雌激素剂
阅读：594发布：2020-05-11
专利汇可以提供雌激素剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用作雌 激素 剂的新的3-[4-(2-苯基-吲哚-1-基甲基)-苯基]-丙烯酰胺化合物和新的2-苯基-1-[4-( 氨 基-1-基-烷-1-炔基)-苄基]-1H-吲哚-5-醇化合物，以及使用这些化合物的药物组合物和 治疗 方法，这些化合物具有上列通式：其中Z选自上式。，下面是雌激素剂专利的具体信息内容。
1、具有下列结构的化合物及其药用盐： 其中：
R1选自H，OH或其C1-C4酯或烷基醚，或卤素；
R2，R3，R4，R5和R6独立地选自H，OH，或其C1-C4酯 或烷基醚，卤素，氰基，C1-C6烷基，三氟甲基，条件是，当R1为H时， R2是OH；
n是2或3；
X选自H，C1-C6烷基，氰基，硝基，三氟甲基，卤素；
Z选自 Y选自： a)部分：
其中R7和R8独立地选自基团H，C1-C6烷基，苯基或通过 -(CH2)p-连接，其中p是2至6的整数，以便形成环，该环可选择地 被最多三个选自下列的取代基取代：氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基， 三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4烷硫基， C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4)烷基， -CO2H，-CN，-CONH(C1-C4)烷基，-NH2，C1- C4烷氨基，二(C1-C4)烷氨基，-NHSO2(C1-C4)烷基， -NHCO(C1-C4)烷基，和-NO2。
b)五-，六-或七-元饱和的，不饱和的或部分不饱和杂环，该杂环含有 最多2个选自下列基团的杂原子：-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基) -，-N＝，和-S(O)m-，其中m是0-2的整数，该杂环可选择地被 1-3个独立地选自下列的基团取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基， 三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4酰氧基，C1- C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1 -C4)烷基，-CO2H-，-CN-，-CONHR1-，-NH2-，( C1-C4)烷氨基，二(C1-C4)烷氨基，-NHSO2R1-， -NHCOR1-，-NO2-和可选择地被1至3个(C1-C4)烷基取代的 苯基；
c)含有与苯环稠合的五或六-员杂环的双环系，该杂环含有最多2个选 自下列基团的杂原子：-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基)-，和 -S(O)m-其中m是0-2的整数，并且该杂环可选择地被1-3个独立地 选自由下列基团的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤 代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4酰氧基，C1-C4 烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1- C4)烷基， -CO2H-，-CN-，-CONHR1-，-NH2-， (C1-C4)烷氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-NHSO2R1-， -NHCOR1，-NO2和可选择地被1至3个(C1-C4)烷基取代的 苯基。
2、权利要求1的化合物，其中：
R1选自H，OH或C1-C4酯或烷基醚，卤素；
R2，R3，R4，R5和R6独立地选自H，OH或其C1-C4酯或 烷基醚，卤素，氰基，C1-C6烷基，或三氟甲基，条件是，当R1是H， R2不为OH；
X选自H，C1-C6烷基，氰基，硝基，三氟甲基，卤素；
Y是部分
R7和R8独立地选自H，C1-C6烷基，或通过-(CH2)p-连 接，其中p是2至6的整数，以使形成环，该环可选择地被最多3个选自下列 的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤代甲基，C1- C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基， C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4)烷基，-CO2H，-CN，-C ONH(C1-C4)烷基，-NH3，C1-C4烷氨基，C1-C4二烷 氨基，-NHSO2(C1-C4)烷基，-NHCO(C1-C4)烷基， 和-NO2。
3、权利要求3的化合物，其中R7和R8以-(CH2)p-连接在一 起形成环，其中p为2至6的整数，该环可选择地被1-3个选自下列基团的 取代基取代；C1-C3烷基，三氟甲基，卤素，氢原子，苯基，硝基，或 -CN。
4、权利要求1的化合物，该化合物是5-苄氧基-2-(4-氟-苯基) -3-甲基)-1H-吲哚。
5、权利要求1的化合物，该化合物是5-苄氧基-2-(4-苄氧基- 苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)-吲哚。
6、权利要求1的化合物，该化合物是5-苄氧基-2-(4-氟-苯基) -3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)-吲哚。
7、权利要求1的化合物，该化合物是2-(4-羟苯基)-3-甲基) -1-基甲基-(4-苯基溴化物)-吲哚-5-醇。
8、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N，N-二乙基-3-{ 4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】 -苯基}-丙烯酰胺。
9、权利要求1的化合物，该化合物是1(E)-N-叔丁基-3-{4 -【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】 -苯基}-丙烯酰胺。
10、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-吡咯烷基-3-{4- 【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯 基}-丙烯酰胺。
11、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N，N-二甲基-3- {4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】 -苯基}-丙烯酰胺。
12、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N，N-二丁基-3- {4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】 -苯基}-丙烯酰胺。
13、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N-丁基，N’-甲基 -3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1- 基甲基】-苯基}-丙烯酰胺。
14、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-吗啉代-3-{4-【 5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基} -丙烯酰胺。
15、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-3-{4-【5-羟基 -2-(4-羟基苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰 胺。
16、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N，甲基-3-{4- 【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯 基}-丙烯酰胺。
17、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N，N-二丁基-3- [4-【5-羟基-2-(4-氟-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】 -苯基}-丙烯酰胺。
18、权利要求1的化合物，该化合物是(E)-N-丁基，N’-甲基 -3-{4-【5-羟基-2-(4-氟-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基 甲基】-苯基}-丙烯酰胺。
19、权利要求1的化合物，该化合物是2-(4-羟基-苯基)-3- 甲基-1-【4-(3-N，N-二甲基-1-基-丙-1-炔基)-苄基】 -1H-吲哚-5-醇或其药用盐。
20、权利要求1的化合物，该化合物是2-(4-羟基-苯基)-3- 甲基-1-【4-(3-哌啶-1-基-丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲 哚-5-醇或其药用盐。
21、权利要求1的化合物，该化合物是2-(4-羟基-苯基)-3- 甲基-1-【4-(3-吡咯烷-1-基-丙-1-炔基)-苄基】-1H- 吲哚-5-醇或其药用盐。
22、治疗和预防哺乳动物骨损失的方法，该方法包括给有此需要的哺乳 动物用有效量的权利要求1化合物，或其药用盐。
23、治疗和预防哺乳动物由雌激素不足引起的或与其有关的疾病状态或 症状的方法，该方法包括给有此需要的哺乳动物服用有效量的权利要求1的化 合物，或其药用盐。
24、治疗和预防哺乳动物心血管疾病的方法，该方法包括给有此需要的 哺乳动物服用有效量的权利要求1化合物，及其药用盐。
25、含有权利要求1化合物，或其药用盐，和药用载体或赋形剂的药物 组合物。
本发明涉及用作雌激素剂的新的3-【4-(2-苯基-吲哚-1-基甲 基)苯基】-丙烯酰胺化合物和新的2-苯基-1-【4-(氨基-1-基- 烷-1-炔基)苄基】-1H-吲哚-5-醇化合物，以及使用这些化合物的 药物组合物和治疗方法。
发明背景
激素替代治疗用于预防绝经后妇女的骨的损失早已为人所知。通常是用含 有乙酸纤维素纤维，雌三醇，乙炔雌二醇的那些药剂或从天然材料(从Wyeth -Ayerst中得到的马雌激素)分离的络合雌激素来满足雌激素的供给。对于有 些病人，由于非拮抗雌激素(不与孕激素联合给药的雌激素)对子宫组织引起 的增生影响，这种治疗是禁忌的。这种增生是与子宫内膜异位和/或子宫内膜 癌症的风险的增加相关的。非拮抗雌激素在乳房组织的作用还不甚清楚，但却 有些相关。雌激素的满足可以保持骨的节省作用，同时又大大降低子宫和乳房 的增生作用是明显的。某些非甾体抗雌激素在卵巢切除鼠模型及人体临床试验 中均显示有保持骨质的作用。例如三苯氧胺，用于乳房癌症治疗中症状的减轻。 已经证明其在人骨中起到类雌激素拮抗剂作用。然而，它在子宫内也是部分拮 抗剂，这是有些相关的原因。那洛亚芬，一个苯并噻吩抗雌激素，在卵巢切除 鼠中显示刺激子宫生长的程度小于三苯氧胺同时保持骨节省的能力。组织选择 性雌激素的适宜综述是：Tissue-Selective Actions Of Estrogen Analogs，Bone Vol.17，No.4，October 1995，181s-190 S。
用吲哚作雌激素拮抗剂由Von Angerer在Chemical Abstracts，Vol. 99，No.7(1983)，文摘号53886U，也见于J.Med.Chem. 1990，33，2635-2640；J.Med.Chem.1987，30，13 1-136。也见于Ger.Offen.，DE 3821148A1 89122 8和WO 96/03375。此外，见于WO，A，9323374( Otsuka Pharmaceutical Factory，Inc)。 Yon An9erer的工作仅限于吲 哚氮原子上联接脂肪链和然后联接碱性胺(或酰胺)或，苄基但不具有碱性胺。 在Otsuka(日本)的世界专利中含有与本发明相关的除R3(如式I所示)定 义为-SR其中R是烷基的化合物。此外，在其专利中吲哚氮原子没有侧链， 这与本发明权利要求或实施例给出的结构相同。相关的专利WOA 9310 741描述了5-羟基吲哚。WO A 9517383(kar Bio AB) 描述了脂肪链化合物。
WO A 9517383(Karo Bio AB)描述了具有长直链的吲哚 抗雌激素。另-个相关专利WO A 9310741描述了具有宽范围侧链 的5-羟基吲哚。WO 93/23374(Otsuka Pharmacenticals，(日 本)描述的化合物与本发明化合物的结构更相似，除了此处式I和II中关于 R3在下面定义为硫代烷基的结构之外，并且参考文献中未公开那些与本发明 化合物具有相同结构的具有吲哚氮原子侧链的化合物。
本发明描述
式(I)和(II)所示的通用结构类型的化合物是雌激素激动剂/拮抗 剂，用于治疗与雌激素缺乏有关的疾病。本发明化合物显示强的与雌激素受体 的结合力。这些化合物被证明是没有内在的雌激素特性的抗雌激素。在三天卵 巢切除鼠模型中，式(I)化合物在单独给药时能够拮抗17β一雌二醇的作 用同时又没有子宫刺激。
本发明包括如下的式(I)和(II)化合物及其药用盐： 其中：
R1选自H，OH或其C1-C4酯或烷基醚，或卤素；
R2，R3，R4，R5和R6独立地选自H，OH或其C1-C4酯或 烷基醚，卤素，氰基，C1-C6烷基或三氟甲基，条件是，当R1是H时， R2不是OH；
n是2或3；
X选自H，C1-C6烷基，氰基，硝基，三氟甲基，卤素；
Z选自
Y选自：
a)部分：
其中R7和R8独立地选自以下一组的基团：H，C1-C6烷基，苯基或由 -(CH2)p-连接，其中p是整数2至6，以便形成环，环可选择地被最 多3个选自下列的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤 代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4烷硫基，C1-C4 烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4)烷基， -CO2H，-CN，-CONH(C1-C4)，-NH3，C1-C4烷基氨基， C1-C4二烷基氨基，-NHSO2(C1-C4)， -NHCO(C1-C4)，和-NO2。
b)五-，六-或七是饱和的，不饱和的或部分不饱和的杂环，该杂环含 有至多两个选自由-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基)-，-N＝， 和-S(O)m-(其中m是0-2的整数)组中的杂原子，该杂环可选择地 被1-3个独立地选自由下列基团组成的取代基取代；氢原子，羟基，卤素， C1-C4烷基，三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1- C4酰氧基，C1-C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基 磺酰基，羟基(C1-C4)烷基，被1至3个(C1-C4)烷基， -CO2H-，-CN-，-CONHR1-，-NH2-，(C1-C4) 烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-NHSO2R1-，-NHCOR1-， -NO2-取代的苯基；
c)由一个五或六员杂环与苯环稠合组成的二环环系，该杂环含有最多2 个选自-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基)-，和-S(O)m-( 其中m是0-2的整数)的杂原子，该杂环可选择地被1-3个独立地选自由 下列基团组成的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤代 甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4酰氧基，C1-C4烷 硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4) 烷基，被1至3个(C1-C4)烷基，-CO2H-，-CN-， -CONHR1-，-NH2-，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨 基，-NHSO2R1-，-NHCOR1，-NO2取代的苯基。
上述通过连环的R7和R8形成的环可以包括但不限于为氮丙啶，氮杂环 丁烷，吡咯烷，哌啶，或六亚甲基胺环。
更优选的是，当R7和R8连接在一起为-(CH2)p-时，这样形成 的环可选择地被1-3个含有C1-C3烷基，三氟甲基，卤原子，氢原子， 苯基，硝基，-CN的取代基所取代。
本发明最优选的化合物是那些含有上面式I或II结构的化合物及其药用 盐，其中R1是OH；R2-R6如上定义；X则选自Cl，NO2，CN， CF3，或CH3；和Y是部分 和R7和R8连接在一起为-(CH2)p-，其中p是4至6的整数，形成 可选择地被最多3个选自下列的取代基取代的环，这些取代基是氢原子，羟基， 卤素，C1-C4烷基，三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基， C1-C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基 (C1-C4)烷基，-CO2H，-CN，-CONH(C1-C4)烷基， -NH3，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基， -NHSO2(C1-C4)，-NHCO(C1-C4)烷基，和-NO2。
本发明包括与无机或有机酸通过加成反应形成的药用盐。无机酸如盐酸， 氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸，硝酸可以使用，有机酸如乙酸，丙酸，柠檬酸， 马来酸，苹果酸，酒石酸，邻苯二甲酸，琥珀酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，萘磺 酸，樟脑磺酸，苯磺酸同样也可使用。已知含有碱性氮原子的化合物可以与许 多不同的酸(质子酸和非质子酸)配合并且本发明化合物优选以其酸加成盐形 成服用。
本发明化合物是部分雌激素激动剂并且具有与雌激素受体的高亲和性。不 同于许多雌激素，然而，这些化合物不引起子宫湿重量的增加。这些化合物在 子宫中是抗雌激素的并且能全完拮抗雌激素激动剂在子宫组织中的营养作用。 这些化合物可用于治疗或预防哺乳动物由雌激素不足引起的或与之有关的疾病 状态或症状。
本发明化合物通过降低胆固醇和预防骨的损失而具有类雌激素激动剂的作 用。因此，这些化合物可用于治疗许多疾病包括骨质疏松，前列腺肥大，不育 症，乳腺癌，子宫内膜肿瘤，心血管疾病，避孕，阿耳茨海默氏疾病，黑素瘤。 此外，这些化合物能用于绝经后妇女激素的替代沿疗或对其它雌激素不足状态 可使雌激素供给的补充。
本发明化合物也可用于骨的损失的治疗方法中，这种骨损失是由于个体中 新的骨组织的形成和老组织的再吸收的不平衡，而导致骨的净损失。这种骨的 缺失可导致大量个体，特别是绝经后妇女，子宫切除后妇女，接受或已接受长 期皮质甾类治疗的患者，性腺发育不全者，和患库兴氏综合症的患者。对于骨 复位的特别需要可以给骨折，有缺陷骨架的患者，和那些接受与骨相关的外科 手术和/或假体移植的患者使用这些化合物。除了上述这些问题，这些化合物 还可用于治疗关节炎，佩吉特疾病，骨软化，骨质缺乏，子宫内膜癌症，多发 性骨髓瘤和其它形式的对骨组织有害影响的癌症。此外所列的疾病的治疗方法 可以理解为包括给需要这种治疗的患者服用药学有效量的一个或多个本发明化 合物或其药用盐。本发明也包括使用一个或多个这些化合物，和/或其药用盐， 与一个或多个药用载体，赋形剂等的药物组合物。
可以理解，这些化合物的服药剂量，方案和方式将根据疾病和被治疗的患 者变化并且涉及医师的判断。优选在服用此处的化合物时开始以低剂量并增加 直至达到所需效果。
这些化合物的有效服用的剂量以大约0.1mg/天至大约1000mg/ 天。优选地，服药可以约50mg/天至600mg/天的单剂或以二或多个分 剂量服用。这种剂量可以直接用活性化合物以多种方式服药到患者的血流中， 包括口服，非肠道给药(包静脉注射，腹腔注射和皮下注射)，和透皮给药。
为了公开的目的，透皮给药可以理解为包括所有通过体表或身体的内通道 包括上皮和粘膜组织的服药。这种服药可通过用这些化合物或其药用盐在洗液， 乳剂，泡沫，碎片，悬浮液，溶液和栓剂(直肠或阴道)中来完成。
含有本发明化合物的口服制剂包括任何的常规使用的口服形式，包括片剂， 胶囊，颊给药形式，锭剂，糖锭和口服液，悬浮液或溶液。胶囊可以含有活性 化合物与惰性充填剂和/或稀稀剂例如药用淀粉(如玉米，马铃薯或木薯淀粉)， 糖，人造甜味剂，粉沫纤维素，如晶体和微晶纤维素，面粉，明胶，树胶等的 混合物。可用的片剂可以通过常规的压片。湿粒化或干粒化方法并使用药用稀 释剂，粘合剂，润滑剂，崩解剂，悬浮剂或稳定剂，包括，但不限于硬脂酸镁， 硬脂酸，滑石，十二烷基硫酸钠，微晶纤维素，羧甲基纤维素钙，聚乙烯吡咯 烷酮，明胶，藻酸，金合欢胶，黄原胶，柠檬酸钠，复合硅胶，碳酸钙，甘氨 酸，糊精，蔗糖，山梨醇，磷酸二钙，硫酸钙，乳糖，高岭土，甘露糖醇，氯 化钠，滑石，干淀粉和糖粉制成。此处的口服制剂可以用标准延迟或控时释放 制剂来改变活性化合物的吸收。栓剂可以用常规材料，包括可可油，加或不加 蜡来改变栓剂的熔点，和甘油来制备。水溶性栓剂基质，例如不同分子量的聚 乙二醇也可使用。
本发明化合物一般可根据下列的反应流程1和2来合成。 流程图1
流程图1中起始的吲哚的合成可通过在适宜的高沸点溶剂如DMF中被适 当取代的苯胺(1)和被适当取代的α-溴代苯基苯丙酮(2)来完成。然后 将产物用4-溴苄基溴化物进行烷基化得取代的吲哚(3)。在这一点上，可 将苯酚(如果出现)去保护。通常，苯酚用苄醚保护并可常规地用TMSI去 除。可以在Heck反应条件下用纯Et3N或Et3N/CH3CN结合丙烯酰 胺。 流程图2
流程图2中起始的吲哚的合成可以在适当的高沸点溶剂如DMF中加热被 适当取代的苯胺(1)与被适当取代的α-溴代苯基烷基苯酮(2)而完成。 然后可将产物用4-碘苄基溴化物烷基化而得到吲哚(3)。在这一点，可将 苯酚(如果出现)脱保护。通常，苯酚可以用苄醚保护并可常规地用TMSI 去除。然后可以将炔丙胺结合到苯基碘化物上。炔丙胺一般可由炔基溴化物或 甲苯磺酰炔基酯通过与适当的胺进行取代来制备。取代反应可以就地完成，不 需分离炔丙胺。3-位不是烷基取代的化合物可以通过先合成3-位有H取代 的吲哚来制备。然后可将吲哚进行亲电卤化，甲酰化等，得到其它3-位取代 的化合物。
此处用于反应的溶剂是不需进一步纯化的无水Aldrich Sure Seal TM。 试剂一般为Aldrich的并不需进一步纯化便使用。所有反应是在氮气中进行。 色谱中使用的是230-400目硅胶(Merck Grade 60，Aldrich Chemical Company)。薄层色谱用EM Science的硅胶60 P254 板。1H NMR谱是用Bruker AM-400仪在DMSO中得到的并且化学 位移以ppm表示。熔点用Thomas-Hoover仪测定并且未校正。IR谱是用 Perkin-Elmer衍射光栅计或Perkin-Elmer 784分光光度计记录的。质谱是用 Kratos MS 50或Finnigan 8230质谱仪测定的。元素分析是用 Perkin-Elmer2400元素分析仪测定的。分析值在0.4％理论值中。
本发明通过下列不依限制的实施例来进一步说明。
实施例1
5-苄氧-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
在烧瓶中加入4-苄氧基苯胺(45g，0.23mol)，4’-苄氧 -2-溴苯基苯丙酮(21g，O.066mol)，和DMF(50ml)。 将反应物回流加热30分钟然后冷却至室温，然后使其在EtOAc(250 ml)和1N HCl(水溶液)(100mL)间分配。将EtOAc部分 用NaHCO3(水溶液)和盐水洗涤，用MgSO4干燥。将溶液浓缩并将 残余物用CH2Cl2提取并加入己烷沉淀出25g固体粗品。将固体溶于 CH2Cl2中并在硅胶上蒸发再用CH2Cl2/己烷(1∶5)进行色谱 分离得到9.2g褐色固体(33％)：MPt＝150-152℃；1H NMR
(DMSO)10.88(s，1H)，7.56(d，2H，J＝8.8Hz)，7.48(d，4H，J＝7.9Hz)，7.42-
7.29(m，6H)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.13(d，2H，J＝8.8Hz).7.08(d，1H，J＝
2.2Hz)，6.94(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.16(s，2H)，5.11(s，2H)，2.33(s，3H)：
IR(KBr)3470，2880，2820，1620cm-1；MS cI m/z419.
实施例2
5-苄氧-2-(4-氟-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
类似地制备标题化合物(3)：Mp＝132℃，1HNMR(DMSO) 11.0(s，1H)，7.68-7.64(m，2H)，7.49-7.47 (m，2H)，7.41-7.31(m，5H)，7.23(d，1H，J＝ 8.8Hz)，7.10(d，1H，J＝2.4Hz)，6.82(dd，1H， J＝8.8，2.4Hz)，5.11(s，2H)，2.34(s，3H)；M S EI m/z 331；CHN calcd for C22H18FNO。
实施例3
5-苄氧-2-(4-苄氧-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4- 苯基溴化物)-吲哚
将60％ NaH(0.17g，7.1mmol)的DMF(20mL) 溶液冷却至0℃用在其中滴加苄氧吲哚1(2.5g，5.94mmol)的 DMF(10m1)溶液来处理。15分钟后，再滴加4’-溴苄基溴化物( 1.63g，6.53mmol)的DMF(10mL)溶液。将反应物在0℃ 搅拌5分钟然后再在室温20分钟。将反应混合物用乙醚(300mL)稀释 并用NH4Cl(2×25mL)然后NHCO3(1×25mL)，和盐水 (25mL)洗涤。将有机提取物用MgSO4干燥并浓缩。将残余物用TH F/己烷结晶得到2.7g(77％)2：Mp＝144-146℃；
1HNMR(CDCl3)7.51-7.36
(m，8H)，7.34(d，4H，J＝8.6Hz)，7.20(d，2H，J＝8.8Hz)，7.15(d，1H，J＝2.4
Hz)，7.03-7.00(m，3H)，6.89(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.6Hz)，
5.14(s，2H)，5.12(s，2H)，5.09(s，2H)，2.25(s，3H)；IR(KBr)3400，3020，1600
cm-1；MS eI m/z587.
实施例4
5-苄氧-2-(4-氟-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯 基溴化物)-吲哚
类似地制备标题化合物化合物5。Mp＝139-139.5℃；
1H NMR(DMSO)7.49-7.46(m，2H)，7.41-7.37(m，6H)，7.33-7.27(m，4H)，7.24
(d，1H，J＝8.8Hz)，7.16(d，1H，J＝2.2Hz)，6.84(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz).6.73
(d，1H，J＝8.6Hz)，5.2(s，2H)，5.12(s，2H)，2.15(s，3H)；IR(KBr)2920，1630
cm-1；MS eI m/z(499/501，出现Br)；CHN calcd for C29H23BrFNO.
实施例5
2-(4-羟苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)- 引哚-5-醇
将由5(0.5g，0.85mmol)和CH2Cl2(10mL)组成 的溶液在室温通过滴加3.5当量TMSI(0.47mL，3.0mmol) 处理。两小时后，将反应停止并于其中再加2.2当量TMSI并将反应物加 热回流5小时。将反应物冷却至0℃并缓慢加入甲醇以猝灭反应。将反应物用 乙醚(25mL)稀释并用NaHCO3(25mL)，10％Na2SO3(25mL)和盐水洗涤。将乙醚层用MgSO4干燥并浓缩到硅胶上。用 EtOAc/己烷(1∶4至1∶1)进行色谱得到0.25g3(71％)； Mp＝83-86℃；1HNMR(CDCl3)苯酚上的2H宽峰
(＞10)，s7.35(d，2H，J＝9.0Hz)，7.15(d，2H，J＝8.8Hz)，7.01(dd，1H，J
＝2.4，0.4HZ)，6.86(d，2H，J＝8.8HZ)，6.80(d，1H，J＝8.6Hz)，6.72(dd，1H，
J＝8.6，2.4Hz)，5.10(s，2H)，4.88(s，1H)，4.50(s，1H)， 2.21(s，3H)；MS eI m/z
407/409含有Br；IR 3390，2900，1600cm-1；CHN calc′d for C22H18BrNO2+0.25
EtOAc.
实施例6
2-(4-氟-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)-吲哚-5-醇 类似地制备标题化合物为化合物7并分离为泡沫
1H NMR (DMSO)8.79(s，1H)，7.39-7.34(m，4H)，7.32-7.30(m，3H)，
7.11(d，1H，J＝8.8Hz)，6.85(d，1H，J＝2.2Hz)，6.74(d，1H，J＝2.4Hz)，6.63
(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.16(s，2H)，2.11(s，3H)；IR(KBr)3400，2900，1630
cm-1；MS eI m/z 409/411 contains Br. 吲哚丙烯酰胺的一般制备方法。
将实施例3在Et3N的溶液中用三-邻-甲苯基膦(10mol％)和 丙烯酰胺(1.25当量)处理并加N2充分吹扫并加入Pd(OAc)2(2.5m ol％)。将反应物在密封管中加热至100-110℃直至用TLC分析反 应完全。将粗反应物浓缩并直接结晶或在硅胶上色谱纯化。
实施例7
(E)-N，N-二乙基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝160-165℃；1H NMR 9.67(s，1H)，8.72(s，1H)，7.50(d，2H，J＝8.1 Hz)，7.37(d，1H，J＝15.4Hz)，7.17(d，2H，J＝8.3Hz)，7.06(d，1H，J＝8.8 Hz)，6.97(d，2H，J＝15.4Hz)，6.86-6.82(m，5H)，6.58(dd，1H，J＝8.6，2.2 Hz)，5.19(brs，2H)，3.47-3.42(m，2H)，3.34-3.30(m，2H)，2.09(s，3H)，1.10(t， 3H，J＝7.0Hz)，1.03(t，3H，J＝7.0Hz)；IR(KBr)3300，2950，1660，1580cm-1； MS(eI)m/z 454；CHN calc′d for C29H30N2O3+0.15CH2Cl2+0.30H2O.
实施例8
1(E)-N-叔丁基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基) -3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝168-170℃；1H NMR 9.66(s，1H)，8.71(s，1H)，7.66(s，1H)，7.34(d，
2H，J＝8.3Hz)，7.24(d，1H，J＝15.8Hz).7.15(d，2H，J＝8.3Hz)，7.05(d，1
H，J＝8.6Hz)，6.85-6.82(m，5H)，6.59-6.56(m，1H)，6.55(d，1H，J＝16.0Hz)，
5.18(s，2H)，2.11(s，3H)，1.28(s，9H)；IR(KBr)3350，2950，1660，1620；MS
(eI)m/z 454；CHN calc′d for C29H30N2O3+0.4H2O
实施例9
(E)-吡咯烷基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)- 3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝170-175℃；1H NMR 9.67(s，1H)，8.71(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.1 Hz)，7.35(d，1H，J＝15.4Hz)，7.16(d，2H，J＝8.6Hz)，7.05(d，1H，J＝8.8 Hz)，6.88-6.81(m，6H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.19(brs，2H)，3.56(t，2 H，J＝6.6Hz)，3.35(m，2H)，2.11(s，3H)，1.87(p，2H，J＝7.0Hz)，1.77(p，2 H，J＝7.0Hz)；MS m/z 452；CHN calc′d for C29H28N2O3+0.1MeOH+1.3H2O.
实施例10
(E)-N，N-二甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝278-280℃；1H NMR(DMSO)9.65(s，1H )，8.70(s，1H)，7.50(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.33(d，1H，J＝15.4Hz)，7.15(d，2H，J＝8.6Hz)，7.07(d，1H，J＝
15.6Hz)，7.05(d，1H，J＝8.8Hz)，6.85-6.80(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.4
Hz)，5.19(s，2H)，3.09(s，3H)，2.88(s，3H)，2.11(s，3H)；MS eI m/z 426；IR
(KBr)3410，3220，1650，1580cm-1；CHN calc′d for C27H26N2O3+0.5H2O.
实施例11
(E)-N，N-二丁基-3-[4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝126-128℃，1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.70(s，1H)，7.48(d，2H，
J＝8.3Hz)，736(d，1H，J＝152Hz)，7.16(d，2H，J＝8.6Hz)，7.05(d，1H，J＝
8.6Hz)，6.97(d，1H，J＝15.2Hz)，6.86-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4
Hz)，5.19(s，2H)，3.39(t，2H，J＝7.0Hz)，3.29(t，2H，J＝7.2Hz)，2.11(S，3
H)，1.48-1.43(M，4H)，1.29-1.20(M，4H)，0.87(t，6H，J＝7.2Hz)；MS eI m/z
510；IR(KBr)3300，2920，2900，2850，1650，1625，1580cm-1；CHN calc′d for
C33H38N2O3.
实施例12
(E)-N-丁基，N’-甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟 基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝240-242℃；1H NMR(DMSO)9.66(s，1H)，8.70(s，1H)，7.50(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.38-7.32(m，1H)，7.16(d，2H，J＝6.8Hz)，7.06-7.01(m，2H)，
6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.19(s，2H)，3.44，3.33(2t，2
H，J＝7.2Hz)，3.06，2.87(2s，3H)，2.11(s，3H)，1.45(m，2 H)，1.24(p，2H，J＝
7.5Hz)，0.87(t，3H，J＝7.2Hz)；Ms eI m/z 468；IR(KBr)3300，1660，1590cm-1；
CHN calcd for C30H32N2O3+0.2H2O.
实施例13
(E)-吗啉代-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3 -甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝165-167℃，1H NMR(DMSO)9.66(s，1H)，8.71(s，1H)，7.52(d，2H， J＝8.1Hz)，7.39(d，1H，J＝15.4Hz)，7.15(d，2H.J＝8.6Hz)，7.12(d，1H，J＝ 15.4Hz)，7.06(d，1H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2 Hz)，5.19(s，2H)，3.65-3.64(m，2H)，3.59-3.53(m，6H)，2.11(s，3H)；IR(KBr) 3330，1650，1620，1580cm-1；MS(FAB)m/z 469(M+H+)；CHN calc′d for C29H28N2O4+0.5H2O.
实施例14
(E)-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基- 吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝161-163℃，1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.70(s，1H)，7.48(s，1H)， 7.37(d，2H，J＝8.35Hz)，7.30(d，1H，J＝15.8Hz)，7.14(d，2H，J＝8.35Hz)， 7.04(d，2H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.48 (d，1H，J＝15.8Hz)，5.18(s，2H)，2.10(s，3H)；IR(KBr)3320，3180，1660，1580 cm-1；MS(FAB)m/z 399(M+H+)；CHN calc′d for C25H22N2O3+1.3H2O.
实施例15
(E)-N，甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)- 3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝155-158℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.99(d，1H，
J＝4.4Hz)，7.37(d，2H，J＝8.1Hz)，7.30(d，1H，j＝15.8Hz)，7.14(d，2H，J＝
8.6Hz)，7.03(d，1H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.4
Hz)，6.48(d，1H，J＝15.8Hz)，5.18(s，2H)，2.66(d，3H，J＝4.6Hz)，2.10(5，3
H)；IR(KBr)3400，1660，1620cm-1；MS eI m/z 412；CHN calc′d for C26H24N2O3+
0.4H2O.
实施例16
(E)-N，N-二丁基-3-{4-【5-羟基-2-(4-氟-苯基) -3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝180℃；1H NMR(DMSO)8.77(s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.4Hz)，7.41-
7.38(m，3H)，7.38-7.29(m，3H)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz)，6.97(d，1H，J＝15.4
Hz)，6.85(d，1H，J＝2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.1Hz)，5.2(s，2H)，3.40-3.36
(m，2H)，3.30-3.27(m，2H)，2.10(s，3H)，1.50-1.40(m，4H)，1.29-1.21(m，4
H)，0.86(t，6H，J＝7.2Hz)；IR(KBr)3180，2950，2900，2850，1650，1590cm-1；
MS eI m/z 512；CHN calcd for C33H37N2O2.
实施例17
(E)-N-丁基，N’-甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-氟 -苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝153-153.5℃；1H NMR(DMSO)8.77(s，1H)，7.50(d，2H，J＝8.1Hz)，
7.42-7.36(m，2H)，7.35-7.28(m，3H)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz)，7.03(dd，1H，J
＝15.4，2.6Hz)，6.84(d，1H，J＝2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.1Hz)，6.62(dd，1H，
J＝8.8，2.4Hz)，5.21(s，2H)，3.44，3.41(2t，2H，J＝7.0Hz)，3.06，2.87(2s，3
H)，2.10(s，3H)，1.49-1.42(m，2H)，1.27-1.20(m，2H)，0.86(t，3H)；IR(KBr)
3300，2950，2860，1645，1580cm-1；MS eI m/z 470；CHN calcd for C30H31FN2O2.
实施例18
5-苄氧基-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
在烧瓶中加入4-苄氧基苯胺(45g，0.23mol)，4’-苄氧 基-2-溴苯基苯丙酮(21g，0.066mol)，和DMF(50mL)。 将反应物加热回流30分钟然后冷却至室温并使其在EtOAc(250mL) 和1N HCl(水溶液)(100mL)间分配。将EtOAc部分用 NaHCo3(水溶液)和盐水洗涤，用MgSO4干燥。将溶液浓缩并将残 余物用CH2Cl2提取并加入己烷沉淀出25g固体粗品。将固体溶于 CH2Cl2中并在硅胶上蒸发再用CH2Cl2/己烷(1∶5)色谱纯化 得到9.2g褐色固体(33％)：Mpt＝150-152℃；1HNMR (DMSO)10.88(s，1H)，7.56(d，2H，J＝8.8Hz)，7.48(d，4H，J＝7.9Hz)，7.42 7.29(m，6H)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.13(d，2H，J＝8.8Hz)，7.08(d，1H，J＝ 2.2Hz)，6.94(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.16(s，2H)，5.11(s，2H)，2.33(s，3H)； IR(KBr)3470，2880，2820，1620cm-1；MS eI m/z 419.
实施例19
5-苄氧基-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基碘化物)-吲哚
将4(3.0g，7.4mmol)的DMF(25mL)溶液用NaH( 60％分散液，0.21g，8.9mmol)处理并在室温搅拌15分钟。在 其中加入4-碘溴化苄溴化物(2.2g，7.4mmol)并将反应物搅拌1 小时。将反应混合物倾倒入水中并用EtOAc萃取，用MgSO4干燥并浓 缩。粗品用乙醚研制得到2.2g白色固体产物：Mpt＝153-156℃， 1H NMR(DMSO)7.54(d，2H)＝8.6 Hz)，7.52-7.45(m，4H)，7.37-7.29(m，6H)，7.27(d，2H，J＝8.8Hz)，7.17(d，1 H，J＝9.0Hz)，7.13(d，1H，J＝2.2Hz)，7.10(d，2H，J＝8.8Hz)，6.81(dd，1H，J ＝8.8，2.4Hz)，6.60(d，2H，J＝8.3Hz)，5.18(s，2H)，5.12(s，2H)，5.11(s，2H)， 2.15(s，3H)；MS eI m/z 635.
实施例20
2-(4-羟苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基碘化物)- 吲哚-5-醇
将4(2.2g，3.5mmol)的CHCl3溶液用碘化三甲基硅烷( 1.04mL，7.0mmol)处理并将反应物加热至回流。2小时后，再加 3当量碘化三甲基硅烷并将反应物室温搅拌18小时。加入甲醇(5mL)猝 灭反应。有机层用10％的Na2SO3水溶液，HCl(1M)水溶液洗涤 并用MgSO4干燥。将溶液浓缩并在硅胶上用EtOAc/己烷(3∶7) 进行色谱纯化得到4a为泡沫(1.2g)：
1H NMR 9.65(s，1H)，8.71(s，1H)，7.54(d，2H，J＝ 8.3Hz)，7.12(d，2H，J＝8.3Hz)，7.02(d，1H，J＝8.6Hz)，6.84-6.80(m，3H)， 6.61(d，2H，J＝8.3Hz)，6.57(dd，1H，J＝6.4Hz)，5.12(s，2H)，2.09(s，3H)； MS eI m/z 455. 吲哚炔丙胺制备的一般方法
实施例21-23的标题化合物可以用将含有10倍摩尔过量的二级胺的 DMF溶液冷却至0℃并用炔丙溴化物(3当量，80％的甲苯溶液)处理来 制备。在0℃1小时后，将反应物在室温1小时。加入吲哚碘化物(4a， 1当量)接着加入Cu(I)I(0.1当量)和Pd(PPh3)2Cl2(0.035当量)。然后将反应混合物搅拌16-48小时然后将其倾倒入 水中并用EtOAc萃取。将EtOAc部分浓缩并在硅胶上用EtOAc/ 己烷为洗脱系统进行色谱纯化。
实施例21
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-N，N-二甲基 -1-基-丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇
Mp＝173-176℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.25(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.12(d，2H，J＝8.3Hz)，7.03(d，1H，J＝8.6Hz)，6.83-6.78(m，5
H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.17(s，2H)，3.39(s，2H)，2.19(s，6H)，2.10
(s，3H)；IR(KBr)3390，1490cm-1；MS esI 411(M+H+).
实施例22
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-哌啶-1-基- 丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇
Mp＝118-123℃；1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.71(s，1H)，7.24(d，2H， J＝8.1Hz)，7.12(d，2H，J＝8.6Hz)，7.02(d，1H，J＝8.6Hz)，6.83-6.80(m，5 H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.17(s，2H)，3.39(s，2H)，2.41(m，4H)，2.10 (s，3H)，1.48(p，4H，J＝5.7Hz)，1.36-1.33(m，2H)；IR(KBr)3400，2920，1620， 1420cm-1；MS EI m/z 450；CHN calc′d for C30H30N2O2+0.25H2O
实施例23
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-吡咯烷-1-基 -丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇(5c)
Mp＝174-176℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.23(d，2H，
J＝8.3Hz)，7.11(d，2H，J＝8.6Hz)，7.02(d，1H，J＝8.8Hz)，6.84(m，5H)，
6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.17(s，2H)，3.53(s，2H)，2.53-2.51(m，4H)，
2.09(s，3H)，1.69-1.66(m，4H)；IR(KBr)3400，2920，2900，1620c-1；MS cI
m/z 436；CHN calcd for C29H28N2O2+0.7H2O. 生物学方法 体外雌激素受体结合测定 受体的制备
使超表达雌激素受体的CHO细胞在DMEM+10％活性炭包衣的葡聚 糖，已脱色的胎牛血清中的150mm2盘上生长。将该盘用PBS洗涤两次 并用10mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA洗涤一次。 通过刮面收集细胞然后将细胞悬液于冰中。在手提式电动组织研磨机上用2个 10-秒破裂将细胞破碎。将粗制品在12000g离心20分钟接着在转速 100000g离心60分钟得到核糖体游离胞质溶胶。然后将胞质溶胶在- 80℃冷冻并储藏。用参考标准蛋白进行BCA测定以确定胞质溶胶中的蛋白 质浓缩物。 结合测定条件
在与投入的【3H】-17β-雌二醇总量的结合＜2.0％的96-孔 板(聚苯乙烯*)上进行竞争性测定并且每个数据收集三份。将100uG/ 100μL的受体制品在每个孔上分成等份。将50uL体积的2.5nM 【3H】17β-雌二醇十竞争剂(或缓冲液)的饱和剂量加到初级竞争中， 而测定100×和500×竞争剂时，则仅用0.8nM【3】17β-雌二 醇。将该板在室温保温2.5小时。在保温时间结束时将150uL冰冷却的 活性炭包衣的葡聚糖(5％活性炭包衣0.05％ 69k葡聚糖)加入每个 孔中并将该板立即在4℃99g离心5分钟。将200μL上清液除去依闪 烁计数。无论哪一个先出现，样品计数2％或10分钟。由于聚苯乙烯吸收少 量【3H】17β-雌二醇，含有放射性和胞质溶胶，但不用活性炭操作的孔 包含定量有效同位素。同时，含有放射性但没有胞质溶胶的孔用活性炭操作以 测定未除去的【3H】17β-雌二醇的DPM。使用Corning #25880-96，96-孔板，因为经证明它们结合雌二醇的量最少。 结果分析
通过Beckman LS7500闪烁计数仪用一套猝灭标准物将放射性的每 分钟计数(CPM)自动转变为每分钟衰变(DPM)以使每个样品产生一个 H#。用下式计算在100倍或500倍竞争剂存在时雌二醇结合的百分数：
((DPM样品-未用活性炭除去的DPM)/(DPM雌二醇-未用活性炭 除去的DPM))×100％二雌二醇结合％
为了得到IC50曲线，将结合％对化合物绘图。IC50值是由在 500×竞争剂显示＞30％竞争的化合物浓度产生。对于该方法的描述，可 见Hulme，E.C.，1992版。Receptor-Ligand Interactions；A Practical Approach，IRL Press，New York(特别见第8章)。 IShikawa细胞碱性磷酸酶测定 细胞的保持和处理
将Ishikawa细胞保持在含有苯酚红+10％胎牛血清的DMEM/F12 (50％∶50％)中并给培养基供给2mM Glutamax，1％ Pen/Strap 和1mM丙酮酸钠。在每个试验(处理细胞)前5天将培养基变成除去苯酚红 的DMEM/F12+10％活性炭包衣的10％葡聚糖的已脱色的血清。在 试验的前一天，将细胞用0.5％胰蛋白酶/EDTA收集并置于密度为 5×104细胞/孔的96-孔组织培养板上。试验化合物的剂量除10-6M(化合物) +10-9M17β-雌二醇外还有10-6，10-7和10-8M来评价化合 物作抗雌激素的能力。测定前将细胞处理48小时。每个96-孔板含有一个 17-β-雌二醇对照。每个剂量的样品群为n＝8。 碱性磷酸酶测定
在48小时后抽吸培养基并将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗三次。将 50μL裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.8，0.2％ Triton X-100)加入到每个孔中。将板置-80℃15分钟。将板在37℃ 保温接着在每个孔中加入150μL含有4mM磷酸对-硝基苯酯(pNPP) 的0.1M Tris-HCl pH9.8(最终浓度，3mMpNPP)。
用KineticCalc Application程序(Bio-Tek，Instruments，Inc.， Winooski，VT)进行吸光度和斜率的计算。在反应动力曲线(光密度每5分 钟读取作30分钟吸收读取)的线性部分上平均，其结果表示为酶反应(斜率) 速率的平均+/-S.D.。化合物结果概括为与1nM17β-雌二醇相关的响 应的百分数。
用碱性磷酸酶法测定不同化合物的雌激素活性并计算相应的ED50值( 95％ C.I)。下列四条用作参考标准：
17β-雌二醇 0.03nM
17α-雌二醇 1.42nM
雌二醇 0.13nM
雌酮 0.36nM
该方法的描述可见Holinka，C.F.，Hata，H.Kuramoto，H.和Gurpide，E .(1986)的甾体激素和抗甾体对人体子宫内膜癌细胞(Ishikawa Line) 的碱性磷酸酶活性的影响。Littlefield，B.A.Gurpide，E.Markiewicz， L.McKinley，B.的Cancer Research.46：2771-2774，和 Hochberg，R.B.(1990)的Ishikawa细胞中基于刺激碱性磷酸酯的简单 和敏感微量滴定板的雌激素生物测定；D5肾上腺甾体化合物的雌激素作用。 Endocrinology，6：2757-2762。 2X VIT ERE转染测定 细胞的保持和处理
将用人体雌激素受体稳定转染的Chinese Hamster Ovary细胞 (CHO)在DMEM+10％胎牛血清(FBS)中保持。处理前48小时 将生长培养基换成没有苯酚红的DMEM+10％葡聚糖包衣的活性炭脱色 PBS(处理培养基)。将细胞置于密度为5000细胞/孔的含有200μL培 养基/孔的96-孔板上。 磷酸钙转染
将报道DNA(在基本胸苷激酶促进剂前推动萤光素酶基因的含有2个卵 黄生成素ERE串联拷贝的Promega质粒p GL 2)与B-半乳糖苷酶表达质粒 pCH110(Pharmacia)和载体DNA(pTZ18U)以下列比率 混合：
10uG 报道DNA
5uG pCH110DNA
5uG pTZ18U
20uG DNA/1mL转染液
将DNA(20uG)溶解在500uL 250mM无菌CaCl2中 并将其滴加到500uL 2×HeBs(0.28m NaCl，50mM HEPES，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)中，然后在室温 保温20分钟。将20uL这种混合物加到每个细胞孔中并在细胞上保持16 小时。保温结束后除去沉淀，将细胞用培养基洗涤，换上新处理的培养基并将 细胞用载体，1nM17β-雌二醇，1uM化合物或1μM化合物+1 nM17β-雌二醇(用作雌激素拮抗试验)处理。每一个处理条件作8孔(n ＝8)，这些孔在进行萤光素酶测定前保温24小时。 萤光素酶测定
在暴露于化合物24小时后，将培养基除去并用2X没有Mg++和 Ca++的125uL的PBS洗涤每个孔。除去PBS后，将25uL Promega裂解缓冲液加到每个孔中并于室温静置15分钟，接着于-80℃ 15分钟和37℃15分钟。将20uL裂解液转移到不透明的96孔板进 行萤光素酶活性评价并用保持裂解液(5μl)进行B-半乳糖苷酶活性评价(正 态转染)。将萤光素(luciferan)底物(Promega)加入用发光计自动等份为 100uL的每个孔中并将产生的光(相对光单位)在加入后读取10秒钟。 B-半乳糖苷酶测定
在保持5uL裂解液中加入45uL PBS。然后加入50uL Promega B-半乳糖苷酶2X测定缓冲液，将孔混合并于37℃保温1小时。 将含有标准曲线(0.1至1.5毫单位三份)的板用于每个试验。在 Molecular Devices分光光度计板取器上在410nm分析这些板。将未知 的光密度从标准曲线上用数学外推法转换成活性毫单位。 结果分析
将萤光素酶数据以在10秒测定期间累集的相对光单位(RLUs)形成 得到并自动转移到JMP(SAS Inc)文档中，该文档已将背景 RLUs扣除。B-半乳糖苷酶值被自动输入到该文档中并且这些值被分成 RLUs以得到归一化数据。从n＝8的每个处理来确定平均值和标准偏差。 每个板上将化合物活性与17β-雌二醇比较。用式％＝((雌二醇-对照) /(化合物值))×100来计算与17β-雌二醇活性比较的百分数。这些 技术见Tzukerman，M.T.，Esty，A.Santiso-Mere，D.Danielian，P.，Parker， M.G.Stein，R.B.，Pike，J.W.和Mc Donnel，D.P.的描述(1994)。人 雌激素受体的转激活能力是通过细胞的和推进剂环境两者决定的并通过两个 功能不同的分子内区域介导的(见Molecular Endocrinology，8：21-30)。 子宫营养/抗子宫营养鼠的生物测定
在未成熟鼠子宫营养测定(4天)中确定化合物的雌激素和抗雌激素特性 (见由L.J.Black和R.L.Goode，在Life Sciences，26，1453(1 980)的在先描述)。将未成熟的Sprague-Dawley鼠(雌性，18天龄)分 成六组用于试验。将动物每日腹腔注射10uG化合物，100uG化合物， (100uG化合物+1uG17β-雌二醇)用于测定抗雌激素性，以及 1uG17β-雌二醇，用50％ DMSO/50％盐水作为注射载体。 在第4天将动物用CO2窒息法杀死动物并剥离其子宫然后在过量脂质中解吸， 除去所有流体并确定其湿重。将一个角的一个小截面用于组织学而将其余部分 用于分离总RNA以评价补体组分3的基因表达。 生物学结果 雌激素受体亲和性(报道为RBA：17β-雌二醇＝100) 化合物 RBA 那洛亚芬 200 三苯氧胺 1.8 实施例10 20 实施例7 42 实施例8 40 实施例9 40 实施例12 114 实施例11 80 实施例13 27 实施例14 32 实施例15 53 实施例21 53 实施例22 23 传染萤光素酶测定 化合物 ％激活 ％1nM17β-雌二醇的激活 17β-雌二醇 100％ N/A 雌三醇 38％ N/A 三氧苯胺 0％ 10％ 那洛亚芬 0％ 0％ 实施例10 1％ 2％ 实施例7 4％ 8％ 实施例8 6％ 78％ 实施例9 6％ 8％ 实施例12 13％ 24％ 实施例11 8％ 12％ 实施例13 8％ 17％ 实施例14 19％ 57％ 实施例15 15％ 31％ 实施例21 34％ 34％ 实施例22 17％ 19％ Ishikawa碱性磷酸酶测定 化合物 ％激活 ％激活(化合物+1nM17β
雌二醇) 17β-雌二醇 100％ N/A 三氧苯胺 0％ 45％ 那洛亚芬 5％ 5％ 实施例10 6％ 19％ 实施例7 1％ 9％ 实施例8 10％ 22％ 实施例9 3％ 11％ 实施例12 7％ 16％ 实施例11 6％ 11％ 实施例13 7％ 9％ 实施例14 2％ 14％ 实施例15 0％ 5％ 实施例21 34％ 34％ 实施例22 27％ 23％ 3-天子宫切除鼠模型 化合物 10μG 100μG 三氧苯胺 69.6mg 71.4mg 那洛亚芬 47.5mg 43.2mg 对照＝42.7mg 1μG17β-雌二醇＝98.2 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例7 47.8mg 64.8mg 75.4 对照＝20.2mg 1μG17β-雌二醇＝80.2mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例12 36.9mg 49.5mg 63.1 对照＝31.4mg 1μG17β-雌二醇＝89.0mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例11 39.3mg 59.8mg 81.0mg 对照＝24.5mg 1μG17β-雌二醇＝90.8mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例14 32.5mg 56.4mg 79.8mg 实施例15 40.4mg 56.3mg 69.3mg 对照＝29.1mg 1μG17β-雌二醇＝95.5mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例21 56.0mg 84.0mg 77.6mg 对照＝32.1mg 1μG17β-雌二醇＝90.2mg 实施例22 55.6mg 71.3mg 66.8mg 对照＝21.7mg 1μG17β-雌二醇＝82.8mg
用吲哚作雌激素拮抗剂由Von Angerer在Chemical Abstracts，Vol. 99，No.7(1983)，文摘号53886U，也见于J.Med.Chem. 1990，33，2635-2640；J.Med.Chem.1987，30，13 1-136。也见于Ger.Offen.，DE 3821148A1 89122 8和WO 96/03375。此外，见于WO，A，9323374( Otsuka Pharmaceutical Factory，Inc)。 Yon An9erer的工作仅限于吲 哚氮原子上联接脂肪链和然后联接碱性胺(或酰胺)或，苄基但不具有碱性胺。 在Otsuka(日本)的世界专利中含有与本发明相关的除R3(如式I所示)定 义为-SR其中R是烷基的化合物。此外，在其专利中吲哚氮原子没有侧链， 这与本发明权利要求或实施例给出的结构相同。相关的专利WOA 9310 741描述了5-羟基吲哚。WO A 9517383(kar Bio AB) 描述了脂肪链化合物。
WO A 9517383(Karo Bio AB)描述了具有长直链的吲哚 抗雌激素。另-个相关专利WO A 9310741描述了具有宽范围侧链 的5-羟基吲哚。WO 93/23374(Otsuka Pharmacenticals，(日 本)描述的化合物与本发明化合物的结构更相似，除了此处式I和II中关于 R3在下面定义为硫代烷基的结构之外，并且参考文献中未公开那些与本发明 化合物具有相同结构的具有吲哚氮原子侧链的化合物。
本发明描述
式(I)和(II)所示的通用结构类型的化合物是雌激素激动剂/拮抗 剂，用于治疗与雌激素缺乏有关的疾病。本发明化合物显示强的与雌激素受体 的结合力。这些化合物被证明是没有内在的雌激素特性的抗雌激素。在三天卵 巢切除鼠模型中，式(I)化合物在单独给药时能够拮抗17β一雌二醇的作 用同时又没有子宫刺激。
本发明包括如下的式(I)和(II)化合物及其药用盐： 其中：
R1选自H，OH或其C1-C4酯或烷基醚，或卤素；
R2，R3，R4，R5和R6独立地选自H，OH或其C1-C4酯或 烷基醚，卤素，氰基，C1-C6烷基或三氟甲基，条件是，当R1是H时， R2不是OH；
n是2或3；
X选自H，C1-C6烷基，氰基，硝基，三氟甲基，卤素；
Z选自
Y选自：
a)部分：
其中R7和R8独立地选自以下一组的基团：H，C1-C6烷基，苯基或由 -(CH2)p-连接，其中p是整数2至6，以便形成环，环可选择地被最 多3个选自下列的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤 代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4烷硫基，C1-C4 烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4)烷基， -CO2H，-CN，-CONH(C1-C4)，-NH3，C1-C4烷基氨基， C1-C4二烷基氨基，-NHSO2(C1-C4)， -NHCO(C1-C4)，和-NO2。
b)五-，六-或七是饱和的，不饱和的或部分不饱和的杂环，该杂环含 有至多两个选自由-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基)-，-N＝， 和-S(O)m-(其中m是0-2的整数)组中的杂原子，该杂环可选择地 被1-3个独立地选自由下列基团组成的取代基取代；氢原子，羟基，卤素， C1-C4烷基，三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1- C4酰氧基，C1-C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基 磺酰基，羟基(C1-C4)烷基，被1至3个(C1-C4)烷基， -CO2H-，-CN-，-CONHR1-，-NH2-，(C1-C4) 烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基，-NHSO2R1-，-NHCOR1-， -NO2-取代的苯基；
c)由一个五或六员杂环与苯环稠合组成的二环环系，该杂环含有最多2 个选自-O-，-NH-，-N(C1-C4烷基)-，和-S(O)m-( 其中m是0-2的整数)的杂原子，该杂环可选择地被1-3个独立地选自由 下列基团组成的取代基取代；氢原子，羟基，卤素，C1-C4烷基，三卤代 甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基，C1-C4酰氧基，C1-C4烷 硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基(C1-C4) 烷基，被1至3个(C1-C4)烷基，-CO2H-，-CN-， -CONHR1-，-NH2-，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨 基，-NHSO2R1-，-NHCOR1，-NO2取代的苯基。
上述通过连环的R7和R8形成的环可以包括但不限于为氮丙啶，氮杂环 丁烷，吡咯烷，哌啶，或六亚甲基胺环。
更优选的是，当R7和R8连接在一起为-(CH2)p-时，这样形成 的环可选择地被1-3个含有C1-C3烷基，三氟甲基，卤原子，氢原子， 苯基，硝基，-CN的取代基所取代。
本发明最优选的化合物是那些含有上面式I或II结构的化合物及其药用 盐，其中R1是OH；R2-R6如上定义；X则选自Cl，NO2，CN， CF3，或CH3；和Y是部分 和R7和R8连接在一起为-(CH2)p-，其中p是4至6的整数，形成 可选择地被最多3个选自下列的取代基取代的环，这些取代基是氢原子，羟基， 卤素，C1-C4烷基，三卤代甲基，C1-C4烷氧基，三卤代甲氧基， C1-C4烷硫基，C1-C4烷基亚磺酰基，C1-C4烷基磺酰基，羟基 (C1-C4)烷基，-CO2H，-CN，-CONH(C1-C4)烷基， -NH3，(C1-C4)烷基氨基，二(C1-C4)烷基氨基， -NHSO2(C1-C4)，-NHCO(C1-C4)烷基，和-NO2。
本发明包括与无机或有机酸通过加成反应形成的药用盐。无机酸如盐酸， 氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸，硝酸可以使用，有机酸如乙酸，丙酸，柠檬酸， 马来酸，苹果酸，酒石酸，邻苯二甲酸，琥珀酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，萘磺 酸，樟脑磺酸，苯磺酸同样也可使用。已知含有碱性氮原子的化合物可以与许 多不同的酸(质子酸和非质子酸)配合并且本发明化合物优选以其酸加成盐形 成服用。
本发明化合物是部分雌激素激动剂并且具有与雌激素受体的高亲和性。不 同于许多雌激素，然而，这些化合物不引起子宫湿重量的增加。这些化合物在 子宫中是抗雌激素的并且能全完拮抗雌激素激动剂在子宫组织中的营养作用。 这些化合物可用于治疗或预防哺乳动物由雌激素不足引起的或与之有关的疾病 状态或症状。
本发明化合物通过降低胆固醇和预防骨的损失而具有类雌激素激动剂的作 用。因此，这些化合物可用于治疗许多疾病包括骨质疏松，前列腺肥大，不育 症，乳腺癌，子宫内膜肿瘤，心血管疾病，避孕，阿耳茨海默氏疾病，黑素瘤。 此外，这些化合物能用于绝经后妇女激素的替代沿疗或对其它雌激素不足状态 可使雌激素供给的补充。
本发明化合物也可用于骨的损失的治疗方法中，这种骨损失是由于个体中 新的骨组织的形成和老组织的再吸收的不平衡，而导致骨的净损失。这种骨的 缺失可导致大量个体，特别是绝经后妇女，子宫切除后妇女，接受或已接受长 期皮质甾类治疗的患者，性腺发育不全者，和患库兴氏综合症的患者。对于骨 复位的特别需要可以给骨折，有缺陷骨架的患者，和那些接受与骨相关的外科 手术和/或假体移植的患者使用这些化合物。除了上述这些问题，这些化合物 还可用于治疗关节炎，佩吉特疾病，骨软化，骨质缺乏，子宫内膜癌症，多发 性骨髓瘤和其它形式的对骨组织有害影响的癌症。此外所列的疾病的治疗方法 可以理解为包括给需要这种治疗的患者服用药学有效量的一个或多个本发明化 合物或其药用盐。本发明也包括使用一个或多个这些化合物，和/或其药用盐， 与一个或多个药用载体，赋形剂等的药物组合物。
可以理解，这些化合物的服药剂量，方案和方式将根据疾病和被治疗的患 者变化并且涉及医师的判断。优选在服用此处的化合物时开始以低剂量并增加 直至达到所需效果。
这些化合物的有效服用的剂量以大约0.1mg/天至大约1000mg/ 天。优选地，服药可以约50mg/天至600mg/天的单剂或以二或多个分 剂量服用。这种剂量可以直接用活性化合物以多种方式服药到患者的血流中， 包括口服，非肠道给药(包静脉注射，腹腔注射和皮下注射)，和透皮给药。
为了公开的目的，透皮给药可以理解为包括所有通过体表或身体的内通道 包括上皮和粘膜组织的服药。这种服药可通过用这些化合物或其药用盐在洗液， 乳剂，泡沫，碎片，悬浮液，溶液和栓剂(直肠或阴道)中来完成。
含有本发明化合物的口服制剂包括任何的常规使用的口服形式，包括片剂， 胶囊，颊给药形式，锭剂，糖锭和口服液，悬浮液或溶液。胶囊可以含有活性 化合物与惰性充填剂和/或稀稀剂例如药用淀粉(如玉米，马铃薯或木薯淀粉)， 糖，人造甜味剂，粉沫纤维素，如晶体和微晶纤维素，面粉，明胶，树胶等的 混合物。可用的片剂可以通过常规的压片。湿粒化或干粒化方法并使用药用稀 释剂，粘合剂，润滑剂，崩解剂，悬浮剂或稳定剂，包括，但不限于硬脂酸镁， 硬脂酸，滑石，十二烷基硫酸钠，微晶纤维素，羧甲基纤维素钙，聚乙烯吡咯 烷酮，明胶，藻酸，金合欢胶，黄原胶，柠檬酸钠，复合硅胶，碳酸钙，甘氨 酸，糊精，蔗糖，山梨醇，磷酸二钙，硫酸钙，乳糖，高岭土，甘露糖醇，氯 化钠，滑石，干淀粉和糖粉制成。此处的口服制剂可以用标准延迟或控时释放 制剂来改变活性化合物的吸收。栓剂可以用常规材料，包括可可油，加或不加 蜡来改变栓剂的熔点，和甘油来制备。水溶性栓剂基质，例如不同分子量的聚 乙二醇也可使用。
本发明化合物一般可根据下列的反应流程1和2来合成。 流程图1
流程图1中起始的吲哚的合成可通过在适宜的高沸点溶剂如DMF中被适 当取代的苯胺(1)和被适当取代的α-溴代苯基苯丙酮(2)来完成。然后 将产物用4-溴苄基溴化物进行烷基化得取代的吲哚(3)。在这一点上，可 将苯酚(如果出现)去保护。通常，苯酚用苄醚保护并可常规地用TMSI去 除。可以在Heck反应条件下用纯Et3N或Et3N/CH3CN结合丙烯酰 胺。 流程图2
流程图2中起始的吲哚的合成可以在适当的高沸点溶剂如DMF中加热被 适当取代的苯胺(1)与被适当取代的α-溴代苯基烷基苯酮(2)而完成。 然后可将产物用4-碘苄基溴化物烷基化而得到吲哚(3)。在这一点，可将 苯酚(如果出现)脱保护。通常，苯酚可以用苄醚保护并可常规地用TMSI 去除。然后可以将炔丙胺结合到苯基碘化物上。炔丙胺一般可由炔基溴化物或 甲苯磺酰炔基酯通过与适当的胺进行取代来制备。取代反应可以就地完成，不 需分离炔丙胺。3-位不是烷基取代的化合物可以通过先合成3-位有H取代 的吲哚来制备。然后可将吲哚进行亲电卤化，甲酰化等，得到其它3-位取代 的化合物。
此处用于反应的溶剂是不需进一步纯化的无水Aldrich Sure Seal TM。 试剂一般为Aldrich的并不需进一步纯化便使用。所有反应是在氮气中进行。 色谱中使用的是230-400目硅胶(Merck Grade 60，Aldrich Chemical Company)。薄层色谱用EM Science的硅胶60 P254 板。1H NMR谱是用Bruker AM-400仪在DMSO中得到的并且化学 位移以ppm表示。熔点用Thomas-Hoover仪测定并且未校正。IR谱是用 Perkin-Elmer衍射光栅计或Perkin-Elmer 784分光光度计记录的。质谱是用 Kratos MS 50或Finnigan 8230质谱仪测定的。元素分析是用 Perkin-Elmer2400元素分析仪测定的。分析值在0.4％理论值中。
本发明通过下列不依限制的实施例来进一步说明。
实施例1
5-苄氧-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
在烧瓶中加入4-苄氧基苯胺(45g，0.23mol)，4’-苄氧 -2-溴苯基苯丙酮(21g，O.066mol)，和DMF(50ml)。 将反应物回流加热30分钟然后冷却至室温，然后使其在EtOAc(250 ml)和1N HCl(水溶液)(100mL)间分配。将EtOAc部分 用NaHCO3(水溶液)和盐水洗涤，用MgSO4干燥。将溶液浓缩并将 残余物用CH2Cl2提取并加入己烷沉淀出25g固体粗品。将固体溶于 CH2Cl2中并在硅胶上蒸发再用CH2Cl2/己烷(1∶5)进行色谱 分离得到9.2g褐色固体(33％)：MPt＝150-152℃；1H NMR
(DMSO)10.88(s，1H)，7.56(d，2H，J＝8.8Hz)，7.48(d，4H，J＝7.9Hz)，7.42-
7.29(m，6H)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.13(d，2H，J＝8.8Hz).7.08(d，1H，J＝
2.2Hz)，6.94(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.16(s，2H)，5.11(s，2H)，2.33(s，3H)：
IR(KBr)3470，2880，2820，1620cm-1；MS cI m/z419.
实施例2
5-苄氧-2-(4-氟-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
类似地制备标题化合物(3)：Mp＝132℃，1HNMR(DMSO) 11.0(s，1H)，7.68-7.64(m，2H)，7.49-7.47 (m，2H)，7.41-7.31(m，5H)，7.23(d，1H，J＝ 8.8Hz)，7.10(d，1H，J＝2.4Hz)，6.82(dd，1H， J＝8.8，2.4Hz)，5.11(s，2H)，2.34(s，3H)；M S EI m/z 331；CHN calcd for C22H18FNO。
实施例3
5-苄氧-2-(4-苄氧-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4- 苯基溴化物)-吲哚
将60％ NaH(0.17g，7.1mmol)的DMF(20mL) 溶液冷却至0℃用在其中滴加苄氧吲哚1(2.5g，5.94mmol)的 DMF(10m1)溶液来处理。15分钟后，再滴加4’-溴苄基溴化物( 1.63g，6.53mmol)的DMF(10mL)溶液。将反应物在0℃ 搅拌5分钟然后再在室温20分钟。将反应混合物用乙醚(300mL)稀释 并用NH4Cl(2×25mL)然后NHCO3(1×25mL)，和盐水 (25mL)洗涤。将有机提取物用MgSO4干燥并浓缩。将残余物用TH F/己烷结晶得到2.7g(77％)2：Mp＝144-146℃；
1HNMR(CDCl3)7.51-7.36
(m，8H)，7.34(d，4H，J＝8.6Hz)，7.20(d，2H，J＝8.8Hz)，7.15(d，1H，J＝2.4
Hz)，7.03-7.00(m，3H)，6.89(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.6Hz)，
5.14(s，2H)，5.12(s，2H)，5.09(s，2H)，2.25(s，3H)；IR(KBr)3400，3020，1600
cm-1；MS eI m/z587.
实施例4
5-苄氧-2-(4-氟-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯 基溴化物)-吲哚
类似地制备标题化合物化合物5。Mp＝139-139.5℃；
1H NMR(DMSO)7.49-7.46(m，2H)，7.41-7.37(m，6H)，7.33-7.27(m，4H)，7.24
(d，1H，J＝8.8Hz)，7.16(d，1H，J＝2.2Hz)，6.84(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz).6.73
(d，1H，J＝8.6Hz)，5.2(s，2H)，5.12(s，2H)，2.15(s，3H)；IR(KBr)2920，1630
cm-1；MS eI m/z(499/501，出现Br)；CHN calcd for C29H23BrFNO.
实施例5
2-(4-羟苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)- 引哚-5-醇
将由5(0.5g，0.85mmol)和CH2Cl2(10mL)组成 的溶液在室温通过滴加3.5当量TMSI(0.47mL，3.0mmol) 处理。两小时后，将反应停止并于其中再加2.2当量TMSI并将反应物加 热回流5小时。将反应物冷却至0℃并缓慢加入甲醇以猝灭反应。将反应物用 乙醚(25mL)稀释并用NaHCO3(25mL)，10％Na2SO3(25mL)和盐水洗涤。将乙醚层用MgSO4干燥并浓缩到硅胶上。用 EtOAc/己烷(1∶4至1∶1)进行色谱得到0.25g3(71％)； Mp＝83-86℃；1HNMR(CDCl3)苯酚上的2H宽峰
(＞10)，s7.35(d，2H，J＝9.0Hz)，7.15(d，2H，J＝8.8Hz)，7.01(dd，1H，J
＝2.4，0.4HZ)，6.86(d，2H，J＝8.8HZ)，6.80(d，1H，J＝8.6Hz)，6.72(dd，1H，
J＝8.6，2.4Hz)，5.10(s，2H)，4.88(s，1H)，4.50(s，1H)， 2.21(s，3H)；MS eI m/z
407/409含有Br；IR 3390，2900，1600cm-1；CHN calc′d for C22H18BrNO2+0.25
EtOAc.
实施例6
2-(4-氟-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基溴化物)-吲哚-5-醇 类似地制备标题化合物为化合物7并分离为泡沫
1H NMR (DMSO)8.79(s，1H)，7.39-7.34(m，4H)，7.32-7.30(m，3H)，
7.11(d，1H，J＝8.8Hz)，6.85(d，1H，J＝2.2Hz)，6.74(d，1H，J＝2.4Hz)，6.63
(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.16(s，2H)，2.11(s，3H)；IR(KBr)3400，2900，1630
cm-1；MS eI m/z 409/411 contains Br. 吲哚丙烯酰胺的一般制备方法。
将实施例3在Et3N的溶液中用三-邻-甲苯基膦(10mol％)和 丙烯酰胺(1.25当量)处理并加N2充分吹扫并加入Pd(OAc)2(2.5m ol％)。将反应物在密封管中加热至100-110℃直至用TLC分析反 应完全。将粗反应物浓缩并直接结晶或在硅胶上色谱纯化。
实施例7
(E)-N，N-二乙基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝160-165℃；1H NMR 9.67(s，1H)，8.72(s，1H)，7.50(d，2H，J＝8.1 Hz)，7.37(d，1H，J＝15.4Hz)，7.17(d，2H，J＝8.3Hz)，7.06(d，1H，J＝8.8 Hz)，6.97(d，2H，J＝15.4Hz)，6.86-6.82(m，5H)，6.58(dd，1H，J＝8.6，2.2 Hz)，5.19(brs，2H)，3.47-3.42(m，2H)，3.34-3.30(m，2H)，2.09(s，3H)，1.10(t， 3H，J＝7.0Hz)，1.03(t，3H，J＝7.0Hz)；IR(KBr)3300，2950，1660，1580cm-1； MS(eI)m/z 454；CHN calc′d for C29H30N2O3+0.15CH2Cl2+0.30H2O.
实施例8
1(E)-N-叔丁基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基) -3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝168-170℃；1H NMR 9.66(s，1H)，8.71(s，1H)，7.66(s，1H)，7.34(d，
2H，J＝8.3Hz)，7.24(d，1H，J＝15.8Hz).7.15(d，2H，J＝8.3Hz)，7.05(d，1
H，J＝8.6Hz)，6.85-6.82(m，5H)，6.59-6.56(m，1H)，6.55(d，1H，J＝16.0Hz)，
5.18(s，2H)，2.11(s，3H)，1.28(s，9H)；IR(KBr)3350，2950，1660，1620；MS
(eI)m/z 454；CHN calc′d for C29H30N2O3+0.4H2O
实施例9
(E)-吡咯烷基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)- 3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝170-175℃；1H NMR 9.67(s，1H)，8.71(s，1H)，7.49(d，2H，J＝8.1 Hz)，7.35(d，1H，J＝15.4Hz)，7.16(d，2H，J＝8.6Hz)，7.05(d，1H，J＝8.8 Hz)，6.88-6.81(m，6H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.19(brs，2H)，3.56(t，2 H，J＝6.6Hz)，3.35(m，2H)，2.11(s，3H)，1.87(p，2H，J＝7.0Hz)，1.77(p，2 H，J＝7.0Hz)；MS m/z 452；CHN calc′d for C29H28N2O3+0.1MeOH+1.3H2O.
实施例10
(E)-N，N-二甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝278-280℃；1H NMR(DMSO)9.65(s，1H )，8.70(s，1H)，7.50(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.33(d，1H，J＝15.4Hz)，7.15(d，2H，J＝8.6Hz)，7.07(d，1H，J＝
15.6Hz)，7.05(d，1H，J＝8.8Hz)，6.85-6.80(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.4
Hz)，5.19(s，2H)，3.09(s，3H)，2.88(s，3H)，2.11(s，3H)；MS eI m/z 426；IR
(KBr)3410，3220，1650，1580cm-1；CHN calc′d for C27H26N2O3+0.5H2O.
实施例11
(E)-N，N-二丁基-3-[4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯 基)-3-甲基-吲哚-1基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝126-128℃，1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.70(s，1H)，7.48(d，2H，
J＝8.3Hz)，736(d，1H，J＝152Hz)，7.16(d，2H，J＝8.6Hz)，7.05(d，1H，J＝
8.6Hz)，6.97(d，1H，J＝15.2Hz)，6.86-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4
Hz)，5.19(s，2H)，3.39(t，2H，J＝7.0Hz)，3.29(t，2H，J＝7.2Hz)，2.11(S，3
H)，1.48-1.43(M，4H)，1.29-1.20(M，4H)，0.87(t，6H，J＝7.2Hz)；MS eI m/z
510；IR(KBr)3300，2920，2900，2850，1650，1625，1580cm-1；CHN calc′d for
C33H38N2O3.
实施例12
(E)-N-丁基，N’-甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟 基-苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝240-242℃；1H NMR(DMSO)9.66(s，1H)，8.70(s，1H)，7.50(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.38-7.32(m，1H)，7.16(d，2H，J＝6.8Hz)，7.06-7.01(m，2H)，
6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.19(s，2H)，3.44，3.33(2t，2
H，J＝7.2Hz)，3.06，2.87(2s，3H)，2.11(s，3H)，1.45(m，2 H)，1.24(p，2H，J＝
7.5Hz)，0.87(t，3H，J＝7.2Hz)；Ms eI m/z 468；IR(KBr)3300，1660，1590cm-1；
CHN calcd for C30H32N2O3+0.2H2O.
实施例13
(E)-吗啉代-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3 -甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝165-167℃，1H NMR(DMSO)9.66(s，1H)，8.71(s，1H)，7.52(d，2H， J＝8.1Hz)，7.39(d，1H，J＝15.4Hz)，7.15(d，2H.J＝8.6Hz)，7.12(d，1H，J＝ 15.4Hz)，7.06(d，1H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2 Hz)，5.19(s，2H)，3.65-3.64(m，2H)，3.59-3.53(m，6H)，2.11(s，3H)；IR(KBr) 3330，1650，1620，1580cm-1；MS(FAB)m/z 469(M+H+)；CHN calc′d for C29H28N2O4+0.5H2O.
实施例14
(E)-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)-3-甲基- 吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝161-163℃，1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.70(s，1H)，7.48(s，1H)， 7.37(d，2H，J＝8.35Hz)，7.30(d，1H，J＝15.8Hz)，7.14(d，2H，J＝8.35Hz)， 7.04(d，2H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.48 (d，1H，J＝15.8Hz)，5.18(s，2H)，2.10(s，3H)；IR(KBr)3320，3180，1660，1580 cm-1；MS(FAB)m/z 399(M+H+)；CHN calc′d for C25H22N2O3+1.3H2O.
实施例15
(E)-N，甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-羟基-苯基)- 3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝155-158℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.99(d，1H，
J＝4.4Hz)，7.37(d，2H，J＝8.1Hz)，7.30(d，1H，j＝15.8Hz)，7.14(d，2H，J＝
8.6Hz)，7.03(d，1H，J＝8.6Hz)，6.85-6.81(m，5H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.4
Hz)，6.48(d，1H，J＝15.8Hz)，5.18(s，2H)，2.66(d，3H，J＝4.6Hz)，2.10(5，3
H)；IR(KBr)3400，1660，1620cm-1；MS eI m/z 412；CHN calc′d for C26H24N2O3+
0.4H2O.
实施例16
(E)-N，N-二丁基-3-{4-【5-羟基-2-(4-氟-苯基) -3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝180℃；1H NMR(DMSO)8.77(s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.4Hz)，7.41-
7.38(m，3H)，7.38-7.29(m，3H)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz)，6.97(d，1H，J＝15.4
Hz)，6.85(d，1H，J＝2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.1Hz)，5.2(s，2H)，3.40-3.36
(m，2H)，3.30-3.27(m，2H)，2.10(s，3H)，1.50-1.40(m，4H)，1.29-1.21(m，4
H)，0.86(t，6H，J＝7.2Hz)；IR(KBr)3180，2950，2900，2850，1650，1590cm-1；
MS eI m/z 512；CHN calcd for C33H37N2O2.
实施例17
(E)-N-丁基，N’-甲基-3-{4-【5-羟基-2-(4-氟 -苯基)-3-甲基-吲哚-1-基甲基】-苯基}-丙烯酰胺
Mp＝153-153.5℃；1H NMR(DMSO)8.77(s，1H)，7.50(d，2H，J＝8.1Hz)，
7.42-7.36(m，2H)，7.35-7.28(m，3H)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz)，7.03(dd，1H，J
＝15.4，2.6Hz)，6.84(d，1H，J＝2.4Hz)，6.80(d，2H，J＝8.1Hz)，6.62(dd，1H，
J＝8.8，2.4Hz)，5.21(s，2H)，3.44，3.41(2t，2H，J＝7.0Hz)，3.06，2.87(2s，3
H)，2.10(s，3H)，1.49-1.42(m，2H)，1.27-1.20(m，2H)，0.86(t，3H)；IR(KBr)
3300，2950，2860，1645，1580cm-1；MS eI m/z 470；CHN calcd for C30H31FN2O2.
实施例18
5-苄氧基-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基-1H-吲哚
在烧瓶中加入4-苄氧基苯胺(45g，0.23mol)，4’-苄氧 基-2-溴苯基苯丙酮(21g，0.066mol)，和DMF(50mL)。 将反应物加热回流30分钟然后冷却至室温并使其在EtOAc(250mL) 和1N HCl(水溶液)(100mL)间分配。将EtOAc部分用 NaHCo3(水溶液)和盐水洗涤，用MgSO4干燥。将溶液浓缩并将残 余物用CH2Cl2提取并加入己烷沉淀出25g固体粗品。将固体溶于 CH2Cl2中并在硅胶上蒸发再用CH2Cl2/己烷(1∶5)色谱纯化 得到9.2g褐色固体(33％)：Mpt＝150-152℃；1HNMR (DMSO)10.88(s，1H)，7.56(d，2H，J＝8.8Hz)，7.48(d，4H，J＝7.9Hz)，7.42 7.29(m，6H)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.13(d，2H，J＝8.8Hz)，7.08(d，1H，J＝ 2.2Hz)，6.94(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.16(s，2H)，5.11(s，2H)，2.33(s，3H)； IR(KBr)3470，2880，2820，1620cm-1；MS eI m/z 419.
实施例19
5-苄氧基-2-(4-苄氧基-苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基碘化物)-吲哚
将4(3.0g，7.4mmol)的DMF(25mL)溶液用NaH( 60％分散液，0.21g，8.9mmol)处理并在室温搅拌15分钟。在 其中加入4-碘溴化苄溴化物(2.2g，7.4mmol)并将反应物搅拌1 小时。将反应混合物倾倒入水中并用EtOAc萃取，用MgSO4干燥并浓 缩。粗品用乙醚研制得到2.2g白色固体产物：Mpt＝153-156℃， 1H NMR(DMSO)7.54(d，2H)＝8.6 Hz)，7.52-7.45(m，4H)，7.37-7.29(m，6H)，7.27(d，2H，J＝8.8Hz)，7.17(d，1 H，J＝9.0Hz)，7.13(d，1H，J＝2.2Hz)，7.10(d，2H，J＝8.8Hz)，6.81(dd，1H，J ＝8.8，2.4Hz)，6.60(d，2H，J＝8.3Hz)，5.18(s，2H)，5.12(s，2H)，5.11(s，2H)， 2.15(s，3H)；MS eI m/z 635.
实施例20
2-(4-羟苯基)-3-甲基)-1-基甲基-(4-苯基碘化物)- 吲哚-5-醇
将4(2.2g，3.5mmol)的CHCl3溶液用碘化三甲基硅烷( 1.04mL，7.0mmol)处理并将反应物加热至回流。2小时后，再加 3当量碘化三甲基硅烷并将反应物室温搅拌18小时。加入甲醇(5mL)猝 灭反应。有机层用10％的Na2SO3水溶液，HCl(1M)水溶液洗涤 并用MgSO4干燥。将溶液浓缩并在硅胶上用EtOAc/己烷(3∶7) 进行色谱纯化得到4a为泡沫(1.2g)：
1H NMR 9.65(s，1H)，8.71(s，1H)，7.54(d，2H，J＝ 8.3Hz)，7.12(d，2H，J＝8.3Hz)，7.02(d，1H，J＝8.6Hz)，6.84-6.80(m，3H)， 6.61(d，2H，J＝8.3Hz)，6.57(dd，1H，J＝6.4Hz)，5.12(s，2H)，2.09(s，3H)； MS eI m/z 455. 吲哚炔丙胺制备的一般方法
实施例21-23的标题化合物可以用将含有10倍摩尔过量的二级胺的 DMF溶液冷却至0℃并用炔丙溴化物(3当量，80％的甲苯溶液)处理来 制备。在0℃1小时后，将反应物在室温1小时。加入吲哚碘化物(4a， 1当量)接着加入Cu(I)I(0.1当量)和Pd(PPh3)2Cl2(0.035当量)。然后将反应混合物搅拌16-48小时然后将其倾倒入 水中并用EtOAc萃取。将EtOAc部分浓缩并在硅胶上用EtOAc/ 己烷为洗脱系统进行色谱纯化。
实施例21
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-N，N-二甲基 -1-基-丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇
Mp＝173-176℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.25(d，2H，
J＝8.1Hz)，7.12(d，2H，J＝8.3Hz)，7.03(d，1H，J＝8.6Hz)，6.83-6.78(m，5
H)，6.57(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，5.17(s，2H)，3.39(s，2H)，2.19(s，6H)，2.10
(s，3H)；IR(KBr)3390，1490cm-1；MS esI 411(M+H+).
实施例22
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-哌啶-1-基- 丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇
Mp＝118-123℃；1H NMR(DMSO)9.65(s，1H)，8.71(s，1H)，7.24(d，2H， J＝8.1Hz)，7.12(d，2H，J＝8.6Hz)，7.02(d，1H，J＝8.6Hz)，6.83-6.80(m，5 H)，6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.17(s，2H)，3.39(s，2H)，2.41(m，4H)，2.10 (s，3H)，1.48(p，4H，J＝5.7Hz)，1.36-1.33(m，2H)；IR(KBr)3400，2920，1620， 1420cm-1；MS EI m/z 450；CHN calc′d for C30H30N2O2+0.25H2O
实施例23
2-(4-羟基-苯基)-3-甲基-1-【4-(3-吡咯烷-1-基 -丙-1-炔基)-苄基】-1H-吲哚-5-醇(5c)
Mp＝174-176℃；1H NMR(DMSO)9.64(s，1H)，8.70(s，1H)，7.23(d，2H，
J＝8.3Hz)，7.11(d，2H，J＝8.6Hz)，7.02(d，1H，J＝8.8Hz)，6.84(m，5H)，
6.57(dd，1H，J＝8.6，2.2Hz)，5.17(s，2H)，3.53(s，2H)，2.53-2.51(m，4H)，
2.09(s，3H)，1.69-1.66(m，4H)；IR(KBr)3400，2920，2900，1620c-1；MS cI
m/z 436；CHN calcd for C29H28N2O2+0.7H2O. 生物学方法 体外雌激素受体结合测定 受体的制备
使超表达雌激素受体的CHO细胞在DMEM+10％活性炭包衣的葡聚 糖，已脱色的胎牛血清中的150mm2盘上生长。将该盘用PBS洗涤两次 并用10mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA洗涤一次。 通过刮面收集细胞然后将细胞悬液于冰中。在手提式电动组织研磨机上用2个 10-秒破裂将细胞破碎。将粗制品在12000g离心20分钟接着在转速 100000g离心60分钟得到核糖体游离胞质溶胶。然后将胞质溶胶在- 80℃冷冻并储藏。用参考标准蛋白进行BCA测定以确定胞质溶胶中的蛋白 质浓缩物。 结合测定条件
在与投入的【3H】-17β-雌二醇总量的结合＜2.0％的96-孔 板(聚苯乙烯*)上进行竞争性测定并且每个数据收集三份。将100uG/ 100μL的受体制品在每个孔上分成等份。将50uL体积的2.5nM 【3H】17β-雌二醇十竞争剂(或缓冲液)的饱和剂量加到初级竞争中， 而测定100×和500×竞争剂时，则仅用0.8nM【3】17β-雌二 醇。将该板在室温保温2.5小时。在保温时间结束时将150uL冰冷却的 活性炭包衣的葡聚糖(5％活性炭包衣0.05％ 69k葡聚糖)加入每个 孔中并将该板立即在4℃99g离心5分钟。将200μL上清液除去依闪 烁计数。无论哪一个先出现，样品计数2％或10分钟。由于聚苯乙烯吸收少 量【3H】17β-雌二醇，含有放射性和胞质溶胶，但不用活性炭操作的孔 包含定量有效同位素。同时，含有放射性但没有胞质溶胶的孔用活性炭操作以 测定未除去的【3H】17β-雌二醇的DPM。使用Corning #25880-96，96-孔板，因为经证明它们结合雌二醇的量最少。 结果分析
通过Beckman LS7500闪烁计数仪用一套猝灭标准物将放射性的每 分钟计数(CPM)自动转变为每分钟衰变(DPM)以使每个样品产生一个 H#。用下式计算在100倍或500倍竞争剂存在时雌二醇结合的百分数：
((DPM样品-未用活性炭除去的DPM)/(DPM雌二醇-未用活性炭 除去的DPM))×100％二雌二醇结合％
为了得到IC50曲线，将结合％对化合物绘图。IC50值是由在 500×竞争剂显示＞30％竞争的化合物浓度产生。对于该方法的描述，可 见Hulme，E.C.，1992版。Receptor-Ligand Interactions；A Practical Approach，IRL Press，New York(特别见第8章)。 IShikawa细胞碱性磷酸酶测定 细胞的保持和处理
将Ishikawa细胞保持在含有苯酚红+10％胎牛血清的DMEM/F12 (50％∶50％)中并给培养基供给2mM Glutamax，1％ Pen/Strap 和1mM丙酮酸钠。在每个试验(处理细胞)前5天将培养基变成除去苯酚红 的DMEM/F12+10％活性炭包衣的10％葡聚糖的已脱色的血清。在 试验的前一天，将细胞用0.5％胰蛋白酶/EDTA收集并置于密度为 5×104细胞/孔的96-孔组织培养板上。试验化合物的剂量除10-6M(化合物) +10-9M17β-雌二醇外还有10-6，10-7和10-8M来评价化合 物作抗雌激素的能力。测定前将细胞处理48小时。每个96-孔板含有一个 17-β-雌二醇对照。每个剂量的样品群为n＝8。 碱性磷酸酶测定
在48小时后抽吸培养基并将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗三次。将 50μL裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.8，0.2％ Triton X-100)加入到每个孔中。将板置-80℃15分钟。将板在37℃ 保温接着在每个孔中加入150μL含有4mM磷酸对-硝基苯酯(pNPP) 的0.1M Tris-HCl pH9.8(最终浓度，3mMpNPP)。
用KineticCalc Application程序(Bio-Tek，Instruments，Inc.， Winooski，VT)进行吸光度和斜率的计算。在反应动力曲线(光密度每5分 钟读取作30分钟吸收读取)的线性部分上平均，其结果表示为酶反应(斜率) 速率的平均+/-S.D.。化合物结果概括为与1nM17β-雌二醇相关的响 应的百分数。
用碱性磷酸酶法测定不同化合物的雌激素活性并计算相应的ED50值( 95％ C.I)。下列四条用作参考标准：
17β-雌二醇 0.03nM
17α-雌二醇 1.42nM
雌二醇 0.13nM
雌酮 0.36nM
该方法的描述可见Holinka，C.F.，Hata，H.Kuramoto，H.和Gurpide，E .(1986)的甾体激素和抗甾体对人体子宫内膜癌细胞(Ishikawa Line) 的碱性磷酸酶活性的影响。Littlefield，B.A.Gurpide，E.Markiewicz， L.McKinley，B.的Cancer Research.46：2771-2774，和 Hochberg，R.B.(1990)的Ishikawa细胞中基于刺激碱性磷酸酯的简单 和敏感微量滴定板的雌激素生物测定；D5肾上腺甾体化合物的雌激素作用。 Endocrinology，6：2757-2762。 2X VIT ERE转染测定 细胞的保持和处理
将用人体雌激素受体稳定转染的Chinese Hamster Ovary细胞 (CHO)在DMEM+10％胎牛血清(FBS)中保持。处理前48小时 将生长培养基换成没有苯酚红的DMEM+10％葡聚糖包衣的活性炭脱色 PBS(处理培养基)。将细胞置于密度为5000细胞/孔的含有200μL培 养基/孔的96-孔板上。 磷酸钙转染
将报道DNA(在基本胸苷激酶促进剂前推动萤光素酶基因的含有2个卵 黄生成素ERE串联拷贝的Promega质粒p GL 2)与B-半乳糖苷酶表达质粒 pCH110(Pharmacia)和载体DNA(pTZ18U)以下列比率 混合：
10uG 报道DNA
5uG pCH110DNA
5uG pTZ18U
20uG DNA/1mL转染液
将DNA(20uG)溶解在500uL 250mM无菌CaCl2中 并将其滴加到500uL 2×HeBs(0.28m NaCl，50mM HEPES，1.5mM Na2HPO4，pH7.05)中，然后在室温 保温20分钟。将20uL这种混合物加到每个细胞孔中并在细胞上保持16 小时。保温结束后除去沉淀，将细胞用培养基洗涤，换上新处理的培养基并将 细胞用载体，1nM17β-雌二醇，1uM化合物或1μM化合物+1 nM17β-雌二醇(用作雌激素拮抗试验)处理。每一个处理条件作8孔(n ＝8)，这些孔在进行萤光素酶测定前保温24小时。 萤光素酶测定
在暴露于化合物24小时后，将培养基除去并用2X没有Mg++和 Ca++的125uL的PBS洗涤每个孔。除去PBS后，将25uL Promega裂解缓冲液加到每个孔中并于室温静置15分钟，接着于-80℃ 15分钟和37℃15分钟。将20uL裂解液转移到不透明的96孔板进 行萤光素酶活性评价并用保持裂解液(5μl)进行B-半乳糖苷酶活性评价(正 态转染)。将萤光素(luciferan)底物(Promega)加入用发光计自动等份为 100uL的每个孔中并将产生的光(相对光单位)在加入后读取10秒钟。 B-半乳糖苷酶测定
在保持5uL裂解液中加入45uL PBS。然后加入50uL Promega B-半乳糖苷酶2X测定缓冲液，将孔混合并于37℃保温1小时。 将含有标准曲线(0.1至1.5毫单位三份)的板用于每个试验。在 Molecular Devices分光光度计板取器上在410nm分析这些板。将未知 的光密度从标准曲线上用数学外推法转换成活性毫单位。 结果分析
将萤光素酶数据以在10秒测定期间累集的相对光单位(RLUs)形成 得到并自动转移到JMP(SAS Inc)文档中，该文档已将背景 RLUs扣除。B-半乳糖苷酶值被自动输入到该文档中并且这些值被分成 RLUs以得到归一化数据。从n＝8的每个处理来确定平均值和标准偏差。 每个板上将化合物活性与17β-雌二醇比较。用式％＝((雌二醇-对照) /(化合物值))×100来计算与17β-雌二醇活性比较的百分数。这些 技术见Tzukerman，M.T.，Esty，A.Santiso-Mere，D.Danielian，P.，Parker， M.G.Stein，R.B.，Pike，J.W.和Mc Donnel，D.P.的描述(1994)。人 雌激素受体的转激活能力是通过细胞的和推进剂环境两者决定的并通过两个 功能不同的分子内区域介导的(见Molecular Endocrinology，8：21-30)。 子宫营养/抗子宫营养鼠的生物测定
在未成熟鼠子宫营养测定(4天)中确定化合物的雌激素和抗雌激素特性 (见由L.J.Black和R.L.Goode，在Life Sciences，26，1453(1 980)的在先描述)。将未成熟的Sprague-Dawley鼠(雌性，18天龄)分 成六组用于试验。将动物每日腹腔注射10uG化合物，100uG化合物， (100uG化合物+1uG17β-雌二醇)用于测定抗雌激素性，以及 1uG17β-雌二醇，用50％ DMSO/50％盐水作为注射载体。 在第4天将动物用CO2窒息法杀死动物并剥离其子宫然后在过量脂质中解吸， 除去所有流体并确定其湿重。将一个角的一个小截面用于组织学而将其余部分 用于分离总RNA以评价补体组分3的基因表达。 生物学结果 雌激素受体亲和性(报道为RBA：17β-雌二醇＝100) 化合物 RBA 那洛亚芬 200 三苯氧胺 1.8 实施例10 20 实施例7 42 实施例8 40 实施例9 40 实施例12 114 实施例11 80 实施例13 27 实施例14 32 实施例15 53 实施例21 53 实施例22 23 传染萤光素酶测定 化合物 ％激活 ％1nM17β-雌二醇的激活 17β-雌二醇 100％ N/A 雌三醇 38％ N/A 三氧苯胺 0％ 10％ 那洛亚芬 0％ 0％ 实施例10 1％ 2％ 实施例7 4％ 8％ 实施例8 6％ 78％ 实施例9 6％ 8％ 实施例12 13％ 24％ 实施例11 8％ 12％ 实施例13 8％ 17％ 实施例14 19％ 57％ 实施例15 15％ 31％ 实施例21 34％ 34％ 实施例22 17％ 19％ Ishikawa碱性磷酸酶测定 化合物 ％激活 ％激活(化合物+1nM17β
雌二醇) 17β-雌二醇 100％ N/A 三氧苯胺 0％ 45％ 那洛亚芬 5％ 5％ 实施例10 6％ 19％ 实施例7 1％ 9％ 实施例8 10％ 22％ 实施例9 3％ 11％ 实施例12 7％ 16％ 实施例11 6％ 11％ 实施例13 7％ 9％ 实施例14 2％ 14％ 实施例15 0％ 5％ 实施例21 34％ 34％ 实施例22 27％ 23％ 3-天子宫切除鼠模型 化合物 10μG 100μG 三氧苯胺 69.6mg 71.4mg 那洛亚芬 47.5mg 43.2mg 对照＝42.7mg 1μG17β-雌二醇＝98.2 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例7 47.8mg 64.8mg 75.4 对照＝20.2mg 1μG17β-雌二醇＝80.2mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例12 36.9mg 49.5mg 63.1 对照＝31.4mg 1μG17β-雌二醇＝89.0mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例11 39.3mg 59.8mg 81.0mg 对照＝24.5mg 1μG17β-雌二醇＝90.8mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例14 32.5mg 56.4mg 79.8mg 实施例15 40.4mg 56.3mg 69.3mg 对照＝29.1mg 1μG17β-雌二醇＝95.5mg 化合物 10μG 100μG 100μG加1μG-
17β-雌二醇 实施例21 56.0mg 84.0mg 77.6mg 对照＝32.1mg 1μG17β-雌二醇＝90.2mg 实施例22 55.6mg 71.3mg 66.8mg 对照＝21.7mg 1μG17β-雌二醇＝82.8mg
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
激素热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈