脑血管疾病基因治疗剂
阅读：566发布：2020-05-12
专利汇可以提供脑血管疾病基因治疗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供 治疗 脑血管病的新方法，其中通过导入HGF基因过度表达HGF。本发明使用HGF基因的方法通过基因导入能够有效治疗脑血管病，如脑梗塞，并且能够维持直到现在还没有适当治疗方法的患者梗塞区的神经功能以及抑制梗塞区。，下面是脑血管疾病基因治疗剂专利的具体信息内容。
1.治疗或预防脑梗塞的试剂，其中该试剂包含：
(i)HGF基因，所述HGF基因被包围在HVJ包膜载体中；和
(ii)药学上可接受的载体。
2.权利要求1的试剂，其中所述试剂包含1μg-50mg HGF基因。
3.权利要求1的试剂，其中所述试剂包含10μg-5mg HGF基因。
4.权利要求1的试剂，其中所述试剂包含50μg-5mg HGF基因。
5.权利要求1的试剂，其中所述试剂是用来降低梗塞面积的。
6.权利要求1的试剂，其中所述试剂是用来在脑梗塞后维持神经元功 能的。
7.权利要求1的试剂，其中所述试剂被给药至脑的枕大池。
8.权利要求1的试剂，其中所述HVJ是野生型HVJ。
9.权利要求1的试剂，其中所述HVJ是重组HVJ。
10.权利要求1-9任一项中的试剂，其中该试剂是片剂、丸剂、糖衣片、 胶囊、液体、凝胶、软膏、糖浆剂、膏剂、或悬浮液。
11.HGF基因在制备治疗或预防脑梗塞的试剂的用途，其中所述HGF 基因被包围在HVJ包膜载体中。
12.权利要求11的用途，其中所述试剂包含1μg-50mg HGF基因。
13.权利要求11的用途，其中所述试剂包含10μg-5mg HGF基因。
14.权利要求11的用途，其中所述试剂包含50μg-5mg HGF基因。
15.权利要求11的用途，其中所述试剂是用来降低梗塞面积的。
16.权利要求11的用途，其中所述试剂是用来在脑梗塞后维持神经元 功能的。
17.权利要求11的用途，其中所述试剂被给药至脑的枕大池。
18.权利要求11的用途，其中所述HVJ是野生型HVJ。
19.权利要求11的用途，其中所述HVJ是重组HVJ。
技术领域
本发明涉及用肝细胞生长因子(HGF)基因治疗或预防脑血管疾病。更具 体地，本发明涉及治疗或预防试剂，该试剂包含HGF基因作为活性成分， 还涉及包括向靶位点施用这种试剂的步骤的方法。
背景技术
肝细胞生长因子(HGF)是作为在体外导致肝实质细胞增殖的因子而被 发现的一种细胞因子(Biochem.Biophys.Res.Commun.122：1450(1984)； Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6489(1986)；FEBS Letters 22：231(1987)； Nature 342：440-443(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3200(1991))。 HGF是一种纤溶酶原相关的和间充质来源的多效(pleiotropic)生长因子，已 知在各种类型的细胞中控制细胞生长和细胞运动(Nature 342：440-443 (1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.239：639-644(1997)；J.Biochem. Tokyo 119：591-600(1996))。已知HGF也是一种在许多器官的再生中调控 胚胎发生以及形态发生过程的重要因子(Exp.Cell Res.196：114-120 (1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1937-1941(1993)；Gene Therapy 7： 417-427(2000))。HGF不仅在体内作为受损肝脏的修复和再生中的肝再生因 子，其也一直显示具有血管新生效应，并且能在局部缺血或动脉疾病的治 疗或预防中起重要的作用(Symp.Soc.Exp.Biol.47 cell behavior 227-234 (1993)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1937-1941(1993)；Circulation 97： 381-390(1998))。
由于HGF显示各种功能，包括血管新生功能，如上面所描述的，已经 进行了其在药物制剂中使用的各种研究(Jikken Igaku(Experimental Medicine) (supplementary volume)10(3)：330-339(1992))。例如，有使用HGF作为下 列试剂的报道：
抗癌剂(未审查的已公开的日本专利申请No.(JP-A平6-25010)；
肺损伤治疗剂(JP-A平6-172207)；
癌症治疗副作用减轻剂(JP-A平6-340546)；
上皮细胞生长增强剂(JP-A平7-179356)；
免疫抑制剂副作用减轻剂(JP-A平7-258111)；
暴发性肝炎治疗剂(JP-A平10-167982)；
心肌梗塞治疗剂(JP-A平11-246433)；
动脉疾病治疗剂(JP-A平8-295634)；
肥胖治疗剂(JP-A平10-279500)；
扩张性心肌病治疗剂(JP-A平11-1439)；
肌萎缩性侧索硬化治疗剂(JP-A 2002-87983)；
肺纤维化预防剂(JP-A平8-268906)；
软骨病治疗剂(JP-A平8-59502)；
胶原降解促进剂(JP-A平7-300426)；
胃十二指肠疾病治疗剂(JP-A平7-138183)；
颅神经病治疗剂(JP-A平7-89869)；
急性肾功能衰竭治疗剂(已公开的国际公开No.2001-516358的日文译 文)；
缺血性疾病/动脉疾病治疗剂(WO 00/07615)；
糖尿病治疗剂(WO 98/32458)；
毛发外用剂(JP-A平5-213721)；
皮肤化妆品(JP-A平5-213733)；
促毛发生长剂(JP-A平5-279230)；
巨核细胞增加剂(JP-A平7-101876)；
诱导分化剂(JP-A 2002-78482)；
肾小球疾病治疗剂(JP-A平9-87199)；
恶病质治疗剂(JP-A平10-316584)；
多脏器功能衰竭治疗剂(JP-A平10-310535)；
缺血性疾病治疗剂(WO 96/32960)；
细胞增殖和分化剂(已公开的国际公开No.平10-503923的日文译文)；
造血细胞生长和分化剂(已公开的国际公开No.平10-509951的日文译 文)；
神经疾病改善剂(JP-A平7-41429)；和
低血糖和糖原病治疗剂(JP-A平10-7586)。
蛋白质制品通常是通过静脉内给药。在缺血疾病模型中，HGF给药的 实例有静脉内给药和动脉内给药(Circulation 97：381-390(1998))。尽管在 这种动物模型中已经显示静脉内或动脉内给予HGF是有效的，但是一直没 有得出有关HGF对特定疾病的有效给药方法，剂量，等等的结论。特别地， 当将HGF蛋白用作药物制剂时，HGF在血液中的半衰期短便成了一个问题。 由于HGF在血液中的半衰期是短暂的10分钟，因此一直很难在血液中将 HGF的浓度维持在HGF充分发挥功能的水平。此外，关于如何将有效量的 HGF输送到受感染部位一直是另一个挑战。
由于分子生物学领域显著的技术进步，包含将基因导入到细胞中的基 因治疗现在是可能的。通常可在各种医学治疗中使用基因治疗(Science 256： 808-813(1992)；Anal.Biochem.162：156-159(1987))。选择基因导入的合 适载体对于成功地进行基因治疗特别重要。迄今为止，在基因导入中一直 建议使用病毒来源的载体，如腺病毒来源的载体。
然而，也一直提示病毒载体可能具有下列危险：
与病毒感染相关的毒性；
产生与宿主被抑制的免疫功能相关的病毒致病性；
病毒的诱变或致癌本性；等等。
作为使用病毒载体方法的一种替代方法，已经发展了使用脂质体连同 病毒外膜的体内基因导入方法，或HVJ(日本血凝病毒)-脂质体介导的基因 导入方法(Science 243：375-378(1989)；Anal.NY Acad.Sci.772：126-139 (1995))。使用这些方法已经成功地在体内将基因导入到各种组织，这些组 织包括肝脏、肾、血管壁、心脏，以及脑(Gene Therapy 7：417-427(2000)； Science 243：375-378(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.186： 129-134(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8474-8478(1993)；Am.J. Physiol.271(Regulatory Integrative Comp.Physiol.40)：R1212-R1220(1996))。
然而，由于使用HVJ-脂质体的方法需要不同的媒介物(vehicle)，如病 毒和脂质体，因此它们制备起来很复杂。此外，将HVJ病毒体与脂质体融 合致使所得颗粒的平均直径是病毒颗粒直径的1.3倍。已知这增加的直径将 细胞融合活性减少到野生型病毒的10％或更少，并且有一些组织不可能进 行基因导入或者该导入无效。因此，发展了使用病毒包膜载体的基因导入 方法作为一种允许更安全和更有效基因治疗的方法(日本专利申请No. 2001-026185/JP-A 2001-286282)。在这种方法中，用灭活的不能复制病毒 蛋白的病毒作为病毒包膜，基因被包裹在这种病毒包膜中。该载体可用于 将基因导入到培养细胞，生物组织中等等。已知使用这种病毒包膜载体能 够安全和高效地将基因导入到肝脏、骨骼肌、子宫、脑、眼、颈动脉、皮 肤、血管、肺、心脏、肾、脾、癌组织、神经、B淋巴细胞、呼吸器官组织、 悬浮细胞等等。
以脑梗塞和脑出血为代表的脑血管病是也具有社会意义的重要疾病。 尽管在最近数年里由于脑血管疾病导致的死亡率已经下降，但是这些疾病 仍然高居死亡原因的前列。受缺血性脑血管疾病后效应影响的患者，以及 正通过临床机构接受治疗的入院病人或门诊病人仍然在继续增长。
通常，脑梗塞是由于闭塞，或者由于脑动脉或颈动脉内的灌注压降低， 导致局部缺血损伤，而引起的脑组织不可逆坏死。脑梗塞可分成下列三大 组(Manabe，H.，和Omae，T.Ed.“Nou-Kekkan Shogai(Cerebrovascular disorder)”Life Science Publishing，p54-55(1992)；Imura，H.et al.Ed.， “Saishin Naikagaku Taikei Dai 66 Kan Nou-Kekkan Shogai(Integrated handbook of internal medicine，Vol.66，Cerebrovascular disorder)” Nakayama Shoten，p28(1996))：
(1)脑血栓，其中由于动脉闭塞而在脑组织发生缺血坏死，其中动脉 闭塞是由于血液粘稠度增加，灌输压降低所致，或者这种闭塞是由于脑动 脉内的硬化损伤引起的；
(2)脑栓塞，其中由于心内血栓或者，尽管非常少见，由于血栓从动 脉壁脱离，而在脑动脉内形成栓子；和
(3)血液动力学梗塞，由于头部的动脉或颅内脑动脉的狭窄或者闭塞 使得流向外周脑组织的血流量减少所致。
在脑梗塞中，在疾病发生的数个小时内发生脑水肿，并且这种情况持 续到发病后大约一周。此后，水肿逐渐减小，但是在发病后1到3个月内 固定成为梗塞区。脑水肿导致脑容积增加。由于脑被坚硬的颅骨包绕，因 此当由于脑水肿导致脑容积超过某种限度时，就会导致组织压力和颅内压 迅速增加。因而，脑损害更加严重，此后，梗塞区的范围固定(Inamura，K.， Terashi，A.“Nippon Rinsho，Dai 51 Kan，CT，MRI Jidai no No-Sotchu Gaku，Jo-Kan(Nippon Rinsho，Vol.51，Cerebral Apoplexy in the Age of CT and MRI，No.1)”Nippon Rinsho Sha，p231-239(1993))。当大脑的一部 分发生梗塞时，患病部分所具有的那些功能，如识别、知觉、感觉、以及 记忆功能都将丧失。
到目前为止，临床上神经细胞被一直公认为易受缺血损伤。当置于缺 血条件下仅数分钟，一些类型的神经细胞就会受到损伤，并且这些细胞随 后就会死亡。缺血时，在海马结构和锥体细胞中与去极化相关的显著神经 兴奋之后，就会发生传导阻断。随后，由于细胞外谷氨酸、细胞内钙离子、 自由基等水平的增加所导致的细胞毒性使得细胞丧失功能，细胞最终死亡。 如果由于缺血所导致的不可逆性改变在急性期能够得到适当地治疗，那么 据认为能够改善死亡率，并且也会减轻病后效应。目前对脑梗塞的治疗包 括给予抗血小板试剂、改善脑循环和代谢的试剂等等。在这些抗血小板试 剂中，存在对治疗急性期脑血栓有效的药物试剂。然而，由于这些试剂在 患有脑出血或产生与脑血栓相似症状的脑梗塞患者中促进出血性脑梗塞， 因此禁忌它们在这些患者中使用，当使用这些试剂时必需要仔细诊断该疾 病的类型。
在急性期期间，使用那些在脑梗塞发病后大约一个月的慢性期期间才 给予的改善脑循环的试剂被认为是有害的(Kameyama，M.Ed.“Nou-sotchu Chiryou Manyuaru(Treatment Manual of Cerebral Apoplexy)”Igaku-Shoin， p172-173(1991))。为了重建流向细胞仍然没有死亡的区域的血流，在超急 性期内可使用再灌注治疗如溶栓治疗、旁路手术(bypasss surgery)、血栓内 膜切除术、以及栓塞摘除术用作替代疗法。然而，当脑组织由于脑梗塞已 经不可逆性地被损害时，由于会加重组织损伤，如增加出血性梗塞和脑水 肿，因此随后的血流重建会有很多问题(Okada，Y.，“Shinkei Kenkyu no Shinpo(Progress in Neurologic Research)”Vol.40，No.4，p.655-665， Igaku-Shoin，(1996)；Takahasi，A.“medicina”Vol.32，No.11，p. 2261-2263，Igaku-Shoin，(1991))。
现在，在脑梗塞的急性期使用药剂是危险的，因为它们可能导致出血 性梗塞和缺血/再灌注损伤。此外，由于其它问题如所针对的致病情况有限， 以及给药后达到治疗效果所需时间的限制，因此这些试剂并不完全令人满 意。
发明公开
本发明的一个目的是提供可降低与脑血流中断后再灌注相关的脑缺血/ 再灌注损伤所导致的脑损伤程度的药剂。HGF基因不同于其它血管新生因 子，如VEGF，因为它不提高新生血管的通透性。特别是在脑血管病中，血 管通透性增大将增加由于脑水肿和脑内压增大导致脑组织损伤的风险。因 此，与使用其它血管新生因子的方法相比，使用不提高血管通透性的HGF 的治疗和预防方法是有益的。
本发明的一个目的是提供使用HGF基因抗脑血管病的治疗或预防试 剂，以及提供使用这些药物试剂治疗和预防脑血管病的方法。更具体地， 本发明总结如下：
(1)治疗或预防脑血管病的试剂，其中该试剂包含HGF基因。
(2)(1)的试剂，其中脑血管病是脑梗塞。
(3)(1)或(2)的试剂，其中该试剂是片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、 凝胶、软膏、糖浆剂(syrup)、膏剂(slurry)、或悬浮液的形式。
(4)(1)到(3)中任意一种试剂，其中该试剂通过下列方法将基因导入到 细胞中：使用病毒包膜载体、内在型脂质体、静电型脂质体(electrostatic liposome)、HVJ脂质体、或改进的HVJ-脂质体的方法，受体介导的基因 导入方法，通过使用基因枪将核酸分子连同载体导入到细胞中的方法，使 用裸DNA的直接导入法，或者使用阳离子聚合物的导入法。
(5)(1)到(3)中任意一种试剂，其中该试剂通过使用HVJ-包膜将基因 导入到细胞中。
(6)治疗或预防脑血管病的方法，其中该方法包括将HGF基因导入 到哺乳动物中的步骤。
(7)(6)的方法，其中该脑血管病是脑梗塞。
(8)(6)或(7)的方法，其中该方法包括通过使用HVJ-包膜经两到三次 将HGF基因导入到哺乳动物中的步骤。
(9)HGF基因用于生产治疗或预防脑血管病的试剂的用途。
(10)(9)的HGF基因的用途，其中脑血管病是脑梗塞。
本发明中使用的术语“HGF基因”指能够表达HGF(HGF蛋白)的核酸 分子。在这里，术语“核酸分子”指如DNAs、RNAs、cDNAs和mRNAs 等分子。具体地，例如在Nature 342：440(1989)，日本专利No.2777678， 和Biochem.Biophys.Res.Commun.163：967(1989)中描述了编码HGF的 cDNAs。编码HGF的cDNAs的核苷酸序列描述在上述文献中，也登记在如 GenBank等数据库中。基于这个序列信息，可通过使用适当的序列片段作 为PCR引物，并且使用例如，来自肝脏或白细胞的mRNAs，通过进行RT -PCR，来克隆HGF的cDNAs。本领域技术人员能够通过下列基础教科书， 如分子克隆第二版(冷泉港实验室出版社)(1989)很容易地完成这样的克隆。 此外，通过筛选基因组DNA文库，可分离基因组DNAs。
本发明的HGF基因不限于这些cDNAs和基因组DNAs。只要所述基因 编码的蛋白与HGF具有实际上相同的功能，那么该基因可被用作本发明的 HGF基因。更具体地是，可在本发明中使用的HGF基因包括1)在严紧条件 下与上述cDNA杂交的核酸，或2)编码包含由上述cDNA所编码蛋白的氨 基酸序列的蛋白的核酸，其中缺失、取代、添加、和/或插入一个或更多(优 选数个)氨基酸，只要这种核酸编码的蛋白具有HGF的功能。上述1)和2) 的核酸可以很容易地通过下列方法获得，如定点突变、PCR方法(见，Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons， Sections 6.1-6.4)，或者常规的杂交方法(见，Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons，Sections 6.3-6.4)。
更具体地，通过使用HGF基因的已知序列，或其部分作为探针；或者 通过使用与该DNA序列特异性杂交的寡核苷酸作为引物，本领域技术人员 能够分离与该DNA序列杂交的核酸。获得编码与已知HGF功能相同的蛋 白的核酸的严紧杂交条件通常是“37℃，1X SSC”等，更严紧地“42℃， 0.5XSSC和0.1％SDS”等，甚至更严紧地“65℃，0.1XSSC和0.1％SDS” 等。当使用更严紧的杂交条件时，可分离包含与探针序列更同源的序列的 核酸。然而，这里列举的SSC、SDS和温度条件仅仅是举例。通过考虑上 述条件和决定杂交严紧性的其它条件，如探针浓度、探针长度以及反应时 间，本领域技术人员能很容易地确定构成与上述相同严紧程度的条件。
由通过上述杂交方法或PCR方法分离获得的核酸所编码的蛋白的氨基 酸序列通常显示与常规已知的HGF蛋白高度同源。术语“高度同源”指至 少50％或更高的序列同源性，更优选地70％或更高，甚至更优选地90％或 更高(例如，95％或更高)。可使用Karlin and Altschul’s BLAST算法确定氨 基酸序列和核苷酸序列的序列一致性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 5873-5877(1993))。基于这种算法已经发展了如BLASTN和BLASTX这样 的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。当使用BLASTN分 析核苷酸序列时，基于BLAST，将参数设置为，例如，分值为100和字长 为12。当使用BLASTX分析氨基酸序列时，基于BLAST，将参数设置为， 例如，分值为50和字长为3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使 用各自程序的默认参数。这些分析方法的具体技术是公知的 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如上面描述的，本发明中使用的HGF基因可以是天然存在的或人工合 成的核酸，只要这些基因编码的蛋白包含HGF活性。HGF具有体外促进肝 实质细胞增殖的活性。因此，可以通过例如，研究这些蛋白在体外对肝实 质细胞增殖的影响，来确定由上述杂交方法等所得核酸所编码的蛋白，或 者由经过修饰的天然HGF基因的核酸所编码的蛋白是否具有HGF活性。
下面描述本发明基因治疗中所使用的基因导入方法、导入方式、导入 量等。
可将给予含有HGF基因作为活性成分的基因治疗剂的方法分成两类： 使用非病毒载体的方法；以及使用病毒载体的方法。在实验指南中详细描 述了这些载体的制备方法、给药方法等等(Jikken Igaku(Experimental Medicine)Supplementary Volume，“Idenshichiryo no Kisogijyutsu (Fundamental Techniques for Gene Therapy)”，Yodosha，1996；Jikken Igaku (Experimental Medicine)Supplementary Volume，“Idenshidonyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis)”，Yodosha，1997；“Idenshi-chiryo Kaihatsu Kenkyu Handbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”，Nihon Idenshichiryo Gakkai(The Japan Society of Gene Therapy)Edition，NTS， 1999)。下面具体描述这些载体和方法。
可使用这样的重组载体，其已将靶基因插到非病毒的常规基因表达载 体中，通过下面显示的方法将靶基因导入到细胞和组织中。
将基因导入到细胞中的方法的实例是：脂质转染法、钙-磷酸盐共沉 淀法、DEAE-右旋糖酐法、使用玻璃毛细管的DNA直接注入法，等等。 将基因导入到组织的方法包括使用病毒包膜载体、内在型脂质体、静电型 脂质体、HVJ脂质体、改进的HVJ-脂质体(HVJ-AVE脂质体)的方法，受 体介导的基因导入方法，使用基因枪将载体(如金属颗粒)连同DNAs一同导 入的方法，直接导入裸DNAs的方法，使用阳离子聚合物的导入法，等等。
通过将DNA掺入由脂质双分子层形成的脂质体中，可构建上述HVJ -脂质体，然后将这种脂质体与灭活的仙台病毒(日本血凝病毒；HVJ)融合。 与常规的脂质体方法相比，使用HVJ-脂质体具有极高水平的细胞膜融合， 是特别优选的导入方式之一。制备HVJ-脂质体的方法在下列文献中有详 细的描述，例如Experimental Medicine Supplementary Volume， “Idenshichiryo no Kisogijyutsu(Fundamental Techniques of Gene Therapy)”， Yodosha，1996；Experimental Medicine Supplementary Volume， “Idenshidonyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis)”，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.93： 1458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271：R1212-1220(1996)。使用HVJ-脂 质体的方法描述在下列文献中，例如，Molecular Medicine 30：1440-1448 (1993)；Jikken Igaku(Experimental Medicine)，12：1822-1826(1994)；和 Tanpakushitsu Kakusan Kouso(Protein，Nucleic Acid，and Enzyme)，42， 1806-1813(1997)；以及优选地描述于Circulation 92(Suppl.II)：479-482 (1995)。
此外，使用病毒包膜的方法是给予本发明HGF基因的特别优选的方法。 可通过在有表面活性剂的情况下将纯化的病毒与感兴趣的表达载体混合， 或者通过将病毒和表达载体的混合物冻融来制备病毒包膜(日本专利申请 No.2001-026185/JP-A 2001-286282)。
可在使用病毒包膜的方法中使用的病毒是那些属于如逆转录病毒、披 膜病毒、冠状病毒、黄病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、弹状病 毒、痘病毒、疱疹病毒、杆状病毒，以及嗜肝DNA病毒科的病毒，特别优 选的是HVJs。在这里，这些病毒可以是野生型病毒或重组病毒。特别地， Hasan，M.K.等报道的重组HVJ(J.General Virol.78：2813-2820(1997))， Yonemitsu，Y等(Nature Biotech.18：970-973(2000))，或这类病毒可用作 HVJ。
尽管在使用HVJ-脂质体或HVJ包膜的方法中通常优选使用HVJ的Z 株(可从ATCC中获得)，但是本质上，也可以使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。在制备病毒包膜的方法中，可通过UV照射 等方法将纯化的病毒灭活，然后将其与所需表达载体混合。可用于混合病 毒和表达载体的表面活性剂是，例如，辛基葡糖苷、Triton X-100、CHAPS， 以及NP-40。可通过注射或这类方法，将以这种方式制备的病毒包膜载体 导入到治疗或疾病预防所针对的靶组织中。此外，通过在-20℃冷冻，可 将病毒包膜载体贮藏至少两到三个月。
可在这里使用的表达载体可以是任何表达载体，只要它们能够在体内 表达目的基因。这些表达载体的实例是pCAGGS(Gene 108：193-200 (1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1、以及pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
使用病毒载体进行基因导入的典型的方法是那些使用病毒载体，如重 组腺病毒和逆转录病毒的方法。更具体地，可通过下列步骤将受试基因导 入到细胞中：将基因导入到DNA或RNA病毒中，这些病毒如脱毒的逆转 录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘苗病毒、痘病毒、 脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒(sindbis viruses)、仙台病毒、SV40、或人类免 疫缺陷病毒(HIV)(见Pharmacol.Ther.80：35-47(1998)；Front.Biosci.4： E26-33(1999)；J.Recep.Signal.Transduct.Res.19：673-686)；然后用得到 的重组病毒感染细胞。
腺病毒载体的感染效率远高于其它上述病毒载体。因此，从这个观点 看，优选使用腺病毒载体系统。
在基因治疗期间导入本发明试剂的方法包括：在体内将基因治疗剂直 接导入到机体；以及体外(ex vivo)将基因治疗剂导入到从机体获得的细胞 中，随后将经过修饰的细胞再次导入到机体中(Nikkei Science，April 1994， 20-45；Gekkann Yakuji 36(1)，23-48，1994；Jikken Igaku(Experimental Medicine)Supplementary Volume，12(15)，1994；“Idenshi-chiryo Kaihatsu Kenkyu Handbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”， Nihon Idenshichiryo Gakkai eds.(The Japan Society of Gene Therapy)Edition， NTS，1999)。在本发明中特别优选体内方法。
可采用适合上述每一种给药方法的各种配制剂，(例如，液体制剂)，作 为制剂的形式。例如，可通过常规方法制备包含基因作为有效活性成分的 注射剂，该方法可包括将基因溶于适当的溶剂(例如，缓冲液，如PBS、生 理盐水、以及无菌水)中，当需要时通过过滤除菌，然后装入无菌容器中。 可根据需要将常规载体或这类物质添加到注射剂中。或者，可将脂质体制 剂，如包含HVJ-脂质体的制剂，制成悬浮液，冷冻剂，或者离心浓缩的 冷冻剂。
在本发明的治疗或预防剂中，HGF基因可用作单一活性成分，也可与 其它已知具有血管生成功能的因子一起使用。例如，已经报道了因子如 VEGF和EGF具有血管生成功能，因而可同时应用编码这些因子的基因。 此外，由于已经报道生长因子如EGF能够修复各种组织中的细胞损害，因 此当需要时可以同时使用编码各种生长因子的基因。从本发明的描述中， 本领域技术人员很清楚，在本发明的治疗或预防试剂中可根据需要将下列 试剂与HGF基因结合使用：对于治疗或预防的脑血管病具有治疗或预防效 果的其它药物试剂；以及稳定或提高HGF活性的物质(如，肝素样物质(JP -A平10-158190)和寡聚糖(JP-A平5-301824))。如果这些添加的药剂和 物质是由基因编码的，那么可以在本发明的治疗或预防试剂中将编码它们 的基因与HGF基因一起施用。
对于本发明治疗和预防试剂，可根据治疗疾病的种类、症状等选择适 当的给药方法和给药部位。特别优选肠胃外给药。枕大池和腰椎是特别优 选的给药部位。可刺穿枕大池或腰椎进入脑脊膜，然后收集适当量的脊髓 液以确定穿刺部位，并且防止提高颅内压。然后给予治疗或预防剂。例如， 可应用Hayashi，K.等报道的使用套管给予HVJ-脂质体复合物的方法 (Gene Therapy 8：1167-73(2001))，将本发明的治疗或预防剂施用到枕大池 内。
本发明的治疗或预防剂的效果被认为是，由于给予HGF基因，在脑梗 塞灶周围所谓“半影(penumbra)”区内抑制凋亡，从而维持神经细胞。因此， 本发明中“治疗”意味着在脑部发生血流障碍后减少其影响的疗法。
更具体地，本发明的药剂或方法的治疗效果是指，与没有给药相比， 发生脑血管病后，施用本发明药剂或应用本发明方法可减少由于脑血管病 所致的脑组织损伤。因此，本发明中“治疗”不仅包括从损害中完全恢复， 也包括减少损害的程度。
在另一方面，本发明中“预防”是指在发生脑血流障碍前，通过预防 性地给予HGF基因，减少血流障碍的影响。更具体地，施用HGF基因据说 具有预防效应，与没有给药相比，当在脑血管病如脑梗塞发作前给予HGF 基因，能够减少由给药后发生的脑血管病所致的脑组织损害。因此，本发 明中“预防”不仅包括从损害中完全恢复，也包括减少损害的程度。
本发明使用的术语“治疗剂”和“预防剂”意思是包含上述功能的药 物组合物。本发明的治疗和预防方法是包括给予包含上述效果的药物组合 物的方法。
在另一方面，本发明的脑血管病是指脑血流被抑制的疾病。导致脑血 流抑制的疾病是，例如，脑梗塞和脑出血。血流被抑制并不限于疾病所致。 例如，手术治疗中人工封闭血管以及由于创伤导致血管损伤所造成的血流 量减少的情况，包括在本发明的脑血管疾病中。本发明的脑血管病包括， 例如，导致脑实质中缺血或梗塞性病变的脑血管病，如脑梗塞(脑血栓、脑 栓塞，等等)、脑出血、蛛网膜下出血、高血压脑病、脑血管性痴呆、以及 阿尔茨海默型(Alzheimer-type)痴呆。
本发明的治疗或预防剂包含足以完成药剂预期目的量的HGF基因。换 句话说，本发明的试剂包括“治疗有效量”或“药理学有效量”的HGF基 因。术语“治疗有效量”和“药理学有效量”是药剂产生预期药理学结果 的有效量，以及足以缓解受治患者症状的量。可用于确定具体应用的有效 量的试验是，例如，测定从靶疾病中恢复程度的方法。实际施用的量视受 治患者的年龄、体重和症状，以及给药方法等情况而变，优选达到期望效 果而没有显著副作用的最佳量。
可通过细胞培养试验，或者任选地，通过使用适当的动物模型确定治 疗有效量、药理学有效量、以及毒性。这类动物可用于确定药剂的所需浓 度范围和给药途径。基于这些动物模型，本领域技术人员可决定施用给人 的有效量。治疗效应与毒性效应的比率称为“治疗指数”，这种比率可表述 为ED50/LD50。优选具有高治疗指数的药物组合物。根据剂型、患者的敏 感度、年龄、和其它情况，以及疾病的类型和严重度选择适当的剂量。尽 管本发明治疗剂的剂量根据患者的情况而不同，但是HGF基因的成人剂量 是在大约1μg到大约50mg的范围内，优选在大约10μg到大约5mg的范 围内，更优选在大约50μg到大约5mg的范围内。特别地，由于可通过HVJ 包膜法反复地施用HGF基因，因此不仅可以一次给予HGF基因，而且可以 多次给药，如两次或三次，以便获得更好的治疗或预防效果。这种使用HVJ 包膜的多次给药方式也包括在本发明的治疗或预防方法中。
附图说明
图1是一组属于生理盐水组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状 切片照片。
图2是一组属于pVAXI组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状切 片照片。
图3是一组属于HGF组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状切 片照片。
图4是生理盐水组、pVAXI组以及HGF组中梗塞区域的比较图。在右 上方显示大鼠脑部的图解示图。通过沿着所示线1到5把大脑切成薄片制 备冠状切片。图解示图中的数字1到5对应于水平轴的那些数字。垂直轴 表示梗塞区占总冠状切片区的百分率(％)。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将参考实施例具体举例说明本发明，但是这不能被解释是 为对本发明的限定。
(1)制备HGF基因表达载体
在pVAX1载体(Invitrogen)的BamHI和NotI位点之间插入人HGF cDNA(2.2kb)。
(2)制备HVJ-包膜
纯化的仙台病毒(HVJ)(Z株)在即将使用前用UV辐射(99mJ/cm2)灭活。 接着，在4℃用0.3％Triton X-100溶液将灭活的HVJ(15,000血细胞凝集单 位(HAU))和在(1)中制备的载体，或不含有HGF cDNA的表达载体混合。这 种混合物在4℃离心15分钟。移去上清液后，将缓冲盐溶液加到残余物中， 然后在4℃再离心15分钟。移去上清液后，将沉淀悬浮于100μl磷酸缓冲 盐中，并用于研究对脑梗塞的效应。
(3)向大鼠右中脑动脉闭塞模型施用HVJ包膜-DNA复合物
将体重250到270克的Wistar大鼠用氟烷(halothane)(初次给予4％；以 1％维持)麻醉。接着使用26 G针从脑池向动物给药：1)向生理盐水组给予 生理盐水(100μl)；2)向pVAXI组给予仅包含载体的pVAXI(400μg)/HVJ- E(15,000 HAU)(100μL)；以及3)向HGF给药组给予pVAXI-HGF(400 μg)/HVJ-E(15,000 HAU)(100μL)。每组中使用6只动物。给药后3天，在 氟烷麻醉下将长21mm，涂有聚L-赖氨酸的4-0尼龙缝合线从右颈外动 脉插入右颈内动脉中，制造右中脑动脉闭塞模型。在这个处理期间，使用 加热垫将动物的体温维持在37℃左右，在尾动脉测量血压。在这种处理后 1小时和24小时进行神经评价。根据下面显示的标准进行神经评价，并且 比较每组的总得分(在表1中表示为神经损伤严重程度评分(Neurological Severty Score)(NSS))。使用StadView 5.0J的Mann-Whitney U检验对结果 进行统计分析。
1)出现左前腿的屈曲
0 没有屈曲
0.5 轻度屈曲
0 完全屈曲
2)抗侧向压迫的抵抗力
0 对左向和右向有同样程度的抵抗力
0.5 轻度减弱的抵抗力
1 完全无抵抗力
3)躯体姿式
0 正常
0.5 轻度向左弯曲
1 完全向左弯曲
4)左前腿的位置
0 迅速返回到原始位置
0.5 返回到原始位置
1 不能返回到原始位置
5)右前腿的位置
0 迅速返回到原始位置
0.5 返回到原始位置
1 不能返回到原始位置
表1
HGF/HVJ pVAXI/HVJ 生理盐水 p值 体重 血压(处理前) 血压(处理后) 体温(处理前) 体温(处理后) NSS(1小时) NSS(24小时) 250.4±2.0 88.6±1.9 82.4±1.7 37.4±0.1 37.6±0.1 1.0±0.2 1.0±0.1 253±2.3 88.8±3.7 81.2±3.8 37.3±0.1 37.1±0.2 1.3±0.4 1.4±0.2 251.8±2.4 88.5±2.1 82.8±1.4 37.2±0.2 37.4±0.2 1.4±0.2 1.3±0.3 p＜0.05* p＜0.05*
*使用Mann-Whitney U检验与生理盐水组比较
如表1所示，手术期间在生理盐水组、pVAXI组以及HGF组之间没有 观察到血压和体温的差异。HGF组的神经评价分显著低于其它两个组，提 示给予HGF基因能够维持神经功能。
24小时后处死动物，从前额端开始每隔2mm(在图4右上角的图解图 示中线1到5所示的位置)制备一张冠状切片。用TTC进行染色，并且比较 梗塞区的面积(图1到图3)。为了比较这些面积，使用Adobe Photoshop 5.0 测量梗塞区所占像素(pixel)的数量。考虑水肿的影响，并且根据下列公式进 行评价：(健康脑的外侧面积-(梗塞脑的外侧面积-梗塞区面积))/健康脑的 外侧面积×100(％)。图4显示结果。梗塞区与冠状切片总面积之比用百分 率表示。从图1到4显而易见，证实HGF基因转染组中梗塞面积减小。
工业应用性
上述结果证实，给予HGF基因显示有益效果，维持神经元的功能，并 且减少脑血管病如脑梗塞的早期梗塞区的大小。更具体地，显示HGF可能 在调节脑血管病中起作用。本发明提供治疗包括脑梗塞在内的脑血管病的 新方法，其中该方法包括导入HGF基因以过度表达HGF。利用HGF基因 的本发明的方法通过基因导入，能够有效地治疗包括脑梗塞在内的脑血管 病。本发明的方法也能够维持直到现在还没有适当治疗方法的患者的梗塞 区的神经元功能以及抑制梗塞面积。
由于HGF显示各种功能，包括血管新生功能，如上面所描述的，已经 进行了其在药物制剂中使用的各种研究(Jikken Igaku(Experimental Medicine) (supplementary volume)10(3)：330-339(1992))。例如，有使用HGF作为下 列试剂的报道：
抗癌剂(未审查的已公开的日本专利申请No.(JP-A平6-25010)；
肺损伤治疗剂(JP-A平6-172207)；
癌症治疗副作用减轻剂(JP-A平6-340546)；
上皮细胞生长增强剂(JP-A平7-179356)；
免疫抑制剂副作用减轻剂(JP-A平7-258111)；
暴发性肝炎治疗剂(JP-A平10-167982)；
心肌梗塞治疗剂(JP-A平11-246433)；
动脉疾病治疗剂(JP-A平8-295634)；
肥胖治疗剂(JP-A平10-279500)；
扩张性心肌病治疗剂(JP-A平11-1439)；
肌萎缩性侧索硬化治疗剂(JP-A 2002-87983)；
肺纤维化预防剂(JP-A平8-268906)；
软骨病治疗剂(JP-A平8-59502)；
胶原降解促进剂(JP-A平7-300426)；
胃十二指肠疾病治疗剂(JP-A平7-138183)；
颅神经病治疗剂(JP-A平7-89869)；
急性肾功能衰竭治疗剂(已公开的国际公开No.2001-516358的日文译 文)；
缺血性疾病/动脉疾病治疗剂(WO 00/07615)；
糖尿病治疗剂(WO 98/32458)；
毛发外用剂(JP-A平5-213721)；
皮肤化妆品(JP-A平5-213733)；
促毛发生长剂(JP-A平5-279230)；
巨核细胞增加剂(JP-A平7-101876)；
诱导分化剂(JP-A 2002-78482)；
肾小球疾病治疗剂(JP-A平9-87199)；
恶病质治疗剂(JP-A平10-316584)；
多脏器功能衰竭治疗剂(JP-A平10-310535)；
缺血性疾病治疗剂(WO 96/32960)；
细胞增殖和分化剂(已公开的国际公开No.平10-503923的日文译文)；
造血细胞生长和分化剂(已公开的国际公开No.平10-509951的日文译 文)；
神经疾病改善剂(JP-A平7-41429)；和
低血糖和糖原病治疗剂(JP-A平10-7586)。
蛋白质制品通常是通过静脉内给药。在缺血疾病模型中，HGF给药的 实例有静脉内给药和动脉内给药(Circulation 97：381-390(1998))。尽管在 这种动物模型中已经显示静脉内或动脉内给予HGF是有效的，但是一直没 有得出有关HGF对特定疾病的有效给药方法，剂量，等等的结论。特别地， 当将HGF蛋白用作药物制剂时，HGF在血液中的半衰期短便成了一个问题。 由于HGF在血液中的半衰期是短暂的10分钟，因此一直很难在血液中将 HGF的浓度维持在HGF充分发挥功能的水平。此外，关于如何将有效量的 HGF输送到受感染部位一直是另一个挑战。
由于分子生物学领域显著的技术进步，包含将基因导入到细胞中的基 因治疗现在是可能的。通常可在各种医学治疗中使用基因治疗(Science 256： 808-813(1992)；Anal.Biochem.162：156-159(1987))。选择基因导入的合 适载体对于成功地进行基因治疗特别重要。迄今为止，在基因导入中一直 建议使用病毒来源的载体，如腺病毒来源的载体。
然而，也一直提示病毒载体可能具有下列危险：
与病毒感染相关的毒性；
产生与宿主被抑制的免疫功能相关的病毒致病性；
病毒的诱变或致癌本性；等等。
作为使用病毒载体方法的一种替代方法，已经发展了使用脂质体连同 病毒外膜的体内基因导入方法，或HVJ(日本血凝病毒)-脂质体介导的基因 导入方法(Science 243：375-378(1989)；Anal.NY Acad.Sci.772：126-139 (1995))。使用这些方法已经成功地在体内将基因导入到各种组织，这些组 织包括肝脏、肾、血管壁、心脏，以及脑(Gene Therapy 7：417-427(2000)； Science 243：375-378(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.186： 129-134(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8474-8478(1993)；Am.J. Physiol.271(Regulatory Integrative Comp.Physiol.40)：R1212-R1220(1996))。
然而，由于使用HVJ-脂质体的方法需要不同的媒介物(vehicle)，如病 毒和脂质体，因此它们制备起来很复杂。此外，将HVJ病毒体与脂质体融 合致使所得颗粒的平均直径是病毒颗粒直径的1.3倍。已知这增加的直径将 细胞融合活性减少到野生型病毒的10％或更少，并且有一些组织不可能进 行基因导入或者该导入无效。因此，发展了使用病毒包膜载体的基因导入 方法作为一种允许更安全和更有效基因治疗的方法(日本专利申请No. 2001-026185/JP-A 2001-286282)。在这种方法中，用灭活的不能复制病毒 蛋白的病毒作为病毒包膜，基因被包裹在这种病毒包膜中。该载体可用于 将基因导入到培养细胞，生物组织中等等。已知使用这种病毒包膜载体能 够安全和高效地将基因导入到肝脏、骨骼肌、子宫、脑、眼、颈动脉、皮 肤、血管、肺、心脏、肾、脾、癌组织、神经、B淋巴细胞、呼吸器官组织、 悬浮细胞等等。
以脑梗塞和脑出血为代表的脑血管病是也具有社会意义的重要疾病。 尽管在最近数年里由于脑血管疾病导致的死亡率已经下降，但是这些疾病 仍然高居死亡原因的前列。受缺血性脑血管疾病后效应影响的患者，以及 正通过临床机构接受治疗的入院病人或门诊病人仍然在继续增长。
通常，脑梗塞是由于闭塞，或者由于脑动脉或颈动脉内的灌注压降低， 导致局部缺血损伤，而引起的脑组织不可逆坏死。脑梗塞可分成下列三大 组(Manabe，H.，和Omae，T.Ed.“Nou-Kekkan Shogai(Cerebrovascular disorder)”Life Science Publishing，p54-55(1992)；Imura，H.et al.Ed.， “Saishin Naikagaku Taikei Dai 66 Kan Nou-Kekkan Shogai(Integrated handbook of internal medicine，Vol.66，Cerebrovascular disorder)” Nakayama Shoten，p28(1996))：
(1)脑血栓，其中由于动脉闭塞而在脑组织发生缺血坏死，其中动脉 闭塞是由于血液粘稠度增加，灌输压降低所致，或者这种闭塞是由于脑动 脉内的硬化损伤引起的；
(2)脑栓塞，其中由于心内血栓或者，尽管非常少见，由于血栓从动 脉壁脱离，而在脑动脉内形成栓子；和
(3)血液动力学梗塞，由于头部的动脉或颅内脑动脉的狭窄或者闭塞 使得流向外周脑组织的血流量减少所致。
在脑梗塞中，在疾病发生的数个小时内发生脑水肿，并且这种情况持 续到发病后大约一周。此后，水肿逐渐减小，但是在发病后1到3个月内 固定成为梗塞区。脑水肿导致脑容积增加。由于脑被坚硬的颅骨包绕，因 此当由于脑水肿导致脑容积超过某种限度时，就会导致组织压力和颅内压 迅速增加。因而，脑损害更加严重，此后，梗塞区的范围固定(Inamura，K.， Terashi，A.“Nippon Rinsho，Dai 51 Kan，CT，MRI Jidai no No-Sotchu Gaku，Jo-Kan(Nippon Rinsho，Vol.51，Cerebral Apoplexy in the Age of CT and MRI，No.1)”Nippon Rinsho Sha，p231-239(1993))。当大脑的一部 分发生梗塞时，患病部分所具有的那些功能，如识别、知觉、感觉、以及 记忆功能都将丧失。
到目前为止，临床上神经细胞被一直公认为易受缺血损伤。当置于缺 血条件下仅数分钟，一些类型的神经细胞就会受到损伤，并且这些细胞随 后就会死亡。缺血时，在海马结构和锥体细胞中与去极化相关的显著神经 兴奋之后，就会发生传导阻断。随后，由于细胞外谷氨酸、细胞内钙离子、 自由基等水平的增加所导致的细胞毒性使得细胞丧失功能，细胞最终死亡。 如果由于缺血所导致的不可逆性改变在急性期能够得到适当地治疗，那么 据认为能够改善死亡率，并且也会减轻病后效应。目前对脑梗塞的治疗包 括给予抗血小板试剂、改善脑循环和代谢的试剂等等。在这些抗血小板试 剂中，存在对治疗急性期脑血栓有效的药物试剂。然而，由于这些试剂在 患有脑出血或产生与脑血栓相似症状的脑梗塞患者中促进出血性脑梗塞， 因此禁忌它们在这些患者中使用，当使用这些试剂时必需要仔细诊断该疾 病的类型。
在急性期期间，使用那些在脑梗塞发病后大约一个月的慢性期期间才 给予的改善脑循环的试剂被认为是有害的(Kameyama，M.Ed.“Nou-sotchu Chiryou Manyuaru(Treatment Manual of Cerebral Apoplexy)”Igaku-Shoin， p172-173(1991))。为了重建流向细胞仍然没有死亡的区域的血流，在超急 性期内可使用再灌注治疗如溶栓治疗、旁路手术(bypasss surgery)、血栓内 膜切除术、以及栓塞摘除术用作替代疗法。然而，当脑组织由于脑梗塞已 经不可逆性地被损害时，由于会加重组织损伤，如增加出血性梗塞和脑水 肿，因此随后的血流重建会有很多问题(Okada，Y.，“Shinkei Kenkyu no Shinpo(Progress in Neurologic Research)”Vol.40，No.4，p.655-665， Igaku-Shoin，(1996)；Takahasi，A.“medicina”Vol.32，No.11，p. 2261-2263，Igaku-Shoin，(1991))。
现在，在脑梗塞的急性期使用药剂是危险的，因为它们可能导致出血 性梗塞和缺血/再灌注损伤。此外，由于其它问题如所针对的致病情况有限， 以及给药后达到治疗效果所需时间的限制，因此这些试剂并不完全令人满 意。
发明公开
本发明的一个目的是提供可降低与脑血流中断后再灌注相关的脑缺血/ 再灌注损伤所导致的脑损伤程度的药剂。HGF基因不同于其它血管新生因 子，如VEGF，因为它不提高新生血管的通透性。特别是在脑血管病中，血 管通透性增大将增加由于脑水肿和脑内压增大导致脑组织损伤的风险。因 此，与使用其它血管新生因子的方法相比，使用不提高血管通透性的HGF 的治疗和预防方法是有益的。
本发明的一个目的是提供使用HGF基因抗脑血管病的治疗或预防试 剂，以及提供使用这些药物试剂治疗和预防脑血管病的方法。更具体地， 本发明总结如下：
(1)治疗或预防脑血管病的试剂，其中该试剂包含HGF基因。
(2)(1)的试剂，其中脑血管病是脑梗塞。
(3)(1)或(2)的试剂，其中该试剂是片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、 凝胶、软膏、糖浆剂(syrup)、膏剂(slurry)、或悬浮液的形式。
(4)(1)到(3)中任意一种试剂，其中该试剂通过下列方法将基因导入到 细胞中：使用病毒包膜载体、内在型脂质体、静电型脂质体(electrostatic liposome)、HVJ脂质体、或改进的HVJ-脂质体的方法，受体介导的基因 导入方法，通过使用基因枪将核酸分子连同载体导入到细胞中的方法，使 用裸DNA的直接导入法，或者使用阳离子聚合物的导入法。
(5)(1)到(3)中任意一种试剂，其中该试剂通过使用HVJ-包膜将基因 导入到细胞中。
(6)治疗或预防脑血管病的方法，其中该方法包括将HGF基因导入 到哺乳动物中的步骤。
(7)(6)的方法，其中该脑血管病是脑梗塞。
(8)(6)或(7)的方法，其中该方法包括通过使用HVJ-包膜经两到三次 将HGF基因导入到哺乳动物中的步骤。
(9)HGF基因用于生产治疗或预防脑血管病的试剂的用途。
(10)(9)的HGF基因的用途，其中脑血管病是脑梗塞。
本发明中使用的术语“HGF基因”指能够表达HGF(HGF蛋白)的核酸 分子。在这里，术语“核酸分子”指如DNAs、RNAs、cDNAs和mRNAs 等分子。具体地，例如在Nature 342：440(1989)，日本专利No.2777678， 和Biochem.Biophys.Res.Commun.163：967(1989)中描述了编码HGF的 cDNAs。编码HGF的cDNAs的核苷酸序列描述在上述文献中，也登记在如 GenBank等数据库中。基于这个序列信息，可通过使用适当的序列片段作 为PCR引物，并且使用例如，来自肝脏或白细胞的mRNAs，通过进行RT -PCR，来克隆HGF的cDNAs。本领域技术人员能够通过下列基础教科书， 如分子克隆第二版(冷泉港实验室出版社)(1989)很容易地完成这样的克隆。 此外，通过筛选基因组DNA文库，可分离基因组DNAs。
本发明的HGF基因不限于这些cDNAs和基因组DNAs。只要所述基因 编码的蛋白与HGF具有实际上相同的功能，那么该基因可被用作本发明的 HGF基因。更具体地是，可在本发明中使用的HGF基因包括1)在严紧条件 下与上述cDNA杂交的核酸，或2)编码包含由上述cDNA所编码蛋白的氨 基酸序列的蛋白的核酸，其中缺失、取代、添加、和/或插入一个或更多(优 选数个)氨基酸，只要这种核酸编码的蛋白具有HGF的功能。上述1)和2) 的核酸可以很容易地通过下列方法获得，如定点突变、PCR方法(见，Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons， Sections 6.1-6.4)，或者常规的杂交方法(见，Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)John Wiley & Sons，Sections 6.3-6.4)。
更具体地，通过使用HGF基因的已知序列，或其部分作为探针；或者 通过使用与该DNA序列特异性杂交的寡核苷酸作为引物，本领域技术人员 能够分离与该DNA序列杂交的核酸。获得编码与已知HGF功能相同的蛋 白的核酸的严紧杂交条件通常是“37℃，1X SSC”等，更严紧地“42℃， 0.5XSSC和0.1％SDS”等，甚至更严紧地“65℃，0.1XSSC和0.1％SDS” 等。当使用更严紧的杂交条件时，可分离包含与探针序列更同源的序列的 核酸。然而，这里列举的SSC、SDS和温度条件仅仅是举例。通过考虑上 述条件和决定杂交严紧性的其它条件，如探针浓度、探针长度以及反应时 间，本领域技术人员能很容易地确定构成与上述相同严紧程度的条件。
由通过上述杂交方法或PCR方法分离获得的核酸所编码的蛋白的氨基 酸序列通常显示与常规已知的HGF蛋白高度同源。术语“高度同源”指至 少50％或更高的序列同源性，更优选地70％或更高，甚至更优选地90％或 更高(例如，95％或更高)。可使用Karlin and Altschul’s BLAST算法确定氨 基酸序列和核苷酸序列的序列一致性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 5873-5877(1993))。基于这种算法已经发展了如BLASTN和BLASTX这样 的程序(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。当使用BLASTN分 析核苷酸序列时，基于BLAST，将参数设置为，例如，分值为100和字长 为12。当使用BLASTX分析氨基酸序列时，基于BLAST，将参数设置为， 例如，分值为50和字长为3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使 用各自程序的默认参数。这些分析方法的具体技术是公知的 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如上面描述的，本发明中使用的HGF基因可以是天然存在的或人工合 成的核酸，只要这些基因编码的蛋白包含HGF活性。HGF具有体外促进肝 实质细胞增殖的活性。因此，可以通过例如，研究这些蛋白在体外对肝实 质细胞增殖的影响，来确定由上述杂交方法等所得核酸所编码的蛋白，或 者由经过修饰的天然HGF基因的核酸所编码的蛋白是否具有HGF活性。
下面描述本发明基因治疗中所使用的基因导入方法、导入方式、导入 量等。
可将给予含有HGF基因作为活性成分的基因治疗剂的方法分成两类： 使用非病毒载体的方法；以及使用病毒载体的方法。在实验指南中详细描 述了这些载体的制备方法、给药方法等等(Jikken Igaku(Experimental Medicine)Supplementary Volume，“Idenshichiryo no Kisogijyutsu (Fundamental Techniques for Gene Therapy)”，Yodosha，1996；Jikken Igaku (Experimental Medicine)Supplementary Volume，“Idenshidonyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis)”，Yodosha，1997；“Idenshi-chiryo Kaihatsu Kenkyu Handbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”，Nihon Idenshichiryo Gakkai(The Japan Society of Gene Therapy)Edition，NTS， 1999)。下面具体描述这些载体和方法。
可使用这样的重组载体，其已将靶基因插到非病毒的常规基因表达载 体中，通过下面显示的方法将靶基因导入到细胞和组织中。
将基因导入到细胞中的方法的实例是：脂质转染法、钙-磷酸盐共沉 淀法、DEAE-右旋糖酐法、使用玻璃毛细管的DNA直接注入法，等等。 将基因导入到组织的方法包括使用病毒包膜载体、内在型脂质体、静电型 脂质体、HVJ脂质体、改进的HVJ-脂质体(HVJ-AVE脂质体)的方法，受 体介导的基因导入方法，使用基因枪将载体(如金属颗粒)连同DNAs一同导 入的方法，直接导入裸DNAs的方法，使用阳离子聚合物的导入法，等等。
通过将DNA掺入由脂质双分子层形成的脂质体中，可构建上述HVJ -脂质体，然后将这种脂质体与灭活的仙台病毒(日本血凝病毒；HVJ)融合。 与常规的脂质体方法相比，使用HVJ-脂质体具有极高水平的细胞膜融合， 是特别优选的导入方式之一。制备HVJ-脂质体的方法在下列文献中有详 细的描述，例如Experimental Medicine Supplementary Volume， “Idenshichiryo no Kisogijyutsu(Fundamental Techniques of Gene Therapy)”， Yodosha，1996；Experimental Medicine Supplementary Volume， “Idenshidonyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho(Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis)”，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.93： 1458-1464(1994)；Am.J.Physiol.271：R1212-1220(1996)。使用HVJ-脂 质体的方法描述在下列文献中，例如，Molecular Medicine 30：1440-1448 (1993)；Jikken Igaku(Experimental Medicine)，12：1822-1826(1994)；和 Tanpakushitsu Kakusan Kouso(Protein，Nucleic Acid，and Enzyme)，42， 1806-1813(1997)；以及优选地描述于Circulation 92(Suppl.II)：479-482 (1995)。
此外，使用病毒包膜的方法是给予本发明HGF基因的特别优选的方法。 可通过在有表面活性剂的情况下将纯化的病毒与感兴趣的表达载体混合， 或者通过将病毒和表达载体的混合物冻融来制备病毒包膜(日本专利申请 No.2001-026185/JP-A 2001-286282)。
可在使用病毒包膜的方法中使用的病毒是那些属于如逆转录病毒、披 膜病毒、冠状病毒、黄病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、弹状病 毒、痘病毒、疱疹病毒、杆状病毒，以及嗜肝DNA病毒科的病毒，特别优 选的是HVJs。在这里，这些病毒可以是野生型病毒或重组病毒。特别地， Hasan，M.K.等报道的重组HVJ(J.General Virol.78：2813-2820(1997))， Yonemitsu，Y等(Nature Biotech.18：970-973(2000))，或这类病毒可用作 HVJ。
尽管在使用HVJ-脂质体或HVJ包膜的方法中通常优选使用HVJ的Z 株(可从ATCC中获得)，但是本质上，也可以使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。在制备病毒包膜的方法中，可通过UV照射 等方法将纯化的病毒灭活，然后将其与所需表达载体混合。可用于混合病 毒和表达载体的表面活性剂是，例如，辛基葡糖苷、Triton X-100、CHAPS， 以及NP-40。可通过注射或这类方法，将以这种方式制备的病毒包膜载体 导入到治疗或疾病预防所针对的靶组织中。此外，通过在-20℃冷冻，可 将病毒包膜载体贮藏至少两到三个月。
可在这里使用的表达载体可以是任何表达载体，只要它们能够在体内 表达目的基因。这些表达载体的实例是pCAGGS(Gene 108：193-200 (1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1、以及pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
使用病毒载体进行基因导入的典型的方法是那些使用病毒载体，如重 组腺病毒和逆转录病毒的方法。更具体地，可通过下列步骤将受试基因导 入到细胞中：将基因导入到DNA或RNA病毒中，这些病毒如脱毒的逆转 录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘苗病毒、痘病毒、 脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒(sindbis viruses)、仙台病毒、SV40、或人类免 疫缺陷病毒(HIV)(见Pharmacol.Ther.80：35-47(1998)；Front.Biosci.4： E26-33(1999)；J.Recep.Signal.Transduct.Res.19：673-686)；然后用得到 的重组病毒感染细胞。
腺病毒载体的感染效率远高于其它上述病毒载体。因此，从这个观点 看，优选使用腺病毒载体系统。
在基因治疗期间导入本发明试剂的方法包括：在体内将基因治疗剂直 接导入到机体；以及体外(ex vivo)将基因治疗剂导入到从机体获得的细胞 中，随后将经过修饰的细胞再次导入到机体中(Nikkei Science，April 1994， 20-45；Gekkann Yakuji 36(1)，23-48，1994；Jikken Igaku(Experimental Medicine)Supplementary Volume，12(15)，1994；“Idenshi-chiryo Kaihatsu Kenkyu Handbook(Handbook of Gene Therapy Research and Development)”， Nihon Idenshichiryo Gakkai eds.(The Japan Society of Gene Therapy)Edition， NTS，1999)。在本发明中特别优选体内方法。
可采用适合上述每一种给药方法的各种配制剂，(例如，液体制剂)，作 为制剂的形式。例如，可通过常规方法制备包含基因作为有效活性成分的 注射剂，该方法可包括将基因溶于适当的溶剂(例如，缓冲液，如PBS、生 理盐水、以及无菌水)中，当需要时通过过滤除菌，然后装入无菌容器中。 可根据需要将常规载体或这类物质添加到注射剂中。或者，可将脂质体制 剂，如包含HVJ-脂质体的制剂，制成悬浮液，冷冻剂，或者离心浓缩的 冷冻剂。
在本发明的治疗或预防剂中，HGF基因可用作单一活性成分，也可与 其它已知具有血管生成功能的因子一起使用。例如，已经报道了因子如 VEGF和EGF具有血管生成功能，因而可同时应用编码这些因子的基因。 此外，由于已经报道生长因子如EGF能够修复各种组织中的细胞损害，因 此当需要时可以同时使用编码各种生长因子的基因。从本发明的描述中， 本领域技术人员很清楚，在本发明的治疗或预防试剂中可根据需要将下列 试剂与HGF基因结合使用：对于治疗或预防的脑血管病具有治疗或预防效 果的其它药物试剂；以及稳定或提高HGF活性的物质(如，肝素样物质(JP -A平10-158190)和寡聚糖(JP-A平5-301824))。如果这些添加的药剂和 物质是由基因编码的，那么可以在本发明的治疗或预防试剂中将编码它们 的基因与HGF基因一起施用。
对于本发明治疗和预防试剂，可根据治疗疾病的种类、症状等选择适 当的给药方法和给药部位。特别优选肠胃外给药。枕大池和腰椎是特别优 选的给药部位。可刺穿枕大池或腰椎进入脑脊膜，然后收集适当量的脊髓 液以确定穿刺部位，并且防止提高颅内压。然后给予治疗或预防剂。例如， 可应用Hayashi，K.等报道的使用套管给予HVJ-脂质体复合物的方法 (Gene Therapy 8：1167-73(2001))，将本发明的治疗或预防剂施用到枕大池 内。
本发明的治疗或预防剂的效果被认为是，由于给予HGF基因，在脑梗 塞灶周围所谓“半影(penumbra)”区内抑制凋亡，从而维持神经细胞。因此， 本发明中“治疗”意味着在脑部发生血流障碍后减少其影响的疗法。
更具体地，本发明的药剂或方法的治疗效果是指，与没有给药相比， 发生脑血管病后，施用本发明药剂或应用本发明方法可减少由于脑血管病 所致的脑组织损伤。因此，本发明中“治疗”不仅包括从损害中完全恢复， 也包括减少损害的程度。
在另一方面，本发明中“预防”是指在发生脑血流障碍前，通过预防 性地给予HGF基因，减少血流障碍的影响。更具体地，施用HGF基因据说 具有预防效应，与没有给药相比，当在脑血管病如脑梗塞发作前给予HGF 基因，能够减少由给药后发生的脑血管病所致的脑组织损害。因此，本发 明中“预防”不仅包括从损害中完全恢复，也包括减少损害的程度。
本发明使用的术语“治疗剂”和“预防剂”意思是包含上述功能的药 物组合物。本发明的治疗和预防方法是包括给予包含上述效果的药物组合 物的方法。
在另一方面，本发明的脑血管病是指脑血流被抑制的疾病。导致脑血 流抑制的疾病是，例如，脑梗塞和脑出血。血流被抑制并不限于疾病所致。 例如，手术治疗中人工封闭血管以及由于创伤导致血管损伤所造成的血流 量减少的情况，包括在本发明的脑血管疾病中。本发明的脑血管病包括， 例如，导致脑实质中缺血或梗塞性病变的脑血管病，如脑梗塞(脑血栓、脑 栓塞，等等)、脑出血、蛛网膜下出血、高血压脑病、脑血管性痴呆、以及 阿尔茨海默型(Alzheimer-type)痴呆。
本发明的治疗或预防剂包含足以完成药剂预期目的量的HGF基因。换 句话说，本发明的试剂包括“治疗有效量”或“药理学有效量”的HGF基 因。术语“治疗有效量”和“药理学有效量”是药剂产生预期药理学结果 的有效量，以及足以缓解受治患者症状的量。可用于确定具体应用的有效 量的试验是，例如，测定从靶疾病中恢复程度的方法。实际施用的量视受 治患者的年龄、体重和症状，以及给药方法等情况而变，优选达到期望效 果而没有显著副作用的最佳量。
可通过细胞培养试验，或者任选地，通过使用适当的动物模型确定治 疗有效量、药理学有效量、以及毒性。这类动物可用于确定药剂的所需浓 度范围和给药途径。基于这些动物模型，本领域技术人员可决定施用给人 的有效量。治疗效应与毒性效应的比率称为“治疗指数”，这种比率可表述 为ED50/LD50。优选具有高治疗指数的药物组合物。根据剂型、患者的敏 感度、年龄、和其它情况，以及疾病的类型和严重度选择适当的剂量。尽 管本发明治疗剂的剂量根据患者的情况而不同，但是HGF基因的成人剂量 是在大约1μg到大约50mg的范围内，优选在大约10μg到大约5mg的范 围内，更优选在大约50μg到大约5mg的范围内。特别地，由于可通过HVJ 包膜法反复地施用HGF基因，因此不仅可以一次给予HGF基因，而且可以 多次给药，如两次或三次，以便获得更好的治疗或预防效果。这种使用HVJ 包膜的多次给药方式也包括在本发明的治疗或预防方法中。
附图说明
图1是一组属于生理盐水组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状 切片照片。
图2是一组属于pVAXI组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状切 片照片。
图3是一组属于HGF组大鼠(6只动物中的3只)的TTC染色的冠状切 片照片。
图4是生理盐水组、pVAXI组以及HGF组中梗塞区域的比较图。在右 上方显示大鼠脑部的图解示图。通过沿着所示线1到5把大脑切成薄片制 备冠状切片。图解示图中的数字1到5对应于水平轴的那些数字。垂直轴 表示梗塞区占总冠状切片区的百分率(％)。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将参考实施例具体举例说明本发明，但是这不能被解释是 为对本发明的限定。
(1)制备HGF基因表达载体
在pVAX1载体(Invitrogen)的BamHI和NotI位点之间插入人HGF cDNA(2.2kb)。
(2)制备HVJ-包膜
纯化的仙台病毒(HVJ)(Z株)在即将使用前用UV辐射(99mJ/cm2)灭活。 接着，在4℃用0.3％Triton X-100溶液将灭活的HVJ(15,000血细胞凝集单 位(HAU))和在(1)中制备的载体，或不含有HGF cDNA的表达载体混合。这 种混合物在4℃离心15分钟。移去上清液后，将缓冲盐溶液加到残余物中， 然后在4℃再离心15分钟。移去上清液后，将沉淀悬浮于100μl磷酸缓冲 盐中，并用于研究对脑梗塞的效应。
(3)向大鼠右中脑动脉闭塞模型施用HVJ包膜-DNA复合物
将体重250到270克的Wistar大鼠用氟烷(halothane)(初次给予4％；以 1％维持)麻醉。接着使用26 G针从脑池向动物给药：1)向生理盐水组给予 生理盐水(100μl)；2)向pVAXI组给予仅包含载体的pVAXI(400μg)/HVJ- E(15,000 HAU)(100μL)；以及3)向HGF给药组给予pVAXI-HGF(400 μg)/HVJ-E(15,000 HAU)(100μL)。每组中使用6只动物。给药后3天，在 氟烷麻醉下将长21mm，涂有聚L-赖氨酸的4-0尼龙缝合线从右颈外动 脉插入右颈内动脉中，制造右中脑动脉闭塞模型。在这个处理期间，使用 加热垫将动物的体温维持在37℃左右，在尾动脉测量血压。在这种处理后 1小时和24小时进行神经评价。根据下面显示的标准进行神经评价，并且 比较每组的总得分(在表1中表示为神经损伤严重程度评分(Neurological Severty Score)(NSS))。使用StadView 5.0J的Mann-Whitney U检验对结果 进行统计分析。
1)出现左前腿的屈曲
0 没有屈曲
0.5 轻度屈曲
0 完全屈曲
2)抗侧向压迫的抵抗力
0 对左向和右向有同样程度的抵抗力
0.5 轻度减弱的抵抗力
1 完全无抵抗力
3)躯体姿式
0 正常
0.5 轻度向左弯曲
1 完全向左弯曲
4)左前腿的位置
0 迅速返回到原始位置
0.5 返回到原始位置
1 不能返回到原始位置
5)右前腿的位置
0 迅速返回到原始位置
0.5 返回到原始位置
1 不能返回到原始位置
表1
HGF/HVJ pVAXI/HVJ 生理盐水 p值 体重 血压(处理前) 血压(处理后) 体温(处理前) 体温(处理后) NSS(1小时) NSS(24小时) 250.4±2.0 88.6±1.9 82.4±1.7 37.4±0.1 37.6±0.1 1.0±0.2 1.0±0.1 253±2.3 88.8±3.7 81.2±3.8 37.3±0.1 37.1±0.2 1.3±0.4 1.4±0.2 251.8±2.4 88.5±2.1 82.8±1.4 37.2±0.2 37.4±0.2 1.4±0.2 1.3±0.3 p＜0.05* p＜0.05*
*使用Mann-Whitney U检验与生理盐水组比较
如表1所示，手术期间在生理盐水组、pVAXI组以及HGF组之间没有 观察到血压和体温的差异。HGF组的神经评价分显著低于其它两个组，提 示给予HGF基因能够维持神经功能。
24小时后处死动物，从前额端开始每隔2mm(在图4右上角的图解图 示中线1到5所示的位置)制备一张冠状切片。用TTC进行染色，并且比较 梗塞区的面积(图1到图3)。为了比较这些面积，使用Adobe Photoshop 5.0 测量梗塞区所占像素(pixel)的数量。考虑水肿的影响，并且根据下列公式进 行评价：(健康脑的外侧面积-(梗塞脑的外侧面积-梗塞区面积))/健康脑的 外侧面积×100(％)。图4显示结果。梗塞区与冠状切片总面积之比用百分 率表示。从图1到4显而易见，证实HGF基因转染组中梗塞面积减小。
工业应用性
上述结果证实，给予HGF基因显示有益效果，维持神经元的功能，并 且减少脑血管病如脑梗塞的早期梗塞区的大小。更具体地，显示HGF可能 在调节脑血管病中起作用。本发明提供治疗包括脑梗塞在内的脑血管病的 新方法，其中该方法包括导入HGF基因以过度表达HGF。利用HGF基因 的本发明的方法通过基因导入，能够有效地治疗包括脑梗塞在内的脑血管 病。本发明的方法也能够维持直到现在还没有适当治疗方法的患者的梗塞 区的神经元功能以及抑制梗塞面积。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 嵌合抗原受体(CAR)、组合物及其使用方法 | 2020-07-22 | 5 |
| 抑制ALCAM基因表达的siRNA序列及其应用 | 2022-12-27 | 3 |
| 基于B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途 | 2021-10-10 | 4 |
| 一个新的食管癌标志基因RPL14及其用途 | 2020-12-30 | 1 |
| 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法 | 2022-01-25 | 3 |
| 眼内压调节早期基因及其用途 | 2021-06-25 | 1 |
| 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 | 2021-09-22 | 0 |
| 检测APC基因突变的引物以及试剂盒和方法 | 2021-09-27 | 2 |
| 治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗 | 2020-12-18 | 2 |
| 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法 | 2021-10-18 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈