用于脆性X综合征基因治疗的重组DGKK基因
阅读：847发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于脆性X综合征基因治疗的重组DGKK基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及编码缺乏功能性脯 氨 酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白的核酸，及其在有需要的患者中 治疗 脆性X综合征的用途。，下面是用于脆性X综合征基因治疗的重组DGKK基因专利的具体信息内容。
1.编码缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的功能性人DGKk(二酰基甘油激酶κ)蛋白质的核酸，其中所述核酸与SEQ ID ID NO：1的核苷酸序列具有至少约
85％的相同性，其中所述脯氨酸富含区域是SEQ ID NO：1的核苷酸70和132之间的核苷酸区域，并且其中所述EPAPE重复区域是SEQ ID NO：1的核苷酸142和539之间的核苷酸区域。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述人DGKk蛋白缺乏功能性脯氨酸富含区域和功能性EPAPE重复区域。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中所述人DGKk蛋白缺乏脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述核酸与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约90％的相同性、更优选至少约95％的相同性，以及包含在SEQ ID No：1的第
70-132位和/或第142-539位的核苷酸序列中的一个或多个突变和/或表观遗传修饰，所述突变优选是缺失，以及任选地包含在SEQ ID No：1的第4-69位和/或第133-141位和/或第
540-648位的核苷酸序列中的一个或多个突变和/或表观遗传修饰，所述突变优选是缺失。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸，其中所述核酸与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约90％的相同性、更优选至少约95％的相同性，并且包含选自以下的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-
132位序列、SEQ ID No：1的第4-142位的序列、SEQ ID No：1的第4-539位序列、以及SEQ D No：1的第4-648位的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸，其中所述核酸具有SEQ D No：1的序列，并且包含选自以下的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ D No：1的第70-132位和第142-539位的序列、和SEQ ID No：1的第4-539位的序列。
7.表达盒，其包含根据权利要求1至6中任一项的核酸和启动子。
8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述启动子是神经元特异性启动子，优选是人突触蛋白-1基因启动子。
9.表达载体，其包含根据权利要求1至6中任一项的核酸或根据权利要求7或8的表达盒。
10.根据权利要求9的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒，优选腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/10，更优选腺相关病毒2/9。
11.根据权利要求1至6中任一项的核酸、根据权利要求7或8的表达盒、或根据权利要求
9或10的表达载体，其用作药物。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项的核酸、根据权利要求7或8的表达盒、或根据权利要求9或10的表达载体。
13.根据权利要求1至6中任一项的核酸、根据权利要求7或8的表达盒、根据权利要求9或10的表达载体、或根据权利要求12的药物组合物，其用于在有需要的患者中治疗脆性X综合征。
14.用于根据权利要求13的用途的核酸、表达载体或药物组合物，其中其与PPARγ激动剂组合使用，所述PPARγ激动剂优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自下组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，且甚至更优选吡格列酮。
15.试剂盒，其包含根据权利要求1至6中任一项的核酸、根据权利要求7或8的表达盒、根据权利要求9或10的表达载体、或根据权利要求12的药物组合物和用于施用所述核酸或所述表达盒或所述表达载体或所述药物组合物的工具，以及任选的提供使用所述试剂盒的指导的说明书。
用于脆性X综合征基因治疗的重组DGKK基因
发明领域
[0001] 本发明涉及医学领域，特别是脆性X综合征。其提供了脆性X综合征的新疗法。
背景技术
[0002] 脆性X综合征(FXS)是一种导致智力残疾、行为和学习挑战以及多种身体特征的遗传病。尽管脆性X综合征发生在两种性别中，但男性(4,000个中有1个)比女性更容易受到影响(8,000个中有1个)，并且通常具有更高的严重性。
[0003] 受影响的个体通常在2岁时发生言语和语言的延迟发育。大多数患有脆性X综合征的男性患有轻度至中度智力残疾，而约三分之一的受影响女性智力残疾。患有脆性X综合征的儿童也可能具有焦虑和过度活跃的行为，例如坐立不安或冲动行为。他们可能患有注意力缺陷障碍(ADD)，其中包括维持注意力的能力受损以及难以专注于特定任务。脆性X综合征患者中约有三分之一具有影响交流和社交互动的自闭症谱系障碍的特征。癫痫发作发生在约15％的患有脆性X综合征的男性和约5％的患有脆性X综合征的女性中。
[0004] 大多数患有脆性X综合征的男性和大约一半患有脆性X综合征的女性具有随年龄增长而变得更明显的特征性身体特征。这些特征包括长而窄的脸、大耳朵、突出的下巴和前额、异常灵活的手指、扁平的脚、以及男性中青春期后扩大的睾丸(大睾丸(macroorchidism))。
[0005] 脆性X染色体综合征是由CGG三核苷酸重复的扩增引起的，所述重复影响X染色体上的脆性X智力迟滞1(FMR1)基因，所述扩增导致无法表达脆性X智力迟滞蛋白(FMRP)，该蛋白是正常神经发育所必需的。
[0006] 在小鼠中，缺乏FMRP与数百种神经元蛋白的过度翻译有关，特别是包括突触后蛋白。这种局部蛋白质合成失调被认为是观察到的谷氨酸能突触成熟和功能的缺陷的基础，并且优先影响据报道与FMRP结合的数百种mRNA种类。
[0007] 目前没有显示出特异性对脆性X综合征有益的治疗。治疗该病症的当前趋势仅包括基于症状的治疗的药物，所述治疗旨在最小化与该病症相关的继发性特征，如注意力缺陷和多动、焦虑和攻击的症状。还开发了支持性管理，以优化患有脆性X综合征的个体的功能，包括言语治疗、职业治疗以及个性化的教育和行为计划。
[0008] 因此，现在仍然迫切需要医学科学来创新新的和有效的脆性X综合征治疗。本发明旨在满足这些和其他需求。
发明内容
[0009] 本发明人惊奇地发现，其5′编码区截短的Dgkk(二酰基甘油激酶κ)核酸的表达能够挽救海马CA1锥体Fmr1-KO神经元的树突棘异常。发明人还表明，在该5′编码区中，有两个结构域是至关重要的：脯氨酸富含结构域和EPAPE重复结构域。
[0010] 因此，在第一方面，本发明涉及编码缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白的核酸。
[0011] 优选地，该人DGKk蛋白缺乏功能性脯氨酸富含区域和功能性EPAPE重复区域。
[0012] 特别地，根据本发明的人DGKk蛋白可缺少脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域。
[0013] 优选地，根据本发明的核酸与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约85％的相同性、优选至少约90％的相同性、更优选至少约95％的相同性并且包含在SEQ ID No：1的第70-132位和/或第142-539位核苷酸序列中的一个或多个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰，以及任选地包含在SEQ ID No：1的第4-69位和/或第133-141位和/或第540-648位的核苷酸序列中的一个或多个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0014] 更优选地，根据本发明的核酸与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约85％的相同性、优选至少约90％的相同性、更优选至少约95％的相同性并且包含选自由以下组成的组的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-132位的序列、SEQ ID No：1的第4-142位的序列、SEQ ID No：1的第4-539位的序列、和SEQ ID No：1的4-648位的序列。
[0015] 甚至更优选地，根据本发明的核酸具有SEQ ID No：1的序列，并且包含选自由以下组成的组的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的序列、以及SEQ ID No：1的第4-539位的序列。
[0016] 在第二方面，本发明还涉及表达盒，其包含根据本发明的核酸和启动子。优选地，所述启动子是神经元特异性启动子，更优选是人突触蛋白(synapsin)-1基因启动子。
[0017] 在第三方面，本发明还涉及表达载体，其包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达盒。优选地，所述表达载体是腺相关病毒，更优选腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/10，甚至更优选腺相关病毒2/9。
[0018] 在第四个实施方案中，本发明涉及根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、或根据本发明的表达载体，其用作药物。
[0019] 在第五方面，本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、或根据本发明的表达载体。
[0020] 在第六方面，本发明还涉及根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物，其用于在有需要的患者中治疗脆性X综合征。
[0021] 优选地，所述核酸、表达载体或药物组合物与PPARγ激动剂组合使用，所述PPARγ激动剂优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮(rivoglitazone)和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮。
[0022] 在第七方面，本发明还涉及试剂盒，其包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物和用于施用所述核酸或所述表达盒或所述表达载体或所述药物组合物的工具和任选的提供使用这种试剂盒的指导的说明书。
[0024] 图1：按比例表示的小鼠Dgkk构造图。描述了Dgkk的5′编码区的两个主要结构域：Pro是指脯氨酸富含区域，并且(EPAPE)10是指EPAPE重复区域。HA指血凝素标签，GFP指绿色荧光蛋白，并且CMV指巨细胞病毒启动子。符号Δ表示缺少下列DNA或蛋白质区域。术语“5′区域”是指Bgkk的5′编码区，其包含脯氨酸富含区域和EPAPE重复区域和Dgkk的5′UTR。术语“N-ter”是指对应于Dgkk基因的5′编码区的蛋白质区域。术语“FL”指全长并且Dgkk-FL载体携带包含所有Dgkk外显子、其5′UTR区、其3′UTR区和HA标签的序列。灰色条代表1kb。
[0025] 图2：FMRP对Cos-1细胞中Dgkk表达的影响。A：用含有指定Dgkk构建体(Dgkk-FL或Δ5′reg-Dgkk)的质粒或转染对照(TC)转染24小时前，用siRNA对照(siCtlr)或针对Fmr1(siFmr1)的siRNA转染的Cos-1细胞的分析的代表性蛋白印迹。使用的抗体表示：抗HA抗体(HA)、抗FMRP抗体(FMRP)和抗GAPDH抗体(GAPDH)。B：A中所示构建体的蛋白质印迹的密度图。横坐标表示对于siCtrl条件，归一化至GAPDH的指定蛋白质(HA或FMRP)的信号的任意单位设定为100。***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.1，NS：不显著，p值用Student检验计算，n＝6。
[0026] 图3：Cos-1细胞中不同Dgkk构建体表达的比较。A：未用Dgkk构建体(NT)转染或用带有指定Dgkk构建体的质粒转染的Cos-1细胞分析的代表性蛋白质印迹。使用的抗体表示：抗HA抗体(HA)和抗GAPDH抗体(GAPDH)。B：A中所示构建体的蛋白质印迹的密度图。横坐标表示归一化至GAPDH的HA蛋白信号的任意单位。
[0027] 图4：Dgkk的5′区域对于通过FMRP控制其表达的影响。A：未用Dgkk构建体(NT)转染或用带有指定Dgkk构建体(在左侧表示)的质粒转染的Cos-1细胞的分析的代表性蛋白质印迹。用构建体转染前24小时，用siRNA对照(siCtlr)或用针对Fmr1的siRNA(siFmr1)转染细胞。使用的抗体表示：抗HA抗体(HA)、抗FMRP抗体(FMRP)和抗GAPDH抗体(GAPDH)。B：A中所示构建体的蛋白质印迹的密度图。横坐标表示对于siCtrl条件，归一化至GAPDH的指定蛋白质(HA或FMRP)的信号的任意单位设定为100。***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.1，NS：不显著；p值用Student检验计算，n＝6。
[0028] 图5：用Δ5′-Dgkk表达调节进行的树突棘改变和拯救。A：在分别用pAAV-EGFP-shRNA-scramble、pAAV-EGFP-shRNA-Dgkκ、pAAV-EGFP、pAAV-Δ5′-Dgkκ转染的CA1锥体神经元中，由shRNA-scramble(左上)、shRNA-Dgkκ(左下)、Fmr1-/y(右上)、Fmr1-/y+Δ5′-Dgkk(右下)的表达诱导的棘形态变化的图示。注意多头棘(星状)以及非常长的细棘(箭头；条形：2μm)的存在。B：在表达锥体神经元的shRNA-scramble中发生的棘变化(新棘，+和失去的棘，-)(条形：2μm)。C：在四种条件下棘密度没有变化。D：shRNA-Dgkk(sh-Dgkk)(n＝10)相对shRNA-scramble(sh-scrbl)转染细胞(n＝8)和Fmr1-/y(FMRKO)(n＝8)相对Fmr1-/y+Δ5′-Dgkk(FMRKO+Δ5′-DGKK)转染细胞(n＝8)的多头棘增加和蘑菇棘减少(*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001，使用Bonferroni后检验的2路ANOVA)。E：shRNA-Dgkk(n＝342个棘)、shRNA-scramble(n＝297个棘)、Fmr1-/y(n＝359个棘)、Fmr1-/y+Δ5′-Dgkk(n＝377个棘)转染的细胞中棘长度的分布(p＝0.13，Kolgomorov-Smimov检验)。F：随着时间的推移棘稳定性降低(*：p＜0.05，使用Bonferroni事后检验的2因素ANOVA)，G：在CA1锥体神经元中由shRNA-Dgkκ(右)或shRNA-scramble(左)表达诱导的树突棘形态和动力学改变。指示时间(h)。这些图片对应于在用表达shRNA-Dgkκ或shRNA-scramble的质粒载体通过生物射弹方法(材料和方法)转染的小鼠海马器官型培养物的指定时间拍摄的重复共聚焦图像。H：在shRNA-Dgkk(n＝10)转染的细胞中相对于shRNA-scramble(n＝8)转染的细胞中，每24小时新棘形成增加(**：p＜0.01，非配对t-检验)。I：每24小时失去的棘的增加(*：p＜0.05，非配对t检验)。
[0029] 图6：AAVΔ5ransductκ在体外和体内的转导，以及对Fmr1-KO小鼠行为的影响。A)用AAV9-Δ5′reg-Dgkk有效转导解离的皮质神经元(体外14天)。通过使用抗HA一抗的免疫标记使Dgkk可视化。AAV-GFP显示为转导阳性对照。Map2是神经元的标记。B)Fmr1-/y神经元中起始因子4E(eIF4E)的磷酸化增加。使用指定的一抗对10μg皮质神经元(14DIV)蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。显示了三个生物学重复。C)来自AAV9的Δ5′reg-Dgkk表达在感染后7天降低Fmr1-/y神经元中的eIF4E磷酸化。数据对应于如B中所进行的蛋白质印迹。指示病毒的滴度(基因组拷贝)。右图显示了蛋白质印迹的光密度分析。P值***＜0.001，**≤0.01，学生T检验n＝4。D)在用指定载体注射的小鼠的海马区域上用抗HA抗体(绿色)免疫荧光标记Δ5′reg-Dgkk。E)通过在D中处理的小鼠的海马中的qRT-PCR定量病毒基因组拷贝/细胞(AAV9和AAV 10分别对应于AAV9-Δ5′reg-Dgkk和AAV10-Δ5′reg-Dgkk)。F)用加速旋转棒试验测试处理的小鼠的身体性能。数据对应于4天期间(1-4)掉落的时间(min)，如D中所述处理的小鼠(AAV9和AAV 10对应于AAV9-erroups(T检验)。Wt Ctr，Fmr1 y/+处理的盐水；A，Fmr1Y/-处理的盐水；B，Fmr1Y/-处理的AAV9-Δ5′reg-Dgkk；C，B Fmr1Y/-处理的AAV9-Δ5′reg-Dgkk.G)直接的社会相互作用。指示具有相同基因型的2只小鼠之间的触摸次数(平均值。数据coP≤0.05T-检验，n＝10)。Wt对照，Fmr1 y/+处理过的生理盐水；KO对照，Fmr1Y/-处理过的生理盐水；KO-AAV9，Fmr1Y/-处理的AAV9-Δ5′reg-Dgkk；KO-AAV10，Fmr1Y/-处理的AAV9-Δ5′reg-Dgkk。H)新的物体识别测试。在测试的第二天，针对新物体(NO)和熟悉物体(FO)指示％嗅探时间。数据是平均值±SEM，***P≤0.001 T-检验，n＝10。G中的组名称。I)Acfimetry测试。数据是24小时内光束中断的平均值±SEM，动物组标记为F，T检验中*P≤0.05，n≥9，ns无显著性。J)actimetry测量的细节。数据是如I中的光束中断的平均值±SEM。显示了每个时间段的P值。
[0030]
[0031]
[0032] 发明详述
[0033] 最近，发明人已经在皮质神经元中显示FMRP主要与一种独特的mRNA相关联：二酰基甘油激酶κ(Dgkk)，一种控制二酰基甘油和磷脂酸信号传导途径之间转换的主要调节因子(参见Tabet R et al，2016，Proc Natl Acad Sci USA，pii：201522631)。神经元中没有FMRP导致Dgkk表达的丧失。发明人已经证明，神经元中Dgkk表达的减少足以引起树突棘异常、突触可塑性改变和类似于脆性X综合征小鼠模型中观察到的行为障碍。因此，神经元中Dgkk的过表达能够挽救FMRP的缺失。总而言之，这些数据表明Dgkk失调导致脆性X综合征病理学并支持一种模型，其中FMRP通过控制Dgkk的翻译，通过影响树突棘中的脂质信号传导间接控制突触蛋白翻译和膜特性。
[0034] 发明人已发现，在细胞模型中不存在FMRP时，全长Dgkk核酸的过表达不会导致DGKk蛋白表达。因此，全长Dgkk核酸过表达不能挽救FMRP缺失的影响。然而，他们惊奇地发现，5′编码区截短的Dgkk的过表达消除了FMRP的控制并导致DGKk蛋白表达。这种截短的Dgkk核酸的表达显示能够拯救海马CA1锥体Fmr1-KO神经元的树突棘异常。本发明人还表明，在Dgkk核酸的这个5′编码区中，两个结构域是至关重要的：脯氨酸富含结构域和EPAPE重复结构域。缺乏功能性脯氨酸富含结构域或功能性EPAPE重复结构域确实足以消除FMRP的控制。
[0035] 因此，在第一方面，本发明涉及编码缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白质的核酸。优选地，编码人DGKk蛋白的核酸缺乏功能性脯氨酸富含区域和功能性EPAPE重复区域。
[0036] ·定义
[0037] 如本文所用，术语“脆性X综合征”、“fra(X)综合征”、“FXS”、“FRAXA综合征”、“标记X综合征”、“马丁-贝尔综合征”、“X连锁精神发育迟滞和大睾丸”、和“埃斯卡兰特综合症”是等同的，并且可以在本申请中用于另一种。如本文所用，“脆性X综合征”是指导致智力残疾、行为和学习挑战以及多种身体特征的遗传病症。脆性X综合征是未能表达脆性X智力迟滞蛋白的结果。
[0038] 如本文所用，术语“智力残疾(ID)”，“一般学习障碍”或“智力迟钝(MR)”是等同的，并且在本申请中一个可以用作另一个。如本文所用，“智力残疾”是指以智力和/或适应性功能显著受损为特征的全身性神经发育障碍。
[0039] 如本文所用，术语“脆性X智力迟滞蛋白”或“FMRP”是指由位于X染色体上的脆性X智力迟滞1基因(FMR1，基因ID：2332)编码的蛋白质(NCBI参考序列：NP_001172004.1；Uniprot KB：QO6787)。这种蛋白质是正常神经发育所必需的。
[0040] 通常，脆性X综合征是由于FMR1的5′非翻译区中CGG三核苷酸重复数目增加而发生的。根据CGG重复的长度，FMR1等位基因可分为：
[0041] -正常，在6到54个CGG重复之间，携带者不受该综合征的影响；
[0043] -完全突变，超过约200个CGG重复，携带者通常受脆性X综合征的影响。
[0044] FMR1的功能缺失突变和/或异常基因甲基化也可能参与脆性X综合征。
[0045] 如本文所用，术语“二酰基甘油激酶κ”或“DGKk”是指由位于X染色体上的Dgkk基因(基因ID：139189)编码的蛋白质(NCBI参考序列：NP_001013764.1；Uniprot KB：Q5KSL6；SEQ ID NO：9)。DGKk是能够将二酰基甘油转化为磷脂酸的酶。
[0047] 如本文所用，术语“核苷酸”是指具有糖(修饰的、未修饰的或其类似物)、核苷酸碱基(修饰的、未修饰的或其类似物)和磷酸基团(修饰的、未修饰的或其类似物)的化学部分。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和修饰的核苷酸类似物，包括例如锁核酸(“LNA”)、肽核酸(“PNA”)、L-核苷酸、乙烯桥接核酸(“ENA”)、阿拉伯糖苷、和核苷酸类似物(包括无碱基核苷酸)。
[0048] 如本文所用，术语“剪接”是指前RNA转录物的修饰，其中内含子被去除并且外显子被连接。
[0049] 如本文所用，术语“内含子”或“内含子序列”是指基因内的任何核苷酸序列，所述核苷酸序列在最终RNA产物成熟期间通过RNA剪接除去。RNA剪接后在最终成熟RNA中连接在一起的序列是“外显子”或“外显子序列”。术语“内含子”和“外显子”是指基因内的DNA序列和RNA转录物中的相应序列。
[0050] 特别地，根据本发明的核酸优选是从天然存在的基因中分离的DNA多核苷酸和/或经过修饰以含有核酸区段的DNA多核苷酸，所述核酸区段已经以在自然界中不存在的方式组合或并置，优选通过除去最初存在于天然存在的基因中的内含子序列。
[0051] 如本文所用，术语“5′UTR”、“5′非翻译区”、“前导序列”或“前导RNA”是等同的，并且可以使用一个用作另一个。它们指的是直接位于起始密码子上游的mRNA区域。该区域对于调节转录本的翻译是重要的。术语“5′UTR”指基因内的DNA序列和RNA转录物中的相应序列。
[0052] 如本文所用，术语“序列相同性”或“相同性”是指两个多核苷酸的精确的核苷酸与核苷酸的对应性。通过比对序列直接比较两个分子之间的序列信息，计算两个比对序列之间的确切匹配数，除以较短序列的长度，并将结果乘以100，可以确定相同性百分比。
[0053] 可以通过使用全局或局部比对算法比对两个核苷酸序列来确定序列相同性，这取决于两个序列的长度。优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)比对相似长度的序列，所述全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)比对显著不同长度的序列。当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时)共享至少一定的最小百分比的序列相同性时，序列可以被称为“基本相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数量并最小化间隙数量。当两个序列具有相似的长度时，全局比对适合用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)和缺口延伸罚分＝3(核苷酸)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS，89：915-919)。序列比对和百分比序列相同性的分数可以使用计算机程序确定，例如GCG Wisconsin Package，Version 10.3，可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752 USA获得，或使用开放资源软件，例如EmbossWIN版本2.10.0中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(对于“needle”和“water”两者，默认的缺口开放罚分为10.0，以及默认的缺口延伸罚分为0.5；默认的评分矩阵对于蛋白质为Blossum62和对于DNA为DNAFull)。当序列具有显著不同的总长度时，优选局部比对，例如使用Smith Waterman算法的比对。或者，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库来确定百分比相似性或相同性。
[0054] 如本文所用，术语“脯氨酸富含结构域”、“脯氨酸富含区域”、“脯氨酸富含序列”、“脯氨酸富含区段”和“PRR”是等同的并且可以使用一个用作另一个。它们指的是蛋白质的一部分，其主要包含脯氨酸。术语“脯氨酸富含区域”是指主要包含脯氨酸的蛋白质部分和编码它的基因内的DNA序列两者。人DGKk呈现N末端的脯氨酸富含区域(对应于SEQ ID No：1中核苷酸第70和132位之间的核苷酸区域)。
[0055] 如本文所用，术语“EPAPE重复结构域”、“EPAPE重复区域”、“EPAPE重复序列”、“EPAPE重复片段”是等同的并且可以使用一个用作另一个。它们是指蛋白质的一部分，其包含EPAPE基序的几个重复，所述EPAPE基序即连续的谷氨酸(Glutamic acid)、脯氨酸(Proline)、丙氨酸(Alanine)、脯氨酸(Proline)和谷氨酸(Glutamic acid)。术语“EPAPE重复区域”是指包含EPAPE基序的若干重复的蛋白质部分和编码它的基因内的DNA序列两者。人DGKk呈现N末端EPAPE重复区域(对应于SEQ ID No：1中核苷酸第142和539位之间的核苷酸区域)。
[0056] 在本文件中描述的肽或蛋白质序列中，氨基酸由它们的单字母代码表示，根据以下命名法：A：丙氨酸；C：半胱氨酸；D：天冬氨酸；E：谷氨酸；F：苯丙氨酸；G：甘氨酸；H：组氨酸；I：异亮氨酸；K：赖氨酸；L：亮氨酸；M：蛋氨酸；N：天冬酰胺；P：脯氨酸；Q：谷氨酰胺；R：精氨酸；S：丝氨酸；T：苏氨酸；V：缬氨酸；W：色氨酸和Y：酪氨酸。
[0057] 如本文所用，术语“突变”是指基因核苷酸序列的改变。术语突变包括但不限于以下：取代、缺失和插入。
[0058] 如本文所用，术语“取代”或“点突变”是等同的，并且是指由单个核苷酸交换成另一个核苷酸组成的突变。优选地，根据本发明的取代是错义突变。在错义突变中，交换的核苷酸是核苷酸三联体的一部分，其在突变后编码与原始三联体不同的氨基酸。优选地，突变不是沉默突变或无义突变。在沉默突变中，交换的核苷酸是核苷酸三联体的一部分，其在突变后编码与原始三联体相同的氨基酸。在无义突变中，交换的核苷酸是核苷酸三联体的一部分，其在突变后编码终止密码子并能因此截短蛋白质。
[0059] 如本文所用，术语“缺失”是指从DNA中去除一个或多个核苷酸的突变。根据本发明的缺失不会导致阅读框的移位(移码)。因此，缺失的核苷酸的数量是三的倍数。
[0060] 如本文所用，术语“插入”是指在DNA中添加一个或多个额外核苷酸组成的突变。根据本发明的插入不会导致读取框的移位。因此插入的核苷酸的数量是三的倍数。
[0061] 如本文所用，术语“表观遗传修饰”是指基因组的功能相关变化，其不涉及核苷酸序列的变化。产生这种变化的机制的实例是DNA甲基化和组蛋白修饰。
[0062] 如本文所用，术语“表达盒”是指包含编码区和表达所必需的调节区的核酸构建体，所述调节区可操作地连接于编码区。表述“可操作地连接”表示以这样的方式组合元件，使得编码区的表达处于调节区的控制之下。通常，调节区位于编码区的上游，其距离与编码区表达的控制相适应。调节区可包括启动子、增强子、沉默子、减弱子和内部核糖体进入位点(IRES)。间隔区序列也可以存在于调节元件和编码区之间，只要它们不阻止其表达即可。表达盒还可以包括在蛋白质编码基因前面的起始密码子、内含子的剪接信号、和终止密码子、转录终止子、多腺苷酸化序列。
[0063] 如本文所用，术语“启动子”和“转录启动子”是等同的，并且是指作为表达盒调节区的一部分的DNA区域。启动子是启动特定基因转录的调节元件。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5′区域)。如本文所用，术语“组成型启动子”是指在大多数组织中并且在大多数情况下在细胞中有活性的启动子。如本文所用，术语“受调节的启动子”或“诱导型启动子”是等同的，并且是指仅在响应特定物理或化学刺激时在细胞中被激活或抑制的启动子。术语“特异性启动子”是指仅能在特定器官或组织(例如脑)或特定细胞类型(例如神经元)中活化的启动子。
[0064] 如本文所用，术语“增强子”是指作为调节区的一部分的DNA的短(50-1500bp)区域。增强子是可以被蛋白质(激活剂)结合以增加转录在基因上发生的可能性的调节元件。增强子通常是顺式作用的，位于距离基因高达1Mbp(1,000,000bp)的位置，并且可以位于起始位点的上游或下游，并且可以在正向或反向方向。
[0065] 如本文所用，术语“转录终止子”是指核酸序列的一部分，其可以是表达盒的一部分并且在转录期间标记基因的末端。该序列通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，所述信号触发从转录复合物释放mRNA的过程。
[0066] 如本文所用，术语“载体”是指核酸分子，通常是用于将过客(passenger)核酸序列(即DNA或RNA)转移到宿主细胞中的DNA或RNA。载体可包含复制起点、选择标记和用于插入基因(例如多克隆位点)的合适位点。有几种常见类型的载体包括质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒和人工染色体。优选地，本发明的载体是DNA病毒载体。
[0067] 如本文所用，“病毒载体”是指包含以下一些或全部的载体：编码基因产物的病毒基因、控制序列和病毒包装序列。
[0068] 如本文所用，“细小病毒载体”是指重组产生的细小病毒或细小病毒颗粒，其包含待在体内、离体或体外待递送到宿主细胞中的多核苷酸。细小病毒载体的实例包括例如腺相关病毒载体(AAV)，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV-PHP.B(Devernam et al，2016，Nature Biotechnology，34，204-206)。本文中，细小病毒载体还指包含病毒基因组或其部分的多核苷酸，以及目标核酸。特别地，修饰的AAV序列也可用于本发明的上下文中。这种修饰的序列包括AAV，其中可以使用其他AAV的部分代替野生型AAV ITR(反向末端重复)、Rep(复制蛋白)或VP(病毒蛋白)序列。已知AAV VP蛋白质决定AAV病毒粒子的细胞嗜性。VP蛋白编码序列比ITR和Rep蛋白和不同AAV血清型中的基因显著更不保守。Rep和ITR序列交叉互补其他血清型的相应序列的能力允许产生包含一种血清型(例如AAV5)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(例如AAV2)的ITR序列的假型AAV颗粒。这种假型AAV颗粒可称为“x/y”型，其中“x”表示ITR序列的来源，“y”表示衣壳的血清型，例如AAV 2/9颗粒具有来自AAV2的ITR序列和来自AAV5的衣壳。
[0069] 如本文所用，术语“表达载体”是指设计用于细胞中基因表达的载体。表达载体允许将特定基因引入靶细胞，并且可以包括用于蛋白质合成的细胞机制以产生由该基因编码的蛋白质。表达载体包含表达元件，包括例如启动子、正确的翻译起始序列(例如核糖体结合位点和起始密码子)、终止密码子和转录终止序列。表达载体还可以包含其他调节区，例如增强子、沉默子和边界元件/绝缘子，以指导给定基因的转录水平。表达载体可以是用于稳定或瞬时表达基因的载体。如本文所用，“稳定表达”是指即使在宿主细胞复制后也能及时维持的基因表达。为了稳定表达，必须将引入的遗传物质整合到宿主基因组中。整合表达载体是适于稳定表达的表达载体。如本文所用，“瞬时表达”是指基因表达，其在时间上受限制，优选在1天至1年之间，更优选在10天至8个月之间，更优选在1个月至6个月之间，甚至更优选在2个月至4个月之间。对于瞬时基因表达，引入的遗传物质不必整合到宿主基因组中。
[0070] 如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指旨在改善患者健康状况的任何行为，例如治疗和预防疾病。
[0071] 如本文所用，术语“有效量”是指预防、延迟、消除或减少脆性X综合征的有害作用的核酸、表达盒、表达载体或药物组合物的量。
[0072] 如本文所用，术语“活性物质”、“活性成分”和“活性药物成分”是等同的，并且是指具有治疗效果的药物组合物的组分。
[0073] 如本文所用，术语“治疗效果”是指由活性成分或根据本发明的药物组合物诱导的效果，其能够预防或延迟脆性X综合征的出现、或治愈或减弱脆性X综合征的作用。
[0074] 如本文所用，术语“赋形剂或药学上可接受的载体”是指除药物组合物中存在的活性成分之外的任何成分。其添加可旨在赋予最终产品特定的稠度或其他物理或味觉性质。赋形剂或药学上可接受的载体必须与活性成分不存在任何相互作用，特别是化学相互作用。
[0075] 如本文所用，术语“基因疗法”是指使用基因以治疗、减弱、延迟或预防疾病(例如脆性X综合征)的技术。特别地，基因疗法可以是基因增强疗法，并且可以指将经修饰的人Dgkk基因引入体内以帮助对抗脆性X综合征。或者，基因治疗可以是缺失基因治疗，并且可以指在细胞基因组中将人Dgkk部分缺失以帮助对抗脆性X综合征。
[0077] 如本文所用，术语“噻唑烷二酮类的分子”、“噻唑烷二酮”或“格列酮”可互换使用，并且是指含有其中噻唑烷用作二酮的官能团的一类分子。噻唑烷二酮能够结合核PPAR-γ受体(过氧化物酶体增殖物激活受体y)。根据本发明的噻唑烷二酮可以选自吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮。优选地，根据本发明的噻唑烷二酮是吡格列酮。
[0078] 如本文所用，术语“mGluR”和“代谢型谷氨酸受体”可互换使用，并且是指可以结合谷氨酸的G蛋白偶联受体的C族家族的成员。mGluR通过间接代谢过程激活。根据本发明的mGluR配体可以是能够结合mGluR的任何分子。根据本发明的mGluR配体可以是mGluR的激动剂。
[0079] 在本文件中，术语“约”是指值的范围为指定值的±10％。例如，“约50”包括50的±10％的值，即45和55之间的值。优选地，术语“约”指的是指定值的±5％的值范围。
[0080] ·核酸
[0081] 本发明涉及编码人DGKk蛋白的核酸。根据本发明的核酸缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域。如本文所用，“功能区”或“功能结构域”是等同的，并且是指通过FMRP参与控制人Dgkk基因表达的区域。在人Dgkk基因中缺乏功能性脯氨酸富含区域或功能性EPAPE重复区域消除或减少了FMRP对该基因表达的控制。在人Dgkk基因中缺乏功能性脯氨酸富含区域或功能性EPAPE重复区域允许该Dgkk基因独立于FMRP而表达。根据本发明的核酸可能缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域，因为这些区域中的一个或两个是无功能的或已被缺失。
[0082] 在一个具体实施方案中，根据本发明的核酸编码人DGKk蛋白，其包含非功能性脯氨酸富含区域和/或非功能性EPAPE重复区域。
[0083] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸编码缺乏脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域的蛋白质。特别是，脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域已被缺失。
[0084] 在一些实施方案中，根据本发明的核酸编码人DGKk蛋白，其独立于FMRP而表达。
[0085] 优选地，根据本发明的核酸在其序列中包含一个或几个突变，所述突变导致缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的核酸。根据本发明的突变可以是取代、缺失和/或插入。所述突变可以在相关区域中或在相关区域内。或者，根据本发明的核酸包含一个或几个表观遗传修饰，所述表观遗传修饰导致缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域的核酸。
[0086] 在一个具体实施方案中，根据本发明的核酸包含所述富含脯氨酸区域和/或所述EPAPE重复区域的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的缺失。
[0087] 根据本发明的核酸编码功能性“DGKk蛋白”。如本文所用，术语“功能性蛋白”是指人DGKk蛋白，其能够在细胞中实现与正常DGKk蛋白相同的功能。优选地，除了废除通过FMRP对其表达的调节，它受到与正常DGKk蛋白相同的调控。特别地，DGKk蛋白的催化功能在由根据本发明的核酸编码的蛋白质中被保留。特别地，催化功能是从磷酸化二酰基甘油(DAG)产生磷脂酸(PA)的能力。特别地，功能性DGKk蛋白包含Pleckstrin同源结构域(PH结构域)和催化结构域。所述PH结构域位于第216和309位之间，所述催化结构域位于人DGKk蛋白的第487和622位之间(如NCBI参考序列：NP_001013764.1；Uniprot KB：Q5KSL6所公开；也参见SEQ ID NO：9)。
[0088] 优选地，根据本发明的核酸仅包含外显子序列。
[0089] 优选地，根据本发明的核酸缺乏5′UTR。
[0090] 在一个具体实施方案中，根据本发明的核酸编码缺乏功能性脯氨酸富含区域的人DGKk蛋白。优选地，根据本发明的核酸编码缺乏脯氨酸富含区域的人DGKk蛋白。或者，根据本发明的核酸编码包含非功能性脯氨酸富含区域的人DGKk蛋白。
[0091] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的核酸编码缺乏功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。优选地，根据本发明的核酸编码缺乏EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。或者，根据本发明的核酸编码包含非功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。
[0092] 在更优选的实施方案中，根据本发明的核酸编码缺乏功能性脯氨酸富含区域和功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。优选地，根据本发明的核酸编码缺乏脯氨酸富含区域和EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。或者，根据本发明的核酸编码包含非功能性脯氨酸富含区域和非功能性EPAPE重复区域的人DGKk蛋白。
[0093] 在一个优选的实施方案中，由于其序列中的突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰，根据本发明的核酸缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域。因此，根据本发明的核酸可以是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％的相同性、甚至更优选至少约99％的相同性，并且包含在SEQ ID No：1的第70-132位和/或第142-539位的核苷酸序列中的一个或多个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰，或任选地包含在SEQ ID No：1的第4-69位和/或第133-141位和/或第540-648位的核苷酸序列中的一个或几个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0094] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％相同性、甚至更优选至少约99％相同性，并且包含在SEQ ID No：1的第70-132位和/或第142-539位的核苷酸序列中的一个或多个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0095] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％的相同性、甚至更优选至少约99％的相同性，并且包含在SEQ ID No：1的第70-132位核苷酸序列中的一个或几个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0096] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％的相同性、甚至更优选至少约99％的相同性，并且包含在SEQ ID No：1的第142-539位核苷酸序列中的一个或几个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0097] 在一个优选的具体实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％相同性、甚至更优选至少约99％相同性，并且包含在SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的核苷酸序列中的一个或几个突变(优选缺失)和/或表观遗传修饰。
[0098] 优选地，当突变是缺失时，第70-132位的序列和/或第142-539位的序列中的总缺失率为相应的核苷酸序列的至少约20％、优选至少约30％、更优选至少约40％，更多优选地至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，并且甚至更优选至少约99％。
[0099] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％相同性、甚至更优选至少约99％相同性，并且包含SEQ ID No：1的核苷酸第70-132位和/或第142-539位的缺失，并且任选地包含在SEQ ID No：1的第4-69位和/或第133-141位和/或第540-648位的核苷酸序列中的一个或几个缺失。
[0100] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％相同性、甚至更优选至少约99％相同性，并且包含选自由以下组成的组的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-132位的序列、SEQ ID No：1的第4-142位的序列、SEQ ID No：1的第4-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-648位的序列。
[0101] 在更优选的实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：与SEQ ID No：1的核苷酸序列具有至少约70％相同性、优选至少约80％相同性、更优选至少约90％相同性、更优选至少约95％相同性，甚至更优选至少约99％相同性，并且包含选自由以下组成的组的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的序列、以及SEQ ID No：1的第4-539位的序列。
[0102] 在甚至更优选的实施方案中，根据本发明的核酸是具有以下的核酸：具有SEQ ID No：1序列，并且包含选自由以下组成的组的序列的缺失：SEQ ID No：1的第70-132位的序列、SEQ ID No：1的第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-132位和第142-539位的序列、SEQ ID No：1的第70-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-132位的序列、SEQ ID No：1的第4-142位的序列、SEQ ID No：1的第4-539位的序列、SEQ ID No：1的第4-648位的序列。
[0103] 在一个具体实施方案中，根据本发明的核酸具有第70-132位核苷酸已缺失的SEQ ID No：1的序列。
[0104] 在另一个具体的实施方案中，根据本发明的核酸具有第142-539位核苷酸已缺失的SEQ ID No：1的序列。
[0105] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸具有第70-132位和第142-539位核苷酸已缺失的SEQ ID No：1的序列。
[0106] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸具有第4-539位核苷酸已缺失的SEQ ID No：1的序列。
[0107] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的核酸与SEQ ID No：1的第648-3816位、优选第539-3816位、更优选第4-69位和第539-3816位，并且甚至更优选第4-69位、第133-141位和第539-3816位的核苷酸序列具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、99％的相同性。
[0108] ·表达盒
[0109] 在第二方面，本发明还涉及表达盒，其包含可操作地连接于调节区的根据本发明的核酸。
[0110] 优选地，所述表达盒的所述调节区包含允许在所述宿主细胞中表达所述核酸的启动子，甚至更优选地，所述调节区是启动子。所述调节区还可以包含其他调节元件，优选地，所述调节区包含至少一个与所述启动子可操作连接的增强子。间隔区序列也可以存在于所述调节元件之间和所述调节区与所述核酸之间的所述表达盒中。
[0111] 本领域技术人员可以容易地选择适合于使根据本发明的核酸在细胞或生物体中表达的品种繁多的启动子。用于哺乳动物细胞的合适启动子的实例例如描述于Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3 edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
[0112] 所述启动子可以是与Dgkk基因天然相关的启动子。
[0113] 所述启动子也可以是与Dgkk基因异源的组成型或诱导型启动子。优选地，所述启动子是组成型启动子。
[0114] 根据本发明的启动子还可以是器官或组织特异性的，优选脑特异性的。优选地，根据本发明的启动子是细胞类型特异性的，优选神经元特异性的。
[0115] 根据本发明的合适的启动子的实例包括但不限于人突触蛋白-1基因启动子、人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II基因启动子、神经肽生长抑素(SST)基因启动子、人微管蛋白αI基因启动子、人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因启动子、人血小板衍生生长因子β链基因启动子、人前脑啡肽原基因启动子、人多巴胺b羟化酶(dbH)基因启动子、人催乳素基因启动子、人胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子、人谷氨酸脱羧酶(GAD67)基因启动子、人同源框Dlx5/6基因启动子、人谷氨酸受体1(GluR1)基因启动子、人前胰蛋白酶原1(Tac1)基因启动子、人多巴胺能受体1(Drd1a)基因启动子、人芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)基因启动子、神经丝基因启动子、甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因启动子的片段(特别是其-677/+56片段，如Adachi et al，Hum Mol Genet.200514，3709-22所公开)、和血清素受体基因启动子。
[0116] 优选地，根据本发明的启动子是人突触蛋白-1基因启动子。
[0117] 所述表达盒可以进一步包含转录终止子，任选地随后是3′反向末端重复序列(3′ITR)，所述转录终止子可操作地连接至根据本发明的核酸。本领域技术人员可以容易地选择转录终止子。例如，合适的转录终止子是β-珠蛋白转录终止子或人生长激素多腺苷酸化信号。
[0118] ·表达载体
[0119] 在第三方面，本发明还涉及表达载体，其包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达盒。
[0120] 优选地，所述表达载体是DNA病毒表达载体。
[0121] 优选地，所述表达载体适合于转化哺乳动物细胞，优选人细胞。
[0122] 表达载体可以通过本领域技术人员熟知的经典分子生物学技术构建。
[0123] 优选地，本发明的表达载体包含调节元件，例如启动子和/或增强子，优选启动子，特别是人突触蛋白-1基因启动子。根据宿主细胞选择这些元件的方法是本领域技术人员公知的，所述宿主细胞中进行期望的表达。
[0124] 根据本发明的表达载体可以是用于稳定或瞬时表达的载体。
[0125] 在一个具体实施方案中，所述表达载体是适合于稳定表达的整合载体。这种载体包含一个或几个序列，所述序列允许所述表达载体、所述表达盒或所述核酸靶向插入宿主细胞的基因组中。
[0126] 在优选的实施方案中，所述表达载体是用于瞬时表达的载体。
[0127] 优选地，所述表达载体是特异性靶向脑细胞的载体。甚至更优选地，所述表达载体是特异性靶向神经元的载体。
[0128] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的表达载体选自由以下组成的组：慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)、重组HSV载体和细小病毒载体，优选细小病毒载体，甚至更优选腺相关病毒载体(AAV)。
[0129] 在甚至更优选的实施方案中，根据本发明的表达载体是腺病毒相关病毒载体，其选自由以下组成的组：腺相关病毒1、腺相关病毒2、腺相关病毒5、腺相关病毒9、腺相关病毒rh.10、腺相关病毒2/1、腺相关病毒2/5、腺相关病毒2/9、腺相关病毒2/rh.10，优选根据本发明的表达载体是腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/rh.10，甚至更优选腺相关病毒2/9。
[0130] 在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的表达载体是包含人突触蛋白-1基因启动子的腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/rh.10，优选包含人突触蛋白-1基因启动子的腺相关病毒2/9。
[0131] 在一个具体实施方案中，根据本发明的表达载体是腺相关病毒载体，其中1至约50个丙氨酸，优选约5至约25个丙氨酸，更优选约10至约20个丙氨酸，甚至更优选19个丙氨酸已经被加入到VP衣壳蛋白中，优选VP2衣壳蛋白。例如，这种载体可以是AAV-AS载体(Choudhury et al，2016，Mol Ther.2016，24，726-35)。
[0132] 在另一个具体实施方案中，根据本发明的表达载体特异性靶向谷氨酸能神经元。优选地，这种载体是经修饰以将mGluR配体表达到其衣壳中的载体。根据本发明的mGluR配体可以是mGluR激动剂。
[0133] 可选地，可以将模拟对于细胞质动力蛋白的结合结构域的肽和/或衍生自NMDA受体拮抗剂的肽插入衣壳中(Xu et al，2005，Virology，341，203-214)。
[0134] ·作为药物的用途
[0135] 在第四方面，本发明还涉及根据本发明的核酸，根据本发明的表达盒，或根据本发明的表达载体，其用作药物。
[0136] 本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的核酸，根据本发明的表达盒或根据本发明的表达载体。
[0137] 根据本发明的药物组合物还可包含另一种活性成分。特别地，根据本发明的药物组合物可以进一步包含PPARγ激动剂，优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮。实际上，本发明人已经显示PPARγ激动剂(特别是吡格列酮)增加或改善DgK活性。关于额外的治疗剂的共同施用的指导可以例如在Canadian Pharmacists Association的Compendium of Pharmaceutical and Specialties(CPS)中找到。
[0138] 优选地，药物组合物还包含至少一种赋形剂或药学上可接受的载体，优选选自由以下组成的组：溶剂、等渗和吸收延迟剂、抗粘附剂、粘合剂、包衣、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和载体。
[0139] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物，其用于在有需要的对象中治疗脆性X综合征，或治疗与神经元中Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾，优选治疗脆性X综合征。任选地，它可以与另一种活性成分组合使用。在一个实施方案中，所述其他活性成分是PPARγ激动剂，优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮。
[0140] 本发明还涉及在有需要的对象中治疗脆性X综合征或与神经元中Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾的方法，优选治疗脆性X综合征的方法，所述方法包括对对象施用有效量的根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物。任选地，所述方法可以进一步包括施用另一种活性成分。在一个实施方案中，所述其他活性成分是PPARγ激动剂，优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮。
[0141] 本发明还涉及根据本发明的的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体在制备用于在有需要的对象中治疗脆性X综合征或与神经元中Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾(优选脆性X综合征)的药物中的用途。任选地，它可以与另一种活性成分组合使用。在一个实施方案中，所述其他活性成分是PPARγ激动剂，优选噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮。
[0142] ·对象、方案和施用
[0143] 本发明的对象是人，优选新生儿或儿童。可选地，所述对象可以是成年人。
[0144] 在优选的实施方案中，所述对象已被诊断患有脆性X综合征。脆性X综合征的诊断方法是本领域技术人员所熟知的。特别地，鉴定FMR1基因中的功能丧失突变足以诊断表现出发育迟缓或智力残疾的个体中的脆性X综合征。脆性X综合征的诊断可分为三个步骤：1)发育、行为和认知功能的历史和评估；2)针对病症特征和相关FMR1疾病的有针对性的家族史；3)分子遗传学测试，即通过Southern印迹或PCR(聚合酶链式反应)对FMR的三核苷酸重复区进行靶向突变分析。
[0145] 在一个替代实施方案中，所述对象未被诊断患有脆性X综合征，但呈现出与Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾，优选在神经元中。Dgkk表达的这种降低可能是Dgkk基因的脯氨酸富含区域和/或EPAPE富含区域中突变的结果。
[0146] 优选地，所述对象的治疗在诊断后不到一年开始，优选在诊断后不到一个月。
[0147] 根据本发明的核酸，根据本发明的表达盒，根据本发明的表达载体或根据本发明的药物组合物可以通过任何常规施用途径施用，优选肠胃外施用，甚至更优选通过静脉内途径施用。在一个具体实施方案中，施用途径是颅内，例如在皮质或海马区域。施用途径也可以是鞘内注射，即在脑脊髓轴的任何水平的脑脊液内施用，包括注入脑室(也参见"Route of Administration".25 Data Standards Manual.Food and Drug Administration.Retrieved 11 March 2011)。
[0148] 在优选的实施方案中，所述对象用包含瞬时表达载体的药物组合物治疗。因此，所述治疗必须定期施用，优选在约每周至约一年之间，更优选在约2周至约9个月之间，更优选在约每月至约每6个月之间，甚至更优选在约每2个月至约每4个月之间。
[0149] 优选地，根据本发明的表达载体以每次注射包含1010至1013(优选包含1011至1012)的载体基因组(VG)的剂量施用。本领域技术人员可以根据载体的类型、患者(特别是其年龄、体重和一般身体状况)、以及疾病的严重程度，调整待施用的载体剂量。
[0150] 在一个特别优选的实施方案中，所述对象用包含腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/rh.10的药物组合物治疗，所述腺相关病毒包含可操作地连接于本发明的核酸的人突触蛋白-1基因启动子。
[0151] ·试剂盒和试剂盒的用途
[0152] 在第五方面，本发明还涉及用于治疗对象的脆性X综合征的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物、及施用它们的工具以及任选地提供使用这种试剂盒的指导的说明书。
[0153] 在另外的实施方案中，本发明还涉及试剂盒，其包含根据本发明的核酸、根据本发明的表达盒、根据本发明的表达载体、或根据本发明的药物组合物和噻唑烷二酮家族的PPARγ激动剂，更优选选自选自由以下组成的组的分子：吡格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、萘格列酮、利格列酮和曲格列酮，甚至更优选吡格列酮，作为组合制剂用于同时、分开或顺序使用，用于在有此需要的对象中治疗脆性X综合征或与神经元中Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾，优选脆性X综合征。
[0154] 本发明还涉及如上所述的试剂盒在需要其的对象中治疗脆性X综合征或与神经元中Dgkk表达降低相关的另一种智力残疾，优选脆性X综合征中的用途。
[0155] 优选地，所述对象是人。
[0156] ·缺失基因疗法
[0157] 在第六方面，本发明还涉及用于在细胞基因组中靶向重组人Dgkk基因的工具，其中所得重组Dgkk基因缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域。可以通过同源重组引入脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域中的修饰或缺失。例如，系统Crispr/Cas9可用于修饰基因。
[0158] 在优选的实施方案中，用于人Dgkk基因的靶向重组的工具包括编码该基因特异性的指导RNA的核酸。如本文所用，术语“指导RNA”是指包含固定于Crispr/Cas9酶的RNA结构和与Dgkk基因的靶序列互补的RNA序列的RNA。如本文所用，术语“Crisp/Cas9酶”是指RNA引导的DNA核酸内切酶，所述内切酶切割与其指导RNA互补的DNA底物，并因此允许人Dgkk基因的重组。
[0159] 优选地，所述指导RNA靶向包含在SEQ ID No：1的第70-132位和/或第142-539位序列中的一个或几个核苷酸序列。
[0160] 优选地，用于人Dgkk基因的靶向重组的工具还包含编码Crispr/Cas9酶的核酸。优选地，相同的核酸编码指导RNA和Crispr/Cas9酶。
[0161] 在一个优选的实施方案中，本发明包含表达载体，其包含与编码Crispr/Cas9酶的基因可操作地连接的启动子和编码特异性靶向人Dgkk基因重组的指导RNA的基因，其中所得的重组Dgkk基因缺乏功能性脯氨酸富含区域和/或功能性EPAPE重复区域。
[0162] 优选地，所述表达载体是腺相关病毒2/9或腺相关病毒2/rh.10，甚至更优选腺相关病毒2/9。
[0163] 优选地，所述启动子是细胞类型特异性的，优选神经元特异性的。
[0164] 优选地，所述启动子是人突触蛋白-1基因启动子。
[0165] 在一个具体实施方案中，指导RNA靶向SEQ ID No：1的核苷酸第70-132位的缺失。
[0166] 在另一个具体实施方案中，指导RNA靶向SEQ ID No：1的核苷酸第142-539位的缺失。
[0167] 在另一个具体实施方案中，指导RNA靶向SEQ ID No：1的核苷酸第70-132位和第142-539位的缺失。
[0168] 在另一个特定实施方案中，指导RNA靶向SEQ ID No：1的核苷酸第4-539位的缺失。
[0169] 本发明还涉及用于本发明的人Dgkk基因的靶向重组的工具，其用作药物。优选地，本发明涉及表达载体，其包含与编码Crispr/Cas9酶的基因和编码本发明的指导RNA的基因可操作地连接的启动子，其用作药物，优选用于在有此需要的对象中治疗脆性X综合征。
[0170] 本发明还涉及药物组合物，其包含用于人Dgkk基因的靶向重组的工具。优选地，本发明涉及包含表达载体的药物组合物，所述表达载体包含与编码Crispr/Cas9酶的基因和编码本发明的指导RNA的基因可操作地连接的启动子，优选用于在有此需要的对象中治疗脆性X综合征。优选地，所述对象是人。
[0171] 本发明还涉及在有此需要的对象中治疗脆性X综合征的方法，包括对所述对象施用有效量的表达载体，所述表达载体包含与编码Crispr/Cas9酶的基因和编码本发明的指导RNA的基因可操作地连接的启动子，或施用根据本发明的药物组合物。优选地，所述对象是人。
[0172] 本发明还涉及表达载体在制备用于在有此需要的对象中治疗脆性X综合征的药物的用途，所述表达载体包含与编码Crispr/Cas9酶的基因和编码本发明的指导RNA的基因可操作地连接的启动子。优选地，所述对象是人。
[0174] 尽管具有不同的含义，但术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”在整个申请中可以彼此替换。
[0175] 本发明的其他方面和优点将在以下实施例中描述，这些实施例应视为说明性的而非限制性的。实施例
[0176] 实施例1：鉴定在Cos-1细胞中通过FMRP控制Dgkk表达所涉及的区域。
[0177] 材料与方法
[0178] 细胞培养：COS细胞( CRL-1650TM)在抗生素存在下，在37℃，5％CO2下，在补充有10％胎牛血清、1g/l葡萄糖的DMEM中生长。转染前一天，将4x104个细胞接种到500μl无抗生素培养基中的24孔板中。
[0179] 质粒构建：从克隆IMAGE IRAVp968H03163D亚克隆小鼠Dgkκ。用引物GCAGCTAGCTCCTTGAAAGCTGGAAGGAGA(SEQ ID No：2)和AATAGAATGCGGCCGCCAGCTTCAACAGCACTTGTAG(SEQ ID No：3)通过PCR从小鼠基因组DNA克隆缺失的Dgkκ 3′UTR区，并将其导入pYX-Dgkκ载体的XbaI和NotI位点以得到pYX-DgkκFull。使用pCI-DgkκFull作为模板(通过将Dgkk亚克隆到pCI载体GenBank U47119中获得)并通过在终止密码子之前使用引物有义(TTCTCAACTATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAGTCCTTG-AAAGCTGGAAGG，SEQ ID No：4)和反义(TCAAGGACTAAGCGTAATCTGGA-ACATCGTATGGGTATAGTTGAGAACTTGAAGGTGTTG，SEQ ID No：5)添加HA序列，通过PCR亚克隆获得质粒pCI-Dgkκ-FL(参见图1、上表1和SEQ ID No：8)。
[0180] 通过将pYX-mDgkk亚克隆到pEGF-N1(U55762)中以获得并通过酶消化pCi-mDgkk-3′UTR并定向诱变以便插入标签HA和缺失5′区域以完成质粒Δ5′reg-Dgkk(参见图1)。
[0181] 通过插入预先克隆到pEGFP-C1(U55763)载体中的5′区片段以获得并通过定向诱变以插入标签HA，以完成质粒5′reg-Dgkk(参见图1)。
[0182] 通过直接诱变pEGF-C1 5′reg质粒以除去所需的序列，来获得Δ5′UTR-5′reg-Dgkk，ΔPro-5′reg-Dgkk，ΔEPAPE-5′regDgkk，ΔEPAPEI-5′reg-Dgkk和ΔEPAPEII-5′reg-Dgkk质粒(参见图1)。
[0183]
[0184] 表1：Dgkκ-FL质粒构建体的主要相关结构域的位置
[0185] (编号从Dgkk基因的5′UTR开始)
[0186] *在ΔEPAPE II-5′reg-Dgkk构建中，对应于Dgkk-FL质粒中的531-857序列，缺失了EPAPE基序的最后5个重复(总共10个)
[0187] 转染和蛋白质印迹分析：sh-RNA的转染用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)如制造商所指导地用20pmol siRNA(Control或On Target plus Smart Pool mouse FMR1，Thermo)以最终体积为600μl在60000细胞上一式三份进行。二十四小时后，如上共转染0.6μg质粒构建体和20pmol shRNA。四十八小时后，在PBS中洗涤两次的细胞直接在上样缓冲液(100mM Tris-HCl、pH6.8、4％SDS、30％甘油、1.4M β-巯基乙醇和溴酚蓝)中于95℃裂解3分钟。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质，并在Tris-甘氨酸-SDS/20％乙醇缓冲液中在200mA下免疫印迹到PVDF(Millipore)上1小时。将膜在4℃下与小鼠抗FMRP 1C3 1∶10000、小鼠抗HA 1∶1000或小鼠抗GAPDH 1∶10000孵育过夜，并在室温下与过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体孵育(1/5000)。用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce，Rockford，IL)显现免疫反应条带。
[0188] 结果
[0189] 发明人已经研究了FMRP对Cos-1细胞中Dgkk表达的影响。用表达全长Dgkk构建体(Dgkk-FL，参见图1)、缺乏其5′编码区及其5′-UTR的Dgkk构建体(Δ5′reg-Dgkk，参见图1)的质粒或对照质粒转染Cos-1细胞。两种Dgkk构建体都包含HA标签，允许用特异性抗体进行检测。在质粒转染之前，用靶向Fmr1的siRNA或通过对照siRNA处理Cos-1细胞。
[0190] 使用抗FMRP抗体的Western印迹结果显示，与对照siRNA条件相比，靶向Fmr1的siRNA有效降低FMRP的表达(参见图2A)。FMRP的表达降低约70％(参见图2B或2C)。
[0191] 当FMRP表达降低时，与对照条件相比，Dgkk-FL的表达水平也降低约70％(参见图2A和2B，具有HA抗体)。这些结果证明FMRP正向控制Dgkk的表达。
[0192] 相反，Δ5′reg-Dgkk构建体的表达不受FMRP表达降低的影响(参见图2A和2C)，表明Δ5′reg-Dgkk表达不受FMRP控制。这些结果强调了包含Dgkk的5′编码区和5′UTR的Δ5′区域对于通过FMRP控制Dgkk表达至关重要。因此，与全长Dgkk基因相反，Δ5′reg-Dgkk构建体可以在缺乏FMRP的细胞中表达。
[0193] 此外，比较Δ5′reg-Dgkk和Dgkk-FL之间HA标记的强度似乎表明，与FMRP对照无关，Δ5′reg-Dgkk的基础表达水平可能优于Dgkk-FL的基础表达水平。在图3的实验中，通过不同的Dgkk构建体(包括Dgkk-FL和Δ5′reg-Dgkk)转染Cos-1细胞，然后通过蛋白质印迹在相同的凝胶上分析它们的表达。在Dgkk-FL和Δ5′reg-Dgkk构建体之间发现了显著的表达差异，证实Dgkk的5′区域对Dgkk的表达水平发挥抑制作用。
[0194] 因此，抑制Dgkk的5′区域抑制FMRP对Dgkk表达所施加的正向控制并增强Dgkk的表达。
[0195] 在第二系列实验中，发明人旨在确定Dgkk的5′区域的哪个部分在通过FMRP控制Dgkk表达中是重要的。为了实现该目标，发明人制备了不同的构建体，其全部包含GFP和HA标签用于它们的检测(参见图1)。第一个构建体5′reg-Dgkk包含在Δ5′reg-Dgkk构建体中除去的序列：Dgkk的5′编码区和Dgkk的5′UTR。然后，在每个其他构建体中，去除5′reg-Dgkk序列的一部分：Δ5′UTR-5′reg-Dgkk构建体中为5′UTR，ΔPro-5′reg-Dgkk中为脯氨酸富含区域，ΔEPAPE-5′reg-Dgkk构建体中为EPAPE重复区域和其余的5′reg-Dgkk，ΔEPAPEI-5′reg-Dgkk构建体中为EPAPE重复区域，并且ΔEPAPEII-5′reg-Dgkk构建体中为EPAPE重复区域的第二半部分。然后，如前所述，在存在或不存在Fmr1 siRNA的情况下，通过这些构建体转染Cos-1细胞，并通过蛋白质印迹分析构建体的表达。
[0196] 在使用5′reg-Dgkk构建体的实验中，与对照条件相比，用Fmr1 siRNA转染的细胞中FMRP表达水平降低约80％(图4A和B，第一幅图)。当FMRP表达水平降低时，5′reg-Dgkk构建体的表达水平也降低了约45％。这些结果证明Dgkk的5′区域足以允许FMRP对表达的正向控制。
[0197] 在使用Δ5′UTR-5′reg-Dgkk构建体的实验中，与对照条件相比，用siRNA Fmr1转染的细胞中FMRP表达水平降低约60％(图4A和B，第二幅图)。当FMRP表达水平降低时，Δ5′UTR-5′reg-Dgkk构建体的表达水平降低约25％。这些结果表明，在Dgkk的5′区域中不存在5′UTR时，维持了FMRP对表达的控制。因此，5′UTR在通过FMRP控制Dgkk的表达中似乎不是最重要的。此外，与先前相比，本实验中FMRP对表达的控制从50％到30％的明显减少可能是FMRP消除较少的结果(在先前实验中为50％而不是80％)。
[0198] 在使用ΔPro-5′reg-Dgkk构建体的实验中，与对照条件相比，用siRNA Fmr1转染的细胞中FMRP表达水平降低约80％(图4A和B，第三幅图)。ΔPro-5′reg-Dgkk构建体的表达水平不受FMRP表达水平降低的影响。这些结果表明，当从其序列中除去脯氨酸富含区域时，FMRP不能控制Dgkk的5′区域的表达，这表明脯氨酸富含区域在通过FMRP控制Dgkk的表达中是至关重要的。
[0199] 在使用ΔEPAPE-5′reg-Dgkk构建体的实验中，与对照条件相比，用siRNA Fmr1转染的细胞中FMRP表达水平降低约70％(图4A和B，第四幅图)。ΔEPAPE-5′reg-Dgkk构建体的表达水平不受FMRP表达水平降低的影响。这些结果表明，当EPAPE重复区域从其序列中移除时，FMRP不能控制Dgkk的5′区域的表达，这表明EPAPE重复区域在通过FMRP控制Dgkk的表达中是至关重要的。
[0200] 在使用ΔEPAPE I-5′reg-Dgkk构建体或ΔEPAPE II-5′reg-Dgkk构建体的实验中，与对照条件相比，Fmr1基因转染的细胞中FMRP表达水平减少约60％(图4A和B，第五和第六幅图)。ΔEPAP I-5′reg-Dgkk构建体和ΔEPAPE II-5′reg-Dgkk的表达水平不受FMRP表达水平降低的影响。这些结果表明，当EPAPE重复区域的全部或一半从它的序列中除去时FMRP不能控制Dgkk的5′区域的表达，表明不完全EPAPE重复区域不够允许通过FMRP控制Dgkk的表达。
[0201] 此外，构建体5′reg-Dgkk、Δ5′UTR-5′reg-Dgkk、ΔPro-5′reg-Dgkk、ΔEPAPE-5′reg-Dgkk、ΔEPAPEI-5′reg-Dgkk和ΔEPAPEII-5′reg-Dgkk在同一凝胶上的表达的比较显示ΔPro-5′reg-Dgkk构建体的表达水平，并且尤其是ΔEPAPE-5′reg-Dgkk、ΔEPAPE I-5′-Dgkk和ΔEPAPE II-5′reg-Dgkk构建体的表达水平比5′reg-Dgkk的表达水平更高，证实了脯氨酸富含区域和EPAPE重复区域对Dgkk的表达施加了抑制行为。
[0202] 总之，这些结果证明了Dgkk的脯氨酸富含区域和EPAPE重复区域对通过FMRP正向控制Dgkk的表达的重要性。抑制Dgkk的5′编码区，特别是脯氨酸富含区域和/或EPAPE重复区域，足以消除FMRP对Dgkk表达的控制，因此这种修饰的Dgkk基因可以在细胞中独立于FMRP表达水平而表达。
[0203] 实施例2：用Δ5′-Dgkκ表达调节进行树突棘改变和拯救。
[0204] 材料与方法
[0205] AAV载体构建：设计用于靶向Dgkk(shRNA Dgkk，5′-GGAATGCACTACTGGTATTCC，SEQ ID No：6)的短发夹RNA和在小鼠基因组中的计算机模拟中没有匹配的所选择的shRNA-scramble序列(5′-GCGCTTAGCTGTAGGATTC，SEQ ID No：7)，在mU6启动子的控制下将其克隆到pAAV-MCS衍生的质粒中，该质粒在CMV启动子的控制下表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。通过在人类Synapsin-1基因启动子的控制下克隆HA标记的Δ5′reg-Dgkk来实现Dgkk的过表达，所述启动子取代对照质粒pENN.AAV.hSynapsin1.EGFP.RBG(由宾夕法尼亚大学的Penn Vector Core提供)中的EGFP。产生共表达EGFP和shRNA的重组腺相关病毒血清型9(AAV9)(AAV9-EGFP-shRNA-Dgkk和对照AAV9-EGFP-shRNA-scramble)以及表达HA-Dgkk或EGFP的AAV9(AAV9-hSynapsin1-HA-Dgkk和对照AAV9-hSynapsin1-EGFP)。使用具有一些修改的AAV Helper-Free系统(Agilent Technologies)进行AAV生产。使用pAAV-EGFP-shRNA-Dgkk或pAAV-EGFP-shRNA-scramble，pAAV-hSynapsin1-HA-Δ5′reg-Dgkk或
pENN.AAV.hSynapsin1.EGFP.RBG与pAAV2/9(Penn Vector Core)和pHelper一起通过三重转染293T/17细胞系产生载体AAV9，所述pAAV2/9含有AAV血清型9的cap基因。转染后两天，收集细胞，在37℃的干冰-乙醇浴中通过三次冷冻/解冻循环裂解，进一步用100U/ml Benzonase(Novagen)在37℃处理30分钟并通过离心澄清。通过碘克沙醇(OptiprepTM，Axis Shield)梯度超速离心纯化病毒载体，然后透析，并使用离心过滤器(Amicon Ultra-15
100K)对含有0.5mM MgCl2的PBS进行浓缩。使用线性化标准质粒pAAV-EGFP通过实时PCR定量病毒颗粒。为了达到相当的工作浓度，将病毒稀释至每ml(vg/ml)5×1012个病毒基因组的终浓度，并储存在-80℃直至使用。
pENN.AAV.hSynapsin1.EGFP.RBG与pAAV2/9(Penn Vector Core)和pHelper一起通过三重转染293T/17细胞系产生载体AAV9，所述pAAV2/9含有AAV血清型9的cap基因。转染后两天，收集细胞，在37℃的干冰-乙醇浴中通过三次冷冻/解冻循环裂解，进一步用100U/ml Benzonase(Novagen)在37℃处理30分钟并通过离心澄清。通过碘克沙醇(OptiprepTM，Axis Shield)梯度超速离心纯化病毒载体，然后透析，并使用离心过滤器(Amicon Ultra-15
100K)对含有0.5mM MgCl2的PBS进行浓缩。使用线性化标准质粒pAAV-EGFP通过实时PCR定量病毒颗粒。为了达到相当的工作浓度，将病毒稀释至每ml(vg/ml)5×1012个病毒基因组的终浓度，并储存在-80℃直至使用。
[0206] 切片培养物转染和成像：使用日内瓦兽医办公室批准的方案，从出生后5-6天龄的C57BL/6Fmr1+/y或其Fmr1-/y同窝小鼠制备海马器官型切片培养物(400μm厚)并保持在如所述的培养条件(De Roo M et al，2008，Cereb Cortex，18(1)：151-161)。使用涂有mRFP的金珠和pAAV-EGFP-shRNA-Dgkk、pAAV-EGFP-shRNA-scramble、pAAV-hSynapsin1-EGFP或pAAV-hSynapsin1-HA-Δ5′reg-Dgkk，在DIV7上用基因枪方法(Helios Gene Gun，Bio-Rad)进行转染。如前所述进行重复共聚焦成像(De Roo M et al，2008，Cereb Cortex，18(1)：151-161)。简而言之，使用Olympus Fluoview 300系统从DIV12到DIV15(在0、5、24、48和72小时)对CA1转染的神经元(长度为30-40μm)的树突片段进行成像并使用Osirix软件进行如此获得的Z-堆叠图像的分析。
[0207] 结果
[0208] 发明人研究了Dgkk功能丧失对树突棘形态和动力学的影响。小鼠海马器官切片CA1区Dgkk沉默导致异常长和多头棘的强烈增加和成熟棘的比例显著降低(参见图5A-D)，而棘密度保持不变(参见图5C)。另外，棘翻转的显著增加，如棘形成和消除的增加，与棘不稳定性相关(参见图5G-1)。这些数据表明Dgkk对于棘成熟和维持是必需的，并且其损失导致类似于先前在Fmr1-/y小鼠中观察到的结构缺陷(Comery TA et al，1997，Proc Natl Acad Sci USA，94(10)：5401-5404；He CX&Portera-Cailliau C，2013，Neuroscience，251：120-128)。为了在Dgkk和FMRP之间建立功能性关联，发明人测试了Fmr1-/y神经元内Δ5′reg-Dgkk的过表达是否可以挽救树突棘表型。值得注意的是，由表达Δ5′reg-Dgkk的AAV9转导的Fmr1-/y神经元修正了其棘缺陷(参见图5A-F Fmr1-/y+Δ5′reg-Dgkk)，表明Δ5′reg-Dgkk过表达能够以弥补FMRP的不足。
[0209] 实施例3：体外和体内AAVΔ5′reg-Dgkκ的转导，以及对Fmr1-KO小鼠行为的影响。
[0210] 材料与方法
[0211] AAV载体构建：如实施例2中所述制备在人突触蛋白-1基因启动子(AAV9-Δ5′reg-Dgkk和AAV10-Δ5′reg-Dgkk)的控制下表达HA标记的Δ5′reg-Dgkk的重组腺相关病毒血清型9(AAV9)和RH10(AAV10)。
[0212] 原代皮质神经元培养物：来自C57BL/6J Fmr1+/y或Fmr1-/y小鼠胚胎[胚胎日(E17.5)]的皮质在1xPBS、2.56mg/mL D-葡萄糖、3mg/mL BSA和1.16mM MgSO4中解剖；用0.25mg/mL胰蛋白酶和0.08mg/mL DNase I孵育20分钟；在用0.5mg/mL胰蛋白酶大豆抑制剂、0.08mg DNase I和1.5mM MgSO4补充培养基后进行机械解离。将细胞接种在聚-L-赖氨酸氢溴酸盐包被的六孔培养板上在补充有B27、青霉素/链霉素和0.5μML-谷氨酰胺的Neurobasal培养基(GIBCO)中8天。
[0213] 立体定向手术和AAV注射：小鼠(C57BL/6J)用溶于无菌等渗盐水(NaCl 0.9％)的氯胺酮/甲苯噻嗪(Virbac/Bayer，100/10mg/kg，10mL/kg，腹膜内)深度麻醉并安装在立体定位框架(Unimecanique)上。根据小鼠脑图谱坐标，在纹状体和海马两者中双侧注射AAV9-12
Δ5′reg-Dgkk、AAV10-Δ5′reg-Dgkk或AAV9-EGFP(每毫升5×10 个病毒基因组)。每个注射部位以1.5μL AAV载体的体积通过连接至输注泵的30号不锈钢套管以缓慢注射速率(0.1μL/min)双侧递送。在每次注射完成后，将注射器再放置10分钟以确保最佳扩散并在取出注射器时使回流最小化。在AAV注射后进行4周行为实验，以允许足够的时间进行病毒转导和Dgkκ表达。通过qRT-PCR和通过免疫荧光评估有效的基因表达。
Δ5′reg-Dgkk、AAV10-Δ5′reg-Dgkk或AAV9-EGFP(每毫升5×10 个病毒基因组)。每个注射部位以1.5μL AAV载体的体积通过连接至输注泵的30号不锈钢套管以缓慢注射速率(0.1μL/min)双侧递送。在每次注射完成后，将注射器再放置10分钟以确保最佳扩散并在取出注射器时使回流最小化。在AAV注射后进行4周行为实验，以允许足够的时间进行病毒转导和Dgkκ表达。通过qRT-PCR和通过免疫荧光评估有效的基因表达。
[0214] 行为实验：在纹状体注射后4周，在AAV9-Δ5′reg-Dgkk、AAV10-Δ5′reg-Dgkk或AAV9-EGFP处理的小鼠组进行行为测试盲试。直接社交互动和NOR在四个相等的方形场地(50x50厘米)中进行，所述方形场地是在白色有Plexiglas平台(观察点)上由35厘米高的不透明灰色Plexiglas墙隔开。
[0215] 直接社交互动：在第1天，将小鼠置于每个场地中15分钟适应。在第2天，在每个场地中引入一对动物(相同的条件，不是同笼伙伴)10分钟。以下事件在视频录制中记录分数：密切接触(鼻子和爪子接触)所花费的总时间，鼻子和爪子(爬过去、爬上、踩踏和推动)接触、以及相互理毛、以及大量的跟随、抚养和绕行事件的次数和持续时间。在这次测试中，我们观察到主角之间没有攻击行为(攻击、咬伤或尾巴嘎嘎声)。
[0216] 身体状况：用旋转棒(Bioseb)在5分钟内从4到40rpm加速评估身体性能。杆上覆盖有绝缘管以获得更好的抓力，外围为5厘米(40lx)。在第1天，使小鼠习惯于以4rpm在杆上旋转，直到它们能够保持＞180s。从第2天到第5天，对小鼠进行三次每日试验(试验间60-s)。每个试验开始于将小鼠放在杆上并以恒定的4rpm速度开始旋转60秒。然后启动加速程序，当特定鼠掉落杆时，试验结束。在杆上的时间自动记录。
[0217] 新物体识别(NOR)：如所述进行NOR测试(Le Merrer等人(2013)Neuropsychopharmacology 38(6)：1050-1059)。简言之，在第1天，将动物放置在场地中与两份不熟悉的物体适应15分钟。在第2天，识别测试由3次10分钟的试验组成，10分钟的试验由间隔5分钟的两个间隔分开。在熟悉阶段，给小鼠提供两份不熟悉的物体。在地点阶段，两份中的一个被转移到场地中的新位置。在对象阶段，先前试验中未移动的那份被新物体替换。刺激物体大小为1.5-3x 2-3厘米。在对象之间平衡对象的身份及其空间位置。在视频录制中对访问次数和探索每个对象所花费的时间进行评分。按照如下针对访问次数和探索物体的时间计算辨别的百分比：对移动的或新物体的探索/总探索x100。在视频录制中引用了象限交叉的模式。完全探索(FE；即形成重叠四重集的四个象限的连续交叉，例如ABCD)，象限返回(QR；例如ABCB)和象限交替(QA；例如，ABAB)被评分，并且FE，QR和QA的百分比计算如下：FE或QR或QA/(总交叉)x100。
[0218] 自发活动：在自动笼子(Imetronic，Pessac，France)中评估自发活动和食物/水摄入量的测量，以评价24小时内的生物节律和睡眠异常。从早上7点开始，笼子每天照射12小时。架子连接到电子接口以与计算机通信以进行自动数据存储。每只小鼠在下午6点被引入活动笼中，并在接下来的25小时内保持不受干扰。基于红外捕获器的断裂次数评估运动活动。在10分钟的箱中分别分析第一个测试小时，以评估运动反应和对新环境的适应。剩余的24小时在1小时-块中进行分析，其中12小-暗/光周期作为对象因子中的进一步，以评估运动活性的昼夜节律调节。
[0219] 统计分析：通过ANOVA分析所有数据，以遗传背景B6和Fmr1基因型(y/+或y/-)作为对象之间的因子。根据需要包括对象内部因子。使用Fisher′s LSD测试进行事后比较。数据表示为平均值±SEM。
[0220] 结果
[0221] 本发明人检测了腺相关病毒血清型9(AAV9)或rh10(AAV10)在解离的神经元培养物中或体内在C57BL/6Fmr1+/y或其Fmr1-/y同窝小鼠中的Δ5′reg-Dgkk表达的影响。来自C57BL/6Fmr1+/y或其Fmr1-/y同窝小鼠的皮层神经元在体外14天被有效转导(±100％)，并且通过用HA标签可视化Δ5′reg-Dgkk转基因很好地表达(图6A)。之前已经显示起始因子4E(eIF4E)的磷酸化在Fmr1-/y神经元和患者中增加(Gantois et al.Nat Med.2017 Jun；23(6)：674-677，图6B)并且提出了由脆性X条件下代谢型谷氨酸受体(mGluR)信号传导的过度活化引起的eIF4E磷酸化。发明人显示，AAV9(图6C)或AAV10(数据未显示)的Δ5′reg-Dgkk表达的表达在感染后7天降低了Fmr1-/y神经元中的eIF4E磷酸化。这些数据表明AAV9-Δ5′reg-Dgkk或AAV10-Δ5′reg-Dgkk载体具有纠正Fmr1-/y神经元中异常eIF4E磷酸化的潜力。发明人接下来检查了来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达的能力以校正Fmr1-/y小鼠的行为。C57BL/6J Fmr1+/y或Fmr1-/y小鼠在4周龄时在纹状体和海马区域两者接受AAV注射(2×10E10 GC/注射部位)。注射后4周，通过qRT-PCR和通过免疫荧光评估有效基因表达(图
6D、E)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达的表达对小鼠的身体条件没有影响，而与基因型无关(图)。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠与陌生小鼠的互动时间增加(焦虑减少)(图6A)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达校正该表型(图6A)。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠在新物体识别(NOR)测试中具有降低的记忆(Bhattacharya等，2012)。虽然Fmr1-/y小鼠缺乏区分新物体和熟悉物体的能力，但AAV9-Δ5′reg-Dgkk处理的动物显示出对熟悉物体和新物体的辨别能力(图6H)。这些数据表明对动物记忆的治疗的部分效率。将AAV靶向特定脑区可以解释部分恢复。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠在整个24小时期间(过度活跃)具有增加的活动(图6I)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达校正该表型(图6I)。总之，这些数据表明Δ5′reg-Dgkk表达具有改善脆性X的Fmr1-/y小鼠模型表型的能力。
6D、E)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达的表达对小鼠的身体条件没有影响，而与基因型无关(图)。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠与陌生小鼠的互动时间增加(焦虑减少)(图6A)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达校正该表型(图6A)。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠在新物体识别(NOR)测试中具有降低的记忆(Bhattacharya等，2012)。虽然Fmr1-/y小鼠缺乏区分新物体和熟悉物体的能力，但AAV9-Δ5′reg-Dgkk处理的动物显示出对熟悉物体和新物体的辨别能力(图6H)。这些数据表明对动物记忆的治疗的部分效率。将AAV靶向特定脑区可以解释部分恢复。与野生型Fmr1+/y相比，Fmr1-/y小鼠在整个24小时期间(过度活跃)具有增加的活动(图6I)。来自AAV9或AAV10的Δ5′reg-Dgkk表达校正该表型(图6I)。总之，这些数据表明Δ5′reg-Dgkk表达具有改善脆性X的Fmr1-/y小鼠模型表型的能力。
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