基因治疗载体的广泛的基因递送
阅读：264发布：2020-05-12
专利汇可以提供基因治疗载体的广泛的基因递送专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于在 哺乳动物 中递送和表达 治疗 基因的改进的组合物和方法。更具体地，本发明源自于如下出乎意料的发现：当将治疗基因并入到病毒载体中并且施用到哺乳动物的CSF和血液两者中时，在哺乳动物中获得了显著的、大量的且广泛的治疗基因递送和表达。与施用到一个单一位点相比，这样的联合施用在哺乳动物中导致令人惊讶和显著的治疗益处，并且还使得能够使用降低剂量的病毒。本发明可用于任何哺乳动物(包括人类对象)，并特别适合于治疗其中需要治疗基因的广泛表达的多系统 疾病 例如运动神经元或溶酶体疾病。，下面是基因治疗载体的广泛的基因递送专利的具体信息内容。
1.一种在哺乳动物中表达治疗基因的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的脑脊液和血液联合施用包含所述基因的可转移的病毒载体。
2.一种治疗哺乳动物中的多系统疾病的方法，所述治疗通过施用有效地治疗所述疾病的治疗基因来实现，其中所述治疗基因被包含在可转移的病毒载体中，并且其中所述方法包括向所述哺乳动物的脑脊液和血液联合施用所述载体。
3.权利要求1或2的方法，其中所述可转移的病毒载体是可转移的AAV(tAAV)载体。
4.权利要求3的方法，其中所述tAAV载体选自AAV4载体、AAV7载体、AAV9载体、AAV10载体、或牛AAV载体。
5.权利要求1～4任一项的方法，其中所述tAAV载体的基因组是单链的或双链的。
6.权利要求1～5任一项的方法，其中所述tAAV载体包含缺少功能性Rep和Cap编码病毒序列的复制缺陷型AAV基因组。
7.权利要求1～6任一项的方法，其中所述tAAV载体是ssAAV9载体、scAAV9载体、或AAV10载体。
8.权利要求1或2的方法，其中通过i.c.v.注射(ICV)、鞘内注射、或小脑延髓池内注射来将可转移的病毒载体施用到所述哺乳动物的脑脊液(CSF)中。
9.权利要求8的方法，其包括将载体至少施用到一个脑侧室中。
10.权利要求1或2的方法，其中通过静脉内注射(IV)、肌内注射、动脉内注射、腹膜内注射、或皮下注射来将可转移的病毒载体施用到所述哺乳动物的血液中。
11.权利要求10的方法，其包括载体的静脉内注射。
12.权利要求1或2的方法，其包括载体的ICV和IV联合注射。
13.权利要求1或2的方法，其中所述联合施用包括在彼此相隔小于72小时内、优选小于48小时内、更优选小于24小时内、还更优选彼此相隔小于1小时内施用到所述哺乳动物的CSF和血液中。
14.权利要求12的方法，其中所述联合施用是基本上同时的注射。
15.权利要求1或2的方法，其中比率：被施用到CSF中的剂量/被施用到血液中的剂量介于0.2和5之间，优选地介于0.2和1.5之间。
16.权利要求13的方法，其中所述比率为0.4、0.6、0.8、1.0、或1.25。
17.前述权利要求任一项的方法，其中所述治疗基因编码治疗性RNA或治疗性蛋白，所述治疗性蛋白选自生长因子、细胞因子、激素、神经递质、酶、抗凋亡因子、血管生成因子、已知在病理疾病中突变的任何蛋白例如“运动神经元存活”蛋白(SMN)。
18.权利要求2～17任一项的方法，其中所述多系统疾病选自神经退行性疾病、神经肌肉疾病、疼痛、溶酶体疾病、创伤、骨髓疾病、神经系统肿瘤、脱髓鞘性疾病、神经系统的自身免疫疾病、神经毒性综合征、睡眠障碍。
19.前述权利要求任一项的方法，其包括单次CSF-血液联合施用。
20.一种在需要的哺乳动物中治疗SMA的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的脑脊液和血液联合施用包含SMN基因的tAAV载体，所述联合施用导致SMN蛋白在神经系统以及外周组织和器官中表达并允许对SMA进行治疗。
21.一种试剂盒，其包含两个单位剂量的包含治疗基因的tAAV载体，其中一个单位剂量适用于全身注射，一个单位剂量适用于注射到CSF中。
基因治疗载体的广泛的基因递送
[0001] 本发明涉及用于在哺乳动物中递送和表达治疗基因的改进的组合物和方法。更具体地，本发明源自于如下出乎意料的发现：当将治疗基因并入到特定的一类病毒载体中并且施用到哺乳动物的脑脊液(CSF)和血液两者中时，在哺乳动物中获得了显著的、大量的且广泛的治疗基因递送和表达。如在脊髓性肌萎缩(SMA)模型中所示，与施用到一个单一位点相比，这样的联合施用在哺乳动物中导致令人惊讶和显著的治疗益处，这使得能够使用降低剂量的载体。令人惊讶地，向CSF和血液的联合递送显示出比单独应用到CSF中或单独静脉内应用的相同总剂量更高的功效，由此表明了超累加性(supra-additive)效应。与单独CSF递送或单独全身递送相比，这一超累加性效应继而允许降低必需的总剂量，虽然事实上被施用到CSF中的载体也将分布到整个身体，并且被全身递送的载体也将被递送到中枢神经系统。本发明可用于任何哺乳动物(包括人类对象)，并特别适合于治疗其中需要治疗基因的广泛表达的多系统疾病例如运动神经元(MN)或溶酶体疾病。
[0002] 前言
[0003] 运动神经元(MN)疾病例如脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或肯尼迪病是由脊髓、脑干和/或运动皮质中MN的选择性退化所表征的神经退行性疾病(Monani 2005；Pasinelli和Brown2006)；(Maclean，Warne等1996)。对于这些疾病没有疗法，主要是因为经由全身注射进行的向MN的药物递送被“血脑屏障”(BBB)的存在所阻碍。这一解剖学和生理学屏障由中枢神经系统(CNS)毛细血管的内皮细胞之间的紧密连接所形成，并防止分子在循环系统和CNS之间轻松通过(Scherrmann 2002)。使用被直接注射到CNS实质中的重组蛋白进行的MN的可选供应也是困难的，因为所述蛋白向神经实质的低扩散、对重复注射或植入渗透泵的需要、以及手术操作的侵入性阻碍了潜在的临床应用。
[0004] 传统药理学的失败已经导致科学团体开发基于特别是使用病毒载体的基因转移技术的新的治疗策略。
[0005] 在这方面，首先提出的MN疾病的基因转移策略基于将载体鞘内递送或直接注射到脊髓实质中(Davidson，PNAS 2000)(Azzouz，Hottinger等2000)。然而，这些方法没能产生有效的广泛CNS转导。
[0006] 将病毒载体注射到脑室中也用于如下目的：转导脉络丛和室管膜的上皮细胞，以及引起治疗性蛋白在脑脊液(CSF)中的分泌(Passini和Wolfe 2001)。然而，重组蛋白向神经组织的扩散是不充分的，并且不可能观察到病毒的扩散。
[0007] 通过肌内(i.m.)注射，利用病毒载体向MN的逆向轴突输送，进一步开发了可选的非侵入性策略。源自于腺病毒、腺相关病毒(AAV)或用狂犬病G糖蛋白假型化的马贫血病毒(EIAV)的一些病毒载体确实可以在i.m.注射后沿着MN轴突进行逆向输送。这些病毒中的一些被成功地用于在实验动物中转导较低的MN(Finiels等，1995；Kaspar等，2003；Azzouz等，2004)。然而，特别是因为需要大量的注射位点和病毒粒子以靶向影响患者的大多数运动单元的处于病理状态的MN，所以该方法的临床价值仍是有疑问的。
[0008] 在WO2009/043936和Duque等(Mol Ther 2009)中，发明人已经令人惊讶地发现某些病毒例如AAV9的外周注射能够引起体内CNS细胞的显著转导，这首次表明，可以在单一的外周(例如，静脉内[i.v.]、腹膜内[i.p.]、或肌内[i.m.])注射后将目的基因转移到新生和成年哺乳动物的MN中。
[0009] 通过继续他们的研究，本发明人现已令人惊讶地发现，当将基因克隆到特定的一类病毒载体中时并且当通过CSF/血液联合施用方案来施用所述载体时，能够显著提高在体内的基因转移和表达的功效。与施用到一个单一位点相比，这种方法确实导致令人惊讶和显著的体内治疗益处(存活、体重增加)。联合施用看起来是超累加性的：该联合比递送到CSF或全身的相同剂量更加有效。这一超累加性效应继而使得能够使用总剂量降低的病毒以实现所需效果。因此，本发明提供了用于在体内表达治疗基因的改进方法，并可用于任何哺乳动物，包括人类对象。其特别适合于治疗多系统疾病，例如MN或溶酶体疾病。
发明内容
[0010] 本发明涉及使用可转移的病毒载体在体内递送治疗产品的新方法。更具体地，本发明涉及通过向哺乳动物对象的CSF和血液联合施用可转移的病毒载体以在所述对象的神经系统和外周组织中递送和表达治疗基因的组合物和方法。
[0011] 本发明的目的更具体地涉及在哺乳动物中表达治疗基因的方法，所述方法包括在所述哺乳动物的CSF和血液中联合施用包含所述基因的可转移的病毒载体，优选为可转移的AAV载体(tAAV)。
[0012] 本发明的另一目的涉及治疗哺乳动物中的多系统疾病的方法，所述治疗通过施用有效地治疗所述疾病的治疗基因来实现，其中所述治疗基因被包含在可转移的病毒载体、优选tAAV载体中，并且其中所述方法包括向所述哺乳动物的CSF和血液联合施用所述载体。
[0013] 本发明的另一目的在于在需要的对象中治疗CNS疾病例如MN疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗基因，其中所述治疗基因被包含在可转移的病毒载体、优选tAAV载体中，并且其中所述方法包括向所述哺乳动物的CSF和血液联合施用所述载体，从而导致对所述对象进行治疗。
[0014] 本发明的另一目的在于通过向患有MN疾病的对象施用治疗基因而在所述对象中增加存活或重量的方法，其中所述治疗基因被包含在可转移的病毒载体、优选tAAV载体中，并且其中所述方法包括向所述哺乳动物的CSF和血液联合施用所述载体，从而导致所述对象的存活或体重的增加。
[0015] 本发明的另一目的是包含治疗基因的可转移的病毒载体，所述治疗基因用于通过向哺乳动物对象的CSF和血液联合施用所述载体来治疗所述对象中的多系统疾病。
[0016] 本发明的另一目的是包含治疗基因的可转移的病毒载体，所述治疗基因用于通过向需要的对象的CSF和血液联合施用所述载体来治疗哺乳动物对象中的CNS疾病。
[0017] 根据优选实施方式，可转移的病毒载体是tAAV，例如AAV9或AAV10载体。
[0018] 向哺乳动物的CSF施用病毒载体优选通过脑室内(i.c.v.或ICV)注射、鞘内注射、或脑池内注射来进行，并且向血液的施用优选通过肠胃外递送(例如i.v.(或IV)注射、i.m.注射、动脉内注射、i.p.注射、皮下注射、皮内注射、经鼻递送、经皮递送(例如贴剂)、或者通过经肠递送(口服或直肠)来进行。
[0019] 如本申请中所示，联合施用更优选地为同时施用，虽然可进行顺序施用。
[0021] 本发明的另一特定目的在于在需要的哺乳动物中治疗SMA的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的CSF和血液联合施用包含治疗基因的可转移的病毒载体、优选tAAV载体，所述联合施用导致治疗基因在神经系统和外周组织或器官中表达并允许对SMA进行治疗。
[0022] 更优选地，用于治疗SMA的治疗基因是SMN基因(即，编码SMN蛋白的任何DNA或RNA)或能够调整可选的剪接、激活启动子、或提高SMN蛋白的稳定性并由此引起SMN水平增加的任何序列(例如编码反义寡核苷酸的序列)。
[0023] 本发明的另一目的在于用于降低被施用到需要基因疗法治疗的对象的治疗基因的剂量而不降低临床益处的方法，所述方法包括使用可转移的病毒载体将所述基因施用到对象的CSF和血液中。
[0025] 图1.ICV和IV scAAV9-PGK-SMNopti注射的SMNΔ7小鼠的Kaplan-Meier存活曲线
[0026] ICV(n＝10)和IV(n＝10)注射小鼠(在P0时)两者存活超过未注射小鼠的最大寿命(18天，n＝14)。未ICV注射小鼠在60天的日龄之前死亡，而仅54％的IV注射小鼠在该日龄时是活着的。ICV注射小鼠的存活中值显著高于IV注射小鼠的存活中值(163天对73天)。
[0027] 图2.ICV和IV注射的scAAV9-PGK-SMNopti SMNΔ7小鼠的体重曲线
[0028] 与IV注射的SMNΔ7小鼠(n＝13)的体重损失表型相比，ICV注射的SMNΔ7小鼠(n＝10)的体重损失表型得到改善。与未注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型相比，IV和ICV注射小鼠两者的体重损失表型均得到改善；对于ICV注射小鼠来说，其改善优于IV注射小鼠的改善(在30天的日龄时，相对于杂合小鼠的≈33g和未治疗的小鼠的≈3g，i.v.和i.c.v.注射小鼠分别为≈17g和≈25g)。Ht：对照杂合小鼠；NI：未注射的SMNΔ7小鼠。
[0029] 图3.在P0时ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMNΔ7小鼠的中枢神经系统中SMN的表达
[0030] 对脑和脊髓中SMN的表达的(A)蛋白质免疫印迹和(B)免疫荧光分析显示，SMN水平在ICV注射的SMNΔ7小鼠(n＝3)中比在未注射的SMNΔ7小鼠(n＝2)和野生型小鼠(n＝2)中高。
[0031] 图4.在P0时ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMNΔ7小鼠的外周器官中SMN的表达
[0032] 在ICV注射的新生SMNΔ7小鼠(n＝3)的心脏、肾脏、和肝脏中检测SMN的表达。
[0033] 图5.scAAV9-PGK-SMNopti ICV、IV、和ICV/IV共注射的SMNΔ7小鼠的Kaplan Meier存活曲线
[0034] 与单独IV(n＝10)或ICV(n＝14)注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠(n＝14)中存在疾病迟发的趋势。100％的ICV/IV共注射小鼠在50天的日龄时仍然是活着的。
[0035] 图6.与单独IV(n＝10)或ICV(n＝14)注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠(n＝14)中体重损失表型得到改善
[0036] 在15周时，ICV/IV共注射、ICV、和IV小鼠的平均体重分别达到24g、21g、和16g(杂合小鼠的体重为26.5g)。在15周时，ANOVA分析没有显示出杂合小鼠和IV/ICV共注射小鼠(与ICV或IV注射小鼠相对比)之间在体重上的任何统计学差异。
[0037] 图7.scAAV9-PGK-SMNopti ICV、IV、和ICV/IV共注射的hSMN2小鼠的Kaplan Meier存活曲线
[0038] ICV/IV共注射小鼠的平均存活(≈27天)优于IV(≈9天)或ICV(≈8天)注射小鼠的平均存活，其中一只ICV/IV共注射小鼠存活长达170天。
[0039] 对于scAAV10-SMNopti注射小鼠发现了相似的差异，其中一只日龄为200天的小鼠在此提交时间时仍然存活。
[0040] 图8.在P0时用scAAV9-PGK-SMNopti ICV、IV或ICV/IV共注射的严重hSMN2小鼠(KO)的体重表型的比较
[0041] 与IV或ICV注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型相比，ICV/IV共注射的KO小鼠的体重损失表型得到改善(Hz：对照杂合小鼠；KO：未注射的严重SMA小鼠；WT：野生型小鼠)。重要的是，一只ICV/IV注射小鼠存活长达170天的日龄。
[0042] 图9.scAAV9-PGK-SMN ICV、IV、或IV/ICV共注射的SMNΔ7小鼠的CNS中SMN表达的比较
[0043] (A)对在P0时根据不同的递送途径(每种递送途径n＝2)用scAAV9-PGK-SMN注射后15天的小鼠脑和脊髓组织以及在未注射的SMNΔ7和野生型对照中进行的蛋白质免疫印迹分析。与单独ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN水平降低。ICV注射的SMNΔ7小鼠中脑和脊髓的SMN表达。(B)来自于在P0时根据不同的递送途径用scAAV9-PGK-SMN注射并在注射后15天进行SMN免疫荧光处理的小鼠的脊髓横向切片的代表性切片。同样地，与单独ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN-阳性细胞的数量和染色强度降低。
[0044] 图10.治疗后的SMA小鼠中生殖能力的恢复
[0045] 与IV注射小鼠相比，在ICV或ICV/IV注射后的SMNΔ7雌性小鼠中，在恢复的生殖能力方面观察到了显著的益处。在ICV/IV和ICV治疗组中，100％的雌性小鼠是可繁殖的，相反，IV治疗的小鼠不能自我繁殖。
[0046] 图11.野生型小鼠和AAV10-hSMNopti ICV/IV共注射的hSMN2小鼠的存活和体重表型的比较
[0047] 与未治疗的小鼠相比，AAV10ICV/IV共注射小鼠的体重损失表型和存活得到了相当大的改善，特别是在日龄为209和36天的两只小鼠中。未治疗的小鼠从来没有度过6天的日龄(存活中值≈3天)。
[0048] 发明详述
[0049] 对于多系统疾病例如MN疾病(例如，脊髓性肌萎缩(SMA)或肌萎缩性侧索硬化症(ALS))或溶酶体疾病的治疗来说，向神经系统和外周组织两者的广泛的基因递送是重大的挑战。在此，我们描述了一种新的基因转移方法，其允许在向哺乳动物的血液和CSF单次联合注射病毒载体之后获得神经系统(中枢和外周两者)和外周器官的有效转导。具体来说，我们在小鼠中静脉内(“i.v.”或“IV”)和脑室内(“i.c.v.”或“ICV”)注射tAAV载体，并在严重(hSMN2)和较不严重(SMNΔ7)的SMA小鼠模型两者中获得了比单一ICV注射之后更高和更显著的临床益处。对于SMNΔ7小鼠观察到了体重增加方面的改善，并在两种hSMN2小鼠中均观察到了存活和体重增加两者的改善。与IV注射小鼠相比，在较不严重的SMNΔ7小鼠模型中观察到了恢复的生殖能力方面的额外益处。可以在脊髓、背部感觉纤维和背根神经节的MN和神经胶质细胞中以及在心脏或肝脏中发现治疗基因的表达。
[0050] 因此，本发明提供可用于通过病毒介导的基因疗法治疗多系统疾病的新的改进方法。
[0051] 可转移的病毒载体
[0052] 在本发明的上下文中，术语“病毒载体”指包含病毒组分或源自于病毒组分并适合于感染哺乳动物细胞(优选人细胞)的任何载体。通常，病毒载体包含被包装在病毒衣壳或包膜中的重组病毒基因组。
[0053] “可转移的”病毒载体指在CSF注射后能够在生物体的CNS和非CNS区域中扩散的病毒载体。具体来说，可转移的病毒载体能够在注射到CSF中之后扩散并转导外周器官的细胞，这通常通过穿过或绕过BBB来实现。本发明确实证明了病毒载体能够表现出这种能力并且能够在CNS注射后以高效率转导外周器官例如心脏、肝脏或肾脏。
[0054] 本发明的可转移的病毒载体可源自于各种类型的病毒。如在下面所公开的，在最优选的实施方式中，本发明的病毒载体是AAV载体。
[0055] 术语AAV载体通常指包含至少一种编码治疗产物(例如，蛋白、肽、或RNA序列如反义序列)的核酸分子(基因组)的AAV病毒粒子(或毒粒)。如在下面所讨论的，AAV可源自于包括血清型组合(即，“假型”AAV)的各种血清型，或源自于各种基因组(例如，单链或自身互补的)。此外，AAV载体可以是复制缺陷型和/或靶向AAV载体。
[0056] 腺相关病毒(AAV)是约20纳米大小的依赖性微小病毒。如同其他的微小病毒，AAV是单链的无包膜DNA病毒，具有约5000核苷酸长度的基因组，含有两个开放阅读框。左侧的开放阅读框编码负责复制的蛋白(Rep)，而右侧的开放阅读框编码衣壳的结构蛋白(Cap)。开放阅读框的两侧有两个ITR序列，其充当病毒基因组的复制起点。此外，基因组还含有包装序列，允许将病毒基因组包装到AAV衣壳中。
[0057] AAV需要共辅助功能(其可由例如腺病毒或合适的包装细胞或辅助质粒提供)以在培养细胞中进行生产性感染。在这种辅助功能不存在时，AAV毒粒基本上进入细胞、作为单链DNA分子迁移到细胞核、并且整合到细胞基因组中。AAV具有易感染的广泛宿主范围(包括人类细胞)，在人类中普遍存在，并且完全是非致病性的。
[0058] AAV载体已被设计、生产和用于介导人类对象中的基因递送，包括用于治疗目的。使用AAV载体的临床试验目前在多个国家进行。通常，用在基因转移中的AAV载体包含缺少功能性Rep和Cap编码病毒序列的复制缺陷型AAV基因组。这种复制缺陷型AAV载体更优选地缺少大部分或全部的Rep和Cap编码序列，并且基本上保留一个或两个AAV ITR序列和包装序列。缺陷型基因组被包装在病毒粒子中，以形成缺陷型重组AAV病毒，也称作“AAV载体”。
[0059] 文献中已经公开了生产这种AAV载体的方法，包括使用包装细胞、辅助性病毒或质粒、和/或杆状病毒系统(Samulski等，(1989)J.Virology 63，3822；Xiao等，(1998)J.Virology 72，2224；Inoue 等，(1998)J.Virol.72，7024；WO98/22607；WO2005/072364)。也已经报道了生产假型AAV载体的方法(例如，WO00/28004)，以及AAV载体的各种修饰或制剂，以在体内施用后降低它们的免疫原性(参见例如，WO01/23001；WO00/73316；
WO04/112727；WO05/005610；WO99/06562)。
WO04/112727；WO05/005610；WO99/06562)。
[0060] AAV载体可从AAV的各种血清型制备或得到，所述AAV的各种血清型甚至可以被混合在一起或与其他类型的病毒混合，以生产嵌合的(例如假型)AAV病毒。
[0061] tAAV的优选实例是人AAV4载体、人AAV7载体、人AAV9载体、人AAV10载体、或牛AAV载体。
[0062] AAV载体可源自于单一的AAV血清型或包含来自至少两种不同的AAV血清型的序列或组分(假型AAV载体)，例如包含源自于一种AAV血清型(例如AAV9)的AAV基因组和至少部分源自于不同的AAV血清型的衣壳的AAV载体。
[0063] AAV载体的具体实例为：
[0064] -在AAV9来源的衣壳中包含AAV9来源的基因组(包含可操作地连接于编码治疗性蛋白的核酸的AAV9来源的ITR和AAV9来源的包装序列的核酸分子，优选地两个AAV9来源的ITR在AAV9来源的包装序列和编码治疗性蛋白的核酸的两侧)的载体；
[0065] -在AAV10来源的衣壳中包含AAV10来源的基因组的载体；
[0066] -在AAV10来源的衣壳中包含AAV9来源的基因组的载体；
[0067] -在AAV9来源的衣壳中包含AAV10来源的基因组的载体；
[0068] -在AAV10来源的衣壳中包含AAV2来源的基因组的载体；
[0069] -在AAV9来源的衣壳中包含AAV2来源的基因组的载体；
[0070] -在牛AAV来源的衣壳中包含牛AAV来源的基因组的载体。
[0071] AAV载体可包含修饰的衣壳，包括非病毒起源或结构修饰的蛋白或肽，以改变载体的向性。作为具体的实例，衣壳可包括特定受体的配体或特定配体的受体，以将载体分别靶向表达所述受体或配体的细胞类型。
[0072] 在本发明中使用的AAV载体中，AAV基因组可以是单链核酸或双链、自身互补的核酸(McCarty等，Gene Therapy，2001)，更优选为自身互补的核酸。
[0073] 用于本发明的最优选的病毒载体是scAAV9载体、ssAAV9载体、scAAV10载体或ssAAV10载体。
[0074] 如上所讨论的，AAV来源的基因组包含编码治疗产物(例如，蛋白或RNA)的核酸。通常，核酸也包含允许表达、优选地分泌编码的蛋白的调节序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、编码蛋白转导结构域(PTD)的序列等。在这一方面，核酸最优选地包含可操作地连接于编码序列的启动子区域，以引起或提高治疗性蛋白在感染细胞中的表达。这样的启动子可以是普遍存在的、组织特异性的、强的、弱的、受调节的、嵌合的启动子等，以允许治疗产物在感染组织中有效和合适的生产。启动子可以是与编码的蛋白同源或异源的，包括细胞、病毒、真菌、植物或合成启动子。用于本发明的最优选的启动子在神经细胞中、特别是在人细胞中、更优选在MN中应当是功能性的。这种受调节的启动子的实例包括但不限于含有Tet开/关元件的启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。特异性针对MN的启动子的实例包括降钙素基因相关肽(CGRP)的启动子或HB9启动子，所述降钙素基因相关肽是一种已知的MN来源的因子。其他在MN中有功能的启动子包括胆碱乙酰转移酶(ChAT)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、突触蛋白的启动子，或普遍存在的启动子，包括神经元特异性沉默子元件(NRSE)。普遍存在的启动子的实例包括：
病毒启动子，尤其是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等；以及细胞启动子例如PGK(磷酸甘油酸酯激酶)启动子。
病毒启动子，尤其是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等；以及细胞启动子例如PGK(磷酸甘油酸酯激酶)启动子。
[0075] 在特定的实施方式中，核酸可以包含允许编码的蛋白分泌的前导序列。目的转基因与编码分泌信号肽(通常位于分泌的多肽的N-端)的序列的融合允许治疗性蛋白以可以从转导的细胞分泌的形式进行生产。这种信号肽的实例包括白蛋白、β-葡萄糖苷酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌的信号肽。
[0076] 根据另一个特定的实施方式，转基因与PTD序列如Tat或VP22序列融合，从而引起或提高治疗性蛋白从转导细胞的分泌和被相邻细胞的再摄取。
[0077] 在特定的实施方式中，核酸包含可操作地连接的启动子和前导序列，以允许表达和分泌编码的蛋白。
[0078] 在另一个特定的实施方式中，核酸包含可操作地连接的启动子、前导序列和PTD序列，以允许表达和分泌编码的蛋白。
[0079] 在最优选的实施方式中，启动子是普遍存在的。
[0080] 同样，也可以使用编码超过一种治疗产物的病毒载体。这种双顺反子或多顺反子的病毒载体例如可编码：SMN(或促进SMN水平增加的任何序列)，以及所编码的因子促进对治疗的疾病而言具有治疗重要性的另一种功能例如细胞存活(例如，抗凋亡或神经营养因子)、轴突生长或维持(例如神经营养因子，转化生长因子或细胞外基质组分)的序列，或对骨骼肌或心肌(例如肌肉营养因子，肌生成的活化剂)赋予有益效果的任何序列。
[0081] 如上所讨论的，AAV载体可通过本领域中本身已知的技术来生产，如在实施例中进一步示出的。
[0082] 脑脊液和血液联合施用
[0083] 本发明特别基于以下出乎意料的发现：当使用可转移的病毒载体并将其递送到对象的血液和脑脊液(CSF)两者中时，可以获得提高的病毒介导的基因表达和疾病矫正。令人惊讶地，结果显示，与在一个单一施用位点中相同剂量的病毒相比，这样的联合施用导致显著增加的治疗基因表达。本发明进一步显示，联合施用提高了治疗对象中的治疗益处，例如显著提高存活和重量增加并恢复生殖能力。
[0084] 在本发明的上下文中，血液施用指将载体直接外周施用到血流或周围组织中。这样的施用包括但不限于全身注射例如静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、皮下或经皮注射。最优选的血液施用包括i.v.、i.a.、或s.c.注射。
[0086] 可使用常规装置和方案实现血液施用。例如，可使用任何可用的注射器、针、泵、手术等进行注射。
[0087] 在本发明的上下文中，施用到CSF中指将载体直接施用到CSF或周围组织中，使病毒载体释放到CSF中。脑脊液充满脑室并包围脑和脊髓。CSF本质上由脉络丛产生。研究表明成人中CSF的体积为约150ml，并且每天产生约500ml的CSF，这与CSF被连续不断地生产、循环和吸收的事实相一致。CSF最终经由蛛网膜绒毛和颅内血管窦流入血液。
[0088] 通过将本发明的tAAV载体注射到CSF中，本发明人已令人惊讶地发现，tAAV载体能够转导CNS(包括脑、视网膜和脊髓)中的细胞以及外周系统(例如，外周神经系统和外周器官，包括骨骼肌和心脏)中的细胞。将tAAV注射到CSF中甚至可导致比单独外周施用更强的基因表达和临床益处。
[0089] 本发明的CSF施用具体包括i.c.v.注射、鞘内(i.t.)注射、或脑池内(i.c)注射。优选的CSF施用包括ICV或IT注射。最优选的施用包括注射在至少一个脑侧室中。
[0090] 在这一方面，本发明的病毒载体可通过使用任何合适的装置例如针、注射器、套管、或导管注射到脑室区域中(例如，注射到填充有CSF的一个或两个脑侧室中)而被直接递送到CSF中。这种施用可使用本领域本身已知的神经外科技术来进行(Davidson等，PNAS97:3428-3432，2000)。对于i.c.v.注射来说，注射的病毒载体溶液的总体积通常介于0.1～5ml之间。
[0091] 也可使用本领域本身已知的技术实现鞘内注射。在患者中i.t.注射后，AAV载体可通过腰椎穿刺进行鞘内施用，腰椎穿刺是在床边常规进行的安全程序，其允许将病毒粒子释放到周围CSF中(Beutler AS，Curr Opin Mol Ther.2005Oct；7(5):431-9)。
[0092] 将病毒载体具体施用到CNS的特定区域可通过立体定位微注射来完成。为此目的，可使用例如高分辨MRI生成一个或多个脑图像，并可以将得到的图像转移到指导立体定位注射的计算机。如果必要，可使用公知常识来鉴定人脑内的特定结构(参见例如，人脑：表面、使用MRI的三维断面解剖学、以及血液供应(The Human Brain:Surface,Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI,and Blood Supply)，第二版，Deuteron等主编，Springer Vela，1999)。
[0093] 如上所指出的，本发明在于基于向CSF和血液联合施用的病毒介导的基因治疗方法。
[0094] 在本发明的上下文中，术语“联合”施用指在足以在体内产生联合效果而没有显著的免疫干扰的短时间框架内将载体施用到两个隔室中。更优选地，“联合”施用包括在彼此相隔小于72小时内、优选小于48小时内、更优选小于24小时内、还更优选彼此相隔小于1小时内施用到所述哺乳动物的CSF和血液中。联合施用可以首先在CSF中进行，随后在血液中进行，反之亦然。
[0095] 在优选的实施方式中，联合施用是基本上同时的注射，即两种注射基本上同时进行或一个紧接着另一个进行。
[0096] 病毒载体的剂量和CSF/血液比率可由技术人员例如根据疾病状况、对象和治疗时间表进行调整。病毒载体通常以“治疗有效”量施用，“治疗有效”量即足以缓解(例如，降低、减轻、阻断或矫正)至少一种与疾病状态相关的症状或提供对象的状况的改善的量。9 16 10 15
有效剂量可能是足以提高存活的剂量。通常，使用10～10 、优选约10 ～10 的总剂量的病毒载体(即，粒子或病毒基因组)，该总剂量被分成两个单位剂量，分别用于CSF/血液
10 14
施用。一个示例性剂量介于5x10 至5x10 /kg之间。
有效剂量可能是足以提高存活的剂量。通常，使用10～10 、优选约10 ～10 的总剂量的病毒载体(即，粒子或病毒基因组)，该总剂量被分成两个单位剂量，分别用于CSF/血液
10 14
施用。一个示例性剂量介于5x10 至5x10 /kg之间。
[0097] 在这方面，可以调整被施用在CSF中和血液中的病毒载体的相对量以提供最佳临床益处。在这方面，本发明人已经表明，比率：被施用在CSF中的剂量/被施用在血液中的剂量应优选地介于0.2和5之间，甚至更优选地介于0.2和3之间。优选的比率的具体实例为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0或1.25。
[0098] 治疗可以由单次联合施用构成，或可以重复进行。如果重复施用，随后的施用可以是单一(即，仅在选自CSF或血液的一个位点中)或联合的。同样，当进行重复施用时，优选交替使用不同的病毒血清型。作为一个实例，可以使用AAV9载体进行首次联合施用并且使用AAV10载体进行第二次施用，反之亦然。
[0099] 病毒载体可以以任何合适的形式进行施用：作为液体溶液或混悬液，作为适合于在注射前配制成液体溶液或混悬液的固体形式，作为凝胶或乳液，或喷雾剂。病毒载体通常与任何合适且药学可接受的赋形剂、载体、佐剂、稀释剂等配制在一起。对于注射来说，赋形剂可以是液体、等渗溶液、缓冲液，例如无菌且无热原的水或者无菌且无热原的磷酸盐缓冲的盐溶液。
[0100] 在特定的实施方式中，本发明在于治疗哺乳动物中的多系统疾病的方法，所述治疗通过施用有效地治疗所述疾病的治疗基因来实现，其中所述治疗基因被包含在AAV9或AAV10载体中，并且其中所述方法包括以介于0.3和3之间的剂量比i.c.v./i.v.对所述载体进行i.c.v.和i.v.联合施用。
[0101] 如上所指出的，本发明可用于治疗神经系统疾病，优选CNS或多系统神经疾病。治疗可用于缓解病理，特别是用于提高存活、重量、生殖能力、运动功能、MN的数量或肌肉大小。
[0102] 试剂盒
[0103] 本发明还涉及组合物和试剂盒。在这方面，本发明的另一目的是组合物或试剂盒，其包含两个单位剂量的包含治疗基因的可转移的病毒载体，其中一个单位剂量适用于全身注射，一个单位剂量适合于注射到CSF中。i.c.v./全身剂量比优选介于0.3和3之间，甚至更优选选自0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、或1.25。
[0104] 本发明的试剂盒通常包含一个或多个独立的容器，所述容器各自包含CSF和血液单位剂量。试剂盒也可包含一套说明书，一般是书面说明书，所述说明书涉及用于本文中描述的任何方法的载体的使用。试剂盒还可包含适合于单位剂量的施用的装置或部件，例如安瓿、注射器、针等。
[0105] 运动神经元疾病
[0106] 本发明可通过治疗产物的大量和广泛递送而用于治疗各种疾病。治疗产物可以是可能缓解或减轻疾病的病因或症状或者以其他方式向对象赋予益处的任何蛋白、肽或RNA。治疗性蛋白的实例包括生长因子、细胞因子、激素、神经递质、酶、抗凋亡因子、血管生成因子、以及已知在病理疾病中突变的任何蛋白例如“运动神经元存活”蛋白(SMN)。治疗性RNA的实例包括靶向信使RNA的反义RNA或RNAi，所述信使RNA编码在下文提到的任何疾病中具有治疗重要性的蛋白。例如，在ALS的治疗方面，靶向超氧化物歧化酶的RNAi可由如上定义的AAV载体编码。
[0107] 下面提供了优选的候选治疗产物的列表：
[0108] SMN(SMA)
[0109] IGHMBP2(SMA-RD)
[0110] VAPB(SMA或ALS)
[0111] 靶向SMN2的mRNA前体剪接位点的反义寡核苷酸序列(SMA)
[0112] 靶向SOD1的mRNA前体剪接位点的反义寡核苷酸序列(ALS)或ATX(脊髓小脑性共济失调)或UBQLN2(ALS)或ATAXIN2(ALS)或C9orf72(ALS)或TARDBP(ALS)或TDP-43，FUS，(ALS和FTD)
[0113] 靶向SOD1的mRNA的shRNA(微RNA或siRNA)(ALS)或ATX(脊髓小脑性共济失调)或UBQLN2(ALS)或ATAXIN2(ALS)或C9orf72(ALS或额颞叶退化症|FTD])或TARDBP(ALS)或TDP-43(ALS和FTD)或FUS，(ALS和FTD)或CHMP2B(ALS)
[0114] ATX(脊髓小脑性共济失调)或UBQLN2(ALS)或ATAXIN2(ALS)或C9orf72(ALS或额颞叶退化症|FTD])或TARDBP(ALS)或TDP-43或FUS，(ALS和FTD)或CHMP2B(ALS)[0115] MECP2或靶向MECP2的shRNA(Rett综合征)
[0116] HEXB(山德霍夫病(Sandhoff disease))
[0117] 根据治疗产物，本发明可用于治疗各种疾病，包括可通过在神经组织中表达治疗性蛋白、或抑制来自于神经组织的毒性蛋白而进行治疗或预防的任何疾病。这种疾病包括中枢或外周神经疾病，优选选自神经退行性疾病、神经肌肉疾病、创伤、骨髓损伤、疼痛(包括神经性疼痛)、神经系统肿瘤、脱髓鞘性疾病、神经系统的自身免疫疾病、神经毒性综合征、或多系统疾病例如溶酶体或过氧化物酶体疾病。
[0118] 疾病的特定实例包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、杜尔雷斯综合征(Tourette Syndrome)、精神分裂症、斯莱病(Sly disease)、亨特病、痴呆、多疑症、强迫症、智力迟钝、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie Tooth disease)、脊髓小脑性共济失调、痉挛性截瘫、肯尼迪病、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、自闭症、高雪病(Gaucher's disease)、粘多糖病(Hurler's disease)、克拉伯病和行为改变(例如，睡眠、感知或认知障碍)。
[0119] 本发明可用于任何哺乳动物，特别是人类对象，包括成人，以进行预防性或治疗性治疗。
[0120] 在以下实验部分中将公开本发明的其他方面和优点，所述实验部分应仅视为说明性的并且不限制本申请的范围。实施例
[0121] 材料和方法
[0122] 动物
[0123] SMNΔ7小鼠(被认为是I型SMA的模型)购自Jackson实验室(SMN2+/+，SMNΔ7+/+，Smn-/-，JACKSON no.SN 5025)。这些小鼠是三重突变体，通过外显子2的靶向突变而使内源性鼠Smn基因失效，并带有两种转基因的等位基因(人SMN2cDNA[缺少外显子7]和整个人SMN2基因)(Le T.T.Hum Mol Genet 2005)。野生型小鼠(WT)对应于[SMN2+/+，SMNΔ7+/+，Smn+/+]同窝出生者，并且杂合小鼠(Ht)对应于[SMN2+/+，SMNΔ7+/+，Smn+/-]同窝出生者。喂养小鼠以产生自立的群体并且将它们维持在受控的条件下(22±1℃，
60±10％相对湿度，12h/12h光/黑循环，食物和水随意)。根据关于实验动物护理和使用的欧洲指南进行所有的动物实验。
60±10％相对湿度，12h/12h光/黑循环，食物和水随意)。根据关于实验动物护理和使用的欧洲指南进行所有的动物实验。
[0124] scAAV载体的生产
[0125] 如之前所述(Duqué等，Mol Ther 2009；Dominguez等，Hum Mol Genet 2011)并加以轻微的修改，使用AAV2质粒生产相应的假型AAV9载体，所述AAV2质粒在CMV启动子的控制下表达GFP转基因，或在磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子的控制下表达hSMN1的密码子优化的序列(SMNopti)。简单地说，使用(i)腺病毒辅助质粒、(ii)编码rep2和cap9基因的AAV包装质粒(p5E18-VD2/9)和表达GFP或SMNopti的AAV2质粒，通过在HEK293细胞中进行无辅助病毒的三质粒转染来生产AAV9-SMN。通过在碘克沙醇密度梯度上超速离心来纯化重组载体。使用Amicon Ultra—Ultra cell 100K过滤器单元(Millipore)对病毒制备物进行脱盐和浓缩。将等分试样储存在-80℃直到使用。载体滴度通过实时PCR确定并表示为每毫升的病毒基因组(vg/ml)。
[0126] 体内AAV注射
[0127] 新生小鼠:
[0128] 以靠近眼睛的颞静脉的血流方向，使用具有33G针的Hamilton注射器进行i.v.注射。使用具有33G针的Hamilton注射器，在后囟点前部1mm，侧向1mm和深2mm处进行i.c.v.注射。IV和ICV注射两者均使用蓝色染料溶液进行验证。
[0129] 新生的SMNΔ7小鼠或对照野生型同窝出生者在出生日(P0)用病毒溶液进行注射。对于单一i.c.v注射来说，将AAV9-GFP(每只小鼠1.7×10e10vg，7μl)或AAV9-SMNopti(每只小鼠4.5×10e10vg，7μl)单侧地注射到右侧室中。对于单一i.v.注射来说，将相同浓度的载体以70μl的体积(在PBS中)注射到颞静脉中。对于i.v.和i.c.v.联合注射来说，将2.5x10e10vg(30μl)的AAV9-SMNopti注射到颞静脉中并且将2x10e10vg(3μl)的AAV9-SMNopti单侧地注射到右侧室中。
[0130] 新生的Smn-/-SMN2+/+小鼠和野生型对照同窝出生者在出生时用相似的程序进行注射。对于AAV9-GFP和AAV9-SMNopti的单一i.c.v注射来说，载体剂量和体积与用于新生的SMNΔ7小鼠的载体剂量和体积相同。对于i.v.注射来说，将AAV9-GFP(每只小鼠1.2×10e11vg)或AAV9-SMNopti(每只小鼠3.4×10e11vg)以50μl的体积(在PBS中)注射到颞静脉中。对于i.v.和i.c.v.联合注射来说，将4.5x10e10vg(50μl)的AAV9-SMNopti注射到颞静脉中并且将4.5x10e10vg(7μl)的AAV9-SMNopti单侧地注射到左侧室中。
[0131] 成年小鼠.一月龄的野生型小鼠(n＝4)用scAAV9-GFP(4.8×10e10vg，20μl)注射到右侧室中。在腹膜内麻醉(氯胺酮(100mg/Kg)，甲苯噻嗪(10mg/kg))下进行注射。直接在左脑室中进行立体定位注射(在前卤后部0.34mm，侧向1.0mm和距脑顶深1.8mm)。
[0132] 组织学
[0133] 在注射后15天和1个月时将小鼠安乐死以分别进行SMN和GFP表达分析。将小鼠麻醉(10mg/kg甲苯噻嗪，100mg/kg氯胺酮)并用0.1mol/l PBS、随后用4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液进行心内灌注。在仅PBS灌注后将肌肉冷冻(除了P15新生小鼠)。将组织取出并通过在相同的PBS-4％PFA溶液中孵育24小时来进行后固定。然后，对于脑和非神经器官来说，将它们在PBS-15％蔗糖溶液中在4℃下孵育至少24小时，对于脊髓来说，将它们在PBS-30％蔗糖溶液中在4℃下孵育至少24小时，然后冷冻在冷的异戊烷(-50℃)中。在低温保持器上切出连续切片(脑为16μm切片；脊髓和心脏为14μm切片；脾脏和肾脏为12μm切片；肝脏为10μm切片；肌肉为8μm切片)并且储存在-80℃以供进一步分析。
[0134] 免疫染色分析
[0135] 为了对来自AAV9-GFP注射小鼠的组织中的GFP进行免疫组织化学检测，将切片首先在PBS Triton X-1000.1％中进行洗涤，然后在含有过氧化氢1％、甲醇20％和Triton X-1000.1％的PBS缓冲溶液(或过氧化氢溶液[过氧化物酶封闭液；Dako，Trappes，France])中孵育20分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。将切片在含有山羊血清(Dako)4％、牛血清白蛋白(Sigma)4％和Triton X-1000.1％的PBS缓冲液中在室温下封闭1小时。然后将切片与兔多克隆抗GFP抗体(1/5000；Abcam)孵育过夜。在清洗后，将切片与辣根过氧化物酶(HRP)生物素化的抗兔抗体(1/250；Vectastain，Vector Laboratories)孵育2小时，然后与亲和素-生物素复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)孵育30分钟。在用PBS Triton X-1000.1％清洗后，使用来自Vector Laboratories的过氧化物酶用3.3'-DAB底物试剂盒揭示二氨基联苯胺(DAB)染色。用水终止反应，并将切片在醇和二甲苯中脱水，然后用Eukitt进行封片。
[0136] 对于双重NeuN/GFP-免疫荧光分析来说，通过与在PBS中的5％牛血清蛋白(Sigma)、3％驴血清(Millipore)和0.4％Triton X-100孵育1小时来将低温切片封闭，然后与兔多克隆抗GFP抗体(1:2000；Abcam)孵育过夜。将切片在PBS中进行洗涤，然后与Alexa 488偶联的驴抗兔IgG(1:500；Invitrogen)在室温下孵育1小时。将切片在PBS中进行洗涤，并且根据试剂盒MOM方法进行封闭。然后，用鼠抗NeuN抗体(1/300；MAB377，Chemicon International)将切片封闭过夜。将切片在PBS中进行洗涤，然后与Alexa 594偶联的驴抗鼠IgG(1:500；Invitrogen)在室温下孵育1小时。将切片在PBS中进行洗涤，用fluoromount-G(Calbiochem)进行封片，并在用共聚焦显微镜(Axio Imager Z1，Zeiss)和AxioVision 4.7软件(Zeiss)观察之前储存在4℃下。
[0137] 蛋白质免疫印迹分析
[0138] 从来自14日龄的未治疗SMNΔ7小鼠(n＝3)、AAV9-SMNopti治疗的SMNΔ7小鼠(n＝3)和WT小鼠(n＝3)以及来自1个月和2个月大的AAV9-GFP注射(n＝3)或未注射(n＝3)的WT小鼠的脑、脊髓、心脏、肝脏、肾脏和脾脏制备蛋白提取物。使用Qproteome FFPE组织试剂盒，根据制造商的方案(Qiagen)制备组织提取物。将肌肉在供应有蛋白酶抑制剂混合物(Complete Mini，Roche Diagnostics)的RIPAE缓冲液(150mm NaCl，50mm Tris–HCl，0.5％脱氧胆酸钠，1％NP40，1％SDS)中进行裂解。将85或70(对于肝脏来说)微克的总蛋白在SDS 10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到Immobilon-p膜(Millipore)。将该膜接连地与被稀释在TBST封闭缓冲液(补充有5％脱脂奶粉的含0.2％吐温20的Tris缓冲盐水)中的兔抗GFP抗体(1:2000；AbCam)或鼠抗SMN抗体(1:1000；BD transduction)以及鼠抗α微管蛋白抗体(1:10000；Sigma)进行孵育。在TBST缓冲液中洗涤四次后，将膜与被稀释在封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶偶联的抗鼠抗体或抗兔抗体(GE Healthcare，1:10000)进行孵育。使用化学发光超信号终极试剂(chemiluminescence Super Signal Ultra reagent)(Pierce)对膜进行进一步处理。
[0139] 将AAV联合施用到SMA小鼠SMNΔ7中的方案
[0140] 载体：AAV9-PGK-SMN(CsCl梯度纯化)
[0141] 滴度：6,7x10e12vg/ml
[0142] SMA小鼠：SMNΔ7(不严重的SMA，2型SMA模型)
[0143] 存活中值13.6天(最大预期寿命18天)
[0144] 剂量
[0145] ICV(n＝10)：每只小鼠4.5x10e10vg
[0146] IV(n＝10)：每只小鼠4.5x10e10vg
[0147] ICV+IV(n＝9)：2.5x10e10vg IV+2x10e10vg ICV
[0148] 将AAV联合施用到SMA小鼠smn-/-中的方案
[0149] 载体：AAV9-PGK-SMN(CsCl梯度纯化)
[0150] 滴度：6.7x10e12vg/ml
[0151] SMA小鼠模型：[Smn-/-；hSmn1+/+](<>)(严重的SMA，1型SMA模型)[0152] 存活中值3.6天(最大寿命6天)
[0153] 剂量
[0154] KO ICV(n＝7)：每只小鼠4,7.1010vg(7μl)
[0155] KO IV(n＝4)：每只小鼠3,35.1011vg(50μl)
[0156] KO ICV+IV(n＝4)：(4,7.1010vg ICV+4,7.1010vg IV)，每只小鼠总共9,4.1010vg[0157] 结果
[0158] ·i.c.v.与i.v.AAV9-SMNopti注射的SMNΔ7小鼠的存活和表型
[0159] 我们使用优化的scAAV9载体，所述载体在人磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子控制下表达人SMN1基因的密码子优化的版本，并在PGK启动子和SMN1cDNA之间包括嵌合内含子以提高翻译效率和转基因表达(AAV9-SMN)(Dominguez，Hum.Mol.Genet.2011)。
[0160] 35只SMNΔ7小鼠在P0时用AAV9-SMNopti载体(每只小鼠4.5x1010vg，3x1013vg10
vg/kg)注射到颞静脉(70μl，n＝13)、脑侧室(7μl，n＝13)或两个位点(2.5x10 vg
10
i.v.，30μl；2.5x10 vg i.c.v.，3μl，n＝9)中。对照是未注射的SMNΔ7小鼠(n＝14)或杂合(n＝14)同窝出生的小鼠。
vg/kg)注射到颞静脉(70μl，n＝13)、脑侧室(7μl，n＝13)或两个位点(2.5x10 vg
10
i.v.，30μl；2.5x10 vg i.c.v.，3μl，n＝9)中。对照是未注射的SMNΔ7小鼠(n＝14)或杂合(n＝14)同窝出生的小鼠。
[0161] 动物的表型表征包括对存活、体重、外周性坏死、整体一般性外观的每日分析以及在70天的日龄时的运动活动性监测。所有AAV9-SMN注射的SMNΔ7小鼠都存活超过未注射小鼠的最大寿命(18天)。然而，由i.c.v.AAV9-SMNopti赋予的治疗优势超过i.v.治疗的治疗优势(图1)。实际上，与i.v.相比，被施用到脑室中的相同剂量的AAV9-SMNopti使死亡发作延迟了35天(60天对25天)。与i.v.注射小鼠相比，当对小鼠i.c.v.注射AAV9-SMNopti时，存活中值显著增加(对于i.c.v.和i.v.来说，从未注射小鼠的11.5天分别增加到163和73天)。我们在i.v.注射组中的存活最长的小鼠到目前为止为327日龄，而我们的最后一只i.c.v.注射小鼠在286天的日龄时死亡。
[0162] ·i.c.v.与i.v.AAV9-SMNopti注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型的改善[0163] i.v.和i.c.v.AAV9-SMN注射小鼠两者在整个研究阶段均重量增加，并且在14天(疾病的最终阶段)时它们的体重显著高于未注射SMNΔ7小鼠的体重(对于i.v.和i.c.v.来说，平均体重分别为4.7g和5.5g，相对于未注射小鼠的3.1g)(图2)。在注射后6周时，i.c.v.注射小鼠的平均体重几乎是杂合小鼠的平均体重，相比之下，i.v.注射小鼠看起来显著较小(i.v.和i.c.v.注射小鼠的体重分别为11.0±1.3和16.3±1.2，相对于杂合小鼠的18.3±0.6)。
[0164] ·在P0时ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMNΔ7小鼠的中枢神经系统中SMN的表达
[0165] 蛋白质免疫印迹分析证实，ICV注射的SMNΔ7小鼠(n＝3)中脑和脊髓的SMN表达显著高于未注射的SMNΔ7(n＝2)和甚至野生型动物(n＝2)(图3A)。i.c.v.注射小鼠的CNS中SMN表达水平的增加优于先前报导的在i.v.注射相同浓度的载体后的情形(在P0时，在颞静脉中)(Duque等，Mol.Ther.2009)。i.c.v.注射编码GFP的scAAV9载体后的小鼠的脑和脊髓中存在一些GFP阳性星形神经胶质细胞和神经元细胞，证实了由i.c.v.注射诱导的高CNS表达(图3B)。这表明CNS中的SMN表达可能足以从SMA病理中拯救SMNΔ7小鼠。
[0166] ·在P0时ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMNΔ7小鼠的外周器官中SMN的表达[0167] 出乎意料地，在P0时i.c.v.递送scAAV9-PGK-SMN后，在外周器官中检测到SMN的表达。具体地，在ICV注射的SMNΔ7小鼠(n＝3)的心脏、肾脏和肝脏中发现了SMN蛋白(图4A)。这些结果通过在以相同条件下注射编码GFP的scAAV9载体的小鼠中的GFP免疫荧光分析得到了证实(图4B)。
[0168] ·在P0SMNΔ7小鼠中ICV/IV共注射scAAV9-PGK-SMNopti后的存活百分比[0169] 100％的ICV/IV注射小鼠在注射后50天时仍然是活着的(在IV后，40％)(图5)。然而，仍然太早而不能检测ICV和IV/ICV组之间的任何存活差异。
[0170] ·在P0SMNΔ7小鼠中ICV/IV共注射scAAV9-PGK-SMNopti后SMNΔ7小鼠的体重[0171] 与IV或ICV注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型相比，ICV/IV共注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型得到改善(Ht：对照杂合小鼠；NI：未注射的SMNΔ7小鼠)(图6)。
[0172] ·在P0严重SMA小鼠中ICV/IV共注射scAAV9-PGK-SMNopti后的存活百分比[0173] 在ICV(8.1±2，n＝7)或IV(9±2.7，n＝4)注射后，与未注射小鼠(3.7±0.4，n＝14)相比，AAV9-SMN注射小鼠的平均存活增加(图7)。然而，IV/ICV小鼠的寿命中值(17天)优于单独IV注射(12天)或ICV注射(9天)小鼠的寿命中值。由于严重SMA小鼠的个体间变化性(ICV的平均存活为27±13天)，IV/ICV联合注射的治疗效果是可变的(7到超过60天)。在IV/ICV联合组中，4只小鼠中有一只小鼠仍然是活着的(在注射后超过60天时)。
[0174] 此外，与IV或ICV注射的SMNΔ7小鼠的体重损失表型相比，ICV/IV共注射的KO小鼠的体重损失表型得到改善(Ht：对照杂合小鼠；KO：未注射的严重SMA小鼠；WT：野生型小鼠)(图8)。
[0175] scAAV9-PGK-SMN ICV、IV、或IV/ICV共注射的SMNΔ7小鼠的CNS中SMN表达的比较
[0176] 图9显示与单独ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN水平降低。与单独ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN-阳性细胞的数量和染色强度也降低。
[0177] 治疗后的SMA小鼠中生殖能力的恢复
[0178] 与IV注射小鼠相比，在ICV或ICV/IV注射后的SMNΔ7雌性小鼠中，在恢复的生殖能力方面观察到了显著的益处(图10)。在ICV/IV和ICV治疗组中，100％的雌性小鼠是可繁殖的，相反，IV治疗的小鼠不能自我繁殖。
[0179] 野生型小鼠和AAV10-hSMNopti ICV/IV共注射的hSMN2小鼠的存活和体重表型的比较
[0180] 与未治疗的小鼠相比，AAV10ICV/IV共注射小鼠的体重损失表型和存活得到了相当大的改善，特别是在日龄为209和36天的两只小鼠中(图11)。未治疗的小鼠从来没有度过6天的日龄(存活中值≈3天)。
[0181] 参考文献
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