本发明属于生物工程技术领域；具体涉及一种重组人表皮生长因子基因，含有该基因的载体 以及用该载体转化的菌株及其表达产物的生产和应用。

1962年美国生物学家Cohen教授发现小鼠颌下腺存在一种53个氨基酸的多肽，具有广泛的促 进细胞增殖的作用，于是定名为表皮生长因子(EGF)。70年代初明确了活性小鼠EGF的氨基酸组 成和结构，70年代中发现并进一步研究了人表皮生长因子(hEGF)。与此同时，对EGF及其受体在 动物体内的来源、分布、作用机制以及生物学活性等也进行了深入研究。研究表明，EGF可促进多 种细胞的增殖，主要是内皮和表皮细胞的增殖，因此EGF有应用于皮肤的烧伤、烫伤、溃疡、角膜 损伤治疗的可能性。

现已清楚，表皮生长因子(EGF)是一类广泛存在于人和动物体内的、可促进或抑制多类细胞 生长的多肽，由53个氨基酸残基组成，分子量为6000Da左右。由于EGF在体外具有广泛的促细胞 增殖和组织生长的生物学活性、且广泛存在于人体内，人们很自然地将EGF的体外生物学活性与其 在体内的生理学功能及创伤的愈合联系起来，并为此进行了大量的体内外研究，以求早日将EGF作 为一种有效的创伤治疗药物应用于临床实践。

早期的EGF制品是从组织或体液中提取得到的，从小鼠颌下腺中可以提取mEGF，从人尿中可 以提取hEGF，但由于这些组织和体液中EGF的含量很低(提取1g hEGF需人尿液1-10万升)，来 源极为有限，价格昂贵；而且提取的EGF一般包括正常生物活性的53肽，51肽和活性较低的49 肽、48肽及活性更低的其它肽段，而一般纯化方法很难将其分开，制品的活性难以保证，因而限 制了其在临床的推广应用。

近年，已有利用甲醇酵母表达系统生产hEGF的报道，虽然使用该系统按批次计算时表达水平 较高，但是，其发酵周期长(6天以上)，能耗和物耗过高，生产管理困难，单位生产成本高，因 而限制了hEGF的进一步开发应用。

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，重新设计合成一种重组人表皮生长因子(rhEGF) 基因，以及包含该基因的表达载体和遗传工程菌株，并提供利用该工程菌株生产rhEGF的方法及 rhEGF在制药上的应用。

本发明的重组人表皮生长因子基因是根据大肠杆菌偏爱的密码子设计而成的，其核苷酸序列 及其所编码的氨基酸序列如序列表1所示。

本发明还构建了含有上述重组人表皮生长因子基因的表达载体。特别是含有该基因的大肠杆 菌表达载体，该载体的结构包括沿着转录方向排列的E．coli中最强的T7启动子、信号肽ompA、 以及重组人表皮生长因子基因和转录终止结构。该重组载体命名为pT48，其具体结构和构建过程 分别如图5和图6所示。

利用上述表达载体转化大肠杆菌可获得能表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌遗传工程菌 株。本发明特别优选表达载体pT48转化大肠杆菌E．coli JM109(DE3)，得到能高效分泌表达rhEGF 的大肠杆菌重组菌株，该菌株命名为Escherichia coli JM109(DE3)／pT48，简称E．coli JM109(DE3)／pT48；该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏 编号：CCTCC NO：M200011，保藏日：2000年4月24日。

利用本发明的上述重组菌株E．coli JM109(DE3)／pT48(即CCTCC NO：M200011)，通过常规方 法即可分离提取得到本发明的上述重组载体pT48以及重组人表皮生长因子(RhEGF)基因。

本发明还提供了利用上述大肠杆菌遗传工程菌珠生产重组人表皮生长因子的方法，该方法是 将菌珠进行接种、培养发酵，使其表达重组人表皮生长因子蛋白，再收集菌体细胞，经分离纯化即 可得到重组人表皮生长因子产品。

利用本发明的重组菌株(优选E．coli JM109(DE3)／pT48)生产重组人表皮生长因子(rhEGF)的 具体方法为：

(1)．种子液制备：将菌种接种于三角瓶，接种量1-2％V／V，于37℃培养过夜(一般为18-20 小时)；当O．D600达到3-3．5时即可接种发酵；上述所用种子液培养基为：LB培养基加100-200mg／l 氨卞青霉素；

(2)．发酵：在无菌条件下将上述培养好的种子液按50-200ml／l的接种量接种于发酵培养 基上；发酵培养基的成分组成为(g／l)：Tryptone(蛋白胨)10-15，Yeast extract(酵母提取物)5 -15，NaCl 5-10，Na2HPO4 0-10，氨卞青霉素0．1-0．2，用去离子水溶解定容；发酵条件为：温 度37℃，pH7．0，溶解氧10-50％；溶解氧量可通过控制搅拌速度和通气量进行调节(通常，搅 拌速度为100-200rmp，通气量为5-10l／min)；发酵至O．D600达到3．0～4．0时，加入IPTG(异 丙基硫代-β-D-半乳糖苷)100mM进行表达诱导，诱导3～4小时后离心收菌；收取的菌体可存放 于-21℃冰箱中，待分离纯化；

(3)．RhEGF的分离纯化：

①粗提： a．将上述收集的菌体细胞用NaCl+磷酸盐缓冲液(PH7．6)洗涤； b．用蔗糖+EDTA+磷酸盐缓冲液(pH7．6)悬浮细胞，室温下5-20分钟，离心收集细胞； c．用磷酸盐缓冲液(pH7．6)悬浮细胞，4℃下5-20分钟，离心收集上清，得粗提液；

经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法从周质分泌型大肠杆菌系统粗提rhEGF效果很好，经此法 粗提后大部分rhEGF产物被粗提，而残存于菌体中的量极微；本法粗提rhEGF简单易行，规模可随 意扩大，可变因素少，因此重复性很好；

②纯化： a．将粗提液进行疏水层析(H柱，Pharmacia公司产品)，用含0．5M(NH4)2SO4的20mM磷酸盐缓冲 液(pH7．6)平衡，用20mM磷酸盐缓冲液(pH7．6)洗脱，收集特征峰(第一洗脱峰)即为初步纯化和 浓缩的rhEGF溶液； b．将所得初步纯化浓缩的rhEGF溶液用阴离子柱层析(Q柱，Pharmacia公司产品)，用20mM磷酸 盐缓冲液(pH7．6)平衡，0~0．6M NaCl+20mM磷酸盐缓冲液(pH7．6)梯度洗脱，收集特征峰(第 一洗脱峰)； c．将所收集的特征峰产物经凝胶过滤层析(S柱，Pharmacia公司产品)，用含20mM磷酸盐缓冲液 (pH7．6)平衡，再用20mM磷酸盐缓冲液(pH7．6)洗脱；洗脱特征峰(主峰)即为所需的纯rhEGF。

本发明上述所制得的rhEGF可用于制备能加速创面愈合和提高愈合质量的药剂。该药剂最好 是做成一种液体喷剂(rhEGF喷剂)，该喷剂的成分组成及配比一般为：

磷酸盐缓冲液       20mM pH7．0

甘油(医药级)       6-15％(W／W)

甘露醇(医药级)     6-15％(W／W)

EDTA               0．5-1．5mM

RhEGF              1．5-2．5％(W／W)

其余为无菌去离子水

上述喷剂的制备方法为：按所需要配比将除rhEGF外的其它各成分一起于121℃灭菌30分钟， 冷却至室温后，加入rhEGF，摇匀即得所需要rhEGF喷剂。

本发明的rhEGF基因的核苷酸序列是根据已知的人表皮生长因子(hEGF)的氨基酸顺序，按大肠 杆菌偏爱的密码子设计重组的，并且用该基因与E．coli外膜蛋白信号肽ompA基因形成融合蛋白基 因，置于强启动子PR，T7的下游与强终止子rrnBT1T2之间，整合成单拷贝型表达载体pT48。通过 利用E．coli的最强启动子和最强终止子之间的协同作用，实现了rhEGF在大肠杆菌中的高效分泌 表达。同时，ompA是E．coli中最有效、最准确的信号肽，胞内的二肽酶能在其识别位点处准确切 出表达产物，并引导至细胞的间质，有利于表达产物的分离纯化。因此，利用本发明表达生产rhEGF， 具有表达效率高，表达量大(占细胞总蛋白的20％)，表达时间短(仅3-5小时)，易于纯化，产 物纯度高(纯度可达97％以上)等优点。并且经试验证明，本发明所表达生产的rhEGF与天然hEGF 的生物活性无任何区别。

本发明采用大肠杆菌表达系统表达生产rhEGF，还具有生产周期短(1天)，能耗低的优点， 能降低生产成本，有利于基因工程hEGF的产业化应用。

现有hEGF制品及其它生物制品大多以人血白蛋白作为生物活性保护剂，使用该保护剂不仅成 本高，而且容易带入血源性传染病；同时，大多还需要做成冻干粉形式，进一步增加了成本，也不 便于使用。本发明的rhEGF喷剂采用甘油和甘露醇作为活性保护剂，该保护剂不仅在工业上易得、 价格低廉，而且使用操作简便，可配成液体制剂，便于临床使用，同时还有利于减少创面渗出物。

本发明的rhEGF喷剂具有使用方便，施药均匀，药量易控制，效果好等特点。经临床试验证 明，该rhEGF喷剂对促进上皮细胞、成纤维细胞，内皮细胞等多类细胞生长和胞外基质生成具有良 好的功效，能显著加速创面愈合，提高修复质量，可广泛应用于各种体表创伤、皮肤溃疡的治疗。

经对345例各种创面患者的Ⅱ期临床观察结果表明，本发明的rhEGF喷剂能有效促进创面愈合， 总有效率为93．91％(见表1)，并显著缩短愈合时间16．3-54．4％(见表2)，且明显提高愈合质量。

表1、rhEGF喷剂对各类创面的疗效

创面类型 (例数) 浅Ⅱ度 (110) 深Ⅱ度 (108) 供皮区 (49) 植皮区 (41)     肉芽     (21)     溃疡     (16) 有效率 (％)  92．73  96．30  91．84  95．12     85．71     100

表2、rhEGF喷剂与Ag-SD霜治疗345例各类创面的平均愈合天数比较

    组别   浅Ⅱ度   深Ⅱ度   供皮区   植皮区     肉芽     溃疡 rhEGF喷剂     9．72     17．43     12．29     11．78     13．45     16．63 Ag-SD霜     13．06     21．59     15．86     18．26     28．94     19．88 提前天数     3．34     4．16     3．57     6．48     15．49     3．25 提前率(％)     25．6     19．3     22．5     35．5     54．4     16．3

本发明的rhEGF喷剂对预防放射性治疗引起的皮炎或表皮溃疡效果显著，参见表3。

表3、皮肤表面不同方法处理后放射性皮炎(溃疡)的发生率

    处理方式    例数  发生率(％)     未处理     30     73．3     Ag-SD霜     25     72．0     RhEGF喷剂     28     10．7

本发明的rhEGF喷剂的使用方法一般为：常规清创后，将药液直接喷洒于伤患处；需包扎的创 面，同时将适当大小的内层消毒纱布喷湿，覆盖于创面，常规包扎。一般使用剂量为400IU／10cm2， 均匀喷湿，每日1次。

本发明的rhEGF喷剂，经临床使用，未见不良反应。经毒理学试验表明：本品无致畸、致癌、 致突变作用，亦未见致敏性和刺激性。经急慢性毒性试验结果显示：用本品按大鼠体重以0．5ml／100g 剂量(为临床应用剂量的171倍)皮肤给药，受试动物未出现不良反应；按此剂量每天一次，连续 给药30天，动物的一般症状、血流指标、血流生化等与对照组相比均无明显差异，脏器未见异常 变化。

以下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。

图1是由计算机辅助按大肠杆菌偏爱的密码子设计出的rhEGF核苷酸顺序，该顺序与序列表1 所示的本发明合成的rhEGF核苷酸顺序完全一致；

图2是MER1，MER2，MER3，MER4四个片段的核苷酸顺序，及其相互关系示意图；

图3是rhEGF基因的合成过程示意图；

图4是所合成的rhEGF基因的核苷酸顺序分析结果示意图；

图5是表达载体pT48的结构示意图；

图6是表达载体pT48的构建过程示意图。

实施例一、rhEGF基因的合成

1．根据已知人表皮生长因子(hEGF)的氨基酸顺序，由计算机辅助按大肠杆菌偏爱的密码子 设计出rhEGF核苷酸顺序，5’-端外加EcoRⅠ切点，3’-端外加2个终止密码和HindⅢ切点，全 长170bp，如图1所示。

2．按图2所示，用DNA合成仪分别合成四个片段(MER1，MER2，MER3，MER4)，每个片段有 10个bp的交叉。

3．按图3所示，以片段2(MER2)与片段3(MER3)互为引物和模板进行第一次常规的PCR 反应，反应温度：94℃→37℃→72℃，反应时间各2分钟，每个循环共6分钟，共10个循环。用 琼脂糖凝胶电泳纯化出第一次PCR产物作为模板，加入片段1(MER1)与片段4(MER4)作引物进行第 二次PCR反应，温度及时间条件同第一次反应，共20个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化， 得到纯化的PCR产物。

4．上述经纯化的PCR产物用EcoRⅠ，HindⅢ酶切，连接至M13的EcoRⅠ，HindⅢ位点上，筛选 出克隆质粒(pT8)，用常规方法测序，结果如图4所示。结果表明，所得的PCR产物的核苷酸顺序 与原设计的rhEGF基因(图1所示)完全一致，即该PCR产物即为所需要的rhEGF基因。该rhEGF 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如序列表1所示。

实施例二、含rhEGF基因的表达载体pT48的构建

表达载体pT48的构建过程如图6所示。具体步骤说明如下：

1．用EcoRⅠ和HindⅢ酶切pT8，取小片段(rhEGF基因，约200bP)；

2．用EcoRⅠ和HindⅢ酶切pT7，取大片段；

3．取上述1、2所得片段进行常规连接反应，得pT18；

4．人工合成E．coli外膜蛋白信号肽(ompA，21个氨基酸)基因片段，5’-端加NdeⅠ，3’- 端加EcoRⅠ两个酶切位点；

5．用NdeⅠ，EcoRⅠ酶切pT18，取大片段；

6．取上述4-5所得片段进行常规连接反应得pT108；

7．用BamHⅠ酶切pBV220(中国预防医学科学院病毒研究所提供)，Klenow补平，再用BglⅡ 酶切，取大片段；

8．用HindⅢ酶切pT108，Klenow补平，再用BglⅡ酶切，取小片段；

9．取上述7、8所得片段进行常规连接反应得pT48。

所得到的pT48为能高效表达rhEGF的大肠杆菌表达载体，其具体结构如图5所示。pT48分子 大小约为3．7kb，其中的rhEGF基因与E．coli外膜蛋白信号肽ompA基因成融合蛋白基因，位于启 动子P5，T7的下游与强终止子rrnBT1T2之间，实现了rhEGF的高效表达。表达产物由ompA引导， 穿过细胞内膜，到达细胞内膜与外壁之间的细胞间质，并由细胞内的二肽酶在图5中的箭头所指处 切开，使rhEGF与ompA分离。

实施例三、能高效表达rhEGF的大肠肝菌重组菌株E．coli JM109(DE3)／pT48的构建

按常规方法，用表达载体pT48转化E．coli JM109(DE3)，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转 化子，经质粒检测和酶切分析，获得含pT48的重组菌株E．coli JM109(DE3)／PT48。

上述所得重组菌株经连续传代50代试验，证明传代过程中质粒pT48的结构稳定性、生长与表 达水平稳定性及其对氨苄青霉素的耐受能力均保持不变，相当稳定。

pT48经BglⅡ+PstⅠ和BglⅡ+SalⅠ酶切均可获得3．5kb和0．5kb二个片段。对E．coli JM109(DE3)／pT48重组菌株的第23、24代及第48、49和50代菌株的pT48质粒进行BglⅡ+PstⅠ 酶切检定，结果表明，直至第50代其酶切图谱仍为3．5Kb和0．5kb二条带所组成，证明该菌株在 连续传代过程中，其质粒pT48的结构是非常稳定的。分别对E．coli JM109(DE3)／pT48重组菌不 同代次的菌株在相同条件下进行培养发酵，检测对比其最大O．D值(收菌时用7230分光光度计测 得的600nm波长吸收值)、湿菌量(菌体经12000rpm高速离心脱水后的重量)和rhEGF表达量(据 菌体裂解液SDS-PAGE的扫描结果算得)，结果如表4所示。结果表明，该重组菌在传代过程中的生 长和表达水平没有明显改变。

表4、E．coli JM109(DES)／pT48连续传代过程的生长与表达水平     代次 最大O．D值   湿菌量(g) 表达量(％)     1     7．8     20     17．6     2     8．0     21     13．6     3     8．1     18     19．3     23     8．2     20     17．4     24     8．1     19     16．9     25     8．5     21     18．4     48     8．3     19     17．3     49     7．9     18     15．7     50     8．5     21     18．6

实施例四、利用E．coli JM109DE3／pT48生产rhEGF。

1．种子液制备：将甘油保存的生产菌种接种于三角瓶(每瓶200ml种子液培养基，接种量 200ul)，于37℃培养过夜，当O．D600达到3．33时即可接种发酵。上述所用种子液培养基为：LB培 养基再加入100-200mg／l氨卞青霉素；

2．发酵：每罐发酵体积2L。发酵培养基的成分组成为(g／l)：TrypTone(蛋白胨)15，yeast extract(酵母提取物)15，NaCl 5，Na2HPO42．5，氨卞青霉素0．2，用去离子水溶解定容后装入发 酵罐；121℃高压灭菌30分钟，冷却至37℃即可接种。在无菌条件下将种子液按100ml／l的接种 量接种于发酵培养基上。发酵条件为：温度37℃，pH7．0，溶解氧10％。发酵过程每隔1小时取样 测O．D600值，并作O．D600时间曲线图，当O．D值达到最大值时即可结束发酵。发酵时间一般为6-8 小时。发酵结束后离心收菌。

3．rhEGF的分离纯化：

(1)粗提：

a．将上述收集的菌体细胞用30mM NaCl+20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)洗涤2次；

b．用20％蔗糖+1mM EDTA+20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)悬浮细胞，室温下10分钟，离心收 集细胞；

c．再用20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)悬浮细胞，4℃下10分钟，离心收集上清，得粗提 液。

(2)纯化： a．将粗提液用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)(H柱，Pharmacia公司产品)进行疏水 层析，层析柱1．5×20cm。用含0．5M(NH4)2SO4的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)洗脱，收集特 征峰(第一洗脱峰)即为初步纯化和浓缩的rhEGF溶液；上样速度7ml／分，洗脱速度4ml／分， 层析系统为BIO-RAD常压层析系统； b．将所得初步纯化浓缩的rhEGF溶液用Q Sepharose High Perfomance(Q柱，Pharmacia公司产 品)阴离子柱层析，层析柱1．5×30cm。用20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)平衡，0．6M NaCl+20mM 磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)梯度洗脱，流速4ml／分，层析系统为BIO-RAD常压层析系统，收集特 征峰(第一洗脱峰)； c．将所收集的特征峰产物用Superdex30(S柱，Pharmacia公司产品)凝胶过滤层析，层析柱1．5× 40cm，用含20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)平衡，再用20mM磷酸钠盐缓冲液(pH7．6)洗脱，流 速2ml／分，洗脱特征峰(主峰)即为所需的纯rhEGF。本步骤可连续进行，即在特征峰(主峰) 出现后进行下一次上样和洗脱，无须进行洗柱和再平衡，单次层析时间仅需30分钟左右。

上述本发明所得的rhEGF，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量与rhEGF标准品(分子量6．2KD， Promega公司产品)一样，均为6．2KD；其纯度在95％以上；其肽图与hEGF标准品(Promega公司产 品)一致，且与理论推断结果一致；经聚丙烯酰胺凝胶柱等电聚焦法测定，其等电点与rhEGF标准 品一致，pH为4．6；经用不同方法水解样品后进行氨基酸自动分析，其氨基酸组成与天然hEGF高 度一致。

实施例五、本发明的rhEGF喷剂的制备

将甘油500克、甘露醇500克、磷酸氢二钠20克、磷酸二氢钠5克、100mM EDTA 50ml，加无 菌去离子水至500ml，调pH7．0，经121℃灭菌30分钟，冷至室温，再加入无菌的rhEGF 12500ug， 摇匀，即为所需的rhEGF喷剂。装入喷雾瓶即可使用。本产品于2~8℃保存有效期可达一年以上。

实施例六、

按照实施例五，其中rhEGF的加入量为7500ug，其它条件相同。

               序列表1

1．序列特征：长度：170bp，类型：核酸及相应蛋白质，链数：单链，几何结构：线性；

2．分子类型：DNA

3．来源：人工合成。

4．序列描述：SEQ ID NO．1 G  AAT  TCC  GAC  TCT  GAA  TGC  CCG  CTG  TCT  CAC  GAC  GGT    37    Asn  Ser  Asp  Ser  Glu  Cys  Pro  Leu  Ser  His  Asp  Gly

 1                   5                       10    TAC  TGC  CTA  CAC  GAT  GGT  GTT  TGC  ATG  TAT  ATC  GAA    73    Tyr  Cys  Leu  His  Asp  Gly  Val  Cys  Met  Tyr  Ile  Glu

          15                       20    GCT  CTG  GAC  AAA  TAC  GCG  TGC  AAC  TGT  GTT  GTT  GGT   109    Ala  Leu  Asp  Lys  Tyr  Ala  Cys  Asn  Cys  Val  Val  Gly

25                       30                       35    TAC  ATC  GGT  GAA  CGT  TGC  CAG  TAC  CGT  GAC  CTG  AAA   145    Tyr  Ile  Gly  Glu  Arg  Cys  Gln  Tyr  Arg  Asp  Leu  Lys

               40                       45    TGG  TGG  GAA  CTG  CGT  TAA  TAA  GCT  T                    170    Trp  Trp  Glu  Leu  Arg  ***  ***

     50