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一种人源化的转基因动物

阅读：926发布：2023-03-06

专利汇可以提供一种人源化的转基因动物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于研究人类疾病的转基因动物。特别地，本发明涉及表达至少两种人蛋白(任选地取代在动物中的相应蛋白)的转基因动物，其中第一人蛋白与第二人蛋白相互作用。可以将所述转基因动物用于评价药物或构建疾病模型，其与动物中表达的人蛋白相关。本申请公开的动物和方法降低了鉴定出假阳性化合物的可能性，所述假阳性化合物在天然的、非转基因动物中有效，但在人体内不一定有效或可能没有治疗作用，因为所述化合物可能仅干扰两种动物蛋白之间的相互作用，而不一定干扰两种相关的人蛋白之间的相互作用。并且，本申请公开的动物和方法降低了鉴定出假阴性化合物的可能性，所述假阴性化合物是在天然的、非转基因动物中不起作用或无效，但在人类中可能具有治疗作用，因为所述化合物可能仅干扰至少两种相关的人蛋白之间的相互作用，不一定干扰两种相关的动物蛋白之间的相互作用。，下面是一种人源化的转基因动物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人源化的转基因动物的制备方法，包括将第一人基因和第二人基因引入发育成所述转基因动物的胚胎干细胞的步骤，其中所述第一人基因编码第一人蛋白，第二人基因编码第二人蛋白，所述第一人蛋白和第二人蛋白之间彼此间相互作用，其中在所述转基因动物基因组中与所述第一人基因基本上同源的第一动物基因被所述第一人基因取代，并且在所述转基因动物基因组中与所述第二人基因基本上同源的第二动物基因被所述第二人基因取代。
2.一种人源化的转基因动物的制备方法，包括：
将第一人基因敲入第一动物，使得所述第一动物表达由所述第一人基因编码的第一人蛋白；
将第二人基因敲入第二动物，使得所述第二动物表达由所述第二人基因编码的第二人蛋白；
将所述第一动物和所述第二动物交配以产生同时表达第一人蛋白和所述第二人蛋白的子代，
其中所述第一人蛋白和所述第二人蛋白彼此间相互作用，在所述转基因动物基因组中与所述第一人基因基本上同源的第一动物基因被所述第一人基因取代，并且在所述转基因动物基因组中与所述第二人基因基本上同源的第二动物基因被所述第二人基因取代。

说明书全文

一种人源化的转基因动物

[0001] 本申请是申请号为201180055100.9、申请日为2011年11月28日、发明名称为“一种人源化的转基因动物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2011/062272的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年11月27日，申请号为61/417,411的美国临时申请的优先权。

[0002] 相关申请的交叉引用

[0003] 本申请要求2010年11月27日提交的美国临时申请序列号61/417,411的优先权，其整体通过引用特别地并入。发明领域

[0004] 本发明一般涉及用于研究人类疾病的转基因动物。具体而言，本发明涉及表达至少两种人蛋白的转基因动物，其中第一人蛋白与第二人蛋白动态地相互作用。

[0005] 发明背景

[0006] 在人类疾病的研究和调查中使用非人动物可用于更好地理解疾病，在该过程中不会导致对实际的人的损害风险增加。通过在动物中首先试验，已开发了很多用于人类疾病的药物、治疗方法和治愈方法(参见，例如Greaves et al.，2004，Nat.Rev.Drug Discov.3，226-236；Olson et al.，2000，Regul.Toxicol.Pharmacol.32，56-67)。

[0007] 在人类疾病的研究和临床前试验中使用非人动物的缺点之一是，由于目标人蛋白和动物蛋白之间存在差异，导致在动物中应用有效的药物可能在人类中无效。这种药物疗效的差异可能会导致昂贵的临床前和临床研究失败。另一方面，当使用动物模型筛选或检测药物时，人类与动物蛋白的差异可能导致失去对人类疾病治疗有效的候选物。例如，阿瓦斯汀，它是一种人血管内皮生长因子(VEGF)中和抗体和抑制人癌症血管生成的药物，其与鼠源性VEGF的相互作用较差，但是其阻断人VEGF与人VEGF受体之间的结合(Ferrara et al.，2004，Nat Rev Drug Discov.3，391-400)。这种戏剧性的差别是由于阿瓦斯汀结合的人表位与相应的鼠源性表位之间存在单个的氨基酸差异(Fuh et al.，2006，J Biol Chem 281：6625-31；Muller et al.，1998，Structure 6：1153-67)。据报道，VEGF的19个氨基酸残基参与形成人VEGF与中和抗体复合物的界面(Muller et al.，1998，Structure 6：1153-
67)。对人和小鼠的VEGF序列进行比较后发现，在人VEGF的19个氨基酸残基中，仅有一个残基(Gly88)与其在小鼠中的对应残基不同(参见Muller et al.，1998，Structure 6：1153-
67)。

[0008] 因此，为了研究和评价治疗人类疾病的药物候选物，需要开发动物模型，将人类基因导入动物模型中，从而在动物细胞中表达人类蛋白，并模拟人类疾病。而且，为防止内源性动物蛋白对药物候选物与人蛋白之间相互作用的干扰，需要将与所需的人基因对应的内源性动物基因破坏，以使得引入的人基因可操作地取代相应的动物基因。已制备出一些转基因动物来满足这些需求，在这些转基因动物中，用某个人基因取代相应的动物基因。例如，已制备出转基因小鼠，其中用人VEGF基因取代内源性小鼠VEGF基因，以研究人VEGF在正常和病理血管发生条件下的作用(美国专利公开号2010/0162415 A1)。

[0009] 然而，仅表达一种人基因的转基因小鼠在探索和评价治疗人类疾病的候选药物方面具有局限性，因为候选药物为了发挥对人类疾病的作用，往往需要以所需方式作用于在人类疾病的生理过程中起作用的目标蛋白-蛋白相互作用。例如，人VEGF中和抗体通过阻断人VEGF与人VEGF受体的结合而抑制血管生成。中和抗体候选物在仅表达人VEGF的转基因小鼠中可能不具有任何作用，因为所表达的人VEGF与鼠源性的VEGF受体可能并不是以同人VEGF受体相同的方式发生相互作用。因此，需要开发一种动物模型来表达在人类疾病生理过程中起作用的目标蛋白-蛋白相互作用涉及的两种人蛋白。

[0010] 本申请提供了一种表达至少两种人蛋白的转基因动物，其中第一人蛋白与第二人蛋白动态地相互作用，其中第一人蛋白与第二人蛋白相互作用的结果为形成指示细胞变化的信号通路级联的一部分。在某些优选实施方式中，当第二人蛋白在信号通路级联中与第三人蛋白相互作用时，将第三人蛋白也引入转基因动物。更优选地，当第三人蛋白在信号通路级联中与第四人蛋白相互作用时，将第四人蛋白也引入转基因动物中，并且以此类推，直至将信号通路级联全部引入转基因动物中。

[0011] 发明概述

[0012] 本申请在整体上涉及表达至少两种人基因的非天然的非人转基因动物，其中由第一人基因表达的第一人蛋白与由第二人基因表达的第二人蛋白相互作用。

[0013] 本申请的蛋白-蛋白相互作用包括第一蛋白和第二蛋白之间的任意动态关联，其中蛋白-蛋白相互作用的结果为形成指示细胞变化的信号通路级联的一部分。在一个方面，蛋白-蛋白相互作用包括配体与细胞表面受体结合，从细胞外转导信号。在另一个方面，蛋白-蛋白相互作用包括具有酶活性的第一蛋白与其底物结合以便对其进行修饰。在又一个方面，蛋白-蛋白相互作用包括作为支架的第一蛋白，其可结合信号通路级联中的全部或一些蛋白以形成复合物。

[0014] 在一些实施方式中，当靶动物的基因组中包含与所需人基因同源的内源性基因时，内源性动物基因的表达被沉默，以使得内源性动物基因在人源化的转基因动物中被所需的人基因可操作地取代。在某些优选实施方式中，所需的人基因被插入相应动物基因的基因座中，并且更优选地，处于相应动物基因调控序列的控制下。

[0015] 在一个方面，本发明公开的人源化转基因动物提供了一种系统，来了解人蛋白彼此之间如何相互作用。在一些实施方式中，人源化的转基因动物提供了一种方法，来鉴定调节所需的人蛋白之间相互作用的分子。所述方法包括将所述分子给予人源化的转基因动物，并监测其对所需人蛋白之间相互作用的调节。

[0016] 在另一个方面，人源化的转基因动物提供了一种与所需人基因相关的人类疾病的模型。

[0017] 在又一个方面，人源化的转基因动物提供了一种方法来识别用于与所需人基因相关的人类疾病的新型治疗剂。所述方法包括：a)将所述试剂给予人源化的转基因动物，其中所述动物模拟与所需人基因相关的人类疾病；和b)在人源化的转基因动物中监测所述试剂对人类疾病的效力。

[0018] 发明详述

[0019] 蛋白-蛋白相互作用

[0020] 为了描述所需人蛋白之间的关系，蛋白的相互作用包括蛋白分子的任意的直接接触的结合。蛋白-蛋白相互作用包括蛋白分子的持久性结合以形成作为蛋白机器的蛋白复合物。例如，两条重链与两条轻链相互作用，以形成用于识别抗原的免疫球蛋白。再例如，α亚基与β亚基相互作用以形成T细胞受体，用于识别与主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原。蛋白复合物的其他例子包括血红蛋白，其由两个α球蛋白和两个β球蛋白组成。

[0021] 在本发明的一个优选的方面中，当第一蛋白与第二蛋白瞬时结合时，发生蛋白-蛋白相互作用，其中动态蛋白-蛋白相互作用的结果为形成指示细胞变化的信号通路级联的一部分。在某些实施方式中，动态蛋白-蛋白相互作用包括配体与细胞表面受体结合，从细胞外转导信号。例如，VEGF与VEGF受体(VEGFR)的结合导致不同信号通路的级联，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)通路的细胞内活化，导致与介导内皮细胞的增殖和迁移、以及促进其存活和血管通透性相关的基因上调(Holmes et al.，(2007)Cellular Signaling 19，2003-12)。

[0022] 在另一个实施方式中，动态的蛋白-蛋白相互作用包括具有酶活性的第一蛋白(例如，蛋白激酶)结合至其底物以便对其进行修饰(例如，添加磷酸)。蛋白的修饰包括，但不限于，磷酸化、去磷酸化、羟基化、乙酰化、泛素化和蛋白水解裂解。例如，当受到细胞外刺激时(例如，丝裂原、渗透胁迫、热休克和促炎性细胞因子)，活化的丝裂原活化蛋白(MAP)-激酶-激酶与其底物MAP激酶相互作用，导致MAP激酶上的苏氨酸和酪氨酸被磷酸化。磷酸化的MAP激酶通过磷酸化细胞内的多种蛋白，使信号向下游传递，从而调节多种细胞的活性如基因表达、有丝分裂、增殖、分化、和细胞凋亡。在另一个例子中，当蛋白磷酸酶与磷酸化的MAP激酶结合并从酪氨酸或苏氨酸上除去磷酸时，发生动态的蛋白-蛋白相互作用，以确保MAP激酶仅在被激活的瞬间对细胞外信号产生应答。在又一个例子中，在生理氧条件下，缺氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶与HIF的α亚基相互作用，并羟基化保守的脯氨酸残基。然后，经修饰的HIFα亚基与VHL E3泛素连接酶相互作用，并被其泛素化，VHL E3泛素连接酶标记HIFα亚基使其被蛋白酶体迅速降解。在缺氧条件下，HIF脯氨酰羟化酶被抑制，因其需要氧作为共底物，这导致HIF的稳定化。然后，稳定的HIF转录调控一组基因以促进在缺氧条件下的存活。在又一个例子中，一旦接收到细胞内或细胞外的促凋亡信号，起始因子半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶(半胱天冬酶)，例如，半胱天冬酶8、10、9、2，与效应器半胱天冬酶相互作用，例如半胱天冬酶3、7、6，并且通过蛋白水解裂解活化效应器半胱天冬酶。然后，活化的效应器半胱天冬酶蛋白水解降解一组细胞内蛋白以执行细胞死亡程序。

[0023] 可以采用本领域公知的多种方法鉴定蛋白-蛋白相互作用(参见，通常，Protein-Protein Interactions：A Molecular Cloning Manual，第2版，Golemis and Adams，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2005))。例如，可以采用分子和生物化学方法鉴定蛋白-蛋白相互作用，如常规柱层析、免疫共沉淀、拉下检测(pull-down assay)、酵母双杂交、和噬菌体展示。或者可以采用生物物理学方法鉴定蛋白-蛋白相互作用，如荧光共振能量转移(FRET)、质谱和表面等离子体共振(SPR)。本领域技术人员还可以通过参考公开可用的数据库鉴定蛋白间的相互作用，如BioGRID、STRING、MIPS(mammalian protein-protein interaction database，哺乳动物蛋白-蛋白相互作用数据库)和DIP(Database of Interacting Proteins，蛋白质相互作用数据库)。

[0024] 本申请中的人蛋白包括全长人蛋白或人源化的蛋白(例如，比如人源化抗体)，其中蛋白的功能性部分来源于人蛋白，并且框架来源于动物蛋白。

[0025] 蛋白-蛋白相互作用和人类疾病

[0026] 因为蛋白-蛋白相互作用形成指示细胞变化的信号通路级联的一部分，所以异常的蛋白-蛋白相互作用扰乱细胞内的正常结果，并且导致人类疾病。例如，VEGF与VEGFR相互作用，诱导血管内皮细胞增殖、修剪和再生，以便从预先存在的血管网络中形成新的血管，这是在多种人类疾病的发展过程中异常血管发生的关键(Ferrara and Davis-Smyth，Endocrine Rev.18：4-25(1997)；Ferrara，J.Mol.Med.77：527-543(1999))。VEGF在大部分检测的人类肿瘤中过表达(Berkman et al.，J Clin Invest 91：153-159(1993)；Brown et al.，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown et al.，Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattem et al.，Brit.J.Cancer.73：931-934(1996)；和Dvorak et al.，Am
J.Pathol.1461029-1039(1995))。由VEGF的过表达导致的过度VEGF-VEGFR相互作用与乳腺癌的预后较差有关。此外，眼液体中异常的VEGF-VEGFR相互作用与糖尿病和其他缺血相关的视网膜病的患者中存在的血管活性增殖高度相关(Aiello et al.，New Engl J.Med.331：1480-1487(1994))。

[0027] 在另一个例子中，MAP激酶激酶(MAPKK)和MAP激酶(MAPK)的相互作用，使得MAPK磷酸化和活化，其在促有丝分裂信号转导通路中起关键作用(Raman M et al.，Oncogene 26(22)：3100-12(2007))。促有丝分裂信号转导通路涉及对多种刺激的细胞应答，如细胞因子、生长因子、抗原、毒素、和应激如温度变化和辐射，以及细胞形状、细胞-细胞相互作用和细胞基质成分的改变。因此，MAPK的异常活化导致了多种人类疾病，如癌症、炎症和神经退行性疾病(Cuendaa and Rousseaua，Biochim Biophys Acta.1773(8)：1358-75(2007)；Dhillon et al.，Oncogene 26(22)：3279-90(2007))。

[0028] 在又一个例子中，淀粉样前体蛋白(APP)、完整的膜蛋白、和γ-分泌酶之间的相互作用导致APP裂解，产生39-42个氨基酸的短肽，称为β淀粉样蛋白。β淀粉样蛋白的过度产生和聚集形成折叠异常的淀粉样蛋白纤维，其为在阿尔茨海默氏症患者的脑中发现的淀粉样蛋白斑块的主要组分。淀粉样蛋白纤维的聚集诱导程序性细胞死亡，人们认为是其导致了阿尔茨海默氏症的病理现象(Van Broeck et al.，Neurodegener Dis 4(5)：349-65(2007))。

[0029] 人源化的转基因动物

[0030] 本申请提供了一种转基因动物，其中在靶动物中表达编码至少两种人蛋白的至少两种人基因。术语“转基因动物”是指包括任何非天然存在的非人动物，其中所述动物的一种或多种细胞含有编码人基因的核酸，通过人工干预的方式将其导入，如通过本领域公知的转基因技术。详细情况见上文。术语“非人动物”指不包括人的动物，是指包括任何脊椎动物，如哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类。适宜的哺乳动物包括啮齿类、非人灵长类、绵羊、犬和牛。优选的非人动物选自啮齿类家族，其包括大鼠和小鼠，最优选小鼠。如本申请所使用的，术语“天然的”适用于能够在自然界中找到的对象。

[0031] 特别地，本申请提供了一种转基因动物，其中在靶动物中表达的所需的人蛋白彼此间相互作用。例如，本申请中所描述的人源化的转基因动物可以是表达人VEGF和人VEGFR的转基因小鼠。在另一个例子中，本申请中所描述的人源化的转基因动物可以是表达人MAPKK和人MAPK的转基因小鼠。在又一个例子中，本申请中所描述的人源化的转基因动物可以是表达人APP和人γ-分泌酶的转基因小鼠。

[0032] 本申请所描述的人源化的转基因动物指包括表达两种以上人蛋白的转基因动物，其相互作用形成信号通路级联的一部分，即第一人蛋白与第二人蛋白相互作用，其随后与第三人蛋白相互作用。例如，人源化的转基因动物可以是表达人MAP3K、人MAP2K和人MAPK的转基因小鼠。在某些实施方式中，第三人蛋白随后可以与第四人蛋白相互作用，其随后可以与第五人蛋白相互作用，依此类推，直至将形成整个信号通路级联的所有人蛋白均引入转基因动物中。例如，人源化的转基因动物可以是表达人VEGF、人VEGFR、人GRB2、人SOS、人MAP3K、人MAP2K和人MAPK的转基因小鼠。

[0033] 在某些优选实施方式中，破坏转基因动物中与所需的人基因基本上同源的内源性动物基因，以使得所需的人基因可操作地取代内源性动物基因。

[0034] 相应的动物基因

[0035] 在某些优选实施方式中，对应于转移的人基因的动物基因被沉默，以使得转移的人基因可操作地取代内源性动物基因。当描述动物基因与人基因的关系时，术语“对应的”或“基本上同源的”可以互换使用，其指两个基因的核苷酸序列，当进行最佳的比对并与适宜的核苷酸插入或删除进行比较时，与对方相比具有至少约80％的序列同一性，更优选地约85％的序列同一性，更优选地约90％的序列同一性，更优选地约95％的序列同一性，以及更优选地约99％的序列同一性。两个序列比对和鉴定其同一性百分率的方法是本领域技术人员公知的。可以采用本领域技术人员公知的多种方法进行比对以确定核苷酸序列同一性百分率，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于比对的适宜参数，包括在待比较序列的全长范围内达到最大比对所需的任何算法。

[0036] 当基因正常蛋白产物的表达被抑制时，基因被“沉默”。通常通过破坏基因的基因组序列使基因沉默。当DNA片段定位并与内源性同源序列重组时，基因被破坏。所述破坏可以包括DNA序列的插入、错义、移码、缺失、或置换或取代，或其任意组合。插入包括整个基因的插入。通过部分或完全抑制正常基因的产生，破坏可以改变正常基因的产物。在优选实施方式中，所述破坏是缺失破坏，使得所述基因不具有显著的表达。

[0037] 如本申请所使用的，术语“可操作地取代”或“取代”指在引入所需人基因的转基因动物中，与引入的人基因对应的内源性动物基因被沉默，以使得引入的人基因功能性地取代相应的动物基因。例如，在引入人VEGF和人VEGFR的人源化的转基因小鼠中，内源性的鼠源性VEGF和VEGFR被进一步沉默，以使得引入的人VEGF和VEGFR蛋白功能性地取代鼠源性VEGF和VEGFR。

[0038] 在某些更优选的实施方式中，所需的人基因被插入与相应的内源性动物基因相同的基因座，以使得通过相应的内源性动物基因的转录调控序列控制所需人基因的表达。术语“转录调控序列”指一种核苷酸序列，其具有调节或控制与其可操作地连接的蛋白编码序列的转录功能。此类转录调控序列的例子包括，但不限于，启动子、增强子、沉默子和起始信号。在优选实施方式中，可以制备包含人VEGF和VEGFR基因的人源化的转基因小鼠，以使得人VEGF基因的蛋白编码序列插入内源性的鼠源性VEGF基因的基因座中。插入可以通过重组实现，以使得被引入的人VEGF基因的蛋白编码序列取代相应的鼠源性VEGF基因的蛋白编码序列。其允许通过鼠源性VEGF基因的转录调控序列控制被引入的人VEGF基因的表达。

[0039] 人源化转基因动物的生产

[0040] 生产本发明转基因动物的方法包括敲除和敲入，均是本领域所公知的(参见，一般情况下，Gene Targeting：A Practical Approach，Joyner，ed.，Oxford University Press，Inc.(2000)；Transgenesis Techniques：Principles and Protocols，Clarke，ed.，Human Press(2002))。在本申请中，人源化转基因动物的产生涉及将所需的人基因引入宿主动物的基因组中。在某些实施方式中，可以破坏与所需人基因对应的动物基因的内源性基因座。还可以通过使用相应的人基因取代内源性的动物基因产生人源化的转基因动物，其中所需的人基因被引入与相应的内源性动物基因相同的位置。

[0041] 将人基因引入非人动物

[0042] (i)通过使用胚胎干细胞(ES)将人基因引入动物

[0043] 生产人源化的转基因动物的基本方法为将所需的人基因引入非人靶动物。在本申请中，人源化的转基因动物优选地由在基因组中插入所需人基因的胚胎干细胞(ES)生产得到。通过DNA转染或逆转录病毒介导的转导，能够将所需的人基因有效地引入ES细胞(参见例如，Lakshmipathy et al.，Stem Cells，22(4)：531-43(2004)；Bowen，Retroviral Infection，in Transgensis Techniques：Principles and Protocols，Clarke eds.，Human Press，pp 83-90(2002))。然后可以将转化的ES细胞与来自非人动物的胚泡组合。然后，ES细胞植入胚胎并产生得到的嵌合动物的种系(参见，例如Wells，Production of chimeras derived from murine embryonic stem cells，in Transgensis Techniques：Principles and Protocols，Clarke eds.，Human Press，127-149(2002))。

[0044] 为了将所需人基因引入ES细胞，将包含所需人基因的多核苷酸分子插入载体，优选DNA载体，以产生转基因构建体(参见，一般情况下，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook，Fritsch and Maniatis eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。术语“构建体”指包含特别感兴趣的基因或核酸序列的多核苷酸分子。典型地，所述构建体还包括选择性标记物基因和适宜的控制序列。“转基因构建体”指一种构建体，其中感兴趣的基因是所需人基因。“靶构建体”指一种构建体，其中感兴趣的核酸序列是与靶动物中的内源性序列基本上同源的序列，并将所述构建体整合至所述靶动物基因组。

[0045] “选择性标记物”指识别因子，通常是抗生素或化学抗性基因，能够基于标记物基因的作用，即对抗生素、酶、荧光标记物等的抗性进行选择，其中所述作用用于示踪感兴趣的核酸的遗传特性和/或鉴定具有感兴趣的核酸的遗传特性的细胞或生物体。本领域公知的和使用的选择性标记物基因的例子包括：提供氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、新霉素等抗性的基因。

[0046] 应当理解的是，可以产生分别含有第一人基因和第二人基因的独立构建体，或者单一构建体可以含有多个所需的人基因。

[0047] 多核苷酸分子优选地进一步包括功能性连接至所需的人基因的调控序列。“调控序列”指调控第二核酸序列表达的核酸序列。调控序列可以包括第二核酸序列上游(5’)或下游(3’)的核酸序列。那些邻近序列通常影响第二核酸序列在所需细胞类型中的加工和/或表达。例如，所述的调控序列可以包括在宿主细胞中使编码序列表达的序列，如启动子、增强子、终止子等。在另一个例子中，所述调控序列还可以包括所需人基因编码序列的3’非翻译区的下游区。此类区域能够稳定所需人基因的RNA转录本，以增加所需人蛋白的收率。3’非翻译区包括提供polyA信号的序列。此类序列可以从例如SV40小t抗原中获得，所需人基因的内源性3’非翻译区或其他3’非翻译序列是本领域公知的。

[0048] 优选地，调控序列来源于人基因组，并且包括一个或多个内含子。例如，多核苷酸分子可以包括位于所需人基因的5’-翼侧区的调控序列，其以能够使所需的人基因在宿主细胞中复制和表达的方式可操作地连接至编码序列。在另一个例子中，调控序列包括与所需人基因天然地连接的内源性启动子序列。在又一个例子中，启动子提供的组织特异性表达的水平与在人体内表达的水平接近。

[0049] 或者，所述的调控序列可以是那些与非人动物宿主中相应的内源性基因相关的调控序列。例如，多核苷酸分子中可以包括与所需人基因对应的鼠源性基因的鼠源性调控序列，如启动子，并且功能性地连接至所需人基因的编码序列，以使得所需人基因能够在小鼠细胞中适宜地表达。

[0050] 可以使用本领域公知的方法制备包含所需人基因的多核苷酸分子。例如，可以将多核苷酸分子制备成更大质粒的一部分。此类制备允许采用本领域公知的有效方法克隆和分离正确的构建体。在质粒的制备和宿主生物体的转化中使用的多种方法是本领域公知的(参见，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook等eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。此外，可以使用酵母人工染色体(YAC)分离、克隆和转移所需人基因的整个基因座。或者，细菌人工染色体(BAC)文库(参见，例如Invitrogen的基因组BAC文库，Carlsbad Calif.)可以提供用于所需人基因和调控序列的核酸序列。

[0051] 可以使用本领域公知的任意方法将制备得到的转基因构建体引入ES细胞。在本发明中可以使用多种用于转化哺乳动物细胞的技术，包括例如：显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染等等(参见，例如Gordon，Intl.Rev Cytol.，115：171(1989)；Keown et al.，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)；Mansour et al.，Nature，336：348-352(1988))。

[0052] ES细胞一般从在体外培养的植入前胚胎中获得(参见，例如Evans，M.J.et al.，Nature 292：154-156(1981)；Bradley，M.O.et al.，Nature 309：255-258(1984)；Gossleer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：9065-9069(1986)；和Robertson et al.，Nature 322：445-448(1986))。使用本领域公知的方法培养和制备用于引入转基因构建体的ES细胞(参见，例如Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells：a Practical Approach，Robertson eds.，IRL Press(1987)；Bradley et al.，Current Topics in
Devel.Biol.20：357-371(1986)；Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1986)；Thomas et al.，Cell 51：503(1987)；Koller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10730(1991)；Dorin et al.，Transgenic Res.1：101(1992)；和Veis et al.，Cell 75：229(1993))。插入所需人基因的ES细胞来源于的胚胎或胚泡，与ES细胞将被引入的发育中的胚胎，是同一种属的。通常，选择ES细胞是因为其具有整合至内细胞团的能力，当作为处于胚泡发育阶段的胚胎被引入宿主动物时，可以形成个体的生殖系。因此，任何具有这种能力的ES细胞系均适宜在本发明的实践中使用。

[0053] 当在ES细胞中引入转基因构建体之后，对发生成功的基因插入的细胞进行识别。通常通过识别选择性标记物基因在细胞中的表达，来检测插入宿主细胞基因组的转基因构建体。例如，使用适宜的药物(例如，G418)处理经转基因构建体转化的细胞，其能淘汰不表达选择性标记物基因(例如，新霉素抗性基因)的细胞。仅有那些表达选择性标记物基因(例如，新霉素抗性基因)的细胞才能在一定条件下存活和生长。

[0054] 然后将所选择的ES细胞注射至动物的胚胎(胚泡或适于形成存活动物目的的其他发育阶段)以形成嵌合体(参见，例如Bradley，A.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.，IRL，Oxford，pp113-152(1987))。或者，所选择的细胞能够与分裂的胚胎细胞聚集以形成聚集的嵌合体。然后将嵌合胚胎植入适宜的假孕雌性寄养动物中，直至胚胎分娩。可以使用在其生殖细胞中携带所需人基因的嵌合体子代繁殖动物，所述动物的所有细胞均含有所需的人基因(参见，例如同上)。

[0055] (ii)通过使用位点特异性重组系统将人基因引入动物

[0056] 将所需人基因引入动物的其他优选方法包括使用位点特异性重组系统(参见，一般情况下，Roebroek et al.，Trangenic Mouse Methods and Protocols，Hofker and van Deursen eds.，Methods in Mol Biol，693：257-275(2011))。该方法将所需的人基因整合至宿主动物基因组中预先确定的位点(参见，例如美国专利7846732；美国专利7972857)。多种位点特异性重组系统(例如，Cre/Lox P系统，ФC31-衍生的整合酶系统)开发自一些噬菌体和整合型质粒，它们利用该系统将自身基因组稳定整合至其宿主，并从宿主基因组中切除所述基因组。在这些系统中，用于重组反应的最低要求为重组酶，其催化重组事件，以及两个重组酶识别序列(Sadowski，J.Bacteriol.165：341-347(1986)；Sadowski，FASEB J.7：760-767(1993))。对于噬菌体整合系统，重组酶的识别序列被称为附着(att)位点，其具有来自噬菌体DNA的attP元件和存在于细菌基因组中的attB元件。重组酶与这两个附着位点结合，并催化DNA链保守的和相互的交换，其结果为将环状噬菌体或质粒DNA整合至宿主DNA。

[0057] 在本发明的某些实施方式中，在适宜的动物细胞(例如，ES细胞)中，针对位点特异性重组酶(例如，ФC31整合酶)的第一重组酶识别序列(例如，attB)被插入基因组的位点，可以是随机或预先确定的位点。随后，使用携带所需人基因和第二重组酶识别序列(例如，attP)的转基因构建体转染动物细胞。在转染的动物细胞中还提供重组酶的来源(表达质粒、RNA、蛋白或病毒的重组酶，例如ФC31整合酶)。第一和第二重组酶识别序列之间的重组导致所需人基因在动物细胞基因组中的整合。然后选择成功发生整合事件的动物细胞，并使用前述章节中描述的方法将其用于发展人源化的转基因动物。

[0058] (iii)通过使用胚胎将人基因引入动物

[0059] 除了上文所描述的使用ES细胞将所需人基因引入非人动物的方法以外，还可以通过将所需的人基因引入不同发育阶段的胚胎生产本发明的人源化的转基因动物。根据胚胎的发育阶段，使用不同方法。用于实施本发明的任何动物的特定品系均选择整体健康状况良好、胚胎产量较好、胚胎中胚胎原核的能见度较好、和生殖适合度较好的品系。用于实施本发明的品系本身可以是转基因的，和/或可能是被敲除的。优选与初始用于制备敲除动物和转基因动物相同的品系。这将使后续的繁殖和杂交更加有效。

[0060] 可以使用本领域公知的任意方法将所需人基因引入胚胎。例如，可以通过将转基因构建体显微注射至哺乳动物受精卵的原核中，以使得转基因构建体的一个或多个拷贝保留在发育中动物的细胞中，从而将所需人基因引入动物。随后，可以将卵在体外孵育不同的时间，或者重新植入替代宿主，或两者兼有之。一种常用的方法是将胚胎在体外孵育约1-7天，这取决于具体的种属，然后再将其重新植入替代宿主。

[0061] 还可以使用逆转录病毒感染将所需人基因引入胚胎。可以在体外培养发育中的非人胚胎，以形成用作逆转录病毒感染对象的胚泡(Jaenich，R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：1260-1264(1976))。卵裂球通常经过酶处理以除去透明带，以实现有效感染(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1986))。用于引入所需人基因的病毒载体系统一般是携带所需人基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner et al.，PNAS82：6927-6931(1985)；Van der Putten et al.，PNAS 82：
6148-6152(1985))。通过在产生病毒的单层细胞上培养卵裂球可以容易、有效地获得感染(Van der Putten，如上所述；Stewart et al.，EMBO J.6：383-388(1987))。或者，在晚期阶段，可以通过将病毒或产生病毒的细胞注射至囊胚腔进行感染(Jahner et al.，Nature
298：623-628(1982))。此外，也可能通过使妊娠中期胚胎在子宫内感染逆转录病毒将转基因引入生殖系(Jahner et al.，Nature 298：623-628(1982))。在大多数祖细胞中(founders)的转基因是嵌合的，因为掺入仅发生在形成转基因动物的细胞的亚群中。此外，祖细胞可以在基因组的不同位点含有多种逆转录病毒插入的转基因，其通常将在子代中分离。

[0062] 用相应的人基因取代内源性动物基因

[0063] 在本发明的某些优选实施方式中，将与所需人基因对应的动物基因的内源性基因座沉默以抑制内源性动物基因的表达，以使得所引入的人基因可操作地取代内源性动物基因。在更优选的实施方式中，所引入的人基因完全取代内源性动物基因的蛋白编码序列。更优选地，作为同源整合的结果，所引入的人基因可操作地连接至内源性动物基因的转录调控序列(例如，增强子或启动子)，以使得所需人基因在来自相应内源性动物基因基因座的转录调控序列的控制下表达。

[0064] (i)通过同源重组灭活内源性基因座

[0065] 优选在适宜的动物细胞中通过同源重组进行靶向破坏实现内源性基因组的灭活(参见，一般情况下，Gene Targeting：A Practical Approach，Joyner，ed.，Oxford University Press，Inc.(2000))。在本发明中优选使用的细胞类型包括胚胎干细胞。在上文的章节及其参考文献中对操作ES细胞的方法进行了描述。

[0066] 为了便于同源重组，需要制备一种靶构建体，其包含与靶动物基因的内源性序列基本上同源的核苷酸序列。生产所述靶构建体以使得同源重组后靶动物基因的表达被破坏(例如，通过插入或删除改变靶动物基因的基因座)。可以使用本领域公知的方法生产靶构建体(参见，例如，Molecular Cloning：A laboratory Manual，第2版，Sambrook et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II，Glover eds.(1985))。例如，可以使用标准方法制备靶构建体，其中序列可以是化学合成的、使用PCR扩增从天然来源分离的、由带有感兴趣的序列的载体克隆的(例如，质粒、嗜菌粒、YAC、粘粒、BAC、细菌噬菌体DNA、其他病毒DNA)、连接的、经体外诱变的，等等。可以通过限制性分析、测序等对结合的序列进行分析。

[0067] 一旦制备了适宜的靶构建体，可以使用本领域公知的任意方法将靶构建体引入适宜的动物细胞，包括在此前的章节中描述的方法(例如，显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染)。

[0068] 在将靶构建体引入动物细胞后，使用本领域公知的方法识别成功的同源重组事件(参见，例如，Transgensis Techniques：Principles and Protocols，Clarke eds.，Human Press，pp 83-90(2002))。通常，通过鉴定表达选择性标记物基因的细胞来检测插入靶基因的靶构建体。例如，可以使用阳性-阴性选择技术选择同源重组体。在这个过程中，使用携带两个选择性标记物的靶构建体。使用第一选择剂(例如，新霉素样药物)处理用靶构建体转化的细胞，以选择那些表达阳性选择性标记物(例如，新霉素抗性基因)的细胞，即阳性选择。仅有那些引入靶构建体并表达选择性标记物基因的细胞存活和生长。随后加入第二选择剂，如更昔洛韦(GANC)或FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-B-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)以杀死表达阴性选择性标记物的细胞，即阴性选择。使用第二选择剂杀死具有非同源插入的细胞，其含有并表达阴性选择性标记物(例如，SV胸苷激酶)，而不含有和表达阴性选择性标记物的同源重组细胞则存活(参见，例如Mansour et al.，Nature 336：348-352，(1988)；Capecchi，Science 244：1288-1292，(1989))。

[0069] 可以对所选择的细胞进行分析，以确认成功同源重组。可以使用本领域公知的多种技术，如PCR和Southem印迹分析，以确认同源重组事件。

[0070] 然后使用本领域公知的方法将所选择的细胞注入动物的胚胎中以形成嵌合体(见上文)。可以使用在其生殖细胞中携带同源重组DNA的嵌合体子代繁殖动物，所述动物的所有细胞均含有同源重组DNA。

[0071] 在产生含有同源重组DNA的动物之后，可以采用任意适宜的方法筛选在所需细胞、组织或动物中靶动物基因表达的破坏。检测靶动物基因表达破坏的标准方法包括，使用针对靶动物蛋白抗体的Western印迹分析。用于评估靶动物蛋白表达破坏的其他方法包括但不限于，适宜的生化检测如针对特定标记物或酶活性的组织学染色、流式细胞仪分析、酶和/或免疫学检测等。

[0072] 随后将其中靶动物基因被破坏的转基因动物与携带相应人基因的转基因动物杂交以繁殖人源化的转基因动物，其中内源性的动物基因被相应的人基因取代(转基因动物杂交的详细情况见下文)。

[0073] (ii)通过使用位点特异性重组系统灭活内源性基因座

[0074] 用于功能性灭活内源性基因组的其他优选方法包括使用位点特异性重组系统(例如，Cre/LoxP系统、Flp/FRT系统、或ФC31-衍生整合酶系统；参见上文的一般说明)。作为这个策略的出发点，通常通过同源重组将第一重组酶识别序列(例如，attB)和第二重组酶识别序列(例如，attP)引入动物基因组，以使得靶动物基因核酸片段的两侧为两个重组酶识别序列。因引入重组酶(例如，ФC31整合酶)产生的两个识别序列重组，导致核酸片段删除和靶动物基因的灭活(参见Curr.Opin.Biotechnol.，18，411-419(2007))。在一些实施方式中，第一重组位点和第二重组位点具有相同的核酸序列(例如，Lox P位点)(参见Curr.Opin.Biotechnol.，5：521-527(1994))。可以通过在动物细胞中转入重组酶蛋白，或者表达重组酶的质粒、RNA或病毒，从而引入重组酶。或者，可以将重组酶基因整合至动物细胞基因组中，并置于组成型或诱导型启动子的控制下，由此表达重组酶。

[0075] (iii)通过同源重组取代内源性动物基因

[0076] 优选地，可以通过同源重组实现使用相应的人基因取代内源性动物基因(参见，例如，Allen et al.，Eur J Neurosci 17，1881-1895(2003)；Makita et al.，Am J Physiol Renal Physiol 294，F542-F553(2008))。通常使用取代型靶构建体进行同源性基因取代。为制备取代型靶构建体，将两个来自动物基因组序列的同源重组序列连接在所需人基因核酸序列的两侧。在靶构建体序列和动物基因组序列的同源重组序列之间的双交换，使得所需人基因的核酸序列靶向整合至动物细胞中相应动物基因的基因座中。通常，靶构建体的同源重组序列包含内源性动物基因片段两侧的序列，以使得同源重组导致同时删除内源性动物基因片段和同源整合所需的人基因片段(参见Roebroek et al.，Trangenic Mouse Methods and Protocols，Hofker and van Deursen eds.，Methods in Mol Biol，693：
257-275(2011))。整个内源性动物基因可以通过单一靶向事件或多个靶向事件被所需的人基因取代，从而取代各外显子。可以将一个或多个选择性标记物(例如，阳性或阴性选择性标记物基因)引入靶构建体中。通常优选的是，选择性标记物位于所需人基因的内含子区域。

[0077] 在某些实施方式中，可以通过使用位点特异性重组系统实现使用相应的人基因取代内源性动物基因(例如，Cre/LoxP系统、Flp/FRT系统、或ФC31-衍生整合酶系统；参见，一般情况下，Roebroek et at.，Trangenic Mouse Methods and Protocols，Hofker and van Deursen eds.，Methods in Mol Biol，693：257-275(2011))。作为这个策略的出发点，通过第一同源重组事件将两个重组酶识别序列(例如，LoxP、FRT、或attB/attP序列)引入适宜的动物细胞(例如，ES细胞)，以使得在内源性动物基因的两侧引入重组酶识别序列。通常在第一同源重组事件中将选择性标记物基因(例如，HygTK)引入动物细胞中，用于阳性选择(例如，通过潮霉素B)和阴性选择(例如，通过更昔洛韦)。制备携带与内源性动物基因对应的所需人基因的转基因构建体，以使得所需人基因的两侧为两个重组酶识别位点。随后将转基因构建体引入第一同源重组事件产生的靶动物细胞。提供重组酶的来源以启动位点特异性重组，其导致将内源性动物基因交换为所需的人基因。在交换后，重组酶识别序列可以仍存在于基因座中，优选不存在于蛋白编码区域中。

[0078] 产生表达多种人基因的人源化的转基因动物

[0079] 可以通过多个单独的步骤产生表达至少两种人基因的人源化的转基因动物。例如，由具有第一所需人基因的胚胎或ES细胞生产第一转基因动物。然后由具有第二所需人基因的胚胎或ES细胞生产第二转基因动物。随后将第一转基因动物与第二转基因动物杂交以产生表达第一人基因和第二人基因的转基因动物。类似地，可以由胚胎或ES细胞生产转基因动物，在这些胚胎或ES细胞中，与第一人基因对应的内源性动物基因被沉默。然后将产生的转基因动物与表达第一人基因的转基因动物杂交以生产第一人基因可操作地取代相应的动物基因的转基因动物(参见，例如，Mihara et al.，Eur J Immnol 35，2573-2582(2005))。又例如，可以由胚胎或ES细胞生产第一转基因动物，在这些胚胎或ES细胞中，第一所需人基因通过同源重组取代相应的动物基因。可以由胚胎或ES细胞生产第二转基因动物，在这些胚胎或ES细胞中，第二所需基因通过同源重组取代相应的动物基因。随后将第一和第二转基因动物在一起繁殖以产生单一的动物，其中这两种所需的动物基因均被相应的人基因取代。

[0080] 此外，可以将第一和第二所需人基因引入单一胚胎或ES细胞中，以取代相应的动物基因。一旦生产和选择出这两种所需的动物基因均被相应的人基因取代的胚胎或ES细胞，就通过使用经选择的胚胎或ES细胞创建具有相同遗传改变的转基因动物。

[0081] 通常，依据在繁殖过程中每个特定步骤的目的不同，通过将同胞或者亲代与子代交配进行杂交和回交。在某些情况下，可能有必要产生大量子代，以产生含有每个所需人基因和/或动物基因破坏的单一子代。此外，可能有必要杂交或回交若干代以便最终获得所需的基因型。

[0082] 转基因存在的验证

[0083] 在将所需人基因引入转基因动物后，可以通过任意适宜的方法在所需细胞、组织或动物中筛选所需人基因的存在和/或表达(参见，一般情况下，Transgensis Techniques：Principles and Protocols，Clarke eds.，Human Press，pp 83-90(2002))。在转基因动物的基因组中检测所需人基因存在的标准方法包括，Southern印迹分析，使用与转基因的至少一部分互补的探针，和PCR分析。通常，使用尾部组织制备基因组DNA，并通过Southern印迹或PCR对所需人基因的存在进行分析。或者，可以通过包括Northern印迹分析和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法对所需人基因的转录表达进行检测。通常，从高水平表达所需人基因的组织或细胞中制备总RNA或mRNA，并通过Northern印迹或RT-PCR进行分析。进一步地，可以通过包括Western印迹分析的方法使用针对所需人蛋白的抗体对所需人蛋白的存在进行筛选。使用Western印迹分析对高水平表达所需人蛋白的组织或细胞进行检测。评估所需人蛋白存在的其他方法包括，但不限于，适宜的生化检测，如对特定标记物或酶活性进行组织学染色、流式细胞术分析、酶和/或免疫学检测等等。

[0084] 人源化转基因动物的用途

[0085] 本发明的人源化的转基因动物代表至少两种人蛋白彼此之间相互作用的模型。因此，这些动物可用于研究人蛋白是如何彼此之间相互作用的，以及潜在分子如何调节相互作用。这些动物可用于产生和检测用于治疗和诊断与所需人基因相关的疾病的产品。

[0086] 在某些实施方式中，在人源化的转基因动物中表达的所需人蛋白保留了与在人体内显示出的类似的功能性质。因此，可以将本发明的人源化的转基因动物作为确定人蛋白之间的相互作用是否被某种分子调节的模型，通过在人源化的转基因动物中给予所述分子，并检测人蛋白之间相互作用的变化。

[0087] 本发明的人源化的转基因动物，包括细胞、组织、或来自其的其他材料，均可以作为与所需人基因相关的或由其介导的疾病的模型。可以使用许多种属的动物用于生产疾病的动物模型，包括，但不限于，小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猪、微型猪、山羊、和非人灵长类。这些模型可以与多种实验一起，作为筛选策略的一部分，用于识别试剂，如能够改善疾病症状的化合物。因此，来自本发明转基因动物的基于动物和细胞的模型可以用于识别能够有效治疗疾病的药物、药物制剂、治疗和介入治疗。例如，具有人源化VEGF和VEGFR的转基因动物可以用于鉴定能够治疗VEGF相关疾病的试剂，如抗-人VEGF抗体和小分子VEGF拮抗剂。又例如，具有人源化APP和γ-分泌酶的转基因动物可以用于识别抑制γ-分泌酶的蛋白水解活性和能够治疗阿尔茨海默氏症的试剂。实施例

[0088] 实施例I。产生表达人源化形式VEGF的敲入小鼠。如在Cellular，Molecular，and Tumor Biology 95：Angiogenesis Mechanisms and Microenvironment(摘要#4782，2004)中所公开的，Ajay K.Malik等人能够在小鼠中敲入人VEGF，并除去相应的鼠源性VEGF。简言之，Ajay K.Malik等人描述了表达不同形式人源化VEGF的两个品系转基因小鼠的产生，所述人源化VEGF均被阿瓦斯汀中和。鼠源性VEGF基因编码191个氨基酸，其中的19个在小鼠与人之间不同。基于结构和生物化学数据，Ajay K.Malik等人设计了两种突变体形式，其分别含有一个(mutI)或十个(mutX)人氨基酸取代。对重组蛋白的生物化学分析揭示，在阿瓦斯汀与mutI、mutX和全长人VEGF之间具有相似的结合亲和性。当检测促有丝分裂活性时，这两种突变形式对人VEGF均表现出相当的效能，并且阿瓦斯汀对所有蛋白生物学效果的阻断程度相似。产生靶载体，通过同源重组，并使用Cre-Lox技术除去新霉素选择盒之后，获得携带这些突变的ES细胞。利用Southern、PCR和测序分析表征ES细胞克隆。检测来自阳性ES细胞克隆的条件培养基中是否存在人源化形式的VEGF。通过使用阿瓦斯汀抗体的ELISA，鉴定得到其表达水平与小鼠VEGF相当。具有任一突变体等位基因的杂合小鼠均可存活，并用于育种以获得供临床前研究使用的纯合子。因此，这两个转基因品系对在小鼠中评估人VEGF靶向的不同化合物的药理学活性很有帮助。

[0089] 实施例II。产生表达人源化形式VEGF的小鼠。根据Hans-Peter Gerber团队的报道(Gerber et al.，Mice expressing a humanized form of VEGF-A may provide insights into the safety and efficacy of anti-VEGF antibodies，PNAS Vol.104，pp：9 3478-3483(2007))，Gerber等人能够在小鼠中敲入人源化的VEGF。

[0090] 目前已公认VEGF-A是生理性和病理学血管发生的重要调节子。已证明几种VEGF抑制剂在癌症和新生血管性年龄相关的黄斑变性(AMD)中有效。其中，抗-VEGF-A Mab贝伐单抗(阿瓦斯汀)已被FDA批准与化疗联用用于治疗转移性结直肠癌(8)和非鳞状、非小细胞肺癌。贝伐单抗是小鼠抗-人VEGF Mab A4.6.1的人源化变体，最初确定其具有阻止人VEGF-A-刺激的内皮细胞(EC)增殖的作用，并且随后其在裸鼠中显示出对人肿瘤移植物生长的抑制作用。

[0091] 贝伐单抗和Mab A4.6.1中和人VEGF-A的所有亚型，并显示出与huVEGF-A165相似的Kd值。Mab Y0317是贝伐单抗的亲和性成熟的变体。Y0317的Fab形式(兰尼单抗)最近已被FDA批准用于治疗新生血管性AMD。

[0092] 虽然这些Mab阻断人VEGF-A，但其不能中和啮齿动物的VEGF-A。因此，其主要的临床前结果均来自于以人VEGF-A作为血管发生关键驱动力的疾病模型。然而，在啮齿类动物中，此类抗体不能揭示来自宿主的VEGF在肿瘤血管发生中的作用，也不能揭示任何与VEGF抑制相关的不希望的毒性。

[0093] 为了突破这些限制，Gerber等人试图开发表达人源化形式的VEGF-A的小鼠。Gerber等人使用基因取代技术(基因敲入技术)，通过该技术，小鼠的序列在相应的基因组位置被人的对应序列所取代。若干体外和体内的研究表明，VEGF仅具有(如果有的话)极低的种属特异性。因此，我们推测，表达人源化形式的VEGF-A的成年敲入小鼠是可以存活的，并且能够在免疫活性或免疫缺陷的遗传背景下，作为模型来评估具有不同表位和结合亲和性的其他抗-VEGF抗体。此类模型也可用于检测VEGF-A在转基因小鼠的遗传癌症模型中的作用。

[0094] 根据Gerber等人，通过X-射线结构结合位点定向诱变，鉴定了三个不同区域，这些区域与VEGF-A的外显子3和4编码的序列相对应，这些序列与贝伐单抗直接接触。这些接触中的大部分由β5-β6环的残基(在残基80附近)与另外两个来自N-末端螺旋的残基和两个来自α1-β2环的残基(在残基40附近)形成，它们在界面的边缘处发生相互作用。除了一个残基以外，与贝伐单抗接触的所有人VEGF-A的氨基酸在小鼠的VEGF-A中均是保守的。非保守的残基人Gly-88在小鼠VEGF序列中对应于Ser-87，其位于蛋白-抗体界面的核心部位。人VEGF-A与贝伐单抗-Fab复合物的晶体结构显示分子之间的界面是紧密包装的。对在小鼠VEGF-A中的丝氨酸侧链进行建模后发现，其中没有足够的空间容纳Gly-88→Ser的改变引入的两个附加的非氢原子。此前的研究证明，在人VEGF-A中Gly-88至丙氨酸的突变(Gly88Ala)大幅降低Mab A4.6.1的结合。这些观察结果提示，在小鼠的VEGF中引入单一突变Ser87Gly可以足以恢复与A4.6.1的结合和中和。但是，使用了截短的VEGF-A变体(8-109)测定复合物的结晶结构和进行诱变分析。因此，在VEGF8-109中不存在的残基的作用是未知的。此外，已知衍生自噬菌体的抗体如G6-31或B20-4与其他非保守性残基接触。这些观察结果促使我们设计出能够被其他抗体识别的更为广泛的人源化的鼠源性VEGF-A。因此，Gerber等人制备了两个版本的“人源化”VEGF-A蛋白。一个突变体含有单一的Ser87Gly突变，另一种形式为hum-X VEGF，其中小鼠和人VEGF-A的受体结合结构域不同的10个残基被人序列中相应的氨基酸所取代。

[0095] 在大肠杆菌中表达重组的hum-X VEGF、WT人和鼠源性VEGF-A蛋白，并进行纯化。Gerber等人首先测定了贝伐单抗和三个第二代抗-人VEGF抗体针对天然人VEGF-A和hum X VEGF蛋白的相对亲和性。在鼠源性VEGF-A中引入10个人氨基酸取代产生一种能被所有抗-人VEGF-A Mab识别的蛋白，其亲和性与WT人VEGF-A相比变化不大。然后，Gerber等人评估了各VEGF-A变体刺激培养的EC增殖的效能。HuVEGF-A、muVEGF-A、和hum-X VEGF刺激牛毛细血管EC增殖的半数最大浓度分别为1.5、0.6、和0.9ng/ml。在HUVE细胞中观察到了类似的结果。最后，Gerber等人比较了不同抗-VEGF-A抗体干扰不同重组VEGF-A蛋白诱导的EC增殖的效力。与预期结果一致，贝伐单抗和Y0317不能阻断鼠源性VEGF-A，而其余配体/抗体对的EC50值与抗体的亲和性具有良好的相关性，但B20-4.1除外，其对鼠源性的VEGF-A的EC50比预期更高。这些数据确证，hum-X、WT人、和WT小鼠VEGF-A蛋白具有接近的生物学和生物化学性质，且抗体干扰hum-X变体的能力与WT人VEGF-A相比分别与其对WT人蛋白的亲和性相关。

[0096] 在体外确定hum-X VEGF和WT鼠源性VEGF-A接近等效后，Gerber等人开始制备基因靶向载体，以便将1或10个人氨基酸引入小鼠的生殖系。通过Southern印迹实验、基因组PCR、和基因组测序确证了在ES细胞中正确的重组事件，通过ELISA确定了VEGF-A在靶ES细胞中的表达。＞500KI小鼠的基因型频率分析揭示，纯合子单突变或10-氨基酸突变(hum-X VEGF)小鼠具有预期的孟德尔比率，在为期1年的观察期内未发现成年小鼠生存能力和存活方面的改变。

[0097] 实施例III。产生具有敲入全长人VEGF的小鼠。使用实施例I和II中所公开的方法，能够将全长人VEGF基因敲入小鼠，其中鼠源性VEGF对应基因被敲除。可以通过Southern印迹、Northern印迹以及ELISA对基因的存在及其表达情况进行评估。

[0098] 实施例IV。产生具有敲入人VEGF受体基因的小鼠。Flk-1(对应的人基因为KDR)酪氨酸激酶是两种VEGF受体之一，对血管的发育至关重要。Flk-1敲除小鼠可以从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买。使用本领域公知的方法可以将人KDR敲入Flk-1敲除小鼠。例如，制备能够携带人KDR的靶载体(参见Sakurai et al.，Essential role of Flk-1(VEGF receptor 2)tyrosine residue 1173in vasculogenesis in mice，PNAS vol.102，pp.1076-1081(2005))。在所述靶载体中，插入两侧接有loxP的新霉素(neo)抗性基因(pMC1-NeopolyA)，并在靶载体的3′末端插入白喉毒素A亚基基因(pMC1-DT-A)。将靶载体线性化并通过电穿孔转染至129E14胚胎干细胞(ES)。使用400μg/ml G418选择ES细胞克隆，并用Southern印迹筛选。通过测序确证ES克隆的突变。将正确靶向至KDR的各ES细胞克隆注射至C57BL/6J的胚泡中，并将嵌合体与雌性C57BL/6J交配。为了删除neo-抗性基因，将KDR杂合子的雄性与CAG-cre转基因雌性交配。通过Southern印迹对neo基因的删除进行确证。然后将全长人KDR杂合子小鼠互交，以产生纯和子突变体小鼠。通过Southern印迹和基因组PCR确定小鼠的基因型。通过使用来自KDR纯合子胚胎的mRNA进行测序分析来确证KDR全长mRNA的序列。

[0099] 实施例V。产生具有人IL-3/GM-CSF敲入基因的小鼠。Willinger等的研究发现(Willinger et al.，Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung，PNAS Vol.108(6)：2390-2395(2011))，若干小鼠的细胞因子如IL-3和GM-CSF并不作用于人类的同源受体。此外，Rag2-/-Il2rg-/-小鼠具有完整的小鼠髓室，人髓系细胞相对于宿主细胞可能处于竞争劣势。为了突破这些限制，Willinger等人决定制备人细胞因子敲入(KI)小鼠，其中小鼠的细胞因子被其对应的人细胞因子取代。细胞因子取代的标准为：(i)小鼠的细胞因子在人细胞中不具有或仅具有较弱的作用；(ii)人的细胞因子在小鼠细胞中不具有或仅具有较弱的作用，以便在人细胞中获得竞争优势；(iii)人的细胞因子不仅仅只通过造血(移植)细胞生产；以及(iv)缺乏小鼠的细胞因子对小鼠宿主不是致死性的，或者人的KI细胞因子具有足够的交叉反应性以挽救小鼠的敲除(KO)表型。KI策略应允许在适宜的器官中以及在生理浓度下的稳定表达。重要的是，在纯合子KI小鼠中，人同源受体表达细胞应当相对于各小鼠细胞获得竞争优势。

[0100] 编码GM-CSF(CSF2)和IL-3(IL3)的基因分别在人和小鼠的5号和11号染色体上紧密连接(＜10kb)。这种紧密程度允许Willinger等人在这两个基因上采用人的基因座取代小鼠的以产生hIL-3/GM-CSF KI小鼠。虽然人IL3KI等位基因受小鼠调控元件的控制，但是人CSF2KI等位基因仍受人调控元件的控制。Willinger等人通过RT-PCR在hIL-3/GM-CSF KI小鼠中分析了小鼠和人GM-CSF mRNA的表达，hIL-3/GM-CSF KI小鼠表达每个小鼠的一个等位基因和每个人基因的一个等位基因，其被称为IL-3/GM-CSF“人/小鼠”(h/m)小鼠。仅具有小鼠Il3和Csf2等位基因的野生型小鼠被称为IL-3/GM-CSF“小鼠/小鼠”(m/m)小鼠。人GM-CSF mRNA与其对应的小鼠GM-CSF mRNA具有相似的表达类型，其在肺中表达量最高。为使人造血细胞具有竞争优势，Willinger等制备了表达人IL3和CSF2两个等位基因的纯合子KI小鼠，其被称为IL-3/GM-CSF“人/人”(h/h)小鼠。对肺组织进行常规和定量RT-PCR分析的结果显示，h/h小鼠仅表达人GM-CSF mRNA，而不表达小鼠GM-CSF mRNA。在h/h小鼠的支气管肺泡灌洗液中，通过ELISA能够检测到人GM-CSF蛋白。在h/m小鼠活化的脾细胞中，小鼠和人的IL-3mRNA均高表达，其在经消化的骨中低表达，在肺中均不表达。在分离自h/m小鼠的活化脾细胞的上清液中能够检测到人IL-3(和GM-CSF)蛋白。得出的结论是，hIL-3/GM-CSF KI小鼠稳定地表达人GM-CSF和IL-3。(参见Willinger et al.，PNAS Vol.108(6)：2390-2395(2011))。

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