基因治疗载体系统和药物前体基因
阅读：50发布：2020-05-12
专利汇可以提供基因治疗载体系统和药物前体基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种包含胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因和胞嘧啶脱 氨 酶(CD)基因的复制型逆转录病毒载体系统，其使基因转移至癌细胞组织以有效 治疗 癌症。具体地，本发明的HSV-TK/CD组合的自主复制型逆转录病毒载体系统的特征在于既包含HSV-TK基因又包含CD基因；无须担心失去治疗基因，因为在 病毒感染 期间在该系统中不会发生重组；并且具有优异的 稳定性 ，而且也能够通过使用药物前体GCV或5-FC诱导癌细胞死亡以及可以选择性地将治疗基因或其药物前体应用于对采用TK或CD的 癌症治疗 显示抗性的癌症，因此本发明的该系统可以具有优势地用作治疗癌症的药物组合物。，下面是基因治疗载体系统和药物前体基因专利的具体信息内容。
1.一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
2.一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的启动子来源于以下癌症特异性启动子之一：MCMV即时早期启动子、EF1α启动子、HCMV即时早期启动子、PGK启动子和hTERT启动子。
4.根据权利要求3所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的EF1α启动子是具有由SEQ.ID.NO:34表示的核苷酸序列的多核苷酸。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的病毒Env基因选自以下病毒的那些Env基因：长臂猿白血病病毒(GaLV)、兼嗜性MuLV、异嗜性MuLV、RD114、疱疹性口炎病毒(VSV)和麻疹病毒(MV)。
6.根据权利要求5所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的GaLV Env基因是具有由SEQ.ID.NO:35表示的核苷酸序列的多核苷酸。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的胸腺嘧啶核苷激酶基因是具有由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列的多核苷酸。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的胞嘧啶脱氨酶基因按人类密码子进行优化。
9.根据权利要求8所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的胞嘧啶脱氨酶基因是具有由SEQ.ID.NO:16、SEQ.ID.NO:17、SEQ.ID.NO:18、SEQ.ID.NO:19、SEQ.ID.NO:20、SEQ.ID.NO:21、SEQ.ID.NO:22、SEQ.ID.NO:23、SEQ.ID.NO:24、SEQ.ID.NO:25、SEQ.ID.NO:
26、SEQ.ID.NO:27、SEQ.ID.
NO:28、SEQ.ID.NO:29、SEQ.ID.NO:30、或SEQ.ID.NO:31表示的核苷酸序列的多核苷酸。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的胸腺嘧啶核苷激酶或胞嘧啶脱氨酶基因能够激活药物前体。
11.根据权利要求10所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的药物前体是选自以下药物的一种或多种药物：更昔洛韦和5-氟胞嘧啶。
12.根据权利要求1或权利要求2所述的复制型逆转录病毒载体系统，其中所述的MuLV Gag-Pol基因是具有融合核苷酸序列的多核苷酸，所述的融合核苷酸序列包含分别由SEQ.ID.NO:32和SEQ.ID.NO:33表示的两个序列。
13.一种重组逆转录病毒，包含如权利要求1或权利要求2所述的载体系统。
14.一种用权利要求13所述的重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
15.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如权利要求13所述的重组逆转录病毒作为活性成分。
16.根据权利要求15所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述的癌症选自：
粘液癌、圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性肿瘤、尤文肉瘤、癌转移、淋巴转移、鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤、胸腺淋巴瘤肺癌、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产促肾上腺皮质激素肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、与结肠直肠癌形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性表面膀胱肿瘤、浸润性转移性细胞膀胱癌、肌肉浸润性膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、食道癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、原发性腹膜瘤、宫颈癌、阴道癌、阴部癌、子宫癌、卵泡实体瘤、睾丸癌、阴茎癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、神经母细胞瘤、脑干胶质瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统转移性肿瘤细胞侵袭、骨瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、人皮肤角质细胞肿瘤发展、鳞状细胞癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、间皮瘤、维尔姆氏瘤、胆囊癌、滋养层肿瘤、血管周皮细胞瘤和卡波西氏肉瘤。
17.一种用于基因转移的组合物，其包含如权利要求13所述的重组逆转录病毒，用于治疗癌症。
18.一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：
1)制备包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及
2)制备包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
19.一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：
1)制备包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及
2)制备包含Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
20.一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：将权利要求13所述的重组逆转录病毒给予有需求的受试者。
21.如权利要求13所述的逆转录病毒在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
基因治疗载体系统和药物前体基因
技术领域
背景技术
[0002] 基因疗法是一个通用术语，指通过用靶基因取代在患者细胞或组织中导致疾病的异常基因或者通过在其中插入有助于疾病治疗的靶基因来治疗疾病的技术。在基因治疗产品的早期发展阶段，基因治疗的主要原则是通过将外源DNA插入靶细胞染色体来诱导特异基因表达。但是，目前的基因治疗包括通过使用反义寡脱氧核苷酸或siRNA，利用反义来抑制与特定疾病相关的基因表达的方法。
[0003] 上述基因疗法采取与传统治疗方法完全不同的路径，因此可以在分子水平上研究疾病的病因以得到更好的治疗。这种方法还有利于减少在其他治疗方法中经常观察到的不必要的副作用，因为其核苷酸序列的特异性作用可以消除与主要疾病相关的因素。只要用于调控表达水平的靶基因的核苷酸序列得到鉴定，如上所述的这种靶向基因的方法在药物生产过程中就不需要单独的优化步骤，这表明其生产过程比抗体或复合药物的生产过程更简单。此外，一旦引起疾病的基因得到鉴定，该方法可以靶向其他方法不能将其作为治疗对象的任何疾病，这说明基因疗法具有充分的潜力成为下一代治疗剂。大量研究证实，采用基因治疗有可能增加用传统药物治疗方法难以治疗的绝症、癌症、艾滋病、遗传性疾病和神经系统疾病的成功治疗机会，因此基因治疗现正应用于实际的临床试验(YOUNG等人，2006)。
[0004] 基因药物由基因转移载体和治疗基因组成。作为在体内运送基因的工具，基因转移载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体是通过去除大部分或一部分必需基因而不是在其中插入治疗基因，从而使病毒不可复制来制备的(Lotze MT等人，癌症基因治疗，9：692-699，2002)。病毒载体可以高效地运送基因，但存在一些问题：难以根据病毒类型进行批量生产、引起免疫反应、毒性或引入可复制病毒等。用于开发基因药物的主要病毒载体的例子有：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒和痘病毒等。
同时，非病毒载体不引起免疫反应、毒性低、并易于批量生产，但在运送基因方面效率不高，只能诱导临时基因表达。
同时，非病毒载体不引起免疫反应、毒性低、并易于批量生产，但在运送基因方面效率不高，只能诱导临时基因表达。
[0005] 在临床试验领域最常用的病毒载体之一是逆转录病毒载体，其于1990年首次用于由NIH进行的第一次基因治疗临床试验中。该载体被认为是用于稳定基因插入的最有用的载体。基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒载体广泛应用于基因治疗的各种临床试验中。
[0006] 自主复制缺陷的非复制型逆转录病毒适用于插入较大的基因。其滴度为106～107pfu/ml，因此用这种载体感染靶细胞没有大的问题。此外，包装细胞系已经建立，这表明这种载体的制备是容易的。另外，逆转录病毒载体可以通过在逆转录病毒质粒中插入治疗基因来扩大规模，采用其感染包装细胞系以生成重组病毒，并用生成的重组病毒感染靶细胞。然而，在逆转录病毒整合到染色体的过程中有发生突变的可能性。
[0007] 自主复制型逆转录病毒载体在增殖细胞如癌细胞中的基因组稳定性一直是个问题。此外，可以插入自主复制型病毒载体进行基因治疗的外源基因的大小限制在1.3kb以内，这表明各种治疗基因的插入并不容易(病毒学杂志，第75卷，6989-6998，2001)。
[0008] 可用于基因治疗的治疗基因的例子有：通过使用药物前体如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶或胞嘧啶脱氨酶诱导癌细胞凋亡的基因；加速免疫反应的细胞因子基因，如白细胞介素-12或GM-CSF等；以及肿瘤特异性抗原基因，如CEA或Her-2等(Gottesman MM，癌症基因治疗，10:501-508，2003)。自杀基因在运送入癌细胞时会杀死癌细胞。细胞因子基因或肿瘤特异性抗原基因通过激活抗癌症的免疫反应来攻击癌细胞。
[0009] 最近，有关对恶性肿瘤展现选择性抗肿瘤作用的酶/药物前体的合成技术的研究一直很活跃。当自杀基因在癌组织中表达且其前体在体内被全身给药时，它在正常细胞中不会引起毒性，而仅在那些表达治疗基因的肿瘤细胞中，前体会转化为毒性物质，以杀死肿瘤细胞。
[0010] 最常用的自杀基因之一是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)。对细胞无害的药物前体更昔洛韦(GCV)通过酶反应转化为细胞毒性物质时，它产生旁观者效应，不仅可以诱导包含自杀基因的细胞凋亡，还可以通过间隙连接诱导相邻细胞凋亡。目前，该基因的效果和稳定性到第3期临床试验为止已得到证实(人类基因治疗，4：725-731，1993；分子治疗，1：195-203，2000)。
[0011] 另一种自杀基因是胞嘧啶脱氨酶(CD)，其诱导5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨以生成强效抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU代谢成5-氟尿苷三磷酸(5-FUTP)和5-氟脱氧尿苷单磷酸(5-FdUMP)。与核糖核酸融合的5-FUTP阻断了核糖体核糖核酸和信使核糖核酸的合成。同时，5-FdUMP不可逆地抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，导致DNA合成的抑制。因此，通过在表达TK或CD的肿瘤细胞中将诸如GCV和5-FC的药物前体转化为毒性代谢物，可以选择性地杀死肿瘤细胞。
[0012] 同时使用超过两种的不同的治疗基因进行基因治疗在疾病治疗中是更有效的，特别是在治疗对用于基因治疗的特异基因显示抗性的疾病时。关于这样的技术，能够在癌组织中同时表达TK和CD的基因治疗载体系统是非常有优势的，特别是对于那些报告对TK和CD治疗有抗性的癌症的治疗。然而，当将HSV-TK和CD都插入复制型逆转录病毒载体(RRV)时，基因组大小变为10kb或更大，这表明在单个逆转录病毒载体中同时插入这两个基因实际上是不可能的。当复制型逆转录病毒载体用于基因治疗时，除了其原有内源基因组RNA，它还必须包含一个外源基因，因此基因组RNA的大小变得更大，而且因为其中导入额外的异源核苷酸序列所引起的重组，治疗基因丢失的可能性很高，这使得载体系统的构建变得困难。
[0013] 本发明人尝试开发一种不会发生重组的用于基因治疗的安全的病毒载体系统。结果，本发明人开发出一种TK/CD组合的自主复制型逆转录病毒载体系统，其既包含HSV-TK基因又包含CD基因，具有优异的稳定性，无须担心重组引起的基因缺失。本发明人证实，所述载体可以通过使用药物前体GCV或5-FC诱导癌细胞死亡，并通过选择适合的治疗基因及其药物前体，选择性地应用于对TK或CD表现抗性的特定癌症的治疗。本发明人通过证实所述载体由此可用作预防或治疗癌症的药物组合物，进一步完成了本发明。
发明内容
[0014] 技术问题
[0015] 本发明的一个目的是提供一种包含胸腺嘧啶核苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因的复制型逆转录病毒载体系统，用于治疗癌症。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种包含逆转录病毒载体系统的重组逆转录病毒和一种用上述重组逆转录病毒感染的宿主细胞。
[0017] 本发明的又一个目的是提供一种包含上述重组逆转录病毒的用于治疗癌症的药物组合物和一种包含上述重组逆转录病毒的用于基因转移的组合物。
[0018] 本发明的再一个目的是提供一种制备上述复制型逆转录病毒系统的方法。
[0019] 技术方案
[0020] 为了实现上述目的，本发明提供一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
[0021] 本发明还提供一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
[0022] 本发明还提供一种包含载体系统的重组逆转录病毒。
[0023] 本发明还提供一种用上述重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
[0024] 本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含重组逆转录病毒作为活性成分。
[0025] 本发明还提供一种用于基因转移的组合物，其包含上述重组逆转录病毒，用于治疗癌症。
[0026] 本发明还提供一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：制备包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及制备包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
[0027] 本发明还提供一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：制备包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及制备包含Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
[0028] 本发明还提供一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：将上述重组逆转录病毒给予有需求的受试者。
[0029] 此外，本发明提供上述逆转录病毒在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
[0030] 有益效果
[0031] 本发明的TK/CD组合的自主复制型逆转录病毒载体系统既包含HSV-TK基因又包含CD基因，无须担心在病毒感染过程中由于重组而失去治疗基因；具有优异的稳定性，并且也能够通过使用药物前体GCV或5-FC诱导癌细胞死亡以及可以选择性地将治疗基因或其药物前体应用于对采用TK或CD的癌症治疗显示抗性的癌症，因此本发明的该系统可以具有优势地用作治疗癌症的药物组合物。
[0033] 本发明的优选实施方式的应用可以参照以下附图得到最好的理解。其中：
[0034] 图1a是说明spRRVe-P1-TK和sRRVgp-P1-RFP的结构的示意图。
[0035] 图1b是说明sRRVgp-P1-TK和spRRVe-P1-GFP的结构的示意图。
[0036] 图2a是说明spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP和sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP的病毒滴度的图示。
[0037] 图2b是spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP和sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP的病毒滴度的图示的延续。
[0038] 图3a是说明spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP病毒载体中是否发生重组的图示。
[0039] 图3b是说明sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP病毒载体中是否发生重组的图示。
[0040] 图4是说明spRRVe-P1-TK载体的重组模式的分析的图示。
[0041] 图5是说明spRRVe-P1-yCD和sRRVgp-P1-RFP的结构的示意图。
[0042] 图6是说明spRRVe-P1-yCD和sRRVgp-P1-RFP中是否发生重组的图示。
[0043] 图7是说明spRRVe-P1-yCD载体的重组模式的分析的图示。
[0044] 图8是说明spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK载体的结构的示意图。
[0045] 图9是说明spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK载体中是否发生重组的图示。
[0046] 图10是说明spRRVe-P1-yCD载体的重组模式的分析的图示。
[0047] 图11是说明sRRVgp-P1-TK载体的重组模式的分析的图示。
[0048] 图12是说明spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK的药物敏感性的图片。
[0049] 图13是说明spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb和spRRVe-P1-CDc的结构的示意图。
[0050] 图14是说明spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb和spRRVe-P1-CDc载体中是否发生重组的图示。
[0051] 图15是说明spRRVe-P1-CDa载体的重组模式的分析的图示。
[0052] 图16是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和spRRVe-P1-CD9的结构的示意图。
[0053] 图17a是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和sp1RVe-P1-CD9在p1阶段的药物敏感性的图片。
[0054] 图17b是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和spRRVe-P1-CD9在p2阶段的药物敏感性的图片。
[0055] 图17c是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和spRRVe-P1-CD9在p3阶段的药物敏感性的图片。
[0056] 图17d是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和spRRVe-P1-CD9在p4阶段的药物敏感性的图片。
[0057] 图18是说明spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7、spRRVe-P1-CD8和spRRVe-P1-CD9载体中是否发生重组的图示。
[0058] 图19a是说明spRRVe-P1-CD6载体的重组模式的分析的图示。
[0059] 图19b是说明spRRVe-P1-CD6载体的重组模式的分析的图示的延续。
[0060] 图20a是说明spRRVe-P1-CD8载体的重组模式的分析的图示。
[0061] 图20b是说明spRRVe-P1-CD8载体的重组模式的分析的图示的延续。
[0062] 图21是说明spRRVe-P2-yCD、spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9的结构的示意图。
[0063] 图22a是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p1阶段的药物敏感性的图片。
[0064] 图22b是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p3阶段的药物敏感性的图片。
[0065] 图22c是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p5阶段的药物敏感性的图片。
[0066] 图22d是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p7阶段的药物敏感性的图片。
[0067] 图22e是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p8阶段的药物敏感性的图片。
[0068] 图22f是说明spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8和spRRVe-P2-CD9在p9阶段的药物敏感性的图片。
[0069] 图23是说明spRRVe-P2-yCD、spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7、spRRVe-P2-CD8、spRRVe-P2-CD9和sRRVgp-P1-TK中是否发生重组的图示。
[0070] 图24是说明sRRVgp-P1-TK载体的重组模式的分析的图示。
[0071] 图25是说明sRRVgp-P2-TK载体的结构的示意图。
[0072] 图26a说明spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8在p1和p3阶段的药物敏感性的图片。
[0073] 图26b说明spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8在p5和p7阶段的药物敏感性的图片。
[0074] 图26c是spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8在p9和p11阶段的药物敏感性的图片。
[0075] 图27a是说明通过使用MuLV4194F和MFGSac IR引物确认的spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7或spRRVe-P2-CD8/sRRVgp-P2-TK中是否发生重组的图示。
[0076] 图27b是说明通过使用GaLV1624F和MFGSac IR引物确认的spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7或spRRVe-P2-CD8/sRRVgp-P2-TK载体中是否发生重组的图示。
[0077] 图28a是说明spRRVe-P2-CD6载体的重组模式的分析的图示。
[0078] 图28b是说明spRRVe-P2-CD6载体的重组模式的分析的图示的延续。
[0079] 图29a是说明spRRVe-P2-CD8载体的重组模式的分析的图示。
[0080] 图29b是说明spRRVe-P2-CD8载体的重组模式的分析的图示的延续。
[0081] 图30a是说明spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD10、spRRVe-P2-CD11、spRRVe-P2-CD12、spRRVe-P2-CD13、spRRVe-P2-CD14、spRRVe-P2-CD15或sp1RVe-P2-CD16在p1阶段的药物敏感性的图片。
[0082] 图30b是说明spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD10、spRRVe-P2-CD11、spRRVe-P2-CD12、spRRVe-P2-CD13、spRRVe-P2-CD14、spRRVe-P2-CD15或spRRVe-P2-CD16在p3阶段的药物敏感性的图片。
[0083] 图30c是说明spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD10、spRRVe-P2-CD11、spRRVe-P2-CD12、spRRVe-P2-CD13、spRRVe-P2-CD14、spRRVe-P2-CD15或spRRVe-P2-CD16在p5阶段的药物敏感性的图片。
[0084] 图31是说明sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7和sRRVgp-P2-CD8的结构的示意图。
[0085] 图32是说明spRRVe-P2-TK的结构的示意图。
[0086] 图33a是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表。
[0087] 图33b是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0088] 图33c是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0089] 图33d是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0090] 图33e是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0091] 图33f是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0092] 图33g是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0093] 图33h是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0094] 图33i是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0095] 图33j是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0096] 图33k是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0097] 图33l是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0098] 图33m是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0099] 图33n是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0100] 图33o是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0101] 图33p是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0102] 图33q是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0103] 图33r是说明spRRVe-P2-TK载体的序列的图表的延续。
[0104] 图34是说明sRRVgp-P2-CD6载体的结构的示意图。
[0105] 图35a是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表。
[0106] 图35b是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0107] 图35c是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0108] 图35d是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0109] 图35e是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0110] 图35f是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0111] 图35g是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0112] 图35h是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0113] 图35i是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0114] 图35j是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0115] 图35k是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0116] 图35l是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0117] 图35m是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0118] 图35n是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0119] 图35o是说明sRRVgp-P2-CD6载体的序列的图表的延续。
[0120] 图36a是说明通过使用GaLV1624F和MFGSac IR引物确认的spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8中是否发生重组的图示。
[0121] 图36b是使用MuLV4194F或MuLV7130F和MFGSac IR引物确认的spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8中是否发生重组的图示。
[0122] 图37a是说明spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8在p1和p2阶段的药物敏感性的图片。
[0123] 图37b是说明spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8在p3和p4阶段的药物敏感性的图片。
[0124] 图37c是说明spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8在p5、p6和p7阶段的药物敏感性的图片。
[0125] 优选实施方式的描述
[0126] 在下文中，更详细地描述本发明。
[0127] 本发明提供一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
[0128] 本文中的胸腺嘧啶核苷激酶基因可以是由SEQ.ID.NO:15表示的核苷酸序列所组成的多核苷酸。上述多核苷酸不仅是编码胸腺嘧啶核苷激酶的氨基酸序列的多核苷酸，而且是具有与所述的多核苷酸及其片段实质上相同的核苷酸序列的多核苷酸。由与上述相同的核苷酸序列所组成的多核苷酸与本发明的多核苷酸可以具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的同源性。如上所述，只要该多核苷酸可以编码具有与上述相同活性的蛋白质，本发明的多核苷酸可以在序列中具有一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入。
[0129] 上述胞嘧啶脱氨酶基因可以按人类密码子优化。
[0131] 胞嘧啶脱氨酶基因可以选自由以下序列分别组成的那些多核苷酸：由SEQ.ID.NO:16表示的序列、由SEQ.ID.NO:17表示的序列、由SEQ.ID.NO:18表示的序列、由SEQ.ID.NO:19表示的序列、由SEQ.ID.NO:20表示的序列、由SEQ.ID.NO:21表示的序列、由SEQ.ID.NO:22表示的序列、由SEQ.ID.NO:23表示的序列、由SEQ.ID.NO:24表示的序列、由SEQ.ID.NO:25表示的序列、由SEQ.ID.NO:26表示的序列、由SEQ.ID.NO:27表示的序列、由SEQ.ID.NO:28表示的序列、由SEQ.ID.NO:29表示的序列、由SEQ.ID.NO:30表示的序列、和由SEQ.ID.NO:31表示的序列。多核苷酸可包括具有与上述相同特征的变体。
[0132] 胸腺嘧啶核苷激酶基因或胞嘧啶脱氨酶基因可以激活药物前体。药物前体可以选自以下药物中的一种或多种：更昔洛韦和5-氟胞嘧啶。在本发明的一个优选的实施方式中，胸腺嘧啶核苷激酶基因可以激活更昔洛韦，胞嘧啶脱氨酶基因可以激活5-氟胞嘧啶。
[0133] 所述Gag基因可以是编码形成逆转录病毒核心的四种蛋白质的多核苷酸。同时，Pol基因可以是编码逆转录病毒逆转录酶的多核苷酸，并且Env基因可以是编码逆转录病毒包膜糖蛋白的多核苷酸。
[0134] 所述MuLV-Gag基因是鼠白血病病毒的Gag基因，其可以是由SEQ.ID.NO:32表示的核苷酸序列所组成的多核苷酸。所述MuLV-Pol基因是鼠白血病病毒的Pol基因，其可以是由SEQ.ID.NO:33表示的核苷酸序列所组成的多核苷酸。MuLV Gag-Pol基因可以是由融合序列组成的多核苷酸，该融合序列包含由SEQ.ID.No.32表示的核苷酸序列和由SEQ.ID.NO:33表示的核苷酸序列。
[0135] 上述启动子可以是来源于诸如MCMV即时早期启动子、EF1α启动子、HCMV即时早期启动子、PGK启动子和hTERT启动子的癌症特异性启动子的启动子之一。在本文中，所述的EF1α启动子可以是由SEQ.ID.NO:34表示的核苷酸序列所组成的多核苷酸。
[0136] 所述的Env基因可以选自：长臂猿白血病病毒(GaLV)、兼嗜性MuLV、异嗜性MuLV、RD114、疱疹性口炎病毒(VSV)和麻疹病毒(MV)。长臂猿白血病病毒的Env基因可以是由SEQ.ID.NO:35表示的核苷酸序列所组成的多核苷酸。所述多核苷酸可以包括具有与上述相同特征的变体。
[0137] 在本发明中，术语“复制型/可复制”是指病毒载体可以在导入了包含特异基因的病毒基因组的细胞中或者被包含特异基因的动物细胞或病毒载体感染的细胞中自主复制。
[0138] 在本发明中，术语“复制型逆转录病毒载体”是指生产非裂解病毒的载体。载体可以特异性地感染增殖细胞，即癌细胞，因为它可以在核被膜破裂时侵入细胞核，从而可以防止插入的外源基因在其他正常细胞中表达。因此，该载体可以将靶基因安全地运送到癌细胞中，并且也进行复制以提高基因转移的效率。
[0139] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以便在每个载体中分别地表达它们。本发明人在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人进一步在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人最后证实，在那些载体中没有发生重组(参见图36a和36b)。
[0140] 本发明还提供一种复制型逆转录病毒载体系统，包括：包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及包含病毒Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
[0141] 所述载体系统具有上面解释的特征。例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因可以激活药物前体更昔洛韦，胞嘧啶脱氨酶基因可以激活药物前体5-氟胞嘧啶。
[0142] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以便在每个载体中分别地表达它们。本发明人在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。本发明人进一步在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图25)。
[0143] 本发明还提供一种包含上述载体系统的重组逆转录病毒。
[0144] 该载体系统可以具有上述的特征。
[0145] 上述重组逆转录病毒可以由第一重组表达载体和第二重组表达载体来制备，第一重组表达载体包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，第二重组表达载体包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。此时，第一重组表达载体和第二重组表达载体可以独立地或一起包含于重组逆转录病毒中。
[0146] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以便在每个载体中分别地表达它们，并在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还用所述载体制备了病毒。
[0147] 本发明还提供一种用所述重组逆转录病毒转染的宿主细胞。
[0148] 上述载体系统可以具有上述的特征。
[0149] 本文中的宿主细胞可选自：NS/0骨髓瘤细胞、人293T细胞、CHO细胞、HeLa细胞、CapT细胞(人羊水源细胞)、COS细胞、犬D17细胞和猫PG4细胞。在本发明的一个优选的实施方式中，宿主细胞可以是人293T。
[0150] 所述的转染可以用本领域技术人员熟知的常规方法之一来进行，例如脂质体转染法、显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖处理和基因轰击。在本发明的一个优选的实施方式中，转染通过脂质体转染法来完成。
[0151] 转染的细胞在通常用于动物细胞培养的常规培养基中培养。上述培养基可以是选自以下培养基的一种或多种：低限量Eagle培养基(MEM)、α-MEM、Iscove的MEM、199培养基、CMRL 1066、RPMI 1640、F12、F10、DMEM、DMEM/F12组合培养基、Way-mouth的MB752/1、McCoy的5A和MCDB系列培养基。在本发明的一个优选的实施方式中，培养基是DMEM。
[0152] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们。本发明人在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人最后证实，在那些载体中没有发生重组(参见图36a和36b)。
[0153] 本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述重组逆转录病毒作为活性成分。
[0154] 上述重组逆转录病毒可以由第一重组表达载体和第二重组表达载体来制备，第一重组表达载体包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，第二重组表达载体包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。此时，第一重组表达载体和第二重组表达载体可以独立地或一起包含于重组逆转录病毒中。
[0155] 上述逆转录病毒可以在增殖过程中靶向细胞，更准确地说靶向癌细胞。本文中的癌细胞可以包括源自以下之一的那些细胞：粘液癌、圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性肿瘤、尤文肉瘤、癌转移、淋巴转移、鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、口腔癌、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤、胸腺淋巴瘤肺癌、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产促肾上腺皮质激素肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、小细胞癌、导管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、与结肠直肠癌形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、原发性表面膀胱肿瘤、浸润性转移性细胞膀胱癌、肌肉浸润性膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、食道癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、原发性腹膜瘤、宫颈癌、阴道癌、阴部癌、子宫癌、卵泡实体瘤、睾丸癌、阴茎癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、神经母细胞瘤、脑干胶质瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统转移性肿瘤细胞侵袭、骨瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、人皮肤角质细胞肿瘤发展、鳞状细胞癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、间皮瘤、维尔姆氏瘤、胆囊癌、滋养层肿瘤、血管周皮细胞瘤和卡波西氏肉瘤。
[0156] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们，并在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还证实，所述载体对更昔洛韦和5-氟胞嘧啶具有优异的药物敏感性(参见图37a、37b和37c)。
[0157] 本发明的药物组合物优选地包含本发明的组合物，其作为药物组合物的活性成分，占药物组合物总重量的10-95wt％。本发明的组合物，除活性成分外，还可以包含一种或多种与活性成分具有相同或相似功能的有效成分。
[0158] 本发明的组合物可以包括任何通常使用的载体、稀释剂、赋形剂、或其中至少两种的组合。药学上可接受的载体可以是能够在活体内不受限制地运送本发明组合物的任何载体，例如在默克公司的默克索引第13版中描述的化合物，比如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡糖糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体和包含一种或多种这些组分的混合物。如果需要，可以另外添加通用的添加剂，比如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。
[0160] 本发明的组合物可以配制用于口服给药或用于非消化道给药。用于口服给药的制剂的例子有片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂和锭剂。用于口服给药的固体制剂通过混合一种或多种适合的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶等来制备。除了简单的赋形剂外，还可以加入润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉等。用于口服给药的液体制剂是悬浮液、溶液、乳浊液和糖浆，并且上述制剂可包含各种赋形剂如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
[0161] 用于非消化道给药的制剂可以包含注射液，如无菌水溶液、非水溶性赋形剂、悬浮液和乳浊液。
[0163] 本发明还提供一种用于基因转移的组合物，其包含上述重组逆转录病毒，用于治疗癌症。
[0164] 上述重组逆转录病毒可以由第一重组表达载体和第二重组表达载体制备，第一重组表达载体包含MuLVGag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，第二重组表达载体包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。此时，第一重组表达载体和第二重组表达载体可以独立地或一起包含于重组逆转录病毒中。
[0165] 本文中的癌症可以包括在上文中所描述的癌症。
[0166] 在本发明中，术语“用于基因转移的组合物”是指可以将基因运送到靶细胞中的组合物。
[0167] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们，并在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还证实，所述载体对更昔洛韦和5-氟胞嘧啶具有优异的药物敏感性(参见图37a、37b和37c)。
[0168] 本发明还提供一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：
[0169] 1)构建包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第一重组表达载体；以及
[0170] 2)构建包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第二重组表达载体。
[0171] 上述载体系统具有上述的特征。例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因可以激活药物前体更昔洛韦，胞嘧啶脱氨酶基因可以激活药物前体5-氟胞嘧啶。
[0172] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们。本发明人在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还证实，在那些载体中没有发生重组(参见图36a和36b)。
[0173] 本发明还提供了一种制备复制型逆转录病毒载体系统的方法，包括以下步骤：
[0174] 1)构建包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因的第一重组表达载体；以及
[0175] 2)构建包含病毒Env基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因的第二重组表达载体。
[0176] 上述载体系统具有上述的特征。例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因可以激活药物前体更昔洛韦，胞嘧啶脱氨酶基因可以激活药物前体5-氟胞嘧啶。
[0177] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们。本发明人在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图25)。
[0178] 本发明还提供一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：将上述重组逆转录病毒给予有需求的受试者。
[0179] 癌症可以具有上述的特征。受试者可以是哺乳动物，更具体地，可以是人。上述重组逆转录病毒可以由第一重组表达载体和第二重组表达载体制备，第一重组表达载体包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，第二重组表达载体包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。此时，第一重组表达载体和第二重组表达载体可以独立地或一起包含于重组逆转录病毒中。
[0180] 本发明的重组逆转录病毒可以根据给药目的通过口服给药或非消化道给药。此时，非消化道给药途径可选自：皮肤外用、腹膜内注射、直肠给药、皮下注射、静脉注射、肌肉注射或胸腔内注射。
[0181] 本发明的重组逆转录病毒优选地以有效剂量给药，有效剂量可以通过考虑疾病的类型、疾病严重程度、药物活性、药物敏感性、给药时期、给药途径、排泄率、疗程和联合治疗的其他药物来确定。本发明的组合物可以单独给药或与其他药物一起给药。如果需要联合治疗，给药可以分阶段或同时进行。
[0182] 为了获得更优选的效果，本发明的组合物中活性成分的浓度为0.001-10,000mg/kg，更优选地0.1-5g/kg。该组合物可以每天一次或每天数次给药。
[0183] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们，并在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还证实，所述载体对更昔洛韦和5-氟胞嘧啶具有优异的药物敏感性(参见图37a、37b和37c)。
[0184] 此外，本发明提供上述逆转录病毒在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
[0185] 癌症可以具有上述的特征。上述重组逆转录病毒可以由第一重组表达载体和第二重组表达载体制备，第一重组表达载体包含MuLV Gag-Pol基因、启动子和胞嘧啶脱氨酶基因，第二重组表达载体包含病毒Env基因、启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因。此时，第一重组表达载体和第二重组表达载体可以独立地或一起包含于重组逆转录病毒中。
[0186] 在本发明的一个优选的实施方式中，本发明人分离了MuLV-Gag基因和MuLV-Pol基因、以及GalV-EnV基因，以在每个载体中分别地表达它们，并在包含Gag基因和Pol基因的载体中克隆了P2启动子和胞嘧啶脱氨酶基因。本发明人还在包含Env基因的载体中克隆了P2启动子和胸腺嘧啶核苷激酶基因，从而构建复制型逆转录病毒载体(参见图31)。本发明人还证实，所述载体对更昔洛韦和5-氟胞嘧啶具有优异的药物敏感性(参见图37a、37b和37c)。
[0187] 本发明实用的和当前优选的实施方式在以下实例中予以展示说明。
[0189] 实施例1：仅包含单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因的复制型逆转录病毒载体系统的构建
[0190] <1-1>病毒载体构建
[0191] 在常规RRV载体中，gag基因、pol基因和MuLV-env基因合成为一个基因组。在本文中，本发明人分别在独立载体中诱导gag-pol和MuLV-env的表达。env基因已被对灵长类动物感染具有亲和力的GaLV(长臂猿白血病病毒)env基因所取代。在gag-pol载体或GalV-env载体中克隆HSV-TK基因。在每个载体中交叉克隆荧光基因作为靶标记，从而构建载体系统。
[0192] 具体地，病毒载体构建如下：
[0193] 1.spRRVe-P1-TK载体：用限制性酶PmeI在启动子1(P1；MCMV即时早期启动子)下消化具有多克隆位点的spRRVe-P1-mcs载体，然后用CIAP(小牛肠碱性磷酸酶)处理。用限制性酶NcoI和XhoI消化pSXLC-TK载体(Sugimoto等人，1994，生物/技术12，694-698)，然后收集TK基因。收集的TK基因用T4DNA聚合酶处理使其平端。用限制性酶BamHI和SalI消化spRRVe-P1-mcs载体，然后用CIAP处理。收集后，进行克隆。结果，构建了spRRVe-P1-TK载体(图1a)。
[0194] 2.sRRVgp-P1-RFP载体：用限制性酶EcoRI消化在pol和3’-LTR之间含有EcoRI切割位点的sRRVgp载体(韩国专利公开号10-1381064)，用CIAP处理。用限制性酶PpuMI和NcoI消化由本发明人构建的Lenti-P1-REP(单体)载体(忠南大学，韩国)，然后收集P1-REP基因。通过使用T4DNA聚合酶将收集的P1-RFP基因克隆入sRRVgp载体中，从而构建载体(图1a)。
[0195] 3.sRRVgp-P1-TK载体：用EcoRI消化sRRVgp载体，然后用CIAP处理。将包含EcoRI、PmeI和P1启动子的PCR产物(EcoRI-P1-PmeI-EcoRI)克隆入载体sRRVgp中，从而构建sRRVgp-P1载体。用限制性酶PmeI消化该载体，然后用CIAP处理。通过使用本发明人构建的spRRVe-P1-TK载体(忠南大学，韩国)作为模板，使用引物HSV-TK-EcoRI-F(5’-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCGGCCA-3’,SEQ.ID.NO:1)和引物HSV-TK-EcoRI-R(5’-GCGAATTCTCAGTAGCCTCCCCCATCTC-3’,SEQ.ID.NO:2)扩增TK基因以包含EcoRI切割位点。收集扩增的基因并用EcoRI消化，然后克隆入sRRVgp-P1载体中(图1b)。
[0196] 4.spRRVe-P1-GFP载体：为了在表达GFP的逆转录病毒载体Retro-MCMV-GFP(MFG-mCMV-GFP，韩国专利公开号10-1381064)的gag基因和GFP基因之间克隆入GaLV-env基因，用限制性酶PmeI消化由本发明人构建的Retro-P1-GFP载体(忠南大学，韩国)。通过使用由本发明人构建的MYK-GaLV载体(忠南大学，韩国)作为模板，使用引物GaLV-PmlI-F(5’-CGGCACGTGATGGTATTGCTGCCTGGG-3’,SEQ.ID.NO:3)和引物GaLV-PmlI-R(5’-GCCCACGTGTTAAAGGTTACCTTCGTT-3’,SEQ.ID.NO:4)扩增GaLV-env基因以包含PmlI切割位点。收集扩增的基因并用PmlI消化，然后克隆入Retro-P1-GFP载体中(图1b)。
[0197] <1-2>病毒制备
[0198] 为了用实施例<1-1>中构建的载体制备病毒，将spRRVe-P1-TK载体和sRRVgp-P1-RFP载体组合在一起(spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP)，并且将sRRVgp-P1-TK载体和spRRVe-P1-GFP载体组合在一起(sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP)。
[0199] 具体地，在转染前一天，将293T细胞以6×105个细胞/孔的密度放在6孔板中。第二天，用FBS和不含抗生素的0.8ml DMEM更换培养基。将该板置于细胞培养箱中。同时，将DMEM装入两个1.5ml试管(每个试管100μl)中以制备用于转染的溶液。一个试管包含1μg RRV(spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP或sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP)DNA和5μl PLUS试剂(英杰公司)，而另一个试管包含3μl脂质体转染试剂(英杰公司)。在充分混合10秒后，将试管在室温下静置15分钟。将包含脂质体转染试剂的溶液倒入包含PLUS试剂的试管中，并充分混合10秒。将试管在室温下静置20分钟。将包含RRV DNA、PLUS试剂和脂质体转染试剂的混合溶液逐滴缓慢地装入208μl/孔的细胞培养板中，然后培养4小时。4小时后，弃去培养基，小心地装入添加了3％FBS的DMEM，避免使细胞脱落，然后培养48小时。48小时后，得到上清液并用0.45μm针筒过滤器过滤。通过使用可以纯化100kDa蛋白质的15ml微量浓缩器将30ml滤液提纯。为了提高纯度，将所得溶液用15ml D-PBS过滤两次，然后浓缩10倍。将溶液分成50μl并存于-80℃深度冷冻室中。
[0200] <1-3>所制备病毒的滴定
[0201] 通过流式细胞术和qPCR测定实施例<1-2>中制备的病毒的滴度。
[0202] 具体地，在病毒感染前一天，将神经胶质瘤细胞(U87MG)接种在6孔板中。第二天，将10倍浓缩并分离的病毒在新鲜培养基中连续稀释(1×，10×，50×，100×和500×)。向1ml稀释的病毒中加入4μg/ml的聚凝胺。进行细胞计数。然后，用病毒感染神经胶质瘤细胞。
48小时后，向其中加入50μM叠氮胸腺嘧啶(病毒逆转录抑制剂)，然后反应24小时以抑制病毒的增殖。用流式细胞术对GFP表达进行定量，通过以下数学公式1计算滴度。
48小时后，向其中加入50μM叠氮胸腺嘧啶(病毒逆转录抑制剂)，然后反应24小时以抑制病毒的增殖。用流式细胞术对GFP表达进行定量，通过以下数学公式1计算滴度。
[0203] [数学公式1]
[0204] TU/ml＝(感染前的细胞数×GFP比(％))/稀释比
[0206] 结果，如表1、图2a和图2b所示，病毒感染前的神经胶质瘤细胞个数为1.533×105，针对神经胶质瘤细胞的病毒滴度大约为6.13×107TU/ml(表1、图2a和2b)。
[0207] [表1]针对神经胶质瘤细胞的病毒滴度
[0208]
[0209] <1-4>复制型逆转录病毒载体中重组的研究
[0210] 为基因治疗设计的复制型逆转录病毒载体中，有很大的重组可能性，因为由于插入的外源基因以及其中所加的非同源核苷酸序列，基因组RNA的大小增加。因此，为了构建稳定且有效的用于基因治疗的复制型逆转录病毒载体，重要的是在构建过程中追踪重组的可能性，而且如果有重组的话，测定重组的水平是很重要的。为研究实施例<1-1>中构建的载体的稳定性，进行以下实验。
[0211] 具体地，前一天传代培养的神经胶质瘤细胞用106TU spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP或106TU sRRVgp-P1-TK/spRRVe-P1-GFP感染三天。上清液用于感染在前一天新传代培养的U-87MG细胞，以3天间隔逐步进行8次。将得到的感染细胞命名为p1(第1代)～p8(第8代)。在荧光显微镜下观察在每个阶段细胞中表达的RFP或GFP。
[0212] 使用Env载体和gag-pol载体特异性引物MuLV4194F(5’-AGCAAGCTATTGGCCACTG-3’,SEQ.ID.NO:5)、GaLV(1624)F(5’-GACTCAGTCAGCAAGTTAGAG-3’,SEQ.ID.NO:6)和MFGSac1R(5’-CAATCGGAGGACTGGCGCCCCGAGTGA-3’,SEQ.ID.NO:7)，对从相同阶段细胞中提取的基因组DNA进行PCR，然后确认基因按预期扩增。向PCR反应管中装入100ng基因组DNA、1×反应缓冲液、0.25mM dNTP、0.2pmol正向引物、0.2pmol反向引物和0.2单位Taq聚合酶，并且最后加入灭菌蒸馏水以使最终体积到20μl。根据表1中列出的以下条件进行PCR。将扩增的DNA装到1％琼脂糖凝胶上，然后进行分析。
[0213] [表2]PCR条件
[0214]
[0215] 结果，如图3a和图3b所示，spRRVe-P1-TK载体中表达的TK基因的带强度从p2阶段开始减弱，且其大小从p3阶段开始迅速降低。另一方面，在sRRVgp-P1-RFP载体中表达的RFP基因持续扩增生成相同大小的PCR产物直到p8阶段(图3a)。同时，在sRRVgp-P1-TK载体和spRRVe-P1-GFP载体中未观察到重组(图3b)。上述结果证实，TK基因在sRRVgp-P1载体中比在spRRVe-P1载体中定位更稳定。
[0216] <1-5>spRRVe-P1-TK载体的重组模式的分析
[0217] 在用实施例<1-4>中组合的spRRVe-P1-TK/sRRVgp-P1-RFP的基因组DNA进行PCR之后，收集从spRRVe-P1-TK载体的p4阶段重组带(*)获得的PCR产物，其比预期的更小，并将其克隆入pGEM-T载体中用于基因分析。
[0218] 结果，如图4所示，收集的PCR产物丢失了大约2kb的基因，范围自GaLV env到P1，直到3’-LTR的边缘，或者丢失了大约1.8kb的基因，范围自GaLV env到P1，直到HSV-TK末端，这似乎归因于核苷酸序列AGAAAAAGGGGGGAAT或ATGGGG之间的重组(图4)。
[0219] 实施例2：仅使用胞嘧啶脱氨酶基因的复制型逆转录病毒载体系统的构建[0220] <2-1>病毒载体构建
[0221] 由于当TK基因位于实施例<1-4>中的sRRVgp-P1载体中时未发生重组，因此将现在临床领域中用作治疗工具的另一种自杀基因CD插入spRRVe-P1载体中，从而构建另一种载体系统。
[0222] 具体地，病毒载体构建如下：
[0223] 1.spRRVe-P1-yCD载体：用限制性酶XhoI和HindIII消化pcDNA-yCD载体(韩国癌症中心医院，由Lee博士提供)。然后，收集yCD(SEQ.ID.NO:16)。用限制性酶PmeI消化由本发明人构建的载体spRRVe-P1-MCS(忠南大学，韩国)，其中克隆了yCD基因(图5)。
[0224] 2.sRRVgp-P1-RFP载体：该载体以与实施例<1-1>中描述的相同的方式构建(图5)。
[0225] <2-2>病毒制备
[0226] 为了用实施例<2-1>中构建的载体制备病毒，将spRRVe-P1-yCD载体和sRRVgp-P1-RFP载体组合在一起(spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-RFP)，用于以与实施例<1-2>中描述的相同的方式制备病毒。
[0227] <2-3>复制型逆转录病毒载体中重组的研究
[0228] 以与实施例<1-4>中描述的相同方式和相同条件进行研究，不同之处在于采用spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-RFP的感染以3天间隔逐步进行5次，以研究实施例<2-1>中构建的载体的稳定性，并且在72℃下诱导聚合90秒。
[0229] 结果，如图6所示，从p1开始就在spRRV-P1-yCD载体中观察到重组，而在sRRVgp-P1-RFF载体中未观察到重组(图6)。
[0230] <2-4>spRRVe-P1-yCD载体的重组模式的分析
[0231] 用实施例<2-3>中组合的spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-RFP的基因组DNA进行PCR之后，收集从spRRVe-P1-yCD载体的p4阶段重组带(*)获得的PCR产物，其比预期的更小，并将其克隆入pGEM-T载体中。之后，分析了12个克隆。
[0232] 结果，如图7所示，观察到两种不同的重组模式。这两种类型的重组都是在GaLV Env和P1之间以及yCD和3’-LTR之间诱导的，表明其中诱导了基因缺失(图7)。
[0233] 实施例3：既包含胞嘧啶脱氨酶基因又包含胸腺嘧啶核苷激酶基因的复制型逆转录病毒载体系统的构建
[0234] <3-1>病毒制备
[0235] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，用组合的载体spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK制备病毒(图8)。
[0236] <3-2>复制型逆转录病毒载体中重组的研究
[0237] 以与实施例<1-4>中描述的相同方式、在相同条件下进行研究，不同之处在于采用spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK的感染以3天间隔逐步进行5次以研究实施例<3-1>中使用的载体的稳定性。
[0238] 结果，如图9所示，证实了从阶段p1开始就在spRRVe-P1-yCD载体中观察到重组(图9)。
[0239] <3-3>spRRVe-P1-yCD载体的重组模式的分析
[0240] 用实施例<3-2>中组合的spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK的基因组DNA进行PCR之后，收集从spRRVe-P1-yCD载体的p4阶段重组带(*)获得的PCR产物，其比预期的更小，并将其克隆入pGEM-T载体中。然后，对10个克隆进行基因分析。
[0241] 结果，如图10所示，观察到3种不同的重组模式。在从GaLV Env到P1的区域和从yCD到3’-LTR的区域之间观察到这三种模式中的两种模式，在从GaLV Env到P1的区域和yCD基因之间观察到另一种重组，其中证实了基因丢失(图10)。
[0242] <3-4>sRRVgp-P1-TK载体的重组模式的分析
[0243] 用实施例<3-2>中组合的spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK的基因组DNA进行PCR之后，回收从sRRVgp-P1-TK载体的p1阶段重组带(*)获得的PCR产物，其比预期的更小，并将其克隆入pGEM-T载体中。然后，对20个克隆进行了基因分析。
[0244] 结果，如图11所示，观察到五种不同的重组模式，其主要在Pol基因的末端区域和HSV-TK基因之间或HSV-TK基因和3’-LTR之间观察到，其中证实了基因缺失(图11)。
[0245] <3-5>spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK病毒的药物敏感性的研究
[0246] 对实施例<3-1>中制备的病毒spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK对更昔洛韦(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)的药物敏感性进行研究。
[0247] 具体地，通过使用PLUS试剂(英杰公司)和脂质体转染试剂(英杰公司)，用spRRVe-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK共转染293T细胞。2天后，获得上清液。向前一天以1.5×105个细胞/孔密度在6孔板中传代培养的U-87MG细胞中加入8μl/ml聚凝胺，然后用病毒感染8小时。感5
染后5天(感染后5d)，获得上清液。将前一天以1.5×10个细胞/孔密度在6孔板中传代培养的U-87MG细胞用上清液(p1)感染。连续感染直至p4阶段。用胰蛋白酶-EDTA处理各阶段的细胞以制备单细胞。将制备的单细胞以1.5×105个细胞/孔密度分布在12孔板中。从传代培养的第二天开始，用30μl/ml的GCV和1mM的5-FC处理细胞5天或8天，接着研究细胞的死亡。
染后5天(感染后5d)，获得上清液。将前一天以1.5×10个细胞/孔密度在6孔板中传代培养的U-87MG细胞用上清液(p1)感染。连续感染直至p4阶段。用胰蛋白酶-EDTA处理各阶段的细胞以制备单细胞。将制备的单细胞以1.5×105个细胞/孔密度分布在12孔板中。从传代培养的第二天开始，用30μl/ml的GCV和1mM的5-FC处理细胞5天或8天，接着研究细胞的死亡。
[0248] 结果，如图12所示，spRRV-P1-yCD/sRRVgp-P1-TK对GCV的药物敏感性持续到p3阶段。同时，在没有诱导重组的情况下，即使在感染后5天阶段也未观察到对5-FC的药物敏感性(图12)。
[0249] 实施例4：spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb和spRRVe-P1-CDc病毒载体系统的构建[0250] <4-1>病毒载体构建
[0251] 根据实施例<3-3>中进行的研究，spRRVe-P1-yCD载体中的重组主要发生在GaLV Env基因和P1启动子之间以及3’-LTR和yCD基因之间。因此，通过去除对于病毒合成不必要的核苷酸序列来构建载体系统。
[0252] 具体地，病毒载体构建如下：
[0253] 1.spRRVe-P1-CDa载体：使用spRRVe-P1-yCD载体作为模板，用引物spRRVe-CDa-F(5’-GAAGGTAACCTTTAATTCAATAACAGGAAAG-3’,SEQ.ID.NO:8)和spRRVe-CDa-R(5’-CTTTCCTGTTATTGAATTAAAGGTTACCTTC-3’,SEQ.ID.NO:9)进行重叠PCR以构建载体(图13)。
[0254] 2.spRRVe-P1-CDb载体：使用spRRVe-P1-CD载体作为模板，用引物spRRVe-CDb-F(5’-GAAGATATTGGTGAGTAGCTATAAAATAAAAGATTTT-3’,SEQ.ID.NO:10)和spRRVe-CDb-R(5’-AAAATCTTTTATTTTATAGCTACTCACCAATATCTTC-3’,SEQ.ID.NO:11)进行重叠PCR以构建载体(图13)。
[0255] 3.spRRVe-P1-CDc载体：使用spRRVe-P1-CD载体作为模板，用引物spRRVe-CDc-F(5’-ACCACCGTAGAACGCAATGGTGACAGGGGGAAT-3’,SEQ.ID.NO:12)和spRRVe-CDc-R(5’-ATTCCCCCTGTCACCATTGCGTTCTACGGTGGT-3’,SEQ.ID.NO:13)进行重叠PCR以构建载体(图13)。
[0256] <4-2>病毒制备
[0257] 用spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb或spRRVe-P1-CDc载体和sRRVgp-P1-RFP载体组合的载体制备病毒；而spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb或spRRVe-P1-CDc载体和sRRVgp-P1-TK载体在实施例<4-1>中以与实施例<1-2>中描述的相同方式构建。
[0258] <4-3>spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb和spRRVe-P1-CDc载体中重组的研究[0259] 以与实施例<2-3>中描述的相同的方式对载体中的重组进行研究，不同之处在于将实施例<4-2>中制备的6种病毒用于感染细胞以研究实施例<4-1>中构建的载体的稳定性。
[0260] 结果，如图14所示，在载体spRRVe-P1-CDa和spRRVe-P1-CDc中从p2阶段开始观察到重组，同时在spRRVe-P1-CDb载体中重组也从p2阶段开始，因此在p3中未观察到PCR产物(图14)。
[0261] <4-4>spRRVe-P1-CDa载体的重组模式的分析
[0262] 用实施例<4-3>中组合的载体spRRVe-P1-CDa/sRRVgp-P1-RFP和spRRVe-P1-CDa/sRRVgp-P1-TK的基因组DNA进行PCR之后，收集从spRRVe-P1-CDa载体的p2和p3阶段重组带(*)获得的PCR产物，其比预期的更小，并将其克隆入pGEM-T载体中。然后，对24个克隆进行了基因分析。
[0263] 结果，如图15所示，在P1和yCD基因中或在yCD基因和3’-LTR之间仍观察到重组(图15)。
[0264] 实施例5：按人类密码子优化的CD基因的鉴定
[0265] 实例2-实例4中所用的yCD基因证实了在感染过程中其中的重组，还显示对5-FC的低药物敏感性。为了克服这些缺点，对8种按人类密码子优化的CD基因(CD2-CD9)进行鉴定。
[0266] 具体地，CD2，其用作阳性对照，是Tocagen公司通过密码子优化由CD发展来的。CD3是通过优化12个密码子生成的基因，这些密码子在CD2基因中未按人类密码子优化。CD4是其中spRRVe-P1-yCD、spRRVe-P1-CDa、spRRVe-P1-CDb和spRRVe-P1-CDc载体中显示重组的32个位点都已突变的基因。5种CD基因CD5-CD9是其中按人类密码子优化酵母CD得到的基因。上述8种CD基因由Cosmogen有限公司合成。CD2-CD9基因的序列如表3所示。
[0267] [表3]按人类密码子优化的CD基因的序列
[0268]
[0269]
[0270]
[0271] 实施例6：各spRRVe-P1-CD病毒载体系统的构建
[0272] <6-1>病毒载体构建
[0273] 用实例5中鉴定的按人类密码子优化的CD基因构建载体系统。
[0274] 具体地，病毒载体构建如下：
[0275] 1.spRRVe-P1-CD2载体：用限制性酶BamHI和ClaI消化spRRVe-P1-RFF载体，并克隆CD2基因，其中RFP被去除(图16)。
[0276] 2.spRRVe-P1-CD3载体：用限制性酶BamHI和ClaI消化spRRVe-P1-RFP载体，并克隆CD3基因，其中RFP被去除(图16)。
[0277] 3.spRRVe-P1-CD4载体：用限制性酶HpaI消化spRRVe-P1-RFP载体，并克隆CD4基因，其中RFP被去除(图16)。
[0278] 4.spRRVe-P1-CD5载体：构建spRRVe-P1-mcs载体，其包含在spRRVe-P1载体P1区下的多克隆位点，并用限制性酶MluI和SalI对其进行消化，并在其中克隆CD5基因(图16)。
[0279] 5.spRRVe-P1-CD6载体：构建spRRVe-P1-mcs载体，其包含spRRVe-P1载体P1区下的多克隆位点，用限制性酶MluI和SalI对其进行消化，并在其中克隆CD6基因(图16)。
[0280] 6.spRRVe-P1-CD7载体：构建spRRVe-P1-mcs载体，其包含spRRVe-P1载体P1区下的多克隆位点，用限制性酶MluI和SalI对其进行消化，并在其中克隆CD7基因(图16)。
[0281] 7.spRRVe-P1-CD8载体：构建spRRVe-P1-mcs载体，其包含spRRVe-P1载体P1区下的多克隆位点，用限制性酶MluI和SalI对其进行消化，并在其中克隆CD8基因(图16)。
[0282] 8.spRRVe-P1-CD9载体：构建spRRVe-P1-mcs载体，其包含spRRVe-P1载体P1区下的多克隆位点，用限制性酶MluI和SalI对其进行消化，并在其中克隆CD9基因(图16)。
[0283] <6-2>病毒制备
[0284] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，用实施例<6-1>中构建的载体spRRVe-P1-yCD、spRRVe-P1-CD2、spRRVe-P1-CD3、spRRVe-P1-CD4、spRRVe-P1-CD5、spRRVe-P1-CD6、spRRVe-P1-CD7和spRRVe-P1-CD8，或者组合的载体spRRVe-P1-CD9和sRRVgp-P1-TK制备病毒。
[0285] <6-3>各spRRVe-P1-CD/sRRVgp-P1-TK病毒的药物敏感性的研究
[0286] 以与实施例<3-5>中描述的相同的方式，对实施例<6-2>中制备的病毒对GCV和5-FC的药物敏感性进行研究，不同之处在于实施例<6-2>中制备的病毒是共转染的。
[0287] 结果，如图17a-17d所示，spRRVe-P1-CD2/sRRVgp-P1-TK、spRRVe-P1-CD6/sRRVgp-P1-TK、spRRVe-P1-CD7/sRRVgp-P1-TK和spRRVe-P1-CD8/sRRVgp-P1-TK在p3阶段之前显示对GCV和5-FC的药物敏感性。然而，从p4阶段开始，每种病毒的药物敏感性都降低了(图17a-17d)。
[0288] <6-4>各spRRVe-P1-CD中重组的研究
[0289] 以与实施例<1-4>中描述的相同方式、在相同条件下，对实施例<6-2>中用于病毒制备的载体的稳定性进行研究，不同之处在于实施例<6-2>中制备的病毒以3天间隔逐步感染4次，并且在72℃诱导聚合3分20秒，其中使用了引物GaLV(488)F(5’-GGCTAGAATCCCTATATGTA-3’,SEQ.ID.NO:10)。
[0290] 结果，如图18所示，在所有这些载体spRRVe-P1-yCD、各spRRVe-P1-CD和sRRVgp-P1-TK的p2阶段中都证实了重组，且在p3或P4阶段证实了基因缺失(图18)。这些结果与实施例<6-3>的结果一致，证明了药物敏感性从p3阶段开始降低。
[0291] <6-5>各spRRve-P1-CD的重组模式的分析
[0292] 将实施例<6-3>中已证明对5-FC具有优异药物敏感性的spRRVe-P1-CD6和spRRVe-P1-CD8载体的p2和p3的PCR产物回收(收集)。将该PCR产物克隆入pGEM-T载体中。然后，对24个克隆进行了基因分析。
[0293] 结果，如图19a-20b所示，观察到各种重组模式。大多数情况下，从P1开始在CD中或在CD和3’-LTR之间观察到重组(图19a-20b)。
[0294] 实施例7：各spRRVe-P2-CD病毒载体系统的构建
[0295] <7-1>病毒载体构建
[0296] 从实施例1-实施例6证实，spRRV-P1载体中的重组主要发生在P1启动子区域。这似乎是因为P1启动子的重复核苷酸序列。因此，用P2基因控制区取代P1，从而构建另一个载体系统。
[0297] 具体地，从每个spRRVe-P1-CD和p2启动子(EF1α启动子)中去除p1启动子(MCMV即时早期启动子)区域，使其中没有克隆重复的核苷酸序列，从而构建载体spRRVe-P2-yCD和各spRRVe-P2-CD。此时，显示弱药物敏感性的CD4基因被排除(图21)。
[0298] <7-2>病毒制备
[0299] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，用在实施例<7-1>中构建的载体spRRVe-P2-yCD、spRRVe-P2-CD2、spRRVe-P2-CD3、spRRVe-P2-CD5、spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8，或者组合的载体spRRVe-P2-CD9和sRRVgp-P1-TK制备病毒。
[0300] <7-3>spRRVe-P2-yCD/sRRVgp-P1-TK和各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P1-TK的药物敏感性的研究
[0301] 以与实施例<3-5>中描述的相同方式，对实施例<7-2>中制备的病毒对GCV和5-FC的药物敏感性进行研究，不同之处在于实施例<7-2>中制备的病毒是共转染的以从p1至p9逐步感染，且分别在GCV和5-FC处理9或12天之后观察到细胞死亡。
[0302] 结果，如图22a-22f所示，与各spRRVe-P1-CD/sRRVgp-P1-TK不同，直到p8阶段之前都能在各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P1-TK中观察到细胞死亡。然而，从p9开始，细胞杀伤活性迅速降低。同时，spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8的细胞杀伤活性总是弱于阳性对照spRRVe-P2-CD2的细胞杀伤活性。但是，与spRRVe-P2-yCD相比，对5-FC的药物敏感性大大提高了(图22a-22f)。
[0303] <7-4>spRRVe-P2-yCD/sRRVgp-P1-TK和各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P1-TK中重组的研究
[0304] 以与实施例<6-4>中描述的相同的方式、在相同条件下，对实施例<7-1>中构建的载体的稳定性进行研究，不同之处在于将实施例<7-2>中制备的8种病毒用于感染。
[0305] 结果，如图23所示，在除了spRRVe-P2-CD5之外的各spRRVe-P2-CD载体中在p4阶段之前未观察到重组，而重组主要在sRRVgp-P1-TK载体中观察到(从p1或p2阶段开始)(图23)。
[0306] <7-5>sRRVgp-P1-TK的重组模式的分析
[0307] 用实施例<7-4>中组合的载体spRRVe-P2-yCD/sRRVgp-P1-TK和各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P1-TK的基因组DNA进行PCR之后，回收从sRRVgp-P1-TK载体的p3和p4阶段重组带获得的PCR产物，其比预期的更小，接着进行基因分析。
[0308] 结果，如图24所示，在P1和TK之间观察到以基因缺失为特征的重组(图24)。
[0309] 实施例8：sRRVgp-P2-TK病毒载体系统的构建
[0310] <8-1>病毒载体构建
[0311] 作为实施例7的结果，各spRRVe-P2-CD中的重组发生率低于使用P1对照区域的载体中的重组发生率。然而，在sRRVgp-P1-TK载体中的P1对照区还观察到基因缺失。本发明人通过用P2启动子区替换P1启动子区构建了sRRVgp-P2-TK载体系统。
[0312] 具体地，进行PCR以将EcoRI、NotI和PmeI限制性酶序列连接到P2启动子上(EcoRI-P2-NotI-PmeI-EcoRI)。用EcoRI消化该PCR产物，并在由本发明人构建的sRRVgp载体(忠南大学，韩国)的Pol基因下方插入，从而构建sRRVgp-P2载体。通过PCR扩增HSV-TK基因以包含NotI和PmeI限制性酶序列(NotI-HSV TK-PmeI)。然后，用NotI和PmeI消化该PCR产物，接着克隆入P2基因下方。结果，构建了载体sRRVgp-P2-TK(图25)。
[0313] <8-2>病毒制备
[0314] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，用载体spRRVe-P2-CD2、不发生重组的载体spRRVe-P2-CD6和spRRVe-P2-CD7、或组合的载体spRRVe-P2-CD8和sRRVgp-P2-TK制备病毒。
[0315] <8-3>各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P2-TK的药物敏感性的研究
[0316] 以与实施例<3-5>中描述的相同的方式，对实施例<8-2>中制备的病毒对GCV和5-FC的药物敏感性进行研究，不同之处在于实施例<8-2>中制备的病毒是共转染的以从p1至p11逐步感染，且在GCV和5-FC处理5或7天之后观察到细胞死亡。
[0317] 结果，如图26a-26c所示，在p11之前，spRRVe-P2-CD6、spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8对5-FC的药物敏感性与阳性对照spRRVe-P2-CD2的药物敏感性一样高，spRRVe-P2-yCD除外(图26a-26c)。
[0318] <8-4>各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P2-TK中重组的研究
[0319] 以与实施例<6-4>中描述的相同方式、在相同条件下，对实施例<8-1>中构建的载体的稳定性进行研究，不同之处在于实施例<8-2>中制备的4种病毒以3天间隔逐步感染7次。
[0320] 结果，如图27a和27b所示，从p4开始观察到spRRVe-P2-yCD载体中的重组，而从p7开始观察到spRRVe-P2-CD2中的重组。同时，从p6开始观察到spRRVe-P2-CD6载体中的重组，从p5开始观察到spRRVe-P2-CD7和spRRVe-P2-CD8中的重组。特别的是，特别早地观察到sRRVgp-P2-TK和spRRVe-P2-CD2中的重组(图27a和27b)。
[0321] <8-5>spRRVe-P2-CD6和spRRVe-P2-CD8的重组模式的分析
[0322] 对在实施例<8-4>中证实具有重组的spRRVe-P2-CD6和spRRVe-P2-CD8的p7的PCR产物进行收集。将该PCR产物克隆入pGEM-T载体中。然后，对19个克隆进行了基因分析。
[0323] 结果，如图28a-29b所示，在P2和直至3’-LTR的边缘之间证实了重组(图28a-29b)。
[0324] 实施例9：按人类密码子优化的7种CD基因的附加鉴定
[0325] 在上述实施例中，经证实与yCD基因相比具有优异药物敏感性的CD6、CD7和CD8基因得到鉴定。为了确保具有最大的药物依赖性细胞杀伤活性的CD基因，本发明人另外对按人类密码子优化的7种其他CD基因(CD10-CD16)进行了鉴定。
[0326] 这7种CD基因CD10-CD16是其中按人类密码子优化酵母CD得到的基因。上述7种CD基因由Cosmogen有限公司合成。CD10-CD16基因的序列如表4所示。
[0327] [表4]按人类密码子优化的CD基因的序列
[0328]
[0329]
[0330]
[0331] 实施例10：各spRRVe-P2-CD病毒载体系统的构建
[0332] <10-1>病毒载体构建
[0333] 将在实施例9中新鉴定的按人类密码子优化的这些CD基因克隆入spRRVe-P2载体中，从而构建各spRRVe-P2-CD载体。
[0334] <10-2>病毒制备
[0335] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，通过使用实施例<10-1>中构建的7种spRRVe-P2-CD和sRRVgp-P2-TK载体的组合来制备病毒。
[0336] <10-3>各spRRVe-P2-CD/sRRVgp-P2-TK的药物敏感性的研究
[0337] 以与实施例<3-5>中描述的相同的方式，对实施例<10-2>中制备的病毒对GCV和5-FC的药物敏感性进行研究，不同之处在于实施例<10-2>中制备的病毒是共转染的以从p1至p5逐步感染，且分别在GCV和5-FC处理6或8天之后观察到细胞死亡。
[0338] 结果，如图30a-30c所示，证实CD6基因具有最优异的药物敏感性(图30a-30c)。
[0339] 实施例11：spRRVe-P2-TK、sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7和sRRVgp-P2-CD8病毒载体系统的构建
[0340] <11-1>病毒载体构建
[0341] 随着在实施例<8-4>中连续感染阶段的延长，即使包含P2启动子的载体spRRVe-P2-CD也表现出重组作用。为了改善此问题，制备组合载体spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD以构建病毒载体系统。
[0342] 具体地，病毒载体构建如下：
[0343] 1.spRRVe-P2-TK载体：使用TK基因作为模板，使用引物HSV-TK-BamHI-F(5’-CGGGATCCATGGCTTCGTACCCCTGCCAT-3’,SEQ.ID.NO:11)和HSV-TK-SalI-R(5’-CGGTCGACTCAGTTAGCCTCCCCCATCTC-3’,SEQ.ID.NO:12)进行PCR。用限制性酶BamHI和SalI消化PCR产物，然后克隆到spRRVe-P2-mcs载体的BamHI-SalI位点，从而构建spRRVe-P2-TK载体(SEQ.ID.NO:13)(图31、32和33a-33r)。
[0344] 2.sRRVgp-P2-yCD载体：使用yCD基因作为模板，使用引物CD-NotI-F(5’-CGGCGGCCGCATGGTGACAGGGGGAATGGC-3’,SEQ.ID.NO:36)和CD-PmeI-R(5’-CGGTTTAAACCTACTCACCAATATCTTCAAA-3’,SEQ.ID.NO:37)进行PCR。用限制性酶NotI和PmeI消化PCR产物，然后克隆到sRRVgp-P2载体的NotI-PmeI位点，从而构建sRRVgp-P2-yCD载体。
[0345] 3.sRRVgp-P2-CD2载体：使用CD2基因作为模板，用引物CD2-NotI-F(5’-CGGCGGCCGCATGGTGACCGGCGGCATGGC-3’,SEQ.ID.NO:38)和CD2-PmeI-R(5’-CGGTTTAAACTTACTCGCCGATATCCTCGA-3’,SEQ.ID.NO:39)进行PCR。用限制性酶NotI和PmeI消化PCR产物，然后克隆到sRRVgp-P2载体的NotI-PmeI位点，从而构建sRRVgp-P2-CD2载体。
[0346] 4.sRRVgp-P2-CD6载体：使用CD6基因作为模板，用引物CD6-NotI-F(5’-CGGCGGCCGCATGGTTACTGGAGGGATGGC-3’,SEQ.ID.NO:40)和CD6-PmeI-R(5’-CGGTTTAAACTCATTCGCCAATATCCTCGA-3’,SEQ.ID.NO:41)进行PCR。用限制性酶NotI和PmeI消化PCR产物，然后克隆到sRRVgp-P2载体的NotI-PmeI位点，从而构建sRRVgp-P2-CD6载体(SEQ.ID.NO:14)(图31、34和35a-35o)。
[0347] 5.sRRVgp-P2-CD7载体：使用CD7基因作为模板，使用引物CD7-NotI-F(5’-CGGCGGCCGCATGGTAACTGGTGGCATGGC-3’,SEQ.ID.NO:42)和CD7-PmeI-R(5’-CGGTTTAAACCTACTCTCCGATATCCTCAA-3’,SEQ.ID.NO:43)进行PCR。用限制性酶NotI和PmeI消化PCR产物，然后克隆到sRRVgp-P2载体的NotI-PmeI位点，从而构建sRRVgp-P2-CD7载体。
[0348] 6.sRRVgp-P2-CD8载体：使用CD8基因作为模板，用引物CD8-NotI-F(5’-CGGCGGCCGCATGGTTACTGGGGGAATGG-3’,SEQ.ID.NO:44)和CD8-PmeI-R(5’-CGGTTTAAACTTATTCCCCGATGTCTTCGA-3’,SEQ.ID.NO:45)进行PCR。用限制性酶NotI和PmeI消化PCR产物，然后克隆到sRRVgp-P2载体的NotI-PmeI位点，从而构建sRRVgp-P2-CD8载体。
[0349] <11-2>病毒制备
[0350] 以与实施例<1-2>中描述的相同的方式，通过使用诸如实施例<11-1>中构建的sRRVgp-P2-yCD、sRRVgp-P2-CD2、sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7或sRRVgp-P2-CD8的载体与spRRVe-P2-TK载体的组合来制备病毒。
[0351] <11-3>spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD(2,6,7,8)中重组的研究
[0352] 以与实施例<1-4>中描述的相同方式、在相同条件下，对实施例<11-1>中构建的载体的稳定性进行研究，不同之处在于spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD(2,6,7,8)以3天间隔逐步感染7次，并在72℃下诱导聚合3分钟。
[0353] 结果，如图36a和36b所示，在p7阶段之前，在载体sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7和sRRVgp-P2-CD8中未观察到重组(图36a和36b)。
[0354] <11-4>spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD的重组模式的分析
[0355] 用实施例<11-3>中组合的载体spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-yCD、spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD2、spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD6、spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD7和spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD8的基因组DNA进行PCR之后，对从spRRVe-P2-TK、sRRVgp-P2-yCD和sRRVgp-P2-CD(2,6,7,8)载体的p6和p7阶段获得的PCR产物进行回收，接着进行基因分析。
[0356] 结果，如图36a和36b所示，在sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7和sRRVgp-P2-CD8中均未观察到重组。这些载体比阳性对照载体sRRVgp-P2-CD2具有更优异的稳定性(图36a和36b)。
[0357] <11-5>spRRVe-P2-TK/sRRVgp-P2-CD的药物敏感性的研究
[0358] 以与实施例<3-5>中描述的相同的方式，对实施例<11-2>中制备的病毒对GCV和5-FC的药物敏感性进行研究，不同之处在于实施例<11-2>中制备的病毒是共转染的以从p1至p9逐步感染，并且在GCV和5-FC分别处理8天或12天之后观察到细胞死亡。
[0359] 结果，如图37a-37c所示，在p7阶段之前，很好地观察到由sRRVgp-P2-CD6、sRRVgp-P2-CD7、sRRVgp-P2-CD8和spRRVe-P2-TK导致的细胞死亡(图37a-37c)。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种人的过硫双加氧酶突变蛋白及其应用 | 2021-05-18 | 2 |
| 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法 | 2022-01-25 | 3 |
| 非小细胞肺癌中miR-96基因的应用 | 2021-04-06 | 6 |
| 早老综合征所致ALT肿瘤的特有p53突变蛋白-p53N236S及其应用 | 2022-02-02 | 3 |
| 一种新的多肽——人脊椎肌肉萎缩决定基因产物9.13和编码这种多肽的多核苷酸 | 2021-07-23 | 1 |
| 基因工程化的细胞及应用 | 2020-10-05 | 5 |
| 羧基末端调节蛋白（CTMP）在治疗心肌肥厚中的应用 | 2021-10-09 | 4 |
| 基于B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途 | 2021-10-10 | 4 |
| 一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法 | 2022-05-19 | 4 |
| 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 | 2021-09-22 | 0 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈