南方鲇生长激素基因
阅读：1034发布：2020-05-19
专利汇可以提供南方鲇生长激素基因专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了南方鲇的生长 激素 基因，其特征是它以脑垂体的mRNA为模板经RT－PCR，5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列。该序列可作为转基因鱼育种的目的基因 片段 ，也可被插入表达载体(pET－30a(t)、pPIC9K等)构建表达工程菌(BL21(DE3)、BL21等)，生产生长激素。方法简便，成本低廉，加快了经济鱼类生长，在 水 产养殖领域具有应用价值。，下面是南方鲇生长激素基因专利的具体信息内容。
1.一种南方鲇生长激素基因，其特征在于它以脑垂体的mRNA为模板经RT-PCR，获得cDNA的第一链，再依据其它已知鱼类生长激素氨基酸序列保守区LLPEER的三联密码子和SNCTL及终止密码子的三联密码子，设计一对简并引物，正向GHFC 5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’，反向GHRA 5’TCT ACA GGGTRC AGT TKG 3’，以cDNA的第一条链为模板克隆得到生长激素cDNA部分同源分子，然后经5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列，并推导出氨基酸序列，其南方鲇的生长激素的全长cDNA序列如下：1 aaagtctacc tcgagatttc agcaggatct gagaaagttt cttctgggaa aaatggctag 6061 agtgtgggtg ctgctctccg tggtgctggc gagtttgttc tttagtcagg gcgcgacatt 120121 cgagaaccag cgtctcttca acaacgcagt catccgtgtg caacaccttc atcagctggc 180181 tgccaaaatg atggatgact ttgaggaagc tttgctacct gaagaacgca aacagctgag 240241 caagatcttc ccattgtcct tctgcaattc agactccatc gaagctccat caggcaaaga 300301 cgaaacccag aagagttctg tgttgaagct gctgcacacc tcctaccgtc tgatcgagtc 360361 atgggagttc cccagtaaga acctgggcaa ccccaatcac atctcagaga agctggctga 420421 cctgaaaatg ggcatcggtg tgcttatcga gggatgtctg gatggacaaa ccagcctgga 480481 tgagaacgac tctctggctc cacccttcga ggatttctac cagaccctaa ccgagggaaa 540541 cctgaggaag agcttccgtc tgctctcctg cttcaagaag gacatgcaca aagtggagac 600601 ctatctgagc gtggccaagt gcaggagatc cctggattcc aactgcaccc tgtagagggc 660661 atgatttagc ctcagcctgt gatttgaatt gttttaatag tccaggtgta gctaaattat 720721 taatcctttt cccctggatt tcacttctaa ctttaagtat ttattttctc ctcctccatt 780781 ctcatgtctc ggcaacttta aggttgtaaa atgggactgg tttcacaacg gtgctatgca 840841 aatccagatt tctatcaaat aatgaccagc atatgataac caggatggtg gaagtatacg 900901 ctcctgcctt atgaatatat attatatttt tcatattaga gtctattcta tatactttta 960961 aagtacgaat aataatttgc tatttagctt tgaataattc ctctgtgtaa aaaaaatctc 10201021 tgtctttgtt tttgtggatt tccaataaacctaatcttcg cattaaaatc aaaaaaaaaa 10801081 aaaaaaa
2.根据权利要求1所述的南方鲇生长激素基因，其特征在于南方鲇的生长激素基因编码的氨基酸序列如下：Met Ala Arg Val Trp Val Leu Leu Ser Val Val Leu Ala Ser Leu Phe Phe Ser Gln Gly-20 -15 -10 -5Ala Thr Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu Leu Pro Glu Glu Arg Lys20 25 30 35Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser40 45 50 55Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Set Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu60 65 70 75Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser Glu Lys80 85 90 95Lue Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly Cys Leu Asp Gly Gln Thr100 105 110 115Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr120 125 130 135Glu Gly Asn Leu Arg Lys Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys140 145 150 155Val Glu Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr Leu160 165 170 175-52 AAAGTCTACCTCGAGATTTCAGCAGGATCTGAGAAAGTTTCTTCTGGGAAAA -121 A T F E N Q R L F N N A V I R V Q H L H 40121 CAG CTG GCT GCC AAA ATG ATG GAT GAC TTT GAG GAA GCT TTG CTA CCT GAA GAA CGC AAA 18041 Q L A A K M M D D F E E A L L P E E R K 60181 CAG CTG AGC AAG ATC TTC CCA TTG TCC TTC TGC AAT TCA GAC TCC ATC GAA GCT CCA TCA 24061 Q L S K I F P L S F C N S D S I E A P S 80241 GGC AAA GAC GAA ACC CAG AAG AGT TCT GTG TTG AAG CTG CTG CAC ACC TCC TAC CGT CTG 30081 G K D E T Q K S S V L K L L H T S Y R L 100301 ATC GAG TCA TGG GAG TTC CCC AGT AAG AAC CTG GGC AAC CCC AAT CAC ATC TCA GAG AAG 360101 I E S W E F P S K N L G N P N H I S E K 120361 CTG GCT GAC CTG AAA ATG GGC ATC GGT GTG CTT ATC GAG GGA TGT CTG GAT GGA CAA ACC 420121 L A D L K M G I G V L I E G C L D G Q T 140421 AGC CTG GAT GAG AAC GAC TCT CTG GCT CCA CCC TTC GAG GAT TTC TAC CAG ACC CTA ACC 480141 S L D E N D S L A P P F E D F Y Q T L T 160481 GAG GGA AAC CTG AGG AAG AGC TTC CGT CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAC AAA 540161 E G N L R K S F R L L S C F K K D M H K 180541 GTG GAG ACC TAT CTG AGC GTG GCC AAG TGC AGG AGA TCC CTG GAT TCC AAC TGC ACC CTG 600181 V E T Y L S V A K C R R S L D S N C T L 200601 TAG AGGGCATGATTTAGC CTCAGcCTGT GATTTGAATT GTTTTAATAG TCCAGGTGTA GCTAAATTAT 668*669 TAATCCTTTT CCCCTGGATT TCACTTCTAA CTTTAAGTAT TTATTTTCTC CTCCTCCATT 728769 CTCATGTCTC GGCAACTTTA AGGTTGTAAA ATGGGACTGG TTTCACAACG GTGCTATGCA 788789 AATCCAGATT TCTATCAAAT AATGACCAGC ATATGATAAC CAGGATGGTG GAAGTATACG 848849 CTCCTGCCTT ATGAATATAT ATTATATTTT TCATATTAGA GTCTATTCTA TATACTTTTA 908909 AAGTACGAAT AATAATTTGC TATTTAGCTT TGAATAATTC CTCTGTGTAA AAAAAATCTC 968969 TGTCTTTGTT TTTGTGGATT TCCAATAAAC CTAATCTTCG CATTAAAATC AAAAAAAAAA 10281029 AAAAAAA 1035
南方鲇生长激素基因
技术领域
背景技术
南方鲇(Silurus meridionalis)属鲇形目，鲇科，鲇属，俗称河鲇，大河鲇。主产于长江流域的大江河中，是一种以鱼为主食的大型经济鱼类，常见个体重约2～5公斤，最大个体可达30公斤以上。它与分布很广的那种小个体鲇(俗称土鲇、鲇拐子)是同属不同种。南方鲇含肉率高，蛋白质和维生素含量丰富，肉质细嫩，味道鲜美，是产地群众极为推崇的高级鱼之一。四川省水产研究所从1985年即开始对其进行了移养驯化和池塘人工养殖的探索性试验，结果表明，南方鲇具有生长快(在池养条件下，当年4月份繁殖的鱼苗到年底平均尾重可达0.4～0.5公斤，第二年可长到1.5公斤，第三年达2.7公斤)、养殖周期短(当年鱼苗饲养5～6个月即可成为商品鱼)、适应低温能力强(我国南、北方都能在野外自然越冬)、食性可以改变(由专吃活鱼虾转化为吃配合颗粒饲料)、消费市场广阔(国内外都畅销)、经济效益较高(亩利润是养殖常规品种的3～6倍)并具备出口创汇的竞争潜力等优点。
生长激素(growth hormone，GH)是由垂体间叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链蛋白质激素，它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。能影响几呼所有的组织类型和细胞，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调理蛋白质、糖及脂肪的代谢。生长激素发挥功能主要由两个途径：一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长激素介质，再经生长激素介质间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论哪一种方式都需要首先同细胞表面特异性受体结合再由受体介导激发一系列生化事件并最终产生生物效应。(Sun et al.Foreign Medical Sectoin ofPathophysiology and Clinical Medicine 1999，19(1))鱼类生长激素(fish growth hormone，fGH)是由鱼脑垂体间叶细胞分泌的一种单一亚基的多肽激素，它的基本功能是促进鱼体生长发育和参与多种促合成代谢作用(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)，被认为是最具潜力的鱼类生长促进剂。由于鱼类生长激素能够大大加快鱼类生长，在水产养殖领域有重大的应用价值，日益引起人们的关注。(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)目前，鱼类生长激素研究逐渐深入至分子水平，已有大马哈鱼、虹鳟、银大马哈鱼、鳗鲡、金枪鱼、罗非鱼、鲤、牙鲆、真鲷、草鱼、大西洋鳜等的重组生长激素cDNA被分离与克隆；其中鳗鲡、罗非鱼、金枪鱼、虹鳟已在工程菌或动物细胞中高效表达。(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol28，No5 553-556)鱼类生长激素在水产养殖中应用的研究已广泛地开展，由于鱼类生长激素在鱼体内本身含量很少，要通过从鱼体内直接提取，成本较大，工艺也比较的繁琐，所有现阶段的应用研究主要集中在两个方面：转生长激素基因鱼的育种和鱼生长激素基因工程的研究。(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)而应用以上生物工程技术的前提是首先获得鱼类生长激素的完整cDNA序列，这是一切工作的基础。
鱼类生长激素基因是最早用于转基因鱼育种的目的基因。运用转基因技术将含鱼生长激素基因的重组DNA分子导入鱼的受精卵中，使它在鱼体内与染色体发生重组作用。这样外源的生长激素基因就能够在鱼体内稳定存在并得以表达而产生相应的生物学功能(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)。
1985年，朱作言等首先将外源人类生长激素基因采用显微注射法导入金鱼受精卵中，使其整合并表达人生长激素(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5553-556)。从这以来转生长激素基因鱼的研究已取得相当大的进展。泥鳅、鲫鱼、青鱼、虹鳟、沟鲶、鲑鱼、鲂等生长激素基因的导入都相继取得成功，还获得了转基因鱼可以将外源基因向子代稳定遗传的证据(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)。Zhang等(1990)向鲤鱼导入虹鳟，生长速度比普通鱼类快而且这种特性可遗传。(Zhang P.Mol Reprod Devel，1990，25(1)：3-13)Du等(1992)将全鱼生长激素基因导入大西洋鲑，成功地获得比对照组鱼大4-6倍的转基因鱼(Du，S.et al.，1992 Biotechnology，10：176-181)。Devlin等(1994)将红大马哈鱼的全鱼生长激素基因导入银大马哈鱼，取得了比对照组鱼生长快11倍的转基因鱼(Devlin，R H.et al.，1994，Nature，371(6 494)：209-210)。.梁利群等(1994)将外源大马哈鱼生长激素基因(编码区约3.5kb的DNA片段，包括内含子)导入鲫鱼，并证实其对鲫鱼有促生长作用(梁利群等.生物技术，4(5)：24-26，1994)。Tsai等(1995)，Xu等(1995)采用精子携带或电脉冲发将全鱼生长激素基因分别导入泥鳅和牙鲆中，也获得了比对照组鱼生长快2.5倍的转基因鱼。(Tsai，H.J etal.，1995，Can.J.Aquat.Sci.，52(4)：776-787.Xu，B.et al.，1995 Proceeding of FourthAsian Fisheries Forum，Edited and Published by Editorial Committee of Journal ofFisheries of China(Shanghai)，p.80.)通过将外源生长激素基因导入受体鱼并使之表达，能够达到使养殖鱼类快速生长的目的，特别是全鱼基因元件(由鱼类自身高效表达的启动子和鱼生长激素基因构成)的使用，既可提高表达水平，又可消除哺乳类生长激素引入鱼体对消费者产生的食用疑虑。转基因鱼研究在理论和方法上的最终突破，对缩短主要经济鱼类的养殖周期，提高产量和经济效益，乃至对整个水产养殖将产生深刻的变革(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)。
鱼类生长激素为单一多肽，没有亚基，不需要糖基化修饰，而且二硫键较少，容易复性，特别适用于进行基因工程表达(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊)，而且重组生长激素与天然生长激素有相同的生物活性，引入鱼体不会产生积累，不影响鱼体的组成成分。(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)因此，将鱼生长激素基因经过体外重组转入表达宿主菌，构建稳定表达的工程菌，外源基因在宿主菌体内大量表达，纯化后可以得到相应的生长激素。实验证明用基因工程方法生产的重组鱼类生长激素具有生物学活性，能够通过口服经肠道被鱼体吸收，具有很强的促鱼体生长作用(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊)。通过改进工艺，降低成本可望作为饲料添加剂应用于水产养殖业，产生可观的经济效益。
目前进行的鱼类生长激素的基因工程表达主要是通过大肠杆菌和酵母进行表达。简清等(1999)用PCR技术对鲑鱼生长激素基因cDNA进行改造，再将改造后的基因克隆到大肠杆菌表达质粒pBV220，构建重组鲑鱼生长激素基因表达质粒pBVGH18，并在大肠杆菌中获得表达，表达量约占细胞可溶性总蛋白的10％。表达产物经初步纯化和复性后作为饲料添加剂投喂罗非鱼，经过五周的喂饲后，实验鱼的体重和体长增长率分别比对照快119.5％和64.5％(白俊杰等，农业生物技术学报，1998，6(4).简清，白俊杰淡水鱼业，1999，29(3)：3-5.)。陈丹等(1998)在甲醇酵母中成功地表达了鲈鱼生长激素。通过技术克隆得鲈鱼生长激素基因，与含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因启动子的载体pHIL-D进行体外重组，构建pHIL-GH酵母整合质粒，这样鱼生长激素基因处于AOX基因启动子的控制下，通过用电转化法将鱼生长激素基因整合到了酵母的染色体上。在甲醇的诱导下，AOX基因启动子启动了鱼生长激素基因的表达，在摇瓶培养中的表达量达到了0.1(m/m)，经过大规模的发酵培养还能大大提高产量。在喂饲罗非鱼的实验中取得了很好的促生长效果。(陈丹，王玮.生物化学与生物物理进展，1998，25(1)：140-148.)双宝，陈荣忠，杨丰等(2001)用发酵后的酵母制成干粉作为饲料添加剂喂饲鲈鱼、大黄鱼，实验组的重量平均比对照组增长20％以上。(双宝，陈荣忠，杨丰等.鲈鱼生长激素在在酵母中的表达中试实验.2001).马进等(1999)用PCR技术对虹鳟生长激素cDNA进行改造，将改造后的基因克隆到含酵母PRK启动子的大肠杆菌酵母穿梭质粒pMA91，转化酿酒酵母Y33，表达量约占细胞可溶性蛋白总量的3％，表达产物作为饲料添加剂投喂了罗非鱼，具有明显的促生长作用。(马进，白俊杰.生物工程学报，1999，15(4)：434-438.)巫爱珍等(1997)以PRPL，Trp启动子在大肠杆菌中表达鲤鱼生长激素重组DNA，经过高密度发酵，包涵体的提取，恢复天然结构，每升发酵可得鱼生长激素2g，在人工饲料中添加鱼生长激素取得了良好的增产效果。(巫爱珍，孙玉昆.生物工程学报，1997，13(2)：200-205)白俊杰等(1999)也进行了鲤鱼生长激素的原核表达，在对罗非鱼的促增长实验中取得了良好的效果。(白俊杰，马进.中国生物化学与分子生物学学报，1999，15(3)：409-412)发明内容本发明的目的在于提供了一种南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素基因，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链，再以5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列，方法简便，成本低廉，加快了鱼类生长，在水产养殖领域具有应用价值。
本发明从南方鲇的脑垂体中提取总RNA，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链，其特征在于它以脑垂体的mRNA为模板经RT-PCR，5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列，见序列表一，其核苷酸序列及推导的氨基酸序列见序列表二。为了克隆南方鲇生长激素cDNA，依据已知其它23种鱼类的生长激素氨基酸序列保守区LLPEER的三联密码子(DNA序列)设计正向简并引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)；依据已知其它20种鱼类的生长激素氨基酸序列保守区SNCTL及终止密码子的三联密码子(DNA序列)设计出反向简并引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRC AGT TKG 3’)。以垂体cDNA的第一条链为模板，经30个热循环扩增得到一条约0.4kbDNA主带；经琼脂糖凝胶电泳分析，此片段大小与已知其它动物相比较两保守区间的片段大小一致。将此片段克隆到克隆载体pGEM-T easy上，阳性克隆(克隆号SsmB2)经限制性内切酶酶切和DNA序列分析，确认此克隆片段大小为444bp；经查询证实此克隆片段为生长激素cDNA部分同源分子。
30个热循环扩增过程中，复性过程即退火采用的温度至关重要。如果复性温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；如果复性温度太低，引物将产生非特异复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增，无法得到目的DNA扩增片段。我们在对各种退火温度(50℃、52℃、55℃、58℃、60℃)的比较分析试验基上确定出DNA扩增带清晰明亮的退火温度55℃为最佳退火温度。
为了进一步克隆出该生长激素cDNA3’端，依据上述cDNA片段设计出基因特异引物GHFS1。采用特异引物GHFS1和通用引物AUAP，以cDNA为模板扩增出约0.8kbDNA片段，经克隆(克隆号SsmB1-2)和DNA序列分析，确认此克隆片段为完整的南方鲇生长激素cDNA3’端其大小为854bp。
最后依据南方鲇生长激素cDNA 444bp片段序列设计出基因特异引物GSP1和GSP2，以带有Poly(C)垂体cDNA为模板，采用RACE方法扩增出603bp片段，经克隆(克隆号SsmB9)和DNA序列分析，确认此克隆片段为完整的南方鲇生长激素cDNA5’端。
通过三次扩增与克隆，成功地获得南方鲇生长激素完整cDNA。它全长1070nt(nucleotide)(不包括poly(A))，5’端非编码区长52nt，阅读框(ORF)长603nt，3’端非编码区长415nt。.在Poly(A)上游21nt处，有一真核细胞保守性序列AATAAA，此为进行mRNA前体3’端剪切和加Poly(A)的信号。从cDNA序列推导的南方鲇生长激素前体由200个氨基酸组成其中酸性氨基酸27个(13.5％)，碱性氨基酸23个(11.5％)，极性氨基酸54个(27％)，和疏水性氨基酸71个(35.5％)，其等电点为5.94。
在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别检索核苷酸序列数据库(Genbank)和氨基酸序列数据库，发现到目前为止既没有南方鲇生长激素的核苷酸序列也没有其氨基酸序列的提交，证实我们确实是首次克隆南方鲇生长激素的核苷酸序列。当我们在NCBI网站分别用BlastN和BlastP进行搜索，发现克隆的南方鲇生长激素核苷酸序列的编码区和据此推测的氨基酸序列与其它鱼类特别是鲇形目鱼类生长激素基因编码区和氨基酸序列的相似性都很高(见序列表三)，从而基本可以确定我们克隆的确实是南方鲇的生长激素核苷酸序列。该序列可作为转基因鱼育种的目的基因片段也可被插入表达载体(pET-30a(t)、pPIC9K等)构建表达工程菌(BL21(DE3)、BL21等)，生产生长激素，因此在水产养殖上蕴藏着巨大的应用价值。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：与传统鱼类育种和喂饲普通饲料相比，在水产养殖中运用转基因育种和鱼类生长激素基因工程，方法简便，成本低廉，加快了经济鱼类生长，大大增加了水产品产量，显著提高了水产养殖的经济效益，在水产养殖中具有巨大的应用价值。随着研究的不断深入，实际生产中各种问题的解决，克隆出来的各种经济类的生长激素基因必将在水产养殖中产生巨大的经济效益。
附图说明
图1、RT-PCR结果(A)和经酶切的RT-PCR克隆片段(B)M.LambdaDNA/HindIII/Eco.RI分子标准：1、5端RT-PCR；2、采用引物GHFC和GHRA的RT-PCR；3、3端RT-PCR；4、5和6分别为克隆SsmB、9SsmB2和SsmB1-2。
生长激素(growth hormone，GH)是由垂体间叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链蛋白质激素，它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。能影响几呼所有的组织类型和细胞，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调理蛋白质、糖及脂肪的代谢。生长激素发挥功能主要由两个途径：一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长激素介质，再经生长激素介质间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论哪一种方式都需要首先同细胞表面特异性受体结合再由受体介导激发一系列生化事件并最终产生生物效应。(Sun et al.Foreign Medical Sectoin ofPathophysiology and Clinical Medicine 1999，19(1))鱼类生长激素(fish growth hormone，fGH)是由鱼脑垂体间叶细胞分泌的一种单一亚基的多肽激素，它的基本功能是促进鱼体生长发育和参与多种促合成代谢作用(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)，被认为是最具潜力的鱼类生长促进剂。由于鱼类生长激素能够大大加快鱼类生长，在水产养殖领域有重大的应用价值，日益引起人们的关注。(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)目前，鱼类生长激素研究逐渐深入至分子水平，已有大马哈鱼、虹鳟、银大马哈鱼、鳗鲡、金枪鱼、罗非鱼、鲤、牙鲆、真鲷、草鱼、大西洋鳜等的重组生长激素cDNA被分离与克隆；其中鳗鲡、罗非鱼、金枪鱼、虹鳟已在工程菌或动物细胞中高效表达。(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol28，No5 553-556)鱼类生长激素在水产养殖中应用的研究已广泛地开展，由于鱼类生长激素在鱼体内本身含量很少，要通过从鱼体内直接提取，成本较大，工艺也比较的繁琐，所有现阶段的应用研究主要集中在两个方面：转生长激素基因鱼的育种和鱼生长激素基因工程的研究。(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)而应用以上生物工程技术的前提是首先获得鱼类生长激素的完整cDNA序列，这是一切工作的基础。
鱼类生长激素基因是最早用于转基因鱼育种的目的基因。运用转基因技术将含鱼生长激素基因的重组DNA分子导入鱼的受精卵中，使它在鱼体内与染色体发生重组作用。这样外源的生长激素基因就能够在鱼体内稳定存在并得以表达而产生相应的生物学功能(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)。
1985年，朱作言等首先将外源人类生长激素基因采用显微注射法导入金鱼受精卵中，使其整合并表达人生长激素(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5553-556)。从这以来转生长激素基因鱼的研究已取得相当大的进展。泥鳅、鲫鱼、青鱼、虹鳟、沟鲶、鲑鱼、鲂等生长激素基因的导入都相继取得成功，还获得了转基因鱼可以将外源基因向子代稳定遗传的证据(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊85-89)。Zhang等(1990)向鲤鱼导入虹鳟，生长速度比普通鱼类快而且这种特性可遗传。(Zhang P.Mol Reprod Devel，1990，25(1)：3-13)Du等(1992)将全鱼生长激素基因导入大西洋鲑，成功地获得比对照组鱼大4-6倍的转基因鱼(Du，S.et al.，1992 Biotechnology，10：176-181)。Devlin等(1994)将红大马哈鱼的全鱼生长激素基因导入银大马哈鱼，取得了比对照组鱼生长快11倍的转基因鱼(Devlin，R H.et al.，1994，Nature，371(6 494)：209-210)。.梁利群等(1994)将外源大马哈鱼生长激素基因(编码区约3.5kb的DNA片段，包括内含子)导入鲫鱼，并证实其对鲫鱼有促生长作用(梁利群等.生物技术，4(5)：24-26，1994)。Tsai等(1995)，Xu等(1995)采用精子携带或电脉冲发将全鱼生长激素基因分别导入泥鳅和牙鲆中，也获得了比对照组鱼生长快2.5倍的转基因鱼。(Tsai，H.J etal.，1995，Can.J.Aquat.Sci.，52(4)：776-787.Xu，B.et al.，1995 Proceeding of FourthAsian Fisheries Forum，Edited and Published by Editorial Committee of Journal ofFisheries of China(Shanghai)，p.80.)通过将外源生长激素基因导入受体鱼并使之表达，能够达到使养殖鱼类快速生长的目的，特别是全鱼基因元件(由鱼类自身高效表达的启动子和鱼生长激素基因构成)的使用，既可提高表达水平，又可消除哺乳类生长激素引入鱼体对消费者产生的食用疑虑。转基因鱼研究在理论和方法上的最终突破，对缩短主要经济鱼类的养殖周期，提高产量和经济效益，乃至对整个水产养殖将产生深刻的变革(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)。
鱼类生长激素为单一多肽，没有亚基，不需要糖基化修饰，而且二硫键较少，容易复性，特别适用于进行基因工程表达(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊)，而且重组生长激素与天然生长激素有相同的生物活性，引入鱼体不会产生积累，不影响鱼体的组成成分。(徐斌等.海洋与湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)因此，将鱼生长激素基因经过体外重组转入表达宿主菌，构建稳定表达的工程菌，外源基因在宿主菌体内大量表达，纯化后可以得到相应的生长激素。实验证明用基因工程方法生产的重组鱼类生长激素具有生物学活性，能够通过口服经肠道被鱼体吸收，具有很强的促鱼体生长作用(潘登等.台湾海峡，2001，Vol.20增刊)。通过改进工艺，降低成本可望作为饲料添加剂应用于水产养殖业，产生可观的经济效益。
目前进行的鱼类生长激素的基因工程表达主要是通过大肠杆菌和酵母进行表达。简清等(1999)用PCR技术对鲑鱼生长激素基因cDNA进行改造，再将改造后的基因克隆到大肠杆菌表达质粒pBV220，构建重组鲑鱼生长激素基因表达质粒pBVGH18，并在大肠杆菌中获得表达，表达量约占细胞可溶性总蛋白的10％。表达产物经初步纯化和复性后作为饲料添加剂投喂罗非鱼，经过五周的喂饲后，实验鱼的体重和体长增长率分别比对照快119.5％和64.5％(白俊杰等，农业生物技术学报，1998，6(4).简清，白俊杰淡水鱼业，1999，29(3)：3-5.)。陈丹等(1998)在甲醇酵母中成功地表达了鲈鱼生长激素。通过技术克隆得鲈鱼生长激素基因，与含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因启动子的载体pHIL-D进行体外重组，构建pHIL-GH酵母整合质粒，这样鱼生长激素基因处于AOX基因启动子的控制下，通过用电转化法将鱼生长激素基因整合到了酵母的染色体上。在甲醇的诱导下，AOX基因启动子启动了鱼生长激素基因的表达，在摇瓶培养中的表达量达到了0.1(m/m)，经过大规模的发酵培养还能大大提高产量。在喂饲罗非鱼的实验中取得了很好的促生长效果。(陈丹，王玮.生物化学与生物物理进展，1998，25(1)：140-148.)双宝，陈荣忠，杨丰等(2001)用发酵后的酵母制成干粉作为饲料添加剂喂饲鲈鱼、大黄鱼，实验组的重量平均比对照组增长20％以上。(双宝，陈荣忠，杨丰等.鲈鱼生长激素在在酵母中的表达中试实验.2001).马进等(1999)用PCR技术对虹鳟生长激素cDNA进行改造，将改造后的基因克隆到含酵母PRK启动子的大肠杆菌酵母穿梭质粒pMA91，转化酿酒酵母Y33，表达量约占细胞可溶性蛋白总量的3％，表达产物作为饲料添加剂投喂了罗非鱼，具有明显的促生长作用。(马进，白俊杰.生物工程学报，1999，15(4)：434-438.)巫爱珍等(1997)以PRPL，Trp启动子在大肠杆菌中表达鲤鱼生长激素重组DNA，经过高密度发酵，包涵体的提取，恢复天然结构，每升发酵可得鱼生长激素2g，在人工饲料中添加鱼生长激素取得了良好的增产效果。(巫爱珍，孙玉昆.生物工程学报，1997，13(2)：200-205)白俊杰等(1999)也进行了鲤鱼生长激素的原核表达，在对罗非鱼的促增长实验中取得了良好的效果。(白俊杰，马进.中国生物化学与分子生物学学报，1999，15(3)：409-412)发明内容本发明的目的在于提供了一种南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素基因，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链，再以5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列，方法简便，成本低廉，加快了鱼类生长，在水产养殖领域具有应用价值。
本发明从南方鲇的脑垂体中提取总RNA，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链，其特征在于它以脑垂体的mRNA为模板经RT-PCR，5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生长激素cDNA全长序列，见序列表一，其核苷酸序列及推导的氨基酸序列见序列表二。为了克隆南方鲇生长激素cDNA，依据已知其它23种鱼类的生长激素氨基酸序列保守区LLPEER的三联密码子(DNA序列)设计正向简并引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)；依据已知其它20种鱼类的生长激素氨基酸序列保守区SNCTL及终止密码子的三联密码子(DNA序列)设计出反向简并引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRC AGT TKG 3’)。以垂体cDNA的第一条链为模板，经30个热循环扩增得到一条约0.4kbDNA主带；经琼脂糖凝胶电泳分析，此片段大小与已知其它动物相比较两保守区间的片段大小一致。将此片段克隆到克隆载体pGEM-T easy上，阳性克隆(克隆号SsmB2)经限制性内切酶酶切和DNA序列分析，确认此克隆片段大小为444bp；经查询证实此克隆片段为生长激素cDNA部分同源分子。
30个热循环扩增过程中，复性过程即退火采用的温度至关重要。如果复性温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；如果复性温度太低，引物将产生非特异复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增，无法得到目的DNA扩增片段。我们在对各种退火温度(50℃、52℃、55℃、58℃、60℃)的比较分析试验基上确定出DNA扩增带清晰明亮的退火温度55℃为最佳退火温度。
为了进一步克隆出该生长激素cDNA3’端，依据上述cDNA片段设计出基因特异引物GHFS1。采用特异引物GHFS1和通用引物AUAP，以cDNA为模板扩增出约0.8kbDNA片段，经克隆(克隆号SsmB1-2)和DNA序列分析，确认此克隆片段为完整的南方鲇生长激素cDNA3’端其大小为854bp。
最后依据南方鲇生长激素cDNA 444bp片段序列设计出基因特异引物GSP1和GSP2，以带有Poly(C)垂体cDNA为模板，采用RACE方法扩增出603bp片段，经克隆(克隆号SsmB9)和DNA序列分析，确认此克隆片段为完整的南方鲇生长激素cDNA5’端。
通过三次扩增与克隆，成功地获得南方鲇生长激素完整cDNA。它全长1070nt(nucleotide)(不包括poly(A))，5’端非编码区长52nt，阅读框(ORF)长603nt，3’端非编码区长415nt。.在Poly(A)上游21nt处，有一真核细胞保守性序列AATAAA，此为进行mRNA前体3’端剪切和加Poly(A)的信号。从cDNA序列推导的南方鲇生长激素前体由200个氨基酸组成其中酸性氨基酸27个(13.5％)，碱性氨基酸23个(11.5％)，极性氨基酸54个(27％)，和疏水性氨基酸71个(35.5％)，其等电点为5.94。
在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别检索核苷酸序列数据库(Genbank)和氨基酸序列数据库，发现到目前为止既没有南方鲇生长激素的核苷酸序列也没有其氨基酸序列的提交，证实我们确实是首次克隆南方鲇生长激素的核苷酸序列。当我们在NCBI网站分别用BlastN和BlastP进行搜索，发现克隆的南方鲇生长激素核苷酸序列的编码区和据此推测的氨基酸序列与其它鱼类特别是鲇形目鱼类生长激素基因编码区和氨基酸序列的相似性都很高(见序列表三)，从而基本可以确定我们克隆的确实是南方鲇的生长激素核苷酸序列。该序列可作为转基因鱼育种的目的基因片段也可被插入表达载体(pET-30a(t)、pPIC9K等)构建表达工程菌(BL21(DE3)、BL21等)，生产生长激素，因此在水产养殖上蕴藏着巨大的应用价值。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：与传统鱼类育种和喂饲普通饲料相比，在水产养殖中运用转基因育种和鱼类生长激素基因工程，方法简便，成本低廉，加快了经济鱼类生长，大大增加了水产品产量，显著提高了水产养殖的经济效益，在水产养殖中具有巨大的应用价值。随着研究的不断深入，实际生产中各种问题的解决，克隆出来的各种经济类的生长激素基因必将在水产养殖中产生巨大的经济效益。
附图说明
图1、RT-PCR结果(A)和经酶切的RT-PCR克隆片段(B)M.LambdaDNA/HindIII/Eco.RI分子标准：1、5端RT-PCR；2、采用引物GHFC和GHRA的RT-PCR；3、3端RT-PCR；4、5和6分别为克隆SsmB、9SsmB2和SsmB1-2。
具体实施方式
1、南方鲇脑垂体RNA的提取及其cDNA第一链的合成脑垂体经玻璃匀浆器匀浆后采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步抽提法提取总RNA，经DNase I(TAKARA BIO)处理、苯酚和氯仿抽提、无水乙醇沉淀后溶于适量双蒸水中。以1.5μg经DNase I处理过的总RNA为模板，采用引物3AP(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT(T)163’)，用逆转录酶M-MLV(GIBCO BRL)在30μl反应体积中合成第一链cDNA。Chomczynski，P.，Sacchi，N.(1987)Single-step method of RNA isolationby acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction，Anal.Biochem.，162：156-159。
2、南方鲇GH cDNA部分片段的扩增根据已经发表的生长激素序列的保守区域设计了一对简并引物：正向引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)和反向引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRCAGT TKG 3’)。以逆转录合成的总cDNA 0.1μl为模板进行PCR扩增，50μl反应体积中含有10mM Tris·HCl(pH＝8.3)，1.5mM MgCl2，0.1％明胶，2个单位的Taq DNA聚合酶(Promega)，四种dNTP各200μM，每种引物各100pM。PCR条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环后，72℃延伸7min。
3、南方鲇生长激素cDNA3’端(下游区域)和5’端(上游区域)的扩增分别采用3’端和5’端RACE(Rapid amplification of the cDNA ends)依次扩增南方鲇生长激素cDNA的3’端(下游区域)和5’端(上游区域)以获得完整的cDNA序列。RACE中采用的特异引物是根据RT-PCR扩增的片段分别设计。
生长激素cDNA3’端扩增：以3AP合成的第一链cDNA为模板，采用基因特异引物GHFS1(5’AGC TGA GCA AGA TCT TCC 3’)和锚定通用引物AUAP(5’GGCCAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)进行扩增，其PCR反应条件和反应内容物均同“2”。
垂体cDNA第一链3’端poly(c)反应：将(dT)18合成的第一链cDNA用RNaseH(TAKARA BIO)处理(按厂家说明进行)，再进行纯化(QIAQuick PCR PurificationKit，Qiagen)，然后经末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT，TAKARA BIO)处理在3’端加上poly(c)，其反应见有关说明。
生长激素cDNA5’端扩增：第一轮PCR以经过poly(c)加尾的cDNA为模板，用通用引物AAP(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG 3’)和基因特异引物GSP1(5’AAT CCA GGG ATC TCC TGC 3’)进行扩增；第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，用通用引物AUAP和基因特异引物GSP2(5’TAG GTCTCC ACT TTG TGC 3’)进行扩增，以获得生长激素cDNA 5’端。其中第一轮PCR进行热循环35次，第二轮PCR进行热循环30次。除此之外，两次条件相同。
4、PCR产物的克隆、DNA序列分析和氨基酸序列的比较
PCR产物经纯化后直接克隆到pGEM-T easy载体(Promega)，其具体操作见厂家说明。筛选阳性克隆，交由上海联合基因公司，采用载体引物T7、SP6和基因特异引物，利用ABI-377全自动序列分析仪进行双向测序。将RT-PCR和3’端、5’端RACE的测序结果用DNAStar(V.4.01)进行拼接，获得完整的cDNA序列。并用DNAStar进行序列的比较分析。登陆NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，分别检索核苷酸序列数据库(Genbank)和氨基酸序列数据库，以确定克隆的cDNA序列是否以前从未有人获得，并用BlastN和BlastP进行序列相似性搜索。
序列表序列表一：南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素的全长cDNA序列。<110>武汉大学<120>南方鲇生长激素基因<160>2<210>1<211>1088<212>DNA<213>南方鲇(Silurus meridionatis)<220><221>CDS<222>(53)-(656)<220><221>Signal peptide<222>(53)-(119)<220><221>Poly(A)Signal<222>(1070)-(1088)<400>11 aaagtctacc tcgagatttc agcaggatct gagaaagttt cttctgggaa aaatggctag 6061 agtgtgggtg ctgctctccg tggtgctggc gagtttgttc tttagtcagg gcgcgacatt 120121 cgagaaccag cgtctcttca acaacgcagt catccgtgtg caacaccttc atcagctggc 180181 tgccaaaatg atggatgact ttgaggaagc tttgctacct gaagaacgca aacagctgag 240241 caagatcttc ccattgtcct tctgcaattc agactccatc gaagctccat caggcaaaga 300301 cgaaacccag aagagttctg tgttgaagct gctgcacacc tcctaccgtc tgatcgagtc 360361 atgggagttc cccagtaaga acctgggcaa ccccaatcac atctcagaga agctggctga 420421 cctgaaaatg ggcatcggtg tgcttatcga gggatgtctg gatggacaaa ccagcctgga 480481 tgagaacgac tctctggctc cacccttcga ggatttctac cagaccctaa ccgagggaaa 540541 cctgaggaag agcttccgtc tgctctcctg cttcaagaag gacatgcaca aagtggagac 600601 ctatctgagc gtggccaagt gcaggagatc cctggattcc aactgcaccc tgtagagggc 660661 atgatttagc ctcagcctgt gatttgaatt gttttaatag tccaggtgta gctaaattat 720721 taatcctttt cccctggatt tcacttctaa ctttaagtat ttattttctc ctcctccatt 780781 ctcatgtctc ggcaacttta aggttgtaaa atgggactgg tttcacaacg gtgctatgca 840841 aatccagatt tctatcaaat aatgaccagc atatgataac caggatggtg gaagtatacg 900901 ctcctgcctt atgaatatat attatatttt tcatattaga gtctattcta tatactttta 960961 aagtacgaat aataatttgc tatttagctt tgaataattc ctctgtgtaa aaaaaatctc 10201021 tgtctttgtt tttgtggatt tccaataaac ctaatcttcg cattaaaatc aaaaaaaaaa10801081 aaaaaaa 1088
序列表二：由南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素基因编码区推导的氨基酸序列。<210>2<211>200<212>PRT<213>南方鲇(Silurus meridionalis)<400>1Met Ala Arg Val Trp Val Leu Leu Ser Val Val Leu Ala Ser Leu Phe Phe Ser Gln Gly-20 -15 -10 -5Ala Thr Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu Leu Pro Glu Glu Arg Lys20 25 30 35Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser40 45 50 55Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu60 65 70 75Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser Glu Lys80 85 90 95Lue Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly Cys Leu Asp Gly Gln Thr100 105 110 115Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr120 125 130 135Glu Gly Asn Leu Arg Lys Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys140 145 150 155Val Glu Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Ash Cys Thr Leu160 165 170 175-52 AAAGTCTACCTCGAGATTTCAGCAGGATCTGAGAAAGTTTCTTCTGGGAAAA -121 A T F E N Q R L F N N A V I R V Q H L H 40121 CAG CTG GCT GCC AAA ATG ATG GAT GAC TTT GAG GAA GCT TTG CTA CCT GAA GAA CGC AAA 18041 Q L A A K M M D D F E E A L L P E E R K 60181 CAG CTG AGC AAG ATC TTC CCA TTG TCC TTC TGC AAT TCA GAC TCC ATC GAA GCT CCA TCA 24061 Q L S K I F P L S F C N S D S I E A P S 80241 GGC AAA GAC GAA ACC CAG AAG AGT TCT GTG TTG AAG CTG CTG CAC ACC TCC TAC CGT CTG 30081 G K D E T Q K S S V L K L L H T S Y R L 100301 ATC GAG TCA TGG GAG TTC CCC AGT AAG AAC CTG GGC AAC CCC AAT CAC ATC TCA GAG AAG 360101 I E S W E F P S K N L G N P N H I S E K 120361 CTG GCT GAC CTG AAA ATG GGC ATC GGT GTG CTT ATC GAG GGA TGT CTG GAT GGA CAA ACC 420121 L A D L K M G I G V L I E G C L D G Q T 140421 AGC CTG GAT GAG AAC GAC TCT CTG GCT CCA CCC TTC GAG GAT TTC TAC CAG ACC CTA ACC 480141 S L D E N D S L A P P F E D F Y Q T L T 160481 GAG GGA AAC CTG AGG AAG AGC TTC CGT CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAC AAA 540161 E G N L R K S F R L L S C F K K D M H K 180541 GTG GAG ACC TAT CTG AGC GTG GCC AAG TGC AGG AGA TCC CTG GAT TCC AAC TGC ACC CTG 600181 V E T Y L S V A K C R R S L D S N C T L 200601 TAG AGGGCATGATTTAGC CTCAGCCTGT GATTTGAATT GTTTTAATAG TCCAGGTGTA GCTAAATTAT 668*669 TAATCCTTTT CCCCTGGATT TCACTTCTAA CTTTAAGTAT TTATTTTCTC CTCCTCCATT 728769 CTCATGTCTC GGCAACTTTA AGGTTGTAAA ATGGGACTGG TTTCACAACG GTGCTATGCA 788789 AATCCAGATT TCTATCAAAT AATGACCAGC ATATGATAAC CAGGATGGTG GAAGTATACG 848849 CTCCTGCCTT ATGAATATAT ATTATATTTT TCATATTAGA GTCTATTCTA TATACTTTTA 908909 AAGTACGAAT AATAATTTGC TATTTAGCTT TGAATAATTC CTCTGTGTAA AAAAAATCTC 968969 TGTCTTTGTT TTTGTGGATT TCCAATAAAC CTAATCTTCG CATTAAAATC AAAAAAAAAA 10281029 AAAAAAA 1035序列表三：在NCBI网站用BlastN和BlastP搜索得到的序列比对结果。gi|2147434|pir||I51114growth hormone-giant catfishLength＝200Score＝357bits(917)，Expect＝4e-98Identities＝183/200(91％)，Positives＝185/200(92％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|4927276|gb|AAD33070.1|AF147792 1growth hormone[Heteropneustes fossilis]Length＝200Score＝354bits(909)，Expect＝4e-97Identities＝179/200(89％)，Positives＝184/200(92％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120
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300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct：301 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaactgctgcacacctcctaccgtctg 360Query：301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360||||||||||||||||||||||| |||| |||||||||||| || || ||||| ||||||Sbjct：361 atcgagtcatgggagttccccagcaagagcctgggcaacccgaaccatatctctgagaag 420Query：361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||| |||||||||||| ||Sbjct：421 ctggctgacctgaaaatgggcatcagcgtgcttatcgagggatgcgaggatggacaagcc 480Query：421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480|||||||| ||||||||| | | ||||| ||||||||||||||||||||||| || | |Sbjct：481 agcctggacgagaacgacgcatttgctccgcccttcgaggatttctaccagactctgagc 540Query：481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||Sbjct：541 gagggcaacctgaggaagagcttccgtctgctgtcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 600Query：541 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|||||||||||||||||||||||||| | |Sbjct：437 agcctggacgagaatgacgcatttgctccgcccttcgaggatttctaccagaccctgagc 496Query：481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540|||||| ||| ||||||||||||||||||||| || ||||||||||| ||||||||||||Sbjct：497 gaggggaacttgaggaagagcttccgtctgctgtcttgcttcaagaaagacatgcacaaa 556Query：541 gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600|||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct：557 gtggagacttatctcagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcactctg 616Query：601 tag 603|||Sbjct：617 tag 619
2、南方鲇GH cDNA部分片段的扩增根据已经发表的生长激素序列的保守区域设计了一对简并引物：正向引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)和反向引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRCAGT TKG 3’)。以逆转录合成的总cDNA 0.1μl为模板进行PCR扩增，50μl反应体积中含有10mM Tris·HCl(pH＝8.3)，1.5mM MgCl2，0.1％明胶，2个单位的Taq DNA聚合酶(Promega)，四种dNTP各200μM，每种引物各100pM。PCR条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环后，72℃延伸7min。
3、南方鲇生长激素cDNA3’端(下游区域)和5’端(上游区域)的扩增分别采用3’端和5’端RACE(Rapid amplification of the cDNA ends)依次扩增南方鲇生长激素cDNA的3’端(下游区域)和5’端(上游区域)以获得完整的cDNA序列。RACE中采用的特异引物是根据RT-PCR扩增的片段分别设计。
生长激素cDNA3’端扩增：以3AP合成的第一链cDNA为模板，采用基因特异引物GHFS1(5’AGC TGA GCA AGA TCT TCC 3’)和锚定通用引物AUAP(5’GGCCAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)进行扩增，其PCR反应条件和反应内容物均同“2”。
垂体cDNA第一链3’端poly(c)反应：将(dT)18合成的第一链cDNA用RNaseH(TAKARA BIO)处理(按厂家说明进行)，再进行纯化(QIAQuick PCR PurificationKit，Qiagen)，然后经末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT，TAKARA BIO)处理在3’端加上poly(c)，其反应见有关说明。
生长激素cDNA5’端扩增：第一轮PCR以经过poly(c)加尾的cDNA为模板，用通用引物AAP(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG 3’)和基因特异引物GSP1(5’AAT CCA GGG ATC TCC TGC 3’)进行扩增；第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，用通用引物AUAP和基因特异引物GSP2(5’TAG GTCTCC ACT TTG TGC 3’)进行扩增，以获得生长激素cDNA 5’端。其中第一轮PCR进行热循环35次，第二轮PCR进行热循环30次。除此之外，两次条件相同。
4、PCR产物的克隆、DNA序列分析和氨基酸序列的比较
PCR产物经纯化后直接克隆到pGEM-T easy载体(Promega)，其具体操作见厂家说明。筛选阳性克隆，交由上海联合基因公司，采用载体引物T7、SP6和基因特异引物，利用ABI-377全自动序列分析仪进行双向测序。将RT-PCR和3’端、5’端RACE的测序结果用DNAStar(V.4.01)进行拼接，获得完整的cDNA序列。并用DNAStar进行序列的比较分析。登陆NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，分别检索核苷酸序列数据库(Genbank)和氨基酸序列数据库，以确定克隆的cDNA序列是否以前从未有人获得，并用BlastN和BlastP进行序列相似性搜索。
序列表序列表一：南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素的全长cDNA序列。<110>武汉大学<120>南方鲇生长激素基因<160>2<210>1<211>1088<212>DNA<213>南方鲇(Silurus meridionatis)<220><221>CDS<222>(53)-(656)<220><221>Signal peptide<222>(53)-(119)<220><221>Poly(A)Signal<222>(1070)-(1088)<400>11 aaagtctacc tcgagatttc agcaggatct gagaaagttt cttctgggaa aaatggctag 6061 agtgtgggtg ctgctctccg tggtgctggc gagtttgttc tttagtcagg gcgcgacatt 120121 cgagaaccag cgtctcttca acaacgcagt catccgtgtg caacaccttc atcagctggc 180181 tgccaaaatg atggatgact ttgaggaagc tttgctacct gaagaacgca aacagctgag 240241 caagatcttc ccattgtcct tctgcaattc agactccatc gaagctccat caggcaaaga 300301 cgaaacccag aagagttctg tgttgaagct gctgcacacc tcctaccgtc tgatcgagtc 360361 atgggagttc cccagtaaga acctgggcaa ccccaatcac atctcagaga agctggctga 420421 cctgaaaatg ggcatcggtg tgcttatcga gggatgtctg gatggacaaa ccagcctgga 480481 tgagaacgac tctctggctc cacccttcga ggatttctac cagaccctaa ccgagggaaa 540541 cctgaggaag agcttccgtc tgctctcctg cttcaagaag gacatgcaca aagtggagac 600601 ctatctgagc gtggccaagt gcaggagatc cctggattcc aactgcaccc tgtagagggc 660661 atgatttagc ctcagcctgt gatttgaatt gttttaatag tccaggtgta gctaaattat 720721 taatcctttt cccctggatt tcacttctaa ctttaagtat ttattttctc ctcctccatt 780781 ctcatgtctc ggcaacttta aggttgtaaa atgggactgg tttcacaacg gtgctatgca 840841 aatccagatt tctatcaaat aatgaccagc atatgataac caggatggtg gaagtatacg 900901 ctcctgcctt atgaatatat attatatttt tcatattaga gtctattcta tatactttta 960961 aagtacgaat aataatttgc tatttagctt tgaataattc ctctgtgtaa aaaaaatctc 10201021 tgtctttgtt tttgtggatt tccaataaac ctaatcttcg cattaaaatc aaaaaaaaaa10801081 aaaaaaa 1088
序列表二：由南方鲇(Silurus meridionalis)的生长激素基因编码区推导的氨基酸序列。<210>2<211>200<212>PRT<213>南方鲇(Silurus meridionalis)<400>1Met Ala Arg Val Trp Val Leu Leu Ser Val Val Leu Ala Ser Leu Phe Phe Ser Gln Gly-20 -15 -10 -5Ala Thr Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu Leu Pro Glu Glu Arg Lys20 25 30 35Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser40 45 50 55Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu60 65 70 75Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser Glu Lys80 85 90 95Lue Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly Cys Leu Asp Gly Gln Thr100 105 110 115Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr120 125 130 135Glu Gly Asn Leu Arg Lys Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys140 145 150 155Val Glu Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Ash Cys Thr Leu160 165 170 175-52 AAAGTCTACCTCGAGATTTCAGCAGGATCTGAGAAAGTTTCTTCTGGGAAAA -121 A T F E N Q R L F N N A V I R V Q H L H 40121 CAG CTG GCT GCC AAA ATG ATG GAT GAC TTT GAG GAA GCT TTG CTA CCT GAA GAA CGC AAA 18041 Q L A A K M M D D F E E A L L P E E R K 60181 CAG CTG AGC AAG ATC TTC CCA TTG TCC TTC TGC AAT TCA GAC TCC ATC GAA GCT CCA TCA 24061 Q L S K I F P L S F C N S D S I E A P S 80241 GGC AAA GAC GAA ACC CAG AAG AGT TCT GTG TTG AAG CTG CTG CAC ACC TCC TAC CGT CTG 30081 G K D E T Q K S S V L K L L H T S Y R L 100301 ATC GAG TCA TGG GAG TTC CCC AGT AAG AAC CTG GGC AAC CCC AAT CAC ATC TCA GAG AAG 360101 I E S W E F P S K N L G N P N H I S E K 120361 CTG GCT GAC CTG AAA ATG GGC ATC GGT GTG CTT ATC GAG GGA TGT CTG GAT GGA CAA ACC 420121 L A D L K M G I G V L I E G C L D G Q T 140421 AGC CTG GAT GAG AAC GAC TCT CTG GCT CCA CCC TTC GAG GAT TTC TAC CAG ACC CTA ACC 480141 S L D E N D S L A P P F E D F Y Q T L T 160481 GAG GGA AAC CTG AGG AAG AGC TTC CGT CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAC AAA 540161 E G N L R K S F R L L S C F K K D M H K 180541 GTG GAG ACC TAT CTG AGC GTG GCC AAG TGC AGG AGA TCC CTG GAT TCC AAC TGC ACC CTG 600181 V E T Y L S V A K C R R S L D S N C T L 200601 TAG AGGGCATGATTTAGC CTCAGCCTGT GATTTGAATT GTTTTAATAG TCCAGGTGTA GCTAAATTAT 668*669 TAATCCTTTT CCCCTGGATT TCACTTCTAA CTTTAAGTAT TTATTTTCTC CTCCTCCATT 728769 CTCATGTCTC GGCAACTTTA AGGTTGTAAA ATGGGACTGG TTTCACAACG GTGCTATGCA 788789 AATCCAGATT TCTATCAAAT AATGACCAGC ATATGATAAC CAGGATGGTG GAAGTATACG 848849 CTCCTGCCTT ATGAATATAT ATTATATTTT TCATATTAGA GTCTATTCTA TATACTTTTA 908909 AAGTACGAAT AATAATTTGC TATTTAGCTT TGAATAATTC CTCTGTGTAA AAAAAATCTC 968969 TGTCTTTGTT TTTGTGGATT TCCAATAAAC CTAATCTTCG CATTAAAATC AAAAAAAAAA 10281029 AAAAAAA 1035序列表三：在NCBI网站用BlastN和BlastP搜索得到的序列比对结果。gi|2147434|pir||I51114growth hormone-giant catfishLength＝200Score＝357bits(917)，Expect＝4e-98Identities＝183/200(91％)，Positives＝185/200(92％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|4927276|gb|AAD33070.1|AF147792 1growth hormone[Heteropneustes fossilis]Length＝200Score＝354bits(909)，Expect＝4e-97Identities＝179/200(89％)，Positives＝184/200(92％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120
QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNL+KSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLKKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071230|gb|AAL84168.1|AF416489 1growth hormone protein[Heteropneustesfossilis]Length＝200Score＝354bits(909)，Expect＝4e-97Identities＝179/200(89％)，Positives＝183/200(91％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVLLSVVVASLFFSQGATFETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|545073|gb|AAC60745.1|growth hormone：GH[Ictalurus punctatus]gi|8745513|gb|AAF78944.1|growth hormone[Ictalurus punctatus]Length＝200Score＝352bits(904)，Expect＝1e-96Identities＝178/200(89％)，Positives＝183/200(91％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE+QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVLLSVVVASLLFSQGATFESQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDE QKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPS+NLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDEAQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSRNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQT LDENDSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTGLDENDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071226|gb|AAL84166.1|AF416487 1growth hormone protein[Clariasgariepinus]gi|19071228|gb|AAL84167.1|AF416488 1growth hormone protein[Clariasgariepinus]Length＝200Score＝349bits(896)，Expect＝1e-95Identities＝178/200(89％)，Positives＝182/200(91％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARVLVLLSVVVASLFFNQGATFETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEG +DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGIGVLIEGRVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071222|gb|AAL84164.1|AF416485 1growth hormone protein[Clarias batrachus]gi|19071224|gb|AAL84165.1|AF416486 1growth hormone protein[Clariasbatrachus]Length＝200Score＝345bits(884)，Expect＝3e-94Identities＝175/200(87％)，Positives＝179/200(89％)Query：1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGAT E QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct：1 MARGLVLLSVVVASLFFSQGATLETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSK+LGNPNHISEKSbjct：61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKSLGNPNHISEK 120Query：121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGI VLIEGC DGQ SLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct：121 LADLKMGISVLIEGCEDGQASLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|425490|gb|AAB28017.1|growth hormone，GH[Ictalurus punctatus＝catfish，pituitary glands，Peptide，178 aa]Length＝178Score＝341bits(874)，Expect＝4e-93Identities＝170/178(95％)，Positives＝175/178(98％)Query：23 FENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGK 82FE+QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKSbjct：1 FESQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGK 60Query：83 DETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGCLDGQTSL 142DE QKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPS+NLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGC+DGQT LSbjct：61 DEAQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSRNLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGCVDGQTGL 120Query：143 DENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200DE DSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct：121 DEEDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTL 178gi|213566|gb|M63713.1|PNAGHPangasius pangasius growth hormone mRNA，completecdsLength＝603Score＝918bits(463)，Expect＝0.0Identities＝568/603(94％)Strand＝Plus/PlusQuery：1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60||||||||||||| |||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||||||| |||5bjct：1 atggctagagtgttggtggtgctctctgtggtggtggcgagtttgttctttagtcaaggc 60Query：61 gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct：61 gcgacattcgagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120Query：121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||Sbjct：121 cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 180Query：181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||||||||||||||| ||Sbjct：181 cagctgagcaagattttccccctgtctttctgcaactcggactccatcgaagctcctgca 240Query：241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct：241 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaattgctgcacacctcctaccgtctg 300Query：301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||||||||||||||Sbjct：301 atcgagtcatgggagttccccagcaagaacctcggcaaccccaaccacatctcagagaag 360Query：361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||Sbjct：361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggcgtgcttatcgagggatgtttggatggacaaacc 420Query：421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| | | |Sbjct：421 agcctggatgagaacgactctctggctccgcccttcgaggatttctaccagaccttgagc 480Query：481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||Sbjct：481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctgtcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540Query：541 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cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 238Query：181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||||||||||||||| ||Sbjct：239 cagctgagcaagattttccccctgtctttctgcaactcggactccatcgaagctcctgca 298Query：241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct：299 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaattgctgcacacctcctaccgtctg 358Query：301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360|||||||| |||||||||||||| |||||||| ||||||||||| |||||||||||||||Sbjct：359 atcgagtcgtgggagttccccagcaagaacctcggcaaccccaaccacatctcagagaag 418Query：361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||Sbjct：419 ctggctgacctgaaaatgggcatcggcgtgcttatcgagggatgtttggatggacaaacc 478Query：421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480||||||||||||||||||||||||||||| 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gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct：119 gcgacattcgagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 178Query：121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||Sbjct：179 cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 238Query：181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||| ||||| ||||| ||Sbjct：239 cagctgagcaagattttcccgctgtctttctgcaactcggactctatcgaggctccggca 298Query：241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct：299 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaactgctgcacacctcctaccgtctg 358Query：301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360|||||||| |||||||||||||| |||||||| |||||||| || |||||||| ||||||Sbjct：359 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