脊髓失调症的基因治疗
阅读：380发布：2020-05-12
专利汇可以提供脊髓失调症的基因治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了用于 治疗 影响受试者运动功能和控制的失调或损伤的方法和组合物。一方面，本 发明 提供通过 给药 包括转基因的重组向神经的病毒载体而递送转基因到受试者脊髓的方法。该病毒载体递送转基因到脑深部小脑核区的区域。本发明还提供了通过给药包括转基因的重组向神经的病毒载体到受试者脑的运动神经皮层区而递送转基因到受试者脊髓的组合物和方法。，下面是脊髓失调症的基因治疗专利的具体信息内容。
1.一种方法，包括给药含有转基因的重组向神经的病毒载体到脑的深部小脑 核区的至少一个区域，其中所述的给药在有利于转基因产物传递到脊髓和/或 脑干的情况下进行。
2.一种方法，包括给药含有转基因的重组向神经的病毒载体到脑的运动神经 皮层区域，其中所述的给药在有利于转基因产物传递到脊髓的情况下进行。
3.一种传递转基因到受试者运动神经元的方法，包括给药含有所述的转基因 的重组向神经的病毒载体到脑的深部小脑核区的至少一个区域，其中所述的转 基因在远离所述的给药位点的运动神经元里表达或传递到远离所述的给药位 点的运动神经元。
4.一种传递转基因到受试者运动神经元的方法，包括给药含有所述的转基因 的向神经的病毒载体到脑的运动神经皮层区域，其中所述的转基因在远离所述 的给药位点的运动神经元里表达或传递到远离所述的给药位点的运动神经元。
5.一种治疗受试者运动神经元失调的方法，包含给药含有治疗性转基因的重 组向神经的病毒载体到脑的深部小脑核区的至少一个区域，其中该转基因产物 以治疗有效剂量传递到脊髓的至少一个分区和/或脑干的至少一个分区。
6.一种改善受试者运动神经元失调症状的方法，包括给药含有治疗性转基因 的重组向神经的病毒载体到脑运动神经皮层区，其中该转基因产物以治疗有效 剂量传递到脊髓的至少一个分区。
7.权利要求1到6的任何一项的方法，其中所述的向神经的病毒载体是腺相 关病毒载体(AAV)。
8.权利要求1到6的任何一项的方法，其中所述的向神经的病毒载体是选自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8的腺相关病毒 载体。
9.权利要求1、3或5的任何一项的方法，其中所述的脑深部小脑核区的区 域选自内侧区、中间区或外侧区。
10.权利要求1到6的任何一项的方法，其中所述的传递是双侧的。
11.权利要求5或6的方法，其中所述的脊髓分区选自颈部分区、胸部分区、 腰部分区或骶部分区。
12.权利要求5或6的的方法，其中所述的转基因被传递到脊髓的所有分区。
13.权利要求12的方法，其中所述的多重给药的至少一种是双侧的。
14.权利要求1到6的任何一项的方法，其中所述的转基因选自胰岛素生长 因子-1(IGF-1)、钙结合蛋白D28、拟清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、 SMN-1、SMN-2或CNTF(睫状节神经细胞营养因子)。
15.权利要求6的方法，其中所述的转基因表达减轻了选自肌萎缩侧索硬化 (ALS)、原发性侧索硬化(PLS)、脊髓性延髓肌萎缩、脊髓性小脑性共济失调、 脊髓性肌萎缩或外伤性脊髓损伤的运动神经元失调的症状。
16.权利要求1到6任何一项的方法，其中所述的受试者是人类患者。
17.权利要求1到6任何一项的方法，其中所述的转基因表达治疗量的蛋白 选自胰岛素生长因子1(IGF-1)、EPO(促红细胞生成素)、CBP(cAMP效应 元件结合蛋白[CREB]结合蛋白)、钙结合蛋白D28、拟清蛋白、HIF1-alpha、 SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2或CNTF(睫状节神经细胞营养因子)。
技术领域
[02]本发明涉及治疗影响受试者运动功能，特别是受脑部和/或脊髓疾病或损 伤影响的运动功能失调的组合物和治疗方法。
背景技术
[03]基因治疗是一种新出现的治疗影响中枢神经系统(CNS)的失调症的治疗 模式。CNS基因治疗受到了能有效感染分裂期后神经元的病毒载体发展的促进。 中枢神经系统由脊髓和大脑组成。脊髓传导从周围神经系统到大脑的感觉信息， 并传导从大脑到各种效应器的运动信息。关于用来将基因传递到中枢神经系统的 病毒载体的综述可参见Davidson等人，(2003)Nature Rev.4：353-364的文章。
[04]腺相关病毒(AAV)载体被认为对CNS基因治疗有用，因为其拥有有利 的毒性和免疫原性特性，能转导神经元细胞，并能在CNS中介导长期的表达 (Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154；Bartlett等人，(1998)Hum. Gene Ther.9：1181-1186和Passini等人，(2002)J.Neurosci.22：6437-6446)。
[05]AAV载体的一个有用的特性依赖于某些AAV载体能忍受在神经元细胞内 的逆向和/或顺向运输的能力。在一个大脑区域的神经元通过轴突相互连接并到达 远端的大脑区域，因此为载体的传递提供了运输系统。例如，AAV载体可能在或 靠近神经元轴突末梢的位置给予。神经元纳入AAV载体并将其以逆行方式沿着轴 突到细胞体的方向进行运输。腺病毒、HSV和伪狂犬病病毒也显示出了将基因传 递到大脑内远端结构的相似特性。(Soudas等人，(2001)FASEB J.15： 2283-2285；Breakefield等人，(1991)New Biol.3：203-218和deFalco等人， (2001)Science，291：2608-2613)。
[06]几个小组已经报道，用AAV血清型2(AAV2)进行的大脑转导限定于颅 内注射位点(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154；Passini等人，(2002) J.Neurosci.22：6437-6446和Chamberlin等人，(1998)Brain Res.793： 169-175)。近期的报道显示，向神经的病毒载体的逆向轴突运输也能发生在选定 的正常小鼠大脑的回路里(Kaspar等人，(2002)Mol.Ther.5：50-56(AAV载体)； Kasper等人，(2003)Science 301：839-842(慢病毒载体)和Azzouz等人， (2004)Nature 429：413-417(慢病毒载体)。Roaul等人，(2005)Nat.Med.11(4)： 423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4)：429-433报道，肌肉注射表达 沉默人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)干扰RNA的慢病毒阻碍了与治疗肌萎缩性 脊髓侧索硬化症(amytrophic lateral sclerosis)(ALS)相关的啮齿类动物模型的 ALS的疾病发生。
[07]被AAV载体转导的细胞可能表达治疗性的转基因产物，诸如酶或神经元 营养因子，来介导有益的胞内效应。这些细胞也可能分泌这些治疗性的转基因产 物，这些产物可能随后被远端细胞吸收，在这些远端细胞中其可能介导其的有益 效应。这个过程已经被描述为交叉校正(cross-correction)(Neufeld等人，(1970) Science 169：141-146)。
[08]然而，治疗导致病人运动机能丧失的脊髓异常的组合物和方法的需求仍然 存在。本发明满足了这个需求并提供了相关的优点。
[04]腺相关病毒(AAV)载体被认为对CNS基因治疗有用，因为其拥有有利 的毒性和免疫原性特性，能转导神经元细胞，并能在CNS中介导长期的表达 (Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154；Bartlett等人，(1998)Hum. Gene Ther.9：1181-1186和Passini等人，(2002)J.Neurosci.22：6437-6446)。
[05]AAV载体的一个有用的特性依赖于某些AAV载体能忍受在神经元细胞内 的逆向和/或顺向运输的能力。在一个大脑区域的神经元通过轴突相互连接并到达 远端的大脑区域，因此为载体的传递提供了运输系统。例如，AAV载体可能在或 靠近神经元轴突末梢的位置给予。神经元纳入AAV载体并将其以逆行方式沿着轴 突到细胞体的方向进行运输。腺病毒、HSV和伪狂犬病病毒也显示出了将基因传 递到大脑内远端结构的相似特性。(Soudas等人，(2001)FASEB J.15： 2283-2285；Breakefield等人，(1991)New Biol.3：203-218和deFalco等人， (2001)Science，291：2608-2613)。
[06]几个小组已经报道，用AAV血清型2(AAV2)进行的大脑转导限定于颅 内注射位点(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154；Passini等人，(2002) J.Neurosci.22：6437-6446和Chamberlin等人，(1998)Brain Res.793： 169-175)。近期的报道显示，向神经的病毒载体的逆向轴突运输也能发生在选定 的正常小鼠大脑的回路里(Kaspar等人，(2002)Mol.Ther.5：50-56(AAV载体)； Kasper等人，(2003)Science 301：839-842(慢病毒载体)和Azzouz等人， (2004)Nature 429：413-417(慢病毒载体)。Roaul等人，(2005)Nat.Med.11(4)： 423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4)：429-433报道，肌肉注射表达 沉默人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)干扰RNA的慢病毒阻碍了与治疗肌萎缩性 脊髓侧索硬化症(amytrophic lateral sclerosis)(ALS)相关的啮齿类动物模型的 ALS的疾病发生。
[07]被AAV载体转导的细胞可能表达治疗性的转基因产物，诸如酶或神经元 营养因子，来介导有益的胞内效应。这些细胞也可能分泌这些治疗性的转基因产 物，这些产物可能随后被远端细胞吸收，在这些远端细胞中其可能介导其的有益 效应。这个过程已经被描述为交叉校正(cross-correction)(Neufeld等人，(1970) Science 169：141-146)。
[08]然而，治疗导致病人运动机能丧失的脊髓异常的组合物和方法的需求仍然 存在。本发明满足了这个需求并提供了相关的优点。
发明内容
[09]本发明提供了传递转基因到受试者脊髓和/或脑干区域的方法和组合物， 通过给药到受试者脑的深部小脑核(DCN)区域的至少一个区域的含有转基因的 重组向神经的病毒载体可以实现该传递。病毒传递在有利于转基因在脊髓和/或脑 干区域表达的情况下进行。
[010]另一方面，本发明提供了传递转基因到受试者脊髓的方法和组合物，通 过给药受试者脑运动神经皮层区域的含有转基因的重组向神经的病毒载体可以实 现该传递。病毒载体的传递在有利于转基因在脊髓中表达的情况下进行。给药到 运动神经皮层区域的病毒载体被运动神经元通过其细胞体区域纳入，然后转基因 得到表达。表达的转基因可能然后经历顺向转运到运动神经元的轴突终末部分， 这个终末部分存在于脊髓中。由于运动神经皮层的性质，给药到大脑这个区域的 病毒载体也可能被运动神经元的轴突末端纳入。病毒载体也可能经历沿着运动神 经元的轴突的逆向转运并在运动神经元的细胞体中表达。
[011]进一步提供的是传递转基因到受试者运动神经元的方法和组合物，通过 给药受试者脑的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经的病 毒载体可以实现该传递。载体的传递在有利于转基因在位于给药位点远端的运动 神经元里表达的情况下进行。
[012]也提供的是传递转基因到受试者运动神经元的方法和组合物，通过给药 受试者脑运动神经皮层区域的含有转基因的向神经的病毒载体可以实现该传递， 并且，在这里，给药在有利于转基因在位于给药位点远端的运动神经元里表达的 情况下进行。
[013]另一方面，本发明提供了治疗受试者运动神经元失调症的方法和组合物， 通过给药受试者脑的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经 的病毒载体可实现该治疗。给药在有利于治疗有效剂量的转基因在脊髓和/或脑干 区域的至少一个分区里表达的情况下进行。
[014]在更进一步的方面，本发明提供了改善受试者运动神经元失调症症状的 组合物和方法，通过给药受试者脑运动神经皮层区域的含有治疗性转基因的重组 向神经的病毒载体可实现该改善作用，并且，给药在有利于治疗有效剂量的转基 因在脊髓和/或脑干区域的至少一个分区里表达的情况下进行。
[015]应当理解，上述的总体描述和随后的详细描述都仅是范例性和解释性的， 都不对本发明具有限制性。
附图说明
[016]图1：图解DCN如何能被用于运输治疗性病毒到脊髓。起源于描画出 DCN轮廓的黑框内的线条代表了起源于细胞体(箭头)的轴突末端，这些细胞体 位于脊髓内。
[017]图2：再现了通过脑桥延髓接合处和小脑的组织横切面，显示了DCN的 三个区域。
[018]图3：沿着小脑蚓的界线(矢形切面)截断然后展平的小脑的示意视图， 及通过脊髓的水平切面和骨骼肌肉系统的图。其表明了主要的传入(输入)途径。
[019]图4：显示DCN的主要的传出路径(输出路径)的图。
[020]图5：大脑皮层中连接输入到输出的神经回路的示意图。爬行纤维在下 橄榄体中起始，这些纤维本身即可接受从大脑皮层、脊髓和特异感觉(视觉和听 觉)而来的输入(信号)。苔状纤维输入从所有其他传入起始，例如前庭传入、脊 柱传入、肌梭、神经腱索、关节感受器、皮肤感受器和大脑皮层。在内在系统中 也有三种抑制器中间神经元，包括篮状细胞、戈尔吉细胞和星状细胞。这些都涉 及到运动神经元功能的侧抑制和微调。
[021]图2到图5都是从Williams等人，(2005)The Human Brain：Chaper 3： The Cerebellum 中复制而来，从网址：www.vh.org/adult/provider/ anatomy/BrainAnatomy/Ch3Text/Section07.html可以得到这些内容。
[022]图6A到图6E：显示了在将编码人ASM的不同AAV血清型载体[(A) 2/1，(B)2/2，(C)2/5，(D)2/7和(E)2/8]注射到ASMKO小鼠的深部小脑核 后，矢形小脑部分中人酸性神经磷脂(“hASM”)免疫阳性染色。
[023]图7A到7E：显示了从深部小脑核到脊髓的人酸性神经磷脂(“hASM”) 蛋白转运。这个结果从用AAV2/2-ASM、AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM& AAV2/8-ASM(A)hASM，10倍放大；(B)hASM，40倍放大；(C)激光共聚焦 hASM；(D)激光共聚焦ChAT；和(E)激光共聚焦hASM&ChAT处理的小鼠中 观察到。
[024]图8：图示了注射编码人ASM的不同AAV血清型载体(2/1、2/2、2/5、 2/7和2/8)到深部小脑核后(n＝5/组)小脑组织匀浆水平。未用相同字母连接的 组是显著不同的(p＜.0001)。
[025]图9A到9G：显示了在注射编码人ASM的不同AAV血清型载体[(A)2/1、 (B)2/2、(C)2/5、(D)2/7和(E)2/8]到ASMKO小鼠的深部小脑核后矢形小脑部分 的钙结合蛋白免疫阳性染色。
[026]图10A到10B：显示了用ASMKO(用AAV-βgal注射)、WT和AAV-ASM 处理的ASMKO小鼠(n＝8/组)的加速和摇摆旋转表现(14周龄)。未用相同字 母连接的组是显著不同的。在加速旋转试验中，用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM 注射的小鼠显示出了比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小鼠显著(p＜.0009)更 长的延迟跌倒时间。对于摇摆旋转试验，用AAV2/1-ASM注射的小鼠显示出了比 用AAV2/1-βgal注射的小鼠显著(p＜.0001)更长的延迟跌倒时间。
[027]图11A和图11B：显示了ASMKO(n＝8)、WT(n＝8)和双向AAV-ASM (n＝5/组)处理的小鼠(20周龄)的旋转表现。对于加速和摇摆试验，AAV-ASM处 理的小鼠比ASMKO AAV2/1-βgal处理的小鼠的表现显著地更好(p＜.001)。在 加速和摇摆试验中，用AAV2/1-ASM注射的小鼠的表现不能同野生型小鼠区别开 来。
[028]图12A：图解了深部小脑核区域(内侧、中间和外侧)和脊髓区域(颈 部、胸部、腰部和骶部)之间的连接。图12B：图解了深部小脑核区域(内侧、 中间和外侧)和脑干区域(中脑、脑桥和髓质)之间的连接。这些连接用箭头表 示，这些箭头起始于神经元的细胞体区域并终结于神经元的轴突终末区域。例如， DCN的三个区域每一个均有带有细胞体的神经元，这些神经元传出轴突并终结于 脊髓的颈部区域，同时，脊髓的颈部区域拥有传出轴突并终结于DCN的内侧或中 间区域的的细胞体。
[029]图13：图解了编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV的DCN传递后，绿色 荧光蛋白在脑干或上部运动神经元中的分布。
[030]图14：图解了编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV的DCN传递后，绿色 荧光蛋白在脊髓区域的分布。
[031]图15：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，编码IGF-1 的AAV的DCN传递后，脑干中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减少。
[032]图16：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，口部神经核中(三叉神经核、舌下神经核和面神经 核)胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减少。
[033]图17：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，整个脊髓中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减 少。
[034]图18：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，中枢神经系统(CNS)中IFG-1mRNA的分布。 Beta-肌动蛋白用作阳性对照，来比较总mRNA的水平。
[035]图19：图解了AAV-IGF-1的DCN传递促进了运动神经元的存活。用编 码IGF-1的AAV处理的小鼠与用编码GFP的AAV的DCN传递处理的小鼠比较， 其间的不同是统计学上显著的(p值等于0.01)，正如用星号表示的。
[036]图20：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，用编码 IGF-1的AAV的DCN传递处理的小鼠在旋转表现、后肢握力和前肢握力上的提升。
[037]图21：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，用编码 IGF-1的AAV的DCN传递介导的存活率的增加。
[038]图22：显示了表达GFP的AAV1载体双向传递到深部小脑核(DCN)后， GFP在小鼠大脑的分布。除了DCN外，GFP阳性染色也在嗅球、大脑皮层、丘 脑、脑干、小脑皮质和脊髓中观察到。所有的这些区域均接受从DCN而来的投射 (projections)和/或发出到DCN的投射。
[010]另一方面，本发明提供了传递转基因到受试者脊髓的方法和组合物，通 过给药受试者脑运动神经皮层区域的含有转基因的重组向神经的病毒载体可以实 现该传递。病毒载体的传递在有利于转基因在脊髓中表达的情况下进行。给药到 运动神经皮层区域的病毒载体被运动神经元通过其细胞体区域纳入，然后转基因 得到表达。表达的转基因可能然后经历顺向转运到运动神经元的轴突终末部分， 这个终末部分存在于脊髓中。由于运动神经皮层的性质，给药到大脑这个区域的 病毒载体也可能被运动神经元的轴突末端纳入。病毒载体也可能经历沿着运动神 经元的轴突的逆向转运并在运动神经元的细胞体中表达。
[011]进一步提供的是传递转基因到受试者运动神经元的方法和组合物，通过 给药受试者脑的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经的病 毒载体可以实现该传递。载体的传递在有利于转基因在位于给药位点远端的运动 神经元里表达的情况下进行。
[012]也提供的是传递转基因到受试者运动神经元的方法和组合物，通过给药 受试者脑运动神经皮层区域的含有转基因的向神经的病毒载体可以实现该传递， 并且，在这里，给药在有利于转基因在位于给药位点远端的运动神经元里表达的 情况下进行。
[013]另一方面，本发明提供了治疗受试者运动神经元失调症的方法和组合物， 通过给药受试者脑的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经 的病毒载体可实现该治疗。给药在有利于治疗有效剂量的转基因在脊髓和/或脑干 区域的至少一个分区里表达的情况下进行。
[014]在更进一步的方面，本发明提供了改善受试者运动神经元失调症症状的 组合物和方法，通过给药受试者脑运动神经皮层区域的含有治疗性转基因的重组 向神经的病毒载体可实现该改善作用，并且，给药在有利于治疗有效剂量的转基 因在脊髓和/或脑干区域的至少一个分区里表达的情况下进行。
[015]应当理解，上述的总体描述和随后的详细描述都仅是范例性和解释性的， 都不对本发明具有限制性。
附图说明
[016]图1：图解DCN如何能被用于运输治疗性病毒到脊髓。起源于描画出 DCN轮廓的黑框内的线条代表了起源于细胞体(箭头)的轴突末端，这些细胞体 位于脊髓内。
[017]图2：再现了通过脑桥延髓接合处和小脑的组织横切面，显示了DCN的 三个区域。
[018]图3：沿着小脑蚓的界线(矢形切面)截断然后展平的小脑的示意视图， 及通过脊髓的水平切面和骨骼肌肉系统的图。其表明了主要的传入(输入)途径。
[019]图4：显示DCN的主要的传出路径(输出路径)的图。
[020]图5：大脑皮层中连接输入到输出的神经回路的示意图。爬行纤维在下 橄榄体中起始，这些纤维本身即可接受从大脑皮层、脊髓和特异感觉(视觉和听 觉)而来的输入(信号)。苔状纤维输入从所有其他传入起始，例如前庭传入、脊 柱传入、肌梭、神经腱索、关节感受器、皮肤感受器和大脑皮层。在内在系统中 也有三种抑制器中间神经元，包括篮状细胞、戈尔吉细胞和星状细胞。这些都涉 及到运动神经元功能的侧抑制和微调。
[021]图2到图5都是从Williams等人，(2005)The Human Brain：Chaper 3： The Cerebellum 中复制而来，从网址：www.vh.org/adult/provider/ anatomy/BrainAnatomy/Ch3Text/Section07.html可以得到这些内容。
[022]图6A到图6E：显示了在将编码人ASM的不同AAV血清型载体[(A) 2/1，(B)2/2，(C)2/5，(D)2/7和(E)2/8]注射到ASMKO小鼠的深部小脑核 后，矢形小脑部分中人酸性神经磷脂(“hASM”)免疫阳性染色。
[023]图7A到7E：显示了从深部小脑核到脊髓的人酸性神经磷脂(“hASM”) 蛋白转运。这个结果从用AAV2/2-ASM、AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM& AAV2/8-ASM(A)hASM，10倍放大；(B)hASM，40倍放大；(C)激光共聚焦 hASM；(D)激光共聚焦ChAT；和(E)激光共聚焦hASM&ChAT处理的小鼠中 观察到。
[024]图8：图示了注射编码人ASM的不同AAV血清型载体(2/1、2/2、2/5、 2/7和2/8)到深部小脑核后(n＝5/组)小脑组织匀浆水平。未用相同字母连接的 组是显著不同的(p＜.0001)。
[025]图9A到9G：显示了在注射编码人ASM的不同AAV血清型载体[(A)2/1、 (B)2/2、(C)2/5、(D)2/7和(E)2/8]到ASMKO小鼠的深部小脑核后矢形小脑部分 的钙结合蛋白免疫阳性染色。
[026]图10A到10B：显示了用ASMKO(用AAV-βgal注射)、WT和AAV-ASM 处理的ASMKO小鼠(n＝8/组)的加速和摇摆旋转表现(14周龄)。未用相同字 母连接的组是显著不同的。在加速旋转试验中，用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM 注射的小鼠显示出了比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小鼠显著(p＜.0009)更 长的延迟跌倒时间。对于摇摆旋转试验，用AAV2/1-ASM注射的小鼠显示出了比 用AAV2/1-βgal注射的小鼠显著(p＜.0001)更长的延迟跌倒时间。
[027]图11A和图11B：显示了ASMKO(n＝8)、WT(n＝8)和双向AAV-ASM (n＝5/组)处理的小鼠(20周龄)的旋转表现。对于加速和摇摆试验，AAV-ASM处 理的小鼠比ASMKO AAV2/1-βgal处理的小鼠的表现显著地更好(p＜.001)。在 加速和摇摆试验中，用AAV2/1-ASM注射的小鼠的表现不能同野生型小鼠区别开 来。
[028]图12A：图解了深部小脑核区域(内侧、中间和外侧)和脊髓区域(颈 部、胸部、腰部和骶部)之间的连接。图12B：图解了深部小脑核区域(内侧、 中间和外侧)和脑干区域(中脑、脑桥和髓质)之间的连接。这些连接用箭头表 示，这些箭头起始于神经元的细胞体区域并终结于神经元的轴突终末区域。例如， DCN的三个区域每一个均有带有细胞体的神经元，这些神经元传出轴突并终结于 脊髓的颈部区域，同时，脊髓的颈部区域拥有传出轴突并终结于DCN的内侧或中 间区域的的细胞体。
[029]图13：图解了编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV的DCN传递后，绿色 荧光蛋白在脑干或上部运动神经元中的分布。
[030]图14：图解了编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV的DCN传递后，绿色 荧光蛋白在脊髓区域的分布。
[031]图15：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，编码IGF-1 的AAV的DCN传递后，脑干中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减少。
[032]图16：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，口部神经核中(三叉神经核、舌下神经核和面神经 核)胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减少。
[033]图17：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，整个脊髓中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色的减 少。
[034]图18：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果作比较，编码 IGF-1的AAV的DCN传递后，中枢神经系统(CNS)中IFG-1mRNA的分布。 Beta-肌动蛋白用作阳性对照，来比较总mRNA的水平。
[035]图19：图解了AAV-IGF-1的DCN传递促进了运动神经元的存活。用编 码IGF-1的AAV处理的小鼠与用编码GFP的AAV的DCN传递处理的小鼠比较， 其间的不同是统计学上显著的(p值等于0.01)，正如用星号表示的。
[036]图20：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，用编码 IGF-1的AAV的DCN传递处理的小鼠在旋转表现、后肢握力和前肢握力上的提升。
[037]图21：图解了与编码GFP的AAV的DCN传递后的结果比较，用编码 IGF-1的AAV的DCN传递介导的存活率的增加。
[038]图22：显示了表达GFP的AAV1载体双向传递到深部小脑核(DCN)后， GFP在小鼠大脑的分布。除了DCN外，GFP阳性染色也在嗅球、大脑皮层、丘 脑、脑干、小脑皮质和脊髓中观察到。所有的这些区域均接受从DCN而来的投射 (projections)和/或发出到DCN的投射。
具体实施方式
[039]为了使本发明更易理解，首先定义某些术语。其他的定义在整个详述中 进行定义。
[040]除非另有说明，本发明的实施将使用传统的免疫学、分子生物学、微生 物学、细胞生物学和重组DNA的技术，这些均属于本领域的技能。参见例如， Sambrook，Fritsch和Maniatis，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编，(1987))；METHODS IN ENZYMOLOGY系 列(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(MJ. MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编，(1995))，Harlow和Lane编， (1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney编，(1987))。
[041]正如在说明书和权利要求中所用的，单数形式“a”“an”和“the”包括 复数关系，除非上下文清晰地表明。例如，术语“一个细胞”包括很多个细胞， 包括其的混合物。
[042]本文所用的术语“包括”是指，组合物和方法包括已述的要素，但不排 除其他的要素。当用来定义组合物和方法时“基本上由…组成”将意味着排除任 何其他的对组合而言是基本显著的成分的含义。这样，基本上由在本文中定义的 元素组成的组合物将不会排除从分离和纯化方法中而来的痕量污染物和药学上可 接受的载体，例如磷酸盐缓冲生理盐水、防腐剂，等等。“由…组成”将意味着排 除其他成分和用于给药本发明的组合物的基本方法步骤的超过痕量的成分。被这 些过渡术语的每一个术语所定义的实施方案都在本发明的范围之内。
[043]所有以数字表示的指定(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度和 分子量，均是以(+)或(-)0.1增量变动的近似值。应当理解，尽管不总是明 确的声明在所有以数字表示的指定前均加以术语“大约”。也应当理解，尽管不总 是明确的声明在本文中描述的试剂仅是示例性的，以及这些试剂的等价物在本领 域中是所共知的。
[044]术语“转基因”是指多核苷酸，其被引入细胞并能被转录成RNA并 能被可选地在适当的情况下翻译和/或进行表达。在一个方面，其能给与其被引 入的细胞所希望的特性，或导致所希望的治疗或诊断结果。在另一方面，其可能 被转录成介导RNA干扰的分子，例如siRNA。
[045]参照病毒滴度所用的术语“基因组颗粒(gp)”或“基因组同等物” 是指含有重组AAV DNA基因组的病毒粒子的数目，而不管其感染性或功能性。在 特定的载体制备物中的基因组颗粒的数目可以通过诸如在本文的实施例中所描述 的或例如，在Clark等人，(1999)Hum.Gene Ther，10：1031-1039；Veldwijk 等人，(2002)Mol.Ther.，6：272-278文献中的方法所测量。
[046]参照病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制 单位”是指感染性的和能复制的重组AAV载体颗粒的数目，其可以通过例如在 McLaughlin等人，(1988)J.Virol.，62：1963-1973的文章中描述的感染性中心 试验也称为复制中心试验进行测量。
[047]参照病毒滴度使用的术语“转导单元(tu)”是指导致功能性转基因 产物生产的感染性重组AAV载体颗粒的数目，其可通过诸如在本文实施例中或例 如在Xiao等人，(1997)Exp.Neurobiol.，144：113-124；或在Fisher等人， (1996)J.Virol.，70：520-532(LFU实验)文章中描述的功能性实验所测量。
[048]术语“治疗的”、“治疗有效量”和其的相关词指RNA、DNA或DNA 和/或RNA的表达产物的量，在受试者中产生保护或发病延迟或症状改善或预期 的生物学结果的获得，诸如神经病理学校正，例如伴随诸如ALS的运动神经元疾 病的细胞病理学。术语“治疗校正”指在受试者中产生保护或发病延迟或症状改 善的校正程度。有效量能通过已知的经验方法进行测量。
[049]“组合物”也意指包含有效试剂和其他载体的组合，例如，化合物或 组合物，无活性的(例如，可检测的试剂或标记)或有活性的，例如佐剂、稀释 剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂或等等。载体也包 括药用辅料和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括 单糖，二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等等和 多糖或糖聚合物)，其能单独或以组合形式存在，由单独或以组合形式的1-99.99％ 的重量比或体积比组成。示例性的蛋白质辅料包括血清白蛋白，例如人血清白蛋 白(HAS)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。代表性的氨基酸/抗体组 分，其在缓冲液(buffering capacity)中也能起作用，包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、 甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬甜二肽等等。碳水化合物辅料也包括在本发明的 范围内，其范例包括但不限定于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D- 甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维双糖等等；多糖， 例如棉子糖、松三糖、糊精-麦芽糖合剂、葡聚糖、淀粉等等和醛糖醇，例如甘露 醇、木糖醇、麦芽糖醇(maltitol)、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)和肌醇。
[050]术语载体此外还包括缓冲液或pH调整剂；典型地，缓冲液是从有机酸 或碱制备而来的盐。代表性的缓冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡 萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸，或邻苯二甲酸；Tris，盐酸氨基丁三醇， 或磷酸缓冲液。另外的载体包括多聚物辅料/添加剂，例如聚乙烯吡咯酮、聚蔗糖 (一种多聚的糖)、葡聚糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-.正交.-环糊精)、 聚乙烯乙二醇、调味剂、抗菌剂、增甜剂、抗氧化剂、拮抗剂、表面活化剂(例 如聚山梨酯，例如“吐温20”和“吐温80”)、脂质(例如磷脂，脂肪酸)、类固 醇(例如，胆固醇)和鳌合剂(例如，EDTA)。
[051]如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药用载体， 例如磷酸盐缓冲溶液、水和乳状液，例如油/水或水/油乳状液和各种类型的润湿剂。 组合物也能包括稳定剂和防腐剂和满足可用于体内的任何上面所提及的载体。载 体、稳定剂和佐剂的范例可参见Martin REMINGTON′S PHARM.SCI.，15th Ed. (Mack Publ.Co.，Easton，(1975)和Williams&Williams，(1995)， “PHYSICIAN′S DESK REFERENCE”，52nd ed.，Medical Economics， Montvale，NJ.(1998)。
[052]“受试者”、“个体”或“病人”在此处可替换使用，其指脊椎动物，优 选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猿猴、人、 农场动物、运动动物和宠物。
[053]“对照”是实验中用于对照目的的选择性受试者或样品。对照可以是“阳 性”或“阴性”的。例如，在实验目的是测定基因改变的表达水平同特定类型的 病理间的相互关系时(参见ALS，例如，下文)，通常更优选使用阳性对照(带有 这样的改变和表现出那种疾病症状特征的受试者或从受试者而来的样品)，和阴性 对照(缺乏改变的表达和那种疾病临床特征的受试者或从受试者而来的样品)。
[054]当用于基因时，术语“差异性表达的”指从基因转录的mRNA或该基因 编码的蛋白质产物的差异性生产。同正常或对照细胞的表达水平相比较，差异性 表达的基因可能是过表达或欠表达。一方面，它指比在对照样品中检测到的表达 水平高或低至少1.5倍，或至少2.5倍，或可选择的至少5倍，或可选择的至少 10倍的差异。术语“差异性表达的”也指细胞或组织中的核苷酸序列，这些序列 在对照细胞中沉默时表达或在对照细胞中表达时不表达。
[055]本文中所使用的，术语“调整”指改变效应或结果的数量或强度，例如 增强、扩大、减小或减少。
[056]本文中所使用的术语“改善”同“减轻”是同义的，指减少或减轻。例 如，一个人可能通过使疾病或失调变得更可忍受而改善疾病或失调的症状。
[057]在基因传递是被DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV) 介导的方面，载体构建物指含有一个病毒基因组或其的部分和转基因的多核苷酸。 腺病毒(Ads)是一类被相对好地表征的同族病毒，包括超过50个血清型。参见， 例如国际PCT申请No.WO 95/27071。Ads易于生长，并且不需要整合到宿主细 胞的基因组中。重组Ad衍生的载体，特别那些降低了重组和产生野生型病毒可能 的载体，也已经被构建出。参见，国际PCT申请号WO 95/00655和WO 95/11984。 野生型AAV具有很高的侵染性和特异地整合到宿主细胞基因组中。参见， Hermonat和Muzyczka，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和 Lebkowski等人，(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988-3996。
[058]本发明提供了传递转基因到受试者的脊髓和/或脑干的方法，通过给药脑 的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经的病毒载体可以实 现该传递，在其中，传递在有利于转基因在远离给药位点的位点表达的情况下进 行。传递也可能导致转基因在给药位点的表达。
[059]除非特别声明的相反情况，转基因的表达不仅限定于翻译成多肽或蛋白 质也包括转基因多核苷酸的复制和/或转录。
[060]另一方面，本发明提供了传递治疗性转基因产物到CNS目标细胞的方 法，这些目标细胞是经受例如ALS或创伤性脊髓伤害等运动神经元失调症的哺乳 动物的神经元或神经胶质细胞。转基因可以编码IGF-1。
[061]另一方面，本发明提供了传递转基因到受试者脊髓的方法，通过给药含 有所述转基因的重组向神经的病毒载体到脑的运动神经皮层区域可以实现该传 递，此处所述的传递在有利于所述的转基因在远离所述的给药位点的位点表达的 情况下进行。
[062]在另一方面，本发明的病毒载体被给药到大脑深部小脑核的至少一个区 域，在这个区域，转基因产物被表达并传递到受试者的脊髓和/或脑干区域。
[063]在另一个实施例中，病毒载体被给药到互连脑干和脊髓运动神经元的大 脑深部小脑核的至少一个区域。这些目标区域具有同组成运动神经元的细胞环境 的细胞(例如中间神经元和星形胶质细胞)的直接联系。给药传递转基因产物到 运动神经元的细胞环境，在那里该产物介导组成该细胞环境的细胞有益的效应。
[064]在一个实施方案中，本发明提供了传递转基因到受试者运动神经元或调 整转基因在受试者运动神经元中表达的方法，通过给药到受试者大脑运动神经皮 层区域的含有转基因的向神经的病毒载体可实现该传递，其中转基因在远离所述 的给药位点的运动神经元区域表达。
[065]在另一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者运动神经元失调症的方 法，通过给药到受试者大脑深部小脑核的至少一个区域的含有治疗性转基因的向 神经的病毒载体可实现该治疗，在其中转基因在受试者脊髓的至少一个分区以有 效剂量进行表达。这些分区包括颈部、胸部、腰部或骶部的一个或多个(参见图1， 图12A)。转基因也可能在脑干，诸如，例如，中脑、脑桥或髓质(参见图12B) 的至少一个区域以治疗有效剂量表达。其也可能在受试者脑干的至少一个区域和 受试者脊髓的至少一个分区以治疗有效剂量表达。
[066]本发明也提供了改善受试者运动神经元失调症症状的方法，通过给药到 大脑运动神经皮层的含有治疗性转基因的向神经的病毒载体可实现该改善，在其 中所述的转基因在受试者脊髓的至少一个分区以治疗有效剂量表达。这些分区包 括颈部、胸部、腰部或骶部的一个或多个(参见图1，图12A)。
[067]本发明的实施的合适向神经的病毒载体包括，但不限于腺相关病毒载体 (AAV)，单纯疱疹病毒载体(美国专利No.5,672,344)和慢病毒载体。
[068]在本发明的方法中，任何血清型的AAV均能使用。在某些实施方案中， 任何血清型的AAV均能使用，只要这些载体能忍受在缺乏疾病抵抗力的大脑中的 逆行轴突运输，或在有抵抗力的大脑中的轴突运输。在本发明某些实施方案中使 用的病毒载体的血清型选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7 和AAV8(参见，Gao等人，(2002)PNAS，99：11854-11859和Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者Machida，Humana Press，2003)。 除了此处所列的那些病毒载体外的其他血清型也能使用。此外，假模标本AAV载 体也可能用于此处所描述的方法。假模标本AAV载体是在第二个AAV血清型的壳 体内含有一个AAV血清型的基因组；例如，含有AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV 载体或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等人，(2001)Hum. Mol.Genet，10(26)：3075-81)。
[069]AAV载体起源于对哺乳动物不致病的单链(SS)DNA细小病毒组(在 Muzyscka，(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.，158：97-129中进行了综述)。 简单而言，基于AAV的载体的占(account for)去除的病毒基因组的96％功能的 rep和cap基因，留下两段145碱基对(bp)的反向远端重复(ITRs)，其用于启动 病毒DNA复制、包装和整合。在缺少辅助病毒时，野生型AAV整合到人宿主细 胞基因组，其具有在染色体19q 13.3的优先位点特异性，或其可能保留游离表达。 单个的AAV颗粒能容纳长达5kb的ssDNA，因此为转基因和调控元件留下了大约 4.5kb的空间，这是典型足够的。然而，如例如在美国专利No.6,544,785里描述 的分子间拼接系统可能将近是这个限制的两倍。
[070]在一个做例证的实施方案中，AAV是AAV2或AAV1。许多血清型的腺 相关病毒，特别是AAV2已经被广泛的研究并被表征成基因治疗载体。本领域技 术人员熟悉基于AAV的功能性基因治疗载体的制备。关于用于给药人类受试者的 AAV生产、纯化和制备的无数方法的无数文献能在巨大数量的出版文献中找到(参 见，例如，Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者Machida， Humana Press，2003)。另外，针对CNS的细胞的基于AAV的基因治疗已经在 美国专利号Nos.6,180,613和6,503,888中进行了描述。另外的示例性AAV载 体是编码人类蛋白的重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型 载体。
[071]在本发明的某些方法中，载体包括可连接到启动子的转基因。这个转基 因编码具有生物活性的分子，其在CNS的表达导致神经病理学的至少部分的校正。 人ASM的基因组的和功能性的cDNA序列已经发表(参见，例如，美国专利号 No.5,773,278和6,541,218)。胰岛素生长因子-1(IGF-1)基因具有复杂的结 构，这是本领域所熟知的。其至少含有两个从基因转录本而来的选择性拼接的 mRNA产物。一个是153个氨基酸的肽，通过包括IGF-1A或IGF-1Ea在内的多 个名字被知晓，一个是195个氨基酸的肽，通过包括IGF-1B或IGF-1Fb在内的 多个名字被知晓。IGF-1的成熟形式是70个氨基酸的多肽。IGF-1Ea和IGF-1Eb 都含有这个70个氨基酸的成熟肽，但在其的羧末端延长的序列和长度上有所区别。 IGF-1Ea和IGF-1Eb的肽序列分别被SEQ ID NOS：1和2所表示。人IGF-1的基 因组的和功能性的cDNAs，以及其他的关于IGF-1基因和其的产物的信息，可在 Unigene登入号No.NM 00618得到。
[072]在真核细胞中转基因表达的水平主要由在转基因表达框内的转录启动子 决定。显示出长期的活性并是组织-和甚至细胞-特异的启动子在某些实施方案中进 行了使用。非限制性的启动子例子包括，但不限于，细胞巨化病毒(CMV)启动 子(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154)，CMV/人β3-珠蛋白启动子 (Mandel等人，(1998)J.Neurosci.18：4271-4284)，GFAP启动子(Xu等人， (2001)Gene Ther.8：1323-1332)，1.8kb特异性神经元烯醇酶(NSE)启动 子(Klein等人，(1998)Exp.Neurol.150：183-194)，鸡beta-肌动蛋白(CBA) 启动子(Miyazaki，(1989)Gene 79：269-277)，β-葡糖苷酸酶(GUSB)启动 子(Shipley等人，(1991)Genetics 10：1009-1018)和例如那些从人泛素A、 人泛素B和人泛素C分离而来的泛素启动子，在美国专利No.6,667,174中对此 有描述。为了延长表达，其他的调控元件可能被额外的连接到转基因上，诸如， 例如，土拨鼠肝炎病毒后调控元件(WPRE)(Donello等人，(1998)J.Virol.72： 5085-5092)或牛生长激素(BGH)多核苷酸化位点。
[073]对于某些CNS基因治疗应用，控制转录活性可能是必须的。为了这个目 标，用病毒载体进行基因表达的药理学调控能通过包括各种调控元件和药物敏感 启动子，例如，在Haberma等人，(1998)Gene Ther.5：1604-16011和Ye等 人，(1995)Science 283：88-91所描述的而获得。
[074]在本发明的方法中，病毒载体可通过用含有携带转基因的病毒载体的组 合物接触神经元的终端轴突终末而给药，允许病毒颗粒被内吞并沿着轴突到神经 元胞体的方向在胞内运输(逆行的)；允许治疗性转基因产物被表达，在其中治疗 性转基因产物藉此减轻受试者的病理。效应可能在运动神经元上，在组成运动神 经元环境的细胞(例如中间神经元和星状胶质细胞)上，或在二者之上。在某些 实施方案中，组合物中载体的浓度至少是：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、 15、20、25或50(×1012gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、 25或50(×109tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或 50(×1010iu/ml)。
[075]在本发明另外的方法中，病毒载体能通过用含有携带转基因的病毒载体 的组合物接触神经元的胞体而给药，允许病毒颗粒被内吞，允许治疗性转基因产 物被表达并沿着轴突到神经元轴突终末的方向在胞内顺行运输，在其中治疗性转 基因产物藉此减轻受试者的病理。效应可能在运动神经元上，在组成运动神经元 环境的细胞(例如中间神经元和星状胶质细胞)上或在二者之上。在某些实施方 案中，组合物中载体的浓度至少是：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、 25或50(×1012gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50 (×109tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×1010iu/ml)。
[076]在一个方面，转基因编码生物活性分子，该分子在CNS的表达产生至少 部分的神经病理学校正。在某些实施方案中，治疗性转基因产物是抑制受试者SOD 表达的RNA分子，藉此减轻和预防ALS的症状。参见Roaul等人，(2005)Nat. Med.11(4)：423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4)：429-433。
[077]在实施这些方法时的一个方面，转基因表达选自胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、钙结合蛋白D28、拟清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、EPO (促红细胞生成素)、CBP(cAMP效应元件结合蛋白[CREB]结合蛋白)、SMN-1、 SMN-2和CNTF(睫状节神经细胞营养因子)的治疗剂量的蛋白。
[078]作为选择地，转基因抑制蛋白的突变形式的表达，例如导致ALS的突变 SOD的表达。参见上面的Roaul等人，(2005)和上面的Ralph等人，(2005)。
[079]要鉴别人类大脑的结构，参见，例如，The Human Brain：Surface， Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI，and Blood Supply，2nd ed.， 编者Deuteron等人，Springer Vela，1999；Atlas of the Human Brain，编者Mai 等人，Academic Press，1997和Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain： 3-Dimensional Proportional System：An Approach to Cerebral Imaging，编者 Tamarack等人，Thyme Medical Pub.，1988。要鉴别小鼠大脑的结构，参见，例 如，The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates，2nd ed.，Academic Press，2000。 图1概略地显示了脊髓和其的四个分区：颈部、胸部、腰部和骶部。
[080]本发明提供了调整、校正或增进经受运动神经元损伤折磨的受试者的运 动功能。仅为了说明的目的，受试者可能遭受肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊柱延髓 肌萎缩、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化(PLS)或外伤性 脊髓损伤中的一种或多种。
[081]未局限于理论，伴随运动神经元损伤的病理可能包括运动神经元退化、 神经胶质病、神经微丝异常、皮质脊髓束和前根中有髓鞘神经纤维的丧失。例如， 两种类型的发病已经被认识：影响上运动神经元(皮质和脑干运动神经元)的延 髓发病影响面部肌肉、语言和吞咽；影响下位运动神经元(脊髓运动神经元)的 四肢发病被痉挛、全身虚弱、肌萎缩、瘫痪和呼吸衰竭所反射。在ALS中，受试 者同时具有延髓和四肢发病。在PLS中，受试者具有延髓发病。
[082]未局限于理论，本发明的一个实施方案具有提供治疗性分子(例如，蛋 白质或肽)到脊髓每个分区的能力。这可能通过注射AAV载体到DCN中而实现。 此外，对准每一个脊髓分区里的个别层状体可能是重要的。层状体是大脑和脊髓 区域中的特定的亚区域。在某些实施方案中，瞄准在某脊髓分区里的特定层状体 可能是令人期望的。因为运动神经元损伤可能也会在上运动神经元里发生，提供 治疗性分子(例如，蛋白质或肽)到脑干的分区里也可能是令人期望的。在一个 实施方案里，提供治疗性分子到脊髓，包括某些或全部亚分区，及到脑干，包括 某些或全部亚分区里可能是令人期望的。本发明通过导入一种AAV载体到DCN 来实现上面描述的治疗性分子到脊髓区和/或脑干的传递。图12A图解了深部小脑 核区域和脊髓的联接，而图12B图解了深部小脑核区域和脑干间的联接。
[083]组织并执行复杂的运动动作的能力依赖于从大脑皮层运动区域，即运动 皮层而来的信号。皮质运动命令从两条通道传下。皮质延髓纤维控制脑干里移动 面部肌肉的运动核，皮质脊髓纤维控制支配躯干和四肢肌肉的脊髓运动神经元。 大脑皮质也通过作用于下行脑干途径间接地影响脊髓运动活性。
[084]初级运动皮质位于Broadmann区的中央前回(4)。投射到脊髓的皮质 神经元的轴突也在含有大约1百万根轴突的大量纤维束的皮质延髓束里运转。这 些轴突的大约1/3起源于额叶的中央前回。另外的1/3起源于区域6。剩下的起源 于躯体感觉皮层的区域3、2和1并通过背角调节向中枢的输入的传递。
[085]皮质脊髓纤维束通过内囊的后肢同皮质延髓纤维束共同运转，来到达中 脑的腹部。其在脑桥中分离成经过脑桥核的小纤维束。其在髓质中重组来形成延 髓锥体。大约3/4的皮质脊髓纤维交叉通过在髓质和脊髓的接合处部位的锥体交叉 中的正中线。交叉通过的纤维在脊髓侧柱(背外侧束)的背部的部分下行，形成 皮质延髓侧束。未交叉通过的纤维在腹柱下行成为皮质延髓腹侧束。
[086]皮质脊髓束的侧部和腹部区域大约在同脑干外侧和中间系统相同的脊髓 灰质的区域终结。外侧皮质脊髓束主要投射到腹角的外侧部分里的运动核和中间 区的中间神经元。腹部皮质脊髓束双向投射到腹内侧细胞柱和含有神经支配中轴 肌肉的运动神经元的中间区域的毗邻部分。图3图解显示了主要的向中枢的(传 入)路径。
[087]小脑的深部是定义内侧(尖顶的)神经核、中间(居间)神经核和外侧 (齿状)神经核并称为深部小脑核的灰质。本文中使用的，术语“深部小脑核” 共同地指这三个区域。图2图解显示了DCN的三个区域。图4图解显示了从DCN 发出的主要的传出(输出)路径。图5图解显示了大脑皮质中的神经回路。图12A 和12B分别图解显示了DCN和脊髓或脑干间的联接。
[088]假如有需要，人类大脑结构能同其他哺乳动物大脑的相似结构联系起来。 例如，大多数的哺乳动物，包括人和啮齿类动物，显示了内嗅-海马投射的相似的 分区机体组成，具有在投射到海马的背部或间隔杆的外侧和内侧内嗅皮层的外侧 部的神经元，然而到腹部海马的投射主要起源于内嗅皮层的内侧部分的神经元 (Principles of Neural Science，4th ed.，编者Kandel等人，McGraw-Hill，1991； The Rat Nervous System，2nd ed.，编者Paxinos，Academic Press，1995)。此 外，内嗅皮层的II层细胞投射到齿状回，其在齿状回分子层的外2/3处终结。从 III层细胞而来的轴突双向投射到海马的海马角区域CA1和CA3，在腔隙层分子层 终结。
[089]在一个方面，披露的方法包括将携带编码治疗性产物的转基因并允许转 基因在给药位点远端的CNS中以治疗水平表达的向神经的病毒载体给药到受折磨 的受试者的CNS的方法。另外，载体可能包含编码有效治疗CNS失调的生物活 性分子的多核苷酸。这样的生物活性分子可能包含肽，包括但不限于全长蛋白质 的天然或突变形式，蛋白片段的天然或突变形式，合成多肽，抗体和诸如Fab’分 子的抗体片段。生物活性分子也可能包含核苷酸，包括单链或双链DNA多核苷酸 和单链或双链RNA多核苷酸。若需要能应用于本文披露的方法的实施的示例性核 苷酸技术的综述，可参见Kurreck，(2003)J.，Eur.J.Biochem.，270，1628-1644 [反义技术]；Yu等人，(2002)PNAS，99(9)，6047-6052[RNA干扰技术]和 Elbashir等人，(2001)Genes Dev.，15(2)：188-200[siRNA技术]。
[90]在一个例证的实施方案中，通过直接注射高滴度载体溶液到受试者或病人 的DCN可实现给药。例如，可以通过直接注射到选自内侧(尖顶)区域、中间(居 间)区域和外侧(齿状)区域组成的组中选择出的一个或多个脑的深部小脑核区 域中而给药。由于DCN的广泛的与脑干和脊髓间的传出和传入联接，DCN是注 射的一个吸引人的位点。这些细胞提供了一种有效且最小侵害性的方式来传递病 毒载体和表达的转基因到脊髓区域和脑干区域。未局限于理论，病毒载体可能被 轴突末梢吸收并沿着轴突到这些神经元胞体的方向逆向运输，这些神经元在整个 脊髓区域和/或脑干投射。具有终止于，例如，脊髓颈部区域的轴突终端末梢的神 经元胞体在DCN中也存在。病毒载体被这些胞体吸收或者源于病毒载体的表达出 的转基因或二者可能顺向运输到脊髓颈部区域的轴突终端末梢。因此，通过使用 DCN作为注射位点，仅有小体积的病毒载体被注射，但这在脊髓和/或脑干的遍及 一个或多个区域中介导显著的转基因表达。
[091]在某些实施方案中，方法包含高滴度的携带治疗性转基因的向神经的载 体的给药方法，以便转基因产物在CNS中远离第一个位点的第二个位点以治疗水 平表达。在某些实施方案中，组合物中载体的滴度至少是：(a)5，6，7，8，8.4， 9，9.3，10，15，20，25或50(×1012gp/ml)；(b)5，6，7，8，8.4，9，9.3， 10，15，20，25或50(×109tu/ml)；或(c)5，6，7，8，8.4，9，9.3，10， 15，20，25或50(×1010iu/ml)。在此外的实施方案中，通过直接脑实质内注射高 滴度向神经的载体溶液到发病大脑可完成给药，此后，转基因在注射位点的远端、 对侧或同侧以治疗水平且距离给药位点至少2，3，5，8，10，15，20，25，30， 35，40，45或50毫米的地方表达。
[092]第一和第二位点间的距离被定义为给药位点(第一位点)和远端位点能 检测到转导的边界间的最小距离区域，该距离通过使用本领域已知的操作或在实 施例中使用的，例如原位杂交中描述的方法进行测量。更大的哺乳动物CNS中的 某些神经元可能由于其的轴突投射的原因跨越更大的距离。例如，在人中，某些 轴突可能跨越1000毫米的距离或者更大。这样，在本发明的多种方法中，载体能 以这样一个距离沿着轴突的整个长度被轴突运输，来到达并转导母细胞体。
[093]CNS中载体给药的位点以基于所希望的神经病理学的目标区域和涉及 到大脑回路的拓扑学而选择，只要给药位点和目标区域有轴突联接。目标区域能 被定义，例如，通过使用3-D立体定位坐标。在某些实施方案中，给药位点被选 择以使得注射载体总体积的至少0.1、0.5、1、5、或10％被远端传递在目标区域 至少1、200、500或1000mm3中。一个给药位点可能会位于被联接大脑远端区 域的投射神经元支配的区域。例如，黑质和腹侧节段区传递致密突起到尾状体和 壳核(共同被称为纹状体)。在黑质和腹段大脑脚盖中的神经元能通过注射到纹状 体后AAV的逆行运输用作转导的目标。在另一个实施例中，海马体接受从大脑的 其他区域而来的清晰的、可预测的轴突投射。其他的给药位点可能定位于，例如， 脊髓、脑干(髓质、中脑和脑桥)、中脑、小脑(包括深部小脑核)、间脑(丘脑、 下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮层或，在皮层中，枕叶、颞叶、顶叶、额叶)或 其的组合。
[094]第二(目标)位点能位于含有投射到第一(给药)位点的神经元的包括 大脑和脊髓的CNS的任何区域。在某些实施方案中，第二位点在从黑质、延髓、 脑干或脊髓选出的CNS的区域。
[095]为了明确地传递载体到中枢神经系统的特定区域，特别是到大脑的特点 区域，可能通过立体定位显微注射而给药。例如，在手术的那一天，病人将拥有 固定在位的(以螺丝拧紧到颅骨中)立体定位支架基底。具有脑功能立体定位支 架基质(适用的带有可信标记的MRI)的大脑将通过使用高分辨率MRI进行成像。 MRI影像然后将被传递到运行立体定位软件的计算机。一系列冠状、箭头形和轴 的影像将用于确定载体注射的目标位点和轨道。软件直接将轨道翻译成同立体定 位支架相适的3维坐标。钻孔打在进入位点之上，含有针的固定的立体定位仪器 在给定深度植入。在药学上可接受载体中的载体然后将被注射。载体然后通过直 接注射到主要的目标位点而给药，并经由轴突逆向运输到远端的目标位点。另外 的给药路线可能会被使用，例如，在直接目视法或其他非-立体定位应用时使用的 表层皮层用法。
[096]另外，由于DCN的每一个区域都针对CNS的特定区域(见图1和图12A 和12B)，因此，能明确地针对CNS的某个区域，通过预选择给药的DCN区域转 基因能被传递至此。明显的，如本领域技术人员已知的那些技术，通过变化定位、 序列和转基因给药的数目，能完成大量的给药和定向传递。给药物质的总体积和 给药载体颗粒的总数目将基于已知基因治疗的方面被本领域技术熟练人员决定。 治疗有效性和安全性能在适当的动物模型中进行检测。例如，存在大量针对LSDs 的被良好表征的动物模型，例如，本文中所描述的或在Watson等人，(2001) Methods Mol.Med.，76：383-403或Jeyakumar等人，(2002)Neu ropath.Appl. Neurobiol.，28：343-357和ALS(参见Tu等人，(1996)P.N.A.S.，93： 3155-3160；Roaul等人，(2005)Nat.Med.，11(4)：423-428和Ralph等人， (2005)Nat.Med.，11(4)：429-433)。
[097]在实验小鼠中，注射的AAV溶液的总体积是，例如，在1到5ul。对于 其他哺乳动物，包括人类大脑，体积和传递比率被适当界定(scale)。例如，已经 证明，150ul体积能被安全地注射到灵长类动物的大脑中(Janson等人，(2002) Hum.Gene Ther.，13：1391-1412)。治疗可能包含每个目标位点单次注射或假 如需要，可能沿着注射渠道被重复进行。多个注射位点能被使用。例如，在某些 实施方案中，除了第一次的给药位点外，含有携带转基因的病毒载体的组合物被 给药到第一个给药位点对侧或同侧的另一个位点。注射能是单次或多次，单侧或 双侧。
[098]高滴度AAV制备物能通过使用本领域已知技术，例如，在美国专利No. 5,658,776和Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者 Machida，Humana Press，2003中描述的技术进行生产。
[099]下面的实施例提供了本发明说明性的实施方案。本领域的一种普通技术 将识别无数的可能被实施而不改变本发明的精神或范围的修改和变化。这样的修 改和变化包括在本发明的范围内。这些实施例不是对本发明的限制。
实施例
重组载体的滴定
[040]除非另有说明，本发明的实施将使用传统的免疫学、分子生物学、微生 物学、细胞生物学和重组DNA的技术，这些均属于本领域的技能。参见例如， Sambrook，Fritsch和Maniatis，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编，(1987))；METHODS IN ENZYMOLOGY系 列(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(MJ. MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编，(1995))，Harlow和Lane编， (1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL CULTURE (R.I.Freshney编，(1987))。
[041]正如在说明书和权利要求中所用的，单数形式“a”“an”和“the”包括 复数关系，除非上下文清晰地表明。例如，术语“一个细胞”包括很多个细胞， 包括其的混合物。
[042]本文所用的术语“包括”是指，组合物和方法包括已述的要素，但不排 除其他的要素。当用来定义组合物和方法时“基本上由…组成”将意味着排除任 何其他的对组合而言是基本显著的成分的含义。这样，基本上由在本文中定义的 元素组成的组合物将不会排除从分离和纯化方法中而来的痕量污染物和药学上可 接受的载体，例如磷酸盐缓冲生理盐水、防腐剂，等等。“由…组成”将意味着排 除其他成分和用于给药本发明的组合物的基本方法步骤的超过痕量的成分。被这 些过渡术语的每一个术语所定义的实施方案都在本发明的范围之内。
[043]所有以数字表示的指定(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度和 分子量，均是以(+)或(-)0.1增量变动的近似值。应当理解，尽管不总是明 确的声明在所有以数字表示的指定前均加以术语“大约”。也应当理解，尽管不总 是明确的声明在本文中描述的试剂仅是示例性的，以及这些试剂的等价物在本领 域中是所共知的。
[044]术语“转基因”是指多核苷酸，其被引入细胞并能被转录成RNA并 能被可选地在适当的情况下翻译和/或进行表达。在一个方面，其能给与其被引 入的细胞所希望的特性，或导致所希望的治疗或诊断结果。在另一方面，其可能 被转录成介导RNA干扰的分子，例如siRNA。
[045]参照病毒滴度所用的术语“基因组颗粒(gp)”或“基因组同等物” 是指含有重组AAV DNA基因组的病毒粒子的数目，而不管其感染性或功能性。在 特定的载体制备物中的基因组颗粒的数目可以通过诸如在本文的实施例中所描述 的或例如，在Clark等人，(1999)Hum.Gene Ther，10：1031-1039；Veldwijk 等人，(2002)Mol.Ther.，6：272-278文献中的方法所测量。
[046]参照病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制 单位”是指感染性的和能复制的重组AAV载体颗粒的数目，其可以通过例如在 McLaughlin等人，(1988)J.Virol.，62：1963-1973的文章中描述的感染性中心 试验也称为复制中心试验进行测量。
[047]参照病毒滴度使用的术语“转导单元(tu)”是指导致功能性转基因 产物生产的感染性重组AAV载体颗粒的数目，其可通过诸如在本文实施例中或例 如在Xiao等人，(1997)Exp.Neurobiol.，144：113-124；或在Fisher等人， (1996)J.Virol.，70：520-532(LFU实验)文章中描述的功能性实验所测量。
[048]术语“治疗的”、“治疗有效量”和其的相关词指RNA、DNA或DNA 和/或RNA的表达产物的量，在受试者中产生保护或发病延迟或症状改善或预期 的生物学结果的获得，诸如神经病理学校正，例如伴随诸如ALS的运动神经元疾 病的细胞病理学。术语“治疗校正”指在受试者中产生保护或发病延迟或症状改 善的校正程度。有效量能通过已知的经验方法进行测量。
[049]“组合物”也意指包含有效试剂和其他载体的组合，例如，化合物或 组合物，无活性的(例如，可检测的试剂或标记)或有活性的，例如佐剂、稀释 剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂或等等。载体也包 括药用辅料和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括 单糖，二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等等和 多糖或糖聚合物)，其能单独或以组合形式存在，由单独或以组合形式的1-99.99％ 的重量比或体积比组成。示例性的蛋白质辅料包括血清白蛋白，例如人血清白蛋 白(HAS)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。代表性的氨基酸/抗体组 分，其在缓冲液(buffering capacity)中也能起作用，包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、 甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬甜二肽等等。碳水化合物辅料也包括在本发明的 范围内，其范例包括但不限定于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D- 甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维双糖等等；多糖， 例如棉子糖、松三糖、糊精-麦芽糖合剂、葡聚糖、淀粉等等和醛糖醇，例如甘露 醇、木糖醇、麦芽糖醇(maltitol)、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)和肌醇。
[050]术语载体此外还包括缓冲液或pH调整剂；典型地，缓冲液是从有机酸 或碱制备而来的盐。代表性的缓冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡 萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸，或邻苯二甲酸；Tris，盐酸氨基丁三醇， 或磷酸缓冲液。另外的载体包括多聚物辅料/添加剂，例如聚乙烯吡咯酮、聚蔗糖 (一种多聚的糖)、葡聚糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-.正交.-环糊精)、 聚乙烯乙二醇、调味剂、抗菌剂、增甜剂、抗氧化剂、拮抗剂、表面活化剂(例 如聚山梨酯，例如“吐温20”和“吐温80”)、脂质(例如磷脂，脂肪酸)、类固 醇(例如，胆固醇)和鳌合剂(例如，EDTA)。
[051]如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药用载体， 例如磷酸盐缓冲溶液、水和乳状液，例如油/水或水/油乳状液和各种类型的润湿剂。 组合物也能包括稳定剂和防腐剂和满足可用于体内的任何上面所提及的载体。载 体、稳定剂和佐剂的范例可参见Martin REMINGTON′S PHARM.SCI.，15th Ed. (Mack Publ.Co.，Easton，(1975)和Williams&Williams，(1995)， “PHYSICIAN′S DESK REFERENCE”，52nd ed.，Medical Economics， Montvale，NJ.(1998)。
[052]“受试者”、“个体”或“病人”在此处可替换使用，其指脊椎动物，优 选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猿猴、人、 农场动物、运动动物和宠物。
[053]“对照”是实验中用于对照目的的选择性受试者或样品。对照可以是“阳 性”或“阴性”的。例如，在实验目的是测定基因改变的表达水平同特定类型的 病理间的相互关系时(参见ALS，例如，下文)，通常更优选使用阳性对照(带有 这样的改变和表现出那种疾病症状特征的受试者或从受试者而来的样品)，和阴性 对照(缺乏改变的表达和那种疾病临床特征的受试者或从受试者而来的样品)。
[054]当用于基因时，术语“差异性表达的”指从基因转录的mRNA或该基因 编码的蛋白质产物的差异性生产。同正常或对照细胞的表达水平相比较，差异性 表达的基因可能是过表达或欠表达。一方面，它指比在对照样品中检测到的表达 水平高或低至少1.5倍，或至少2.5倍，或可选择的至少5倍，或可选择的至少 10倍的差异。术语“差异性表达的”也指细胞或组织中的核苷酸序列，这些序列 在对照细胞中沉默时表达或在对照细胞中表达时不表达。
[055]本文中所使用的，术语“调整”指改变效应或结果的数量或强度，例如 增强、扩大、减小或减少。
[056]本文中所使用的术语“改善”同“减轻”是同义的，指减少或减轻。例 如，一个人可能通过使疾病或失调变得更可忍受而改善疾病或失调的症状。
[057]在基因传递是被DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV) 介导的方面，载体构建物指含有一个病毒基因组或其的部分和转基因的多核苷酸。 腺病毒(Ads)是一类被相对好地表征的同族病毒，包括超过50个血清型。参见， 例如国际PCT申请No.WO 95/27071。Ads易于生长，并且不需要整合到宿主细 胞的基因组中。重组Ad衍生的载体，特别那些降低了重组和产生野生型病毒可能 的载体，也已经被构建出。参见，国际PCT申请号WO 95/00655和WO 95/11984。 野生型AAV具有很高的侵染性和特异地整合到宿主细胞基因组中。参见， Hermonat和Muzyczka，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和 Lebkowski等人，(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988-3996。
[058]本发明提供了传递转基因到受试者的脊髓和/或脑干的方法，通过给药脑 的深部小脑核区域的至少一个区域的含有转基因的重组向神经的病毒载体可以实 现该传递，在其中，传递在有利于转基因在远离给药位点的位点表达的情况下进 行。传递也可能导致转基因在给药位点的表达。
[059]除非特别声明的相反情况，转基因的表达不仅限定于翻译成多肽或蛋白 质也包括转基因多核苷酸的复制和/或转录。
[060]另一方面，本发明提供了传递治疗性转基因产物到CNS目标细胞的方 法，这些目标细胞是经受例如ALS或创伤性脊髓伤害等运动神经元失调症的哺乳 动物的神经元或神经胶质细胞。转基因可以编码IGF-1。
[061]另一方面，本发明提供了传递转基因到受试者脊髓的方法，通过给药含 有所述转基因的重组向神经的病毒载体到脑的运动神经皮层区域可以实现该传 递，此处所述的传递在有利于所述的转基因在远离所述的给药位点的位点表达的 情况下进行。
[062]在另一方面，本发明的病毒载体被给药到大脑深部小脑核的至少一个区 域，在这个区域，转基因产物被表达并传递到受试者的脊髓和/或脑干区域。
[063]在另一个实施例中，病毒载体被给药到互连脑干和脊髓运动神经元的大 脑深部小脑核的至少一个区域。这些目标区域具有同组成运动神经元的细胞环境 的细胞(例如中间神经元和星形胶质细胞)的直接联系。给药传递转基因产物到 运动神经元的细胞环境，在那里该产物介导组成该细胞环境的细胞有益的效应。
[064]在一个实施方案中，本发明提供了传递转基因到受试者运动神经元或调 整转基因在受试者运动神经元中表达的方法，通过给药到受试者大脑运动神经皮 层区域的含有转基因的向神经的病毒载体可实现该传递，其中转基因在远离所述 的给药位点的运动神经元区域表达。
[065]在另一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者运动神经元失调症的方 法，通过给药到受试者大脑深部小脑核的至少一个区域的含有治疗性转基因的向 神经的病毒载体可实现该治疗，在其中转基因在受试者脊髓的至少一个分区以有 效剂量进行表达。这些分区包括颈部、胸部、腰部或骶部的一个或多个(参见图1， 图12A)。转基因也可能在脑干，诸如，例如，中脑、脑桥或髓质(参见图12B) 的至少一个区域以治疗有效剂量表达。其也可能在受试者脑干的至少一个区域和 受试者脊髓的至少一个分区以治疗有效剂量表达。
[066]本发明也提供了改善受试者运动神经元失调症症状的方法，通过给药到 大脑运动神经皮层的含有治疗性转基因的向神经的病毒载体可实现该改善，在其 中所述的转基因在受试者脊髓的至少一个分区以治疗有效剂量表达。这些分区包 括颈部、胸部、腰部或骶部的一个或多个(参见图1，图12A)。
[067]本发明的实施的合适向神经的病毒载体包括，但不限于腺相关病毒载体 (AAV)，单纯疱疹病毒载体(美国专利No.5,672,344)和慢病毒载体。
[068]在本发明的方法中，任何血清型的AAV均能使用。在某些实施方案中， 任何血清型的AAV均能使用，只要这些载体能忍受在缺乏疾病抵抗力的大脑中的 逆行轴突运输，或在有抵抗力的大脑中的轴突运输。在本发明某些实施方案中使 用的病毒载体的血清型选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7 和AAV8(参见，Gao等人，(2002)PNAS，99：11854-11859和Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者Machida，Humana Press，2003)。 除了此处所列的那些病毒载体外的其他血清型也能使用。此外，假模标本AAV载 体也可能用于此处所描述的方法。假模标本AAV载体是在第二个AAV血清型的壳 体内含有一个AAV血清型的基因组；例如，含有AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV 载体或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等人，(2001)Hum. Mol.Genet，10(26)：3075-81)。
[069]AAV载体起源于对哺乳动物不致病的单链(SS)DNA细小病毒组(在 Muzyscka，(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.，158：97-129中进行了综述)。 简单而言，基于AAV的载体的占(account for)去除的病毒基因组的96％功能的 rep和cap基因，留下两段145碱基对(bp)的反向远端重复(ITRs)，其用于启动 病毒DNA复制、包装和整合。在缺少辅助病毒时，野生型AAV整合到人宿主细 胞基因组，其具有在染色体19q 13.3的优先位点特异性，或其可能保留游离表达。 单个的AAV颗粒能容纳长达5kb的ssDNA，因此为转基因和调控元件留下了大约 4.5kb的空间，这是典型足够的。然而，如例如在美国专利No.6,544,785里描述 的分子间拼接系统可能将近是这个限制的两倍。
[070]在一个做例证的实施方案中，AAV是AAV2或AAV1。许多血清型的腺 相关病毒，特别是AAV2已经被广泛的研究并被表征成基因治疗载体。本领域技 术人员熟悉基于AAV的功能性基因治疗载体的制备。关于用于给药人类受试者的 AAV生产、纯化和制备的无数方法的无数文献能在巨大数量的出版文献中找到(参 见，例如，Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者Machida， Humana Press，2003)。另外，针对CNS的细胞的基于AAV的基因治疗已经在 美国专利号Nos.6,180,613和6,503,888中进行了描述。另外的示例性AAV载 体是编码人类蛋白的重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型 载体。
[071]在本发明的某些方法中，载体包括可连接到启动子的转基因。这个转基 因编码具有生物活性的分子，其在CNS的表达导致神经病理学的至少部分的校正。 人ASM的基因组的和功能性的cDNA序列已经发表(参见，例如，美国专利号 No.5,773,278和6,541,218)。胰岛素生长因子-1(IGF-1)基因具有复杂的结 构，这是本领域所熟知的。其至少含有两个从基因转录本而来的选择性拼接的 mRNA产物。一个是153个氨基酸的肽，通过包括IGF-1A或IGF-1Ea在内的多 个名字被知晓，一个是195个氨基酸的肽，通过包括IGF-1B或IGF-1Fb在内的 多个名字被知晓。IGF-1的成熟形式是70个氨基酸的多肽。IGF-1Ea和IGF-1Eb 都含有这个70个氨基酸的成熟肽，但在其的羧末端延长的序列和长度上有所区别。 IGF-1Ea和IGF-1Eb的肽序列分别被SEQ ID NOS：1和2所表示。人IGF-1的基 因组的和功能性的cDNAs，以及其他的关于IGF-1基因和其的产物的信息，可在 Unigene登入号No.NM 00618得到。
[072]在真核细胞中转基因表达的水平主要由在转基因表达框内的转录启动子 决定。显示出长期的活性并是组织-和甚至细胞-特异的启动子在某些实施方案中进 行了使用。非限制性的启动子例子包括，但不限于，细胞巨化病毒(CMV)启动 子(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8：148-154)，CMV/人β3-珠蛋白启动子 (Mandel等人，(1998)J.Neurosci.18：4271-4284)，GFAP启动子(Xu等人， (2001)Gene Ther.8：1323-1332)，1.8kb特异性神经元烯醇酶(NSE)启动 子(Klein等人，(1998)Exp.Neurol.150：183-194)，鸡beta-肌动蛋白(CBA) 启动子(Miyazaki，(1989)Gene 79：269-277)，β-葡糖苷酸酶(GUSB)启动 子(Shipley等人，(1991)Genetics 10：1009-1018)和例如那些从人泛素A、 人泛素B和人泛素C分离而来的泛素启动子，在美国专利No.6,667,174中对此 有描述。为了延长表达，其他的调控元件可能被额外的连接到转基因上，诸如， 例如，土拨鼠肝炎病毒后调控元件(WPRE)(Donello等人，(1998)J.Virol.72： 5085-5092)或牛生长激素(BGH)多核苷酸化位点。
[073]对于某些CNS基因治疗应用，控制转录活性可能是必须的。为了这个目 标，用病毒载体进行基因表达的药理学调控能通过包括各种调控元件和药物敏感 启动子，例如，在Haberma等人，(1998)Gene Ther.5：1604-16011和Ye等 人，(1995)Science 283：88-91所描述的而获得。
[074]在本发明的方法中，病毒载体可通过用含有携带转基因的病毒载体的组 合物接触神经元的终端轴突终末而给药，允许病毒颗粒被内吞并沿着轴突到神经 元胞体的方向在胞内运输(逆行的)；允许治疗性转基因产物被表达，在其中治疗 性转基因产物藉此减轻受试者的病理。效应可能在运动神经元上，在组成运动神 经元环境的细胞(例如中间神经元和星状胶质细胞)上，或在二者之上。在某些 实施方案中，组合物中载体的浓度至少是：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、 15、20、25或50(×1012gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、 25或50(×109tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或 50(×1010iu/ml)。
[075]在本发明另外的方法中，病毒载体能通过用含有携带转基因的病毒载体 的组合物接触神经元的胞体而给药，允许病毒颗粒被内吞，允许治疗性转基因产 物被表达并沿着轴突到神经元轴突终末的方向在胞内顺行运输，在其中治疗性转 基因产物藉此减轻受试者的病理。效应可能在运动神经元上，在组成运动神经元 环境的细胞(例如中间神经元和星状胶质细胞)上或在二者之上。在某些实施方 案中，组合物中载体的浓度至少是：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、 25或50(×1012gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50 (×109tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×1010iu/ml)。
[076]在一个方面，转基因编码生物活性分子，该分子在CNS的表达产生至少 部分的神经病理学校正。在某些实施方案中，治疗性转基因产物是抑制受试者SOD 表达的RNA分子，藉此减轻和预防ALS的症状。参见Roaul等人，(2005)Nat. Med.11(4)：423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4)：429-433。
[077]在实施这些方法时的一个方面，转基因表达选自胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、钙结合蛋白D28、拟清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、EPO (促红细胞生成素)、CBP(cAMP效应元件结合蛋白[CREB]结合蛋白)、SMN-1、 SMN-2和CNTF(睫状节神经细胞营养因子)的治疗剂量的蛋白。
[078]作为选择地，转基因抑制蛋白的突变形式的表达，例如导致ALS的突变 SOD的表达。参见上面的Roaul等人，(2005)和上面的Ralph等人，(2005)。
[079]要鉴别人类大脑的结构，参见，例如，The Human Brain：Surface， Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI，and Blood Supply，2nd ed.， 编者Deuteron等人，Springer Vela，1999；Atlas of the Human Brain，编者Mai 等人，Academic Press，1997和Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain： 3-Dimensional Proportional System：An Approach to Cerebral Imaging，编者 Tamarack等人，Thyme Medical Pub.，1988。要鉴别小鼠大脑的结构，参见，例 如，The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates，2nd ed.，Academic Press，2000。 图1概略地显示了脊髓和其的四个分区：颈部、胸部、腰部和骶部。
[080]本发明提供了调整、校正或增进经受运动神经元损伤折磨的受试者的运 动功能。仅为了说明的目的，受试者可能遭受肌萎缩侧索硬化(ALS)、脊柱延髓 肌萎缩、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化(PLS)或外伤性 脊髓损伤中的一种或多种。
[081]未局限于理论，伴随运动神经元损伤的病理可能包括运动神经元退化、 神经胶质病、神经微丝异常、皮质脊髓束和前根中有髓鞘神经纤维的丧失。例如， 两种类型的发病已经被认识：影响上运动神经元(皮质和脑干运动神经元)的延 髓发病影响面部肌肉、语言和吞咽；影响下位运动神经元(脊髓运动神经元)的 四肢发病被痉挛、全身虚弱、肌萎缩、瘫痪和呼吸衰竭所反射。在ALS中，受试 者同时具有延髓和四肢发病。在PLS中，受试者具有延髓发病。
[082]未局限于理论，本发明的一个实施方案具有提供治疗性分子(例如，蛋 白质或肽)到脊髓每个分区的能力。这可能通过注射AAV载体到DCN中而实现。 此外，对准每一个脊髓分区里的个别层状体可能是重要的。层状体是大脑和脊髓 区域中的特定的亚区域。在某些实施方案中，瞄准在某脊髓分区里的特定层状体 可能是令人期望的。因为运动神经元损伤可能也会在上运动神经元里发生，提供 治疗性分子(例如，蛋白质或肽)到脑干的分区里也可能是令人期望的。在一个 实施方案里，提供治疗性分子到脊髓，包括某些或全部亚分区，及到脑干，包括 某些或全部亚分区里可能是令人期望的。本发明通过导入一种AAV载体到DCN 来实现上面描述的治疗性分子到脊髓区和/或脑干的传递。图12A图解了深部小脑 核区域和脊髓的联接，而图12B图解了深部小脑核区域和脑干间的联接。
[083]组织并执行复杂的运动动作的能力依赖于从大脑皮层运动区域，即运动 皮层而来的信号。皮质运动命令从两条通道传下。皮质延髓纤维控制脑干里移动 面部肌肉的运动核，皮质脊髓纤维控制支配躯干和四肢肌肉的脊髓运动神经元。 大脑皮质也通过作用于下行脑干途径间接地影响脊髓运动活性。
[084]初级运动皮质位于Broadmann区的中央前回(4)。投射到脊髓的皮质 神经元的轴突也在含有大约1百万根轴突的大量纤维束的皮质延髓束里运转。这 些轴突的大约1/3起源于额叶的中央前回。另外的1/3起源于区域6。剩下的起源 于躯体感觉皮层的区域3、2和1并通过背角调节向中枢的输入的传递。
[085]皮质脊髓纤维束通过内囊的后肢同皮质延髓纤维束共同运转，来到达中 脑的腹部。其在脑桥中分离成经过脑桥核的小纤维束。其在髓质中重组来形成延 髓锥体。大约3/4的皮质脊髓纤维交叉通过在髓质和脊髓的接合处部位的锥体交叉 中的正中线。交叉通过的纤维在脊髓侧柱(背外侧束)的背部的部分下行，形成 皮质延髓侧束。未交叉通过的纤维在腹柱下行成为皮质延髓腹侧束。
[086]皮质脊髓束的侧部和腹部区域大约在同脑干外侧和中间系统相同的脊髓 灰质的区域终结。外侧皮质脊髓束主要投射到腹角的外侧部分里的运动核和中间 区的中间神经元。腹部皮质脊髓束双向投射到腹内侧细胞柱和含有神经支配中轴 肌肉的运动神经元的中间区域的毗邻部分。图3图解显示了主要的向中枢的(传 入)路径。
[087]小脑的深部是定义内侧(尖顶的)神经核、中间(居间)神经核和外侧 (齿状)神经核并称为深部小脑核的灰质。本文中使用的，术语“深部小脑核” 共同地指这三个区域。图2图解显示了DCN的三个区域。图4图解显示了从DCN 发出的主要的传出(输出)路径。图5图解显示了大脑皮质中的神经回路。图12A 和12B分别图解显示了DCN和脊髓或脑干间的联接。
[088]假如有需要，人类大脑结构能同其他哺乳动物大脑的相似结构联系起来。 例如，大多数的哺乳动物，包括人和啮齿类动物，显示了内嗅-海马投射的相似的 分区机体组成，具有在投射到海马的背部或间隔杆的外侧和内侧内嗅皮层的外侧 部的神经元，然而到腹部海马的投射主要起源于内嗅皮层的内侧部分的神经元 (Principles of Neural Science，4th ed.，编者Kandel等人，McGraw-Hill，1991； The Rat Nervous System，2nd ed.，编者Paxinos，Academic Press，1995)。此 外，内嗅皮层的II层细胞投射到齿状回，其在齿状回分子层的外2/3处终结。从 III层细胞而来的轴突双向投射到海马的海马角区域CA1和CA3，在腔隙层分子层 终结。
[089]在一个方面，披露的方法包括将携带编码治疗性产物的转基因并允许转 基因在给药位点远端的CNS中以治疗水平表达的向神经的病毒载体给药到受折磨 的受试者的CNS的方法。另外，载体可能包含编码有效治疗CNS失调的生物活 性分子的多核苷酸。这样的生物活性分子可能包含肽，包括但不限于全长蛋白质 的天然或突变形式，蛋白片段的天然或突变形式，合成多肽，抗体和诸如Fab’分 子的抗体片段。生物活性分子也可能包含核苷酸，包括单链或双链DNA多核苷酸 和单链或双链RNA多核苷酸。若需要能应用于本文披露的方法的实施的示例性核 苷酸技术的综述，可参见Kurreck，(2003)J.，Eur.J.Biochem.，270，1628-1644 [反义技术]；Yu等人，(2002)PNAS，99(9)，6047-6052[RNA干扰技术]和 Elbashir等人，(2001)Genes Dev.，15(2)：188-200[siRNA技术]。
[90]在一个例证的实施方案中，通过直接注射高滴度载体溶液到受试者或病人 的DCN可实现给药。例如，可以通过直接注射到选自内侧(尖顶)区域、中间(居 间)区域和外侧(齿状)区域组成的组中选择出的一个或多个脑的深部小脑核区 域中而给药。由于DCN的广泛的与脑干和脊髓间的传出和传入联接，DCN是注 射的一个吸引人的位点。这些细胞提供了一种有效且最小侵害性的方式来传递病 毒载体和表达的转基因到脊髓区域和脑干区域。未局限于理论，病毒载体可能被 轴突末梢吸收并沿着轴突到这些神经元胞体的方向逆向运输，这些神经元在整个 脊髓区域和/或脑干投射。具有终止于，例如，脊髓颈部区域的轴突终端末梢的神 经元胞体在DCN中也存在。病毒载体被这些胞体吸收或者源于病毒载体的表达出 的转基因或二者可能顺向运输到脊髓颈部区域的轴突终端末梢。因此，通过使用 DCN作为注射位点，仅有小体积的病毒载体被注射，但这在脊髓和/或脑干的遍及 一个或多个区域中介导显著的转基因表达。
[091]在某些实施方案中，方法包含高滴度的携带治疗性转基因的向神经的载 体的给药方法，以便转基因产物在CNS中远离第一个位点的第二个位点以治疗水 平表达。在某些实施方案中，组合物中载体的滴度至少是：(a)5，6，7，8，8.4， 9，9.3，10，15，20，25或50(×1012gp/ml)；(b)5，6，7，8，8.4，9，9.3， 10，15，20，25或50(×109tu/ml)；或(c)5，6，7，8，8.4，9，9.3，10， 15，20，25或50(×1010iu/ml)。在此外的实施方案中，通过直接脑实质内注射高 滴度向神经的载体溶液到发病大脑可完成给药，此后，转基因在注射位点的远端、 对侧或同侧以治疗水平且距离给药位点至少2，3，5，8，10，15，20，25，30， 35，40，45或50毫米的地方表达。
[092]第一和第二位点间的距离被定义为给药位点(第一位点)和远端位点能 检测到转导的边界间的最小距离区域，该距离通过使用本领域已知的操作或在实 施例中使用的，例如原位杂交中描述的方法进行测量。更大的哺乳动物CNS中的 某些神经元可能由于其的轴突投射的原因跨越更大的距离。例如，在人中，某些 轴突可能跨越1000毫米的距离或者更大。这样，在本发明的多种方法中，载体能 以这样一个距离沿着轴突的整个长度被轴突运输，来到达并转导母细胞体。
[093]CNS中载体给药的位点以基于所希望的神经病理学的目标区域和涉及 到大脑回路的拓扑学而选择，只要给药位点和目标区域有轴突联接。目标区域能 被定义，例如，通过使用3-D立体定位坐标。在某些实施方案中，给药位点被选 择以使得注射载体总体积的至少0.1、0.5、1、5、或10％被远端传递在目标区域 至少1、200、500或1000mm3中。一个给药位点可能会位于被联接大脑远端区 域的投射神经元支配的区域。例如，黑质和腹侧节段区传递致密突起到尾状体和 壳核(共同被称为纹状体)。在黑质和腹段大脑脚盖中的神经元能通过注射到纹状 体后AAV的逆行运输用作转导的目标。在另一个实施例中，海马体接受从大脑的 其他区域而来的清晰的、可预测的轴突投射。其他的给药位点可能定位于，例如， 脊髓、脑干(髓质、中脑和脑桥)、中脑、小脑(包括深部小脑核)、间脑(丘脑、 下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮层或，在皮层中，枕叶、颞叶、顶叶、额叶)或 其的组合。
[094]第二(目标)位点能位于含有投射到第一(给药)位点的神经元的包括 大脑和脊髓的CNS的任何区域。在某些实施方案中，第二位点在从黑质、延髓、 脑干或脊髓选出的CNS的区域。
[095]为了明确地传递载体到中枢神经系统的特定区域，特别是到大脑的特点 区域，可能通过立体定位显微注射而给药。例如，在手术的那一天，病人将拥有 固定在位的(以螺丝拧紧到颅骨中)立体定位支架基底。具有脑功能立体定位支 架基质(适用的带有可信标记的MRI)的大脑将通过使用高分辨率MRI进行成像。 MRI影像然后将被传递到运行立体定位软件的计算机。一系列冠状、箭头形和轴 的影像将用于确定载体注射的目标位点和轨道。软件直接将轨道翻译成同立体定 位支架相适的3维坐标。钻孔打在进入位点之上，含有针的固定的立体定位仪器 在给定深度植入。在药学上可接受载体中的载体然后将被注射。载体然后通过直 接注射到主要的目标位点而给药，并经由轴突逆向运输到远端的目标位点。另外 的给药路线可能会被使用，例如，在直接目视法或其他非-立体定位应用时使用的 表层皮层用法。
[096]另外，由于DCN的每一个区域都针对CNS的特定区域(见图1和图12A 和12B)，因此，能明确地针对CNS的某个区域，通过预选择给药的DCN区域转 基因能被传递至此。明显的，如本领域技术人员已知的那些技术，通过变化定位、 序列和转基因给药的数目，能完成大量的给药和定向传递。给药物质的总体积和 给药载体颗粒的总数目将基于已知基因治疗的方面被本领域技术熟练人员决定。 治疗有效性和安全性能在适当的动物模型中进行检测。例如，存在大量针对LSDs 的被良好表征的动物模型，例如，本文中所描述的或在Watson等人，(2001) Methods Mol.Med.，76：383-403或Jeyakumar等人，(2002)Neu ropath.Appl. Neurobiol.，28：343-357和ALS(参见Tu等人，(1996)P.N.A.S.，93： 3155-3160；Roaul等人，(2005)Nat.Med.，11(4)：423-428和Ralph等人， (2005)Nat.Med.，11(4)：429-433)。
[097]在实验小鼠中，注射的AAV溶液的总体积是，例如，在1到5ul。对于 其他哺乳动物，包括人类大脑，体积和传递比率被适当界定(scale)。例如，已经 证明，150ul体积能被安全地注射到灵长类动物的大脑中(Janson等人，(2002) Hum.Gene Ther.，13：1391-1412)。治疗可能包含每个目标位点单次注射或假 如需要，可能沿着注射渠道被重复进行。多个注射位点能被使用。例如，在某些 实施方案中，除了第一次的给药位点外，含有携带转基因的病毒载体的组合物被 给药到第一个给药位点对侧或同侧的另一个位点。注射能是单次或多次，单侧或 双侧。
[098]高滴度AAV制备物能通过使用本领域已知技术，例如，在美国专利No. 5,658,776和Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols，编者 Machida，Humana Press，2003中描述的技术进行生产。
[099]下面的实施例提供了本发明说明性的实施方案。本领域的一种普通技术 将识别无数的可能被实施而不改变本发明的精神或范围的修改和变化。这样的修 改和变化包括在本发明的范围内。这些实施例不是对本发明的限制。
实施例
重组载体的滴定
[0100]AAV载体的滴度根据基因组拷贝数目(每毫升中基因组颗粒数)来测 量。基因组颗粒浓度基于载体DNA的TaqmanPCR，如先前所报道的(Clark 等人，(1999)Hum.Gene Ther.，10：1031-1039；Veldwijk等人，(2002)Mol. Ther，6：272-278)。简言之，提纯的AAV-ASM用衣壳蛋白消化缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA，0.5％SDS，1.0mg/ml蛋白酶K)在50℃处理1 小时来释放载体DNA。DNA样品同退火到载体DNA特定区域，诸如启动子区、 转基因或poly(A)序列的引物进行聚合酶链反应(PCR)。PCR结果然后通过实时 Taqman软件，诸如Perkin Elmer-Applied Biosystems(Foster City，CA)Prism 7700序列检测系统提供的，进行定量。
[0101]携带能检测的标记基因，例如β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白基因 (GFP)的载体能通过使用一种侵染性实验进行滴度测定。易感细胞(例如Hela 或COS细胞)用AAV进行转导，然后进行诸如用X-gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D- 半乳糖苷)进行的β-半乳糖苷酶载体转导的细胞的染色或针对GFP转导的细胞的 荧光显微术的实验来测定基因表达。例如，实验可以如下进行：4×104个HeLa 细胞接种在使用正常生长培养基的24孔培养板的每一个孔中。在吸附后，即大约 24小时后，细胞用Ad5型以感染复数(MOI)10进行侵染并用包装的载体的梯度 稀释物进行转导，然后在37℃进行孵育。一到三天后，在广泛的细胞病变效应被 观察到前，恰当的实验在细胞上进行(例如，X-gal染色或荧光显微术)。假如使 用了诸如β-半乳糖苷酶的报告基因，细胞在2％多聚甲醛、0.5％戊二醛的溶液中 固定并用X-gal进行β-半乳糖苷酶的染色。提供分离良好的细胞的载体稀释物被 进行计数。每一个阳性细胞代表载体的一个转导单位(tu)。功能性蛋白的表达阻止了治疗相关小鼠模型中的运动损伤。
[0102]ASMKO小鼠是一种类型A和B尼-皮二氏病的可接受的模型 (Horinouchi等人，(1995)Nat.Genetics，10：288-293；Jin等人，(2002)J. Clin.Invest.，109：1183-1191和Otterbach，(1995)Cell，81：1053-1061)。 尼-皮二氏病(NPD)被归类为溶酶体贮存病并是一种遗传性的神经代谢失调症， 其特征是在酸性鞘磷脂酶中的遗传缺陷(ASM；神经磷脂胆碱磷酸水解酶， EC3.1.3.12)。功能性ASM蛋白的缺乏导致整个大脑的神经元和神经胶质的溶酶 体中神经磷脂底物的蓄积。这导致了核周体中大量膨胀溶酶体的形成，这是类型A NPD的标志特点和主要的细胞表现型。膨胀溶酶体的存在同正常细胞功能的丧失 和导致受影响个体在幼童时期死亡的进行性神经变性过程相互关联(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases，编者Scriver等人， McGraw-Hill，纽约，2001，3589-3610页)。第二细胞表现型(例如附加的代谢 异常)也同这种疾病相关联，在溶酶体细胞器中显著高水平的胆固醇蓄积。神经 磷脂具有对胆固醇的强的亲和力，这导致ASMKO小鼠和病人的溶酶体中大量胆 固醇的分离(Leventhal等人，(2001)J.Biol.Chem.，276：44976-44983；Slotte， (1997)Subcell.Biochem.，28：277-293和Viana等人，(1990)J.Med.Genet.， 27：499-504)。
[0103]下面的实验，评价编码人ASM(hASM)的重组AAV2/1，AAV2/2， AAV2/5，AAV2/7和AAV2/8血清型载体表达hASM蛋白的相对能力，在深部小 脑核的单侧注射后校正胆固醇储存病理，忍受运输，拯救浦肯野细胞，和启动 ASMKO小鼠中的功能恢复。一个附加的ASMKO小鼠组接受了到DCN的双侧注 射来评价增加的转基因蛋白传播/表达是否将提高行为功能的恢复。
[0104]六十六只雄性纯合(-/-)酸性神经磷脂酶敲除(ASMKO)小鼠和16 只从杂交而来(+/-)的雄性野生型同窝对照鼠被饲养。按照在Gal等人，(1975) N Engl J Med，293：632-636中描述的步骤用PCR将小鼠进行基因分型。从最 初的鼠群而来的小鼠同C57/B16种系进行回交。动物在12:12小时明暗循环的 环境中饲养并无限制的提供食物和水。所有的操作均在公共机构动物关爱和使用 委员会的许可的方法下进行。
[0105]在用异氟烷麻醉后，小鼠(约7周龄)被用下面的AAV血清型载体(n＝8/ 载体)：AAV1-CMV-βgal、AAV1-CMV-ASM、AAV2-CMV-ASM、AAV5-CMV-ASM、 AAV7-CMV-ASM和AAV8-CMV-ASM中的一种进行到深部小脑核(A-P：-5.75 从前囟，M-L：-1.8从前囱，D-V：-2.6从硬膜，门牙杆：0.0)的单侧注射。载 体用安装在注射器泵上的10ul哈密尔顿注射器将每个大脑为总共1.86×1010个的 基因组颗粒以0.5ul/分钟的速率进行递送。每一个载体的最终的注射体积为4ul。 手术的一小时前和24小时后，小鼠被给药优洛芬(5mg/kg；SC)进行止痛。
[0106]小鼠在注射后的7周进行处死(14周龄)。在处死的时候，小鼠给药超 剂量的戊巴比妥钠(150mg/kg；IP)并迅速断头(n＝5/组)或经颈动脉灌流(n＝3/ 组)。断头小鼠的大脑被迅速移除，在液氮中快速冷冻，切成3个部分(右大脑半 球、左大脑半球和小脑)，匀浆，并用ELASA分析hASM。灌流小鼠的大脑和脊 髓被检验人ASM蛋白的表达、如被菲律宾菌素染色检测的胆固醇蓄积和用在 50um震动(vibratone)切片上的钙结合蛋白染色进行的浦肯野细胞存活检测。接 受AAV2/1-βgal(n＝8)、AAV2/1-ASM(n＝5)和AAV2/2-ASM(n＝5)的双侧注射(约 7周龄)的ASMKO小鼠在经历旋转试验后在20周龄进行处死。通过使用本领域 已知的方法，小鼠在Smartrod(AccuScan)被通过加速和摇摆旋转试验检测运动 功能。示例性的方法在Sleat等人，(2004)J.Neurosci.，24：9117-9126中再现。 图10和11图解显示了作为运动功能恢复检测手段的旋转试验的结果。
[0107]在人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子控制下，带有SV40多腺苷 酸序列和杂交内含子的全长人ASM cDNA被克隆到一个含有从AAV血清型2而 来的ITRs(AAV2ITR)的质粒中。Jin等人，(2002)J Clin Invest.，109：1183-1191。 通过使用一系列含有除AAV类型2复制基因外的血清型特异的衣壳编码区的辅助 质粒的三重转染，可生产杂交质粒。这个策略允许AAV2ITR载体包装入每一个血 清型特异病毒粒子Rabinowitz等人，(2002)J Virol.，76：791-801。用这种方法， hASM重组基因组被用于产生一系列各种血清型包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、 AAV2/7和AAV2/8的rAAV-hASM载体。重组AAV载体通过离子交换色谱进行纯 化(血清型2/1、2/2和2/5)。O′Riordan等人，(2000)J Gene Med，2：444-54 或氯化铯离心法(血清型2/8和2/7)Rabinowitz等人，(2002)J.Urrol.，76： 791-801。AAV-ASM病毒颗粒(抗DNA酶的颗粒)的最终滴度通过CMV序列的 TaqMan PCR进行测定。Clark等人，(1999)Hum.Gene Therapy，10： 1031-1039。
[0108]人ASM抗体是人特异性的并且不能同小鼠ASM交叉反应。用稀释在 50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的单克隆重组人ASM(rhASM)抗体(2ug/ml) 包被的(100ul/孔)Coster(Corning，NY)9018平板在2-8℃进行孵育过夜。 移除过量的包被抗体，加入封闭稀释剂(KPL，Inc.，MD)在37℃孵育1小时。 平板用微量培养板洗涤器(Molecular Devices，CA)冲洗2个循环。稀释在标准 稀释缓冲液(PBS，0.05％吐温，1％HP-BSA)中的标准、对照和样品滴入，一 式两份，并被允许在37℃下孵育1小时。平板按上面描述的方法进行冲洗。一百 微升生物素化的重组人ASM(rhASM)抗体(在标准稀释缓冲液中稀释1∶20K) 被加入到每一个孔中，并在37℃下孵育1小时，然后用微量培养板洗涤器进行移 除。稀释1：10K的抗生蛋白链菌素-HRP(Pierce Biotechnology，Inc.，IL)然 后被加入(100ul/孔)并在室温下孵育30分钟。培养板用上面描述的方法进行清 洗，随后用SureBlue TMB(KPL，Inc.，MD)在36-38℃孵育15分钟。反应用 终止溶液(KPL，Inc.，MD)终止，然后用Spectra Max 340培养板读数器(Molecular Devices，CA)在450nm读取吸光度的值。通过使用Softmax Pro 4.3软件 (Molecular Devices，CA)完成数据分析。[010g]每一个样品的蛋白质浓度用使用牛血清白蛋白作为标准的BCA蛋白试 验试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，IL)进行测定。
[0110]小鼠用在pH6.5的0.1M醋酸钠缓冲液中的含有2％多聚甲醛、0.03％ 戊二醛、0.002％氯化钙的固定剂进行经颈动脉灌流，之后用pH8.5的相同固定剂 进行的灌流。小鼠大脑和脊髓被切开并在没有戊二醛的pH8.5的固定剂中在4℃ 下进行过夜的后固定。这些组织在pH7.4的0.1M的磷酸钾缓冲液中被冲洗，被包 埋在3.5％的琼脂并用震动切片机切成50um的矢形切面。
[0111]大脑和脊髓以50um间距进行矢形振动切片。切片用抗人ASM(1∶200) 的一抗进行免疫荧光处理。切片在含10％驴血清、0.3％Triton X-100的PBS中孵 育1小时，然后用生物素化的鼠抗人ASM抗体在含2％驴血清、0.2％Triton X-100 的PBS中孵育72小时。在洗涤后，用酪氨信号放大试剂盒(PerkinElmer，Boston， MA)进行信号放大。人ASM蛋白用尼康荧光显微镜进行观察，用SPOT相机和 Adobe Photoshop软件捕捉图像。
[0112]菲律宾菌素复成物(Sigma，St.Louis，MO)首先稀释到100％甲醇中， 用作1mg/ml的储存浓度。储存液在-20℃可稳定4周。在用PBS1洗涤后，切片 在新鲜配制在PBS中的10ug/ml菲律宾菌素中于暗处孵育3小时。切片然后用 PBS洗涤三次。胆固醇沉着用荧光显微镜的紫外滤镜进行观察。
[0113]大脑用直接抗钙结合蛋白的一抗进行免疫荧光处理。切片用磷酸钾缓冲 液(KPB)进行洗涤，然后用磷酸钾缓冲盐水(KPBS)进行冲洗。切片然后在含 5％的驴血清、0.25％Triton X-100的KPBS中封闭3小时，然后在含5％驴血清、 0.2％Triton X-100和鼠抗钙结合蛋白抗体(1∶2500，sigma，St.Louis，MO)的 KPBS中孵育。在4℃孵育72小时后，切片用含0.1％Triton X-100的KPBS冲 洗三次。二抗，驴抗鼠CY3抗体(1∶333，Jackson Immunoresearch Laboratories， West Grove，PA)加入到KPBS+0.1％Triton X-100的缓冲液中于室温孵育90分 钟。切片用KPB洗涤，然后在涂布胶的载玻片上计数。钙结合蛋白阳性细胞在落 射荧光显微镜(epifluorescence)上观察。为了定量小脑中的浦肯野细胞，从每一 只动物中选择四片全脸的内侧小脑切片。钙结合蛋白免疫阳性浦肯野细胞用荧光 显微镜观察，细胞体在放大20倍的情况下进行计数。每一个叶片被分别计数。在 每一个叶片中两个分离的焦平面被进行计数。只有在焦点上的细胞被计数，来确 保没有细胞被计数两次。
[0114]五十(50)μm振动切片首先按上面描述的方法用直接抗人ASM的抗 体进行免疫荧光处理。切片然后在PBS中洗涤并用上面描述的针对钙结合蛋白的 方法进行胆碱乙酰基转移酶(ChAT；兔多克隆，1∶500，Chemicon International， Temecula，CA)染色。但是是使用驴抗兔FITC抗体(1∶200，Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)，而不是用CY3二抗。首先用 落射荧光显微镜进行染色观察，然后用共聚焦显微镜获得图像。
[0115]菲律宾菌素染色用下述方法定量。用配备SPOT数字相机的尼康E600 全视野立式落射荧光显微镜获取曝光正确的图像。首先成像AAV2/1-β-gal组，然 后此曝光参数用于获取其所有的其它图像。通过每一个半脑的长度，每一幅分析 的图像代表了一个内侧矢状面。用Metamorph软件(Universal Imaging Corporation)进行形态测定分析。AAV2/1-β-gal图像作为阈值；一旦建立，同样 的阈值用于所有图像。下面的区域被使用者手工选取并分别分析：小脑、脑桥、 髓质、中脑、大脑皮层、海马体、丘脑、下丘脑和纹状体。每个区域中的整体强 度被测量，并且从动物的给定组而来的所有测量(n＝3/组)被用于产生平均数。 然后，在经治疗动物中的胆固醇减少以同敲除β-gal的注射鼠相比较的整体强度的 百分比减少进行计算。在深部小脑核中单侧注射AAV-ASM后，阳性hASM免疫 染色在整个小脑(表1)、脑桥、髓质和脊髓中都被观察到。表1
结构 AAV1 AAV2 AAV5 AAV7 AAV8 深部小脑核 ++++ ++ +++ +++ ++++ 小脑叶 ++++ ++ +++ +++ ++++ 脑桥 ++ ++ ++ ++ + 髓质 + ++ ++ +++ + 脊髓 +++ +++ ++ + 丘脑 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 下丘脑 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 海马 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 纹状体 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 大脑皮层 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
结构 AAV1 AAV2 AAV5 AAV7 AAV8 深部小脑核 ++++ ++ +++ +++ ++++ 小脑叶 ++++ ++ +++ +++ ++++ 脑桥 ++ ++ ++ ++ + 髓质 + ++ ++ +++ + 脊髓 +++ +++ ++ + 丘脑 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 下丘脑 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 海马 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 纹状体 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 大脑皮层 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
[0116]作为AAV血清型函数的阳性hASM染色区域显示阳性hASM低于检测 限，但胆固醇病理的校正仍然发生了。
[0117]小鼠用AAV2/1-ASM在小脑中进行处理并且具有最广分布的(即在同 一个矢形切面里的小叶间分布)hASM表达水平，然而，用AAV2/2-ASM处理的 小鼠具有最有限的人ASM蛋白表达水平。用AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM和 AAV2/8-ASM处理的小鼠中的人ASM蛋白表达居于这两组之间。在用血清型1和 8处理的小鼠中，矢形切面间的内侧-外侧分布是最大的，最小的是注射血清型2 的小鼠。开始内侧-外侧传布模式的血清型5和7居于血清型1和2之间。小脑的 每一层(即分子、浦肯野和颗粒)用每一种AAV血清型进行转导；然而，对分子 层的亲和力增加对所有血清型都是明显的。在用血清型1和5处理的小鼠中，浦 肯野细胞转导是最大的。注射血清型7的小鼠具有最少数目的转导浦肯野细胞。 用血清型8处理的小鼠也几乎有极少的转导浦肯野细胞，但当同血清型1、2、5 和7相比较时，其在颗粒层中具有更少的ASM表达。用ASM转导的浦肯野细胞 出现了健康的细胞结构。通过ELISA进行的小脑组织匀浆中AAV介导hASM蛋 白表达的的定量分析支持这些免疫组织化学发现。当同所有其它其小鼠比较时， 注射血清型1和8的小鼠证明了显著(p＜.0001)更高的小脑hASM蛋白水平。 注射血清型2、5和7的小鼠小脑hASM水平不高于WT水平(即背景)。正如所 期望的，在野生型小鼠中未检测到人ASM-在ELISA中使用的hASM抗体是人特 异的。
[0118]功能性ASM蛋白的缺乏导致神经磷脂的溶酶体蓄积，随后导致诸如异 常胆固醇运输的第二代谢缺陷。Sarna等人，Eur.J.Neurosci.，13：1873-1880 和Leventhal等人，(2001)J.Biol.Chem.，276：44976-4498。ASMKO小鼠大 脑中游离胆固醇蓄积通过使用菲律宾菌素，从菲律宾链霉菌中分离而来的自发荧 光分子，进行观察。野生型小鼠大脑对菲律宾菌素不呈阳性染色。在所有AAV处 理的小鼠(AAV2/1-βgal除外)中，菲律宾菌素染色的清除(表2)同指明每一种 血清型载体均能产生功能型转基因产物的hASM免疫染色阳性的面积重叠。表2
2/1 2/2 2/5 2/7 2/8 小脑 96.54± 2.14 93.85± 1.257 86.75± 9.58 96.47± 1.93 99.12± .66 中脑 96.72± 1.73 53.08± 22.89 65.88± 24.53 73.39± 22.39 91.10± .105 脑桥 91.31± 5.80 50.07± 21.26 70.96± 25.60 93.15± 31.20 96.72± 1.20 髓质 93.29± 6.22 88.46± 3.04 81.55± 17.31 80.73± 14.99 97.40± 1.60 丘脑 48.88± 25.25 41.21± 27.35 34.86± 16.67 48.44± 28.65 77.03± 12.08 下丘脑 82.81± 10.14 86.96± 12.93 88.46± 5.90 82.95± 11.46 99.68± .31 皮层 27.60± 24.75 73.62± 14.9 55.65± 28.89 76.97± 14.27 98.30± .34
2/1 2/2 2/5 2/7 2/8 小脑 96.54± 2.14 93.85± 1.257 86.75± 9.58 96.47± 1.93 99.12± .66 中脑 96.72± 1.73 53.08± 22.89 65.88± 24.53 73.39± 22.39 91.10± .105 脑桥 91.31± 5.80 50.07± 21.26 70.96± 25.60 93.15± 31.20 96.72± 1.20 髓质 93.29± 6.22 88.46± 3.04 81.55± 17.31 80.73± 14.99 97.40± 1.60 丘脑 48.88± 25.25 41.21± 27.35 34.86± 16.67 48.44± 28.65 77.03± 12.08 下丘脑 82.81± 10.14 86.96± 12.93 88.46± 5.90 82.95± 11.46 99.68± .31 皮层 27.60± 24.75 73.62± 14.9 55.65± 28.89 76.97± 14.27 98.30± .34
[0119]同在选定的大脑区域中，在小脑内注射编码人ASM的不同AAV血清型 (n＝3/血清型；2/1，2/2，2/5，2/7，和2/8)到ASMKO小鼠的深部小脑核后用 AAV-βgal处理的ASMKO小鼠相比较的菲律宾菌素(即胆固醇)清除百分比减少。
[0120]正如先前被(Passini等人，(2003)“Society for Neuroscience”，New Orleans，LA)证明的，菲律宾菌素的清除也在同注射位点在解剖学上联接的区域 中发生，但其不对hASM呈阳性染色。Metamorph分析表明，菲律宾菌素染色的 减少在整条吻尾轴中发生。在小脑和脑干中，在用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM 处理的小鼠中菲律宾菌素减少最多，然而，在间脑和大脑皮层中，用AAV2/8-ASM 注射的小鼠具有菲律宾菌素清除的最好总水平(表2)。虽然如此，这些结果表明， 校正在ASMKO小鼠CNS中的胆固醇蓄积病理所需的hASM水平是最小限量的 (即低于hASM免疫荧光检测限)。
[0121]组织学研究表明，ASMKO小鼠小脑经历了快速恶化。更明确地，浦肯 野细胞在8和20周龄之间进行性死亡(Sarna等人，(2001)Eur.J.Neurosci.， 13：1813-1880和Stewart等人，(2002)，“Society for Neuroscience”，Orland， FL)。钙结合蛋白是一种广被接受的浦肯野细胞标记。在AAV-ASM处理的小鼠中 阳性钙结合蛋白染色表明AAV介导的hASM表达是治疗性的。全部我们的结果表 明，小脑中AAV介导的hASM表达阻止了ASMKO小鼠中浦肯野细胞的死亡(表 3)。正如所希望的，浦肯野细胞存活在小叶I-III中不发生；小鼠在7周龄进行注 射，8周这些细胞的大多数已经死亡。在小叶IV/V中，浦肯野细胞存活在用血清 型1处理的小鼠中是最大的。在小叶VI中，在AAV处理的小鼠中没有观察到显 著的浦肯野细胞的存活。在小叶VII中，仅有用血清型5处理的小鼠显示了显著的 浦肯野细胞存活。在小叶VIII中，用血清型5和血清型2处理的小鼠又显示了显 著的浦肯野细胞存活。在小叶IX和X中，在WT和KO小鼠间(或在AAV处理 的小鼠间)浦肯野细胞计数没有显著的不同。这是被期望的，因为在14周龄(即 处死的年龄)，在ASMKO小鼠的这些小叶中的浦肯野细胞仍然是有活力的。在所 有的小叶中，在用血清型1、2和5处理的小鼠中的浦肯野细胞存活是最大的，在 用血清型7和8处理的小鼠中的浦肯野细胞存活是最低的。表3
2/1 2/2 2/5 2/7 2/8 KO WT I/II 7.42± 9.80 4.5± 10.58 9.40± 11.59 12.33± 10.58 1±9.16 5.8± 11.59 113± 10.58 III 12.42± 10.32 11.33± 11.14 26.80± 12.21 15.33± 11.14 9.8± 12.21 2±9.65 147.50+ 11.14 IV/ V 60.57± 17.28 36.5± 18.67 27.80± 20.45 29.66± 18.67 6.8± 20.45 8±16.16 220.66± 18.67 VI 61.14± 11.21 27.5± 12.11 72.20± 13.26 31.16± 12.11 3.8± 13.26 68.5± 10.48 121.16± 12.11 VII 17.42± 4.15 37.66+ 4.49 40.60± 4.91 5.33± 4.49 .2±4.95 17.37± 3.88 37.16± 4.49 VIII 44.14± 10.75 48.66± 11.62 82.80± 12.73 11.33+ 11.62 18.40± 12.73 35.12± 10.06 103.33± 11.62 IX 126.28± 19.17 102.66± 20.71 136.40± 22.68 60.16± 20.71 84.40± 22.68 108.0± 17.93 144± 20.71 X 89.85± 12.54 76.83± 13.55 93.80± 14.84 48.16+ 13.55 64.80± 14.84 87± 11.73 86.66± 13.55
2/1 2/2 2/5 2/7 2/8 KO WT I/II 7.42± 9.80 4.5± 10.58 9.40± 11.59 12.33± 10.58 1±9.16 5.8± 11.59 113± 10.58 III 12.42± 10.32 11.33± 11.14 26.80± 12.21 15.33± 11.14 9.8± 12.21 2±9.65 147.50+ 11.14 IV/ V 60.57± 17.28 36.5± 18.67 27.80± 20.45 29.66± 18.67 6.8± 20.45 8±16.16 220.66± 18.67 VI 61.14± 11.21 27.5± 12.11 72.20± 13.26 31.16± 12.11 3.8± 13.26 68.5± 10.48 121.16± 12.11 VII 17.42± 4.15 37.66+ 4.49 40.60± 4.91 5.33± 4.49 .2±4.95 17.37± 3.88 37.16± 4.49 VIII 44.14± 10.75 48.66± 11.62 82.80± 12.73 11.33+ 11.62 18.40± 12.73 35.12± 10.06 103.33± 11.62 IX 126.28± 19.17 102.66± 20.71 136.40± 22.68 60.16± 20.71 84.40± 22.68 108.0± 17.93 144± 20.71 X 89.85± 12.54 76.83± 13.55 93.80± 14.84 48.16+ 13.55 64.80± 14.84 87± 11.73 86.66± 13.55
[0122]在小脑内注射编码人ASM的不同AAV血清型(n＝3/血清型；2/1、2/2、 2/5、2/7和2/8)到ASMKO小鼠的深部小脑核后，在WT和ASMKO小鼠的小 脑小叶I-X中的浦肯野细胞计数。黑斜体数字同KO小鼠(即用AAV2/1-βgal处 理的小鼠)是显著不同的p≤.01。
[0123]在加速旋转试验中，用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM单侧注射的小鼠 证明了比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小鼠显著(p＜.0009)更长的延迟跌倒 时间。用血清型AAV2/1-ASM注射的小鼠同野生型小鼠不是显著不同。用 AAV2/2-ASM和AAV2/5-ASM注射的小鼠比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小 鼠显示出了更长延迟跌倒时间的趋势；然而，用AAV2/7-ASM注射的小鼠并非如 此。对于摇摆旋转试验，只有用AAV2/1-ASM注射的小鼠比用M2/1-βgal注射的 小鼠证明了一个显著(p＜.0001)更长的延迟跌倒时间。在这种情况下，野生型小 鼠比用AAV2/1-ASM注射的小鼠表现得显著更好。对于加速和摇摆试验，接受 AAV2/1-ASM或AAV2/2-ASM双侧注射的ASMKO小鼠比ASMKO AAV2/1-βgal 处理的小鼠均表现得显著(p＜.001)更好。对于这两个试验，AAV2/1-ASM双侧 注射的小鼠表现能同野生型小鼠相当。
[0124]测定ASMKO CNS中AAV产生的hASM是否具有功能性活性的一个途 径是评价其对胆固醇蓄积病理-NPA疾病的二级代谢缺陷的影响。在所有AAV处 理的小鼠中(除了AAV2/1-βgal)，胆固醇蓄积病理的校正同指明每一种血清型载 体均能产生功能型转基因产物的hASM免疫染色阳性的面积重叠。正如上面证明 的，异常胆固醇代谢校正也在同注射位点解剖学上联接的区域中发生，但也在 hASM染色不呈阳性的区域发生，这暗示，校正胆固醇蓄积病理所需的hASM水 平是最低限度。同这些hASM组织化学和生物化学结果相一致地，用血清型1和 8处理的小鼠证明了胆固醇蓄积病理的显著降低。用血清型2、5和7处理的小鼠 也显示了胆固醇蓄积病理的降低，但程度同用血清型1和8处理的小鼠不同。肌萎缩性侧索硬化(ALS)的治疗相关模型
[0125]肌萎缩性侧索硬化(ALS)是致命的神经变性疾病，其特点是皮层、脑 干和脊髓中运动神经元的选择性丧失。该病的进展能导致四肢、轴和呼吸肌的肌 萎缩。运动神经元细胞死亡伴随着反应性神经胶质瘤病、神经微丝异常和皮质脊 髓束及腹根1-6中巨大有髓鞘神经纤维的显著损失。尽管对ALS的病原学所知甚少， 积累的证据表明，散发的(SALS)和家族性(FALS)ALS具有许多相似的病理 特征；这样，提供了其中一种类型疾病的研究将导致一种共同治疗方法的希望7。 FALS大约占诊断病例的10％，其20％伴随Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)8的 显性遗传突变。表达突变人SOD1蛋白的转基因鼠(例如SOD1G93A小鼠)再现 了ALS的许多病理特征，是研究ALS的一种有效动物模型9。对于SALS，无数 的病理机制已经牵扯到下面的原因，包括谷氨酸诱导的兴奋性中毒、毒素接触、 蛋白酶体异常、线粒体损伤、神经微丝分裂和神经营养支持的丧失10，11。
[0126]截至目前，尚无ALS的有效治疗方法。诸如胰岛素生长因子1(IGF-1) 的神经营养因子由于其在ALS治疗上的潜在有用性已经被广泛研究。病毒载体到 联接脑干和脊髓运动神经元的CNS区域的颅内传递(能进行轴突运输的)提供了 给药潜在治疗药物，诸如IGF-1，到那些通过在先的技术方法很难到达的区域的方 法。
[0127]未局限于理论，这些目标区域可能不必需要同运动神经元的直接联接； 即，这些目标区域具有同仅组成运动神经元细胞环境的细胞(例如，中间神经元 和星形细胞)的直接联接就足够了。这个推想被正常和SOD1突变细胞混合体的 嵌合鼠的研究所支持。这些试验显示，不表达突变SOD1的非神经元细胞延迟了 退化并显著增大了突变表达的运动神经元的存活13。此外，另外的试验已经证明， 组成运动神经元的细胞环境的细胞(例如星形细胞和小神经胶质细胞)是神经营 养因子的重要来源，这些细胞的损伤(如在ALS中的病理性发生)已经被暗示是 造成运动神经元退化的潜在因子之一11。
[0128]可能支持治疗性病毒载体和/或表达蛋白到运动神经元细胞环境的运输 的CNS的区域是小脑的深部小脑核(DCN)。DCN具有同脑干和脊髓的大量传入 和传出联接(见图1)14-19。用能进行轴突运输的病毒载体靶向患有神经代谢疾病 的小鼠模型的DCN，在脑干和脊髓中均检测到了转基因蛋白20。有意思的是，转 基因蛋白在那些对胆碱乙酰转移酶(ChAT)，一个运动神经元标记，呈阳性和阴 性的细胞中均检测到。
[0129]小鼠和大鼠中超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突变的过表达概要重现 了人类ALS的临床和病理学特点。延缓此模型症状的活性化合物已经被显示出对 患ALS的病人具有可预言的临床有效性，因此是该病的一种治疗相关模型。这样 的小鼠模型先前已经在Tu等人，(1996)P.N.A.S.，93：3155-3160；Kaspar 等人，(2003)Science，301：839-842；Roaul等人，(2005)Nat.Med.，11(4)： 423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.，11(4)：429-433中进行了描述。
[0130]当前的实验，因此，试图来研究AAV-IGF-1的双侧DCN传递对有症状 的(即90天龄)SOD1G93A小鼠疾病进展的影响。特别地，主要目标是确定 AAV-IGF-1的传递能否导致(1)到脑干和脊髓的载体和/或蛋白传递；(2)在脑干 和脊髓中的神经病理的减少；(3)运动行为功能的提高和(4)显著的寿命延长。 结果表明，病毒载体注射到互联脑干和脊髓的CNS区域是传递潜在的治疗性转基 因到脑干和脊髓的一种有效的方法。而且，我们的结果支持设计来通过修饰其的 分子环境治疗运动神经元退化的治疗方法的发展。
[0131]两个研究在G93A SOD1中进行(SOD1G93A突变小鼠，此处用SOD1 小鼠表示)。这个模型接近地模拟了人类ALS。在小鼠的大约90天龄时会出现伴 随后肢运动缺陷的进行性运动神经元退化。死亡发生在大约120-122天时。每一 个研究都有四个治疗组：1)接受编码IGF-1的AAV血清型1(AAV-IGF-1)的小鼠； 2)接受编码绿色荧光蛋白的AAV血清型1(AAV1-GFP)的小鼠；3)接受编码 IGF-1的AAV血清型2(AAV2-IGF-1)的小鼠和4)接受编码绿色荧光蛋白的AAV 血清型2(AAV2-GFP)的小鼠。
[0132]未局限于理论，IGF-1由于对不同水平的神经轴具有许多好处，因此 是治疗ASL的治疗性蛋白(参见Dore等人，Trends Neurosci，1997，20：326-331)。 在大脑中：其被认为能降低神经元和神经胶质的编程性死亡，保护神经元免受由 铁元素、秋水仙素、钙失稳剂、超氧化物和细胞因子诱发的毒性。其也被认为能 调节神经递质乙酰胆碱和谷氨酸的释放。其也被认为能诱导神经微丝、tublin和髓 磷脂碱蛋白的表达。在脊髓中：IGF-1被认为能调节ChAT活性并减弱胆碱能表型 的丧失，增强运动神经元萌芽，增加髓鞘形成，抑制脱髓鞘，刺激运动神经元从 前体细胞的繁殖和分化，并促进神经鞘细胞分裂、成熟和生长。在肌肉中：IGF-1 被认为能诱导神经肌肉接点处乙酰胆碱受体聚束形成并增强神经肌肉功能和肌肉 强度。在本实验中，使用了该蛋白的IGF-1Ea形式。
[0133]绿色荧光蛋白用作对照蛋白，其也使被AAV载体注射介导的表达能被 观察。
[0134]出生后九十天，SOD1小鼠被用AAV重组载体双侧注射到DCN。在一 个研究中，每个位点的剂量大约是2.0e10gc/ml。某些小鼠在出生后大约110天 被处死，然后其的大脑和脊髓被分析GFP染色、经由免疫组化的IGF-1表达、经 由ELISA的IGF-1表达、经由RT-PCR的IGF-1表达、经由免疫组化的ChAT定 位、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达、运动神经元计数、如上面描述的在旋转台 上的功能测试(摇摆和加速)、通过使用握力剂量器进行的前后肢握力和存活率。
[0135]当动物被放在其自己的背上后在30秒内再也不能将其自己“正”过来 或者动物被动物照看技术员发现死亡时，“死亡事件”被输入进来。“死亡事件” 分类在评价的时间被两个人以动物的组(GFP对IGF-1是盲试的)进行执行。
[0136]在表达GFP的AAV载体被双侧注射到深部小脑核(DCN)后，在脑干 和遍及脊髓的每一个分区中的GFP被检测(见图13和14)。图22显示了小鼠大 脑中GFP的分布。除DCN外，GFP阳性染色也在嗅球、大脑皮质、丘脑、脑干、 小脑皮层和脊髓中观察到。所有这些区域也接受从DCN的投射和/或发送投射到 DCN。另外，GFP阳性纤维和/或细胞在接近ChAT阳性细胞的地方也被观察到。
[0137]IGF-1mRNA在用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1处理的小鼠脑干和脊髓 的每一个分区中检测到，这证明载体经历了逆向运输(参见图18)。IGF-1蛋白在 用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1处理的小鼠脑干和脊髓中检测到。在口神经核 (oromotor nuclei)(例如，运动三叉神经核、面神经核和舌下神经核)和脊髓的每 一个分区中的GFAP染色减少在用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1处理的小鼠中检测 到(参见图15-17)。GFAP是神经胶质瘤病(其是ALS的病理标志)的标记。 AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1的传递导致旋转和握力任务的显著功能提升(参见图 20)。AAV1-IGF-1AAV2-IGF-1的传递也显著地延长了SOD1小鼠的寿命(参见 图21，在AAV-IGF-1处理的小鼠中生存中值增加到133.5或134天，与之相比较， 在AAV-GFP处理的小鼠中为121或120天)。图19表明，AAV-IGF-1的DCN传 递提高了运动神经元的存活率。用编码IGF-1的AAV处理的小鼠和编码GFP的 AAV的DCN传递间的不同是统计学上显著的，p值＝0.01，用星号表示。
[0138]不管血清型，AAV-IGF-1处理显著地提高了运动神经元的存活率，提升 了旋转和握力实验的运动表现和显著延长了寿命。通过使用PCR和ELISA进行 检测，IGF-1表达在整个脑干和脊髓中都检测到。
[0139]本说明书按照本说明书中引用的参考文献的教导可被最彻底地理解。在 本说明书中的实施分案提供了本发明实施分案的一个例证，不应当被解释为对本 发明的范围的限制。本领域技术人员容易地得到许多其他的实施分案也被本发明 包括。在本公开中引用的所有出版物、专利和生物序列均以其的全部整体引入作 为文献。假如文献包括的材料与本申请的说明书相互矛盾或同本说明书不一致， 则以本说明书为准。本文中任何文献的引用并不承认这样的文献是本发明的在先 技术。
[0140]除非另外指明，在本说明书包括权利要求中使用的表达成分、细胞培养 物、治疗情况等等的数量的所有数字应该被理解为在所有的情况下均被术语“大 约”所修饰。相应地，除非另外特别说明，以数字表示的参数是近似值并可能非 常依赖于本发明所试图获得的期望的性质。除非另外表明，在一系列元素前的术 语“至少”应该被理解为是指该系列中的每一个元素。仅通过使用例行实验，那 些本领域中的技术人员将识别或能确定本发明中描述的具体实施方案的许多等价 物。这样的同价物也视为包括于下面的权利要求中。[01]根据美国法典35卷119(e)条规定，本申请要求2005年5月2日申请 的美国临时申请No.60/677,213和2006年4月8日申请的美国临时申请 No.60/790,217权利要求的优先权，上述申请的内容引入本文作为参考。
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19.Matsushita，M.&Yaginuma，H.Afferents to the cerebellar nuclei from the cervical enlargement in the rat，as demonstrated with the Phaseolus vulgaris leucoagglutinin method.Neurosci Lett13，253-9(1990).
20.Matsushita，M.&Yaginuma，H.Projections from the central cervical nucleus to the cerebellar nuclei in the rat，studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 353，234-46(1995)；Voogd，J.The cerebellar nuclei and their efferent pathways，in The rat nervous system (ed.Paxinos，G.)208-215 (Elsevier Academic Press，San Diego，2004).
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