心肌基因治疗质粒
阅读：555发布：2020-05-12
专利汇可以提供心肌基因治疗质粒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种心肌 基因 治疗 质粒，其特征在于在真核表达载体上有心肌细胞特异的启动子(CMV-MLC-2V)及具有细胞穿梭功能的单纯疱疹病毒结构蛋白VP22基因。本 发明 的质粒能特异地在心肌细胞内表达，可与目的基因融合表达，并能方便地检测目的基因的 转染 效率和细胞内 定位 。，下面是心肌基因治疗质粒专利的具体信息内容。
1、一种心肌基因治疗质粒，其特征在于在真核表达载体上有心 肌细胞特异的启动子CMV-MLC-2V及单纯疱疹病毒结构蛋白VP22 基因。
2、根据权利要求1所述的心肌基因治疗质粒，其特征在于其碱 基序列与SEQ ID NO：1在人心脏肌球蛋白轻链2启动子区与多克隆 位点间即1～1591位碱基不能变动，1592～5703位的碱基序列99％ 以上相同。
3、根据权利要求1或2所述的心肌基因治疗质粒，其特征在于 其碱基序列为SEQ ID NO：1。
4、权利要求1所述的心肌基因治疗质粒的构建方法，其特征在 于以PCR扩增连接法制备CMV-MLC-2V片段，以定向克隆法将该片 段替换原pEGFP-N3载体的CMV增加子和启动子，制成pEGFP-MLC 载体；将5’、3’端分别引入BglII和HindIII识别序列VP22基因以 定向克隆法插入pEGFP-MLC载体MLC-2V启动子下游单一的Bgl II和HindIII位点间，从而构建成pEGFP-MLC-VP22载体。
5、权利要求1所述的心肌基因治疗质粒在制备心脏疾病基因治 疗载体中的应用。
技术领域
本发明涉及一种基因治疗质粒及其构建方法，具体地说，本发明 涉及一种心肌基因治疗的质粒载体及其构建方法。
背景技术
心肌基因治疗是一种治疗遗传性和先天性心脏病的新型方法。将 外源基因转入心肌细胞内，通过基因表达，从而达到纠正或增强心肌 细胞功能的目的。
基因转移作为基因治疗的关键技术，在将基因有效地转移到足够 多的靶细胞，并使细胞表达目的基因。
根据所用载体不同可将基因转移法分为四类：病毒载体法、非病 毒性生物载体法、非生物性载体法和非载体法。质粒DNA注射属于 非载体法，质粒DNA直接肌肉注射，简单易行，且注入的DNA不 能整合入染色体中而游离于染色体之外，不会引起突变和肿瘤的发 生，因此是一种较为安全的基因治疗手段。目前进行的心肌基因治疗 主要包括心肌缺血区血管发生、逆转心肌细胞肥厚和降低心肌细胞凋 亡等方面。由于一般的真核表达质粒没有心肌细胞特异性启动子，不 能控制在心肌细胞中特异地表达目的基因，因而大大降低了基因治疗 的特异性和有效性。
基因转移作为基因治疗的关键技术，在将基因有效地转移到足够 多的靶细胞，并使细胞表达目的基因。
根据所用载体不同可将基因转移法分为四类：病毒载体法、非病 毒性生物载体法、非生物性载体法和非载体法。质粒DNA注射属于 非载体法，质粒DNA直接肌肉注射，简单易行，且注入的DNA不 能整合入染色体中而游离于染色体之外，不会引起突变和肿瘤的发 生，因此是一种较为安全的基因治疗手段。目前进行的心肌基因治疗 主要包括心肌缺血区血管发生、逆转心肌细胞肥厚和降低心肌细胞凋 亡等方面。由于一般的真核表达质粒没有心肌细胞特异性启动子，不 能控制在心肌细胞中特异地表达目的基因，因而大大降低了基因治疗 的特异性和有效性。
发明内容
本发明的目的就是为了解决心肌基因治疗的靶向性问题，提供一 种基因治疗的靶向性和有效性均好的心肌基因治疗的质粒载体及其 构建方法。
本发明的另一个目的是提供这种质粒载体在心肌基因治疗载体 中的应用。
本发明的目的通过下列方法得以实现：
采用美国Clontech公司pEGFP-N3真核表达载体或与其相近似的 载体的基础上改建。可以从GenBack数据库(http：//ncbi.nlm.nih.gov) 获取其信息，登录号：U57609；也可从 http：//www.clontech.com上获 得其结构和序列信息。
本发明的质粒的构建采用了人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启 动子，取代原质粒pEGFP-N3的CMV启动子，并将单纯疱疹病毒结 构蛋白VP22的编码序列插入多克隆位点5’端，使之与外源基因融 合表达。
本发明的质粒的碱基序列在人心脏肌球蛋白轻链2启动子区与 多克隆位点间(即1～1591位碱基)不能变动，1592～5703位的碱基序 列可以在1％范围内变异，即99％以上相同，而不影响本发明的效果。
构建的质粒的碱基序列为SEQ ID NO：1
该载体具有以下三个特点：1、包含绿色荧光蛋白(GFP)的编 码序列，可与目的基因融合表达，便于检测目的基因的转染效率和细 胞内定位。2、该载体的多克隆位点上游采用人心肌肌球蛋白轻链 (MLC-2V)启动子，MLC-2V启动子是心肌细胞的特异性表达的启 动子，因此可使载体携带的目的基因特异性地在心肌细胞内表达。3、 在MLC-2V启动子和多克隆位点间插入了单纯疱疹病毒结构蛋白 VP22基因，VP22可与目的基因融合表达。
VP22的独特作用是，它能将与其融合表达的蛋白通过细胞间介 质在邻近细胞间转移。因此，VP22可将与其融合表达的目的蛋白从 转染的细胞转移到邻近未转染细胞内，从而提高基因治疗中目的基因 对靶细胞的转染率，增强基因治疗的效果。
本发明的质粒的构建可以不采用上述商业质粒，而采用直接改建 其它真核表达质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列及引入 VP22编码序列的方式获得。
本发明采用的是非载体法，因此本发明的质粒可以制成注射剂。
本发明的质粒可用于基因治疗心脏疾病。并可与其它心血管疾病 药物联合应用。包括制成复方制剂。
附图说明
图1为本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒的构建。
其构件为：pEGFP-MLC-VP22载体构件：(5703bp)
1、人心脏肌球蛋白轻链2启动子区：1-667
2、VP22ORF：687-1590
3、多克隆位点：1592-1646
4、绿色荧光蛋白ORF：1656-2375
5、SV40早期mRNA多聚腺苷酸化信号：2529-2534和2558- 2563；mRNA 3′终止点：2567和2579
6、f1单链DNA起始点：2626-3081
7、SV40复制起始点：3422-3557
8、卡那霉素抗性基因：3606-4400
9、pUC质粒复制起始点：4985-5628
本发明的另一个目的是提供这种质粒载体在心肌基因治疗载体 中的应用。
本发明的目的通过下列方法得以实现：
采用美国Clontech公司pEGFP-N3真核表达载体或与其相近似的 载体的基础上改建。可以从GenBack数据库(http：//ncbi.nlm.nih.gov) 获取其信息，登录号：U57609；也可从 http：//www.clontech.com上获 得其结构和序列信息。
本发明的质粒的构建采用了人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启 动子，取代原质粒pEGFP-N3的CMV启动子，并将单纯疱疹病毒结 构蛋白VP22的编码序列插入多克隆位点5’端，使之与外源基因融 合表达。
本发明的质粒的碱基序列在人心脏肌球蛋白轻链2启动子区与 多克隆位点间(即1～1591位碱基)不能变动，1592～5703位的碱基序 列可以在1％范围内变异，即99％以上相同，而不影响本发明的效果。
构建的质粒的碱基序列为SEQ ID NO：1
该载体具有以下三个特点：1、包含绿色荧光蛋白(GFP)的编 码序列，可与目的基因融合表达，便于检测目的基因的转染效率和细 胞内定位。2、该载体的多克隆位点上游采用人心肌肌球蛋白轻链 (MLC-2V)启动子，MLC-2V启动子是心肌细胞的特异性表达的启 动子，因此可使载体携带的目的基因特异性地在心肌细胞内表达。3、 在MLC-2V启动子和多克隆位点间插入了单纯疱疹病毒结构蛋白 VP22基因，VP22可与目的基因融合表达。
VP22的独特作用是，它能将与其融合表达的蛋白通过细胞间介 质在邻近细胞间转移。因此，VP22可将与其融合表达的目的蛋白从 转染的细胞转移到邻近未转染细胞内，从而提高基因治疗中目的基因 对靶细胞的转染率，增强基因治疗的效果。
本发明的质粒的构建可以不采用上述商业质粒，而采用直接改建 其它真核表达质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列及引入 VP22编码序列的方式获得。
本发明采用的是非载体法，因此本发明的质粒可以制成注射剂。
本发明的质粒可用于基因治疗心脏疾病。并可与其它心血管疾病 药物联合应用。包括制成复方制剂。
附图说明
图1为本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒的构建。
其构件为：pEGFP-MLC-VP22载体构件：(5703bp)
1、人心脏肌球蛋白轻链2启动子区：1-667
2、VP22ORF：687-1590
3、多克隆位点：1592-1646
4、绿色荧光蛋白ORF：1656-2375
5、SV40早期mRNA多聚腺苷酸化信号：2529-2534和2558- 2563；mRNA 3′终止点：2567和2579
6、f1单链DNA起始点：2626-3081
7、SV40复制起始点：3422-3557
8、卡那霉素抗性基因：3606-4400
9、pUC质粒复制起始点：4985-5628
具体实施方式
实施例1 pEGFP-MLC-VP22质粒的构建
以PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V连接片段，以 定向克隆法将该片段替换原pEGFP-N3载体的CMV增加子和启动子， 制成pEGFP-MLC载体；将5’、3’端分别引入Bgl II和Hind III识别 序列的VP22基因以定向克隆法插入pEGFP-MLC载体MLC-2V启动 子下游单一的Bgl II和HindIII位点间，从而构建成pEGFP-MLC-VP22 载体。
具体作法如下：
根据已知的人MLC-2V启动子序列，设计合成PCR引物：上游 引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，下游引物， 5′-TAATA GCTAGCGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Nhe I)，以人基因组DNA 为模板，扩增获得MLC-2V片段(250bp)。序列SEQ ID NO：2如 下：
GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCAC
GTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCC
TCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCA
GGGGCCGGCC
根据pEGFP-N3载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计 合成PCR引物：上游引物，5′-GCCC ATTAATCGCGTTACATAACTTAC-3′ (Ase I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT -3′，以pEGFP-N3载体为模板，扩增获得CMV增强子片段(406bp)。 序列SEQ ID NO：3如下：
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTAT
GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT
ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT
ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGG
CAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT
GTTTTG
由于CMV enhancer的下游引物和MLC-2V的上游引物是完全互补 序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和MLC-2V的下游引物，以 PCR扩增连接法制备CMV enhancer-MLC-2V连接片段，并使其5′， 3′端分别引入Ase I和Nhe I识别序列。根据pEGFP-N3多克隆位点 上游CMV增强子和启动子两侧单一的Ase I和Nhe I位点。用定向 克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段插入pEGFP-N3载体，替换原有的 CMV增强子和启动子，从而构建成pEGFP-mlc。
根据已知的单纯疱疹病毒VP22基因序列，设计合成一对PCR 引物：上游引物，5′-ATT AGATCTATGACCTCTCGCCGCTC-3′ (Bgl II)，下游引物，5′-TAT AAGCTTGCTCGACGGGCCGTCTG-3′ (HindIII)，以单纯疱疹病毒基因组DNA为模板，扩增获得VP22基 因(903bp)。序列SEQ ID NO：4如下：
ATGACCTCTCGCCGCTCCGTGAAGTCGGGTCCGCGGGAGGTTCCGCGCGATGAGTACGAGGATCTGTACTACACCCCGTC
TTCAGGTATGGCGAGTCCCGATAGTCCGCCTGACACCTCCCGCCGTGGCGCCCTACAGACACGCTCGCGCCAGAGGGGCG
AGGTCCGTTTCGTCCAGTACGACGAGTCGGATTATGCCCTCTACGGGGGCTCGTCTTCCGAAGACGACGAACACCCGGAG
GTCCCCCGGACGCGGCGTCCCGTTTCCGGGGCGGTTTTGTCCGGCCCGGGGCCTGCGCGGGCGCCTCCGCCACCCGCTGG
GTCCGGAGGGGCCGGACGCACACCCACCACCGCCCCCCGGGCCCCCCGAACCCAGCGGGTGGCGTCTAAGGCCCCCGCGG
CCCCGGCGGCGGAGACCACCCGCGGCAGGAAATCGGCCCAGCCAGAATCCGCCGCACTCCCAGACGCCCCCGCGTCGACG
GCGCCAACCCGATCCAAGACACCCGCGCAGGGGCTGGCCAGAAAGCTGCACTTTAGCACCGCCCCCCCAAACCCCGACGC
GCCATGGACCCCCCGGGTGGCCGGCTTTAACAAGCGCGTCTTCTGCGCCGCGGTCGGGCGCCTGGCGGCCATGCATGCCC
GGATGGCGGCGGTCCAGCTCTGGGACATGTCGCGTCCGCGCACAGACGAAGACCTCAACGAACTCCTTGGCATCACCACC
ATCCGCGTGACGGTCTGCGAGGGCAAAAACCTGCTTCAGCGCGCCAACGAGTTGGTGAATCCAGACGTGGTGCAGGACGT
CGACGCGGCCACGGCGACTCGAGGGCGTTCTGCGGCGTCGCGCCCCACCGAGCGACCTCGAGCCCCAGCCCGCTCCGCTT
CTCGCCCCAGACGGCCCGTCGAG
将5′，3′端分别引入BglII和HindIII识别序列的VP22基因定 向插入pEGFP-MLC载体MLC-2V启动子下游单一的Bgl II和Hind III 位点间，从而构建成pEGFP-MLC-VP22。DNA测序结果表明，MLC -2V，VP22已整合到质粒pEGFP-MLC-VP22中。
技术路线如下：
MLC-2V
PCR连接法
← CMV enhancer
↓
CMV enhancer-MLC-2V
pEGFP-N3 ↓
pEGFP-MLC——VP22
↓
pEGFP-MLC-VP22
实施例2 质粒扩增、提取与纯化
以原生生物大肠杆菌为宿主细胞，用常规分子生物学方法扩增 pEGFP-MLC-VP22，并提取、纯化。具体操作见文献《分子克隆 实验指南》([美]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，第二版)。
实施例3 细胞学实验
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP- MLC-VP22分别转染培养的人Hela(人子宫癌细胞株)、Ea.hy926 (人胚脐静脉内皮细胞)、IMA(人肠系膜下动脉中层平滑肌细胞株) 和Hep2(人肝癌细胞株)，转染24hr后，观察各组细胞中的GFP表 达情况。结果发现：pEGFP-N3在以上细胞中都可表达GFP，而pEGFP -MLC和pEGFP-MLC-VP22均不表达GFP。
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP-MLC -VP22分别转染分离培养的乳鼠心肌细胞，转染24hr后，观察各组 细胞中GFP的表达情况。结果发现：pEGFP-N3不表达GFP，而pEGFP -MLC和pEGFP-MLC-VP22均有GFP表达；以100个细胞被转 染的数量进行比较，转染pEGFP-MLC-VP22组表达GFP的细胞 数量(19.83±3.97)显著多于转染pEGFP-MLC组(12.17±4.02) (p＜0.05)。
实验表明，本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒只能特异地在心肌 细胞中表达，而且编码的VP22可显著提高细胞的转染率。
实施例4 整体动物实验
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP- MLC-VP22分别注射新西兰兔心脏壁，48hr后，取注射区心肌标本 做组织切片观察GFP表达情况。结果发现，注射pEGFP-N3的心肌组 织中无GFP表达，注射pEGFP-MLC-VP22的心肌组织中GFP表 达量显著多于注射pEGFP-MLC的心肌组织。
实验表明，本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒只能特异地在心肌 组织中表达，而且编码的VP22可显著提高细胞的转染率。
实施例3的细胞学实验结果与实验例4的整体动物实验结果一 致。本发明的上述实施例是用来说明本发明的可实施的效果，而绝非 对本发明的任何限制。
<110>广东省人民医院
<120>心肌基因治疗质粒
<160>4
<210>1
<211>5703
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc-feature
<400>
TAGTTATTAA TGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC CGCCCAACGA 60
CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA GTAACGCCAA TAGGGACTTT 120
CCATTGACGT CAATGGGTGG AGTATTTACG GTAAACTGCC CACTTGGCAG TACATCAAGT 180
GTATCATATG CCAAGTACGC CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA 240
TTATGCCCAG TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT 300
CATCGCTATT ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT 360
TGACTCACGG GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT TGTTTTGGAC 420
CCAGAGCACA GAGCATCGTT CCCAGGCCAG GCCCCAGCCA CTGTCTCTTT AACCTTGAAG 480
GCATTTTTGG GTCTCACGTG TCCACCCAGG CGGGTGTCGG ACTTTGAACG GCTCTTACTT 540
CAGAAGAACG GCATGGGGTG GGGGGGCTTA GGTGGCCTCT GCCTCACCTA CAACTGCCAA 600
AAGCGGTCAT GGGGTTATTT TTAACCCCAG GGAAGAGGTA TTTATTGTTC CACAGCAGGG 660
GCCGGCCGCT AGCGCTACCG GACTCAGATC TATGACCTCT CGCCGCTCCG TGAAGTCGGG 720
TCCGCGGGAG GTTCCGCGCG ATGAGTACGA GGATCTGTAC TACACCCCGT CTTCAGGTAT 780
GGCGAGTCCC GATAGTCCGC CTGACACCTC CCGCCGTGGC GCCCTACAGA CACGCTCGCG 840
CCAGAGGGGC GAGGTCCGTT TCGTCCAGTA CGACGAGTCG GATTATGCCC TCTACGGGGG 900
CTCGTCTTCC GAAGACGACG AACACCCGGA GGTCCCCCGG ACGCGGCGTC CCGTTTCCGG 960
GGCGGTTTTG TCCGGCCCGG GGCCTGCGCG GGCGCCTCCG CCACCCGCTG GGTCCGGAGG 1020
GGCCGGACGC ACACCCACCA CCGCCCCCCG GGCCCCCCGA ACCCAGCGGG TGGCGTCTAA 1080
GGCCCCCGCG GCCCCGGCGG CGGAGACCAC CCGCGGCAGG AAATCGGCCC AGCCAGAATC 1140
CGCCGCACTC CCAGACGCCC CCGCGTCGAC GGCGCCAACC CGATCCAAGA CACCCGCGCA 1200
GGGGCTGGCC AGAAAGCTGC ACTTTAGCAC CGCCCCCCCA AACCCCGACG CGCCATGGAC 1260
CCCCCGGGTG GCCGGCTTTA ACAAGCGCGT CTTCTGCGCC GCGGTCGGGC GCCTGGCGGC 1320
CATGCATGCC CGGATGGCGG CGGTCCAGCT CTGGGACATG TCGCGTCCGC GCACAGACGA 1380
AGACCTCAAC GAACTCCTTG GCATCACCAC CATCCGCGTG ACGGTCTGCG AGGGCAAAAA 1440
CCTGCTTCAG CGCGCCAACG AGTTGGTGAA TCCAGACGTG GTGCAGGACG TCGACGCGGC 1500
CACGGCGACT CGAGGGCGTT CTGCGGCGTC GCGCCCCACC GAGCGACCTC GAGCCCCAGC 1560
CCGCTCCGCT TCTCGCCCCA GACGGCCCGT CGAGCAAGCT TCGAATTCTG CAGTCGACGG 1620
TACCGCGGGC CCGGGATCCA TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG 1680
GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC 1740
CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC 1800
CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC CTGACCTACG GCGTGCAGTG 1860
CTTCAGCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA 1920
AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC 1980
CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT 2040
CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT 2100
CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA 2160
CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA 2220
CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA 2280
CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC 2340
TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC TCTAGATCAT AATCAGCCAT 2400
ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC CCTGAACCTG 2460
AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC 2520
AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT GCATTCTAGT 2580
TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TAAGGCGTAA ATTGTAAGCG TTAATATTTT 2640
GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 2700
CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 2760
TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 2820
CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 2880
GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTTAGAG CTTGACGGGG 2940
AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 3000
GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 3060
GCTACAGGGC GCGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 3120
ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT 3180
TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTCCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTGTG GAATGTGTGT 3240
CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT 3300
CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG 3360
CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG 3420
CCCCTAACTC CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 3480
TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT 3540
TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAGATCGA TCAAGAGACA GGATGAGGAT CGTTTCGCAT 3600
GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA GGCTATTCGG 3660
CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC 3720
GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA 3780
AGACGAGGCA GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT 3840
CGACGTTGTC ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA 3900
TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG 3960
GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC CACCAAGCGA AACATCGCAT 4020
CGAGCGAGCA CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC TGGACGAAGA 4080
GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGAGCA TGCCCGACGG 4140
CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG 4200
CCGCTTTTCT GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT 4260
AGCGTTGGCT ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT 4320
CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA 4380
CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG ACCAAGCGAC GCCCAACCTG 4440
CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT CGGAATCGTT 4500
TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC 4560
CACCCTAGGG GGAGGCTAAC TGAAACACGG AAGGAGACAA TACCGGAAGG AACCCGCGCT 4620
ATGACGGCAA TAAAAAGACA GAATAAAACG CACGGTGTTG GGTCGTTTGT TCATAAACGC 4680
GGGGTTCGGT CCCAGGGCTG GCACTCTGTC GATACCCCAC CGAGACCCCA TTGGGGCCAA 4740
TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC CACCCCCCAA GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG 4800
CTCGCAGCCA ACGTCGGGGC GGCAGGCCCT GCCATAGCCT CAGGTTACTC ATATATACTT 4860
TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT 4920
AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 4980
GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA 5040
ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT 5100
TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG 5160
CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA 5220
ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA 5280
AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA GGGGGGGTTC GTGCACACAG 5340
CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA 5400
AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA 5460
ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC 5520
GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC 5580
CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT 5640
GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCATG 5700
CAT 5703
<210>2
<211>250
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>Promoter
<400>
GACCCAGAGC ACAGAGCATC GTTCCCAGGC CAGGCCCCAG CCACTGTCTC TTTAACCTTG 60
AAGGCATTTT TGGGTCTCAC GTGTCCACCC AGGCGGGTGT CGGACTTTGA ACGGCTCTTA 120
CTTCAGAAGA ACGGCATGGG GTGGGGGGGC TTAGGTGGCC TCTGCCTCAC CTACAACTGC 180
CAAAAGCGGT CATGGGGTTA TTTTTAACCC CAGGGAAGAG GTATTTATTG TTCCACAGCA 240
GGGGCCGGCC 250
<210>2
<211>406
<212>DNA
<213>人巨细胞病毒(Human Cytomeg8lovirus)
<220>
<221>Enhancer
<400>
GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT 60
TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC 120
AATGGGTGGA GTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC 180
CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT 240
ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA 300
CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG 360
GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTG 406
<210>4
<211>903
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒(Human herpesvirus)
<220>
<221>CDS
ATGACCTCTC GCCGCTCCGT GAAGTCGGGT CCGCGGGAGG TTCCGCGCGA TGAGTACGAG 60
GATCTGTACT ACACCCCGTC TTCAGGTATG GCGAGTCCCG ATAGTCCGCC TGACACCTCC 120
CGCCGTGGCG CCCTACAGAC ACGCTCGCGC CAGAGGGGCG AGGTCCGTTT CGTCCAGTAC 180
GACGAGTCGG ATTATGCCCT CTACGGGGGC TCGTCTTCCG AAGACGACGA ACACCCGGAG 240
GTCCCCCGGA CGCGGCGTCC CGTTTCCGGG GCGGTTTTGT CCGGCCCGGG GCCTGCGCGG 300
GCGCCTCCGC CACCCGCTGG GTCCGGAGGG GCCGGACGCA CACCCACCAC CGCCCCCCGG 360
GCCCCCCGAA CCCAGCGGGT GGCGTCTAAG GCCCCCGCGG CCCCGGCGGC GGAGACCACC 420
CGCGGCAGGA AATCGGCCCA GCCAGAATCC GCCGCACTCC CAGACGCCCC CGCGTCGACG 480
GCGCCAACCC GATCCAAGAC ACCCGCGCAG GGGCTGGCCA GAAAGCTGCA CTTTAGCACC 540
GCCCCCCCAA ACCCCGACGC GCCATGGACC CCCCGGGTGG CCGGCTTTAA CAAGCGCGTC 600
TTCTGCGCCG CGGTCGGGCG CCTGGCGGCC ATGCATGCCC GGATGGCGGC GGTCCAGCTC 660
TGGGACATGT CGCGTCCGCG CACAGACGAA GACCTCAACG AACTCCTTGG CATCACCACC 720
ATCCGCGTGA CGGTCTGCGA GGGCAAAAAC CTGCTTCAGC GCGCCAACGA GTTGGTGAAT 780
CCAGACGTGG TGCAGGACGT CGACGCGGCC ACGGCGACTC GAGGGCGTTC TGCGGCGTCG 840
CGCCCCACCG AGCGACCTCG AGCCCCAGCC CGCTCCGCTT CTCGCCCCAG ACGGCCCGTC 900
GAG 903
以PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V连接片段，以 定向克隆法将该片段替换原pEGFP-N3载体的CMV增加子和启动子， 制成pEGFP-MLC载体；将5’、3’端分别引入Bgl II和Hind III识别 序列的VP22基因以定向克隆法插入pEGFP-MLC载体MLC-2V启动 子下游单一的Bgl II和HindIII位点间，从而构建成pEGFP-MLC-VP22 载体。
具体作法如下：
根据已知的人MLC-2V启动子序列，设计合成PCR引物：上游 引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，下游引物， 5′-TAATA GCTAGCGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Nhe I)，以人基因组DNA 为模板，扩增获得MLC-2V片段(250bp)。序列SEQ ID NO：2如 下：
GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCAC
GTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCC
TCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCA
GGGGCCGGCC
根据pEGFP-N3载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计 合成PCR引物：上游引物，5′-GCCC ATTAATCGCGTTACATAACTTAC-3′ (Ase I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT -3′，以pEGFP-N3载体为模板，扩增获得CMV增强子片段(406bp)。 序列SEQ ID NO：3如下：
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTAT
GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT
ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT
ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGG
CAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT
GTTTTG
由于CMV enhancer的下游引物和MLC-2V的上游引物是完全互补 序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和MLC-2V的下游引物，以 PCR扩增连接法制备CMV enhancer-MLC-2V连接片段，并使其5′， 3′端分别引入Ase I和Nhe I识别序列。根据pEGFP-N3多克隆位点 上游CMV增强子和启动子两侧单一的Ase I和Nhe I位点。用定向 克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段插入pEGFP-N3载体，替换原有的 CMV增强子和启动子，从而构建成pEGFP-mlc。
根据已知的单纯疱疹病毒VP22基因序列，设计合成一对PCR 引物：上游引物，5′-ATT AGATCTATGACCTCTCGCCGCTC-3′ (Bgl II)，下游引物，5′-TAT AAGCTTGCTCGACGGGCCGTCTG-3′ (HindIII)，以单纯疱疹病毒基因组DNA为模板，扩增获得VP22基 因(903bp)。序列SEQ ID NO：4如下：
ATGACCTCTCGCCGCTCCGTGAAGTCGGGTCCGCGGGAGGTTCCGCGCGATGAGTACGAGGATCTGTACTACACCCCGTC
TTCAGGTATGGCGAGTCCCGATAGTCCGCCTGACACCTCCCGCCGTGGCGCCCTACAGACACGCTCGCGCCAGAGGGGCG
AGGTCCGTTTCGTCCAGTACGACGAGTCGGATTATGCCCTCTACGGGGGCTCGTCTTCCGAAGACGACGAACACCCGGAG
GTCCCCCGGACGCGGCGTCCCGTTTCCGGGGCGGTTTTGTCCGGCCCGGGGCCTGCGCGGGCGCCTCCGCCACCCGCTGG
GTCCGGAGGGGCCGGACGCACACCCACCACCGCCCCCCGGGCCCCCCGAACCCAGCGGGTGGCGTCTAAGGCCCCCGCGG
CCCCGGCGGCGGAGACCACCCGCGGCAGGAAATCGGCCCAGCCAGAATCCGCCGCACTCCCAGACGCCCCCGCGTCGACG
GCGCCAACCCGATCCAAGACACCCGCGCAGGGGCTGGCCAGAAAGCTGCACTTTAGCACCGCCCCCCCAAACCCCGACGC
GCCATGGACCCCCCGGGTGGCCGGCTTTAACAAGCGCGTCTTCTGCGCCGCGGTCGGGCGCCTGGCGGCCATGCATGCCC
GGATGGCGGCGGTCCAGCTCTGGGACATGTCGCGTCCGCGCACAGACGAAGACCTCAACGAACTCCTTGGCATCACCACC
ATCCGCGTGACGGTCTGCGAGGGCAAAAACCTGCTTCAGCGCGCCAACGAGTTGGTGAATCCAGACGTGGTGCAGGACGT
CGACGCGGCCACGGCGACTCGAGGGCGTTCTGCGGCGTCGCGCCCCACCGAGCGACCTCGAGCCCCAGCCCGCTCCGCTT
CTCGCCCCAGACGGCCCGTCGAG
将5′，3′端分别引入BglII和HindIII识别序列的VP22基因定 向插入pEGFP-MLC载体MLC-2V启动子下游单一的Bgl II和Hind III 位点间，从而构建成pEGFP-MLC-VP22。DNA测序结果表明，MLC -2V，VP22已整合到质粒pEGFP-MLC-VP22中。
技术路线如下：
MLC-2V
PCR连接法
← CMV enhancer
↓
CMV enhancer-MLC-2V
pEGFP-N3 ↓
pEGFP-MLC——VP22
↓
pEGFP-MLC-VP22
实施例2 质粒扩增、提取与纯化
以原生生物大肠杆菌为宿主细胞，用常规分子生物学方法扩增 pEGFP-MLC-VP22，并提取、纯化。具体操作见文献《分子克隆 实验指南》([美]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，第二版)。
实施例3 细胞学实验
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP- MLC-VP22分别转染培养的人Hela(人子宫癌细胞株)、Ea.hy926 (人胚脐静脉内皮细胞)、IMA(人肠系膜下动脉中层平滑肌细胞株) 和Hep2(人肝癌细胞株)，转染24hr后，观察各组细胞中的GFP表 达情况。结果发现：pEGFP-N3在以上细胞中都可表达GFP，而pEGFP -MLC和pEGFP-MLC-VP22均不表达GFP。
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP-MLC -VP22分别转染分离培养的乳鼠心肌细胞，转染24hr后，观察各组 细胞中GFP的表达情况。结果发现：pEGFP-N3不表达GFP，而pEGFP -MLC和pEGFP-MLC-VP22均有GFP表达；以100个细胞被转 染的数量进行比较，转染pEGFP-MLC-VP22组表达GFP的细胞 数量(19.83±3.97)显著多于转染pEGFP-MLC组(12.17±4.02) (p＜0.05)。
实验表明，本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒只能特异地在心肌 细胞中表达，而且编码的VP22可显著提高细胞的转染率。
实施例4 整体动物实验
用脂质体法将同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP- MLC-VP22分别注射新西兰兔心脏壁，48hr后，取注射区心肌标本 做组织切片观察GFP表达情况。结果发现，注射pEGFP-N3的心肌组 织中无GFP表达，注射pEGFP-MLC-VP22的心肌组织中GFP表 达量显著多于注射pEGFP-MLC的心肌组织。
实验表明，本发明的pEGFP-MLC-VP22质粒只能特异地在心肌 组织中表达，而且编码的VP22可显著提高细胞的转染率。
实施例3的细胞学实验结果与实验例4的整体动物实验结果一 致。本发明的上述实施例是用来说明本发明的可实施的效果，而绝非 对本发明的任何限制。
<110>广东省人民医院
<120>心肌基因治疗质粒
<160>4
<210>1
<211>5703
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc-feature
<400>
TAGTTATTAA TGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC CGCCCAACGA 60
CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA GTAACGCCAA TAGGGACTTT 120
CCATTGACGT CAATGGGTGG AGTATTTACG GTAAACTGCC CACTTGGCAG TACATCAAGT 180
GTATCATATG CCAAGTACGC CCCCTATTGA CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA 240
TTATGCCCAG TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT 300
CATCGCTATT ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT 360
TGACTCACGG GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT TGTTTTGGAC 420
CCAGAGCACA GAGCATCGTT CCCAGGCCAG GCCCCAGCCA CTGTCTCTTT AACCTTGAAG 480
GCATTTTTGG GTCTCACGTG TCCACCCAGG CGGGTGTCGG ACTTTGAACG GCTCTTACTT 540
CAGAAGAACG GCATGGGGTG GGGGGGCTTA GGTGGCCTCT GCCTCACCTA CAACTGCCAA 600
AAGCGGTCAT GGGGTTATTT TTAACCCCAG GGAAGAGGTA TTTATTGTTC CACAGCAGGG 660
GCCGGCCGCT AGCGCTACCG GACTCAGATC TATGACCTCT CGCCGCTCCG TGAAGTCGGG 720
TCCGCGGGAG GTTCCGCGCG ATGAGTACGA GGATCTGTAC TACACCCCGT CTTCAGGTAT 780
GGCGAGTCCC GATAGTCCGC CTGACACCTC CCGCCGTGGC GCCCTACAGA CACGCTCGCG 840
CCAGAGGGGC GAGGTCCGTT TCGTCCAGTA CGACGAGTCG GATTATGCCC TCTACGGGGG 900
CTCGTCTTCC GAAGACGACG AACACCCGGA GGTCCCCCGG ACGCGGCGTC CCGTTTCCGG 960
GGCGGTTTTG TCCGGCCCGG GGCCTGCGCG GGCGCCTCCG CCACCCGCTG GGTCCGGAGG 1020
GGCCGGACGC ACACCCACCA CCGCCCCCCG GGCCCCCCGA ACCCAGCGGG TGGCGTCTAA 1080
GGCCCCCGCG GCCCCGGCGG CGGAGACCAC CCGCGGCAGG AAATCGGCCC AGCCAGAATC 1140
CGCCGCACTC CCAGACGCCC CCGCGTCGAC GGCGCCAACC CGATCCAAGA CACCCGCGCA 1200
GGGGCTGGCC AGAAAGCTGC ACTTTAGCAC CGCCCCCCCA AACCCCGACG CGCCATGGAC 1260
CCCCCGGGTG GCCGGCTTTA ACAAGCGCGT CTTCTGCGCC GCGGTCGGGC GCCTGGCGGC 1320
CATGCATGCC CGGATGGCGG CGGTCCAGCT CTGGGACATG TCGCGTCCGC GCACAGACGA 1380
AGACCTCAAC GAACTCCTTG GCATCACCAC CATCCGCGTG ACGGTCTGCG AGGGCAAAAA 1440
CCTGCTTCAG CGCGCCAACG AGTTGGTGAA TCCAGACGTG GTGCAGGACG TCGACGCGGC 1500
CACGGCGACT CGAGGGCGTT CTGCGGCGTC GCGCCCCACC GAGCGACCTC GAGCCCCAGC 1560
CCGCTCCGCT TCTCGCCCCA GACGGCCCGT CGAGCAAGCT TCGAATTCTG CAGTCGACGG 1620
TACCGCGGGC CCGGGATCCA TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG 1680
GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC 1740
CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC 1800
CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC CTGACCTACG GCGTGCAGTG 1860
CTTCAGCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA 1920
AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC 1980
CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT 2040
CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT 2100
CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA 2160
CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA 2220
CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA 2280
CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC 2340
TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC TCTAGATCAT AATCAGCCAT 2400
ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC CCTGAACCTG 2460
AAACATAAAA TGAATGCAAT TGTTGTTGTT AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC 2520
AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT GCATTCTAGT 2580
TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TAAGGCGTAA ATTGTAAGCG TTAATATTTT 2640
GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 2700
CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 2760
TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 2820
CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 2880
GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTTAGAG CTTGACGGGG 2940
AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 3000
GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 3060
GCTACAGGGC GCGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 3120
ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT 3180
TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTCCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTGTG GAATGTGTGT 3240
CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT 3300
CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG 3360
CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG 3420
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TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT 3540
TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAGATCGA TCAAGAGACA GGATGAGGAT CGTTTCGCAT 3600
GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA GGCTATTCGG 3660
CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC 3720
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AGACGAGGCA GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT 3840
CGACGTTGTC ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA 3900
TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG 3960
GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC CACCAAGCGA AACATCGCAT 4020
CGAGCGAGCA CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC TGGACGAAGA 4080
GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGAGCA TGCCCGACGG 4140
CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG 4200
CCGCTTTTCT GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT 4260
AGCGTTGGCT ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT 4320
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CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG ACCAAGCGAC GCCCAACCTG 4440
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ATGACGGCAA TAAAAAGACA GAATAAAACG CACGGTGTTG GGTCGTTTGT TCATAAACGC 4680
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TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC CACCCCCCAA GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG 4800
CTCGCAGCCA ACGTCGGGGC GGCAGGCCCT GCCATAGCCT CAGGTTACTC ATATATACTT 4860
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AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA 4980
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<210>2
<211>250
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>Promoter
<400>
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<210>4
<211>903
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒(Human herpesvirus)
<220>
<221>CDS
ATGACCTCTC GCCGCTCCGT GAAGTCGGGT CCGCGGGAGG TTCCGCGCGA TGAGTACGAG 60
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GACGAGTCGG ATTATGCCCT CTACGGGGGC TCGTCTTCCG AAGACGACGA ACACCCGGAG 240
GTCCCCCGGA CGCGGCGTCC CGTTTCCGGG GCGGTTTTGT CCGGCCCGGG GCCTGCGCGG 300
GCGCCTCCGC CACCCGCTGG GTCCGGAGGG GCCGGACGCA CACCCACCAC CGCCCCCCGG 360
GCCCCCCGAA CCCAGCGGGT GGCGTCTAAG GCCCCCGCGG CCCCGGCGGC GGAGACCACC 420
CGCGGCAGGA AATCGGCCCA GCCAGAATCC GCCGCACTCC CAGACGCCCC CGCGTCGACG 480
GCGCCAACCC GATCCAAGAC ACCCGCGCAG GGGCTGGCCA GAAAGCTGCA CTTTAGCACC 540
GCCCCCCCAA ACCCCGACGC GCCATGGACC CCCCGGGTGG CCGGCTTTAA CAAGCGCGTC 600
TTCTGCGCCG CGGTCGGGCG CCTGGCGGCC ATGCATGCCC GGATGGCGGC GGTCCAGCTC 660
TGGGACATGT CGCGTCCGCG CACAGACGAA GACCTCAACG AACTCCTTGG CATCACCACC 720
ATCCGCGTGA CGGTCTGCGA GGGCAAAAAC CTGCTTCAGC GCGCCAACGA GTTGGTGAAT 780
CCAGACGTGG TGCAGGACGT CGACGCGGCC ACGGCGACTC GAGGGCGTTC TGCGGCGTCG 840
CGCCCCACCG AGCGACCTCG AGCCCCAGCC CGCTCCGCTT CTCGCCCCAG ACGGCCCGTC 900
GAG 903
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