本发明领域

本发明涉及含有被修饰的胰岛素基因的转基因鱼，其已变为分泌人源化的胰岛 素。本发明还涉及转基因的胰岛在糖尿病治疗中的异体移植，还涉及改进了的大量 分离鱼胰岛的方法。

本发明背景

糖尿病是一种导致高发病率和死亡率的疾病。每年在美国糖尿病的直接和间接 花费超过900亿美元。因为胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)发生的人群比非-IDDM发 生的人群年轻，在这些花费中胰岛素依赖的糖尿病的花费占了极大的比例。虽然靠 每天注射胰岛素，IDDM的急性症状可得到控制，但大多数的患者最终留下了后 遗症，诸如失明、肾病、神经病、微血管病、和心血管疾病。大量的证据提示血糖 的精确控制将预防或减少这些后遗症。

治疗糖尿病的生理学方法为胰腺或胰岛移植。整个或部分的胰腺移植已在人体 中获得了成功，并且一些初步的证据表明该技术可防止在人中的后遗症。然而，胰 腺移植不是小的外科手术；它有对外分泌物引流的问题并需要终生的免疫抑制治 疗。另一方面，胰岛移植具有一定的理论上的优越性—主要是手术容易、不需要外 源的外分泌组织，及分离的胰岛的冷保藏。已建立了用于在大鼠和小鼠中不进行连 续的免疫抑制而使异体移植存活延长的各种方法。因为许多免疫抑制的药物对胰岛 有一定的毒性，在不进行持续的免疫抑制的情况下移植胰岛的能力将被最终证明为 对人是绝对必要的。

最近对分离大量胰岛的方法的改进及几个近期的临床报告提示胰岛移植已处于 可行性治疗IDDM的边缘。然而，还存在几个障碍。首先，胰岛仅含有2％的人胰 腺；人“胰岛分离”步骤的产量极为不同并且每个移植需要几个人供体胰腺来产生 足够的胰岛。其次，用传统的方法难从解决胰岛的异体移植排斥并且，大多数的胰 岛移植片很快丢失了。第三，没有足够的人供体胰腺可用于治疗大量的I型糖尿病 患者。因此，看来广泛地实施胰岛移植可能需要临床胰岛异体移植的发展。

为了此等可能发生的事件，许多生物医药公司正用成百万美元的费用进行“生 物—人工胰腺”技术(即，胰岛组织的微胶囊化或巨胶囊化)的开发和专利化。在 这些目标的背后的想法是胰岛组织由带有小孔的膜保护，使其免受免疫系统的破 坏，所述的小孔小到足以防止免疫细胞和抗体对移植片的破坏，而大到足以让胰岛 素、氧、葡萄糖、和养分自由通过。

在过去的几年中，几个临床胰岛移植中心用大动物做为供体进行了大量的努力 以建立胰岛异体移植的试验模型。这些研究的大部分针对猪、牛、犬、或作人灵长 类胰岛。然而，这些物种的胰腺同人的胰腺一样是纤维性的，不易产生大量的完整 的可变的胰岛组织。而且，从大动物供体产生胰岛制备是昂贵的，且胰岛产量也不 稳定。

利用tilapia，一种硬骨鱼作胰岛供体，我们已建立了胰岛体外移植的独特动物 模型(1)。某些硬骨鱼的胰岛组织，被称为主胰岛或Brockmann体(BBs)，解剖上明 显不同于其胰腺外分泌组织，并可容易地用肉眼鉴定。胰岛分离，如从哺乳动物胰 腺中获得胰岛组织所需的昂贵步骤将不再必要。用手术刀和镊子可容易地收获 BBs。我们已发现将tilapia胰岛移植到患糖尿病的裸鼠体内将产生长期的正常血糖 及哺乳动物样葡萄糖耐受曲线(2)。

硬骨鱼胰岛素已被用于维持人糖尿病患者(1)。然而，硬骨鱼胰岛素的致免疫性 可能防止其临床应用于BBs的体外移植。另一方面，其BBs产生人源化胰岛素的 转基因鱼的产生可解决此问题。产BBs的转基因鱼与生物人造胰腺技术和胶囊化 方法的改进相结合，将满足人胰腺供体和胰岛分离步骤的需要；所述的BBs在生 理上分泌人源化胰岛素。

直到最近，BBs还是通过通风橱内的解剖显微镜在可见的情况下显微解剖手工 操作来获得的(3)。虽然这比从啮齿动物中获得胰岛的标准方法要容易和廉价得 多，但它耗时且费力。虽然容易获取足够的胰岛来完成小鼠的异体移植，但该方法 对于临床应用或大动物的研究所需的大量的胰岛组织的获取不是很合适。而且，显 微解剖使我们仅收集到每条供体鱼的少于50％的胰岛组织(即，那些可用肉眼容 易看见和大BBs)。因此，为了将来将鱼胰岛用作临床和试验所用的供体源，迫 切需要建立更有效的收获BBs方法。我们最近已建立起了大量收获的方法(4)。

迄今，转基因鱼技术已被用于生产能快速生长和耐受不利环境的强壮的鱼 (5-6)。大部分的这些努力均致力于生长激素转基因的插入。另外的一个目标是 将能耐受极冷的水的物种(如，冬比目鱼)的抗冻基因转入其它物种，使它们不仅 能够存活，而且实际上能在较冷的水中茁壮成长。该目标允许在较北的地区进行水 产养殖并可使水产养殖的水产品整年地生长，而不是仅在夏季的生长期生长。

以前的转基因鱼研究还没有针对于胰岛素基因。在鱼中，胰岛素最初是生长激 素，而在哺乳动物中，胰岛素最初是glucostatic激素(7)。因此，改变鱼胰岛素基因 的表达和/或结构很可能可促进生长。结果，带有改变了的鱼胰岛素基因表达产物 的转基因鱼可表现为增强的生长态势。

本发明概述

本发明涉及能在热带鱼胰岛细胞内表达的人源化胰岛素基因，其中所述的基因 含有在热带鱼胰岛素基因的调控序列控制下的编码序列，其中所述的人源化的胰岛 素基因编码在人体中具有生物活性的胰岛素蛋白质。

本文所用的术语“人源化的胰岛素基因”是指被修饰的鱼胰岛素基因，该基因 含有足以产生人源化胰岛素产物的部分人胰岛素编码序列。当移植到人体中时人源 化胰岛素产物应具有生物活性，并含有足够的人胰岛素序列以避免人的免疫系统对 人源化胰岛素产物的破坏。在一优选的实施方案中，人源化胰岛素基因编码人胰岛 素的α链和β链的至少头29个氨基酸。

人源化的或被修饰的胰岛素基因还会有足以使人源化的基因在热带鱼胰岛β细 胞中表达的热带鱼胰岛素基因的部分调控序列。

本发明还涉及其胰岛细胞分泌人源化胰岛素的转基因鱼的制备。

本发明还涉及转基因鱼的胰岛及其用于异体移植以治疗糖尿病。

在优选的实施方案中，热带鱼是如tilapia的硬骨鱼。

本发明还涉及收获主胰岛的改进了的方法，包括如下步骤：

a)将胰岛与胶原酶一起保温一段足够的时间使胰岛从脂肪组织和结缔组织中 释放出来；和

b)分离从脂肪组织和结缔组织中释放出的胰岛。

本发明还涉及人源化胰岛素基因用于促进鱼的生长。

附图的简要说明

图1-由自动Edman降解法测定的tilapia胰岛素激素的氨基酸。tilapia A链和 B链的氨基酸序列被分别描述于SEQ.ID.No.1和2。

图2-tilapia胰岛素和人胰岛素的一级结构的比较。(-)代表序列一致。A链 和B链人胰岛素序列的氨基酸序列被分别描述于SEQ.ID.No.3和4。

图3-tilapia胰岛素基因的DNA及其相应的氨基酸序列。该DNA序列被示于 SEQ.ID.No.5。

图4-第一人源化tilapia胰岛素基因的DNA及其相应的氨基酸序列。该DNA 序列被示于SEQ.ID.No.6。

图5-第二个人源化tilapia胰岛素基因的DNA及其相应的氨基酸序列。该DNA 序列被示于SEQ.ID.No.7。

本发明的详细描述

适宜供体物种的选择

当选择用于异体移植的鱼供体物种时，人们应考虑以下7个选择标准。第一， 该鱼应在当地易于得到或容易饲养。第二，它应足够大以便容易地工作。第三，鱼 种应具有一个或多个分离的由相对纯的内分泌组织组成的BBs。第四，BBs必须 能耐受在宿主体温37℃的培养。而不发生坏死、脱粒、或失去功能。第五，该鱼 种应维持哺乳动物范围内的空腹血浆葡萄糖水平。第六，胰岛素的分泌必须是葡萄 糖依赖的。最后一点，BBs应在移植到患糖尿病的裸鼠后能维持长期正常的血糖。

在本发明的优选实施方案中，温水硬骨鱼用作供体鱼种。在种系发生上，硬骨 鱼是包括30,000个鱼种的多骨鱼的具大而多种多样的下纲。Brockmann体(BBs) 趋于仅在较高等的硬骨鱼中发生，其它的硬骨鱼趋于具有散布的胰岛。Tilapia (Dreochromis nilotica)和巨大的gorami(Osphronemus gorami)是高等热带鱼的例 子。其它的具有解剖学上明显的胰岛组织的热带鱼种如tambaqui(Colossoma macropomum)和Pacu(Piractus mesopotamicus)也可用作供体鱼种。

硬骨鱼胰岛素的一级结构不同于人的胰岛素的一级结构。几种硬骨鱼的胰岛素 已被纯化并且其氨基酸序列也已被测定。它们均在B链的起始处具有额外的残基而 丢失了在B链的末端的第30位残基；取代可发生A链和B链的其它各残基处(例 如，在人的和鳕鱼的胰岛素的A链之间具有9个氨基酸取代，B链具有6个氨基酸 取代)。大多数的硬骨鱼胰岛素表现出人胰岛素(8)的三分之一到二分之一的生物 活性能力。 人源化胰岛素基因的制备

Tilapia胰岛素已被纯化并测序(8)(图1)。Tilapia胰岛素在A链有9个氨基酸， B链有8个氨基酸不同于人的胰岛素(图2)。

用活体外的聚合酶链式反应(PCR)克隆术(Takara Shuzo Co.LTD)及基于人的和 几种硬骨鱼胰岛素保守氨基酸的一套降解的引物(9-11)，已克隆了完整的tilapia 胰岛素基因，包括1kb的5′非翻译区和1.2kb的3′非翻译区序列(图3和SEQ. ID No.5)。全部的编码区，包括前导序列、B链、C-肽、和A链已被测序。通过 对纯化的tilapia胰岛素的氨基酸测序证实，在推测的氨基酸序列和我们最近制得的 蛋白质序列之间存在100％的一致性(图1)。与人胰岛素相比，tilapia的A链具 有12/21的一致的氨基酸(57.1％)并且5个取代氨基酸进行了保守变换。当与人 蛋白质相比时，B链具有23/30的一致的氨基酸(76.7％)并且3个进行了保守变 换。与预期的相同。C-肽与人的C-肽具有很少的一致性。所有已知的胰岛素基因 的基因组结构，在C链内含有内含子。与预期的相同，在C链的第7个氨基酸后， tilapia胰岛素基因含有316bp的内含子(相1)。该内含子具有适当的GT/AG供 体/受体剪接序列。在1kb的5′上游序列应含有所有的调控单从便以与其内源对 应物相似的组织特异的方式调控基因(即葡萄糖响应)。

用定点诱变和接头取代将tilapia胰岛素基因人源化，使其在仍保留tilapia所有 的调控(非编码)序列的同时含有编码人胰岛素的外显子。设计取代的密码子使它 们编码人的胰岛素链并仍使用tilapia的优选密码子，以便得到适当的蛋白质表达。 tilapia的前胰岛素引导肽和C链末做变动。该结构为内肽酶保留了所有的类似的识 别位点，并因此，转基因鱼就能如同对天然胰岛素的加工一样对该修饰的蛋白质进 行加工。第一个人源化的tilapia基因在B链缺乏人末端苏氨酸(即，如同ailapia)(图 4及SEQ.ID.No.6)；将保证了B-C链的适当剪接。第二个结构含有B链末端的苏 氨酸(图5和SEQ.ID.No.7)。 转基因鱼的制备

为得到转基因鱼，将人源化的或被修饰的基因插入到受精的tilapia卵中，首先， 将被修饰的基因插入碎片从质粒DNA中取出。将该DNA悬浮于NT缓冲液(88mM NaCl，10mMTris-HCl pH7.5)中，并将106-107的拷贝注射到每一前核中(12)。线性 碎片应能增加整合的可能性，并且也能减少该基因的染色体外的拷贝(12)。与一次 能产生10-15个卵的小鼠不同，鱼每次可产出上千只卵。Tilapia的繁殖力强，并 且在许多方面是转基因的理想研究对象。与许多其它的每年产一次卵的硬骨鱼不 同，雌tilapia每两周产卵一次。tilapia生长迅速并且在5个月内变得性成熟。可对 tilapia的一次孵化的仔鱼或后代进行窝凹标记以便能通过电子扫描进行个体鱼的 鉴定。将一次孵化的仔鱼，通过穿有孔的塑料板将雄鱼和雌鱼分开，于28℃养于 20加仑的鱼缸中。当雌鱼成熟时，将她的卵剥离到干燥的平皿中，而将雄鱼的鱼 精白(精液)吸入毛细管。将该管中的内容物与孵混合，然后向平皿中加水。2-3 分钟后，用水洗涤鱼卵以除去多余的精子。在授精的5分钟内开始鱼卵的显微注射。 将受精卵保存于21℃的水中，这使得分裂减慢，以使受精卵在注射前保持单细胞 状态。据报道该技术可使tilapia鱼卵在授精后2.5小时后进行显微注射(13)。

硬骨鱼卵具有卵膜孔—在卵壳上的精子大小的一个开口。tilapia卵的卵膜孔直 径是6μm。按照Rahman和Macleam(13)描述的方法进行卵膜孔注射。将卵置于 卵膜孔易于被看见的位置，然后将其固定于由发明人设计的卵托上。在操作显微镜 和显微操作器的帮助下，将针尖推进卵膜孔并用“基因推进器”注入250pl-2nl的 DNA溶液。在其末端尺寸为3-5μm的针头是用微电子拉伸器从硅酸硼玻璃管制 得的。注射后，将鱼卵培养于塑料孵化管中，其水的流速为0.75l/分钟，直至受精 后10天，此时将鱼苗移到鱼缸中使其生长(13)。

一旦通过显微注射引入tilapia，人源化的tilapia胰岛素基因应含有足够的tilapia 序列以便在鱼中发生很小比例的同源重组。目前同源性重组在小鼠中用于打断基因 (即，分离(knockout)试验)以确定无功能的断裂基因在活体内的功能。然后可使 用掺入到人序列但不产生鱼基因组产物的引物，并通过聚合酶链式反应(PCR)(14) 对tilapia鱼鳍剪切物进行筛选。由于PCR非常敏感，人们可首先对鳍剪切物进行 成批地筛选，然后仅当鉴定出阳性批次时才需对个体鱼进行筛选。对表达转基因的 个体鱼在3个月龄时进行凹窝标记，以便用电子扫描在其生活过程对其进行鉴定。 转基因鱼的筛选

饲喂的目的是建立用于组织移植的遗传稳定的转基因tilapia种系。该品系应具 有如下性质：(1)除胰岛素座位(外源的人源化DNA)外缺乏人源化tilapia DNA序 列，(2)人源化的胰岛素基因在tilapia胰岛素座位为纯合的，(3)遗传及发育的稳定性 和一致性，(4)良好的生长及存活特征，及(5)为防止污染及为保护开发者的专有利 益的遗传可鉴定性。 起始筛选步骤：

饲养部分基于以四个PCR引物的筛选：以就在插入碎片1kb引导链上游的引物 (AT)tilapia序列、在引导链内人源化编码区外的引物(BT)tilapia序列、在胰岛素编 码区内的引物(CH)人源位tilapia序列、和与CH同源的引物(CT)tilapia序列的筛 选。 纯合的转基因奠基鱼群：

对AT-CH PCR产物的起始筛选鉴定出的转基因鱼(G0代)在胰岛素座位是杂 合的，并且在基因组内也可能含有外源的人源化插入碎片。尽可能地与许多野生型 鱼一样地饲养这些G0鱼，使之产生含有50％转基因杂合后代(G1)的鱼群。可通过 由AT-GH PCR产物的筛选来选择出含有单拷贝转基因的鱼。然后使这些杂合体鱼 自相交配来产生25％杂合的转基因鱼的G2代。可通过同时筛选AT-CH和AT-CT 产物将G2杂合体从50％杂合体中选择出来。

通过在适于tilapia的海洋基因探针实验室(MGPL)内的随机交配使所得的杂合 的转基因奠基鱼群得以扩增。然后我们将制造出足够的后代，以便我们能对转基因 胰岛素进行纯化和测序以证实其氨基酸序列。 纯化的转基因群：

用人源化的tilapia胰岛素探针通过Southern印迹限制酶消化将奠基鱼群内的外 的人源化的插入碎片(而不是胰岛素座位)筛选并采集出来。对G0和G1代进行 该筛选和采集。如果外源的人源化的插入碎片非常稀少，可用人源化的tilapia胰岛 素探针通过筛选限制酶消化来将它们从奠基鱼群中选择出来。如果外源的人源化的 插入碎片非常丰富，可通过在MGPL肉与非-转基因的基础鱼群进行几代的轮回回 交选择，然后再进行另一轮的交配而使之稀释从重新建立杂合性。该策略是使转基 因与tilapia的几个品系在MGPL内进行回交。当已将外源的插入碎片除去时，可 通过随机交配来使纯化的转基因鱼群进行扩增。

将来自转基因的tilapia的组织最终移植到人体内的可能性对该材料提出了稳定 性及可预言性的硬性要求。用于移植的鱼及相关的支持研究应为遗传上一致的。看 来不需要致力于在所有背景座位(非-胰岛素座位)均纯合的同基因转基因品系， 因为总体上讲鱼是高度近亲交配的，其适合度差并且发育稳定性低。相反，山羊应 是纯合品交配的同基因的第一代杂种。该杂种在遗传上是一致的，在许多背景位点 是杂合的，但对于人源化的tilapia胰岛素基因却是纯合的。同胞交配比雌核发育是 产生纯合品系的更为优选的方法。建立多相近亲交配的亲代品系作为防骤措施，以 防在同胞交配过程中因近交衰退而致的品系丧失。 转基因移植品系：

通过家族内选择进行近交亲代品系内的适合度(生长及生殖力)的选择(15、 16)。选择最初基于品系自身减小近交衰退的能力，其次基因其在同基因的转基因杂 合体中的表现。人们预计适合度的选择将阻碍背景座位趋于纯合的趋势。可通过对 分散于整个基因组的微卫星座位进行的大量筛选对该过程进行控制和监测。最终的 转基因移植品系将是同基因的杂合体。近交的亲代品系应是以存活，不致于该品系 在长期的生科过程中有失掉的危险。 遗传鉴定和安全保障

如必要(例如为了安全或专有权的原因)，转基因产生的品系应为可鉴定的，如 不仅在品系水平可鉴定而且在染色体水平也可鉴定。这可通过对所有的染色体的微 卫星位点建立独特的等位基因图谱来实现。如看起来必要，可对制备可用于移植的 鱼进行激素绝育而使之不能再生殖。 非—同源重组：

如上面所详细描述的，我们试图进行同源性重组。然而，人源化的tilapia胰岛 素基因含有它的“天然”启动子和其它上游调控序列。因此，如果整合到另一位点 (即，非同源重组)，它应仍有功能。从这些转基因产物来的胰岛细胞可在人和鱼 胰岛素的水平产生调控。

也可选择表达人和鱼胰岛素基因的鱼而用于生产。这样的鱼的胰岛应仍能调控 血糖水平，并因此可被用作胰岛供体。而且，表达两种基因(或多拷贝的人源化的 基因)的鱼证明有增强的生长潜能，并因此可证明有水产养殖的价值。 从转基因鱼中收获BB’s

用II型胶原酶收获BBs的新方法描述如下。该方法步骤非常简单、耗时较少， 特别是当用于大量分离时；该方法还使每条鱼的胰岛组织产量增加了一倍多，并因 此使供体鱼的需求量减少了50％。由该方式制备的BB在组织学上比由显微解剖制 备的BB要干净些。以前发明人已将用该新方法从tilapia分离的BBs移植到无胸腺 的裸鼠和有胸腺的BALB/c小鼠中，并将其结果与用通过标准的显微解剖获得的鱼 胰岛所得的那些结果做了比较。该结果表明此新的分离方法既不改变在裸体内移植 后的长期功能，也不改变在有胸腺小鼠内移植后的移植片的平均存活时间(4)。

将供体鱼养于28℃并在宰杀前使之禁食。通过将供体鱼置于含有2-苯氧基乙 醇(1ml/L)或对-氨基苯甲酸乙酯(苯唑卡因)(200mg/L)的一桶水中使之麻醉； 然后对该鱼称重并给其编一个识别号码。接下来，将每条鱼以其左侧置于解剖盘 上。然后用手术刀切断其颈椎脊索而将供体鱼处死。接着，沿肛门至心包腔将腹表 面发开而使腹膜腔充分暴露；在背侧自尾至右鳃盖骨(鳃瓣)将该切口延伸，然后 在尾部沿腹腹腔的背面至肛门将该切口延伸。最后，除去由这三个切口包围的肌包 膜组织的三角瓣(4)。将接近胆管的“BB区”的位识别出来(4)，所述的HBSS含 有27mMHepes，200u/ml的青霉素、和200ug/ml的硫酸链霉素(Giboo，Grand Island，NY)；以鱼的识别号码标记平皿。然后将平皿置于层流橱中直至另外的供 体鱼通过这些步骤被处理。

这些BB区，显微学上由脂肪组织、血管、神经、胆管、和将近15个BBs组成 (4)。收集这些BB区并将其保存于含有27MHEPES、200u/ml的青霉素、及 200ug/ml硫酸链霉素(Gibco，Grand Island，NY)的冷的Hanks平衡盐溶液(HBSS) 中。收集到所需数目的BB区后，对它们进行漂洗并将之置于含有37℃预温的胶 原酶溶液(2个区/ml)的50ml塑料离心管中。通过将II型胶原酶(Sigma C-6885， St.Louis，MO)溶解于HBSS中来制备胶原酶溶液，其浓度为3mg/ml。接下来，将 含有BB区和胶原酶溶液的各管置于37℃的振荡器水浴中。进行消化约15±5分 钟。最佳消化时间由不时地停止消化并将试管对着光来肉眼判断。当大多数的小的 和中度大小的BBs被清楚地释放出来而最大的BBs仍微弱地随着成几个线头样结 构时，停止消化。通过向每支试管中注入冷的HBSS而使消化停止。将试管以 1000RPM离心1分钟而弃掉含有一层自由脂肪细胞稀释的胶原酶的上清液。沉淀 物用冷的HBBS洗涤两次。然后将消化的组织重新悬浮于HBSS中并使之置于 100mm的塑料培养皿内。在解剖显微镜(IOX的放大倍数)下或用肉眼加良好的光 照，被释放出的BBs可容易地从由脉管、胆管、和结缔组织组成的残片中鉴定出 来。BBs呈球状，略带白色；它们比结缔组织还不透明(4)。然后用硅化的吸管手 工将它们挑选出来。通常，每条供体鱼具有一或两个大的BBs及10-15个小的或中 度大小的BBs；BBs的大小为其最大直径在0.3-5mm的范围内(4)。最大的BBs经 常与大直径的血管紧密地连在一起，且在消化后仍微弱地附着在一起(4)；然而， 它们在微血管剪和珠宝商镊子的帮助下很容易分开。然后将所有收集到的BBs转 移到加有10％小牛血清、2.5mg/ml的D-葡萄糖、100u/ml青霉素、及100ug/ml硫 酸链霉素的CMRL-1066培养基(Gibco，Grand Island，NY)中。用小剪子将较大的 BBs剪开以得到一致的大小(最大直径＜0.5mm)。然后，将所有的BB碎片于37℃ 在9.5％空气/5％CO2内自由-浮动过夜培养。在移植前将BB碎片培养过夜以使胰 岛素从任何破损的细胞中泄漏出来。并使附着于BB碎片的外分泌组织在移植前降 解。一旦所有的平皿置于保温箱中时，测定每一供体鱼的血浆葡萄糖水平并以供体 鱼的识别号码记录之。过夜培养后，该BB碎片可用于移植。 功能研究

在应用于临床这前，需要分析转基因胰岛的功能性特征。在活体内及活体外进 行该分析。第一步，测定来自转基因胰岛的分泌的胰岛素的氨基酸序列以证实其是 人源化的。在活体外测定了由作一转基因tilapia胰岛分泌tilapia胰岛素的动力学及 其促分泌剂，并使之与用转基因胰岛和放射免疫分析对人胰岛素的分泌研究进行比 较。因为鱼的胰岛素结构不同于人的、猪的、牛的、和大鼠的胰岛素氨基酸，这些 品种产生的大部分的抗胰岛素抗体不以足以放射免疫分析的亲合性起交叉反应。虽 然已培养出一些抗teleost鱼的胰岛素抗体(17-21)，一种teleost的胰岛素经常与其 它种的teleost的胰岛素不同。因此，已培养出抗纯化的telapia胰岛素的抗体以通 过标准的RIA方法对胰岛素进行测量。

而且，将研究比较tilapia，人源化的tilapia，及人胰岛素对哺乳动物细胞—胰 岛素的一个初级靶的作用效果。IDDM对葡萄糖运输、糖原合成、葡萄糖氯化、 及葡萄糖转运子GLUT-4易位和/或活性有负面的影响；这些问题可由专有的胰岛 素治疗而解决。因此，将测定用人源化的tilapia胰岛素进行治疗对葡萄糖运输、葡 萄糖代谢(糖原生成、糖原降解、及氧化)胰岛素结合、和GLUT-4易位的急性 和慢性效果。另外，这些长期研究中的一些将在患链脲佐菌素—糖尿病的无胸腺裸 鼠中进行，所述的裸鼠已由BB移植片而使其血糖正常。

转基因胰岛将在哺乳动物受体中适当地起作用。这在发明人的以前将非-转基因 鱼胰岛移植到裸鼠中的研究中得到了证实(1、2)。在移植前至少一周进行单静脉 内注射链脲佐菌素(175-200mg/kg)来诱导受体鼠的糖尿病。所有的受体鼠应具有至 少两个相继的在350和500mg/dl之间的非-禁食血浆葡萄糖测量值。对发明人已测 试的所有小鼠品系而言，保证血糖正常和移植后立即出现低血糖的概率最小的 tilapiakg的供体鱼体重/g小鼠体重(如，24g的小鼠需要0.6kg的供体tilapia)。总的 供体鱼体重一般可由一条大鱼或多条小鱼提供。每条重在200和800克之间的 tilapia可用作BB供体。有趣的是，看来供体鱼体重不与BB重量密切相关，结果 看来总的供体鱼重量是定量移植到特定的受体小鼠中所需的组织的量的较好的方 法。

至少在移植前30分钟，从保温箱中取出BB碎片，换上含有4.0mg/mlD-葡萄 糖的CMRL培养基，然将其重新放入保温箱中30分钟。该步骤使胰岛进一步脱粒 并保护受体在移植后最初的24-48小时之间。(即，当胰岛素最可能从死的细胞中 泄漏出来时候)不出现低血糖。经过该30分钟的温育期后，将BB碎片置于会有 2.5mg/mlD-葡萄糖的完全培养基中，然后将其重新放入保温箱中直至移植它们的 时间。就在移植之前，将BB碎片在不完全培养基(即，不含胎牛血清)中洗涤。

患糖尿病的裸鼠受体通过腹膜内注射50-55mg/kg的戊巴比妥而使之麻醉，并使 其右侧朝向放置。将左侧除鳞，然后用碘抗腐溶液清洗之，接下来用乙醇清洗之 用手触及左肾，然使之以前缘椎骨的角度通过0.75cm的亚前缘缺口。收取来到外 部的肾脏并用Hepes-HBSS使之润湿。边在解剖显微镜下观察着，边用珠宝商的镊 子将肾囊轻轻拉出并用25号针头的切割边对其开一个0.2cm的切口。然后用“曲 棍型”的玻璃小药刀将该肾囊从肾脏表面分离出来—因此而创造出可移植BB组织 的空间。必须十分小心以防小药刀撕裂该肾囊。

用弯曲的珠宝商镊子轻轻地提起肾囊而将BB碎片置于肾囊的底部，然后用弯 曲的玻璃小药刀在囊下轻推每一碎片。在该过程中肾脏的表面应用hepes-HBSS经 常的润湿。一旦所有的BB碎片均处于肾囊之下，应将它们平均分开以避免形成 BB组织的大乱团。然后用细尖的低温眼灼烧器(Xomed-Treace.，Jacksonville，FL)将 肾囊上切口缝合。然后将肾脏送回到其正常的位置。并且用5-0根丝缝线将肌肉层 及皮肤缝合(2，22)。 移植评估

a.移植片活体内的功能

移植后数小时，一般地讲小鼠的血糖变为正常(＜200mg/dl)。应不时地观察受体 小鼠在术后期间的低血糖信号。在移植后的最初24-48小时期间，胰岛素释放的调 控差并且小鼠可能成为低血糖的受害者。应对低血糖小鼠立即进行葡萄糖腹膜内注 射。如足够大体积的BB组织已被移植，小鼠应保持正常的血糖直至出现排斥。在 tilapia BB碎片移植到裸鼠后，作一禁食血浆葡萄糖水平的平均值在70～100mg/dl 的范围内(2)；然而，在移植后的头一周内，血浆葡萄糖水平的平均值趋于某种程 度的稍低。BB移植片在裸鼠体内起生理作用；长期的受体小鼠具有相对正常的葡 萄糖耐受曲线(2)。令人感兴趣的是长期受体小鼠的禁食血浆葡萄糖水平的平均值 (72mg/dl)与供体鱼的那些值(75mg/dl)几乎一致(2)。发明人已经发现，如果非-禁食 的血浆葡萄糖水平波动大，可能是移植的BB组织不足(23)。

b.组织学

当每只受体小鼠被处死时需要组织学评估。首先，应检查受体的天然胰腺的β 细胞的再生证据；该检查可通过用醛品红(24)或免疫过氧化物酶对胰岛素的组织切 片染色来完成。

接下来，应检查每只左肾的移植片存活性及β细胞的脱粒程度。可用发明人的 抗tilapia胰岛素抗体通过免疫过氧化物酶染色来检查β细胞的脱粒。含有移植片的 肾脏切片也应用苏木精和曙红染色。

c.单细胞的制备

将BB碎片变成单细胞悬浮液可能有些好处。这与单细胞及小细胞聚集体比整 个BBs或BB碎片展示更高的表面积与体积之比这一额外优越性有关，并因而不易 限制氧及营养的扩散(25)。

BBs可被容易地分散成单细胞。该BBs置于15cc的圆椎形塑料离心管中并用不 含钙-镁的HBSS洗涤两次。进行抽吸并使BB于室温重新悬浮于7ml的Versene (Gibco#670-5040AG，Grand Island，NY)中7分钟。沉淀BBs并去掉上清液。接着， 向试管中加4ml的胰蛋白酶溶液(Sigma#T-0646，St.Louis，MO；1mg/ml溶于不含钙 -镁的由0.22μm注射器滤器过滤的HBSS中)，然后将试管置于层流橱内的37℃ 的水浴；然后胰蛋白酶/BB溶液用移液管一直轻轻地吸上吸下。2分钟后，使较大 的碎片沉到管底而将含有游离的胰岛细胞的上清液移走，并立即转移到含有完全组 织培养基的试管中，然后使之置于冰上。向沉淀中加入另外的4ml胰蛋白酶溶液， 且该过程重复三次。每次都收集上清液并用完全培养基对其稀释。最后，含有上清 液的试管在600g于4℃离心5分钟。弃去上清液并将细胞重悬浮于完全的组织培 养基中并计数。存活时，由台盼蓝排除法估测，为大约95％。如图10所示，过夜 培养后虽然仍有一些聚集发生，但与啮齿动物的或人的分散的胰岛细胞相比，分散 的BB细胞重新聚集成细胞团或链的趋势较小。虽然固定于血浆凝块中的单细胞悬 液被移植到患糖尿病的裸鼠的肾囊下时产生正常的血糖，但数据提示单细胞的制备 物在活体内所起的作用不如BB碎片—可能是因为细胞—细胞间的联系减少了 (26)。

另一种制备单细胞的方法，通过推动BB碎片使之连续地通过无菌的不锈钢#60 网眼(孔大小为230μm)滤器，接着通过无菌的#80网眼(孔大小为190μm)滤器可 简单地制备哺乳动物胰岛大小的BBs(微-BBs)。应用过量的培养基对两种滤器仔细 洗涤。应将所有的过滤物收集到塑料平皿中并过夜培养。因为BBs由几乎是纯的 外分泌细胞组织并具有最少的结缔组织基质，因此几次洗涤后在滤器上应几乎不会 残留组织。虽然当用倒置显微镜检查平皿时，“微BBs”最初显得凸凹不平，但 过夜培养后它们变得很圆且显得与培养的哺乳动物胰岛很相似。培养后，可用巴斯 德吸管手工挑选“微BBs”并在层流工作台上安置的解剖显微镜下边观察边计数 看来”微Bbs”比单细胞的作用要好些，因为一些细胞-细胞间的联系保持完整。不 像BB碎片，“微BBs”很小，足以使它们可被定点移植而不是移植于肾囊之下。 另外，可很容易地将BBs分开，然后培养之，这样会产生类似的哺乳动物胰岛大 小的BBs。我们以该方式制备的微-BBs可被成功地移植到患糖尿病的试验裸鼠内 并产生长期的血糖量正常。

移植到人体中

本自本发明转基因鱼的BBs，一旦其特征被分析后，就可收获之、胶囊化之、 并将之手术移植到糖尿病患者体内。根据本领域已知的对胰岛细胞胶囊化的技术使 BBs囊化(27-29)。我们此前已经表明来自作-转基因tilapia的微胶囊化的BBs腹膜 内移植到小鼠内后，将提供长期的血糖量正常及哺乳动物样的葡萄糖耐受图(30)。

使研究各种各样的人选胰腺技术的研究者们烦恼的一个难题是囊化后由于胰岛 中心的低氧而导致的中心次级坏死使最初的胰岛体积的大部分丢失了。在胶囊化方 面鱼胰岛组织很可能比哺乳动物的胰岛组织优越，因为鱼组织，包括胰岛，可耐受 较低的氧张力(31)。尽管转基因鱼胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌比人的胰岛的葡 萄糖刺激的分泌的效率低些或稍慢，但它们因具有许多鱼胰岛和很少量的人胰岛而 仍可能证明对人造胰腺十分有用；可以想像鱼胰岛可提供大量的胰岛素产量而人胰 岛可“精细调谐”胰岛素应答，就象短效和长效的胰岛素被混合在一起而使糖尿病 的胰岛素治疗最佳。

本文描述的转基因鱼胰岛代表了产胰岛素的人胰岛组织的几乎是无限的供应 源，该供应源不需要昂贵酶的胰岛分离步骤。由于我们已经表明tilapiaBBs可在液 氮内冷保藏(用冷保藏哺乳动物胰岛的标准技术)、解冻、然后移植到患糖尿病的 裸鼠体内以证实胰岛的功能，所以这些胰岛的用途很可能进一步地增加。这样使转 基因胰岛的运输和长期贮存变得容易。 本发明的其它应用

如上所详细描述的，本发明的转基因鱼可用于提供治疗糖尿病的大量的人源化 胰岛素。这是通过人源化的tilapia胰岛素基因的同源重组而发生的。然而，如果发 生非-同源重组，转基因鱼可同时表达人的和鱼的胰岛素基因。这样的鱼可用于水 产养殖，因为表达两种基因(或多个拷贝的人基因)的鱼证明具有增强的生长潜势。

本领域的技术人员很容易认识到在不背离本发明范围和精神的前提下可对本发 明做各种修改。修改，包括基本上不影响胰岛素产物在人体内的生物活性或免疫源 性的对人源化的胰岛素基因序列的修饰或取代的修改也在本发明的范围之内。

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序列表 (1)一般信息：   (I)申请人：

(A)名称：达尔豪榭大学

(B)街道：技术转移办公室大街

(C)城市：哈利法克斯

(D)省：新斯科舍省

(E)国家：加拿大

(F)邮编：B3H3J5

(G)电话：902-494-1648

(H)电传：902-494-5189   (II)发明名称：治疗糖尿病的转基因鱼   (III)序列数：7   (IV)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PATENT In Release#1.0，#1.30版本(欧专局)   (VI)在先申请数据：

(A)申请号：US08/417,866

(B)申请日：1995年4月6日 (2)SEQ.ID NO：1的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：21个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：肽   (V)片段类型：N-末端   (VI)来源：

(A)生物：tilapia胰岛素A链   (XI)SEQ ID NO：1的序列描述 Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys His Lys Pro Cys Thr Ile Phe Asp Leu 1               5                   10                  15 Gln Asn Tyr Cys Asn

        20 (2)SEQ.ID NO：2的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：30个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：肽   (VI)来源：

(A)生物：tilapia胰岛素B链   (XI)SEQ ID NO：2的序列描述 Val Gly Gly Pro Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu val Asp Ala Leu 1               5                   10                  15 Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Phe Tyr Asn Pro Arg

        20                  25                  30 (2)SEQ.ID NO：3的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：21个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：肽 (VI)来源：

(A)生物：人胰岛素A链   (XI)SEQ ID NO：3的序列描述 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1               5                   10                  15 Glu Asn Tyr Cys Asn

        20 (2)SEQ.ID NO：4的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：30个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：肽   (VI)来源：

(A)生物：人胰岛素B链   (XI)SEQ ID NO：4的序列描述 Phe val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1               5                   10                  15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

        20                  25                  30 (2)SEQ.ID NO：5的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：2078对碱基

(B)类型：梭酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：DNA(基因组的)   (VI)来源：

(A)生物：telapia胰岛素基因   (XI)SEQ ID NO：5的序列描述 GTCCCCATAA TCGCACACAA GTCCCCACAA TGTAGGTGAA ATAGGTTCCA CGGAAACACG      60 TGGAACAGGG GGTGTGTCCA GGTGGTGCTG GTGGAGTATA AATGGAGAGA AGGCTCTTGG     120 TTCTGCCTCA CACAGAAAAG CTGCTCCTGC CCTTCATCTC AGAGTTACCT CCTCCTCTCT     180 GTCTGTGCAG GTGAGTGCTG GCTGTAGGTT TGGTTGTGAG GACAGTGACT GTGATGCTAA     240 CGTGAATGTG CTTTTGTGTT CAGCTCTTTT CCAGCATGGC AGCGCTCTGG CTCCAGGCCT     300 TCTCCCTGCT CGTCTTAATG ATGGTTTCGT GGCCGGGCTC CCAGGCCGTC GGTGGGCCAC     360 AGCACCTGTG CGGCTCCCAC CTGGTGGATG CCCTGTACCT GGTCTGTGGG GACAGAGGCT     420 TCTTCTACAA CCCCAGGAGA GATGTGGACC CTCTGCTTGG TGAGACCACC AACCACAAAC      480 AGAAACACTA GACAAACTAT TTGAGGGCAG CTTTTCTTTC TCTGAGTTCA CTTTAAATCA      540 GCTTTCATGT TGGAAACATG GTAATAGTAA TTTTCCATAT CTTTATGGAC CCTACATGAT      600 TAGTTTACAT CTATTGCCAT TTGTCTCAAC ACCTGCATCA TATAATAGCG CTGATTTTGT      660 AACACTTTGT GTTAGAATTA GTAATTTATG TTCTAATAAT GTTTGATATG TATTCTTTAA      720 TATAAATGAC CAGAATTTTT AGATCTGAAC ATTCACCTGC TCTTCATCCC ATCAGGTTTC      780 CTCCCTCCAA AGGCAGGTGG TGCTGTGGTG CAAGGTGGTG AGAATGAAGT GACCTTCAAA      840 GACCAGATGG AAATGATGGT GAAGCGAGGC ATTGTGGAGG AATGCTGTCA CAAACCCTGT      900 ACCATCTTCG ACCTGCAGAA CTACTGCAAC TGAACTGCTC TGCTGGACTT TGTTTAGTCG      960 AGCCAGGCTC GGCTATTCAG GTCTGAGTCC CAGCCCCACC TCGCTCCCTG CTTCAGAGGA     1020 GAGCCACAGC TGTCCTCTCT CTGAAAACCA ACTGCTGTCA AATGAAGTGC TGAGAAATGG     1080 ATAAAATTAA TTTTCCAAGA AATAAAAATG CAAAATGTGA CAACGTGAGG CAAAAAAGTG     1140 TGTTCTTTTG TTGTGATGAA TTCAGTTAAT TGATTAAAGT GAAAACTCGA ACATGTTAGG     1200 TACCTGCTGC TATCCAGCAC AAACTGCTGA GCTTTCACTT TCCAAAGCTT TGTGTTTAGC     1260 TTATAGTGTC TCTGAACAGG ATATAAACAC ATCATGCACT CTGACATGAT GTCCTTTTCA     1320 AACAATCCCT TGTCATCTTC ATTTCAGCAG GTCAGTGTTT TTTATTCAGG TCCTCGTGAT     1380 GACACAGAAG ATAAAAACAC CAAGTATTCT AAAAATTATC AAATTGAATT TTAAGTTCAA     1440 AAGCATTCTT CCATCACAGT CAACAGAACC CCAAGACCTG AAGTTCCAAA GGCCTGTGGT     1500 GTTACCACTA TGCTATCTAC ATATGTTACC TGCTTTTAAC TATTAAACGG AGCAGATGGA     1560 TCAGAAGGTT AATAGCTGAT CAGATCATGT CAGCTCATTA GCTTCAGTTT GTTTTACTGA     1620 GTGCTGTAAC CACTCAATCA GAAACACACT GTTACTTAAT CTGAGTACAT ACTTGTATAC     1680 ATTAAACTTG GAAAAAGATA GATGTGAAAT GTAAAAGTGA GGTCAATCGT CAAATGTGAC     1740 ACGATATTTG GATCTGTTTA TCCTTCCAGG ATCACGGGGC GGGGAGAGCC TATCCCAGCT     1800 ACCATAGTGC GAGAGGTCAG GTACACCCTG GACAGGTCAA CAGCCTGTCA CAGGGTTTAC     1860 GCTCAGAGAC AAGCAACCAC GCCACTTCGG CTTATACCAG TATTATTTCC TAAATGTTGC     1920 CAATAAAAAA CAAAATCAGT AGAATTTTAA GCAGTTTTCA TTTTAATTTA ACCTCATTTG     1980 AAGAAGAAGT CAGAGGTCCA AAGTATGGGA ATATTTATAA TTCCAATGTT GTCAATTCAA     2040 ATAATGGCAA TAAGAAACAT AGTTTGAAAT AGAATAAG                             2078 (2)SEQ.ID NO：6的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：2072对碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状   (II)分子类型：DNA(基因组的)   (VI)来源：

(A)生物：人源化的tilapia胰岛素NO.1   (XI)SEQ ID NO：6的序列描述 GTCCCCATAA TCGCACACAA GTCCCCACAA TGTAGGTGAA ATAGGTTCCA CGGAAACACG     60 TGGAACAGGG GGTGTGTCCA GGTGGTGCTG GTGGAGTATA AATGGAGAGA AGGCTCTTGG    120 TCTTGCCTCA CACAGAAAAG CTGCTCCTGC CCTTCATCTC AGAGTTACCT CCTCCTCTCT    180 GTCTGTGCAG GTGAGTGCTG GCTGTAGGTT TGGTTGTGAG GACAGTGACT GTGATGCTAA    240 CGTGAATGTG CTTTTGTGTT CAGCTCTTTT CCAGCATGGC AGCGCTCTGG CTCCAGGCCT    300 TCTCCCTGCT CGTCTTAATG ATGGTTTCGT GGCCGGGCTC CCAGGCCTTC GTGCAGCAGC    360 ACCTGTGCGG ATCCCACCTG GTGGAGGCCC TCTACCTGGT CTGTGGGGAG AGAGGCTTCT    420 TCTACACCCC CAAGAGAGAT GTGGACCCTC TGCTTGGTGA GACCACCAAC CACAAACACA    480 AACACTAGAC AAACTATTTG AGGGCAGCTT TTCTTTCTCT GAGTTCACTT TAAATCAGCT    540 TTCATGTTGG AAACATGGTA ATAGTAATTT TCCATATCTT TATGGACCCT ACATGATTAG    600 TTTACATCTA TTGCCATTTG TCTCAACACC TGCATCATAT AATAGCGCTG ATTTTGTAAC    660 ACTTTGTGTT AGAATTAGTA ATTTATGTTC TAATAATGTT TGATATGTAT TCTTTAATAT    720 AAATGACCAG AATTTTTAGA TCTGAACATT CACCTGCTCT TCATCCCATC AGGTTTCCTC       780 CCTCCAAAGG CAGGTGGTGC TGTGGTGCAA GGTGGTGAGA ATGAAGTGAC CTTCAAAGAC       840 CAGATGGAAA TGATGGTGAA GCGAGGCATT GTGGAGCAAT GCTGTACCTC CATTTGTTCC       900 CTGTACCAGC TGGAGAACTA CTGCAACTGA ACTGCTCTGC TGGACTTTGT TTAGTCGAGC       960 CAGGCTCGGC TATTCAGGTC TGAGTCCCAG CCCCACCTCG CTCCCTGCTT CAGAGGAGAG      1020 CCACAGCTGT CCTCTCTCTG AAAACCAACT GCTGTCAAAT GAAGTGCTGA GAAATGGATA      1080 AAATTAATTT TCCAAGAAAT AAAAATGCAA AATGTGACAA CGTGAGGCAA AAAAGTGTGT      1140 TCTTTTGTTG TGATGAATTC AGTTAATTGA TTAAAGTGAA AACTCGAACA TGTTAGGTAC      1200 CTGCTGCTAT CCAGCACAAA CTGCTGAGCT TTCACTTTCC AAAGCTTTGT GTTTAGCTTA      1260 TAGTGTCTCT GAACAGGATA TAAACACATC ATGCACTCTG ACATGATGTC CTTTTCAAAC      1320 AATCCCTTGT CATCTTCATT TCAGCAGGTC AGTGTTTTTT ATTCAGGTCC TCGTGATGAC      1380 ACAGAAGATA AAAACACCAA GTATTCTAAA AATTATCAAA TTGAATTTTA AGTTCAAAAG      1440 CATTCTTCCA TCACAGTCAA CAGAACCCCA AGACCTGAAG TTCCAAAGGC CTGTGGTGTT      1500 ACCACTATGC TATCTACATA TGTTACCTGC TTTTAACTAT TAAACGGAGC AGATGGATCA      1560 GAAGGTTAAT AGCTGATCAG ATCATGTCAG CTCATTAGCT TCAGTTTGTT TTACTGAGTG      1620 CTGTAACCAC TCAATCAGAA ACACACTGTT ACTTAATCTG AGTACATACT TGTATACATT      1680 AAACTTGGAA AAAGATAGAT GTGAAATGTA AAAGTGAGGT CAATCGTCAA ATGTGACACG      1740 ATATTTGGAT CTGTTTATCC TTCCAGGATC ACGGGGCGGG GAGAGCCTAT CCCAGCTACC      1800 ATAGTGCGAG AGGTCAGGTA CACCCTGGAC AGGTCAACAG CCTGTCACAG GGTTTACGCT      1860 CAGAGACAAG CAACCACGCC ACTTCGGCTT ATACCAGTAT TATTTCCTAA ATGTTGCCAA      1920 TAAAAAACAA AATCAGTAGA ATTTTAAGCA GTTTTCATTT TAATTTAACC TCATTTGAAG      1980 AAGAAGTCAG AGGTCCAAAG TATGGGAATA TTTATAATTC CAATGTTGTC AATTCAAATA      2040 ATGGCAATAA GAAACATAGT TTGAAATAGA AA                                    2072 (2)SEQ.ID NO：7的信息：   (I)序列特征：

(A)长度：2075对碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线状    (II)分子类型：DNA(基因组的)    (VI)来源：

(A)生物：人源化的tilapia胰岛素NO.2    (XI)SEQ ID NO：7的序列描述 GTCCCCATAA TCGCACACAA GTCCCCACAA TGTAGGTGAA ATAGGTTCCA CGGAAACACG       60 TGGAACAGGG GGTGTGTCCA GGTGGTGCTG GTGGAGTATA AATGGAGAGA AGGCTCTTGG      120 TTCTGCCTCA CACAGAAAAG CTGCTCCTGC CCTTCATCTC AGAGTTACCT CCTCCTCTCT      180 GTCTGTGCAG GTGAGTGCTG GCTGTAGGTT TGGTTGTGAG GACAGTGACT GTGATGCTAA      240 CGTGAATGTG CTTTTGTGTT CAGCTCTTTT CCAGCATGGC AGCGCTCTGG CTCCAGGCCT      300 TCTCCCTGCT CGTCTTAATG ATGGTTTCGT GGCCGGGCTC CCAGGCCTTC GTGCAGCAGC      360 ACCTGTGCGG ATCCCACCTG GTGGAGGCCC TGTACCTGGT CTGTGGGGAG AGAGGCTTCT      420 TCTACACCCC CAAGACCAGA GATGTGGACC CTCTGCTTGG TGAGACCACC AACCACAAAC      480 AGAAACACTA GACAAACTAT TTGAGGGCAG CTTTTCTTTC TCTGAGTTCA CTTTAAATCA      540 GCTTTCATGT TGGAAACATG GTAATAGTAA TTTTCCATAT CTTTATGGAC CCTACATGAT      600 TAGTTTACAT CTATTGCCAT TTGTCTCAAC ACCTGCATCA TATAATAGCG CTGATTTTGT      660 AACACTTTGT GTTAGAATTA GTAATTTATG TTCTAATAAT GTTTGATATG TATTCTTTAA      720 TATAAATGAC CAGAATTTTT AGATCTGAAC ATTCACCTGC TCTTCATCCC ATCAGGTTTC      780 CTCCCTCCAA AGGCAGGTGG TGCTGTGGTG CAAGGTGGTG AGAATGAAGT GACCTTCAAA      840 GACCAGATGG AAATGATGGT GAAGCGAGGC ATTGTGGAGC AATGCTGTAC CTCCATTTGT      900 TCCCTGTACC AGCTGGAGAA CTACTGCAAC TGAACTGCTC TGCTGGACTT TGTTTAGTCG      960 AGCCAGGCTC GGCTATTCAG GTCTGAGTCC CAGCCCCACC TCGCTCCCTG CTTCAGAGGA     1020 GAGCCACAGC TGTCCTCTCT CTGAAAACCA ACTGCTGTCA AATGAAGTGC TGAGAAATGG     1080 ATAAAATTAA TTTTCCAAGA AATAAAAATG CAAAATGTGA CAACGTGAGG CAAAAAAGTG     1140 TGTTCTTTTG TTGTGATGAA TTCAGTTAAT TGATTAAAGT GAAAACTCGA ACATGTTAGG     1200 TACCTGCTGC TATCCAGCAC AAACTGCTGA GCTTTCACTT TCCAAAGCTT TGTGTTTAGC     1260 TTATAGTGTC TCTGAACAGG ATATAAACAC ATCATGCACT CTGACATGAT GTCCTTTTCA     1320 AACAATCCCT TGTCATCTTC ATTTCAGCAG GTCAGTGTTT TTTATTCAGG TCCTCGTGAT     1380 GACACAGAAG ATAAAAACAC CAAGTATTCT AAAAATTATC AAATTGAATT TTAAGTTCAA     1440 AAGCATTCTT CCATCACAGT CAACAGAACC CCAAGACCTG AAGTTCCAAA GGCCTGTGGT     1500 GTTACCACTA TGCTATCTAC ATATGTTACC TGCTTTTAAC TATTAAACGG AGCAGATGCA     1560 TCAGAAGGTT AATAGCTGAT CAGATCATGT CAGCTCATTA GCTTCAGTTT GTTTTACTGA     1620 GTGCTGTAAC CACTCAATCA GAAACACACT GTTACTTAAT CTGAGTACAT ACTTGTATAC     1680 ATTAAACTTG GAAAAAGATA GATGTGAAAT GTAAAAGTGA GGTCAATCGT CAAATGTGAC     1740 ACGATATTTG GATCTGTTTA TCCTTCCAGG ATCACGGGGC GGGGAGAGCC TATCCCAGCT     1800 ACCATAGTGC GAGAGGTCAG GTACACCCTG GACAGGTCAA CAGCCTGTCA CAGGGTTTAC     1860 GCTCAGAGAC AAGCAACCAC GCCACTTCGG CTTATACCAG TATTATTTCC TAAATGTTGC     1920 CAATAAAAAA CAAAATCAGT AGAATTTTAA GCAGTTTTCA TTTTAATTTA ACCTCATTTG     1980 AAGAAGAAGT CAGAGGTCCA AAGTATGGGA ATATTTATAA TTCCAATGTT GTCAATTCAA     2040 ATAATGGCAA TAAGAAACAT AGTTTGAAAT AGAAT                                2075