本发明的发明人出乎意料地发现，在治疗应用中未曾使用过的甾 体化合物即15-羟基或16-羟基取代的睾酮类似物符合上述需求。
据发现，本发明羟睾酮类似物令人惊讶地将足够的雄激素效力与 可接受的口服生物利用度及对肝脏代谢的很小的影响相结合。从而， 该雄激素特别适合于任何已应用或推荐应用雄激素的治疗用途。该羟 睾酮类似物可以被有效地传递，特别是通过透粘膜或透皮途径，以相 对较低的剂量如那些女性通常所需的剂量给药。
本发明羟睾酮类似物的另一个优点是可预知的和一致的治疗效 果，其被认为与有效的摄取、其微弱的肝脏作用和/或其对性激素结 合球蛋白(SHBG)的微弱的亲和力有关。相对而言，有时用于口服 给药的已知雄激素，特别是DHEA或睾酮的17α-烷基化衍生物，其 治疗效果非常依赖于个体的生理甚至他/她的饮食。因此，这些雄激 素通常以相对高的剂量应用以保证每个个体都能达到最低有效剂量。 当然，如此高的剂量自会有缺点，其导致一些个体相对过量，后者又 可能产生显著的副作用。

因此，本发明一个方面涉及包含至少10μg雄性甾体化合物以及 药物学可接受的赋形剂的用于口服、透粘膜或透皮给药的药物剂量单 位，所述雄性甾体化合物选自15-羟睾酮、16-羟睾酮、其前体以及这 些羟睾酮和/或其前体的混合物。
术语“15-羟睾酮”包括15α-羟睾酮(15α，17β-二羟基-4-雄烯-3- 酮)和15β-羟睾酮(15β，17β-二羟基-4-雄烯-3-酮)两者。类似地， 术语“16-羟睾酮”包括16α-羟睾酮(16α，17β-二羟基-4-雄烯-3-酮)和 16β-羟睾酮(16β，17β-二羟基-4-雄烯-3-酮)两者。
本文通篇所使用的术语“前体”是指那些在将所述前体向人类患 者给药后被转变为本发明羟睾酮之一的物质。
本发明雄性甾体化合物优选的前体是该羟睾酮的衍生物，其中至 少一个羟基的氢原子被以下基团取代：1-25个碳原子的烃羧酸、磺 酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基包含1 -20个糖苷单位的直链或支链糖苷残基。
已发现，本发明羟睾酮存在于哺乳动物中，这意味着它们具有可 归于天然雄激素之类这一重要优势(Yamazaki等，Arch Biochem Biophys 1997 Oct 1；346(1)：161-9)。另外，如由上述文章可知， 15α-羟睾酮、15β-羟睾酮和16β-羟睾酮存在于人体中，这意味着初步 看来其不良副作用的危险比合成的雄激素或不存在于人体中的天然 雄激素的要低。因而，在本发明的一个特别优选的具体实施方案中， 该雄性甾体化合物选自15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、16β-羟睾酮、其前 体以及这些羟睾酮和/或其前体的混合物。更优选地，该雄性甾体化 合物选自15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、其前体以及这些羟睾酮和/或 其前体的混合物。
该口服剂量单位可以用本领域熟知的任何一种用于药物组合物 生产的方法来制备，并且这些单位可包含一种或更多的选自甜味剂、 调味剂、着色剂和防腐剂的物质。所述剂量单位可以适当地包含无毒 的、药物学可接受的赋形剂。例如就片剂而言，这些赋形剂可以是例 如惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和 崩解剂如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及 润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以不包衣或用已知的技术 包衣以延缓在胃肠道的崩解与吸收，从而在更长时间内提供持续的作 用。例如，可以使用一种时间延缓材料如可将单硬脂酸甘油酯或二硬 脂酸甘油酯单独应用或者与蜡一同应用。
可通过口服途径给药的剂量单位形式的实例包括片剂、软明胶胶 囊(包括用于软明胶胶囊的溶液)、水或油混悬剂、乳剂、丸剂、锭 剂、药片、糖浆、酏剂等。口服应用的制剂也可采用硬明胶胶囊的形 式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土相 混合，或采用软明胶胶囊的形式，其中甾体成分与水或油介质如花生 油、液体石蜡或橄榄油相混合。在一个特别优选的具体实施方案中， 根据本发明的口服剂量单位是以固体或半固体剂量单位、尤其是片 剂、胶囊、扁囊剂、小球、丸剂、散剂或颗粒剂的形式提供。
根据本发明的水混悬剂包含甾体化合物与适于生产水混悬剂的 赋形剂的混合物。这种赋形剂包括助悬剂如羧甲基纤维素钠、甲基纤 维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶及阿 拉伯胶，以及分散剂或润湿剂如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯化 氧和脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂 肪醇的缩合产物(如十七亚乙基氧代十六醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物 (如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)、或者环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖 醇酐的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。该水混 悬剂还可包含一种或更多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯 甲酸正丙酯、一种或更多种着色剂、一种或更多种调味剂以及一种或 更多种甜味剂例如蔗糖、阿司帕坦或糖精。正如本领域所熟知，眼用 制剂需要调节渗透压。
油混悬剂可通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油 中，或在矿物油如液体石蜡中悬浮该甾体化合物成分而配制。该油混 悬剂可以包含增稠剂如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂以 提供美味的经口制剂(oral preparation)。这些组合物可以通过加入 抗氧化剂如维生素C加以保存。
本发明适于通过加入水而制备水混悬剂的可分散的粉末和颗粒 可以通过将甾体化合物成分与分散剂、助悬剂和/或润湿剂以及一种 或多种防腐剂相混合而配制。适当的分散剂或润湿剂及助悬剂的实例 如上所述。也可加入其他的赋形剂如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物剂量单位也可以是水包油型乳剂的形式。油相可以 是植物油如橄榄油或花生油、矿物油如液体石蜡、或它们的混合物。 适当的乳化剂包括天然存在的树胶如阿拉伯胶和黄蓍胶、天然存在的 磷脂如大豆卵磷脂、源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯如脱水山梨醇 单油酸酯、以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨 醇单油酸酯。该乳剂还可包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂如甘油、山梨醇或蔗糖来配制。该制剂 还可包含缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
本发明的甾体化合物还可以药物的直肠或阴道给药的栓剂的形 式给药。这些剂量单位可以通过将甾体化合物与适当的无刺激性的赋 形剂相混合而制备，该赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液 体，并且因此将在直肠中熔融并释放药物。这种材料为可可脂和聚乙 二醇。
该剂量单位优选地包含至少20μg、更优选为至少40μg、最优选 为至少60μg的雄性甾体化合物。如果该剂量单位是用以提供雄性甾 体化合物的缓慢释放，例如就透皮贴剂而言，包含在该剂量单位中的 雄性甾体化合物的量可达1000mg之多。优选地，该雄性甾体化合物 的用量不超过500mg、更优选为不超过200mg。最优选地，该雄性甾 体化合物在剂量单位中的用量最好不超过100mg。
在本发明一个特别优选的具体实施方案中，该剂量单位设计为用 于口服给药。可适用于传递本发明甾体化合物的口服剂量单位的实例 包括片剂、胶囊、扁囊剂、小球、丸剂、散剂或颗粒剂。
该药物口服剂量单位的重量通常在0.1-10克范围内。包含在该口 服剂量单位中的雄性甾体化合物的量优选为至少30μg、更优选为至 少50μg、最优选为至少80μg。通常包含在该口服剂量单位中的雄性 甾体化合物的量不应超过50mg，更优选为不超过30mg，最优选为不 超过20mg。
本发明的羟睾酮类似物可有利地用于男性避孕法中。如前文所 述，该方法要求孕激素和雄激素联合给药。包含在本剂量单位中的孕 激素的量通常将大于10μg、更优选为大于30μg。在一个特别优选的 具体实施方案中，该剂量单位另外还包含与75至800μg、更优选100 至500μg的左炔诺孕酮等效的量的孕激素。
在其它应用如女性激素替代疗法和女性避孕中，该羟睾酮类似物 可有利地与雌激素联合给药。因此，该剂量单位中除本发明雄性甾体 化合物外可适当地包含用量优选为至少10μg、更优选为至少15μg的 雌激素。
可应用于本发明剂量单位以及本文所述的方法中的孕激素的实 例包括孕酮、左炔诺孕酮、诺孕酯、炔诺酮、地屈孕酮、屈螺酮、3-β- 羟基去氧孕烯、3-酮-去氧孕烯(＝依托孕烯)、17-去乙酰基诺孕酯、 19-去甲孕酮、乙酰氧基孕烯诺龙、烯丙基雌烯三醇、阿那孕酮、氯 地孕酮、环丙孕酮、地美孕酮、去氧孕烯、地诺孕素、dihydrogesterone、 地美炔酮、炔孕酮、双醋炔诺醇、醋酸氟孕酮、gastrinon、孕二烯酮、 孕三烯酮、羟甲基孕酮、羟基孕酮、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羟孕酮、 甲地孕酮、美仑孕酮、诺美孕酮、炔诺酮、异炔诺酮、炔诺孕酮(包 括d-炔诺孕酮和d1-炔诺孕酮)、诺孕烯酮、normethisterone、孕酮、 奎孕酮、(17α)-17-羟基-11-亚甲基-19-去甲孕-4，15-二烯-20-炔-3- 酮、替勃龙、曲美孕酮、阿孕奈德、nestorone、普美孕酮、17-羟基 孕酮酯、19-去甲-17-羟基孕酮、17α-乙炔基睾酮、17α-乙炔基-19-去 甲睾酮、d-17β-乙酰氧基-13β-乙基-17α-乙炔基-甾-4-烯-3-酮肟、应用 于本发明方法时能够在体内释放出这种孕激素的这些化合物的前体 以及它们的组合。优选地，该孕激素选自孕酮、去氧孕烯、依托孕烯、 孕二烯酮、地诺孕素、左炔诺孕酮、诺孕酯、炔诺酮、屈螺酮、曲美 孕酮、地屈孕酮、这些孕激素的前体以及它们的组合。
适于根据本发明应用的雌激素的实例包括乙炔基雌二醇、美雌 醇、quinestranol、雌二醇、雌酮、雌烷、雌三醇、雌四醇、结合马雌 激素、应用于本发明方法时能在体内释放出这种雌激素的这些化合物 的前体以及它们的组合。优选地，该雌激素选自乙炔基雌二醇、雌二 醇、雌四醇以及其组合。
本发明雄性甾体化合物优选的前体是本发明羟睾酮的衍生物，其 中至少一个羟基的氢原子被以下基团取代：1-25个碳原子的烃羧酸、 磺酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基包含 1-20个糖苷单位的直链或支链糖苷残基。
本发明的另一个方面涉及治疗性或预防性地治疗哺乳动物的方 法，所述方法包括向所述哺乳动物口服、透粘膜或透皮给药如上所述 的本发明药物剂量单位。此处使用的术语透粘膜给药是指阴道内、子 宫内、直肠、鼻内、肺部、口腔和舌下传递，最优选为阴道内传递。 该方法特别适用于对人类进行治疗。
口服、直肠、鼻内、口腔和肺部给药理想地适于每天给药(至少) 一次。透皮给药适于以每天一次到每月一次的频率施用。阴道内和子 宫内给药适于以每周一次到每月一次的频率给药。
出于便利、也为达到高顺应率的原因，本方法优选采用的给药间 隔为1天、1周或1月。特别优选采用每日一次口服给药、每周一次 透皮给药或每月一次阴道给药的治疗方案。最优选地，本发明方法包 含每日至少一次给药。
本发明雄激素甾体化合物适于以每公斤体重至少0.5μg的平均 每日剂量给药。优选地，该平均每日剂量为每公斤体重至少1μg，更 优选为每公斤体重至少1.5μg。该平均每日剂量通常为每公斤体重不 超过1.5mg。优选地，该平均每日剂量为每公斤体重不超过1mg， 更优选为每公斤体重不超过0.5mg。
根据本发明的方法优选用于以下方法中：治疗或预防(男性或女 性中)雄激素缺乏的方法；(男性或女性)激素避孕法；治疗或预防 HIV感染的个体中的消耗性综合征、由逆转录病毒药物引起的脂肪代 谢障碍、不健康或疲劳的方法；逆转由慢性疾病、手术介入、肿瘤疾 病、外伤和/或营养不良引起的异化状态的方法；治疗或预防细胞毒 性化疗后引起的莱迪希氏细胞功能紊乱和生殖上皮损伤的方法；在细 胞毒性化疗或放疗期间或之后治疗或预防疲劳或维持体重、血红蛋白 或嗜中性粒细胞计数的方法；治疗或预防良性妇科失调的方法；改善 (男性或女性)性欲的方法；治疗或预防青春期延缓的方法；或维持 女性向男性转变的方法。如前文所述，本发明甾体化合物的给药特别 适用于下述方法中：治疗或预防雄激素缺乏的方法；激素避孕的方法 或治疗或预防良性妇科失调的方法。应注意，雄激素缺乏的症状在男 性和女性中都会存在。在一个特别优选的具体实施方案中，本发明甾 体化合物被用于治疗或预防雄激素缺乏或被用作男性避孕的方法。
前述方法通常在为期至少十天、优选为至少二十天期间持续给药 本发明甾体化合物。在一个特别优选的具体实施方案中，该甾体在为 期至少一百天期间给药，其间不给药的间隔不超过十天，优选为不超 过八天。
在一个优选的实施方案中，本发明方法包括以每公斤体重至少 0.2μg的平均每日剂量联合给药孕激素和/或以每公斤体重至少 0.2μg的平均每日剂量联合给药雌激素。联合给药的孕激素或雌激素 的平均每日剂量通常为每公斤体重不超过1mg，所述剂量更优选为 每公斤体重不超过500μg，最优选为每公斤体重不超过300μg。
本发明的另一个方面涉及选自15-羟睾酮、16-羟睾酮、其前体以 及这些羟睾酮和/或其前体的混合物中的雄性甾体化合物在制备如 本文所述的口服、透粘膜或透皮剂量单位中的应用。在一个特别优选 的具体实施方案中，所述雄性甾体化合物用于制备固体或半固体口服 剂量单位，特别是片剂、胶囊、扁囊剂、小球、丸剂、散剂或颗粒剂 形式的口服剂量单位。
通过下面的实施例，本发明更进一步得以阐明。
实施例
实施例1
采用一种确定的竞争性甾体结合试验测定15α-羟睾酮(15α，17β- 二羟基-4-雄烯-3-酮)、15β-羟睾酮(15β，17β-二羟基-4-雄烯-3-酮)以 及16β-羟睾酮(16β，17β-二羟基-4-雄烯-3-酮)对雄激素受体(AR) 的相对结合亲合力。睾酮(17β-羟基-4-雄烯-3-酮)以及5α-二羟睾酮 (DHT，5α，17β-二羟基-雄烷-3-酮)在该试验中用作对照。
所采用的方法是根据科学文献改编，且由Chang等详细记载 (1987，J.Steroid Biochem.，27，1-3，123-131)。重组大鼠AR得以表 达并自大肠杆菌纯化。体外试验包括应用AR以及将1.5nM固定浓 度的[3H]米勃酮用作标记配体。将重组AR溶于结合缓冲液(50mM Tris-碱，pH7.5，0.8mM NaCl，10％甘油，2mM二硫苏糖醇，1mg/ml BSA和2％乙醇)中，之后将双份等分试样与最终浓度为1.5nM的[3H] 米勃酮以及载体对照(1.0％DMSO)或者等量的包含浓度升高的未标 记的甾体配体作为竞争剂的载体一同温育。于4℃温育4小时后， 移除未结合的配体并测定结合至AR的[3H]米勃酮的量。用在每种竞 争剂浓度下结合至AR的[3H]米勃酮量的平均值绘制抑制曲线。IC50 值随后通过非线性最小二乘法回归分析确定。利用Cheng和Prusoff 方程(Cheng等，1973，Biochem.Pharmacol.，22，3099-3108)，通过 所测得的待测化合物的IC50值、试验中所应用的放射配体的浓度以 及被确定为3nM的放射配体Kd的先验值计算出抑制常数(Ki)。
从三个独立的实验得到的15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、16β-羟睾 酮、睾酮和DHT的平均Ki值如表1所示。为了比较结合亲和力，将 DHT的Ki值(其显示出最高的亲和力)人为地设定为100％并用于 计算相对亲和力(表1)。与DHT和睾酮相比，15α-羟睾酮、15β- 羟睾酮以及16β-羟睾酮与AR结合的亲和力小2至3个数量级(表1)。
表1：经试验测定的15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、16β-羟睾酮、睾 酮以及5α-二羟睾酮(DHT)的AR结合抑制常数(Ki)。将DHT的 Ki值定为100％，得到相对结合亲和力。
  俗名(化学名)   AR-结合   Ki(nM)   相对亲和力(％)   15α-羟睾酮   (4-雄烯-15α，17β-二醇-3酮)   1820   0.05   15β-羟睾酮   (4-雄烯-15β，17β-二醇-3-酮)   557   0.18   16β-羟睾酮   (4-雄烯-16β，17β-二醇-3-酮)   814   0.12   睾酮   (4-雄烯-17β-醇-3-酮)   2   50   5α-二羟睾酮，DHT   (5α-雄烷-17β-二醇-3-酮)   1   100
实施例2
为测定15-取代的睾酮衍生物在体内的雄激素效力，每日一次向 未成熟雄性Wistar大鼠连续5天通过口服给药15α-羟睾酮(15α，17β- 二羟基-4-雄烯-3酮)和15β-羟睾酮(15β，17β-二羟基-4-雄烯-3酮)。 在该生物测定中，采用均口服给药的睾酮(17β-羟基-4-雄烯-3酮)和 5α-二羟睾酮(DHT，5α，17β-二羟基-雄烯-3酮)作为阳性对照。
将15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、睾酮和5α-二羟睾酮溶于2％的吐 温80水混悬液中，最终试验浓度为3mg/ml和1mg/ml。若干组每组 5只未成熟Wistar大鼠，每只重50±2克，或接受载体治疗或以 10ml/kg的给药体积通过经口管饲法连续五天给药30或10mg/kg/ 天的待测物质。在试验期间，将动物饲养在45×23×15cm的笼子里， 并置于温度控制在22-24℃以及湿度为60-80％且明/暗循环周期为 12小时的环境中。食物(试验膳食，啮齿动物膳食，PMI nutrition international)和水自由摄入。
在接受最后剂量24小时后，处死动物，记录每只动物精囊的湿 重并计算出每组的平均湿重。相对于载体治疗的大鼠的平均精囊湿重 而言，平均精囊湿重的增加被认为可指征体内的雄激素效力。
体内的雄激素效力数据如表2所示。睾酮的15α和15β羟基取代 的类似物均导致精囊湿重的剂量依赖性且显著的增加。该体内雄激素 作用与所观察到的睾酮的剂量依赖性作用类似或等效，并且比口服给 药DHT后所观察到的体内雄激素效力更强，其中DHT为经典的雄激 素且为睾酮在体内的活性代谢产物(O’Donnel等，1996， Endocrinology，137，2703-2710)。
表2：，每日一次、连续五天口服给药15α-羟睾酮、15β-羟睾酮、 睾酮或5α-二羟睾酮(DHT)治疗的每组5只未成熟Wistar大鼠的组 中，其精囊湿重相对于载体(2％吐温80)治疗的动物的平均精囊湿 重的平均升高。以DHT作为参照(100％)，还得出相对雄激素效力。
  俗名(化学名)   体内雄激素效力   口服剂量   mg/kg/天   精囊湿重   的增加(％)   相对效   力(％)   15α-羟睾酮   (4-雄烯-15α，17β-二醇-3酮)   30   40   148   10   28   560   15β-羟睾酮   (4-雄烯-15α，17β-二醇-3-酮)   30   35   130   10   20   400   睾酮   (4-雄烯-17β-醇-3-酮)   30   47   174   10   41   820   5α-二羟睾酮，DHT   (5α-雄烷-17β-二醇-3-酮)   30   27   100   10   5   100
实施例3
采用一种确定的竞争性甾体结合试验(Hammond和Lahteenmaki. 1983.Clin Chem Acta 132：101-110)测定15α-羟睾酮(15α-OH-T)、 15β-羟睾酮(15β-OH-T)、脱氢表雄酮(DHEA)、睾酮(T)和5α- 二羟睾酮(DHT)对人性激素结合球蛋白(SHBG)的相对结合亲合 力。
如前所述，自转基因小鼠血清中纯化得到人SHBG(Avvakumov GV等，2000.J Biol Chem 275：25920-25925)。将如此制备的人SHBG 用聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性条件下测定，纯度为＞99％。其甾体结 合特征不能与人血清中的SHBG相区别(Avvakumov GV等，2000.J Biol Chem 275：25920-25925)。体外试验包括使用纯化的人SHBG并 以[3H]DHT作为标记配体。将人SHBG在室温下用右旋糖酐包衣的 炭(DCC)在磷酸缓冲盐(PBS)中的混悬液处理30分钟以除去所 有的甾体配体。离心(2,000×g，10分钟)沉淀DCC之后，将含有 人SHBG的上清液用PBS稀释，直至基于其甾体结合能力的浓度为 1nM。
然后将该人SHBG溶液的双份等分试样(100μl)与10nM等体 积的[3H]DHT以及100μl的PBS或者含有浓度升高的未标记的甾体 配体作为竞争剂的等量PBS一同在聚苯乙烯试管中温育。于室温下 温育1小时后，将反应混合物于冰浴下再放置15分钟。然后将冰冷 的DCC混悬液的等分试样(600μl)加入至每个试管中，并经略微混 合2秒钟后，将每个试管在冰浴下温育10分钟。然后将吸附于DCC 的未结合配体通过离心(2,000×g，15min，4℃)除去，并且以液 体闪烁分光光度计在2ml的ACS闪烁混合物中计算结合到SHBG的 [3H]标记的DHT的数量。将在每种竞争剂浓度下结合至SHBG的[3H] 标记的DHT的平均量(B)表示为竞争剂不存在时结合至SHBG的 [3H]标记的DHT的平均量(T)，并对每个试管中的竞争剂浓度作图。

图1：显示以5α-二氢睾酮(DHT)、睾酮(T)、脱氢表雄酮(DHEA)、 15α-羟睾酮(15α-OH-T)、15β-羟睾酮(15β-OH-T)为竞争剂时，[3H]DHT从 人SHBG中被置换的竞争曲线。结果表示为在每种竞争剂浓度下的结合(B)cpm /不存在竞争剂时的总结合(T)cpm的百分比。
竞争性结合试验的结果如图1所示。数据显示，在以[3H]DHT作 为标记配体的竞争性结合试验中，当与DHT、T或DHEA相比时， 15α-OH-T和15β-OH-T不与人SHBG结合。因此，与其它雄激素相 比，15α-OH-T或15β-OH-T与人SHBG的结合可以忽略不计。