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基因工程化的细胞及应用

阅读：5发布：2020-10-05

专利汇可以提供基因工程化的细胞及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种基因工程的细胞，该细胞表达外源性FLT3L，本发明还提供了该基因工程化的细胞用于治疗肿瘤、病原微生物感染等疾病的用途。本发明的基因工程的细胞具有优异的肿瘤杀伤活性。，下面是基因工程化的细胞及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基因工程的细胞，其特征在于，该细胞表达外源性FLT3L。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述的FLT3L具有与SEQ ID NO:20至少90％相似性的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列至少90％相似性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫应答细胞。
4.如权利要求1-3任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达能识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体。
5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：
促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD22；CD30；
CD70；CD123；CD138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；CD117；白介素
13受体亚单位α(IL-13Ra)；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；MART-1；gp100；间皮素；EpCAM；血管内皮生长因子或其受体；路易斯Y抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；细胞表面相关的粘蛋白；EGFR；EGFR2；ERBB3；ERBB4；EGFRvIII；神经节苷脂GM3；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；CD248；TEM7R；claudin6；Claudin18.2；ASGPR1；CDH16；αvβ6整合素；
BCMA；CSPG4；EGP2；EGP40；FAP；FAR；MAGE-A1；MCSP；NKG2D受体；PSC1；ROR1；SURVIVIN；
TAG72；CD97；CD179a；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；血管生成素结合细胞表面受体2(TIE2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；
优选的，为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、白介素13受体亚单位α(IL-13Ra)、
claudin6、Claudin18.2、EGFR；EGFR2；ERBB3；ERBB4；EGFRvIII、间皮素、BCMA、FAP、肾母细胞瘤蛋白(WT1)。
6.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含能够识别抗原的胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内结构域，
所述跨膜结构域包含选自以下组成的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C；和/或
(iii)所述的细胞内结构域包括：转录因子结合域；一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域:CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、和NKG2D，或其组合。
7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
(i)特异性结合所述抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽；或
(ii)特异性结合所述抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽；或
(iii)特异性结合所述抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽。
8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体以及所述的外源性的FLT3L由与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：38具有至少90％相似性的核苷酸序列编码。
9.一种核酸分子，含有权利要求4-8任一所述的FLT3L的编码基因和嵌合抗原受体的编码基因。
10.一种表达载体，其特征在于，包含有权利要求9所述的核酸分子，所述的表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体，逆转录病毒载体、腺病毒载体、和/或腺相关病毒载体。
11.如权利要求10所述的表达载体，包括如权利要求4至8所述的嵌合抗原受体的表达盒和所述FLT3L的表达盒；并且所述表达盒之间由串联片段连接，其中，所述的串联片段包括F2A、PA2、T2A、和/或E2A。
12.一种多肽，由权利要求9所述的核酸分子编码。
13.一种基因工程的细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子；或权利要求10或11所述的表达载体；或权利要求12所述的多肽。
14.权利要求1至8任一所述的细胞，权利要求9所述的核酸分子，权利要求10或11所述的载体或权利要求12所述的多肽用于制备治疗肿瘤抗原相关的疾病的药物的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，
所述的肿瘤选自血液肿瘤，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，中的任一一种或其组合或转移性病灶。
16.如权利要求13或14所述的用途，其特征在于，当效靶比为20:1、10:1、5:1、3:1、2.5:
1、1:1或者0.3:1时，所述细胞对所述肿瘤的细胞杀伤水平至少为5％、10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、75％。
17.如权利要求13或14所述的用途，其特征在于，所述细胞能够抑制所述肿瘤的生长，并使得肿瘤的增长速率不高于60％、50％、30％、或10％。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-8中任一项所述的细胞、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10或11所述的表达载体或权利要求12所述的多肽，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
19.一种试剂盒，包含权利要求1-8中任一项所述的细胞、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10或11所述的表达载体或权利要求12所述的多肽、或权利要求17所述的药物组合物；以及使用说明书。

说明书全文

基因工程化的细胞及应用

技术领域

[0001] 本发明属于免疫治疗领域；更具体地，本发明涉及一种提高个体免疫力的方法，提供一种基因工程细胞，其表达外源性FLT3L。将所述的基因工程细胞应用于治疗肿瘤、传染病和免疫功能低下有关疾病，具有显著提高受试者免疫力，杀伤肿瘤或病原体的能力。

背景技术

[0002] 树突状细胞(Dendritic cell,DC)是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞。其中组织常驻性DC8含有两个功能专一的亚群：CD103+DC被认为是最主要甚至是唯一的可以转运完整抗原到肿瘤引流区淋巴结的肿瘤内髓系细胞群，并且为PD-L1抗体发挥抗肿瘤免疫所必需。

[0003] FLT3L可以促进CD103+DC的祖细胞(progenitor)在骨髓里大量增殖，并且在肿瘤组织聚集及扩增。用重组蛋白FLT3L和poly I:C联合能够增加具有CD8+T细胞在肿瘤组织中的招募及活化(Salmon H,Idoyaga J,Rahman A，et al.Immunity.2016；44(4):924-38.Expansion and Activation of CD103(+)Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and
BRAFInhibition.)。由于FLT3L在体内的半衰期非常短，易被代谢，故需要持续性外源性给予FLT3L，以保证其提高机体免疫活性的能力。因此，对于更好地理解并运用FLT3L对机体免疫功能方面的作用，以及FLT3L与其他免疫治疗手段联用于肿瘤、传染病及其他免疫相关性疾病的研究存在需要。

发明内容

[0004] 本发明目在于提供一种基因工程化的细胞及其应用。

[0005] 在本发明的第一方面，提供一种基因工程细胞，该细胞表达FLT3L。

[0006] 在一个优选例中，所述的FLT3L具有与SEQ ID NO:20至少90％相似性的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列至少90％相似性的氨基酸序列。

[0007] 在另一优选例中，所述FLT3L连有可剪切蛋白，该可剪切蛋白可以选自但并不限于2A多肽、IRES。2A多肽可以选自F2A、PA2、T2A、E2A等，在一具体实施例中，使用的为F2A。

[0008] 在另一优选例中，所述细胞为免疫应答细胞。

[0009] 在另一优选例中，所述细胞还表达能识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体。

[0010] 在另一优选例中，所述肿瘤抗原选自：

[0011] 促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD22；CD30；CD70；CD123；CD138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；CD117；
白介素13受体亚单位α(IL-13Ra)；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；MART-1；gp100；间皮素；EpCAM；血管内皮生长因子或其受体；路易斯Y抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；细胞表面相关的粘蛋白；EGFR；EGFR2；ERBB3；ERBB4；EGFRvIII；神经节苷脂GM3；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；CD248；TEM7R；claudin6；Claudin18.2；ASGPR1；CDH16；αvβ6整合素；BCMA；CSPG4；EGP2；EGP40；FAP；FAR；MAGE-A1；MCSP；NKG2D受体；PSC1；ROR1；SURVIVIN；
TAG72；CD97；CD179a；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；血管生成素结合细胞表面受体2(TIE2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)。

[0012] 优选的，为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、白介素13受体亚单位α(IL-13Ra)、claudin6、Claudin18.2、EGFR；EGFR2；ERBB3；ERBB4；EGFRvIII、间皮素、BCMA、FAP、肾母细胞瘤蛋白(WT1)。

[0013] 在另一优选例中，所述嵌合受体包含能够识别抗原的抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。

[0014] 在另一优选例中，所述抗原结合结构域可以是完整抗体或抗体片段，包括scFv，Fv，Fab，(Fab')2，单结构域抗体(SDAB)或肿瘤抗原的天然配体，或其组合。

[0015] 在另一优选例中，所述跨膜结构域包含选自以下组成的蛋白质的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C。

[0016] 在另一优选例中，所述的细胞内结构域包括：转录因子结合域；一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。

[0017] 在另一优选例中，所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合。

[0018] 在另一优选例中，所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、和NKG2D，或其组合。

[0019] 在另一优选例中，所述一级信号传导结构域包含CD3ζ的功能结构和/或所述共刺激信号传导结构域包含选自CD137，CD27和CD28的蛋白质的功能结构域。

[0020] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体包括：特异性结合所述抗原的抗体、CD28的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽；或特异性结合所述抗原的抗体、CD28的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽；或特异性结合所述抗原的抗体、CD28的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ融合肽。

[0021] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体以及所述的外源性的FLT3L由与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：38具有至少90％相似性的核苷酸序列编码。

[0022] 在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，包含：

[0023] (i)含有本发明第一方面所述的FLT3L的编码基因和嵌合抗原受体的编码基因。

[0024] 在本发明第三方面，提供一种表达载体，包含有本发明第二方面所述的核酸分子，所述的表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体，逆转录病毒载体、腺病毒载体、和/或腺相关病毒载体。

[0025] 在另一优选例中，包括本发明第一方面所述的结合抗原的受体的表达盒和所述FLT3L的表达盒，并且所述表达盒之间由串联片段连接，其中，所述的串联片段包括F2A、PA2、T2A、和/或E2A。在另一优选例中，所述的表达载体，还包含选自EF-1启动子，CMV IE基因启动子，EF-1α启动子，泛素C启动子，或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的启动子。

[0026] 在本发明第四方面，提供了上述核酸分子编码的多肽分子。

[0027] 在本发明第五方面，提供了一种基因工程的细胞(例如，免疫效应细胞)，其包含：本发明第二方面的核酸分子；或本发明第四方面的多肽分子；或本发明第三方面的载体。

[0028] 在本发明第六方面，提供了一种提高受试者免疫力的方法，包括：对所述受试者施用有效量的包含本发明第一方面的细胞，或本发明第二方面的核酸分子，或本发明第五方面所述的细胞，其中，所述细胞为免疫效应细胞。

[0029] 在本发明第七方面，提供本发明第一和第五方面任一所述的细胞，第二方面所述的核酸分子，第三方面所述的载体，第四方面所述的多肽分子，第六方面所述的方法，用于治疗有此需要的个体的肿瘤相关的疾病。

[0030] 在另一优选例中，所述的肿瘤选自血液肿瘤，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤中的任一一种或组合，或所述癌症的转移性病灶；

[0031] 在另一优选例中，当效靶比为20:1、10:1、5:1、3:1、2.5:1、1:1或者0.3:1时，所述细胞对所述肿瘤细胞或者所述病原体的杀伤水平至少为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、75％。

[0032] 在另一优选例中，所述细胞能够抑制所述肿瘤的生长，并使得肿瘤的增长速率不高于60％、50％、30％、或10％。

[0033] 在另一优选例中，所述受试者是人。

[0034] 在另一优选例中，药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：

[0035] (i)本发明的细胞；或

[0036] (ii)本发明的组合物；

[0037] 以及医药学上可接受的载体或赋形剂。

[0038] 在本发明第八方面，提供了一种试剂盒，包含：本发明的细胞、核酸分子、表达载体、多肽或药物组合物；以及使用说明书。

[0039] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

[0040] 图1A是重组逆转录病毒载体EGFRvIII-28Z-FLT3L结构示意图，图1B是重组逆转录病毒载体EGFRvIII-28Z和EGFRvIII-28Z-FLT3L结构示意图。

[0041] 图2是逆转录病毒感染小鼠T淋巴细胞效率检测。

[0042] 图3是ELISA方法检测小鼠CAR-T细胞分泌FLT3L的水平。

[0043] 图4是EGFRvIII-CAR-T细胞以及EGFRvIII-28Z-FLT3L-T细胞的体外杀伤功能检测图，图4A是EGFRvIII阴性的CT26细胞的体外杀伤情况，图4B是EGFRvIII阳性的CT26-EGFRvIII细胞的体外杀伤情况，*P<0.05，EGFRvIII-28Z VS.EGFRvIII-28Z-FL3L，***P<0.01，EGFRvIII-28Z VS.EGFRvIII-28Z-FL3L。

具体实施方式

[0044] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明进行了深入的研究，发现使细胞表达FLT3L，可有效地增加机体的免疫活性从而杀伤肿瘤细胞。在此基础上，本发明提供了一种基因工程化的细胞，其表达FLT3L或其表达FLT3L和嵌合受体，该表达FLT3L的细胞能够应用于治疗肿瘤相关疾病，具有显著优异的提高机体免疫力，杀伤肿瘤的能力。

[0045] 术语

[0046] 本文采用的科技术语具有与本领域技术人员常规理解的相同或相似的含义。为便于理解本发明，一些术语定义如下。

[0047] 当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语"约”是指包括指定值的±20％，或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％的变化，因此这样的变化适于进行所公开的方法。

[0048] 术语“基因工程(genetic engineering)”又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。经过基因工程获得的细胞称为基因工程细胞。

[0049] 术语，所述的“FLT3L”可以人的FLT3L，由235个氨基酸残基组成的IV型跨膜蛋白(NCBI Reference Sequence:NP_001191431.1)，氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示；也可以是与SEQ ID NO：20具有至少80％相似性的多肽，优选与SEQ ID NO：20具有至少85％或至少90％相似性的多肽；所述的“FLT3L”还可以来自其他种属，包括但不限于鼠、猴、猪。FLT3L可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物；也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组各元件或FLT3L。优选的，本发明可采用重组的各元件或FLT3L。

[0050] 在所述各元件或FLT3L多肽序列的基础上，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也包括在本发明中。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。例如，所述的取代可以根据，例如下表所示进行。

[0051]初始残基代表性的取代残基优选的取代残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0052] 所述各元件或FLT3L的多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

[0053] 术语，所述的“免疫效应细胞”和“免疫应答细胞”在本文中可以互换使用，是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如，α/β的T细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。

[0054] 术语，所述的“启动子”是指被细胞的合成机构识别的、或被引入了合成机构、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。“组成型”启动子是指有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，在细胞的大多数或全部生理条件下引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。“可诱导的”启动子是指当有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。“组织特异性的”启动子是指当有效连接编码或指定基因的多核苷酸时，基本上仅当细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸。所述的“免疫细胞诱导型启动子”是指一种启动子，其仅在免疫应答细胞接触抗原、免疫应答细胞活化时，才会驱动与其操作性连接的基因发生高水平表达或者在缺氧等条件下表达。所述的“免疫细胞诱导型启动子”包括：NFAT6启动子，hypoxia-inducible transcription factor-1 alpha(HIF-1α)启动子。

[0055] 术语，所述的“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质细胞、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官，或组织或相应的细胞。肿瘤包括癌症，如肉瘤，癌，或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。本发明所述的肿瘤，可包括，但不限于白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，滑膜vioma，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤。

[0056] 术语，所述的“肿瘤抗原”是指全部地或以片段形式(例如MHC/肽)在肿瘤细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学作用剂优先靶向肿瘤细胞。肿瘤抗原可以为由正常细胞和癌细胞表达的标记物，例如谱系标记物例如在B细胞上的CD19；肿瘤抗原也可以为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达；肿瘤抗原也可以为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子；肿瘤抗原也可以全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。在某些实施方式中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCRs)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在肿瘤中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表免疫疗法的独特类型的细胞表面靶点。

[0057] 术语，所述的“免疫耐受”是指对抗原特异性应答的T细胞与B细胞，在抗原刺激下，不能被激活，不能产生特异性免疫效应细胞及特异性抗体，从而不能执行正免疫应答的现象。这不同于免疫缺陷或使用免疫抑制剂后造成的抑制状态，不会导致自身免疫病的发生称为免疫耐受。引起免疫耐受的抗原称为耐受原。如自身组织抗原，引起天然免疫耐受；非自身抗原(如病原微生物和异种组织抗原等)，在一定条件下可以是免疫原，也可以是耐受原。所述的“免疫缺陷”是一种由于人体的免疫系统发育缺陷或免疫反应障碍致使人体抗感染能力低下，引起机体感染和恶性肿瘤。免疫缺陷可分为二类，一类是先天具有的；另一类是后天获得的。

[0058] 本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导。

[0059] 术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。

[0060] 术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。

[0061] 术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

[0062] 术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。

[0063] 术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。

[0064] 术语“抗肿瘤”或“抗癌”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状的改善。如该术语在本文中使用的，“来源于”表示第一和第二分子之间的关系。它一般是指在第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不暗示或包括对来源于第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在来源于CD3ζ分子的胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域保持足够CD3ζ结构使得其具有所需的功能，即，在适当的条件下产生信号的能力。它不暗示或包括对产生胞内信号传导结构域的具体过程的限制，例如，它并不意味着，为了提供胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并缺失不需要的序列，或施加突变，以得到胞内信号传导结构域。

[0065] 术语“肿瘤抗原相关的疾病”包括但并不限定于与如本文所述肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的状况，包括例如，增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前状态，如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关的适应证。在一个方面中，与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一个方面中，与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的其它疾病包括但不限于，例如，非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前状态或与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的增生性疾病。与本文所述的肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于，例如，自身免疫性疾病(例如，狼疮)，炎性病症(过敏和哮喘)以及移植。肿瘤抗原表达可以细胞表达，或在任何时间表达了，编码所述肿瘤抗原的mRNA。

[0066] 术语“保守的序列修饰”是指不会显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术(比如定点诱变和PCR-介导的诱变)引入到本发明的抗体或抗体片段中。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本发明的CAR之内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能性测定来测试改变的CAR。

[0067] 术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的特异性CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或者非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。

[0068] 术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T-细胞可以使用其T-细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T-细胞。

[0069] 术语“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞例如CART细胞的免疫效应子功能的信号。在例如CART细胞中免疫效应子功能的实例包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域可以包括一级胞内信号传导结构域。示例性的一级胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，一级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。

[0070] 一级胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。

[0071] 术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCRζ”定义为如GenBan Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基，且“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的细胞质结构域包括GenBank Acc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能性同源物的来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基。

[0072] 术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激信号传导结构域为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，能够促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，以及特异性地结合CD83的配体。

[0073] 共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表:TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及特异性地结合CD83的配体等。

[0074] 胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。

[0075] 术语“4-1BB”是指具有如GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Acc.No..AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为来自人或者来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。

[0076] 术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cDNA、或mRNA中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，该聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物

[0077] 除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子的程度。

[0078] 术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。

[0079] 术语“内源的”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。

[0080] 术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。

[0081] 术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

[0082] 术语“转移载体”是指包括分离的核酸且可用于将所分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体是本领域已知的，包括，但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为进一步包括非质粒和促进核酸转移到细胞中的非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体等

[0083] 术语"表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

[0084] 术语“慢病毒”是指逆转录病毒家族的种类。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，从而它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。

[0085] 术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别地包括自我灭活性慢病毒载体，如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的。可用于临床中的慢病毒载体的其它实例包括，但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术，来自Lentigen的载体系统等。慢病毒载体的非临床种类也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。

[0086] 术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间比如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位点被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个的位置被腺嘌呤占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性为匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位点(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)为同源的，则这两个序列是50％同源；如果90％的位点(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。

[0087] 术语“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境比如例如宿主细胞中。

[0088] 在本发明的上下文中，使用下述通常存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷、“C”是指胞嘧啶、“G”是指鸟苷、“T”是指胸苷、和“U”是指尿苷。

[0089] 术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确地限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质，并且以与天然存在核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生序列而实现，所述序列中一个或更多个所选择的(或所有的)密码子的三个位置被混合碱基和/或去氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

[0090] 术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没限制。多肽包括含有彼此通过肽键结合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。正如本文中使用的那样，该术语是指短链(其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域通常也称为蛋白质，其存在多种类型)。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

[0091] 正如本文中使用的那样，术语“治疗(treat、treatment、treating)”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的CAR)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。术语“治疗”是也可以指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。术语“治疗”也可以是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。术语“治疗”也可以是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。

[0092] 术语“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分转导到细胞的另一个部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨越细胞膜接受信号和传递信号的分子和分子复合体。

[0093] 术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人类)。

[0094] 正如本文中使用的那样，术语“治疗”是指治疗。治疗效果是通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态获得的。

[0095] 正如本文中使用的那样，术语“预防”是指预防性或保护性治疗疾病或疾病状态。

[0096] 术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。

[0097] 术语“识别肿瘤抗原”是指识别并且结合存在于样品中的肿瘤抗原，但基本上不会识别或结合样品中的其它分子。

[0098] 范围：在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。
例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至
4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。

[0099] 提高个体免疫应答细胞活力的方法

[0100] 本发明提供了一种提高个体免疫应答细胞活力的方法，包括给予个体表达有外源性FLT3L的细胞。

[0101] 本发明还提供了一种提高CAR-T细胞免疫应答活力的方法，包括联合给予表达有外源性FLT3L的细胞及CAR-T细胞。表达有外源性FLT3L的细胞可以仅表达有FLT3L，也可以表达有其他促进免疫应答细胞的细胞因子，如I型干扰素。

[0102] 治疗/预防/抑制肿瘤或者病原体感染、或调节免疫耐受能力的药物中的用途[0103] 本发明还提供了表达有FLT3L的细胞在治疗/预防/抑制肿瘤或者病原体感染、或调节免疫耐受能力的药物中的用途，所述的肿瘤包括但并不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、卵巢癌、宫颈癌或胶质瘤；所述的病原体包括但不限于：病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；较佳地，所述的病毒包括：巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒或流感病毒。

[0104] 采用表达有FLT3L的细胞作为效应细胞，当效靶比为20:1,10:1,5:1,3:1,2.5:1,1:1,或者0.3:1时，所述细胞对所述肿瘤细胞或者所述病原体的杀伤水平至少为5％,10％,
15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％，50％，55％，60％，75％。

[0105] 采用表达有FLT3L的细胞作为效应细胞能够显著抑制肿瘤增长，在7天、10天、14天中，肿瘤的增长速率不高于60％、50％、30％、或10％。

[0106] 组合物和试剂盒

[0107] 本发明还提供了包含表达有FLT3L的细胞或本发明的核酸分子、表达载体、多肽以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。

[0108] 本发明还提供了包含本发明的细胞、核酸分子、表达载体、多肽或药物组合物以及使用说明书的试剂盒。

[0109] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0110] 实施例1EGFR-CAR-FLT3L的制备

[0111] 1、实验材料

[0112] 小鼠结肠癌细胞CT26购自美国模式培养物保藏所(ATCC)；

[0113] 过表达嵌合EGFRvIII的CT26-EGFRvIII细胞由本实验室构建；

[0114] Balb/c小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司；

[0115] 胎牛血清(FCS)：Gibco，Cat# 10099-141，56℃热灭活30min；

[0116] IL-2：上海华新注射用重组人白介素-2；

[0117] PE-Streptavidin：BD pharmingen，Cat# 554061；

[0118] polyI:C：InvivoGen，Cat#tlrl-pic；

[0119] CytoTox 非放射性细胞毒性检测：Promega，Cat# G1780；

[0120] 小鼠FLT3L ELISA检测试剂盒：R&D systems，Cat# MFK00；

[0121] pGEM-mFLT3L载体购自Sino Biological Inc.，Cat#：MG51113-G；

[0122] 逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP购自addgene；

[0123] 包装载体pCL-Eco由上海市肿瘤研究所构建；

[0124] RPMI 1640完全培养基：含10％热灭活FCS，50μMβ-巯基乙醇，100ng/ml IL-2。

[0125] 2、实验方法

[0126] 2.1逆转录病毒载体构建

[0127] 2.1.1 EGFRvIII-28Z逆转录病毒载体的构建

[0128] 将鼠CD8α信号肽(SEQ ID No：6)、抗EGFRvIII单抗抗体(SEQ ID No：7)、鼠CD8α胶链区及跨膜区(SEQ ID No：8)、鼠CD28胞内域(SEQ ID No：9)、鼠CD3ζ胞内域(SEQ ID No：10)的基因序列依次连接，通过体外基因合成的方法获得EGFRvIII-28Z基因片段，并用MluⅠ和SalⅠ双酶切位点置换逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP中的IRES-GFP片段，获得重组载体MSCV-EGFRvIII-28Z。

[0129] 2.1.2 EGFRvIII-28Z-FLT3L逆转录病毒载体的构建

[0130] 将小鼠muFLT3L基因片段(SEQ ID No：3)与步骤2.1.1中构建的EGFRvIII-28Z通过F2A(SEQ ID No：5)连接，即将F2A-FLT3L基因插入EGFR-28Z基因中CD3ζ片段后，构建EGFRvIII-28Z-FLT3L逆转录病毒载体。

[0131] (1)采用PCR的方法，以EGFRvIII-28Z逆转录病毒载体为模板，用引物MSCV-F(SEQ ID No：15)和mCD3z-F2A-R(SEQ ID No：16)扩增。加样顺序为：10×KOD-PLUS buffr:5ul，dNTP mix(2.5mM each):5ul，MgCl2(25mM):2ul，MSCV-F:1ul，mCD3z-F2A-R:1ul，MSCV-EGFRvIII-28Z:100ng，KOD-PLUS PCR polymerase:1ul，加双蒸水补充到50ul，进行PCR反应。PCR完成后，通过胶回收纯化目标片段1。

[0132] (2)采用PCR的方法，以pGEM-mFLT3L载体为模板，用引物F2A-mFLT3L-F(SEQ ID No：18)和mFLT3L-R(SEQ ID No：19)扩增目标片段2，加样顺序为：10×KOD-PLUS buffr:5ul，dNTP mix(2.5mM each):5ul，MgCl2(25mM):2ul，F2A-mFLT3L-F:1ul，mFLT3L-R:1ul，pGEM-mFLT3L:100ng，KOD-PLUS PCR polymerase:1ul，加双蒸水补充到50ul，进行PCR反应。
PCR完成后，通过胶回收纯化目标片段2。

[0133] (3)将目标片段1和目标片段2进行over-lap PCR，加样顺序为：10×KOD-PLUS buffr:2.5ul，dNTP mix(2.5mM each):2.5ul，MgCl2(25mM):1ul，片段1:50ng，片段2:100ng，KOD-PLUS PCR polymerase:0.5ul，加双蒸水补充到25ul，进行PCR反应。

[0134] PCR完成后，向反应物中继续添加下列组份进行反应：10×KOD-PLUS buffr:2.5ul，dNTP mix(2.5mM each):2.5ul，MgCl2(25mM):1ul，MSCV-F(SEQ ID No：15):1ul，mFLT3L-R(SEQ ID No：18):1ul，KOD-PLUS PCR polymerase:1ul，加双蒸水补充到50ul，进行PCR反应并回收目标片段。

[0135] (4)将上述步骤(3)中回收的片段进行MluⅠ和SalⅠ双酶切，回收2255bp的片段；将MSCV-EGFPvIII-28Z载体进行MluⅠ和SalⅠ双酶切，回收5160bp的片段；将两个片段进行连接，转化，测序鉴定，获得MSCV-EGFRvIII-28Z-FLT3逆转录病毒载体，载体的质粒图如图1-A所示，结构示意图如图1-B所示。

[0136] 2.2病毒制备

[0137] (1)以4.5×106的密度接种293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备包装病毒，培养基含DMEM，添加10％胎牛血清；

[0138] (2)将9μg MSCV-EGFRvIII-CAR或EGFRvIII-28Z-FLT3与9μg包装质粒pCL-Eco溶入800μL无血清DMEM培养液，混匀；

[0139] (3)将54μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min；

[0140] (4)转染复合物的形成：将质粒混合液加入PEI混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min；

[0141] (5)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中，培养72h后，收集病毒液上清，得到携带EGFRvIII-CAR的逆转录病毒或者得到携带EGFRvIII-28Z-FLT3的逆转录病毒。

[0142] 2.3小鼠脾脏T淋巴细胞分离

[0143] (1)取健康Balb/c小鼠，脱颈处死后，75％酒精浸泡消毒1min，无菌环境中取出脾脏；

[0144] (2)将脾脏置于放置到50ml离心管上的40um细胞淲网，加少许1640培养基润湿，用注射器的活塞轻轻挤压，并不时用培养基冲洗，直到脾脏变成薄薄的一层，400g，离心7min；用1-2ml 1640培养基转移到5ml冻存管中，离心；

[0145] (3)去上清，加200ul红细胞裂解液重悬沉淀，室温静置2min，加2ml 1640培养基稀释，离心；

[0146] (4)去上清，加1ml Robosep溶液重悬细胞沉淀，离心并计数；去上清，加Robosep溶液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×108/ml，按50ul/ml的体积比例加入大鼠血清；

[0147] (5)加入Cell isolation kit中相应的Cocktail(50ul/ml)，混匀后室温静置10min；漩涡混匀cell isolation kit中的Streptavidin RapidSpheres 30s，按75ul/ml的比例吸取Streptavidin RapidSpheres加入到分离物中，混匀，室温孵育5min；

[0148] (6)向各组中加入Robosep溶液至总体积为2.5ml，混匀后插入Magnet孔中，室温静置5min；轻轻拿起Magnet，将未吸附的成分倒入新的5ml离心管中，1640完全培养基清洗一次后，用RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为2×106/ml。

[0149] 2.4小鼠脾脏T淋巴细胞活化

[0150] 将纯化的小鼠CD3+T淋巴细胞按1:1加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28(PBS清洗一次)，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基。

[0151] 2.5小鼠CAR-T淋巴细胞的制备

[0152] (1)将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于retronectin包被的48孔板中，每孔细胞数目1×106，加入1ml步骤2.2制备的携带EGFRvIII-CAR的逆转录病毒或者得到携带EGFRvIII-28Z-FLT3的逆转录病毒，补充培养基至2mL；

[0153] (2)2000g，32℃rpm，离心90min后，转移至细胞培养箱继续培养；

[0154] (3)第二天更换新鲜培养基，调整细胞密度为5×105/mL，每2-3天进行传代。

[0155] 2.6CAR-T细胞嵌合抗原受体表达

[0156] (1)感染3天后，取4×105的T细胞，4℃，400g，离心5min，弃上清，PBS+2％FCS清洗一次；

[0157] (2)加50μL PBS+2％FCS重悬细胞，加入Biotin标记的EGFRvIII蛋白至终浓度为25ug/ml，冰上孵育30min；

[0158] (3)PBS+2％FCS清洗两次后，加入50μL PBS+2％FCS重悬细胞，加入1μL PE标记的streptavidin，冰上孵育30min；

[0159] (4)PBS+2％FCS清洗两次后，加入400μL PBS+2％FCS重悬细胞，转移至流式管中，采用流式细胞仪检测感染效率。

[0160] 结果如2所示，EGFRvIII-28Z CART细胞感染效率为63.6％，GFRvIII-28Z-FLT3L CART细胞感染效率为72.1％。

[0161] 2.7CAR-T细胞分泌FLT3L的水平

[0162] 将FLT3L-CART细胞密度调整到5E+05/ml，48h后，取上清检测FLT3L，实验方法按照说明书进行(R&D systems， ELISA Mouse/Rat Flt-3 Ligand Immunoassay，Cat# MFK00)。

[0163] 采用ELISA方法检测小鼠CAR-T细胞分泌FLT3L的水平，结果如图3所示，活化后正常培养的小鼠T细胞有低水平的FTL3L表达。相对于EGFRvIII-28Z CAR-T，EGFRvIII-28Z-FLT3L CAR-T细胞分泌FLT3L的量增加了240倍，表明转导的FLT3L在CAR-T细胞中高效的表达。

[0164] 实施例2体外毒性实验

[0165] 选取EGFRvIII阴性的CT26细胞和EGFRvIII阳性的CT26-EGFRvIII作为靶细胞。效应细胞为转染了空载体的病毒的T细胞(UT)，EGFRvIII-28Z CAR T细胞，以及GFRvIII-28Z-FLT3L CAR T细胞。

[0166] 调整靶细胞CT26和CT26-EGFRvIII浓度为1×106/mL，取100μL接种到96孔板，按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入分别加入效应细胞。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。

[0167] 其中各实验组和各对照组如下：

[0168] 实验组设置：各靶细胞+表达不同的嵌合抗原受体的T淋巴细胞；

[0169] 对照组1：靶效应细胞的最大释放自发LDH释放；

[0170] 对照组2：靶细胞的自发释放LDH释放；

[0171] 对照组3：效应靶细胞的最大自发释放LDH释放

[0172] 对照组4：体积校正对照；

[0173] 对照组5：培养基背景对照。

[0174] 实验结果的计算：将所有实验组、靶细胞自发LDH释放组和效应细胞自发LDH释放组的吸光度减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；将上述步骤获得的经过校正的值代入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性(％)，计算公式：％细胞毒性＝(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/靶细胞最大-靶细胞自发)*100。

[0175] 将效应细胞EGFRvIII-28Z和EGFRvIII-28Z-FL3L分别与靶抗原EGFRvIII阴性的CT26以及EGFRvIII阳性的CT26-EGFRvIII细胞按不同的效靶比共培养18h，检测上清中的LDH含量，从而计算对靶细胞的杀伤活性。结果如图4(4-A，4-B)所示，EGFRvIII-CAR-T细胞对CT26细胞无明显毒性，而对表达靶抗原的细胞则表现出较强的杀伤作用。在效靶比为0.3:1和1:1时，EGFRvIII-28Z-FLT3L CAR-T的杀伤效率都明显高于EGFRvIII-28Z CAR-T，且具有显著性差异。

[0176] 实施例3观察小鼠EGFRvIII-CAR-T细胞在体内的存活情况

[0177] (1)小鼠结肠癌模型的建立：接种3×105CT26-EGFRvIII于6周龄的雌性Balb/c小鼠的右侧腋部皮下；

[0178] (2)实验分组：肿瘤接种13天，将荷瘤小鼠分为3组，分为UT细胞组、EGFRvIII-28Z CAR-T细胞组和EGFRvIII-28Z-FLT3L CAR-T细胞组；

[0179] (3)CAR-T细胞回输：在肿瘤体积为150mm3时，通过尾静脉输注5.0×106CAR-T细胞(EGFRvIII-28Z CAR-T细胞组和EGFRvIII-28Z-FLT3L CAR-T)，同时以U T细胞组作为对照，CAR-T细胞回输后第3、5天瘤内注射50ug polyI:C。

[0180] (4)回输CAR-T细胞后，分别在第7天、第14天取外周血，检测CAR-T细胞的存活情况：

[0181] 取50ul外周血，加1ul FITC anti-CD3 Ab，室温孵育30min，加450ul红细胞裂解液，室温静置15min，直接采用流式细胞仪检测CD3+细胞比例；同时用血球计数板进行计数，计算出每ul外周血含有的CD3+细胞数量；

[0182] 另取100ul外周血，加Biotin标记的EGFRvIII蛋白以及加1ul FITC anti-CD3 Ab，室温孵育30min，然后加900ul红细胞裂解液，室温静置15min，4℃，400g离心5min，去上清，再加PE-streptavindin于冰上孵育30min，清洗两次后，采用流式细胞仪检测CAR-T细胞与CD3+细胞比例，从而计算出每ul外周血含有的CAR-T细胞数量。

[0183] 结果显示EGFRvIII-28Z-FLT3L CAR-T细胞组在体内的存活数量更多。

[0184] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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