靶向雄激素受体的LNA拮抗剂
阅读：1043发布：2020-06-24
专利汇可以提供靶向雄激素受体的LNA拮抗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及寡聚物化合物(寡聚物)，其在细胞内靶向雄 激素 受体mRNA，导致雄激素受体的表达减少。雄激素受体表达的减少有利于 治疗 一些医学病症，如本文公开的 疾病 或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症。，下面是靶向雄激素受体的LNA拮抗剂专利的具体信息内容。
1.以下的寡聚物：
(SEQ ID NO：31)，
其中大写字母表示β-D-氧基-LNA单体，且小写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯连接，而“s”的缺失表示磷酸二酯连接。
2.以下的寡聚物：
(SEQ ID NO：58)，
其中大写字母表示β-D-氧基-LNA单体，且小写字母表示DNA单体，下标“s”表示硫代磷酸酯连接，且MeC表示含5-甲基胞嘧啶碱基的β-D-氧基-LNA单体。
3.药物组合物，其包含根据权利要求1或2的寡聚物，和药物可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
4.根据权利要求1或2的寡聚物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为前列腺癌、肺癌或乳腺癌，其中所述乳腺癌对雄激素受体拮抗作用有响应。
5.根据权利要求3的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为前列腺癌、肺癌或乳腺癌，其中所述乳腺癌对雄激素受体拮抗作用有响应。
6.权利要求1或2的寡聚物在制备药物中的用途，所述药物治疗疾病，其中所述疾病选自与雄激素受体的抑制相关的脱发、良性前列腺增生。
7.权利要求1或2的寡聚物在制备药物中的用途，所述药物治疗疾病，其中所述疾病为脊髓性肌萎缩。
8.权利要求1或2的寡聚物在制备药物中的用途，所述药物治疗疾病，其中所述疾病为Kennedy疾病。
9.权利要求1或2的寡聚物在制备药物中的用途，所述药物治疗疾病，其中所述疾病为聚谷氨酸疾病。
靶向雄激素受体的LNA拮抗剂
发明领域
[0001] 本发明提供调节雄激素受体的表达的化合物、组合物和方法。特别是，本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向雄激素受体mRNA，导致雄激素受体的表达减少。雄激素受体表达的减少有利于一系列医学病症，如癌症，特别是前列腺癌或乳腺癌。
[0002] 相关案件
[0003] 本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2007年11月26日提交的U.S.临时申请序列号60/990,125的优先权，其公开以其整体在此引入作为参考。
[0004] 背景
[0005] 雄激素受体(AR)为一类细胞核受体，其通过结合雄激素睾酮或二氢睾酮而活化。雄激素受体的主要功能是作为调节基因表达的DNA结合转录因子。然而，雄激素受体也具有独立于DNA结合的其它功能。雄激素受体与孕酮受体最密切相关，且较高剂量的孕酮可阻断雄激素受体。
[0006] 尽管人的AR基因为单拷贝且发现于X染色体的Xq11-12位置上，但受体本身存在两种同工型(A和B)。AR-A为缺少前187个氨基酸(N-端切断)的87kDa蛋白质。同工型
AR-B全长为110kDa。
AR-B全长为110kDa。
[0007] 雄激素与雄激素受体的结合诱导受体的构象变化，导致热休克蛋白的解离、细胞溶胶向细胞核的二聚和转运，在细胞核中雄激素受体二聚物结合至特异的DNA序列-称为激素效应元素。根据与其它核蛋白质的相互作用，该AR控制基因表达，增加或减少特异基因的转录，如胰岛素样生长因子I(IGF-1)。
[0008] 尽管在细胞质中具有信号转导蛋白，雄激素受体也可具有胞质活性。结合至细胞质雄激素受体的雄激素可引起不依赖基因转录的细胞功能的快速转变，例如离子转运，以及基因转录的间接影响，例如通过介导其它信号转导途径，从而影响其它转录因子的活性。
[0009] 雄激素受体的过表达，或突变的雄激素受体基因的表达已在多种疾病中指征，如癌症，包括前列腺癌和乳腺癌，以及其它病症如聚谷氨酸(polyglutamate)疾病(Monks等人，PNAS 2007年11月2日，公开于网上)脱发，良性前列腺增生，脊髓性肌萎缩和Kennedy疾病。
[0011] US 6,733,776和EP 0 692 972报道了治疗雄激素性脱发的方法，其通过施加包含杂交至雄激素受体基因的反义核酸的脂质体。没有提供具有具体序列且靶向雄激素受体的反义分子。
[0012] US 2005/0164970报道了使用靶向雄激素受体mRNA的siRNA复合物治疗前列腺癌的方法。
[0013] WO 2005/027833报道了治疗前列腺癌的方法，其包括向患者给药长度为12-40个吗啉代亚单元的吗啉代寡核苷酸。
[0014] WO 2001/083740报道了反义化合物，其具有靶向人雄激素受体的18至20个连续单元的不带电(uncharged)吗啉代主链。
[0015] 吗啉代反义化合物通过结合至核酸靶以阻断其它分子接近mRNA而工作，所述其它分子如mRNA剪接或翻译起始中涉及的分子。
[0016] US 7,067,256报道了一种核酶，其明显介导雄激素受体的灭活。提供了与雄激素受体mRNA的对应区反义的19个核苷酸的RNA分子。
[0017] 然而，尽管使用siRNA、吗啉代反义和核酶，上述雄激素受体抑制剂没有一种成功地在体内和以药理可接受的剂量有效地减量调节雄激素-受体。
[0018] 在一个示例方面，本发明提供一类新的雄激素受体拮抗剂，其基于使用LNA化学，和/或通过选择雄激素受体mRNA上的特别有效的靶点而选择。
发明内容
[0019] 本发明提供长度为10-50，如10-30个核苷酸的寡聚物，其包含总共10-50，如10-30个核苷酸的连续核苷酸(contiguous nucleotide)序列，其中所述连续核苷酸序列
与对应于以下的区至少80％(例如，85％，90％，95％，98％，或99％)同源：编码哺乳动物雄激素受体的核酸的反向补体(reverse complement)，如哺乳动物雄激素受体基因或
mRNA，如SEQ ID NO：1或其天然存在的变体。因此，例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO：
1的(相应)部分的序列的单链核酸分子。
与对应于以下的区至少80％(例如，85％，90％，95％，98％，或99％)同源：编码哺乳动物雄激素受体的核酸的反向补体(reverse complement)，如哺乳动物雄激素受体基因或
mRNA，如SEQ ID NO：1或其天然存在的变体。因此，例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO：
1的(相应)部分的序列的单链核酸分子。
[0020] 本发明提供缀合物，其包含根据本发明的寡聚物，和至少一种共价连接至所述寡聚物的非核苷酸或非多核苷酸部分。
[0021] 本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的寡聚物或缀合物，和药物可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
[0022] 本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，其用作药物，如用于治疗本文公开的疾病或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症。
[0023] 本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，用于制备用于治疗本文公开的疾病或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症的药物中的用途。
[0024] 本发明提供治疗本文公开的疾病或医学病症，如过度增生性疾病，如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有所述疾病或医学病症的患者给药根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。
[0025] 本发明提供在表达该雄激素受体的细胞中抑制雄激素受体的方法，所述方法包括向所述细胞给药根据本发明的寡聚物或缀合物以实现在所述细胞中时雄激素受体的抑制。
[0027] 本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包括总共10-50个核碱基的连续核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与编码哺乳动物雄激素受体的核酸的靶区的反向补体至少80％相同(identical)。
[0028] 本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以下缀合物，其除了包含寡聚物的核碱基序列，还包含共价连接至本发明的寡聚物的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(“缀合的部分”)。
[0029] 本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚物或缀合物，和药物可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
[0030] 本发明进一步提供本发明的寡聚物，其用于药物。
[0031] 本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文涉及的一种或多种疾病的药物中的用途，该疾病如选自以下的疾病：癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩(spinal and muscular atrophy)，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。
[0032] 本发明进一步提供本发明的寡聚物，用于治疗本文涉及的一种或多种疾病，如选自以下的疾病：癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。
[0033] 还提供包含本发明的寡聚物的药物和其它组合物。进一步提供减量调节AR在细胞或组织中的表达的方法，其包括将所述细胞或组织，体外或体内，与一种或多种本发明的寡聚物、缀合物或组合物接触。
[0034] 还公开了为治疗怀疑患有或倾向于(易于)患有与AR的表达或过表达相关的疾病或病症的非人动物或人的方法，其通过向该辅助动物或人给药治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。而且，提供了使用寡聚物抑制AR的表达，和治疗与AR的活性相关的疾病的方法。
[0035] 本发明提供治疗选自：癌症如乳腺癌如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病的疾病的方法，该方法包括向需要的患者给药(有效量的)本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物。
[0036] 本发明提供在细胞或组织中抑制或减少雄激素受体的表达的方法，如通过减量调节，该方法包括将所述细胞或组织与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、或其缀合物或药物组合物接触的步骤，以使雄激素受体的表达被抑制或减少。
[0037] 本发明提供，在一些实施方案中，由10至30个连续单体组成的寡聚物，其中相邻单体通过磷酸酯基(phosphate group)或硫代磷酸酯基共价连接，其中所述寡聚物包
括至少10个连续单体的第一区；其中所述第一区的至少一个单体为核苷类似物；其中所
述第一区的序列与哺乳动物雄激素受体基因或哺乳动物雄激素受体mRNA的最佳排列的
(best-aligned)靶区的反向补体至少80％相同。
括至少10个连续单体的第一区；其中所述第一区的至少一个单体为核苷类似物；其中所
述第一区的序列与哺乳动物雄激素受体基因或哺乳动物雄激素受体mRNA的最佳排列的
(best-aligned)靶区的反向补体至少80％相同。
[0038] 在一方面，本发明的寡聚物选自
[0039]
[0042] 图1.对表3中存在的寡核苷酸使用实时PCR评价其在转染后24小时在浓度1、4和16nM在MCF7细胞中敲低(knock down)雄激素受体mRNA的潜能。所有结果对于GAPDH
标准化，且AR mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。
标准化，且AR mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。
[0043] 图2.对表3中存在的寡核苷酸使用实时PCR评价其在转染后24小时在浓度1、4和16nM在A549细胞中敲低雄激素受体mRNA的潜能。所有结果对于GAPDH标准化，且AR
mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。
mRNA的抑制显示为未处理的对照的百分比。所示结果为三个独立实验的平均值。
[0044] 图3.人雄激素受体mRNA序列(Genbank登记号：NM_000044)和小鼠雄激素受体mRNA序列(Genbank登记号：NM_0134769)的序列比对。
[0045] 图4.根据本发明的寡聚物靶向的人AR mRNA(cDNA)的优选靶区的位置。尽管显示了16聚体靶点，在一些实施方案中，这些靶区可包含在所示区域的5’或3’的另外4个碱基-即为最多24个连续核苷酸的靶区。
[0046] 图5.SEQ ID NO：1人雄激素受体(二氢睾酮受体；睾丸女性化；脊髓延髓肌萎缩；Kennedy病)(AR)，转录变体1，mRNA。(Genbank登记号NM_000044)。
[0047] 图6.SEQ ID NO 81：小鼠雄激素受体mRNA序列。
[0048] 图7.SEQ ID NO 82：猕猴雄激素受体mRNA序列。
[0049] 图8.SEQ ID NO 83：人雄激素受体蛋白氨基酸序列。
[0050] 图9.SEQ ID NO 84：小鼠雄激素受体蛋白氨基酸序列。
[0051] 图10.SEQ ID NO 85：猕猴雄激素受体蛋白氨基酸序列。
[0052] 图11：转染后24小时LNCaP中的AR mRNA
[0053] 图12：转染后24小时A549中的AR mRNA
[0054] 图13：细胞增殖测试-A549，转染后时程
[0055] 图14：细胞增殖测试-转染后时程
[0056] 图15：转染后24，48或72小时LNCaP细胞中的Caspase 3/7活性。
[0057] 图16：转染后24，48或72小时A549细胞中的Caspase 3/7活性。
[0058] 图17：体内寡聚物处理后血浆中的平均PSA。
[0059] 图18：肿瘤生长的体内抑制
[0060] 发明详述
[0061] 寡聚物
[0062] 本发明使用寡聚化合物(本文称为寡聚物)，用于调节编码哺乳动物雄激素受体的核酸分子，如SEQ ID NO 1中所示的雄激素受体核酸，和这种编码哺乳动物雄激素受体的核酸分子天然存在的变体的功能。本发明中的术语“寡聚物”，是指两个或多个核苷酸共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。在此，各单核苷酸，如本发明的寡聚物中存在的核苷酸，也可称为“单体”或“单元”。在一些实施方案中，该寡聚物由长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列组成或包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列(即包含10-30个共价连接
的单体或由10-30个共价连接的单体组成)。
的单体或由10-30个共价连接的单体组成)。
[0063] 在不同实施方案中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在不同实施方案中，根据本发明的化合物为线性分子或合成为线性分子。在该实施方案中，该寡聚物为单链分子，且通常不包含例如，至少3，4或5个连续核苷酸的短区，该短区与相同寡聚物内的另一区互补(即双链体)-在这点上，在一些实施方案中，该寡聚物不为(实质上)双链的。在一些实施方案中，该寡聚物实质上不为双链的，如不为siRNA。在不同实施方案中，本发明的寡聚物可整个由连续核苷酸区组成。因此，该寡聚物基本上不是自互补的。siRNAs包含2个互补的短RNA(或相当的核碱基单元)序列，如21至23nts长，通常在任一端具有2nt 3’突
出端。为增强体内摄取，siRNAs可为缀合的，如缀合至固醇，如胆固醇基团(通常在一条或两条链的3’或5’端)。
出端。为增强体内摄取，siRNAs可为缀合的，如缀合至固醇，如胆固醇基团(通常在一条或两条链的3’或5’端)。
[0064] 本发明进一步提供AR mRNA或基因中的靶序列，或其等位变体，特别是相应于SEQ ID NOS：2-22的那些，其中相应于所述靶序列的反义寡核苷酸能减量调节AR。例如，相应于反义寡核苷酸序列SEQ ID NOS：2-22的靶序列分别示于图4(粗体和下划线的，且相应寡聚物SEQ ID NOS如上所示)。变体序列，例如但不限于该靶序列的等位变体(如基因座
Xq11-12处存在的(AR)基因)也在本发明的范围内。变体序列可具有与AR中的靶序列至
少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％的序列同源性。通常，对应于所述变体序列的本发明的寡聚物还能减量调节AR。
Xq11-12处存在的(AR)基因)也在本发明的范围内。变体序列可具有与AR中的靶序列至
少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％的序列同源性。通常，对应于所述变体序列的本发明的寡聚物还能减量调节AR。
[0065] 也公开了LNA寡核苷酸的具体设计，例如示于SEQ ID NOS 44-80的那些。本发明的寡聚物认为是雄激素受体mRNA和蛋白质表达的有效的抑制剂。
[0066] 靶
[0067] 哺乳动物雄激素受体优选选自人或小鼠雄激素受体。优选该哺乳动物雄激素受体为人雄激素受体，如SEQ ID NO 1所示的核酸编码的雄激素受体。进一步的哺乳动物雄激素受体基因(靶)和它们相应的蛋白质示于下表：
[0068]
[0069] 应认识到人的雄激素受体基因显示一定程度的等位变异，且几种多态性识别以上公开的核酸的GenBank登记号是指cDNA序列而不是指mRNA序列本身。成熟mRNA的序列可直接从对应cDNA序列衍生，此时胸腺嘧啶碱基(T)被尿嘧啶碱基(U)替换。
[0070] 应认识到人的雄激素受体基因显示一定程度的等位变异，且几种多态性与疾病表型相关(Mooney等人，NAR 15；31(8)2003)。例如，CAG重复扩增与聚谷氨酰胺扩增疾病(polyglutamine expansion disorder)相关，其它表征的等位变体包括(GGC)n三核苷酸
重复，且已鉴定了R726L、T887A和L710H单核苷酸多态性，且后两个显示与AR受体对其它类固醇配体的增强的混杂相关。在一个实施方案中，n的范围可为5至31。小于22的CAG
的重复与African American男性增高的前列腺癌风险相关，且因此这可能为优选的等位变体。
重复，且已鉴定了R726L、T887A和L710H单核苷酸多态性，且后两个显示与AR受体对其它类固醇配体的增强的混杂相关。在一个实施方案中，n的范围可为5至31。小于22的CAG
的重复与African American男性增高的前列腺癌风险相关，且因此这可能为优选的等位变体。
[0071] 在一些实施方案中，该靶核酸为包含一个或多个单核苷酸多态性(包括R726L、T887A和L710H)的AR等位变体。
[0072] 因此，在一些实施方案中，该靶为包含(CAG)n三核苷酸重复或(GGC)n三核苷酸重复的AR等位变体。
[0073] 编码哺乳动物雄激素受体的核酸在一个优选实施方案中为，人雄激素受体cDNA序列显示为SEQ ID NO 1和/或小鼠雄激素受体cDNA序列显示为SEQ ID NO 81，或其等位
变体。根据本发明的寡聚物为反义寡核苷酸。
变体。根据本发明的寡聚物为反义寡核苷酸。
[0074] 因此，根据本发明的寡聚物的‘靶’为雄激素受体mRNA。该寡聚物当引入表达该雄激素受体基因的细胞时，导致雄激素受体mRNA水平的减少，导致细胞中雄激素受体的表达水平的减少。
[0075] 已知雄激素受体调节多种基因的表达，如选自以下的基因：蛋白质激酶Cδ(PRKCD)，谷胱甘肽S-转移酶θ2(GSTT2)，瞬时型受体潜在阳离子通道亚家族V成员
3(TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或鸟氨酸氨基转移酶(OAT)-这些基因在此称
为雄激素受体靶，且因此，在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物可用于调节一种或多种雄激素受体靶在细胞中的表达，该细胞表达或能表达(即缓解细胞中雄激素受体靶的抑制(通过AR)的情况下)所述雄激素受体靶。
3(TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或鸟氨酸氨基转移酶(OAT)-这些基因在此称
为雄激素受体靶，且因此，在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物可用于调节一种或多种雄激素受体靶在细胞中的表达，该细胞表达或能表达(即缓解细胞中雄激素受体靶的抑制(通过AR)的情况下)所述雄激素受体靶。
[0076] 靶向雄激素受体mRNA的寡聚物可杂交至沿着靶mRNA核酸的任何位点，如5′未翻译的前导序列(leader)、外显子、内含子和3′未翻译的尾部。然而，优选靶向雄激素受体mRNA的寡聚物杂交至该靶核酸的成熟mRNA形式。
[0077] 适当地，本发明的寡聚物能减量调节雄激素受体基因的表达。在这点上，通常在哺乳动物如人细胞中，本发明的寡聚物可实现对雄激素受体的抑制。在一些实施方案中，本发明的寡聚物结合至该靶核酸且相比于正常表达水平实现至少10％或20％的表达抑制，更优选相比于正常表达水平(如紧接给药寡聚物之前)至少30％，40％，50％，60％，70％，
80％，90％或95％抑制。在一些实施方案中，当使用0.04至25nM，如0.8至20nM浓度的本发明的化合物时观察到该调解。在相同或不同实施方案中，表达的抑制小于100％，如小于
98％抑制，小于95％抑制，小于90％抑制，小于80％抑制，如小于70％抑制。表达水平的调解可通过测量蛋白质水平而确定，例如通过以下方法，如SDS-PAGE，然后使用针对该靶蛋白产生的合适的抗体进行蛋白质印迹。或者，表达水平的调解可通过测量mRNA水平确定，例如通过RNA印迹法或定量的RT-PCR。当通过mRNA水平测量，当使用合适的剂量，如0.04至
25nM，如0.8至20nM浓度时，减量调节的水平在一些实施方案中通常达到没有本发明的化合物的情况下的正常水平的10-20％的水平。
80％，90％或95％抑制。在一些实施方案中，当使用0.04至25nM，如0.8至20nM浓度的本发明的化合物时观察到该调解。在相同或不同实施方案中，表达的抑制小于100％，如小于
98％抑制，小于95％抑制，小于90％抑制，小于80％抑制，如小于70％抑制。表达水平的调解可通过测量蛋白质水平而确定，例如通过以下方法，如SDS-PAGE，然后使用针对该靶蛋白产生的合适的抗体进行蛋白质印迹。或者，表达水平的调解可通过测量mRNA水平确定，例如通过RNA印迹法或定量的RT-PCR。当通过mRNA水平测量，当使用合适的剂量，如0.04至
25nM，如0.8至20nM浓度时，减量调节的水平在一些实施方案中通常达到没有本发明的化合物的情况下的正常水平的10-20％的水平。
[0078] 因此本发明提供在表达该雄激素受体蛋白和/或mRNA的细胞中减量调节或抑制雄激素受体蛋白和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括向所述细胞给药或使所述细胞接触根据本发明的寡聚物或缀合物(合适地以有效量)以在所述细胞中减量调节或抑制雄激
素受体蛋白和/或mRNA的表达。适当地该细胞为哺乳动物细胞如人细胞。在一些实施方
案中，给药或接触可在体外发生。在一些实施方案中，给药或接触可在体内发生。
素受体蛋白和/或mRNA的表达。适当地该细胞为哺乳动物细胞如人细胞。在一些实施方
案中，给药或接触可在体外发生。在一些实施方案中，给药或接触可在体内发生。
[0079] 本文使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物雄激素受体多肽，如人雄激素受体的DNA或RNA，如SEQ ID NO：1。编码雄激素受体的核酸或其天然存在的变体，和从其衍生的RNA核酸，优选mRNA，如前mRNA，尽管优选成熟mRNA。在一些实施方案中，例如当在研究或诊断学中使用时，“靶核酸”可为cDNA或衍生自上述DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。根据本发明的寡聚物优选能杂交至靶核酸。应认识到SEQ ID NO：1为cDNA序列，且同样
地，相应于成熟mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷替换。
地，相应于成熟mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷替换。
[0080] 术语“其天然存在的变体”是指核酸序列的雄激素受体多肽的变体，其天然存在于限定的分类群中，如哺乳动物，如小鼠、猴，且优选人。通常，当涉及多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还可包括任何编码基因组DNA(其通过染色体易位或复制存在于染色体X：66.68-66.87Mb)和RNA(如其衍生的mRNA)的雄激素受体的等位变体。“天然存在的变体”还可包括衍生自雄激素受体mRNA的选择剪接的变体。当涉及具体多肽序列时，例如，该术语还包括天然存在形式的蛋白质，因此其可进行加工，例如通过共翻译-或翻译后修饰，如信号肽裂解、蛋白水解剪切、糖基化等。
[0081] 寡聚物序列
[0082] 该寡聚物包含以下连续核苷酸序列或由以下连续核苷酸序列组成，该连续核苷酸序列相应于SEQ ID NO：1中存在的核苷酸序列的反向补体。因此，该寡聚物可包含或由选自SEQ ID NOS：2-22和86-106的序列组成，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)相对所述选择的序列可任选具有1个、2个或3个错配。
[0083] 该寡聚物可包含以下连续核苷酸序列或由以下连续核苷酸序列组成，该连续核苷酸序列完全互补(完美互补)于编码哺乳动物雄激素受体的核酸(例如，SEQ ID NO：1)的等效区。因此，该寡聚物可包含反义核苷酸序列或由反义核苷酸序列组成。
[0084] 然而，在一些实施方案中，当寡聚物与靶序列杂交且还足以与靶结合以显示所需作用(即下调靶)时，该寡聚物可包括1，2，3，或4(或更多)个错配。错配可通过，例如，增加寡聚物核苷酸序列的长度和/或增加核苷酸序列中存在的核苷酸类似物(如LNA)的数量而补偿。
[0085] 在一些实施方案中，该连续核苷酸序列当杂交至靶序列，如杂交至编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区时，包含不多于3个，如不多于2个错配。
[0086] 在一些实施方案中，该连续核苷酸序列当杂交至靶序列，如杂交至编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区时，包含不多于一个错配。
[0087] 本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与选自SEQ ID NOS：2-22和86-106的相应序列至少80％同源，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，如100％同源(相同)。
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，如100％同源(相同)。
[0088] 本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与SEQ ID NO：1中存在的相应序列的反向补体至少80％同源，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，如100％同源(相同)。
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，如100％同源(相同)。
[0089] 本发明的寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列优选与SEQ ID NO：1中存在的子序列至少80％互补，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％互补，至少97％互补，至少98％互补，至少99％互补，如100％互补(完美互补)。
[0090] 在一些实施方案中，该寡聚物(或其连续核苷酸部分)选自，或包含，选自SEQ ID NOS：2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21和22的序列之一，或其至少10个连续核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)当与所述序列比较时可任选包含1个、2个或3个错配。
[0091] 在一些实施方案中，该寡聚物(或其连续核苷酸部分)选自，或包含，选自SEQ ID NOS：86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105和106的序列之一，或其至少10个连续核苷酸的子序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)当与所述序列比较时可任选包含1个、2个或3个错配。
[0092] 其它优选寡聚物包括(连续)核苷酸序列，如长度为12，13，14，15或16个连续核苷酸的序列，其具有选自以下的核苷酸序列：选自SEQ ID No 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21和22的序列，其中所述寡聚物(或其连续核苷酸部分)相对所述选择的序列可任选包含1个、2个或3个错配。
[0093] 在一些实施方案中，该子序列可由11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，或29个连续核苷酸组成，如12-22个，如12-18个核苷酸。适当地，在一些实施方案中，该子序列与本发明的寡聚物的连续核苷酸序列的长度相同。
[0094] 然而，认识到，在一些实施方案中寡聚物的核苷酸序列可包含另外的5’或3’核苷酸，如，独立地，1，2，3，4或5个另外的核苷酸5’和/或3’，它们不互补于靶序列。在该方面，本发明的寡聚物在一些实施方案中可包含在5’和或3’侧翼有另外的核苷酸的连续核苷酸序列。在一些实施方案中该另外的5’或3’核苷酸为天然存在的核苷酸，如DNA或RNA。在一些实施方案中，该另外的5’或3’核苷酸可表示本文的缺口聚物(gapmer)寡聚物涉及的D区。
[0095] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID NO 2的核苷酸序列，如SEQ ID NO 44，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0096] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 3的核苷酸序列，如SEQ ID 45，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0097] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 4的核苷酸序列，如SEQ ID NO 46，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0098] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 5的核苷酸序列，如SEQ ID NO 47，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0099] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 6的核苷酸序列，如SEQ ID NO 48，49或50，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0100] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 7的核苷酸序列，如SEQ ID NO 51，52，或53，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0101] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 8的核苷酸序列，如SEQ ID 54，55或56，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0102] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 9的核苷酸序列，如SEQ ID 57，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0103] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 10的核苷酸序列，如SEQ ID 58，59，或60，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0104] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 11的核苷酸序列，如SEQ ID 61，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0105] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 12的核苷酸序列，如SEQ ID 62，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0106] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 13的核苷酸序列，如SEQ ID 63，64或65，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0107] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 14的核苷酸序列，如SEQ ID 66，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0108] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 15的核苷酸序列，如SEQ ID 67，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0109] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 16的核苷酸序列，如SEQ ID 68，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0110] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 17的核苷酸序列，如SEQ ID 69，70或71，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0111] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 18的核苷酸序列，如SEQ ID 72，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0112] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 19的核苷酸序列，如SEQ ID 73，74或75，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0113] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 20的核苷酸序列，如SEQ ID 76，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0114] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 21的核苷酸序列，如SEQ ID 77，78或79，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0115] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下核苷酸序列组成或包含以下核苷酸序列：根据SEQ ID 22的核苷酸序列，如SEQ ID 80，或其至少10个连续核苷酸的子序列，如其11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0116] 当确定本发明的寡聚物(或连续核苷酸序列)和编码哺乳动物雄激素受体的核酸或其反向补体(如本文公开的那些)之间的“同源性”时，同源性可用本发明化合物的对应核苷酸序列和编码哺乳动物雄激素受体的核酸(或靶核酸)的对应区或其反向补体通过简
单比对(alignment)而确定，且同源性通过计数对齐(align)的碱基数并除以本发明的化
合物中的连续核苷酸的总数，再乘以100而确定。在该比较中，如果存在缺口(gaps)，优选该缺口仅为错配而不是下述区域，其中缺口内核苷酸数在本发明的核苷酸序列和靶核酸之间不同。
单比对(alignment)而确定，且同源性通过计数对齐(align)的碱基数并除以本发明的化
合物中的连续核苷酸的总数，再乘以100而确定。在该比较中，如果存在缺口(gaps)，优选该缺口仅为错配而不是下述区域，其中缺口内核苷酸数在本发明的核苷酸序列和靶核酸之间不同。
[0117] 术语″对应于″和″相应于″是指寡聚物的核苷酸序列或连续核苷酸序列(第一序列)与另一序列的等效连续核苷酸序列的比较，该另一序列的等效连续核苷酸序列选自i)核酸靶的反向补体的子序列，如编码雄激素受体蛋白的mRNA，如SEQ ID NO：1，和/或ii)本文提供的核苷酸的序列，如选自SEQ ID NOS：2-22和86-106，或其子序列。核苷酸类似物直接与它们的等效或对应核苷酸比较。在i)或ii)下对应于另一序列的第一序列通
常在第一序列(如连续核苷酸序列)的整个长度上等同于该序列，或如本文所述，在一些实施方案中，可与相应序列至少80％同源，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，如100％同源(相同)。
常在第一序列(如连续核苷酸序列)的整个长度上等同于该序列，或如本文所述，在一些实施方案中，可与相应序列至少80％同源，如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，如100％同源(相同)。
[0118] 术语″相应核苷酸类似物″和″相应核苷酸″是指核苷酸类似物和天然存在的核苷酸中的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接至腺嘌呤时，该″相应核苷酸类似物″包含连接至腺嘌呤的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
[0119] 长度
[0120] 该寡聚物包含长度总共为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。
[0121] 在一些实施方案中，该寡聚物包含长度总共为10-22，如12-18，如13-17或12-16，如13，14，15，16个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。
[0122] 在一些实施方案中，该寡聚物包含长度总共为10，11，12，13，或14个连续核苷酸的连续核苷酸序列，或由上述连续核苷酸序列组成。
[0123] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由不超过22个核苷酸，如不超过20个核苷酸，如不超过18个核苷酸，如15，16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中本发明的寡聚物包含小于20个核苷酸。
[0124] 核苷酸类似物
[0125] 本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的磷酸酯基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，该天然存在的核苷酸如DNA或RNA，优选DNA，包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸在此也称为“核苷酸类似物”。
[0126] 非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，如2’取代的核苷酸。
[0127] “核苷酸类似物”为天然核苷酸如DNA或RNA核苷酸的变体，其经过在糖和/或碱基部分的修饰。在寡核苷酸的情况下类似物可以原则上仅仅“沉默(silent)”或“等效(equivalent)”于天然核苷酸，即对于寡核苷酸抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影响。如果例如，它们更容易制备或制备更廉价，或对储存或制备条件更稳定，或表示标签或标记，这种“等效”类似物还是可以使用的。然而，优选地，该类似物将对寡聚物抑制表达的方式有功能上的影响；例如通过产生增加的对靶的结合亲和力和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或更方便性地转运至细胞。核苷类似物的具体实例描述于例如Freier
& Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443 和 Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，和方案1：
& Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443 和 Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，和方案1：
[0128]
[0129] 方案1
[0130] 因此该寡聚物可包含以下或由以下组成：天然存在的核苷酸-优选2’-脱氧核苷酸(在此通常称为“DNA”)的简单序列，但也可为核糖核苷酸(在此通常称为“RNA”)，或该天然存在的核苷酸和一种或多种非天然存在的核苷酸(即核苷酸类似物)的组合。该核苷酸类似物可适当地增强寡聚物对于靶序列的亲和力。
[0131] 合适的和优选的核苷酸类似物的实例通过PCT/DK2006/000512提供或在其中涉及。
[0132] 在寡聚物中加入增强亲和力的核苷酸类似物，如LNA或2’-取代的糖，可使特异结合寡聚物的尺寸减小，还可将上限减少至非特异或异常结合发生前寡聚物的尺寸。
[0133] 在一些实施方案中，该寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，该寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在迄今最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一个为锁核酸(LNA)；例如至少3或至少4，或至少5，或至少
6，或至少7，或8个核苷酸类似物可为LNA。在一些实施方案中所有核苷酸类似物可为LNA。
6，或至少7，或8个核苷酸类似物可为LNA。在一些实施方案中所有核苷酸类似物可为LNA。
[0134] 应认识到当提及优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列(其仅由核苷酸组成)，由该序列限定的本发明的寡聚物可包含相应的核苷酸类似物以代替所述序列中存在的一个
或多个核苷酸，如LNA单元或其它核苷酸类似物，其增加寡聚物/靶双链体的双链稳定性/Tm(即增强亲和力的核苷酸类似物)。
或多个核苷酸，如LNA单元或其它核苷酸类似物，其增加寡聚物/靶双链体的双链稳定性/Tm(即增强亲和力的核苷酸类似物)。
[0135] 在一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配优选在增强亲和力的核苷酸类似物之外的区域，如在本文所述的B区内，和/或在本文所述的D区内，和/或在非修饰的位点如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在连续核苷酸序列的5’或3’的区。
[0136] 核苷酸的这些修饰的实例包括修饰糖部分以提供2’-取代基或产生桥接的(锁核酸)结构，其增强结合亲和力且也可提供增加的核酸酶抗性。
[0137] 优选的核苷酸类似物为LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧基-LNA)，和/或氨基-LNA(如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫基-LNA(如
β-D-硫基-LNA和α-L-硫基-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的为
β-D-氧基-LNA。
β-D-硫基-LNA和α-L-硫基-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的为
β-D-氧基-LNA。
[0138] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物中存在的核苷酸类似物(如在本文提及的A和C区中)独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，LNA单元，阿糖核酸(ANA)单元，2’-氟-ANA单元，HNA单元，INA(嵌入核酸(intercalating nucleic acid)-Christensen，2002.Nucl.Acids.Res.200230：4918-4925，在此引入作为参考)单元和2’MOE单元。在一些实施方案中，仅有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本发明的寡聚物或其连续核苷酸序列中。
[0139] 在一些实施方案中，该核苷酸类似物为2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)，2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，因此本发明的寡核苷酸可包括独立地选自这三种
类型类似物的核苷酸类似物，或可包括选自这三种类型类似物中的仅一种类型。在一些
实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’MOE-RNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个
2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’-氟DNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
类型类似物的核苷酸类似物，或可包括选自这三种类型类似物中的仅一种类型。在一些
实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’MOE-RNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个
2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’-氟DNA，如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。
[0140] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物包含至少一个锁核酸(LNA)单元，如1，2，3，4，5，6，7，或8个LNA单元，如3-7或4至8个LNA单元，或3，4，5，6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物为LNA。在一些实施方案中，该寡聚物可包含β-D-氧基-LNA和一种或多种以下LNA单元两者：β-D或α-L构型的硫基-LNA、氨基-LNA、氧
基-LNA、和/或ENA或其组合。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元为5’甲基-胞嘧
啶。在本发明一些实施方案中，该寡聚物可包含LNA和DNA单元两者。优选LNA和DNA单
元的组合总共为10-25，优选10-20，甚至更优选12-16。在本发明一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列，如连续核苷酸序列由至少一个LNA组成，且剩余核苷酸单元为DNA单元。在一些实施方案中，该寡聚物仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA，
最优选DNA核苷酸)，任选具有修饰的核苷酸间连接如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。
基-LNA、和/或ENA或其组合。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元为5’甲基-胞嘧
啶。在本发明一些实施方案中，该寡聚物可包含LNA和DNA单元两者。优选LNA和DNA单
元的组合总共为10-25，优选10-20，甚至更优选12-16。在本发明一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列，如连续核苷酸序列由至少一个LNA组成，且剩余核苷酸单元为DNA单元。在一些实施方案中，该寡聚物仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA，
最优选DNA核苷酸)，任选具有修饰的核苷酸间连接如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。
[0141] 术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分且包括天然存在的以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且包括杂环类似物及其互变异构体。
[0142] 核碱基的实例包括，但不限于腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
[0143] 在一些实施方案中，寡聚物中存在的核碱基的至少一个为修饰的核碱基，其选自5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
[0144] LNA
[0145] 术语“LNA”是指双环核苷酸类似物，称为“锁核酸(Locked Nucleic acid)”。其可表示LNA单体，或当在“LNA寡核苷酸”的环境中使用时是指包含一种或多个该双环核苷酸类似物的寡聚物。
[0147]
[0148] 其中X选自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-；
[0149] B选自氢、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4-烷基、任选取代的C1-4-酰基氧基、核碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基(report groups)和配体；
[0150] P表示与在后的单体之间的核苷间连接的基团位置，或5′-末端基团，该核苷间5 5*
连接或5′-末端基团任选包括取代基R 或等同适用取代基R ；
连接或5′-末端基团任选包括取代基R 或等同适用取代基R ；
[0151] P*表示与在前的单体的核苷间连接，或3′-末端基团；
[0152] R4*和R2*一起表示由1-4个 选自下列的基 团/原子组成的二 价基a b a b a a a
团：-C(RR)-，-C(R)＝C(R)-，-C(R)＝N-，-O-，-Si(R)2-，-S-，-SO2-，-N(R)-和＞C＝Z，
团：-C(RR)-，-C(R)＝C(R)-，-C(R)＝N-，-O-，-Si(R)2-，-S-，-SO2-，-N(R)-和＞C＝Z，
[0153] 其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-，且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、C1-6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体，其中芳基a b和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的(geminal)取代基R 和R 一起可表示任选取代
1* 2 3 5 8* 6 6*
的亚甲基(＝CH2)，且存在的取代基R 、R、R、R、R 、R 和R 各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷
基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、C1-6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体、其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基，或一起可形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团，所述亚烷基链任选插入一个或多个杂原子/基团和/或被一个或多个杂原子/基团终止，所述杂原子/
N N
基团选自-O-、-S-和-(NR)-，其中R 选自氢和C1-4-烷基，且其中两个相邻的(非成对的)N*
取代基可表示另一键，导致形成双键；且R ，当存在且不涉及二价基团时，选自氢和C1-4-烷基；
1* 2 3 5 8* 6 6*
的亚甲基(＝CH2)，且存在的取代基R 、R、R、R、R 、R 和R 各自独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷
基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、磺基、C1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、C1-6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体、其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基，或一起可形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团，所述亚烷基链任选插入一个或多个杂原子/基团和/或被一个或多个杂原子/基团终止，所述杂原子/
N N
基团选自-O-、-S-和-(NR)-，其中R 选自氢和C1-4-烷基，且其中两个相邻的(非成对的)N*
取代基可表示另一键，导致形成双键；且R ，当存在且不涉及二价基团时，选自氢和C1-4-烷基；
[0154] 在一些实施方案中，R5*选自H，-CH3，-CH2-CH3，-CH2-O-CH3和-CH＝CH2。
[0155] 在一些实施方案中，R4*和R2*一起表示二价基团，其选自-C(RaRb)-O-，-C(RaRb)-Cc d a b c d e f a b c d a b c d a(RR)-O-，-C(RR)-C(RR)-C(RR)-O-，-C(RR)-O-C(RR)-，-C(RR)-O-C(RR)-O-，-C(RR
b c d a b c d e f a b c d a b c a
)-C(RR)-，-C(RR)-C(RR)-C(RR)-，-C(R)＝C(R)-C(RR)-，-C(RR)-N(R)-，-C(RR
b c d e a b c a b a b c d a b c
)-C(RR)-N(R)-，-C(RR)-N(R)-O-和-C(RR)-S-，-C(RR)-C(RR)-S-，其中R，R，R，
d e f
R，R 和R 各自独立地选自氢，任选取代的C1-12-烷基，任选取代的C2-12-烯基，任选取代的C2-12-炔基，羟基，C1-12-烷氧基，C2-12-烷氧基烷基，C2-12-烯基氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺基，C1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基，C1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基、热化学活性基、螯合a b
基、报道基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基R 和R 一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，
b c d a b c d e f a b c d a b c a
)-C(RR)-，-C(RR)-C(RR)-C(RR)-，-C(R)＝C(R)-C(RR)-，-C(RR)-N(R)-，-C(RR
b c d e a b c a b a b c d a b c
)-C(RR)-N(R)-，-C(RR)-N(R)-O-和-C(RR)-S-，-C(RR)-C(RR)-S-，其中R，R，R，
d e f
R，R 和R 各自独立地选自氢，任选取代的C1-12-烷基，任选取代的C2-12-烯基，任选取代的C2-12-炔基，羟基，C1-12-烷氧基，C2-12-烷氧基烷基，C2-12-烯基氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳基氧基-羰基，芳基氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺基，C1-6-烷基磺酰基氧基，硝基，叠氮基，硫基，C1-6-烷基硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基、热化学活性基、螯合a b
基、报道基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代基R 和R 一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，
[0156] 在另一实施方案中，R4*和R2*一起表示二价基团(bivalent group)，其选自-CH2-O-，-CH2-S-，-CH2-NH-，-CH2-N(CH3)-，-CH2-CH2-O-，-CH2-CH(CH3)-，-CH2-CH2-S-，-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-CH2-CH2-CH(CH3)-，-CH＝CH-CH2-，-CH2-O-CH2-O-，-CH2-NH-O-，-CH2-N(CH3)-O-，-CH2-O-CH2-，-CH(CH3)-O-，-CH(CH2-O-CH3)-O-。
[0157] 对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。
[0158] 优选地，本发明的寡聚物中使用的LNA包括至少一个根据任一下式的LNA单元
[0159]
[0160] 其中Y为-O-、-O-CH2-、-S-、-NH-或N(RH)；Z和Z*独立地选自核苷酸间连接、末H端基团或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分，且R 选自氢和C1-4-烷基。
[0161] 特别优选的LNA单元示于方案2：
[0162]
[0163]
[0164] 方案2
[0165] 术语″硫基-LNA″包括其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-的锁核苷酸。硫基-LNA可为β-D和α-L-构型。
[0166] 术语 ″氨 基-LNA ″是 指 其中 上述 通式 中 的Y选自 -N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-(其中R选自氢和C1-4-烷基)的锁核苷酸。氨基-LNA可为β-D
和α-L-构型。
和α-L-构型。
[0167] 术语″氧基-LNA″是指其中上述通式中的Y表示-O-或-CH2-O-的锁核苷酸。氧基-LNA可为β-D和α-L-构型。
[0168] 术语″ENA″是指其中上述通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子连接至相对碱基B的2’-位)的锁核苷酸。
[0169] 在一个实施方案中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫基-LNA，特别是β-D-氧基-LNA。
[0170] RNAse募集
[0171] 应认识到寡聚化合物可通过非RNase介导的靶mRNA的降解起作用，如通过翻译的位阻，或其它方法，然而，本发明优选的寡聚物能募集核糖核酸内切酶(RNase)，如RNase H。
[0172] 优选该寡聚物或连续核苷酸序列，包含至少6个，如至少7个连续核苷酸单元，如至少8或至少9个连续核苷酸单元(残基)，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸的区域，当其与互补靶RNA形成双链体时能募集RNase。能募集RNAse的连续序列可为本文所述的缺口聚物(gapmer)段落中涉及的B区。在一些实施方案中，能募集RNAse的连续序列(如B区)的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸单元。
[0173] EP 1222309提供了体外测定RNaseH活性的方法，其可用于测定募集RNaseH的能力。使用EP 1222309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶时具有的
初始速率(以pmol/l/min测量)为等效的仅含DNA的寡核苷酸(equivalent DNA only
oligonucleotide)的至少1％，如至少5％，如至少10％或少于20％，该等效仅含DNA的寡核苷酸没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNaseH。
初始速率(以pmol/l/min测量)为等效的仅含DNA的寡核苷酸(equivalent DNA only
oligonucleotide)的至少1％，如至少5％，如至少10％或少于20％，该等效仅含DNA的寡核苷酸没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNaseH。
[0174] 在一些实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/l/min测量)少于使用等效仅含DNA的寡核苷酸测定的初始速率的1％，如少于5％，如少于10％或少于20％，该等效仅含DNA的寡核苷酸没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物基本不能募集RNase H。
[0175] 在其它实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/l/min测量)，为使用等效仅含DNA的寡核苷酸测定的初始速率的至少20％，如至少40％，如至少60％，如至少80％，该等效仅含DNA的寡核苷酸，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNase H。
[0176] 通常，形成连续核苷酸单元的寡聚物的区域，当与互补靶RNA形成双链体时，能募集由核苷酸单元(其与RNA靶形成DNA/RNA状的双链体)组成的RNase-且包括α-L构型的DNA单元和LNA单元，特别优选为α-L-氧基LNA。
[0177] 本发明的寡聚物可包含核苷酸序列，其包括核苷酸和核苷酸类似物，且可为缺口聚物(gapmer)、头聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。
[0178] 头聚物如下定义：在5’-端的连续的一段非-募集RNase的核苷酸类似物，接着直到3’-端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸单元(如至少7个
该核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定义：在5’-端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(如至少7个该核苷酸)，接着直到3’-端的连续的一段非-募集
RNase的核苷酸类似物。其它根据本发明的嵌合体，称为“混合聚物”，其由下述交替组分构成：可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸，和非-募集RNase的核苷酸类似物。一
些核苷酸类似物也能介导RNaseH结合和裂解。因为α-L-LNA募集RNaseH活性到一定程
度，可能需要可由RNaseH识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸的较小缺口区(gap)用于缺口
聚物构建体，且混合聚物构建中会引入更多的柔性(flexibility)。
该核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定义：在5’-端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(如至少7个该核苷酸)，接着直到3’-端的连续的一段非-募集
RNase的核苷酸类似物。其它根据本发明的嵌合体，称为“混合聚物”，其由下述交替组分构成：可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸，和非-募集RNase的核苷酸类似物。一
些核苷酸类似物也能介导RNaseH结合和裂解。因为α-L-LNA募集RNaseH活性到一定程
度，可能需要可由RNaseH识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸的较小缺口区(gap)用于缺口
聚物构建体，且混合聚物构建中会引入更多的柔性(flexibility)。
[0179] 缺口聚物设计
[0180] 优选地，本发明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段连续的核苷酸的寡聚物(该核苷酸能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7个DNA核苷酸的区域，在本文称为B区，其中B区在5’和3’都侧翼有增强亲和力的核苷酸类似物的区域，如1-6个核苷酸类似物，5’和3’连接至一段连续的能募集RNAse的核苷酸-这些区分别称为A区和C
区。
区。
[0181] 优选该缺口聚物包含下式的(多)核苷酸序列(5’至3’)：A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其中；A区(5’区)由以下组成或包含以下：至少一个核苷酸类似物，如至少一个LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；B区由以下组成或包含以下：至少5个能募集RNAse(当与互补RNA分子，如mRNA靶形成双链体时)的连续核苷酸，如DNA核苷酸，和；C区(3’区)由以下组成或包含以下：至少一个核苷酸类似物，如至少一个LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；D区，当存在时由以下组成或包含以下：1，2或
3个核苷酸单元，如DNA核苷酸。
3个核苷酸单元，如DNA核苷酸。
[0182] 在一些实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成，如2-5个核苷酸类似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元；和/或C区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成，如2-5个核苷酸类
似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元。
似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元。
[0183] 在一些实施方案中，B由以下组成或包含以下：5，6，7，8，9，10，11或12个能募集RNAse的连续核苷酸，或6-10，或7-9，如8个能募集RNAse的连续核苷酸。在一些实施方案中，B区由以下组成或包含以下：至少一个DNA核苷酸单元，如1-12个DNA单元，优选4-12个DNA单元，更优选6-10个DNA单元，如7-10个DNA单元，最优选8，9或10个DNA单元。
[0184] 在一些实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成，B区由7，8，9或10个DNA单元组成，且C区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成。这些设计包括
(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3，3-7-4，
4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个核苷酸单元，如DNA单元。
(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3，3-7-4，
4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个核苷酸单元，如DNA单元。
[0185] 其它缺口聚物设计公开于WO2004/046160且在此引入作为参考。
[0186] 美国临时申请，60/977409，在此引入作为参考，涉及‘短聚物(shortmer)’缺口聚物寡聚物，在一些实施方案中，其可为本发明的缺口聚物寡聚物。
[0187] 在一些实施方案中，该寡聚物由总共10，11，12，13或14个核苷酸单元的连续核苷酸序列组成，其中该连续核苷酸序列为式(5’-3’)，A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成；B由7，8或9个连续核苷酸单元组成，当与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时，所述核苷酸单元能募集RNAse；且
C由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成。当存在时，D由单一DNA单元组
成。
C由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成。当存在时，D由单一DNA单元组
成。
[0188] 在一些实施方案中，A由1个LNA单元组成。在一些实施方案中，A由2个LNA单元组成。在一些实施方案中，A由3个LNA单元组成。在一些实施方案中，C由1个LNA单元组
成。在一些实施方案中，C由2个LNA单元组成。在一些实施方案中，C由3个LNA单元组
成。在一些实施方案中，B由7个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B由8个核苷酸单
元组成。在一些实施方案中，B由9个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B包含1-9个
DNA单元，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在一些实施方案中，B由DNA单元组成。在一些实施方案中，B包含至少一个α-L构型的LNA单元，如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方案中，B包含至少一个α-L-氧基LNA单元或其中所有α-L-构型
的LNA单元为α-L-氧基LNA单元。在一些实施方案中，A-B-C中存在的核苷酸数选自(核
苷酸类似物单元-B区-核苷酸类似物单元)：1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3，
3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4， 或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1-9-3，
3-9-1，4-9-1，1-9-4，或；1-10-1，1-10-2，2-10-1，2-10-2，1-10-3，3-10-1。在一些实施方案中，A-B-C中的核苷酸数选自：2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4和4-7-3。
在一些实施方案中，A和C各自都由两个LNA单元组成，且B由8或9个核苷酸单元，优选
DNA单元组成。
成。在一些实施方案中，C由2个LNA单元组成。在一些实施方案中，C由3个LNA单元组
成。在一些实施方案中，B由7个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B由8个核苷酸单
元组成。在一些实施方案中，B由9个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，B包含1-9个
DNA单元，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在一些实施方案中，B由DNA单元组成。在一些实施方案中，B包含至少一个α-L构型的LNA单元，如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方案中，B包含至少一个α-L-氧基LNA单元或其中所有α-L-构型
的LNA单元为α-L-氧基LNA单元。在一些实施方案中，A-B-C中存在的核苷酸数选自(核
苷酸类似物单元-B区-核苷酸类似物单元)：1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3，
3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4， 或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1-9-3，
3-9-1，4-9-1，1-9-4，或；1-10-1，1-10-2，2-10-1，2-10-2，1-10-3，3-10-1。在一些实施方案中，A-B-C中的核苷酸数选自：2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4和4-7-3。
在一些实施方案中，A和C各自都由两个LNA单元组成，且B由8或9个核苷酸单元，优选
DNA单元组成。
[0189] 核苷酸间连接
[0190] 术语″连接基″或“核苷酸间连接(internucleotide linkage)”是指能将两个核苷酸、两个核苷酸类似物、以及核苷酸和核苷酸类似物等共价结合在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸酯基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。
[0191] 本发明的寡聚物或其连续核苷酸序列的核苷酸通过连接基结合在一起。合适地，各核苷酸通过连接基连接至3’邻近的核苷酸。
[0192] 合适的核苷酸间连接包括列于PCT/DK2006/000512的那些，例如列于PCT/DK2006/000512的第34页第一段的核苷酸间连接(在此引入作为参考)。
[0193] 也就是说，在一些实施方案中，优选将核苷酸间连接从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击更有抗性的基团，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-这两个可被RNase H裂解，也产生在减少靶基因的表达中反义抑制的途径。
[0194] 本文提供的合适的含硫(S)核苷酸间连接可为优选的。硫代磷酸酯核苷酸间连接也是优选的，尤其对于缺口聚物的缺口(gap)区(B)。硫代磷酸酯连接也可用于侧翼区(A和C，和用于将A或C连接至D，和在D区内，视情况而定)。
[0195] 然而A、B和C区可包含除硫代磷酸酯外的其它核苷酸间连接，如磷酸二酯连接，特别地，例如当使用核苷酸类似物防止A和C区内的核苷酸间连接被内切核酸酶降解-如当A和C区包含LNA核苷酸时。
[0196] 寡聚物中的核苷酸间连接可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解靶向的RNA。优选硫代磷酸酯，这是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制备。
[0197] 在本发明的寡聚物的一个方面，该核苷酸和/或核苷酸类似物通过硫代磷酸酯基彼此连接。
[0198] 应认识到将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特别是介于核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(典型地在A区和或C区)，可修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布-参见WO2008/053314，在此引入作为参考。
[0199] 在一些实施方案中，如上述实施方案，其中适当且非具体表明，所有剩余的连接基为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。
[0200] 在一些实施方案中，所有核苷酸间连接基为硫代磷酸酯。
[0201] 当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列时，如那些在此提供的，应理解在多种实施方案中，当该连接为硫代磷酸酯连接时，可使用如那些在此公开的其它连接，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别是用于核苷酸类似物，如LNA单元之间的连接。同样，当涉及具体缺口聚物寡核苷酸序列时，如在此提供的那些，当C残基注释为5’甲基修饰的胞嘧啶时，在多种实施方案中，寡聚物中存在的一个或多个C可为未修饰的C残基。
[0202] 寡聚化合物(oligomeric compound)
[0203] 本发明的寡聚物，例如，可选自：22-43和44至80。
[0204] 缀合物
[0205] 在本文中术语″缀合物(conjugate)″是表示通过将本文所述的寡聚物共价连接(“缀合”)至一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分而形成的异源(heterogenous)分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子试剂如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其组合。典型的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。
[0206] 因此，在多种实施方案中，本发明的寡聚物可包含多核苷酸区和另一非核苷酸区两者，该多核苷酸区通常由核苷酸的连续序列组成。当涉及本发明的由连续核苷酸序列组成的寡聚物，该化合物可包含非核苷酸组分，如缀合物组分。
[0207] 在本发明多种实施方案中，该寡聚化合物连接至配体/缀合物，其可用于例如增加寡聚化合物的细胞吸收。WO2007/031091提供了合适的配体和缀合物，其在此引入作为参考。
[0208] 本发明还提供缀合物，其包含本文所述的根据本发明的化合物和至少一个共价连接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多种实施方案中，其中本发明的化合物由特定的核酸或核苷酸序列组成，如本文所公开，该化合物也可包含至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(例如不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)共价连接至所述化合物。
[0209] 缀合(至缀合物部分)可增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布(cellulardistribution)或细胞吸收。这些部分包括，但不限于，抗体、多肽、脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫醇、硫胆固醇(thiocholesterol)、脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1，2-二-o-十六烷
基-rac-甘油-3-h-膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。
基-rac-甘油-3-h-膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。
[0210] 本发明的寡聚物还可缀合至活性药物物质，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿病药，抗菌素或抗生素。
[0211] 在一些实施方案中，该缀合的部分为固醇，如胆固醇。
[0212] 在多种实施方案中，该缀合的部分包含或由以下组成：带正电荷的聚合物，如带正电荷的肽，例如长度为1-50，如2-20如3-10个氨基酸残基，和/或聚环氧烷如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇-参见WO 2008/034123，在此引入作为参考。合适地，该带正电荷的聚合物，如聚环氧烷可通过连接基连接至本发明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可释放的连接基。
[0213] 作为实例，以下缀合物部分可用于本发明的缀合物：
[0214]
[0215] 活化的寡聚物
[0216] 本文所用的术语“活化的寡聚物”，是指共价连接(即，官能化)至至少一个官能部分(functional moiety)的本发明的寡聚物，该官能部分允许寡聚物共价连接至一个或多个缀合的部分(即本身不为核酸或单体的部分)，以形成本文描述的缀合物。典型地，官能部分将包含能通过以下共价连接至寡聚物的化学基团：例如，腺嘌呤碱基的3’-羟基或环外NH2基，优选亲水性的间隔基(spacer)和能结合至缀合的部分的末端基团(例如，
氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，末端基团未被保护，例如，为NH2基团。在其它实施方案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora W Greene和Peter G M Wuts，第三版(John Wiley & Sons，1999)的“Protective Groups in Organic Synthesis″的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯基甲基，或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二苯基甲基，三苯基甲基，苄基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
在一些实施方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能部分为生物可降解的。参见例如，美国专利号7,087,229，其以其整体在此引入作为参考。
氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，末端基团未被保护，例如，为NH2基团。在其它实施方案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora W Greene和Peter G M Wuts，第三版(John Wiley & Sons，1999)的“Protective Groups in Organic Synthesis″的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯基甲基，或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二苯基甲基，三苯基甲基，苄基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
在一些实施方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能部分为生物可降解的。参见例如，美国专利号7,087,229，其以其整体在此引入作为参考。
[0217] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物在5’端官能化以使缀合的部分共价连接至寡聚物的5’端。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在3’端官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在多于一个位置官能化，所述位置独立地选自5’端、3’端、主链和碱基。
[0218] 在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物使用未被官能化的单体合成，且该寡聚物在合成完成后官能化。在一些实施方案中，该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯(hindered ester)官能化，其中该烷基部分具有式(CH2)w，其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中该官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wNH)连接至寡聚物。
[0219] 在其它实施方案中，该寡聚物使用含(CH2)w-巯基(SH)连接基的位阻酯官能化，其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的链，且其中该官能团通过酯基(-O-C(O)-(CH2)wSH)连接至寡聚物。
[0220] 在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合(通过二硫键的形成)。
[0221] 上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通过本领域已知的任何方法合成，且特别是通过公开于PCT公开号WO 2008/034122和其实施例中的方法，其以其整体在此引入作为参考。
[0222] 在其它实施方案中，本发明的寡聚物通过使用官能化试剂(functionalizingreagent)向寡聚物引入巯基、氨基或羟基而官能化，该官能化试剂基本上描述于美国
专利号4,962,029和4,914,210，即，为基本上链状的试剂，其在一端具有亚磷酰胺
(phosphoramidite)通过亲水性间隔基链连接至相对的端，该相对的端包含保护的或未保护的巯基、氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的5’-羟基。在其它实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至3’-羟基。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方案中，本发明的寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化，该官能化试剂描述于美国专利号4,962,029和4,914,210中，以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡聚物的方法公开于美国专利号
4,962,029和4,914,210。
专利号4,962,029和4,914,210，即，为基本上链状的试剂，其在一端具有亚磷酰胺
(phosphoramidite)通过亲水性间隔基链连接至相对的端，该相对的端包含保护的或未保护的巯基、氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的5’-羟基。在其它实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至3’-羟基。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方案中，本发明的寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化，该官能化试剂描述于美国专利号4,962,029和4,914,210中，以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡聚物的方法公开于美国专利号
4,962,029和4,914,210。
[0223] 在一些实施方案中，固相结合的寡聚物的5’-端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过Diels-Alder环加成反应而缀合。
[0224] 在多种实施方案中，将含2’-糖修饰的单体，如2’-氨基甲酸酯取代的糖或2′-(O-戊基-N-苯二甲酰亚氨基)-脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物
的糖的共价连接。在其它实施方案中，一个或多个单体的2′-位具有含氨基的连接基的寡聚物使用以下试剂制备：例如，5′-二甲氧基三苯甲基-′-O-(e-苯二甲酰亚氨基氨基戊基)-2′-脱氧腺苷-3′-N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见，例如，Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。
的糖的共价连接。在其它实施方案中，一个或多个单体的2′-位具有含氨基的连接基的寡聚物使用以下试剂制备：例如，5′-二甲氧基三苯甲基-′-O-(e-苯二甲酰亚氨基氨基戊基)-2′-脱氧腺苷-3′-N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见，例如，Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。
[0225] 在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在核碱基上(包括在N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位上)具有含胺的官能部分。在多个实施方案中，该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。
[0226] 一些官能部分是可商购的，例如，异双官能(heterobifunctional)和同双官能(homobifunctional)连接部分可购自Pierce Co.(Rockford，Ill.)。其它可商购的
连接基为5′-氨基-修饰体(Modifier)C6和3′-氨基-修饰体试剂，均可购自Glen
Research Corporation(Sterling，Va.)。5′-氨基-修饰体C6也可作为Aminolink-2购
自ABI(Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)，且3′-氨基-修饰体也可购自Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto，Calif.)。
连接基为5′-氨基-修饰体(Modifier)C6和3′-氨基-修饰体试剂，均可购自Glen
Research Corporation(Sterling，Va.)。5′-氨基-修饰体C6也可作为Aminolink-2购
自ABI(Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)，且3′-氨基-修饰体也可购自Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto，Calif.)。
[0227] 组合物
[0228] 本发明的寡聚物可用于药物制剂和组合物。合适地，该组合物包含药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。PCT/DK2006/000512提供了合适和优选的药学可接受的稀释剂、载体和佐剂-其在此引入作为参考。合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂也提供于PCT/DK2006/000512-其也在此引入作为参考。
[0229] 应用
[0230] 本发明的寡聚物可用作研究试剂，用于例如，诊断、治疗和预防。
[0231] 在研究中，该寡聚物可用于特异抑制细胞和实验动物中雄激素受体蛋白的合成(通常通过降解或抑制mRNA从而防止蛋白质形成)，从而促进该靶的功能分析或评估其作
为治疗干预的靶的有用性。
为治疗干预的靶的有用性。
[0232] 在诊断中该寡聚物可用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似技术检测和定量细胞和组织中的雄激素受体表达。
[0233] 对于治疗，疑患疾病或病症的动物或人(其可通过调节雄激素受体的表达治疗)通过给药本发明的反义化合物(适当地以有效量)而治疗。本文进一步提供了治疗哺乳动
物的方法，如治疗人，其疑患疾病或症状或易患疾病或症状，该疾病或症状与雄激素受体的表达相关，该方法通过给药治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡聚物或组合物。
物的方法，如治疗人，其疑患疾病或症状或易患疾病或症状，该疾病或症状与雄激素受体的表达相关，该方法通过给药治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡聚物或组合物。
[0234] 根据本发明的药物组合物可用于治疗与异常水平的雄激素受体相关的症状，如癌症，如前列腺癌或乳腺癌。
[0235] 根据本发明的药物组合物可用于治疗脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩和Kennedy疾病或聚谷氨酸疾病。
[0236] 应认识到本文涉及的治疗可为预防性的。
[0237] 合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂也提供于PCT/DK2006/000512-其在此引入作为参考，但应认识到PCT/DK2006/000512中仅仅具体应用于治疗癌症的方面可不适用于本发明的治疗/药物组合物和方法。
[0238] 本发明还提供包含本文所述的化合物或缀合物，以及药物可接受的稀释剂、载体或佐剂的药物组合物。PCT/DK2006/000512提供合适的和优选的药物可接受的稀释剂、载体和佐剂-其在此引入作为参考。
[0239] 根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物通常以有效量给药。
[0240] 本发明还提供本发明所述的化合物或缀合物在制备用于治疗本文涉及的疾病的药物中的用途，或提供治疗本文所述的疾病的方法。
[0241] 本发明还提供治疗本文涉及的疾病的方法，所述方法包括向需要的患者给药根据本发明的化合物，和/或根据本发明的缀合物，和/或根据本发明的药物组合物。
[0242] 包含多于一种活性成分的药物组合物
[0243] 根据本发明的药物组合物可进一步包含其它活性成分，包括表明可用于治疗癌症如前列腺癌或乳腺癌的那些，特别是常规抗雄激素治疗中使用的试剂。
[0244] 一种该类化合物为非甾体抗雄激素(NSAAs)，其阻断雄激素在受体位点结合。
[0245] 促黄体激素释放激素类似物(LHRH-As)将雄激素的睾丸生成抑制为阉割水平(castrate levels)。
[0246] NSAAs，如CASODEX，当与LHRH-A一起使用作为组合的雄激素阻滞(CombinedAndrogen Blocade)治疗的一部分时，有助于抑制前列腺癌细胞的生长。在一个实施方案中，本发明提供组合的雄激素阻滞治疗，其特征在于该治疗包括给药根据本发明的药物组合物，和NSAA和/或LHRH-A剂，该NSAA和/或LHRH-A剂可在给药本发明的药物组合物之
前、之中或之后给药。
前、之中或之后给药。
[0247] 本发明还提供多部分试剂盒，其中第一部分包含根据本发明的寡聚物、缀合物和/或药物组合物，且另一部分包含非甾体抗雄激素和/或促黄体激素释放激素类似物。因此可以想到该多部分试剂盒可用于如本文涉及的治疗方法，其中该方法包括同时或相继给药第一部分和另一部分。
[0248] 医药适应症
[0249] 根据本发明的寡聚物和其它组合物可用于治疗与AR的突变体的过表达或表达相关的症状。本领域一流科学家已表明使用AR的药物干预将导致对抗前列腺或乳腺癌的治
疗方案。
疗方案。
[0250] 可与异常水平的雄激素受体相关且因此可用根据本发明的组合物、缀合物和化合物治疗的其它病症包括选自癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病的疾病。
[0251] 在一个实施方案中，可与异常水平的雄激素受体相关且因此可用根据本发明的组合物、缀合物和化合物治疗的症状包括选自癌症如乳腺癌或前列腺癌的疾病。
[0252] 本发明进一步提供本发明的化合物在制备用于治疗本文公开的任何和所有病症的药物中的用途。
[0253] 一般说来，本发明的一个方面涉及治疗患有或易患有与异常水平的雄激素受体相关的病症的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物给药治疗有效量的靶向AR的包含一个或多个LNA单元的寡聚物。
[0254] 本发明一个感兴趣的方面涉及本文限定的寡聚物(化合物)或本文限定的缀合物在制备用于治疗上述病症的药物中的用途。
[0255] 本发明的方法优选用于治疗或预防异常水平的雄激素受体引起的疾病。
[0256] 而且，本文所述的本发明包括预防或治疗疾病的方法，其包括向需要该治疗的人给药治疗有效量的调节雄激素受体的寡聚物。本发明进一步包括短期给药调节雄激素受体的寡核苷酸化合物的用途。
[0257] 在本发明一个实施方案中，该寡聚物(化合物)连接至配体或缀合物。例如为增加寡聚物的细胞吸收。在一些实施方案中，该缀合物为固醇，如胆固醇。
[0258] 本发明的寡聚物也可缀合至活性药物物质，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿病药，抗菌素或抗生素。
[0259] 或者，本发明进一步涉及治疗异常水平的雄激素受体的方法，所述方法包括向需要的患者给药本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物，且进一步包括给药另一化学治疗剂。所述进一步给药可为以下情况：该另一化学治疗剂缀合至本发明的化合物、存在于药物组合物中或以单独制剂给药。
[0260] 本发明还涉及用作药物的本文限定的寡聚物、组合物或缀合物。
[0261] 本发明进一步涉及本文限定的化合物、组合物或缀合物在制备用于治疗异常水平的雄激素受体或AR的突变体形式(如等位变体，如与本文涉及的疾病之一相关的那些)的表达的药物中的用途。
[0262] 而且，本发明涉及治疗患有选自癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病的疾病或病症的方法，该方法包括向需要的患者给药本文限定的药物组合物的步骤。
[0263] 而且本发明涉及调节基因以及它们各自的mRNA和蛋白质产物的方法，该基因以及它们各自的mRNA和蛋白质产物通过雄激素受体(即雄激素受体靶)调节，如选自以下
的基因、mRNA和/或蛋白质：蛋白质激酶Cδ(PRKCD)，谷胱甘肽S-转移酶θ2(GSTT2)，瞬时型受体潜在阳离子通道亚家族V成员3(TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸(carboxylate)还原酶
1(PYCR1)或鸟氨酸氨基转移酶(OAT)。根据该雄激素受体靶，该调解可导致增加雄激素受体靶的表达或活性，或降低的表达或活性。
的基因、mRNA和/或蛋白质：蛋白质激酶Cδ(PRKCD)，谷胱甘肽S-转移酶θ2(GSTT2)，瞬时型受体潜在阳离子通道亚家族V成员3(TRPV3)，吡咯啉-5-羧酸(carboxylate)还原酶
1(PYCR1)或鸟氨酸氨基转移酶(OAT)。根据该雄激素受体靶，该调解可导致增加雄激素受体靶的表达或活性，或降低的表达或活性。
[0264] 实施方案
[0265] 本发明的以下实施方案可与本文所述的其它实施方案组合使用。
[0266] 1.长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包括总共10-50个核碱基的连续核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区至少80％同源。
[0267] 2.根据实施方案1的寡聚物，其中所述寡聚物包含至少一个LNA单元。
[0268] 3.根据实施方案1或2的寡聚物，其中该连续核碱基序列相对编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区包含不多于3个，如不多于2个错配。
[0269] 4.根据实施方案3的寡聚物，其中所述连续核碱基序列相对编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区包含不超过1个错配。
[0270] 5.根据实施方案4的寡聚物，其中所述连续核碱基序列不包含错配，(即互补于)编码哺乳动物雄激素受体的核酸的对应区。
[0271] 6.根据实施方案1-5中任一项的寡聚物，其中寡聚物的核碱基序列由连续核碱基序列组成。
[0272] 7.根据实施方案1-6中任一项的寡聚物，其中该编码哺乳动物雄激素受体的核酸为人雄激素受体核苷酸序列，如SEQ ID No 1，或其天然存在的等位变体。
[0273] 8.根据实施方案1-7中任一项的寡聚物，其中该连续核碱基序列互补于人雄激素受体核酸序列和非人哺乳动物雄激素受体核酸序列(如小鼠雄激素受体核酸序列)两者的对应区。
[0274] 9.根据实施方案1至8中任一项的寡聚物，其中该连续核碱基序列包含至少7个核碱基残基的连续子序列，当其与互补雄激素受体靶RNA形成双链体时能募集RNaseH。
[0275] 10.根据实施方案9的寡聚物，其中该连续核碱基序列包含至少8，至少9或至少10个核碱基残基的连续子序列，当其与互补雄激素受体靶RNA形成双链体时能募集
RNaseH。
RNaseH。
[0276] 11.根据实施方案9或10任一项的寡聚物，其中所述连续子序列的长度为至少9或至少10个核碱基，如长度为至少12个核碱基或至少14个核碱基，如14，15或16个核碱
基残基，当其与互补雄激素受体靶RNA形成双链体时能募集RNaseH。
基残基，当其与互补雄激素受体靶RNA形成双链体时能募集RNaseH。
[0277] 12.根据实施方案1-11中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物与一个或多个非核碱基化合物缀合。
[0278] 13.根据实施方案1-12中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物具有的长度为10-22个核碱基。
[0279] 14.根据实施方案1-13中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物具有的长度为12-18个核碱基。
[0280] 15.根据实施方案1-14中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物具有的长度为14，15或16个核碱基。
[0281] 16.根据实施方案1-15中任一项的寡聚物，其中所述连续核碱基序列对应于选自SEQ ID NO 86-106的核酸序列中存在的连续核苷酸序列。
[0282] 17.根据实施方案1-16中任一项的寡聚物，其中该寡聚物或连续核碱基序列包含或选自核苷酸序列中存在的对应核碱基序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO 2-22。
[0283] 18.根据实施方案1-17中任一项的寡聚物，其中所述连续核碱基序列包含至少一个增强亲和力的核苷酸类似物。
[0284] 19.根据实施方案18的寡聚物，其中所述连续核碱基序列包含总共2，3，4，5，6，7，8，9或10个增强亲和力的核苷酸类似物，如5至8个增强亲和力的核苷酸类似物。
[0285] 20.根据实施方案1-19中任一项的寡聚物，其包含至少一个增强亲和力的核苷酸类似物，其中剩余的核碱基选自DNA核苷酸和RNA核苷酸，优选DNA核苷酸。
[0286] 21.根据实施方案1-20中任一项的寡聚物，其中该寡聚物包含下式的核碱基序列，以5’至3’方向，A-B-C，且任选为式A-B-C-D，其中：
[0287] A由以下组成或包含以下：至少一个核苷酸类似物，如1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物，优选2-5个核苷酸类似物，优选2，3或4个核苷酸类似物，最优选2，3或4个连续核苷酸类似物；和
[0288] B由以下组成或包含以下：至少5个能募集RNAseH(当与互补RNA分子，如AR mRNA靶形成双链体时)的连续核碱基，如DNA核碱基，如5，6，7，8，9，10，11或12个能募集RNAseH的连续核碱基，或6-10，或7-9，如8个能募集RNAseH的连续核碱基，和；
[0289] C由以下组成或包含以下：至少一个核苷酸类似物，如1，2，3，4，5，或6个核苷酸类似物，优选2-5个核苷酸类似物，如2，3或4个核苷酸类似物，最优选2，3或4个连续核苷酸类似物，和；
[0290] D当存在时，由以下组成或包含以下，优选由以下组成，1个或多个DNA核苷酸，如1-3或1-2个DNA核苷酸。
[0291] 22.根据实施方案21的寡聚物，其中A区由以下组成或包含以下：2，3或4个连续核苷酸类似物。
[0292] 23.根据实施方案21-22中任一项的寡聚物，其中B区由以下组成或包含以下：7，8，9或10个连续DNA核苷酸或等效核碱基(equivalent nucleobases)，当它们与互补
RNA(如雄激素受体mRNA靶)形成双链体时可募集RNAseH。
RNA(如雄激素受体mRNA靶)形成双链体时可募集RNAseH。
[0293] 24.根据实施方案21-23中任一项的寡聚物，其中C区由以下组成或包含以下：2，3或4个连续核苷酸类似物。
[0294] 25.根据实施方案21-24中任一项的寡聚物，其中当存在时，D区由1个或2个DNA核苷酸组成。
[0295] 26.根据实施方案21-25中任一项的寡聚物，其中：
[0296] A由以下组成或包含以下：3个连续核苷酸类似物；
[0297] B由以下组成或包含以下：7，8，9或10个连续DNA核苷酸或等效核碱基，当该连续DNA核苷酸或等效核碱基与互补RNA(如雄激素受体mRNA靶)形成双链体时可募集
RNAseH；
RNAseH；
[0298] C由以下组成或包含以下：3个连续核苷酸类似物；
[0299] D当存在时，由1个或2个DNA核苷酸组成。
[0300] 27.根据实施方案26的寡聚物，其中该连续核碱基序列由10，11，12，13或14个核碱基组成，且其中：
[0301] A由1、2或3个连续核苷酸类似物组成；
[0302] B由7，8，或9个连续DNA核苷酸或等效核碱基组成，当它们与互补RNA(如雄激素受体mRNA靶)形成双链体时可募集RNAseH；
[0303] C由1，2或3个连续核苷酸类似物组成；
[0304] D当存在时，由1个DNA核苷酸组成。
[0305] 28.根据实施方案21-27中任一项的寡聚物，其中B包含至少一个α-L构型的LNA核碱基，如α-L-氧基LNA。
[0306] 29.根据实施方案1-28中任一项的寡聚物，其中该核苷酸类似物独立地或总体地选自：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，PNA单元，HNA单元和INA单元。
[0307] 30.根据实施方案29的寡聚物，其中所有核苷酸类似物为LNA单元。
[0308] 31.根据实施方案1-30中任一项的寡聚物，其包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个LNA单元，如2至8个核苷酸LNA单元。
[0309] 32.根据实施方案29-31中任一项的寡聚物，其中该LNA独立地选自β-D或α-L构型的氧基-LNA、硫基-LNA和氨基-LNA或其组合。
[0310] 33.根据实施方案32的寡聚物，其中该LNA都为β-D-氧基-LNA。
[0311] 34.根据实施方案21-33中任一项的寡聚物，其中A和C区的核苷酸类似物或核碱基为β-D-氧基-LNA。
[0312] 35.根据实施方案1-34中任一项的寡聚物，其中寡聚物中存在的核碱基的至少一个为修饰的核碱基，其选自5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
[0313] 36.根据实施方案1-35中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物与对应哺乳动物雄激素受体mRNA杂交，且Tm至少为50℃。
[0314] 37.根据实施方案1-36中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物与对应哺乳动物雄激素受体mRNA杂交，且Tm不大于80℃。
[0315] 38.根据实施方案1-37中任一项的寡聚物，其中该核苷间连接独立地选自：磷酸二酯，硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
[0316] 39.根据实施方案38的寡聚物，其中该寡聚物包含至少一个硫代磷酸酯核苷间连接。
[0317] 40.根据实施方案39的寡聚物，其中相邻于DNA或RNA单元或介于DNA或RNA单元之间的核苷间连接，或B区内的核苷间连接为硫代磷酸酯连接。
[0318] 41.根据实施方案39或40的寡聚物，其中至少一对连续核苷酸类似物之间的连接为磷酸二酯连接。
[0319] 42.根据实施方案39或40的寡聚物，其中连续核苷酸类似物间的所有连接为磷酸二酯连接。
[0320] 43.根据实施方案42的寡聚物，其中所有核苷间连接为硫代磷酸酯连接。
[0321] 44.缀合物，其包含根据实施方案1-43中任一项的寡聚物和至少一个共价连接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。
[0322] 45.药物组合物，其包含实施方案1-43中任一项限定的寡聚物或实施方案44限定的缀合物，以及药物可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
[0323] 46.根据45的药物组合物，其中该寡聚物构成为前药。
[0324] 47.根据实施方案45或46的药物组合物，其进一步包含另一选自以下的治疗剂：非甾体抗雄激素和释放促黄体激素的激素类似物。
[0325] 48.实施方案1-43中任一项限定的寡聚物或实施方案44限定的缀合物在制备用于治疗选自以下的疾病或病症的药物中的用途：癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。
[0326] 49.实施方案1-43中任一项限定的寡聚物，或实施方案44限定的缀合物，其用于治疗选自以下的疾病或病症：癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病。
[0327] 50.治疗选自以下的疾病或病症的方法：癌症如乳腺癌或前列腺癌，脱发，良性前列腺增生，骨髓性肌萎缩，Kennedy疾病和聚谷氨酸疾病，所述方法包括向需要的患者给药实施方案1-43中任一项限定的寡聚物，或实施方案44限定的缀合物，或实施方案45-47中任一项限定的药物组合物。
[0328] 51.治疗癌症如前列腺癌或乳腺癌的方法，所述方法包括向需要的患者给药实施方案1-43中任一项限定的寡聚物，或实施方案44限定的缀合物，或实施方案45-47中任一项限定的药物组合物。
[0329] 52.减少或抑制雄激素受体在细胞或组织中表达的方法，该方法包括将所述细胞或组织与实施方案1-43中任一项限定的化合物，或实施方案44限定的缀合物，或实施方案45-47中任一项限定的药物组合物接触的步骤，以使雄激素受体的表达减少或被抑制。
[0330] 调整受雄激素受体调节的基因(即雄激素受体靶)在表达所述基因细胞中表达的方法，所述方法包括将所述细胞或组织与实施方案1-43中任一项限定的化合物，或实施方案44限定的缀合物，或实施方案45-47中任一项限定的药物组合物接触的步骤，以使雄激素受体靶的表达被调节。
实施例
实施例
[0331] 实施例1：单体合成
[0332] 该LNA单体构件(building blocks)和衍生物按照公开的方法和其中引用的文献制备-参见WO07/031081和其中引用的文献。
[0333] 实施例2：寡核苷酸合成
[0334] 寡核苷酸根据描述于WO07/031081的方法合成。表1显示本发明的反义寡核苷酸序列的实例。表2和3显示本发明的反义寡核苷酸(寡聚物(oligos))的实例。
[0335] 实施例3：寡核苷酸的设计
[0336] 根据本发明，一系列不同的寡核苷酸设计为靶向人雄激素受体mRNA(GenBank登记号NM_000044，SEQ ID NO：1)的不同区域。
[0337] 表1 本发明的反义寡核苷酸序列：SEQ ID NOS：2-22为设计为靶向人雄激素受体mRNA的寡聚物序列。
[0338]
[0339]
[0340]
[0341] 表2：本发明的寡核苷酸设计-在SEQ ID NOs：23-43中大写字母表示核苷酸类似物单元且下标“S”表示硫代磷酸酯连接。小写字母表示核苷酸单元。“S”的缺失(若有的话)表示磷酸二酯连接。
[0342]
[0343]
[0344] 实施例4：体外模型：细胞培养
[0345] 反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试，条件是该靶核酸以可检测的水平存在。靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用，例如，RNA印迹分析、实时PCR、核糖核酸酶保护测试而确定。为了例示，提供以下细胞类型，但可常规使用其它细胞类型，条件是该靶在所选的细胞类型中表达。
[0346] 细胞如下所述在合适的培养基中培养，并保持在37℃和95-98％湿度和5％CO2下。细胞每周常规传代2-3次。
[0348] MCF7人乳腺癌细胞系MCF7在EagleMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+2mMGlutamax I+1xNEAA+庆大霉素(25μg/ml)中培养。
[0349] 实施例5：体外模型：用反义寡核苷酸+处理
[0350] 将实施例4中列出的细胞系用寡核苷酸处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000(Gibco)作为转染载体。将细胞接种于6-孔细胞培养板(NUNC)并当
铺满80-90％时进行处理。使用的寡聚物浓度范围为1nM至16nM终浓度。寡聚物-脂质复
合物的配制基本上按照制造商的说明进行，其使用无血清OptiMEM(Gibco)且最终脂质浓
度为5μg/mL的LipofectAMINE2000。将细胞在37℃培养4小时且通过去除含寡聚物的培
养基终止处理。清洗细胞且添加含血清的培养基。寡聚物处理后，使细胞恢复20小时，然后将其收集用于RNA分析。
铺满80-90％时进行处理。使用的寡聚物浓度范围为1nM至16nM终浓度。寡聚物-脂质复
合物的配制基本上按照制造商的说明进行，其使用无血清OptiMEM(Gibco)且最终脂质浓
度为5μg/mL的LipofectAMINE2000。将细胞在37℃培养4小时且通过去除含寡聚物的培
养基终止处理。清洗细胞且添加含血清的培养基。寡聚物处理后，使细胞恢复20小时，然后将其收集用于RNA分析。
[0351] 实施例6：体外模型：提取RNA和cDNA合成
[0352] 总RNA分离和第一链合成
[0353] 总RNA从如上转染的细胞提取，且按照制造商的说明使用QiagenRNeasy试剂盒(Qiagen cat.no.74104)。按照制造商的说明使用Ambion的逆转录酶试剂进行第一链合成。
[0354] 对于每种样品用无RNase的H2O将0.5μg总RNA调节至(10.8μl)，并与2μl十碱基的随机引物(random decamers)(50μM)和4μl dNTP混合物(2.5mM各dNTP)混合，
且加热至70℃保持3分钟，然后将样品在冰上快速冷却。样品在冰上冷却后，将2μl 10x缓冲液RT，1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNase抑制剂(10U/μl)添加至各
样品中，然后在42℃培养60分钟，在95℃将酶热灭活10分钟，然后将样品冷却至4℃。
且加热至70℃保持3分钟，然后将样品在冰上快速冷却。样品在冰上冷却后，将2μl 10x缓冲液RT，1μl MMLV逆转录酶(100U/μl)和0.25μl RNase抑制剂(10U/μl)添加至各
样品中，然后在42℃培养60分钟，在95℃将酶热灭活10分钟，然后将样品冷却至4℃。
[0355] 实施例7：体外模型：通过实时PCR分析雄激素受体表达的寡核苷酸抑制
[0356] 雄激素受体表达的反义调节可在多种本领域已知的方式中测试。例如，雄激素受体mRNA水平可通过例如，RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR定量。实时定量的PCR目前是优选的。RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。
[0357] RNA分离的方法和RNA分析方法如RNA印迹分析是本领域中常规的，且在例如John Wiley和Sons的Current Protocols in Molecular Biology中教导。
[0358] 实时定量(PCR)可方便地使用可商购的获自Applied Biosystem的Multi-ColorReal Time PCR Detection System而实现。
[0359] 雄激素受体mRNA水平的实时定量PCR分析
[0360] 人雄激素受体mRNA的样品含量使用人雄激素受体ABI Prism Pre-DevelopedTaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.Hs00171172_m1)根据制造商的说明定量。
[0361] 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的量用作内源性对照用于标准化样品制剂中的任何变量。
[0362] 人GAPDH mRNA的样品含量使用人GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.4310884E)根据制造商的说明定量。
[0363] 实时定量的PCR是本领域公知的技术，且在例如Heid等人Real timequantitative PCR，Genome Research(1996)，6：986-994中教导。
[0364] 实时PCR：将源自第一链合成的cDNA(按实施例6中的描述进行的)稀释2-20倍，且通过实时定量PCR使用Applied Biosystems的Taqman 7500 FAST或7900 FAST分析。
将引物和探针与2x Taqman Fast Universal PCR主混合物(master mix)(2x)(Applied
Biosystems Cat.#4364103)混合，并添加至4μl cDNA至最终体积为10μl。各样品一式
两份进行分析。测试2倍稀释的cDNA得到该测试的标准曲线，该cDNA从表达感兴趣的RNA
的细胞株纯化的物质制备。使用无菌H2O代替cDNA用于无模板对照。PCR程序：95℃保持
30秒，然后进行40个循环，95℃，3秒，60℃，20-30秒。靶mRNA序列的相对量使用Applied Biosystems Fast System SDS软件1.3.1.21版或SDS软件2.3版从计算的阈值循环确定。
将引物和探针与2x Taqman Fast Universal PCR主混合物(master mix)(2x)(Applied
Biosystems Cat.#4364103)混合，并添加至4μl cDNA至最终体积为10μl。各样品一式
两份进行分析。测试2倍稀释的cDNA得到该测试的标准曲线，该cDNA从表达感兴趣的RNA
的细胞株纯化的物质制备。使用无菌H2O代替cDNA用于无模板对照。PCR程序：95℃保持
30秒，然后进行40个循环，95℃，3秒，60℃，20-30秒。靶mRNA序列的相对量使用Applied Biosystems Fast System SDS软件1.3.1.21版或SDS软件2.3版从计算的阈值循环确定。
[0365] 实施例8：体外分析：通过寡核苷酸化合物反义抑制人雄激素受体mRNA表达
[0366] 评估表3中存在的寡核苷酸以浓度1nM、4nM和16nM敲低雄激素受体mRNA的潜能(参见图1和2)
[0367] 表3：通过寡核苷酸反义抑制人雄激素受体mRNA表达.
[0368] 表3中的数据表示在以16nM相对模拟品(mock)转染的细胞的下调百分比表示。小写字母表示DNA单元，粗体的大写字母表示β-D-氧基-LNA单元。所有LNA C为5′甲
基C。下标“S”表示硫代磷酸酯连接。
基C。下标“S”表示硫代磷酸酯连接。
[0369]
[0370]
[0371] 如表3所示，在这些实验中SEQ ID NOs：48，51，54，58，63，69，73和77的寡核苷酸在16nM显示在A549和MCF7细胞中时雄激素受体mRNA表达的抑制大于90％，因此是优选的。同样优选的为基于所示反义寡序列的寡核苷酸，例如改变长度(更短或更长)和/或
核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)，其也提供对雄激素受体表达的良好抑
制。
核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)，其也提供对雄激素受体表达的良好抑
制。
[0372] 实施例9：体内分析：通过寡核苷酸化合物反义抑制小鼠雄激素受体mRNA肝表达[0373] 裸小鼠用100mg/kg寡核苷酸静脉给药q3dx4(组规模，5只小鼠)。将反义寡核苷酸(SEQ ID：48，SEQ ID：51，SEQ ID：58，SEQ ID：63，SEQ ID：77)溶于0.9％磷酸盐缓冲盐水。最后一次给药24小时后处死动物，且将肝组织取样且储存于RNA之后直到RNA
提取和QPCR分析。提取总RNA且通过QPCR按实施例7的描述使用小鼠AR QPCR测试
(cat.Mm01238475_m1，Applied Biosystems)测量肝样品中的AR mRNA表达。结果标准化
为小鼠GAPDH(cat.no.4352339E，Applied Biosystems)，且相对盐水处理的对照组对敲低(Knockdown)进行定量。表4中的数据表示为相对盐水处理的动物的下调百分比。
提取和QPCR分析。提取总RNA且通过QPCR按实施例7的描述使用小鼠AR QPCR测试
(cat.Mm01238475_m1，Applied Biosystems)测量肝样品中的AR mRNA表达。结果标准化
为小鼠GAPDH(cat.no.4352339E，Applied Biosystems)，且相对盐水处理的对照组对敲低(Knockdown)进行定量。表4中的数据表示为相对盐水处理的动物的下调百分比。
[0374]
[0375] 如表4所示，在这些实验中的SEQ ID NOs：58和77的寡核苷酸在100mg/kg显示在小鼠肝细胞中雄激素受体mRNA表达的抑制大于90％，因此是优选的。
[0376] 实施例10：体外分析：人雄激素受体mRNA的反义抑制
[0377] 增殖活细胞的测量(MTS测试)
[0378] 在转染前一天将LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞以密度为150000细胞/孔接种于6孔板。A549细胞培养于DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+2mM Glutamax I+
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mM Glutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/ml LipofectAMINE2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml
在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为4和16nM。处理4小时后，去除培养
基且将细胞用胰蛋白酶消化并以5000细胞/孔的密度在100μl培养基中接种于透明的96
孔板(Scientific Orange no.1472030100)。通过添加10μl四唑 化合物[3-(4，5-二甲
基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑 ，内盐；MTS]和电子偶合
试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES)(CellTiter 96 A Queous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)在所指示的时间测量活细胞。活细胞在Powerwave(Biotek Instruments)中在490nm测量。将OD490nm相对于时间/小时绘图(参见图13和图14)。如图13和图
14所示，SEQ ID NOs：58和77的寡核苷酸抑制LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞的生
长，因此是优选的。
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mM Glutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/ml LipofectAMINE2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml
在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为4和16nM。处理4小时后，去除培养
基且将细胞用胰蛋白酶消化并以5000细胞/孔的密度在100μl培养基中接种于透明的96
孔板(Scientific Orange no.1472030100)。通过添加10μl四唑 化合物[3-(4，5-二甲
基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑 ，内盐；MTS]和电子偶合
试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES)(CellTiter 96 A Queous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)在所指示的时间测量活细胞。活细胞在Powerwave(Biotek Instruments)中在490nm测量。将OD490nm相对于时间/小时绘图(参见图13和图14)。如图13和图
14所示，SEQ ID NOs：58和77的寡核苷酸抑制LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞的生
长，因此是优选的。
[0379] 实施例11：体外分析：通过反义抑制人雄激素受体mRNA测量Caspase 3/7活性
[0380] 在转染前一天将LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞以密度为150000细胞/孔接种于6孔板。A549细胞培养于DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+2mM Glutamax I+
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mM Glutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml
在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为4和16nM。处理4小时后，去除培养基且将细胞用胰蛋白酶消化并以5000细胞/孔的密度在100μl培养基中接种于白色96孔板
(Nunc)。通过添加100μl Caspase-Glo 3/7测试(promega)在所指示的时间测定Caspase
3/7活性。Caspase 3/7活性使用光度计测量。Caspase 3/7活性在三个不同时间点14小
时、48小时和72小时测量(参见图15和图16)。如图15和图16所示，SEQ ID NOs：58和
77的寡核苷酸在LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞中都诱导Caspase 3/7活性，因此是
优选的。
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mM Glutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml
在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为4和16nM。处理4小时后，去除培养基且将细胞用胰蛋白酶消化并以5000细胞/孔的密度在100μl培养基中接种于白色96孔板
(Nunc)。通过添加100μl Caspase-Glo 3/7测试(promega)在所指示的时间测定Caspase
3/7活性。Caspase 3/7活性使用光度计测量。Caspase 3/7活性在三个不同时间点14小
时、48小时和72小时测量(参见图15和图16)。如图15和图16所示，SEQ ID NOs：58和
77的寡核苷酸在LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞中都诱导Caspase 3/7活性，因此是
优选的。
[0381] 实施例12：体外分析：在前列腺癌细胞LNCaP和肺癌细胞系A549中通过寡核苷酸化合物反义抑制人雄激素受体mRNA表达。
[0382] 以浓度0.5，1，2，4，8和16nM评价寡核苷酸敲低雄激素受体mRNA的潜能(参见图11)。在转染前一天将LNCaP前列腺癌细胞和A549肺癌细胞以密度为150000细胞/
孔接种于6孔板。A549细胞培养于DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+2mM Glutamax I+
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mMGlutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为0.5，1，2，4，8和16nM。清洗细胞且添加含血清的培养基。用寡聚物处理细胞后，使细胞恢复20小时，然后将它们收集用于RNA分析。RNA分离、cDNA合成和qPCR的步骤如实施例5，6和7所述。如图11和12所示，SEQ
ID NOs：58和77的寡核苷酸有效地在肺癌细胞系A549和雄激素受体依赖性22RV1前列腺
癌细胞系中敲低AR mRNA表达。
孔接种于6孔板。A549细胞培养于DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+2mM Glutamax I+
庆大霉素(25μg/ml)中，而LNCaP细胞培养于RPMI 1640培养基(Sigma)+10％胎牛血清
(FBS)+2mMGlutamax I+庆大霉素(25μg/ml)中。第二天去除培养基，然后添加1.2ml含
5μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞孵育7分钟然后添加0.3ml在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡核苷酸浓度为0.5，1，2，4，8和16nM。清洗细胞且添加含血清的培养基。用寡聚物处理细胞后，使细胞恢复20小时，然后将它们收集用于RNA分析。RNA分离、cDNA合成和qPCR的步骤如实施例5，6和7所述。如图11和12所示，SEQ
ID NOs：58和77的寡核苷酸有效地在肺癌细胞系A549和雄激素受体依赖性22RV1前列腺
癌细胞系中敲低AR mRNA表达。
[0383] 实施例13：反义寡核苷酸对PSA的作用(图17)：在该研究中使用6至7周龄的雄性无胸腺nu/nu小鼠(Harlan Sprague Dawley)，平均重27.3±2.4g。将悬浮于比例为
1∶1的PBS(Gibco#14190)和Matrigel(BD#356234)的一千万个22RV1细胞(雄激素非
3
依赖性前列腺癌系)皮下注射于各小鼠。当肿瘤达到150-200mm 的平均体积时，将小鼠分
3
为9个实验组。当平均肿瘤尺寸达到152.66±27.97mm 时静脉内注射200μl寡核苷酸
(oligo)。每3天给予寡核苷酸一次，总共5次。对照载体按与寡核苷酸以相同的方案给予。
在第16天，处死小鼠且在加有EDTA的管中收集血液，并旋转5分钟。然后将50μl上清液
使用ALPCO Diagnostics in Salem的ELISA试剂盒(PSAHU-L01)进行PSA测试。
1∶1的PBS(Gibco#14190)和Matrigel(BD#356234)的一千万个22RV1细胞(雄激素非
3
依赖性前列腺癌系)皮下注射于各小鼠。当肿瘤达到150-200mm 的平均体积时，将小鼠分
3
为9个实验组。当平均肿瘤尺寸达到152.66±27.97mm 时静脉内注射200μl寡核苷酸
(oligo)。每3天给予寡核苷酸一次，总共5次。对照载体按与寡核苷酸以相同的方案给予。
在第16天，处死小鼠且在加有EDTA的管中收集血液，并旋转5分钟。然后将50μl上清液
使用ALPCO Diagnostics in Salem的ELISA试剂盒(PSAHU-L01)进行PSA测试。
[0384] 反义寡核苷酸对肿瘤生长的作用(图18)：在该研究中使用6至7周龄的雄性无胸腺nu/nu小鼠(Harlan Sprague Dawley)，平均重27.3±2.4g。将悬浮于比例为1∶1
的PBS(Gibco#14190)和Matrigel(BD#356234)的一千万个22RV1细胞(雄激素非依赖性
3
前列腺癌系)皮下注射于各小鼠。当肿瘤达到150-200mm 的平均体积时，将小鼠分为9个
3
实验组。当平均肿瘤尺寸达到152.66±27.97mm 时静脉内注射200μl寡核苷酸。每3天
给予寡核苷酸一次，总共5次。对照载体按与寡核苷酸相同的方案给予。各小鼠的肿瘤体
2
积通过使用卡尺测量两个尺寸而确定，且使用下式计算：肿瘤体积＝(长x宽 )/2)。
的PBS(Gibco#14190)和Matrigel(BD#356234)的一千万个22RV1细胞(雄激素非依赖性
3
前列腺癌系)皮下注射于各小鼠。当肿瘤达到150-200mm 的平均体积时，将小鼠分为9个
3
实验组。当平均肿瘤尺寸达到152.66±27.97mm 时静脉内注射200μl寡核苷酸。每3天
给予寡核苷酸一次，总共5次。对照载体按与寡核苷酸相同的方案给予。各小鼠的肿瘤体
2
积通过使用卡尺测量两个尺寸而确定，且使用下式计算：肿瘤体积＝(长x宽 )/2)。
[0385] 实施例14：制备寡聚物与聚乙二醇的缀合物
[0386] 具有SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：63所示序列的寡聚物通过下列使用常规亚磷酰胺化学法(phosphoramidite chemistry)从而在5’端官能化：将被封闭基(如Fmoc)封闭的氨基烷基(如己-1-胺)连接至寡聚物的5’磷酸基，氧化所得化合物，将其脱保护且纯
化以得到官能化的寡聚物，分别具有式(IA)和(IB)：
化以得到官能化的寡聚物，分别具有式(IA)和(IB)：
[0387]
[0388] 其中该粗体大写字母表示核苷类似物单体，小写字母表示DNA单体，下标“S”表示Me硫代磷酸酯连接，且 C表示5-甲基胞嘧啶。
[0389] 活化的PEG的方案，如式(II)所示：
[0390]
[0391] 其中该PEG部分的平均分子量为12,000，且PBS缓冲液中式(IA)和(IB)的化合物的每一个在单独的容器中在室温搅拌12小时。将反应溶液用二氯甲烷萃取三次且合并
的有机层用硫酸镁干燥且过滤，且溶剂在减压下蒸发。将所得残余物溶于双蒸水且装载在阴离子交换柱上。未反应的PEG连接基用水洗脱且产物用NH4HCO3溶液洗脱。收集含纯产
物的级分并冻干以得到SEQ ID NOs：48和63的缀合物，分别示于式(IIIA)和(IIIB)：
的有机层用硫酸镁干燥且过滤，且溶剂在减压下蒸发。将所得残余物溶于双蒸水且装载在阴离子交换柱上。未反应的PEG连接基用水洗脱且产物用NH4HCO3溶液洗脱。收集含纯产
物的级分并冻干以得到SEQ ID NOs：48和63的缀合物，分别示于式(IIIA)和(IIIB)：
[0392]
[0393] 其中SEQ ID NOs：48和63的寡聚物的每一个通过可释放的连接基(releasablelinker)连接至平均分子量为12,000的PEG聚合物。
[0394] 可使用上述方法用具有SEQ ID NOs：51，58和77所示的序列的寡聚物制备的PEG聚合物缀合物的化学结构分别示于式(IVA)，(IVB)和(IVC)：
[0395]
[0396] 其中粗体大写字母表示β-D-氧基-LNA单体，小写字母表示DNA单体，下标“S”表示硫代磷酸酯连接且MeC表示5-甲基胞嘧啶。
[0397] 活化的寡聚物具有式(VA)，(VB)和(VC)所示的化学结构，所述活化的寡聚物可用于该方法中分别制备式(IVA)，(IVB)和(IVC)所示的缀合物：
[0398]
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