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TSPO在治疗脑胶质瘤中的应用及重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用

阅读：6发布：2021-03-07

专利汇可以提供TSPO在治疗脑胶质瘤中的应用及重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及基因工程领域，公开了一种重组单纯疱疹病毒、所述重组单纯疱疹病毒的制备方法和应用。具体地，重组单纯疱疹病毒包括载体和外源核苷酸序列，载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因、以及可选的缺失编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种的单纯疱疹病毒，外源核苷酸序列的插入位点为载体上缺失编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列。以及降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用。本发明的重组单纯疱疹病毒具有良好的抗脑胶质瘤效果。，下面是TSPO在治疗脑胶质瘤中的应用及重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒包括载体和外源核苷酸序列，所述载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因、以及可选的缺失编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种的单纯疱疹病毒，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上缺失编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；
其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因的单纯疱疹病毒，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上缺失编码ICP34.5和/或ICP47的基因的位置。
3.根据权利要求1或2所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述外源核苷酸序列还包括启动子和终止序列。
4.根据权利要求3所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述启动子选自U6启动子、H1启动子和CMV启动子中的至少一种，优选为U6启动子和/或H1启动子。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段包括：
-TSPO基因的反义DNA或RNA；以及
-TSPO基因的shRNA；
优选的，TSPO基因的shRNA具有SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述TSPO基因具有SEQ ID No：5所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述外源核苷酸序列还包括CD基因，所述CD基因优选具有SEQ ID No：6所示的核苷酸序列。
8.一种制备权利要求1-7中任意一项所述的单纯疱疹病毒的方法，其特征在于，该方法包括：将单纯疱疹病毒中编码ICP34.5和ICP47的基因敲除、以及可选地敲除编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种，并插入外源核苷酸序列，其中，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上敲除编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；
其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段。
9.降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
10.权利要求1-7中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒和/或由权利要求8所述的方法制备得到的重组单纯疱疹病毒在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

说明书全文

TSPO在治疗脑胶质瘤中的应用及重组单纯疱疹病毒及其制备

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用，以及重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将脑胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ四个级别，Ⅰ、Ⅱ为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ为高级别胶质瘤，其中高级别胶质瘤的侵袭性强，患者预后更差，其中位生存期仅分别为18个月(Ⅲ)及12个月(Ⅳ)。脑胶质瘤的治疗通常采用手术切除，辅助以放疗和化疗等综合治疗；但脑胶质瘤手术难以完全切除，复发率较高，极易对放化疗产生耐受，所以脑胶质瘤患者生存期短，预后差，对人类的健康构成了极大的威胁。尽管近年来脑胶质瘤多种新兴治疗手段不断取得进展，但其预后仍不尽如人意，患者生存期仍然未有明显改善。

[0003] 溶瘤病毒治疗是治疗脑胶质瘤的新型方法之一。溶瘤病毒是通过删除病毒基因组上的特定基因从而赋予溶瘤病毒选择性在肿瘤细胞内复制扩增能力，获得肿瘤杀伤效果，同时改构后的溶瘤病毒在正常细胞中无法复制，因而具备较高的安全性。溶瘤病毒适合治疗脑胶质瘤主要因为脑胶质瘤几乎发生在一个器官内部而不发生转移，有利于溶瘤病毒在局部复制和瘤内的扩增。此外，脑胶质瘤周围几乎都是有丝分裂后的细胞，溶瘤病毒更倾向于在分裂旺盛的肿瘤细胞中复制。HSV-1溶瘤病毒是最早应用在脑胶质瘤上的病毒。1991年Martuza等人删除HSV-1病毒的TK基因，实验证明HSV-1病毒能够选择性杀伤脑胶质瘤细胞系，抑制种植于小鼠的脑胶质瘤的生长并提高小鼠生存率。此后20年，约有15种溶瘤病毒在脑胶质瘤上进行测试，其中7种进入临床试验阶段，包括HSV-1溶瘤病毒1716、G207、G47Δ和M032。HSV-1溶瘤病毒成为进展最快、进入临床试验最多的溶瘤病毒。临床试验结果表明HSV-1溶瘤病毒在脑胶质瘤治疗上具有良好的安全性。

[0004] 但是HSV-1溶瘤病毒有效性依然不能满足治疗需求。导致HSV-1溶瘤病毒疗效较低的原因包括脑胶质瘤的快速生长导致溶瘤病毒相对数量和复制能力的低下。因此，寻求一种能够降低脑胶质瘤生长速度以期为HSV-1溶瘤病毒提供充分的时间以杀伤脑胶质瘤细胞的方法势在必行。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用，以及一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用。本发明提供的重组单纯疱疹病毒能够有效的降低脑胶质瘤的生长速度，并且使用后副反应小，具有良好的应用前景。

[0006] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒包括载体和外源核苷酸序列，所述载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因、以及可选的缺失编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种的单纯疱疹病毒，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上缺失编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；

[0007] 其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段。

[0008] 第二方面，本发明还提供了一种制备如上所述的单纯疱疹病毒的方法，该方法包括：将单纯疱疹病毒中编码ICP34.5和ICP47的基因敲除、以及可选地敲除编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种，并插入外源核苷酸序列，其中，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上敲除编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；

[0009] 其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列。

[0010] 第三方面，本发明还提供了降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

[0011] 第四方面，本发明还提供了如上所述的重组单纯疱疹病毒和/或由如上所述的方法制备得到的重组单纯疱疹病毒在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

[0012] 本发明通过以缺失编码感染细胞多肽34.5(infected cell polypetide 34.5，ICP34.5)的基因和编码ICP47的基因、以及可选择的缺失编码ICP6的基因、编码胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的基因和编码尿嘧啶N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase，UNG)的基因中的至少一种的单纯疱疹病毒为载体，并在缺失上述基因的位置插入具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段，还优选插入CD基因，获得了稳定表达的重组单纯疱疹病毒。并且，该重组单纯疱疹病毒能够有效降低脑胶质瘤生长速度，从而可以为HSV-1溶瘤病毒提供充分的时间以杀伤脑胶质瘤细胞，提高了脑胶质瘤的杀伤效率，而且使用后副反应小，具有良好的应用前景。附图说明

[0013] 图1显示了siTSPO#1和siTSPO#2对TSPO基因的敲低水平。

[0014] 图2显示了感染与未感染插入CD基因的重组单纯疱疹病毒中CD基因的表达情况。

[0015] 图3显示了联合与未联合5-FC的实施例2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U87MG形态的影响。

[0016] 图4显示了联合与未联合5-FC的实施例2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U87MG的活性的影响。

[0017] 图5显示了联合与未联合5-FC的实施例1-2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U87MG形态的影响。

[0018] 图6显示了联合与未联合5-FC的实施例1-2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U87MG的活性的影响。

[0019] 图7显示了联合与未联合5-FC的实施例1-2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U251形态的影响。

[0020] 图8显示了联合与未联合5-FC的实施例1-2和对比例1-2对脑胶质瘤细胞U251的活性的影响。

具体实施方式

[0021] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0022] 有文献报道敲低大鼠C6胶质细胞中的TSPO基因的表达会增加其侵袭能力(The Peripheral-Type Benzodiazepine Receptor and Tumorigenicity:Isoquinoline Binding Protein(IBP)Antisense Knockdown in the C6Glioma Cell Line，Evgeny Levin,et al.,Biochemistry 2005,44,9924-9935)，另有文献报道敲低U118MG胶质瘤细胞中TSPO基因的表达会提高细胞的生长以及血管的生成以及增加瘤细胞的迁移能力(The 18kDa translocator protein influences angiogenesis,as well as aggressiveness,adhesion,migration,and proliferation of glioblastoma cells,Bode et al.,Pharmacogenetics and Genomics 2012,Vol 22No 7,538-550)。而本发明的发明人在研究中发现，通过抑制脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达可以降低脑胶质瘤细胞的代谢水平，从而有效降低脑胶质瘤生长速度，将其与HSV-1溶瘤病毒结合用于与脑胶质瘤的治疗时，可以为HSV-1溶瘤病毒提供充分的时间以杀伤脑胶质瘤细胞。

[0023] 基于如上的发现，本发明的第一方面提供了降低脑胶质瘤细胞中TSPO基因的表达水平在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

[0024] 第二方面，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒，所述重组单纯疱疹病毒包括载体和外源核苷酸序列，所述载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因、以及可选的缺失编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种的单纯疱疹病毒，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上缺失编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；

[0025] 其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段。

[0026] 申请人在此希望说明的是，所述外源核苷酸序列的插入位点为缺失基因的位置中的至少一处。例如，如果编码ICP34.5、ICP47、ICP6和TK的基因缺失，编码UNG的基因不缺失，则插入位点为缺失处的任意一处，而不是编码UNG的基因处。当所述载体中还插入有其他核苷酸序列时，例如，下文提及CD基因，两种核苷酸序列(具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段和CD基因)可以连接后插入同一位点处，也可以分别插入不同位点。优选地，两种核苷酸序列经连接后插入同一位点。

[0027] 在本发明中，所述编码ICP34.5的基因、编码ICP47的基因、编码ICP6的基因、编码TK的基因和编码UNG的基因均为本领域技术人员所公知，并且也能够通过登录相关的数据库查到，例如，可以通过登录GenBank数据库查询到相关的核苷酸序列，这些均是本领域技术人员具有的常规技术手段，本发明在此不再赘述。

[0028] 根据本发明一种优选的实施方式，所述载体为缺失编码ICP34.5和ICP47的基因的单纯疱疹病毒，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上缺失编码ICP34.5和/或ICP47的基因的位置。

[0029] 根据本发明，为了能够有效地对所述外源核苷酸序列进行独立地翻译和表达，本发明的外源核苷酸序列还优选包括启动子和终止序列，外源核苷酸序列优选包括启动子、可选的起始密码子和终止序列(可以为终止密码子)以及可选的连接序列和/或PolyA序列，在这样优选的情况下，在所述重组单纯疱疹病毒感染宿主细胞并进行自身基因的表达时，能够转录出独立的且完整的目的mRNA片段。

[0030] 在本发明的另一种优选的实施方式中，当在载体的同一个位点或不同位点(如，载体上缺失编码ICP34.5的基因的位置，和/或载体上缺失编码ICP47的基因的位置)插入所述外源核苷酸序列，且外源核苷酸序列至少为2种时，例如，具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段和下文提及的CD基因，为了使2种外源核苷酸序列各自单独表达，每个外源核苷酸序列各自具有独立的表达框，且各独立的表达框分别具有启动子。根据本发明，对所述启动子的种类没有特别的限定，只要可以控制外源核苷酸序列的转录即可，在优选的情况下，当外源核苷酸序列为TSPO基因的反义DNA或RNA或TSPO基因的shRNA时，所述启动子为U6启动子或H1启动子。当外源核苷酸序列为其他基因时，所述启动子为CMV启动子，还进一步优选包括起始密码子和终止密码子。在本发明中，所述“降低”可以指相较于未干预的脑胶质瘤细胞中TSPO基因表达的表达水平，采用本发明的方案干预后的脑胶质瘤细胞中TSPO基因表达水平下降，也可以指采用本发明的方案干预后，脑胶质瘤细胞中不再表达TSPO基因。

[0031] 其中，所述“具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列”可以为能够用于降低TSPO基因表达水平的任何核苷酸序列。例如，可以采用RNA干扰的方法，具体的，可以采用TSPO基因的反义DNA或RNA以降低TSPO基因表达水平，也可以采用TSPO基因的siRNA或shRNA以降低TSPO基因表达水平。

[0032] 本发明优选采用shRNA以降低TSPO基因表达水平，所述shRNA的优选实例包括SEQ ID No：1或SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。与shRNA同源的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示。

[0033] 本发明中，所述TSPO基因具有SEQ ID No：5所示的核苷酸序列(Gene ID:706)。

[0034] 5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床应用较为广泛的抗肿瘤化疗药物，其作用机制是在细胞内转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)，抑制脱氧胸苷酸合成酶的作用，阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化生成脱氧胸苷酸(dTMP)，从而影响DNA合成，达到杀死细胞的目的。5-FU在体内转化为5F-dUMP后，也能掺入RNA中，干扰蛋白质合成，对其它各期细胞也有抑制作用。

[0035] 5-FU对多种肿瘤有效，特别是对消化道癌症和乳腺癌疗效较好；对卵巢癌、宫颈癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌等也有效。其不良反应主要为胃肠道反应，重者血性下泻而死；骨髓抑制、脱发、共济失调等；因刺激性可致静脉炎或动脉内膜炎；偶见肝、肾功能损害。

[0036] 5-FU对正常细胞和肿瘤细胞都有杀伤作用，但其前药5氟胞嘧啶(5-FC)对细胞无作用。

[0037] 5-FU由5-FC脱氨基转化而来，这一过程可由某些微生物的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)进行催化，而人体中缺少此类脱氨酶。胞嘧啶脱氨酶(CD基因的表达产物)，能将原本无毒的前体药物5-FC转化成具有细胞毒性的化疗药物5-FU。

[0038] 本发明的发明人发现，通过将5-FC和胞嘧啶脱氨酶应用到脑胶质瘤的治疗中，取得了良好的效果。

[0039] 因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述外源核苷酸序列还包括CD基因，所述CD基因优选具有SEQ ID No：6所示的核苷酸序列。

[0040] 在本发明中，所述外源核苷酸序列还可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白的基因)。并且，所述外源核苷酸序列还可以包括通常与转录序列相关的相关转录调控序列，例如，聚腺苷酸化位点、Kozak序列、WPRE和下游增强子元件。这些均为本领域技术人员所公知，本发明在此不再赘述。

[0041] 在本发明中，对所述单纯疱疹病毒的种类没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，但是为了更好地实现稳定表达细胞因子的目的，所述单纯疱疹病毒优选为I型单纯疱疹病毒。本发明对所述单纯疱疹病毒的来源也没有特别的限定，可以通过常规的商购获得，也可以通过实验室自行分离获得。

[0042] 第二方面，本发明还提供了一种如上的重组单纯疱疹病毒的制备方法，该方法包括：将单纯疱疹病毒中编码ICP34.5和ICP47的基因敲除、以及可选地敲除编码ICP6、TK和UNG的基因中的至少一种，并插入外源核苷酸序列，其中，所述外源核苷酸序列的插入位点为所述载体上敲除编码ICP34.5、ICP47、ICP6、TK和UNG的基因的位置中的至少一处；

[0043] 其中，所述外源核苷酸序列包括具有能够降低TSPO基因表达水平的核苷酸序列的片段。

[0044] 在本发明中，以上编码ICP34.5、ICP47、ICP、TK和UNG的基因的敲除可以采用本领域常规的各种方法，本发明对此并没有特别的限制，例如，通过同源重组的方式，通过定点敲除的方式；或者，还可以通过CRISPY的方式定点敲除。在了解了本发明的发明目的以及本发明使用的病毒载体的前提下，本领域技术人员根据其掌握的常规技术手段能够实现对如上基因的敲除。

[0045] 在本发明中，外源核苷酸序列的插入也可以采用本领域常规的各种方法，所述插入的方式可以为直接在选定的插入位点插入所述目的序列，例如，可以通过CRISPY的方式插入，也可以通过同源重组的方式替换部分碱基序列从而插入所述目的序列，本发明优选后者。

[0046] 在本发明中，重组单纯疱疹病毒与正常单纯疱疹病毒一样，也需要在宿主细胞内完成其生活史，因此所述重组病毒的传代增殖需要在宿主细胞中进行。所述宿主细胞可以是各种能够培养本发明病毒载体和/或重组病毒的宿主细胞，例如，非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、仓鼠肾细胞(BHK细胞)、原代兔肾细胞、鸡胚细胞、羊膜细胞、人宫颈癌细胞(Hela细胞)以及人胚肺二倍体成纤维细胞(WI-38细胞)。

[0047] 第三方面，本发明还提供了上述重组单纯疱疹病毒和/或由上述方法制备得到的重组单纯疱疹病毒在制备用于治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

[0048] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0049] 在以下实施例和对比例中：

[0050] shTSPO#1：5‘-TGAGAAGGCTGTGGTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAACCACAGCCTTC TCTTTTTTC-3’(SEQ ID No：1)；shTSPO#2：5‘-TCACTCAACTACTGCGTATGTTCAAGAGACATACGCAGTAGTTGAGT GTTTTTTC-3’(SEQ ID No：2)；siTSPO#1：5’-GAGAAGGCUGUGGUUCCCC-3’(SEQ ID No：3)；
siTSPO#2：5’-CACUCAACUACUGCGUAUG-3’(SEQ ID No：4)和CD基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成；

[0051] Vero细胞购自ATCC，货号为CCL-81；

[0052] 胶质瘤细胞系U87MG购买自ATCC，货号HTB-14，其中高效表达TSPO基因；

[0053] U251细胞购买自ATCC，货号HTX-1725，其中高效表达TSPO基因。

[0054] 测试例1

[0055] 本测试例用于说明siRNA干扰效果鉴定

[0056] 将siRNA(siTSPO#1和siTSPO#2)分别转染到U87MG细胞中(使用3000转染试剂，购自Thermo公司，方法参照说明书)，并于37℃、5％CO2培养72h后，收集细胞，Western blot检测TSPO基因的表达，从而得到siRNA干扰TSPO基因表达的效率。其中，以未转染siRNA的正常U87MG细胞为阳性对照，以肌动蛋白(Actin)为参比蛋白。

[0057] 结果如图1所示，其中，siTSPO#1和siTSPO#2都能敲低TSPO基因的表达，siTSPO#2效果较siTSPO#1好。

[0058] 实施例1

[0059] 本实施例用于说明本发明提供的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0060] 按照申请号2004100064921，授权公告号CN1283803C的专利申请中记载的方法将野生型HSV-1病毒(其基因序列的GenBank号：NC_001806，下同)的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，并在HSV-1病毒的敲除ICP34.5基因的位置插入外源核苷酸序列，所不同的是本实施例采用Vero细胞为宿主细胞。该外源核苷酸序列从5’端至3’端依次包括：U6启动子、shTSPO#2、终止序列(TTTTTT)。在苏州金唯智公司测序鉴定外源核苷酸序列正确插入到单纯疱疹病毒载体中，以获得重组病毒载体。构建成功的重组病毒载体在Vero宿主细胞上于37℃、5％CO2条件下增殖，感染复数为0.1，收获后用0.65μm滤器去除细胞碎片，然后在
13000rpm条件下高速离心纯化，得到滴度为1×108pfu/mL的病毒悬液，用于细胞实验。

[0061] 实施例2

[0062] 本实施例用于说明本发明提供的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0063] 按照申请号2004100064921，授权公告号CN1283803C的专利申请中记载的方法将野生型HSV-1病毒的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，并且，在HSV-1病毒的敲除ICP34.5基因的位置插入人工化学合成的外源核苷酸序列1，在HSV-1病毒的敲除ICP47基因的位置插入人工化学合成的外源核苷酸序列2，所不同的是本实施例采用Vero细胞为宿主细胞。其中，外源核苷酸序列1从5’端至3’端依次包括：U6启动子、shTSPO#2、终止序列(TTTTTT)。外源核苷酸序列2从5’端至3’端依次包括：CMV启动子、编码CD的基因、BGH PolyA。在苏州金唯智公司测序鉴定外源核苷酸序列正确插入到单纯疱疹病毒载体中，以获得重组病毒载体。构建成功的重组病毒载体在Vero宿主细胞上于37℃、5％CO2条件下增殖，感染复数为0.1，收获后用0.65μm滤器去除细胞碎片，然后在13000rpm条件下高速离心纯化，得到滴度为1×108pfu/mL的病毒悬液，用于细胞实验。

[0064] 实施例3

[0065] 本实施例用于说明本发明提供的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0066] 按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，将野生型HSV-1病毒的ICP34.5基因、ICP47基因和ICP6基因敲除，以获得重组病毒载体。

[0067] 实施例4

[0068] 本实施例用于说明本发明提供的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0069] 按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，外源核苷酸序列的插入位点是HSV-1病毒的敲除ICP47基因的位置。

[0070] 实施例5

[0071] 本实施例用于说明本发明提供的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0072] 按照实施例2中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，外源核苷酸序列1和外源核苷酸序列2的插入位点均是HSV-1病毒的敲除ICP34.5的位置。

[0073] 对比例1

[0074] 本对比例用于说明参比的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0075] 按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，插入的外源核苷酸序列仅为实施例2中的CD基因。

[0076] 对比例2

[0077] 本对比例用于说明参比的重组单纯疱疹病毒的构建。

[0078] 按照实施例1中的方法进行重组单纯疱疹病毒的构建，不同的是，仅将野生型HSV-1病毒的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，未插入外源核苷酸序列。

[0079] 测试例1

[0080] 本测试例用于说明实施例2和对比例1-2中CD基因的表达情况。

[0081] 将U87MG细胞接种到24孔板中，37℃、5％CO2下增殖培养，贴壁后加入相应的溶瘤病毒实施例2和对比例1构建的重组单纯疱疹病毒(感染复数MOI＝0.01)，分别感染U87MG细胞，37℃、5％CO2培养24h后收集细胞，Western blot检测细胞中CD基因的表达。其中，以未感染的U87MG细胞作为阴性对照，肌动蛋白(Actin)作为参比蛋白。

[0082] 结果如图2所示，感染插入CD基因的重组单纯疱疹病毒的U87MG细胞中表达CD基因，而未感染插入CD基因的病毒的细胞中检测不到CD基因的表达。

[0083] 测试例2

[0084] 本测试例用于说明实施例2和对比例1-2中重组单纯疱疹病毒对脑胶质瘤细胞的杀伤情况。

[0085] 将U87MG细胞接种到24孔板中，37℃、5％CO2条件下增殖培养，贴壁后分别加入实施例2和对比例1-2的重组单纯疱疹病毒和5-FC(50μg/ml)，同时分别设置不加入5-FC的组别作为对照，然后放入培养箱中继续培养。48小时后，显微镜下观察细胞形态(100×)，发现未加入5-FC的组中，加入对比例1-2重组病毒组溶瘤效果无差别，加入实施例2重组病毒组的对胶质瘤的杀伤作用明显，结果见图3和图5。而当和5-FC联合应用时，加入对比例2重组病毒组溶瘤效果没有改善，而加入对比例1和实施例2重组病毒组对脑胶质瘤细胞U87MG的杀伤作用明显提升，结果见图3和图5。

[0086] 按照同样的方法对U251细胞进行测试，结果如图7所示(未联合5-FC的对比例1的结果未示出)。

[0087] 电子细胞计数器计数细胞浓度，从而测定细胞活性。将U87MG细胞浓度调整为3000个/100微升。96孔板中每孔加入上述100微升细胞悬液，设为5个组，每组设置4个复孔，37℃、5％CO2培养贴壁后，吸尽孔板中细胞培养液，再向每孔中加入100微升基础培养基(DMEM加10％FBS)和10微升CCK8溶液(注意避免生成气泡，而影响OD值的读数)。将孔板再次放入培养箱内孵育1小时。分别加入对比例1-2和实施例2以及对比例1和实施例2联合5-FC，用酶标仪测定450nm处吸光度检测孵育0小时的细胞活性，然后放入37度培养箱中孵育48h，检测细胞活性。

[0088] 结果如图4和图6所示，对比例1-2和实施例2的重组病毒抑制细胞活性，当对比例1和实施例2的重组病毒联合5-FC后，细胞活性的抑制效果更明显。

[0089] 按照同样的方法对U251细胞进行测试，结果如图8所示(未联合5-FC的对比例1的结果未示出)。

[0090] 测试例3

[0091] 说明实施例1、3-5中重组单纯疱疹病毒对脑胶质瘤细胞的杀伤情况。

[0092] 按照测试例2的方法检测实施例1、3-5中重组单纯疱疹病毒分别对U87MG细胞和U251细胞的杀伤情况，不同的是，不加入5-FC。

[0093] 其中，U87MG细胞，实施例1的结果如图5和图6所示，实施例5的效果比实施例1的效果好，实施例4的效果与实施例1相当，实施例3效果稍差。

[0094] 其中，U251细胞，实施例1的结果如图7和图8所示，实施例5的效果比实施例1的效果好，实施例4的效果与实施例1相当，实施例3效果稍差。

[0095] 通过将以上实施例1-5与对比例1-2的结果相比较可知，本发明提供的重组单纯疱疹病毒表现出良好的抗脑胶质瘤效果，具有良好的应用前景。

[0096] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

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