技术领域
[0001] 本
发明涉及基因突变检测技术领域，具体是一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒。
背景技术
[0002] BRAF基因是人类最重要的原癌基因之一,位于人
染色体7q34,由18个外显子组成,编码蛋白约94kDa。BRAF能够活化丝裂原活化蛋白激酶/细胞外
信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路,该通路将细胞外的各种生长因子、细胞因子及
激素的改变信息传递到细胞核,通过配体与酪
氨酸激酶受体表面相结合形成二聚体和酪氨酸残基自磷
酸化。BRAF突变直接导致丝裂原活化的细胞外信号调节蛋白激酶(MEK)活化并继续活化ERK,致使MAPK通路激活,进而导致细胞周期和循环失控,促进
肿瘤的发生。
[0003] BRAF是黑色素瘤最常见的突变基因,突变发生率为40％-60％,V600E(1799T>A)突变是主要的BRAF突变类型。另一种此
位置的突变类型是V600K(1798G>A),较少发生,但发生V600K突变的黑色素瘤患者较V600E突变的患者更易发生
肺和脑转移,并且生存率更低,提示V600E突变影响蛋白表达。BRAF突变和黑色素瘤的发病部位及病理分型有一定关系,浅表扩散型突变率为63.2％,结节性黑色素瘤为50.4％,恶性雀斑样黑色素瘤和肢端雀斑样黑色素瘤突变率较少,分别为20％和11％。随着FDA批准BRAF突变
抑制剂威罗菲尼应用,对于那些不能
切除的或者转移的黑色素瘤进行靶向
治疗的尝试,已取得了良好的效果。
[0004] 根据组织发生和形态结构甲状腺癌可分为
乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌、转移癌。其中,乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌的类型,约占甲状腺癌的50％。BRAF基因发生在甲状腺癌的突变位点几乎都是V600E突变,突变率为40％～68％。BRAF突变在儿童PTC的发生率明显较低,约31％。研究发现,BRAF基因突变和乳头状癌病理类型明显相关,而在滤泡型癌、髓样癌和良性甲状腺增生中均未见突变。BRAF V600E突变还和肿瘤不良的病理
生物行为有关,Xing等发现V600E突变与肿瘤的复发密切相关并和甲状腺包膜外侵袭、肿瘤多中心型、肿瘤III和IV分期、肿瘤包膜缺如相关。Finkelstein等提出,BRAF突变和PTC的典型肿瘤细胞核特征、浸润性生长、包膜不完整或缺如、淋巴结转移、复发等相关,推测V600E突变后使得BRAF活性增加,促进
细胞增殖从而引发肿瘤,这可能是PTC发生的一个重要分子机制。基于以上研究,BRAF突变已被认为可以作为PTC
预后评估的一个独立指标,更多临床应用研究的展开也为PTC患者的治疗及综合方案的制定提供明确依据。
[0005] 直肠结肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的
恶性肿瘤。研究表明,CRC发生与多种基因突变密切相关,其中包括KRAS、BRAF、MEK、ERK。以上基因均参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等过程的调节。有50％左右的CRC患者表现为BRAF和KRAS基因突变,这些突变病例采用外科治疗存在一定困难,所以倾向于选择基因靶向治疗。BRAF V600E突变更易发生在具有不稳定的微
小卫星肿瘤病例中。存在错配基因参与的林奇(Lynch)综合征的患者并没有发生BRAF突变,所以通过临床BRAF突变的检测可筛选出那些属于真正林奇综合征相关直肠结肠癌患者。还有研究发现,BRAF突变和因癌致死的高
风险联系在一起,约有超过半数的BRAF突变阳性标本呈现不良的癌分化,伴淋巴结转移和神经侵犯。在CRC肝转移的患者中,BRAF突变往往提示不良预后,所以,部分学者考虑将BRAF作为肿瘤分子标志物对CRC预后进行分级评估。
[0006] 由于BRAF基因突变在以上
疾病诊疗中的重要作用，目前对于BRAF基因突变状态的检测已成为辅助肿瘤诊断和治疗的重要手段之一。临床上基因突变检测的金标准是Sanger测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的临床应用，已经得到广大医务人员的认可，但该技术检测灵敏度较不高，且检测周期较长。随着
荧光定量PCR技术的发展，越来越多的相关基因检测产品被推上市场，相比Sanger测序法，荧光PCR技术仅需2小时即可得到检测结果，
分辨率可低至1％，具有明显的优势。鉴于此，特提出本
申请。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针，所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
[0010] 作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中还包括用于对样本
质量进行质控的内参引物和探针，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因。
[0011] 作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于扩增ACTB基因的引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-9所示。
[0012] 作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中包含的引物含量的浓度为：100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
[0013] 作为本发明再进一步的方案：所述核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCR MIX中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶；该MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
[0014] 作为本发明再进一步的方案：所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，其中，阴性对照为工艺用
水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株DNA混合物。
[0015] 作为本发明再进一步的方案：所述突变质粒包含的BRAF基因
片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
[0016] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017] (1)该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，对BRAF基因V600E和V600K突变进行定性检测，从而辅助
结直肠癌、甲状腺癌和黑色素瘤临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度。
[0018] (2)该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用的ARMS-PCR技术，利用TaqMan DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，PCR引物的3’末端的错配会导致产物的急剧减少，通过设计特异性引物，使其扩增受野生型模板阻滞，从而达到检测突变型的目的。使用本发明设计的引物探针通过ARMS荧光定量PCR方法可以对肿瘤组织中低至0.1％丰度的突变进行检测。
附图说明
[0019] 图1为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒的ARMS-PCR方法检测原理图。
[0020] 图2为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒对V600E位点不同突变型和野生型模板检测结果。
[0021] 图3为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒对V600K位点不同突变型和野生型模板检测结果。
具体实施方式
[0022] 下面结合具体实施方式对本
专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0023] 请参阅图1-3，一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液，BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针。所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中的引物探针序列及修饰如下：
[0024] V600E反应液中的上游引物(
序列表中序列1)：5’-GATTTTGGTCTAGCTACAGA-3’[0025] V600E反应液中的下游引物(序列表中序列2)：5’-CACAAAATGGATCCAGAC-3’[0026] V600E反应液中的荧光探针(序列表中序列3)：5’-FAM-GAAATCTCGATGGAGTGGGTCC-TAMRA-3’
[0027] V600K反应液中的上游引物(序列表中序列4)：5’-GATTTTGGTCTAGCTATAAA-3’[0028] V600K反应液中的下游引物(序列表中序列5)：5’-CACAAAATGGATCCAGAC-3’[0029] V600K反应液中的荧光探针(序列表中序列6)：5’-FAM-GAAATCTCGATGGAGTGGGTCC-TAMRA-3’
[0030] 上述两种反应液中除了分别用于检测突变位点的引物和探针以外，还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针。内参基因为基因组保守区选择的一段基因序列，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物探针序列及修饰如下：
[0031] ACTB基因的上游引物(序列表中序列7)：5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’[0032] ACTB基因的下游引物(序列表中序列8)：5’-AGATTTTCTCCATGTCGT-3’[0033] ACTB基因的荧光探针(序列表中序列9)：5’-VIC-TGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG-TAMRA-3’
[0034] 上述反应液中包含的引物含量的浓度为：100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
[0035] 核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCR MIX中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶。该MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
[0036] 本试剂盒所检测样本为结直肠癌、甲状腺癌及黑色素瘤
石蜡包埋组织样本，通过核酸提取试剂纯化组织样本中的DNA，再取总量50ng的DNA进入反应体系进行检测。
[0037] 所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。其中阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株DNA混合物。突变质粒包含的BRAF基因片段序列如下：
[0038] BRAF V600E(序列表中序列10)：
[0039] TATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTA；
[0040] BRAF V600K(序列表中序列11)：
[0041] TATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTA。
[0042] 上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
