发明领域

本说明书涉及癌症的动物模型。具体地，本说明书涉及一种包含人乳 腺癌细胞系的乳腺癌异种移植物模型，所述细胞系已经进行过工程设计以 便在诱导剂诱导后表达血管内皮生长因子(VEGF)，以及所述动物模型在 治疗乳腺癌生长、转移和与乳腺癌相关联的其它特征中的应用。

背景

抗雌激素疗法在绝经前和绝经后乳腺癌患者中和在转移的、辅助的和 化学预防的环境中都是有效的。与化疗相比，抗雌激素药物以低毒性和相 对轻度的副作用被很好地耐受。当前，最广泛使用的抗雌激素药物是他莫 昔芬，其被作为柠檬酸盐口服给药。已经显示所有乳腺癌患者的大约60％ 是雌激素受体(ER)-阳性的，并且在所有阶段的乳腺癌患者中高达70％的 ER-阳性患者从他莫昔芬治疗中获益(Clark等，Semin.Oncol，15： 20-25，1988；Baum等，Br.J.Cancer，78 Suppl 4：1-4，1998)。据估计全世界大 约7百万妇女目前正在接受某种形式的他莫昔芬治疗(Favoni等， Trends.Pharmacol.Sci.，19：406-415，1998)。不过，他莫昔芬并不能完全预防 ER阳性肿瘤的生长和发展。在大多数患者中，最初对他莫昔芬反应的癌 症会复发并成为他莫昔芬抗性的和转移性的(MacGregor等， Pharmacol.Rev.，50：151-196，1998；Clark等，EMBO J，20：3484-3494，2001)。 因此，对这些患者需要发展有效的治疗改进方法。

尽管具有对抗雌激素他莫昔芬的广泛经验，赋予他莫昔芬抗性的精确 机制依然不清楚。在这些年，对于他莫昔芬抗性已经提出过多种机制。这 些研究提出他莫昔芬抗性主要由1)支持肿瘤细胞生长的ER-不依赖的选 择性信号途径，或由2)ER介导的机制诸如他莫昔芬的作用由ER拮抗剂 转变为ER激动剂所引起的。

临床研究已经显示提高水平的VEGF与乳腺癌患者中增加的肿瘤微 血管密度和较弱的反应相关联，所述VEGF是涉及肿瘤新血管发生和血管 渗透性的关键因子，所述患者是对于他们的晚期疾病接受他莫昔芬的患者 (Foekens等，Cancer Res.，61：5407-5414，2001)。此外，明显较短的存活时 间与患者中中间数以上的VEGF水平相关，所述患者是对于结节-阴性乳 腺癌接受他莫昔芬的患者(Linderholm等，Cancer Res.，61：2256-2260， 2001)。这些资料提示VEGF过量表达与乳腺癌他莫昔芬抗性和转移相关。

VEGF家族包含几个成员。VEGF-A，本领域一般称为VEGF，刺激内 皮细胞增殖和在培养物中的转移和在体内的血管发生(Klagsbrun等， Cytokine.GrowthFactor.Rev.，7：259-270，1996)。VEGF是生理和病理血管发 生所需的内皮细胞功能的关键调节物。VEGF家族的其它成员包括 VEGF-B，-C，-D，-E，和胎盘生长因子(P1GF)。它们的细胞受体包括三种膜 酪氨酸激酶VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(Flk-1或KDR)，VEGFR-3(Flt4)，和 一种非激酶受体，神经毡蛋白-1。已经报道一般VEGF结合VEGFR-1和 VEGFR-2进行细胞过程中的信号传导。VEGF以许多同种型出现，包括 121，145，165，189，和206个氨基酸的多肽(氨基酸长度的计算不包括信号 肽序列)，其通过包含八个外显子的单个基因的交替剪接而产生(Neufeld 等，FASEB J.，13：9-22，1999)。尽管VEGF-121和VEGF-165是肿瘤分泌的最常 见的同种型，但最有力作用于内皮细胞上的是VEGF-165同种型，导致新 毛细血管的形成(Veikkola等，Cancer Res.，60：203-212，2000；Ferrara等， Nat.Rev.Cancer，2：795-803，2002)。多种研究已经显示VEGF作为乳腺癌 的严重性的预测指征(Foekens等，Cancer Res.，61：5407-5414，2001)。

转移瘤，而非原发肿瘤，是造成大多数癌症死亡的原因。目前，对于 转移性和抗雌激素抗性乳腺癌的有效治疗非常有限。有效疗法的开发部分 地被缺乏合适动物模型所阻碍(Chambers等，Nat.Rev.Cancer，2：563-572， 2002；Couzin，J.Science，299：1002-1006，2003)。癌细胞的播散包括不同的机 制，诸如直接侵入周围组织，通过血管系统扩散(血源性转移)，和通过淋 巴系统扩散(淋巴性转移)。临床研究已经提示VEGF通过新血管发生提高 转移的可能性(Claffey等，Cancer Res.，56：172-181，1996；Yamamoto等，Clin. Cancer Res.，2：821-826，1996)。血管发生是肿瘤生长必需的，并且涉及从 隐匿的微观转移灶到临床上可检测的转移病变的起始过程(Cristofanilli 等，Nat.Rev Drug Discov，1：415-426，2002)。

乳腺癌能够扩散到身体的几乎任何区域。最常见的转移位点是淋巴 节、肺、骨和肝。高达70％的死于乳腺癌的妇女发展成肺转移，在21％ 的这些人中，肺是转移的唯一位点。已经发现转移的乳腺癌与提高的 VEGF水平相关联。除了其血管发生功能之外，最近已经显示VEGF通过 其受体神经毡蛋白-1由其自分泌效应提高肿瘤细胞的迁移率和侵袭力 (Bachelder等，Cancer Res.，62：7203-7206，2002)。

为了进一步研究VEGF在体外和体内对于乳腺癌的效应，在申请人的 研究实验室中已经建立起几种源自MCF-7的人乳腺癌细胞系，命名为 C9V细胞系，其已经进行过工程化设计以便以多西环素(Dox)调控的方 式过量表达VEGF。用这些细胞系，已经开发了一种异种移植物小鼠模型， 其中肿瘤VEGF表达由通过小鼠饮水施用Dox进行紧密控制。非常重要 的是，小鼠肿瘤中的VEGF水平可以被调控在临床相关的范围之内，所述 范围发现于患者活组织检查样品中。C9V和MCF-7亲本细胞系都是雌激 素受体阳性的，当皮下导入裸鼠中时它们显现雌激素生长依赖性，他莫昔 芬敏感性和最小的转移可能性。在小鼠饮用水中加入Dox诱导C9V异种 移植物中的VEGF表达并且表明通过VEGF促进肿瘤微环境的重建的机 制，VEGF诱导到临床相关水平足以促进ER阳性，他莫昔芬反应性和非 转移性乳腺肿瘤变为他莫昔芬抗性的和转移性的。在原发性和转移的位 点，表达VEGF的肿瘤细胞都能够诱导促结缔组织生成反应，这是对于人 乳腺癌常见的一种宿主基质反应特征，但很少见于异种移植物模型中。据 观察VEGF表达提高在远距离器官肺中的播散性肿瘤细胞的建群，提示除 了它的血管发生效应之外VEGF的新作用。在小鼠中当VEGF过量表达 于早期关闭时，肿瘤生长变得静止并且转移的发生率减少。

概述

因此，本说明书的一个目的是提供人ER阳性乳腺癌细胞系，它以 Dox调控的方式表达VEGF至临床相关的水平。

本说明书的另一个目的是提供一种动物模型以进一步研究VEGF在 乳腺癌发展和进展、他莫昔芬抗性的诱导、弥散癌细胞在远离原发性肿瘤 的继发位点上的建群和转移的诱导中的作用。

本说明书的另一个目的是提供一种动物模型以研究VEGF在乳腺癌 发展和进展、他莫昔芬抗性的诱导、弥散癌细胞在远离原发性肿瘤的第二 位点上的建群和转移的诱导中的作用机制。

本说明书的另一个目的是提供一种动物模型以研究VEGF在肿瘤基 质双向相互作用、肿瘤微环境重建、和乳腺癌进展中播散性癌细胞在远距 离器官中的建群、抗雌激素激素抗性、和转移瘤发展中的作用机制。

本说明书的其它目的是提供一种动物模型以鉴定VEGF作用的抑制 剂抑制VEGF在乳腺癌发展、进展、他莫昔芬抗性的诱导和转移潜力的诱 导中的作用。

本说明书的另一个目的是提供一种动物模型进行潜在治疗剂的临床 前效力研究，在转移性和辅助性疗法的情况下靶向雌激素和VEGF信号途 径二者的多种药物疗法的新治疗。

附图简述

图1A和1B是已经稳定转染到MCF-7细胞中以产生人VEGF165的 DNA构建体的简图。图.1(a)举例说明双顺反子tet-反式激活蛋白构建体 (pBTE)而图1(b)举例说明tet-反应性元件构建体(pTRE-hVEGF)。如所 述制备与这些构建体稳定整合的MCF-7细胞。

图2显示在条件培养基中来自代表性的源于MCF-7的细胞系的分泌 VEGF蛋白的蛋白质印迹分析。使用未转染的MCF-7细胞(称作MCF-7)， 只用pBTE构建体转染的MCF-7细胞(称作C9)，组成性地表达VEGF的 细胞系(称作MLV-165-16)，和人重组165氨基酸形式VEGF(PeproTch， Rocky Hill，NJ)作为对照。如所示在存在和缺乏0.2μg/ml Dox的情况下 对用pTRE-hVEGF和pBTE构建体转染的C9V4和C9V18细胞系进行分 析。高分子量带能够反映VEGF翻译后修饰。

图3显示在体外VEGF对细胞增殖的自分泌效应缺乏。将C9V细胞 去除雌激素，培养在所述的无雌激素的培养基中并如所指示的进行处理。 通过细胞计数在第三天测量细胞数量。如所说明的处理条件是：VEGF： 20ng/ml；FGF：FGFa，20ng/ml；Tam：4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)， 10-7M，和E2：17-β雌二醇，10-8M。

图4A和4B显示VEGF的表达对肿瘤生长的影响(如通过肿瘤体积所 测量的)以及肿瘤体积与胞质VEGF浓度的相关性。如所述，在裸鼠中产 生表达VEGF的肿瘤。图4A显示在50天的时期内，在小鼠饮用水中添 加Dox以诱导VEGF的表达以剂量依赖型的方式增加了肿瘤生长的速度。 图4B显示在每个小鼠组中的平均肿瘤体积与通过ELISA测定的肿瘤 VEGF含量和在小鼠饮用水中Dox的剂量是直接相关的。

图5A-5D显示Dox调节的VEGF表达与肿瘤切片中指示Dox调节的 细胞增殖标记Ki-67的核染色阳性的百分比的增加相关联。如所述，在裸 鼠中产生表达VEGF的肿瘤。VEGF表达在体内刺激肿瘤细胞的增殖。 Dox-调节的VEGF的表达在他莫昔芬处理的小鼠(图5A和5B)和补充雌激 素的小鼠(图5C和5D)中都增加了肿瘤细胞的增殖。

图6A和6B显示Dox调节的VEGF表达增加了肿瘤微导管密度，其 通过用小鼠内皮细胞特异性标记PECAM-1进行的免疫组织化学染色来进 行特征鉴定。如所述，表达VEGF的细胞在裸鼠中产生。图6A显示在存 在雌激素而没有对VEGF表达的诱导情况下的免疫组织化学染色，而图 6B显示在存在雌激素并且存在Dox-诱导的VEGF表达的情况下进行的免 疫组织化学染色。

图7显示VEGF对乳腺肿瘤生长速率的影响是可逆的。如所述，在裸 鼠中产生表达VEGF的肿瘤。将接种的小鼠分成三组(所有的组都接受了 雌激素)。在整个试验中，组1接受0.2mg/ml的Dox，组2仅接受0.2mg/ml 的Dox 11天，而组3在整个实验中接受蔗糖(阴性对照)。仅接受Dox 11 天的小鼠的肿瘤生长速率在去除Dox后大大减少，这说明在早期对VEGF 的抑制可以稳定疾病的进程。

图8A和图8B显示VEGF的表达诱导他昔莫芬抗性。如所述，在裸 鼠中产生表达VEGF的肿瘤。当肿瘤体积达到150-200mm3时，用他昔莫 芬丸取代雌激素丸。与诱导VEGF表达的0.2mg/ml Dox接触的小鼠中的 肿瘤显示持续的肿瘤生长。但是，在他昔莫芬处理的小鼠中，没有接触 Dox的小鼠中的肿瘤保持静止并最终复原。图8A显示来自将C9V4细胞 系用于建立异种移植物的小鼠的结果，而图8B显示来自将C9V18细胞系 用于建立异种移植物的小鼠的结果。

图9A-9D显示VEGF表达诱导了原发肿瘤转移。亲本C9V4 MCF-7 细胞是Lac Z标记的。如所述，在裸鼠中产生表达VEGF的肿瘤。肺的 X-gal染色显示小鼠中肿瘤细胞的大转移性沉积，所述小鼠接受了Dox和 雌激素(图9A和9C)或雌激素随后他昔莫芬(图9B和9D)。X-gal染色显示 在图9A和9B中并且肺组织样品的H&E组织染色显示于图9C和9D中。

图10A-10D显示VEGF表达在远距离器官中增加了播散性肿瘤细胞 的建群，一种除了其生血管作用以外的VEGF的新的作用。通过尾静脉注 射将C9V细胞直接引入循环中，并且通过用针对细胞角蛋白的抗体，一 种上皮细胞标志进行免疫染色来确定在小鼠肺中的播散性肿瘤细胞的模 式。图12A和图12C显示用肺切片的细胞角蛋白进行的免疫染色，所述 肺切片在对没有接受Dox处理的动物(图12A)和接受Dox的动物(图12C) 进行尾静脉注射2小时后获得。图12B和12D显示用从没有接受Dox处 理的动物(图12A)和接受Dox处理的动物(图12C)的尾静脉注射后4周 获得的肺切片的细胞角蛋白进行的免疫染色。而不管是在尾静脉注射后2 小时的Dox处理还是尾静脉注射后4周的Dox处理中，检测动物肺中的 肿瘤细胞时，肿瘤细胞仅在接受诱导VEGF表达的Dox处理的动物的肺 中检测得到。

图11显示VEGF的表达诱导肉眼可见的转移病变。在尾静脉注射10 周后，在其饮用水中接受了Dox的小鼠的肺中观察到了一些肉眼的可见 的转移病变。通过细胞角蛋白免疫组织染色在肉眼可见的转移病变中观察 到单一肿瘤细胞、各种大小的肿瘤细胞群体、血管、血湖(blood lake)和基 质细胞的混合模式(肿瘤外观暗色，环绕染色稍轻的基质细胞；箭头指向 病变中的血湖)。

图12显示VEGF增加了人成纤维细胞的趋化性迁移率。用人包皮成 纤维细胞进行的细胞迁移跨孔(transwell)分析显示与对照和10％的FBS相 比，与VEGF的浓度相关，VEGF大大增加了成纤维细胞的趋化性迁移率。

图13A-13C显示VEGF的表达增加了来自他莫昔芬处理小鼠的原发 肿瘤中的促结缔组织生成的反应。上皮细胞标记、细胞角蛋白的免疫组织 学染色显示增加了在用Dox处理的小鼠中的原发肿瘤中的促结缔组织生 成的反应。图13A显示没有用诱导VEGF表达的Dox处理的动物中的促 结缔组织生成的反应。图13B显示用诱导VEGF表达的Dox处理的动物 中的促结缔组织生成的反应。在用他莫昔芬处理的小鼠中，VEGF的诱导 从10％的每视野的基质细胞到约40％的每视野基质细胞增加了促结缔组 织生成的反应的水平(图13C)。

图14显示VEGF的表达增加了来自他莫昔芬处理的小鼠的原发肿瘤 的bFGF含量。通过用制备自他莫昔芬处理的小鼠的肿瘤裂解物进行的 ELISA分析来确定bFGF含量。bFGF在来自在饮用水中接受了Dox的小 鼠肿瘤中明显增加。这可以通过用VEGF诱导的肿瘤中的高水平的基质含 量来起作用。通过按照生产商的说明书来使用来自R&DSystems Minneapolis，MN的bFGF ELISA试剂盒来进行这项分析。

发明详述

乳腺癌中增加的VEGF水平与抗-雌激素疗法的抗性、增加的肿瘤细 胞增殖和肿瘤转移相关联。为了研究VEGF在体外和体内，在这些过程中 的作用，开发可诱导的人VEGF基因表达系统。使用以Dox调节的方式 表达VEGF的改进的可tet诱导的基因表达系统来开发一些ER-阳性 MCF-7衍生的细胞系，将其称作C9V细胞系(Qu等，Gene，2004，327， 61-73)。关于这些细胞系，开发了乳腺癌的异种移植物小鼠模型以研究 VEGF表达和/或过量表达的效果。重要的是，使用这种异种移植物模型产 生的肿瘤具有胞质VEGF的临床相关水平。如用于本发明书时，VEGF包 括VEGF-A及其衍生物。术语衍生物包括，但不限于“片段”、“简并变 体”、“变体”、“突变体”、“类似物”和“化学衍生物”。术语“片段”意 指VEGF氨基酸序列的任何多肽亚类或任何编码所述多肽的核酸，所述多 肽亚类合并VEGF的5个或更多的顺序或连续的氨基酸(诸如但不限于 VEGF165)。VEGF的类似物涵盖VEGF的各种同种型和剪接变体，其包括 但不限于：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、和VEGF206。

已知在编码具体氨基酸的密码子中有大量丰余部分。因此，本说明书 指向那些包含备选密码子的核酸序列，所述备选密码子编码VEGF或其片 段中相同氨基酸的最终翻译物。为此说明书的目的，将具有一个或多个备 选的密码子的核酸序列定义为“简并变体”。将变体定义为包含保守性氨 基酸变化的VEGF分子及编码所述变体的核酸，所述氨基酸变化，诸如， 但不限于可能不导致多肽的功能性的变化的缬氨酸对亮氨酸的置换或天 冬酰胺对谷氨酰胺的置换。还将在翻译的VEGF多肽(“突变体”)和编码 所述突变体多肽的核酸中的突变也包括在本发明书范围内。这种突变可以 分离自组织细胞系或通过重组机制可以被引入。这种突变体可以或不可以 实质上改变表达的VEGF多肽的最终物理特性。突变体的改变的特性的实 例包括，但不限于在酶对底物的亲和性或受体对配体的亲和性中的变化。

术语“化学衍生物”指包含附加的化学部分或氨基酸的VEGF，所述 化学部分或氨基酸不是基础VEGF分子的正常部分，但是实质上不改变其 结构。如果两个分子在它们各自氨基酸序列中具有至少75％的相同性，分 子在结构方面与VEGF“基本相似”。

在一个实施方案中，VEGF是VEGF165。VEGF165的氨基酸序列显示 于SEQ ID NO：1中。VEGF206的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2中。

开发具有可调型VEGF表达的细胞系

MCF-7细胞是来自一位69岁女性的胸腔积液的人乳腺癌细胞。当将 MCF-7细胞皮下地引入裸鼠中时，其是ER-阳性的、雌激素反应性的、抗 雌激素敏感性的并且显示最小的侵入力。在这个实施方案VEGF165中，使 用两种核酸载体来引入VEGF：1)双顺反子Tet-反式激活蛋白表达载体 (pBTE)；和2)控制VEGF表达的Tet-反应性元件载体(pTRE-hVEGF)(图 1)。如方法部分所描述的构建载体pBTE。pBTE合并了许多修饰，其导 致在人细胞24中VP16毒性减少、基础转录活性减少和Dox敏感性的增加。 将tet-反式激活蛋白作为双顺反子信息的部分表达，所述双顺反子信息的 部分包括与赋予抗杀稻瘟素的第二套编码序列连接的下游内部核糖体进 入位点，由此容许选择维持tet-反式激活蛋白表达的细胞。通过稳定的转 染，将这些载体整合到ER-阳性、Lac-Z标记的MCF-7细胞的染色体DNA 中，导致了以Dox调节的方式表达或过度表达VEGF的MCF-7衍生细胞 系(包括但不限于称为C9V的这种细胞系)。

如所述，用抗生素杀稻瘟素和通过用来自以和不以Dox处理的细胞 培养物的条件培养基进行的hVEGF ELISA来选择表达VEGF的克隆。以 抗-VEGF抗体进行的条件培养基的蛋白质印迹显示分泌的VEGF被Dox 紧密控制(图2)。和亲本MCF-7细胞(称为MCF-7)和组成性表达VEGF的 细胞系(称为MLV-165-16)一起，将人，重组VEGF165用作对照。当与Dox 接触时，两个典型克隆，C9V4和C9V18显示增加的VEGF的表达。高分 子带可以显示VEGF翻译后修饰。

VEGF对于体外细胞增殖或他莫昔芬敏感性没有影响。这与MCF-7 和C9V细胞不表达VEGF受体R1和R2蛋白的观察是一致的。C9V细胞 在培养基中存在和缺乏VEGF的情况下以相似的速率生长，并且对4-羟 基他莫昔芬保持着相等的敏感性(图3)。因此，VEGF似乎对C9V细胞的 增殖并不具有自分泌效应。FGF和雌激素确实刺激C9V细胞的生长(图3)。

本说明书详细描述一种方法，所述方法制备修饰的人乳腺癌细胞系以 将表达的VEGF增加到临床上相关水平。在一个实施方案中，所述细胞系 是MCF-7细胞系。但是，还可以使用其它乳腺癌细胞系，诸如T47D或 ZR-75-1。提供的方法的改进包括在本发明范围内，所述改进对于本领域 技术人员是显而易见的。此外，可以将除所述方法之外的方法，诸如瞬时 转染，用于产生修饰的细胞系以增加VEGF的表达到临床上相关水平。认 为这些备选的方法也包括在本发明范围内。

开发表达VEGF的异种移植物小鼠模型

VEGF的表达以一种附加于由雌激素提供的促有丝分裂的刺激的方式刺 激乳腺肿瘤的生长

VEGF的表达以一种附加于由雌激素提供的促有丝分裂的刺激的方 式刺激乳腺癌的生长。为了研究VEGF的表达在体内对乳腺癌细胞生长的 影响，将C9V细胞接种到切除卵巢的裸鼠的乳房颊脂垫(fat pat)中。将 接种的小鼠分成三组：1)在整个实验过程中，在它们的饮用水中接受 0.05mg/ml Dox的组1；2)在整个实验过程中，在它们的饮用水中接受 0.2mg/ml Dox的组；和3)在整个实验过程中接受适当浓度的蔗糖的组 3(阴性对照)。向所有的三组小鼠补充雌激素丸以提供最大的C9V细胞增 殖。一周两次对肿瘤体积进行监控(图4A)。在60天过程的末尾，切除肿 瘤并且制备它们的细胞裂解物以通过ELISA分析测定胞质VEGF的含量 (图4B)。平均肿瘤体积和来自每组小鼠的异种移植物中的胞质VEGF的 量与在小鼠的饮用水中供给的Dox浓度具有相关性(图4A和4B)。通过饮 用水继续向补充雌激素小鼠施用Dox导致肿瘤体积的显著增加并且提高 了胞质肿瘤VEGF的含量。

与显示VEGF在体外对C9V细胞的增殖没有自分泌效应的结果比较， 该体内结果显示VEGF对乳腺癌的发展具有旁分泌效应，并且这种旁分泌 效应附加于由雌激素提供的促有丝分裂刺激。与这种假说一致的，用这种 细胞增殖标记Ki-67进行的免疫组织化学染色显示Dox诱导的VEGF表 达增加了异种移植物中的增殖细胞的百分比约两倍(图5A-5D)。当异种移 植物与雌激素接触时，肿瘤细胞的显著部分染色对于Ki-67染色为阳性， 说明了雌激素刺激乳腺癌生长(如预期的)(图5C和5D)。当Dox与雌激素 结合施用时，Ki-67阳性细胞的百分比增加，说明了VEGF刺激的增长通 过附加于雌激素生长刺激的机制进行(图5D)。与雌激素的施用比较(比较 图5A与图5C)，抗-雌激素他莫昔芬的施用减少了对于Ki-67染色为阳性 的肿瘤细胞的量。当Dox与他莫昔芬结合施用时，增加了Ki-67阳性细胞 的百分比(图5D)，再次说明了VEGF刺激的生长通过独立于雌激素生长 刺激的机制进行。

由Dox诱导的VEGF的水平是临床上相关的，范围是0.6ng-20ng的 VEGF/mg的总胞质蛋白质(图4B)。包括845个乳腺癌患者的临床研究显 示VEGF表达的中位值水平是0.22ng/mg的总胞质蛋白质。接受他莫昔芬 用于他们的晚期疾病并具有超过中位值的VEGF水平的患者与明显更短 的复发后存活时间相关。而且，肿瘤VEGF水平在1.73ng/mg-542ng/mg 范围内的患者的存活率明显要低于VEGF水平在0-0.22ng/mg范围内和 0.22ng/ml-1.73ng/mg范围内的患者的存活率。本项研究中异种移植的小鼠 中的肿瘤VEGF表达在与临床上侵略的或获得他莫昔芬抗性的乳腺癌相 关的范围内。在本说明书中，术语“临床上相关”意味着在一个修饰的， 人细胞系(诸如被修饰以表达本文所述的VEGF的MCF-7细胞)中表达的 VEGF的浓度，其在与晚期乳腺癌肿瘤(诸如已经获得他莫昔芬抗性的肿 瘤和已经获得转移能力的肿瘤)统计上关联的VEGF浓度范围内。在一个 实施方案中，在修饰的人细胞系中表达的VEGF的浓度在约 0.2ng-500ngVEGF/mg总胞质蛋白质范围内。在另一个实施方案中，在修 饰的人细胞系中表达的VEGF的浓度在约0.5ng-250ngVEGF/mg总胞质 蛋白质的范围内。在另一个实施方案中，在修饰的人细胞系中表达的 VEGF的浓度在约1.7ng-100ng VEGF/mg总胞质蛋白质范围内。本发明书 描述通过将编码VEGF蛋白质的核酸构建体整合到亲本细胞系的基因组 中去来修饰人细胞系。但是，将VEGF的表达增加到临床上相关水平的修 饰应该被认为在本发明范围内。另外地，其它乳腺癌细胞系的应用应该也 被认为在本发明范围内。因此，所述的异种移植小鼠模型是精确的关于 VEGF在乳腺癌发展和进展中作用的体内模型，并且可以用于进一步研究 VEGF在人乳腺癌进程中的效应以及分离抑制这些进展和发展的化合物。 还可以将这种模型用于乳腺癌疗法的临床前功效研究。

为了进一步鉴定上述的异种移植小鼠模型，通过用小鼠内皮细胞 特异性标记PECAM-1进行的免疫组织化学染色(图6A和6B)对肿瘤微 导管密度进行特征鉴定。与Dox不存在时的对照异种移植组织(图6A) 相比，当VEGF的表达被Dox诱导时在异种移植组织中观察到增加的 微导管密度(图6B)，证明了VEGF的生血管作用。这与在人原发乳腺 癌中的临床研究是一致的，所述研究是升高的胞质VEGF水平与增加 的微导管密度是相关的。

VEGF对乳腺癌的生长的作用是可逆的。在与上述相似的实验中，将 C9V细胞接种到切除卵巢的裸鼠的乳房颊脂垫中。将接种的小鼠分成三 组：1)在整个实验的60天时期中，在它们的饮用水中接受了0.2mg/ml Dox 的组1；2)在实验的最初11天，在它们的饮用水中接受了0.2mg/ml Dox 的组2；和3)接受了适当浓度的蔗糖的组3(阴性对照)。对所有的三组小 鼠补充雌激素丸以提供最大的C9V细胞的增殖(图7)。仅接受了11天的 Dox的小鼠的肿瘤生长速率在Dox去除后大大减少，说明了在肿瘤发展 的早期阶段VEGF的表达或作用的抑制可以稳定肿瘤的进展。

VEGF的表达诱导抗-雌激素抗性

临床研究已经揭示高水平的肿瘤VEGF与抗-雌激素疗法，诸如他莫 昔芬疗法的有效性减少，以及治疗后的复发具有相关性。为了进一步研究 VEGF在抗-雌激素抗性上的作用，调查了在用抗-雌激素治疗的异种移植 小鼠中的肿瘤生长，在所述小鼠中，肿瘤VEGF的表达为Dox所诱导。 通过将C9V细胞注射到切除了卵巢的裸鼠的乳房颊脂垫中，肿瘤开始生 长。如所述，给小鼠补充雌激素。当大约10天后肿瘤的大小达到 150-200mm3时，用他莫昔芬丸取代雌激素丸。在这点上，将小鼠分成两 组，给一组提供含蔗糖的饮用水(阴性对照)，而给另一组在饮用水中提供 Dox。Dox诱导的VEGF表达提供C9V异种移植小鼠的持续肿瘤生长(图 8A和8B)。相反，在没有在饮用水中接受Dox的他莫昔芬处理的小鼠中， 肿瘤变得静止并最终退化(图8A和8B)。

这说明VEGF的肿瘤表达使ER-阳性的乳腺癌成为他莫昔芬抗性的。在 不限于VEGF能诱导肿瘤细胞中他莫昔芬抗性的其它机制的情况下，通过 刺激基质细胞去释放肿瘤生长因子诸如，但不限于FGF、EGF和调蛋白， VEGF激活备选的细胞生长的ER-不依赖途径是可能的。

VEGF的表达诱导转移

转移瘤，而不是原发肿瘤是大多数乳腺癌死亡的原因。在他莫昔芬处 理患者中的胞质VEGF水平的升高与较差的总体存活关联。在具有肿瘤的 裸鼠中调查了VEGF的过量表达对转移发展的影响。用细菌编码β-半乳 糖苷酶的lacZ基因转染C9V细胞系。这提供了小鼠组织的X-gal着色以 检测远距离位点的肿瘤细胞散布和生长。肺的X-gal着色显示对VEGF表 达的诱导导致了在具有同位异种移植物的小鼠中自发的肉眼可见的转移， 对所述小鼠补充雌激素或用他莫昔芬处理。在一些具有两个细胞系C9V4 的C9V18异种移植小鼠实验中观察到VEGF诱导的肺转移瘤。用肿瘤细 胞尾静脉注射进行的实验性转移分析也证明了VEGF诱导的转移。

将小鼠实验中的肺转移瘤发生率归纳于表1中。当小鼠接受VEGF诱 导时，总共9个补充雌激素的小鼠中的6个和总共9个他莫昔芬处理小鼠 中的4个出现了肺转移瘤。相反，在没有接受Dox的任何小鼠的肺中都 没有发现转移瘤。此外，从饮用水中去除Dox不仅减少肿瘤生长速率， 还明显减少了肺转移瘤的发生率。当在第11天多西环素的去除抑制了 VEGF的过量表达时，在6个小鼠中没有观察到肺转移瘤。这些结果说明 了VEGF的表达促进了肺转移瘤以及通过抑制VEGF发信号可以阻止或 延缓转移的发展。图9A是表示在具有肿瘤的小鼠中的X-gal染色的肺转 移瘤的示图。肿瘤样品的H&E组织学染色(图9B)证实了通过X-gal染色 所说明的肺的肉眼可见的转移瘤。左侧的图表示C9V异种移植的小鼠与 诱导VEGF的表达的Dox和雌激素接触。右侧图表示C9V异种移植小鼠 与诱导VEGF的表达的Dox和4-羟基他莫昔芬接触。

VEGF的表达增加播散的肿瘤细胞的建群和增加成纤维细胞的趋化 性迁移率

转移过程由一系列步骤组成，其中肿瘤细胞从原发肿瘤渗漏到血液循 环中，散布到继发位点，并且在停滞在或侵入新器官。随之而来的步骤， 在靶器官环境中建群以形成肉眼可见的转移瘤并且增殖以形成肉眼可见 的转移病变是转移发展中的限制性步骤。为了进一步调查在哪个步骤中 VEGF对转移的发展具有关键性作用，通过尾静脉注射将肿瘤细胞直接引 入循环中并且通过用针对细胞角蛋白的抗体和上皮细胞标记进行免疫染 色来检查小鼠肺中的播散性肿瘤细胞的模式。

尾静脉注射2小时后，许多单一肿瘤细胞出现在取自提供或不提供多 西环素处理的小鼠组中的肺中，证实了注射的成功(图10A和10C)。但是， 四周后，在没有提供给Dox的小鼠肺中没有检测到肿瘤细胞(图10B)。推 测播散性肿瘤细胞通过程序性细胞死亡而死亡。反之，在用多西环素处理 的小鼠中则已经频繁发现基质细胞环绕的肿瘤细胞群体(图10D)。这些群 体被基质细胞所环绕，形成了所谓的促结缔组织生成的反应。在来自具有 原发肿瘤的小鼠的转移性肺中也容易地发现具有促结缔组织生成的相似 的肿瘤细胞群体。组织学检查揭示大部分这些基质细胞是成纤维细胞。该 结果显示了通过在新血管生成之前与基质细胞相互作用，VEGF的表达增 加了播散性肿瘤细胞存活和建群，一种除了其生血管作用之外的新功能。

在尾静脉注射10周后，在没有供应以多西环素的小鼠中仍然没有检 测到播散性肿瘤细胞，而用多西环素处理的小鼠形成了肉眼可见的肺的转 移瘤。如在(图11)所显示的，在这些转移病变中，单一肿瘤细胞的混合模 式、各种大小的肿瘤细胞的群体、血管和血湖被基质细胞所环绕。来自尾 静脉注射的小鼠和具有原发肿瘤的小鼠中的转移病变都含有估计为约 50％-80％结缔组织生成/视野的高水平基质含量。

促结缔组织生成反应，或结缔组织生成是一种经常对乳腺癌观察所见 的针对癌的基质反应(占优势的是成纤维细胞)。在人癌症中，可以在原发 肿瘤部位和肿瘤转移部位都观察到结缔组织生成。在许多常见癌诸如乳腺 癌、结肠癌、胃癌和胰腺癌中，所述基质包含大部分的肿瘤块，在一些情 况中，占超过90％的肿瘤块(Elenbaas等，Exp.Cell Research，264，169-184， 2001)。但是，结缔组织生成很少在包括转基因和异种移植模型的动物癌 症模型中观察到。促结缔组织生成反应的特征在于致密胶原基质的存在， 其负责肿瘤“肿块”的临床表现形式。证据提示在促结缔组织生成中观察 到的胶原蛋白和其它材料由间质组织中存在的肌成纤维细胞合成。已经提 出了一些说明肌成纤维细胞活化和胶原蛋白合成的机制，诸如细胞因子机 制和微血管损伤的机制(具有类似于创伤愈合的特点)，和通过肿瘤细胞释 放的生长因子进行的肌成纤维细胞的旁分泌活化。

对被每个表达VEGF的肿瘤细胞的群落围绕的成纤维细胞基质细胞 观察显示VEGF可以增加成纤维细胞基质细胞到肿瘤细胞的趋化性迁移 率。因此，将人包皮成纤维细胞用于评价VEGF是否影响体外成纤维细胞 趋化性迁移率。从细胞迁移跨孔(trans-well)分析的结果显示VEGF却是大 大增加了成纤维细胞的趋化性迁移率(图12)。这种结果显示肿瘤释放的 VEGF吸引并与成纤维细胞基质细胞相互作用以诱导重建肿瘤微环境；并 且这种新环境适合于肿瘤细胞的存活和增殖。但是，VEGF与其它类型的 基质细胞的相互作用可以在转移进程中等同重要地起着作用。

VEGF的表达诱导促结缔组织生成的反应并且增加原发肿瘤中的FGF含 量

用所述的小鼠异种移植模型进一步检查了VEGF过量表达诱导肿瘤 微环境的变化和促进旁分泌发信号机制以赋予他莫昔芬抗性的表型的能 力。通过使用细胞角蛋白作为上皮细胞标记进行的免疫组织学染色，观察 到了在原发肿瘤中的VEGF-增加的促结缔组织生成的反应。图13A-13C。 图13A显示对在接种C9V细胞60天后的他莫昔芬处理的小鼠的原发肿瘤 样品进行细胞角蛋白染色的表示图，所述小鼠没有经过诱导VGEF表达的 Dox处理，而图13B显示对在接种C9V细胞60天后的他莫昔芬处理的小 鼠的原发肿瘤样品的表示图，所述小鼠经过诱导VGEF表达的Dox处理。 在没有VEGF诱导的情况下，在肿瘤部分的大约10％的区域观察到结缔 组织生成。然而，随着VEGF的诱导，在大约40％的肿瘤部分中观察到 结缔组织生成(图13C)。

VEGF表达增强了原发肿瘤中的促结缔组织生成反应，能够影响基质 蛋白、存活因子、生长因子和肿瘤环境中的其它蛋白质含量。对他莫昔芬 治疗的肿瘤中的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达进行检查。图 14显示如通过ELISA分析所测定的肿瘤裂解物中bFGF含量的量化。在 没有Dox处理的情况下，肿瘤裂解物中bFGF的水平在750pg/mg裂解物 蛋白的范围内。不过，Dox诱导的VEGF表达显著提高肿瘤裂解物中bFGF 的水平(bFGF的水平在2500pg/mg裂解物蛋白的范围内)。此结果显示 VEGF表达能够提高在裸鼠C9V异种移植物中的bFGF的含量。已经显示 bFGF参与细胞生长、细胞迁移、分化、基质反应和组织构成以及血管发 生。因此，基质细胞与肿瘤细胞相互作用可以由诸如bFGF和其它的生长 因子进行介导。据报道多种生长因子、生长因子受体或生长因子信号中间 体的组成性表达能够允许ER阳性的乳腺癌细胞获得在不存在雌激素或存 在抗雌激素的情况下生长的能力(Schiff等，Clin.Cancer Res.，9：447S-454S， 2003)。这些资料提示肿瘤VEGF表达有助于在原发性和转移的位点中的 肿瘤细胞建立适于其生存和生长的微环境的机制。

可以刺激表达所述构建体，诸如C9V4和C9V18的MCF-7细胞以 表达临床相关水平的VEGF。尽管对于MCF-7细胞本身并非促有丝分裂 的，但VEGF提供成纤维细胞、内皮细胞和其它基质细胞组分的旁分泌刺 激。这些细胞依次提供肿瘤细胞以多种因子，其有助于肿瘤细胞的生长和 存活。此外，这些因子有助于局部微环境的变换，诸如结缔组织生成和血 管发生的诱导，允许在原发性肿瘤位点和肿瘤转移灶的继发性位点中肿瘤 细胞的生长。而且，受刺激的基质细胞组分可以提供有助于肿瘤侵袭和转 移过程的趋化性因子。

所述的模型系统提供临床相关模型系统以研究VEGF对于癌症发展， 特别是乳腺癌发展的作用。所述模型系统提供一种方法以研究VEGF参与 多种途径，包括乳腺癌生长，乳腺癌细胞对于抗雌激素治疗的耐受性的机 制，转移和结缔组织生成。所述的异种移植模型是独特的，原因在于表达 临床相关范围的VEGF并且VEGF的表达可以通过添加抗生素Dox进行 紧密控制。而且，所述异种移植模型具有一般与人乳腺癌相关联的特性， 诸如促结缔组织生成的反应。因此，本文所述的异种移植模型提供超出本 领域目前已有模型的优势。

在本说明书中所有引证的论文、书、专利、网站和其它出版物都被认 为并入作为参考。只为了要求外国优先权，添加了后附的权利要求。

材料和方法

材料

Lipofectamine PlusTM，Zeocin，the pZeo-SV质粒，和杀稻瘟素获自 Invitrogen(Carlsbad，CA)。质粒pTet-on，pTRE获自Clontech(Palo Alto， CA)。改进的Modified Eagle′s培养基(IMEM)和胎牛血清获自Life Technologies(Gaithersburg，MD)。

载体构建

载体pBTE(图1)的构建：包含在质粒pUHrt 62-1中的修饰的tet-反式激 活蛋白rtTA2S-M2获自WolfgangHillen博士18。将RtTA2S-M2亚克隆入 如下所述生成的载体pEF6-IVS-IRES-bsd，形成一种表达质粒，它产生一 种编码rtTA2S-M2和杀稻瘟素抗性基因(BsdR)的双顺反子信息。

通过利用pEF6Myc/His A(Invitrogen，Carlsbad，CA)作为亲本质粒构 建pEF6-IVS-IRES-bsd载体。利用pIRES-Neo2(来自Clontech)作为模板 扩增PCR片段IVS-IRES并亚克隆入BcI-NcoI限制性的pEF6 Myc/His A 质粒主链。随后，用来自pcDNA6/TR(Invitrogen，Carlsbad，CA)的CMV IE 启动子替代EF1α启动子以生成最终的双顺反子表达质粒pBTE。

pTRE-hVEGF的构建(图1)：通过用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的 mRNA进行RT-PCR获得包括N端分泌信号肽序列的人VEGF-165形式的 cDNA。将hVEGF165于EcoRI位点亚克隆入pTRE载体(Clontech，Palo Alto，CA)中以生成最终载体pTRE-hVEGF。通过用合适的酶消化和测序来 确认定位和VEGF插入。

产生具有Dox调控的VEGF表达的源于MCF-7的细胞系

用双顺反子表达载体pBTE中的修饰tet-反式激活蛋白对LacZ标记的 MCF-7细胞进行稳定地转染，并用3μg/ml培养基中的杀稻瘟素进行筛选， 命名为C9细胞。用pTRE-hVEGF和一种赋予zeocin耐受性的质粒 pZeo-SV对表达tet-反式激活蛋白的克隆C9进行再转染。于100μg/ml的 水平分离并增殖zeocin耐受性细胞克隆。收集来自包含1％FBS有和无 0.5μg/ml Dox的于IMEM中48小时的每种培养物的条件培养基。利用人 VEGF ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN根据生产商的说明 书)测定条件培养基中VEGF的浓度。对来自每种培养物的细胞数目计数 以使ELISAVEGF值正常化。通过用多克隆抗hVEGF抗体(Santa Cruz， California)进行条件培养基的蛋白质印迹来进一步检查选择的细胞系中分 泌的VEGF的Dox调控的表达。

细胞增殖分析

通过用在无酚红(PRF)-IMEM中的5％活性炭-脱过(stripped)的牛 血清(CCS)进行几次培养基交换来在一天内使用于本分析的细胞脱去雌激 素。然后，以20000细胞/孔将细胞接种在具有相同培养基的24孔板上。 以次日作为0天对三个孔进行计数。将如所示的不同条件加入细胞培养物 中，三次重复。在第三天对每只孔的细胞数量进行计数。重组VEGF和 FGFa蛋白来自于R&D系统，VEGF：20ng/ml；FGF-1：20ng/ml；Tam：4- 羟基他莫昔芬，10-7M，和E2：17-β雌二醇，10-8M。

皮下异种移植和尾静脉注射小鼠实验

在细胞接种前3天给7-8周龄的切除卵巢的无胸腺小鼠饮用仅包含蔗 糖(2.5％)，或包含蔗糖和各种浓度的Dox的水。在细胞接种前1天，将60 天释放的0.72mg-17β雌二醇丸(Innovative Research of America)植入小 鼠中。次日，将悬浮于200ml的50％无酚红的基质胶(Matrigel)(BD Biosciences)的107细胞皮下接种于每只小鼠的乳房颊脂垫中。一周两次测 量肿瘤大小和动物重量。通过Vt(mm3)＝LxW2/2确定肿瘤体积，其中L和 W指每次测量的较大和较小大小。在时程的末尾，切除肿瘤并且将其切 成两半，一半贮存于液氮中并且另一半固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林 溶液中。还收集和固定了来自不同小鼠器官的样品用于组织学检查。

为了分析在肿瘤生长中他莫昔芬抗性，一旦肿瘤达到150-250mm3的 体积，用60天释放的5mg的他莫昔芬小丸(Innovative Research of America) 取代植入的雌激素丸。将小鼠随机分成两组：其中一组的饮用水中包含 0.2mg/ml Dox和2.5％蔗糖，另一组的饮用水中仅包含蔗糖。

在尾静脉注射实验中，将在100μl PBS中的1×106V9V细胞注射到 小鼠尾静脉中并在不同时间点收集肺组织。

在组织中的X-gal着色

将收获的肺和淋巴结部分地固定在10％磷酸盐缓冲福尔马林溶液中 4-6小时，然后用X-gal染色溶液：5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾， 2mM MgCl2，0.02％Nonidet P-40，0.01％脱氧胆酸钠，1mg/ml 5-溴-4- 氯-3-indoyl-β-半乳糖苷(稀释自贮存在二甲基甲酰胺中的40mg/ml的 X-gal并在使用前立刻加入)进行着色。将组织样品于室温在黑暗中染色过 夜。用PBS漂洗组织样品，然后在LEICA解剖显微镜下对染成蓝色的转 移肿瘤细胞进行检查和拍照。将所述样品再次固定在10％磷酸盐缓冲福尔 马林溶液中，石蜡包埋并进行H&E组织学分析。

肺转移和免疫组织化学

将肺样品切成一些条块并用石蜡包埋。将5μm肺的切片、淋巴结和 肿瘤样品进行H&E染色。在LEICA DMLB显微镜下检查转移病变。认为 小鼠肺中直径超过10个细胞大小的转移病变大小是大转移，小于10个细 胞大小的转移病变大小是微转移。对来自每只小鼠的约1cm2的肺切片进 行转移病变的检查。

用在免疫组织化学染色中的抗体是针对上皮细胞标记细胞角蛋白的 多克隆抗体(Keratin Pan Ab-1，来自Neomarkers)、针对小鼠PECAM-1的 大鼠单克隆抗体(Mec 13.3，BD，Bioscience PharMingen)、针对细胞增殖标 记Ki-67的多克隆抗体(Santa Cruz，California)。

肿瘤胞质VEGF水平的测定

将贮存在液氮中的肿瘤样品解冻，解剖去除周围的脂肪，并切成小片。 每100mg组织样品中加入0.5ml的胞质制备缓冲液。用Polytron于50％ 电源功率输出在冰上将组织均浆。通过在干冰上冻融3次将处理组织中的 细胞裂解并通过于高电源功率输出商上进行超声波处理3次每次2秒进一 步分解。将样品在4℃下于12000rpm旋转30分钟。从上清液中收集细胞 溶胶样品，所述上清液用于通过VEGF ELISA进行的VEGF含量测定。 对蛋白质浓度进行测定以计算具体的VEGF含量。细胞溶胶制剂缓冲液包 含10mM Tris pH7.4；1.5mM EDTA；10mM钼酸钠(Sigma，St. Louise，Mu)；1.0mM 1-硫代甘油(Sigma，St.Louise，MO)。

跨孔细胞迁移(趋化性迁移)分析

按照生产商的说明书，通过使用24孔趋化性隔室进行细胞迁移分析， 所述趋化性隔室具有来自BD Bioscience的基质胶(matrigel)包被的8μm 孔大小插入物。用DMEM细胞培养基或用10％FBS加载底隔室并加入 100ng/ml重组VEGF蛋白(来自R&D System)。用2×105包皮成纤维 细胞接种上隔室。于37℃培养4小时之后，将滤器固定，用0.5％的结晶 紫进行染色，并对穿过滤器的细胞进行计数。

        表1 C9V异种移植物小鼠中的转移瘤发生率   接种  处理   小鼠数量   大转移   乳房颊脂垫注射  E2-Dox   10   0  E2+Dox   9   6  在第11天去除Dox   6   0  Tam-Dox   8   0  Tam+Dox   9   4   尾静脉注射  E2-Dox   9   0  E2+Dox   9   3

          发明人：曲智参博士和弗朗斯·科恩博士

本申请要求2003年2月26日递交的美国临时专利号60/449,980的 优先权和利益。本申请中所述的研究由来自国家卫生研究院/国家癌症研 究院(National Institute of Health/National Cancer Institute)的奖金 P50CA89019部分资助。政府可以在本发明中具有某些权利。

                             序列表

<110>UAB研究基金会

<120>人乳腺癌的临床相关动物模型和涉及促结缔组织生成性反应，

     他莫昔芬抗性和转移的VEGF

<130>P67611WO00GP

<150>60/449,980

<151>2003-02-26

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1               5                   10                  15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

            20                  25                  30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

        35                  40                  45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

    50                  55                  60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65                  70                  75                  80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

                85                  90                  95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

            100                 105                 110

Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

        115                 120                 125

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser

    130                 135                 140

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<211>206

<212>PRT

<213>人

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1               5                   10                  15

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Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

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Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

                85                  90                  95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

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Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg

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Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

        195                 200                 205