活性消失。SJSA-1对于使用依托泊苷 和顺铂治疗所产生的相对抗药性(resistance)可能归因于HDM2的抗细胞凋亡 作用。破坏HDM2和p53之间的这种相互作用可以很快地使p53堆积和稳 定下来，从而诱导细胞死亡。双芳基磺酰胺的化学致敏活性涉及到p53依赖 型机理，同时还因为在裸p53的H1299细胞中也发现这种活性。
实施例10
作用研究模型
很多不同类型的细胞应激(cellular stress)汇集于(converge)p53生物途径 并诱导其活性。因此，重要的是需要证明本发明的化合物之所以能够活化p53 是直接定位于p53和HDM2之间的相互作用而不是间接定位于活化例如上 游的激酶。利用代表性化合物(主要是化合物2)和一系列具有不同HDM2和 p53组成的细胞系研究了双芳基磺酰胺在细胞水平上的生理活性。这些细胞 系是过度表达的Hdm2(SJSA1-骨肉瘤)、野生型p53以及正常水平的 HDM2(AGS-胃腺癌、MCF7-乳腺癌)、或者裸p53、低水平的HDM2(H1299- 大细胞肺癌)。在HDM2生物途径中的关键蛋白质的细胞水平上分析双芳基 磺酰胺的活性，并将其与那些由效果明显的抗癌药物例如依托泊苷和顺铂所 诱导的活性进行比较。
将AGS、H1299、MCF7或SJSA1细胞使用5倍抗增殖活性IC50浓度的 化合物2或者在某些情形中使用依托泊苷或顺铂处理(图1)。在不同间隔收 集细胞，并且在收集的时候注意形态学的变化。细胞溶解后，相同量的溶菌 液通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法分析。使用依托 泊苷或顺铂处理的AGS或MCF7细胞得到标准的应激响应(stress response) (图1B、1C和1D)，其诱导了p53在丝氨酸15位置上的磷酸化，还提高了 p53和E2F-1蛋白质水平。在较晚的时间点上，它还与PARP分裂有关；85-kDa 分裂产物的产生标志细胞凋亡，这与细胞死亡的形态学变化特征相一致。相 反，使用化合物2处理AGS、H2199、MCF7或SJSA1细胞之后，可以很快 诱导HDM2和E2F-1水平(而不是E2F-2)降低，而不会诱导p53或者诱导p53 在丝氨酸15位置的磷酸化(图1A、1B、1D和1E)。E2F-1水平的降低与通 过E2F依赖型荧光素酶报道分析试验测得的E2F转录活性降低有关(参见实 施例6)。MCF7细胞使用4-溴-5-氯-噻吩-2-磺酸4-三氟甲基-苯甲酰胺(阴性 对照化合物)处理，该化合物在体内不会抑制HDM2-p53相互作用但是具有 与化合物2相类似的化学结构，这样的处理并没有在所测试的蛋白质水平上 或者细胞形态学方面产生任何显著的变化(图1D)。
化合物2所迅速诱导的形态学变化在SJSA1细胞中最为显著，该细胞具 有很重要的细胞质组分。在被测试的所有细胞类型中检测了细胞快速圆形化 的能力。
对使用化合物2处理之后的MCF7细胞中的其它应激途径进行分析，表 明出现短暂的诱导JNK磷酸化现象，但是并没有明显诱导p38 MAPK生物 途径。使用茴香霉素(mRNA翻译抑制剂)作为诱导这些应激途径的阳性对照 (图1D)。在其它细胞类型中没有发现诱导JNK磷酸化。
在H1299细胞中PARP分裂的诱导表现很快，但是仍然慢于在AGS、 MCF7或SJSA1细胞中的诱导速度(图1A、1B、1C、1D和1E)。在MCF7 细胞中，尽管不存在85-kDa PARP分裂产物，但是PARP蛋白质水平仍然有 显著降低(图1D)。另外还在AGS、SJSA1和H1299中对另一种体内抑制剂 化合物49进行了测试(图2)。这种化合物诱导出现了更迅速的细胞圆形化现 象，同时在蛋白质水平上还表现出与使用化合物2相类似的变化。
重要的是，需要判断快速的细胞圆形化现象是否与细胞死亡相关。将 MCF7或H1299细胞使用化合物2处理，在不同时间间隔利用锥虫蓝排除法 计算圆形细胞的数目和存活细胞的数目。在两种细胞类型中快速细胞圆形化 现象出现明显不同于细胞死亡的动力学曲线(图3)。该数据表明细胞圆形化 现象与死亡细胞并不相关。
分析了一对化合物68(竞争性抑制作用IC50＝431μM)和69(IC50＝151 μM；参见表1)对于MCF7和H1299细胞的活性。将细胞使用5倍IC50浓度 的具有更高活性的化合物69处理。当使用68处理时，仅仅检测到蛋白质水 平有细小变化。相反地，69在形态学和蛋白质水平方面均诱导产生了变化。 在两种细胞系中，利用在稍晚时间点上可检测到的85-kDa分裂产物的产生 来检测PARP水平的快速降低(图4A和4B)。MCF7细胞中的HDM2和HDMX 水平在使用化合物69处理之后立即降低(图4A)。在H1299细胞中使用化合 物69处理之后使得HDM2水平迅速降低，在稍晚的时间点上又恢复过来(图 4B)。相对于对照品而言，E2F-1水平几乎没有变化(图4B)。在两种细胞类 型中都没有检测到快速圆形化现象。使用化合物69处理之后检测到68小时 均在迁移的MCF7细胞(具有与死亡细胞之一相对应的形态学特征)，而使用 化合物68处理之后却没有检测到这种现象。这明显与由化合物2观察到细 胞圆形化现象不同。
为了确定双芳基磺酰胺是否诱导细胞周期变化，将MCF7或H1299细 胞使用顺铂或化合物2处理(图5)。顺铂和化合物2都诱导了作为细胞凋亡 标志物的亚G1细胞，但是没有观察到其在细胞周期的任何阶段出现过 (arrest)。
为了表征双芳基磺酰胺的诱导细胞凋亡特性，对天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶(caspase)1/3活性进行了测试。将AGS或H1299细胞使用低浓度的 化合物2或顺铂(相应于2倍IC50值)处理(图6A)。检测72小时内10-20％的 细胞所出现的形态学变化，相当于在48小时时首先检测天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶活性的诱导，然后增加至72小时。我们还使用更高的浓度(相 当于5倍IC50值)对AGS和H1299细胞进行处理(图6B)。在该试验中，我们 使用具体的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂Z-VAD.fmk来确定天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的响应性。检测了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶在H1299中4小时内的活性大小，这与通过Western印迹法检测到的 PARP分裂产物有关(图1C)。与使用顺铂处理相比，在AGS细胞中在24小 时之内仅微弱地诱导了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性。该活性属于天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3依赖型的，因为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂在24小时时将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性降低至电泳 泳道水平(图6B)。特别地，尽管存在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂， 但是在AGS细胞中仍然检测到快速细胞圆形化现象，这进一步证实了我们 的结论，那就是细胞圆形化并不意味着细胞死亡。
我们的试验结果始终表明，双芳基磺酰胺这种HDM2抑制剂能够诱导 E2F-1水平迅速降低。为了确定这是否是反靶向活性(off-target effect)或者通 过抑制HDM2/HDMX活性就可能出现的结果，使用两种不同的siRNAs(一 种抗HDM2、一种抗HDMX)转染MCF7细胞。首先，将细胞使用HDM2或 对照siRNAs每隔24小时连续进行转染，然后24小时后收集起来。细胞溶 解之后，通过SDS-PAGE分离出等量蛋白质，然后通过Western印迹法分析。 使用对照siRNAs处理后在HDM2水平上没有显示出效果(图7A电泳泳道 1-9)。使用HDM2 siRNA处理后显著降低了所有时间点上的HDM2蛋白质 水平(图7A，电泳泳道10-15)。这相应说明了是E2F-1水平降低而不是E2F-4 水平降低，同时还诱导了p53蛋白水平。使用肌动蛋白作为加样对照(loading control)。HDMX显示出能够稳定HDM2水平。接下来，我们对HDM2水平 是否受MCF7细胞中的HDMX水平影响以及降低HDMX水平是否能够降低 E2F-1水平进行确定。将MCF7细胞使用单独或者混合的HDM2 siRNA和 HDMX siRNA进行转染。在存在HDM2 siRNA的情况下，所有时间点上的 HDM2水平都降低了(图7B电泳泳道10-12)。使用HDMX siRNA处理细胞 后降低了HDMX的细胞水平，同时还降低了HDM2水平(图7B电泳泳道 13-15)。在两种情形中，E2F-1水平也有所降低。联合使用HDM2和HDMX siRNA进行处理具有叠加效应，也就是显著降低了E2F-1在48小时时的水 平(图7B电泳泳道17)。这些试验表明，HDM2和HDMX都能调节E2F-1。 HDMX可能是间接通过稳定HDM2来调节E2F-1的。
对本发明进行各种修饰和变型对于本领域技术人员而言是显而易见的， 只要其没有偏离本发明范围和主旨。尽管结合具体优选的实施方案对本发明 进行了描述，但是应该理解的是，本发明并不仅仅限于这些具体的实施方案。 实际上，为了完成本发明而对所述方案进行于相关领域技术人员而言显而易 见的各种变型也是被包括在本发明范围之内的。
表1











n.d.表示未测出。
                                                  表2            细胞系         抗增殖活性，72-h MTT IC50(μM)     2     3     6     7   Roscovitine   AGS     胃腺癌     1.2     1.7     2.2     5.0     10.7   DU145     前列腺癌     3.1     3.6     6.1     9.1     8.5   HT29     结肠腺癌     2.1     2.3     3.5     4.6     15.6   Lovo     结肠腺癌     2.1     2.3     3.9     8.5     13.8   Nci-H460     大细胞肺癌     3.3     5.2     8.0     9.6     12.8   SK-N-MC     神经性上皮癌  (Neuriepithelioma)       3.0       3.8       2.9       3.0       7.1   A549     肺癌     5.2     5.9     10.0     19.3     9.2   H1299     大细胞肺癌     4.4     5.2     4.9     14.0     11.9   HCT116     结肠腺癌     2.8     3.5     6.0     12.2     9.7   HeLa     子宫颈癌     2.8     2.7     3.9     13.7     16.1   MCF7     乳腺癌     2.7     1.9     3.3     11.2     12.1   Messa     子宫癌     13.1     18.3     16.0     8.1     9.9   Messa-Dx5     子宫癌     9.5     12.1     15.5     7.6     5.3   Saos-2     骨肉瘤     9.5     8.9     12.0     13.3     17.4   NaCat     人类角质化细胞     9.3     10.5     10.6     12.9     16.3   SJSA-1     骨肉瘤     13.5     14.1     17.8     17.0     17.8   U2OS     骨肉瘤     6.2     8.2     10.2     8.8     16.4   SKUT-1     子宫平滑肌肉瘤     8.8     14.1     15.0     6.1     10.5   HS27     包皮成纤维细胞     17.3     15.2     21.4     39.2     43.1   IMR90     肺成纤维细胞     23.1     19.8     29.8     41.8     44.2   WI38     肺成纤维细胞     22.7     21.1     30.0     52.3     34.5   变形平均值     5.7±3.9     6.9±5.0     8.4±5.1     10.2±4.4     12.3±3.7   癌症平均值     3.1±1.2     3.8±1.8     4.9±2.3     9.7±4.7     11.2±3.0   肉瘤平均值     10.2±2.7     12.1±3.8     13.7±3.1     11.3±3.7     13.8±5.1   非变形平均值     21.0±3.1     18.7±3.1     27.1±4.9     44.6±6.9     40.6±5.3
                            表3    化合物     浓度b(μM)  荧光素酶活性  的诱导倍数c 体内竞争性HDM2结合测定d     IC50(μM)  对照a     150-200     4     0.19     2     6     231     26.4±3.4     3     6     200     41.9±5.8     4     100e     ＜2     378     6     5.5     84     20.4±1.4     7     9     32     15.4±7.8     39     15     64     46.1±3.4     40     13     68     59.6±10.9     45     15     67     16±3.7     46     6     55     11.1±1.7     48     5.5     43.5     25.3±4.6     49     5.5     117     46.3±4     50     39     21     7.3±0.6     54     10     90     20.2±1.3     55     10     53     27±10.1     57     7     25     31.1±5.6     60     7.5     48     29±6     61     4.8     34     45±14     63     6.4     95     35±8     129     100     5     278±19     65     10     74     7.4±1     66     4.2     65     14.7±0.9     38     13     4     231±13     83     5     10     119±42.5
aH-Phe-Met-Aib-Pmp-(6-Cl-Trp)-Glu-Ac3c-Leu-NH2。
b该浓度的测试化合物其p53诱导活性最大。
c相对于基本的荧光素酶活性而言(16-h时间点)。
d按照实施例3中描述的荧光素偏振测定方法测量。
e最高测试浓度。
                   表4       化合物             IC50(μM)a     非同步细胞     同步细胞b     2     23.2±4.0     n.d.     3     28.8±2.3     69±30     5     73.3±33.4     72±31     6     37.5±12.9     39     41     76.6     84     39     90.0     n.d.     40     99.5     n.d.     46     25.5±3.1     n.d.     48     31.3±2.6     n.d.     49     36.3±2.9     n.d.     60     29.2±6.8     n.d.     61     34.6±22.9     n.d.     64     44.6±2.3     n.d.     83     29.4±6.0     n.d.
a使用测试化合物处理3小时之后。
b使用0.3mM含羞草素同步化24小时，然后冲洗。
                         表5     给药顺序               IC50(μM)     AGS     H1299     SJSA-1   单独施用2     1.1     5.1     14   单独施用顺铂     3.8     2.9     6.1   同时施用2+顺铂     0.11     0.11     0.11   顺铂+6小时后施用2     1.5     0.03     0.23   2+6小时后施用顺铂     0.21     0.18     0.02
                           表6      给药顺序               IC50(μM)     AGS     H1299     SJSA-1    单独施用2     1.1     5.1     14    单独施用依托泊苷     0.28     1.3     16    同时施用2+依托泊苷     0.20     0.04     0.19    依托泊苷+6小时后施用2     0.25     0.06     1.1    2+6小时后施用依托泊苷     0.08     0.05     0.02