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包含IL-15超激动剂的联合免疫疗法

阅读：494发布：2021-07-05

专利汇可以提供包含IL-15超激动剂的联合免疫疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了使用腺病毒载体产生增强的免疫应答的方法和组合物，所述载体可在有需要的受试者中与IL-15超激动剂复合物结合来实现多 疫苗 接种。，下面是包含IL-15超激动剂的联合免疫疗法专利的具体信息内容。

1.一种组合物，所述组合物包括第一重组腺病毒载体，所述第一重组腺病毒载体包括编码抗原的核酸序列，并且所述组合物包括：
a)第二重组腺病毒载体，所述第二重组腺病毒载体包括编码白介素-15(IL-15)超激动剂复合物的IL-15N72D结构域和IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列；或
b)第三重组腺病毒载体，所述第三重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15N72D结构域的核酸序列；以及第四重组腺病毒载体，所述第四重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是CEA抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述CEA抗原包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中编码所述抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体包含与下列之一具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的序列：
SEQ ID NO:2；或者
SEQ ID NO:2的位置1057至3165。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述IL-15超激动剂复合物是多聚体蛋白质复合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述多聚体蛋白复合物包含两个IL-15N72D结构域和二聚体IL-15RαSu/Fc融合结构域，并且其中所述二聚体IL-15Rα/Fc融合结构域包含IL-15Rα结构域和Fc融合蛋白的二聚体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述IL-15Rα结构域是人IL-15RαSu，该人IL-15RαSu包含成熟的人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的组合物，其中所述Fc融合蛋白是包含人IgG1的CH2-CH3区域的人IgG1 Fc蛋白。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述CH2-CH3区域包含232个氨基酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述IL-15超激动剂复合物是ALT-803。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述第二重组腺病毒载体的编码IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码与SEQ ID NO:110具有至少
80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述第二重组腺病毒载体的编码IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:109具有至少80％、至少
85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
14.根据权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述第三重组腺病毒载体的编码IL-
15N72D结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:81具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中编码所述IL-15N72D结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:107具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述第四重组腺病毒载体的编码IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:82具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中编码所述IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:108具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少
95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，所述中值有效浓度比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子的EC50低10倍以上。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体包含重组复制缺陷型腺病毒载体。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述重组复制缺陷型腺病毒载体是基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域、E3区域、E4区或其任意组合中包含缺失。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域中包含缺失。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域中包含缺失。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物在单剂量中包含至少
1x 109个病毒颗粒、至少1x 1010个病毒颗粒、至少1x 1011个病毒颗粒、至少5x 1011个病毒颗粒、至少1x 1012个病毒颗粒或至少5x 1012个病毒颗粒。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述组合物在单剂量中包含1x 
109至5x 1012个病毒颗粒。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述第一重组腺病毒载体还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包括第五重组腺病毒载体，所述第五重组腺病毒载体包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述第五重组腺病毒载体包含基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包含缺失。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物，所述组合物还包括第六重组腺病毒载体，所述第六重组腺病毒载体包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述第六重组腺病毒载体包含基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中基于所述腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包含缺失。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的组合物，其中所述其他靶抗原是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、有丝分裂原或其组合。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的组合物，其中所述其他靶抗原是人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-
1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的组合物，其中所述第五重组腺病毒载体包含编码MUC1-C抗原的核酸序列。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述MUC1-C抗原包含与SEQ ID NO:7具有至少
80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
39.根据权利要求37至38中任一项所述的组合物，其中编码所述MUC1-C抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的组合物，其中所述MUC1-C抗原是经修饰的MUC1抗原，其包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述经修饰的MUC1抗原由包含与SEQ ID NO:
5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的组合物，其中所述MUC-1抗原是在SEQ ID NO:
7的位置93、141-142、149-151、392、404、406、422、430-431、444-445或460处具有一个或多个突变的经修饰的抗原。
43.根据权利要求29至42中任一项所述的组合物，其中所述第五重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:8的位置1105至2532处具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
44.根据权利要求29至43中任一项所述的组合物，其中所述第五重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的组合物，其中所述MUC1-C抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合相结合。
46.根据权利要求32至45所述的组合物，其中所述第六重组腺病毒载体包含编码
Brachyury抗原的核酸序列。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述Brachyury抗原包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
48.根据权利要求46至47中任一项所述的组合物，其中编码所述Brachyury抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的组合物，其中所述Brachyury抗原是经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的Brachyury抗原的氨基酸序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:
102具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少
99％的序列同一性。
50.根据权利要求32至49中任一项所述的组合物，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:13的位置1045至2277处具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
51.根据权利要求32至50中任一项所述的组合物，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
52.根据权利要求32至51中任一项所述的组合物，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:9的520至1824位置具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的的核苷酸序列。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的组合物，所述Brachyury抗原是一种经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的Brachyury抗原包含在WLLPGTSTV(SEQ ID NO:15)中列出的氨基酸序列。
54.根据权利要求46至53中任一项所述的组合物，其中所述Brachyury抗原与HLA-A2结合。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的组合物，其中所述组合物或第一重组腺病毒载体还包含编码共刺激分子的核酸序列。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的组合物，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含位于所述第一重组腺病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含位于分开的重组腺病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含免疫途径检查点调节剂。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述免疫途径检查点调节剂激活或增强免疫应答。
62.根据权利要求60或61所述的组合物，其中所述免疫途径检查点抑制免疫应答。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径检查点调节剂靶向选自下组的内源性免疫途径检查点蛋白或其片段，该组由以下组成：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、和CD244。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径检查点调节剂靶向PD1蛋白。
65.根据权利要求60至64中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径检查点调节剂包含siRNA、反义、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。
66.根据权利要求60至65中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单抗。
68.根据权利要求60至67中任一项所述的组合物，其中所述免疫应答增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少
20倍或至少25倍。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含抗CEA抗体。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述抗CEA抗体是NEO-201、COL1、COL2、COL3、COL4、COL5、COL6、COL7、COL8、COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14、COL15、阿西莫单抗、贝赛洛单抗、拉贝珠单抗或阿托玛单抗。
71.根据权利要求69至70中任一项所述的组合物，其中所述抗CEA抗体是NEO-201。
72.根据权利要求1至71中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含化疗剂。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述化疗剂是5-FU、亚叶酸或奥沙利铂、或其任何组合。
74.根据权利要求1至73中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含工程化的自然杀伤(NK)细胞群体。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤细胞抑制性受体)表达的NK细胞，一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及一个或多个已经被修饰以表达一个或多个CAR(嵌合抗原受体)NK细胞，或其任何组合。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为基本上缺乏KIR表达的NK细胞。
77.根据权利要求75所述的组合物，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。
78.根据权利要求75所述的组合物，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已被修饰以表达一个或多个CAR的NK细胞。
79.根据权利要求75或权利要求78所述的组合物，其中所述CAR是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-
7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、或其任何组合。
80.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予如权利要求1至
79中任一项所述的组合物。
81.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码抗原的核酸序列的第一重组腺病毒载体，和：
a)第二重组腺病毒载体，所述第二重组腺病毒载体包括编码白介素-15(IL-15)超激动剂复合物的IL-15N72D结构域和IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列；或者
b)第三重组腺病毒载体，所述第三重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15N72D结构域的核酸序列；以及第四重组腺病毒载体，所述第四重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述抗原是CEA抗原。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述CEA抗原包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中编码所述抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
85.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体包含与下列之一具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的序列：
SEQ ID NO:2；或者
SEQ ID NO:2的位1057至3165。
86.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述IL-15超激动剂复合物是多聚体蛋白质复合物。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述多聚体蛋白复合物包含两个IL-15N72D结构域和二聚体IL-15RαSu/Fc融合结构域，并且其中二聚体IL-15Rα/Fc融合结构域包含IL-15Rα结构域和和Fc融合蛋白的二聚体。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述IL-15Rα结构域是人IL-15RαSu，所述人IL-
15RαSu包含成熟的人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65。
89.根据权利要求87-88中任一项所述的方法，其中所述Fc融合蛋白是包含人IgG1的CH2-CH3区域的人IgG1 Fc蛋白。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述CH2-CH3区域包含232个氨基酸。
91.根据权利要求81至90中任一项所述的方法，其中所述IL-15超激动剂复合物是ALT-
803。
92.根据权利要求81至91中任一项所述的方法，其中所述第二重组腺病毒载体的编码IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码与SEQ ID NO:110具有至少
80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述第二重组腺病毒载体的编码IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:109具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
94.根据权利要求81至93中任一项所述的方法，其中所述第三重组腺病毒载体的编码IL-15N72D结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:81具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
95.根据权利要求94所述的方法，其中编码所述IL-15N72D结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:107具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
96.根据权利要求81至95中任一项所述的方法，其中所述第四重组腺病毒载体的编码IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:82具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
97.根据权利要求96所述的方法，其中编码所述IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:108具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
98.根据权利要求81至97中任一项所述的方法，其中所述IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，所述中值有效浓度比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
99.根据权利要求81至98中任一项所述的方法，其中所述IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子的EC50低
10倍以上。
100.根据权利要求81至99中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体包含重组复制缺陷型腺病毒载体。
101.根据权利要求100中任一项所述的方法，其中所述重组复制缺陷型腺病毒载体是基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
102.根据权利要求81至101中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域、E3区域、E4区或其任意组合中包含缺失。
103.根据权利要求81至102中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域中包含缺失。
104.根据权利要求81至103中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体、所述第二重组腺病毒载体、所述第三重组腺病毒载体和所述第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域中包含缺失。
105.根据权利要求81至104中任一项所述的方法，其中所述方法包括以单剂量施用重组腺病毒载体的至少1x 109个病毒颗粒、至少1x 1010个病毒颗粒、至少1x 1011个病毒颗粒或5x 1011个病毒颗粒。
106.根据权利要求81至105中任一项所述的方法，其中所述方法包含以单剂量施用重组腺病毒载体的介于1x 109个和5x 1011个之间的病毒颗粒。
107.根据权利要求81至106中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向受试者施用编码一个或多个其他靶抗原或其免疫学表位的核酸序列。
108.根据权利要求81至107中任一项所述的方法，其中所述第一重组腺病毒载体还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
109.根据权利要求81至108中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用第五重组腺病毒载体，所述第五重组腺病毒载体包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述第五重组腺病毒载体包含基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中基于所述腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包含缺失。
112.根据权利要求81-111中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向受试者给药第六重组腺病毒载体，所述第六重组腺病毒载体包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述第六重组腺病毒载体包含基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。
114.根据权利要求113所述的方法，其中基于所述腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包含缺失。
115.根据权利要求107至114中任一项所述的方法，其中所述其他靶抗原是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、有丝分裂原或其组合。
116.根据权利要求107至115中任一项所述的方法，其中所述其他靶抗原是人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-
1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
117.根据权利要求109所述的方法，其中所述第五重组腺病毒载体包含编码MUC1-C抗原的核酸序列。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述MUC1-C抗原包含与SEQ ID NO:7具有至少
80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
119.根据权利要求117至118中任一项所述的方法，其中编码所述MUC1-C抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
120.根据权利要求117至119中任一项所述的方法，其中所述MUC1-C抗原是经修饰的MUC1抗原，其包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述经修饰的MUC1抗原由包含与SEQ ID NO:
5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。
122.根据权利要求117至121中任一项所述的方法，其中所述MUC-1抗原是在SEQ ID NO:7的位置94、141-142、149-151、392、404、406、422、430-431、444-445或460处具有一个或多个突变的经修饰的抗原。
123.根据权利要求109至122中任一项所述的方法，其中所述第五重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:8的位置1105至2532处具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
124.根据权利要求109至123中任一项所述的方法，其中所述第五重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
125.根据权利要求117至124中任一项所述的方法，其中所述MUC1-C抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合相结合。
126.根据权利要求112至125中任一项所述的方法，其中所述第六重组腺病毒载体包含编码Brachyury抗原的核酸序列。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述Brachyury抗原包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
128.根据权利要求126至127中任一项所述的方法，其中编码所述Brachyury抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
129.根据权利要求126至128中任一项所述的方法，其中所述Brachyury抗原是经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的Brachyury抗原的氨基酸序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:102具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
130.根据权利要求112至129中任一项所述的方法，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:13的位置1045至2277处具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
131.根据权利要求112至130中任一项所述的方法，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
132.根据权利要求112至131中任一项所述的方法，其中所述第六重组腺病毒载体包含与SEQ ID NO:9的520至1824位置具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的的核苷酸序列。
133.根据权利要求126至132中任一项所述的方法，所述Brachyury抗原是一种经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的Brachyury抗原包含在WLLPGTSTV(SEQ ID NO:15)中列出的氨基酸序列。
134.根据权利要求126至133中任一项所述的方法，其中所述Brachyury抗原与HLA-A2结合。
135.根据权利要求81至134中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用所述第一重组腺病毒载体，其中所述第一重组腺病毒载体还包含编码共刺激分子的核酸序列。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
137.根据权利要求135或权利要求136所述的方法，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-
1和LFA-3的组合。
138.根据权利要求81至137中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向受试者施用多个核酸序列，所述多个核酸序列位于第一重组腺病毒载体中编码多个共刺激分子。
139.根据权利要求81至138中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向受试者施用位于分开的重组腺病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
140.根据权利要求81至139中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向受试者施用免疫途径检查点调节剂。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述免疫途径检查点调节剂激活或增强免疫应答。
142.根据权利要求140或141所述的方法，其中所述免疫途径检查点抑制免疫应答。
143.根据权利要求140至142中任一项所述的方法，其中所述免疫途径检查点调节剂靶向选自下组的内源性免疫途径检查点蛋白或其片段，该组由以下组成：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、和CD244。
144.根据权利要求140至143中任一项所述的方法，其中所述免疫途径检查点调节剂靶向PD1蛋白。
145.根据权利要求140至144中任一项所述的方法，其中所述免疫途径检查点调节剂包含siRNA、反义、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。
146.根据权利要求140至145中任一项所述的方法，其中所述免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
147.根据权利要求140至146中任一项所述的方法，其中所述免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单抗。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述阿维鲁单抗每周至少一次、至少两次或至少三次施用于所述受试者。
149.根据权利要求147至148中任一项所述的方法，其中在第1周的第1天、第2周的第1天、第4周的第1天、第8周的第1天、第12周的第1天和第16周的第1天施用阿维鲁单抗。
150.根据权利要求147至149中任一项所述的方法，其中在施用包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体后施用阿维鲁单抗。
151.根据权利要求147至150中任一项所述的方法，其中将阿维鲁单抗以包括1mg/kg至
20mg/kg的剂量施用于受试者。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述剂量包括10mg/kg。
153.根据权利要求140至152中任一项所述的方法，其中免疫应答比基础水平增加至少
2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。
154.根据权利要求81至153中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向受试者施用抗CEA抗体。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述抗CEA抗体是NEO-201、COL1、COL2、COL3、COL4、COL5、COL6、COL7、COL8、COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14、COL15、阿西莫单抗、贝赛洛单抗、拉贝珠单抗或阿托玛单抗。
156.根据权利要求154至155中任一项所述的方法，其中所述抗CEA抗体是NEO-201。
157.根据权利要求155至156中任一项所述的方法，其中所述NEO-201抗体以包括3mg/kg的剂量施用。
158.根据权利要求155至157中任一项所述的方法，其中所述NEO-201抗体在第1天、第
15天和第22天静脉内施用。
159.根据权利要求81至158中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向受试者施用化疗剂。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述化疗剂是5-FU、亚叶酸或奥沙利铂、或其任何组合。
161.根据权利要求81至160中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向受试者施用工程化的自然杀伤(NK)细胞群。
162.根据权利要求161所述的方法，其中在第9天、第11天、第18天、第22天、第27天、第
33天或其任何组合中静脉内输注所述工程化的NK细胞群。
163.根据权利要求161至162中任一项所述的方法，其中所述工程化的NK细胞群包含至少2x 109个工程化的NK细胞的剂量。
164.根据权利要求161至163中任一项所述的方法，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤细胞抑制性受体)表达的NK细胞，一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及一个或多个已经被修饰以表达一个或多个CAR(嵌合抗原受体)NK细胞，或其任何组合。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为基本上缺乏KIR表达的NK细胞。
166.根据权利要求164所述的方法，其中所述工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。
167.根据权利要求164所述的方法，其中所述工程化的NK细胞包含已被修饰以表达一个或多个CAR的一个或多个NK细胞。
168.根据权利要求164或权利要求167所述的方法，其中所述CAR是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-
7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、或其任何组合。
169.根据权利要求81至168中任一项所述的方法，其中施用作为单剂量的0.1-5μg IL-
15超激动剂复合物。
170.根据权利要求169所述的方法，其中施用作为单剂量的1μg的IL-15超激动剂复合物。
171.根据权利要求81至170中任一项所述的方法，其中施用为在施用重组腺病毒载体的1天之内、2天之内、3天之内、4天之内、5天之内或6天之内施用IL-15超激动剂复合物，该重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。
172.根据权利要求81至171中任一项所述的方法，其中所述施用为重组腺病毒载体施用后3天施用IL-15超激动剂复合物，所述重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。
173.根据权利要求81至172中任一项所述的方法，其中所述施用为在21天的时间内多次施用单剂量的IL-15超激动剂复合物。
174.根据权利要求81至173中任一项所述的方法，其中所述施用是在21天的时间内多次施用单剂量的重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。
175.根据权利要求173至174中任一项所述的方法，其中所述施用是在第7天、第14天和第21天施用重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。
176.根据权利要求173至175中任一项所述的方法，其中所述施用是在第10天和第17天施用IL-15超激动剂复合物。
177.根据权利要求81至176中任一项所述的方法，其中所述施用包括在8周的时间内施用。
178.根据权利要求177所述的方法，其中在第3周和第6周施用包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体。
179.根据权利要求177至178中任一项所述的方法，其中所述IL-15超激动剂复合物在第1、2、4、5、7和8周施用。
180.根据权利要求81至179中任一项所述的方法，其中所述施用是在给药方案中施用至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次的IL-15超激动剂复合物。
181.根据权利要求81至180中任一项所述的方法，其中所述施用是在给药方案中施用至少一次，至少两次，至少三次，至少四次或至少五次包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体。
182.根据权利要求82至181中任一项所述的方法，其中所述CEA抗原诱导免疫应答。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述免疫应答被测量为抗原特异性抗体应答。
184.根据权利要求182所述的方法，其中所述免疫应答被测量为抗原特异性细胞介导的免疫(CMI)。
185.根据权利要求182所述的方法，其中所述免疫应答被测量为抗原特异性IFN-γ分泌。
186.根据权利要求182所述的方法，其中所述免疫应答被测量为抗原特异性IL-2分泌。
187.根据权利要求182所述的方法，其中通过ELISpot测定法测量针对抗原的所述免疫应答。
188.根据权利要求182所述的方法，其中通过CAP-1致敏的抗原呈递细胞的T细胞裂解、来自肿瘤细胞系或自体肿瘤的同种异体抗原表达细胞来测量所述免疫应答。
189.根据权利要求182至188所述的方法，其中复制缺陷型腺病毒感染受试者的树突状细胞，并且其中被感染的树突细胞呈递抗原，从而诱导免疫应答。
190.根据权利要求81至189中任一项所述的方法，其中所述施用包括皮下、肠胃外、静脉内、肌肉内或腹膜内施用。
191.根据权利要求81至190中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或不患有增生性疾病癌症。
192.根据权利要求81至191中任一项所述的方法，其中所述受试者患有结直肠腺癌、转移性结直肠癌、表达CEA的晚期结直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌。
193.根据权利要求81至192中任一项所述的方法，其中所述受试者具有至少1、2或3个转移性疾病部位。
194.根据权利要求81至193中任一项所述的方法，其中所述受试者包含过表达CEA的细胞。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述过表达CEA的细胞相对于在非癌细胞中的基线CEA表达，将CEA过表达至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
196.根据权利要求195所述的方法，其中所述过表达CEA的细胞包括癌细胞。
197.根据权利要求81至196中任一项所述的方法，其中所述受试者具有经诊断的疾病易感性。
198.根据权利要求81至197中任一项所述的方法，其中所述受试者患有稳定的疾病。
199.根据权利要求81至198中任一项所述的方法，其中所述受试者具有疾病的遗传易感性。
200.根据权利要求81至199中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
201.根据权利要求200所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、结肠癌、乳腺癌或胃癌。
202.根据权利要求200所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
203.根据权利要求200所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
204.根据权利要求81至203中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

说明书全文

包含IL-15超激动剂的联合免疫疗法

交叉引用

[0001] 本申请要求2017年5月26日提交的美国临时专利申请号62/511,845的权益，其全部公开内容通过引用的方式并入本文。

背景技术

[0002] 疫苗通过训练免疫系统以识别并破坏有害物质和病变细胞来帮助人体对抗疾病。疫苗大致上能够分组为两类：预防疫苗和治疗疫苗。预防性疫苗提供给健康人群，以预防特
定疾病的蔓延，而治疗性疫苗(也被称为免疫疗法)提供给被诊断患有疾病的人，以帮助阻
止疾病的滋长及扩散，或作为预防性治疗。目前正在开发病毒疫苗，以帮助对抗传染病和癌
症。这些病毒疫苗通过以下方法起作用：在宿主细胞内诱导与疾病相关的一小部分基因表
达，这继而增强宿主的免疫系统进行识别并破坏病变细胞。这样，基于病毒的疫苗临床反应
能够受到疫苗这样能力的限制：获取高水平免疫原性能力，以及具有持续长期表达的能力。
[0003] 通过提供编码肿瘤相关抗原(TAA)的病毒疫苗实现的癌症免疫疗法可具有存活优势；然而，这些策略存在局限性，并且需要免疫力更强的疫苗。本发明通过将施用疫苗与IL-
15超激动剂结合以增强疫苗在患者中的疗效和效果来解决该限制。

发明内容

[0004] 在各个方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含第一重组腺病毒载体，该第一重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列，和：a)第二重组腺病毒载体，该第二重组腺病
毒载体包含编码白介素-15(IL-15)超激动剂复合物的IL-15N72D结构域和IL-15超激动剂
复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列；或者b)第三重组腺病毒载体，该第三重组
腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15N72D结构域的核酸序列；以及第四重组
腺病毒载体，改第四重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合
结构域的核酸序列。
[0005] 在一些方面，该抗原是CEA抗原。在进一步的方面，CEA抗原包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，编码抗原的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1或SEQ 
ID NO:100具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，第一重组腺病毒载体包含与下列之一具有至少80％、
至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的序列：SEQ ID NO:2；或者SEQ ID NO:2的1057至3165位。
[0006] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物是多聚体蛋白质复合物。在一些方面，多聚体蛋白复合物包含两个IL-15N72D结构域和二聚体IL-15RαSu/Fc融合结构域，并且其中二聚
体IL-15Rα/Fc融合结构域包含IL-15Rα结构域和和Fc融合蛋白的二聚体。在一些方面，IL-
15Rα结构域为人IL-15RαSu，该人IL-15RαSu包括成熟的人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65。在进一步的方面，Fc融合蛋白为包含人IgG1的CH2-CH3区域的人IgG1 Fc蛋白。在一些方面，CH2-
CH3区域包含232个氨基酸。在进一步的方面，IL-15超激动剂复合物是ALT-803。
[0007] 在一些方面，编码第二重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码与SEQ ID NO:110具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编
码第二重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与
SEQ ID NO:109具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
[0008] 在一些方面，编码第三重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:81具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编码IL-15N72D结构域的核
酸序列包含与SEQ ID NO:107具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0009] 在一些方面，编码第四重组腺病毒载体的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:82具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少
95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编码IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:108具有至少80％、至少85％、至少87％、至少
90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0010] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，所述中值有效浓度比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低
4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
[0011] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子的EC50低10倍以上。在一些方面，第一重组腺病毒载体、第二重组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体包含重组复制缺
陷型腺病毒载体。在一些方面，重组复制缺陷型腺病毒载体是基于腺病毒亚型5(Ad5)的载
体。在进一步的方面，第一重组腺病毒载体、第二重组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和
第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域、E3区域、E4区或其任意组合中包括缺失。
[0012] 在一些方面，第一重组腺病毒载体、第二重组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体在E1区域中包括缺失。在进一步的方面，第一重组腺病毒载体、第二重
组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域中包括缺
失。
[0013] 在一些方面，该组合物在单剂量中包含至少1x 109个病毒颗粒、至少1x 1010个病毒颗粒、至少1x 1011个病毒颗粒、至少5x 1011个病毒颗粒、至少1x 1012个病毒颗粒或至少
5x 1012个病毒颗粒。在进一步的方面，该组合物在单剂量中包含1x 109至5x 1012个病毒颗
粒。
[0014] 在一些方面，该组合物还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，重组第一腺病毒载体还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的
核酸序列。在一些方面，该组合物还包含第五重组腺病毒载体，该载体包含编码一个或多个
其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，第五重组腺病毒载体包括基于腺病毒
亚型5(Ad5)的载体。在进一步的方面，基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包括缺失。
[0015] 在一些方面，该组合物还包含第六重组腺病毒载体，该载体包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，第六重组腺病毒载体包括基于腺病毒
亚型5(Ad5)的载体。在进一步的方面，基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包括缺失。
[0016] 在进一步的方面，其他靶抗原是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、有丝分裂原或其组合。
[0017] 在其他方面，所述其他靶抗原是人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、前列腺特异
性抗原(PSA)、PSMA、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-
5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、
Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-
8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
[0018] 在一些方面，第五重组腺病毒载体包括编码MUC1-C抗原的核酸序列。在进一步的方面，MUC1-C抗原包括与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，编码MUC1-C抗原的核酸
序列包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0019] 在又一方面，MUC1-C抗原是经修饰的MUC1抗原，该抗原包括与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，经修饰的MUC1抗原由包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:
101具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少
99％序列同一性的核酸序列编码。
[0020] 在又一方面，MUC-1抗原是在SEQ ID NO:7的位93、141-142、149-151、392、404、406、422、430-431、444-445或460处具有一个或多个突变的经修饰的抗原。
[0021] 在又一方面，第五重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:8的位1105至2532具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，第五重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0022] 在一些方面，MUC1-C抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合相结合。
[0023] 在一些方面，第六重组腺病毒载体包括编码Brachyury抗原的核酸序列。在进一步的方面，Brachyury抗原包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至
少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，编码Brachyury抗原的核酸序列包括与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102具有
至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0024] 在又一方面，Brachyury抗原是经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的Brachyury抗原的氨基酸序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:102具有至少80％、至少85％、至少87％、
至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0025] 在一些方面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:13的位1045至2277处具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、
至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0026] 在一些方面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:9的520至1824位置具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的的核苷酸序列。在一些方面，Brachyury抗原是一种经修饰的Brachyury抗原，该抗原包
含在WLLPGTSTV(SEQ ID NO:15)中列出的氨基酸序列。在一些方面，Brachyury抗原与HLA-
A2结合。
[0027] 在一些方面，该组合物或第一重组腺病毒载体还包括编码共刺激分子的核酸序列。在进一步的方面，该共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在又一方面，该共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些方面，该组合物还包括位于所述第一重组腺病
毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，该组合物还包括位于分开
的重组腺病毒载体中的编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
[0028] 在一些方面，该组合物还包含免疫途径检查点调节剂。在一些方面，免疫途径检查点调节剂激活或增强免疫应答。在进一步的方面，免疫途径检查点抑制免疫应答。在一些方
面，免疫途径检查点调节剂靶向选自下组的内源性免疫途径检查点蛋白或其片段，该组由
以下组成：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA和CD244。在进一步的方面，免疫途径检查点调节剂靶向PD1蛋白。
[0029] 在一些方面，免疫途径检查点调节剂包含干扰RNA(siRNA)、抗转录疗法、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在进一步的方面，免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单
抗。在一些方面，免疫应答增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。
[0030] 在一些方面，该组合物还包含抗CEA抗体。在进一步的方面，抗CEA抗体是NEO-201、COL1、COL2、COL3、COL4、COL5、COL6、COL7、COL8、COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14、COL15、阿西莫单抗、贝赛洛单抗、拉贝珠单抗或阿托玛单抗。在又一方面，抗CEA抗体是NEO-
201。
[0031] 在一些方面，该组合物还包含化疗剂。在进一步的方面，化疗剂是5-FU、亚叶酸或奥沙利铂、或其任何组合。
[0032] 在一些方面，该组合物还包含工程化的自然杀伤(NK)细胞群体。在进一步的方面，工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为大体上缺乏KIR(杀伤细胞抑制性受体)表达
的NK细胞，一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及一个或多个已
经被修饰以表达一个或多个CAR(嵌合抗原受体)NK细胞，或其任何组合。在又一方面，工程
化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为大体上缺乏KIR表达的NK细胞。在进一步的方面，
工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。在进一步
的方面，工程化的NK细胞包含已被修饰以表达一个或多个CAR的一个或多个NK细胞。
[0033] 在一些方面，所述CAR是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-
1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、或其任何组合。
[0034] 在各个方面，本公开提供了一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用以上任何一种组合物。
[0035] 在各个方面，本公开提供了治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用第一重组腺病毒载体，该载体包含编码抗原的核酸序列，和：a)第二重组腺病毒载
体，该第二重组腺病毒载体包括编码白介素-15(IL-15)超激动剂复合物的IL-15N72D结构
域和IL-15超激动剂复合物的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列；或者b)第三重组腺病
毒载体，该第三重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的IL-15N72D结构域的核酸
序列；以及第四重组腺病毒载体，该第四重组腺病毒载体包含编码IL-15超激动剂复合物的
IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列。
[0036] 在一些方面，该抗原是CEA抗原。在进一步的方面，CEA抗原包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在进一步的方面，编码抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:100具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。在又一方面，第一重组腺病毒载体包含与下列之一具有至
少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的序列：SEQ ID NO:2；或SEQ ID NO:2的1057至3165位。
[0037] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物是多聚体蛋白质复合物。在进一步的方面，多聚体蛋白复合物包含两个IL-15N72D结构域和二聚体IL-15RαSu/Fc融合结构域，并且其中
二聚体IL-15Rα/Fc融合结构域包含IL-15Rα结构域和和Fc融合蛋白的二聚体。在又一方面，IL-15Rα结构域是人IL-15RαSu，该人IL-15RαSu包含成熟的人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65。
在又一方面，Fc融合蛋白是包含人IgG1的CH2-CH3区域的人IgG1 Fc蛋白。在又一方面，CH2-
CH3区域包含232个氨基酸。
[0038] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物是ALT-803。
[0039] 在一些方面，编码第二重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码与SEQ ID NO:110具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编
码第二重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域和IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与
SEQ ID NO:109具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性。
[0040] 在一些方面，编码第三重组腺病毒载体的IL-15N72D结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:81具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编码IL-15N72D结构域的核
酸序列包含与SEQ ID NO:107具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0041] 在一些方面，编码第四重组腺病毒载体的IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列编码包含与SEQ ID NO:82具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少
95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的方面，编码IL-15RαSu/Fc融合结构域的核酸序列包含与SEQ ID NO:108具有至少80％、至少85％、至少87％、至少
90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0042] 在一些方面，IL-15超激动剂复合物表现出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，所述中值有效浓度比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低
4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。在一些方面，IL-15超激动剂复合物表现出针
对支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子的EC50低10
倍以上。
[0043] 在一些方面，第一重组腺病毒载体、第二重组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体包含重组复制缺陷型腺病毒载体。在一些方面，重组复制缺陷型腺病
毒载体是基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。在进一步的方面，第一重组腺病毒载体、第二重组
腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域、E3区域、E4
区或其任意组合中包括缺失。
[0044] 在一些方面，第一重组腺病毒载体、第二重组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体在E1区域中包括缺失。在进一步的方面，第一重组腺病毒载体、第二重
组腺病毒载体、第三重组腺病毒载体和第四重组腺病毒载体在E1区域和E2b区域中包括缺
失。在一些方面，该方法包括以单剂量施用重组腺病毒载体的至少1x 109个病毒颗粒、至少
10 11 11
1x 10 个病毒颗粒、至少1x 10 个病毒颗粒或5x 10 个病毒颗粒。在一些方面，该方法包
含以单剂量施用重组腺病毒载体的介于1x 109个和5x 1011个之间的病毒颗粒。在一些方
面，该方法还包括向受试者施用编码一个或多个其他靶抗原或其免疫学表位的核酸序列。
在一些方面，第一重组腺病毒载体还包含编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸
序列。
[0045] 在一些方面，该方法还包括向所述受试者施用第五重组腺病毒载体，所述第五重组腺病毒载体包括编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，第
五重组腺病毒载体包括基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。在进一步的方面，基于腺病毒亚型5
(Ad5)的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包括缺失。
[0046] 在一些方面，该方法还包括向受试者施用第六重组腺病毒载体，该第六重组腺病毒载体包括编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，第六重组
腺病毒载体包括基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。在进一步的方面，基于腺病毒亚型5(Ad5)
的载体在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中包括缺失。
[0047] 在一些方面，其他靶抗原是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、有丝分裂原或其组合。
[0048] 在一些方面，所述其他靶抗原是人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、前列腺特异
性抗原(PSA)、PSMA、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-
5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、
Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-
8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
[0049] 在一些方面，第五重组腺病毒载体包括编码MUC1-C抗原的核酸序列。在进一步的方面，MUC1-C抗原包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。编码在进一步的方面，MUC1-C抗原的
核酸序列包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:101具有至少80％、至少85％、
至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方
面，MUC1-C抗原是经修饰的MUC1抗原，其包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，经修饰的MUC1抗原由包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:101具有至少80％、至少
85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些方面，MUC-1抗原是在SEQ ID NO:7的94、141-142、149-151、392、404、406、
422、430-431、444-445或460位具有一个或多个突变的经修饰的抗原。
在一些方面，第五重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:8的1105至2532位具有至少80％、
至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
在一些方面，第五重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，MUC1-C抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合相结合。
[0050] 在一些方面，第六重组腺病毒载体包括编码Brachyury抗原的核酸序列。在一些方面，Brachyury抗原包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少
87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，编码Brachyury抗原的核酸序列包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102具有至
少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在进一步的方面，Brachyury抗原是经修饰的Brachyury抗原，所述经修饰的
Brachyury抗原的氨基酸序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:102具有至少80％、至少85％、
至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方
面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:13的1045至2277位具有至少80％、至少85％、至
少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、
至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
[0051] 在一些方面，第六重组腺病毒载体包括与SEQ ID NO:9的520至1824位具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面，Brachyury抗原是一种经修饰的Brachyury抗原，该抗原包含
在WLLPGTSTV(SEQ ID NO:15)中列出的氨基酸序列。
[0052] 在一些方面，Brachyury抗原与HLA-A2结合。
[0053] 在一些方面，该方法还包括施用第一重组腺病毒载体，其中第一重组腺病毒载体还包含编码共刺激分子的核酸序列。在进一步的方面，该共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在一些方面，该共刺激分子包含B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些方面，该方法还包括向受试者施用多个核酸序列，该多个核酸序列位于第一重组腺病毒载体中编码多个
共刺激分子中。在一些方面，该方法还包括向受试者施用位于分开的重组腺病毒载体中的
编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
[0054] 在一些方面，该方法还包括向受试者施用免疫途径检查点调节剂。在又一方面，免疫途径检查点调节剂激活或增强免疫应答。在一些方面，免疫途径检查点抑制免疫应答。在
一些方面，免疫途径检查点调节剂靶向选自下组的内源性免疫途径检查点蛋白或其片段，
该组由以下组成：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA和CD244。
[0055] 在一些方面，免疫途径检查点调节剂靶向PD1蛋白。在一些方面，免疫途径检查点调节剂包含干扰RNA(siRNA)、抗转录疗法、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单抗。在进一步的方面，阿维鲁单抗每周至少一
次、至少两次或至少三次施用于所述受试者。在一些方面，在第1周的第1天、第2周的第1天、第4周的第1天、第8周的第1天、第12周的第1天和第16周的第1天施用阿维鲁单抗。在进一步
的方面，在施用包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体后施用阿维鲁单抗。在进一步
的方面，将阿维鲁单抗以包括1mg/kg至20mg/kg的剂量施用于受试者。在又一方面，剂量包
括10mg/kg。
[0056] 在一些方面，免疫应答比基础水平增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用抗CEA抗体。在进一步的方面，抗CEA抗体是NEO-201、COL1、COL2、COL3、COL4、COL5、COL6、COL7、COL8、COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14、COL15、阿西莫单抗、贝赛洛单抗、拉贝珠单抗或阿托玛单抗。在又一方面，抗CEA抗体是NEO-201。在进一步的方面，NEO-201抗体以包括3mg/kg的剂量施用。在进一步的方面，NEO-201抗体在第
1天、第15天和第22天静脉内施用。在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用化疗剂。在进一步的方面，化疗剂是5-FU、亚叶酸或奥沙利铂、或其任何组合。
[0057] 在一些方面，该方法还包括向受试者施用工程化的自然杀伤(NK)细胞群。在进一步的方面，在第9天、第11天、第18天、第22天、第27天、第33天或其任何组合中静脉内注入工程化的NK细胞群。在进一步的方面，工程化的NK细胞群包含的剂量为至少2x 109个工程化
的NK细胞。在进一步的方面，工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为大体上缺乏KIR
(杀伤细胞抑制性受体)表达的NK细胞，一个或多个已经被修饰以表达高亲和力CD16变体的
NK细胞，以及一个或多个已经被修饰以表达一个或多个CAR(嵌合抗原受体)NK细胞，或其任
何组合。在进一步的方面，工程化的NK细胞包含一个或多个已经被修饰为大体上缺乏KIR表
达的NK细胞。在进一步的方面，工程化的NK细胞包含一个或多个NK细胞：该NK细胞已经被修
饰以表达高亲和力CD16变体。在又一方面，工程化的NK细胞包含已经被修饰以表达一个或
多个CAR的一个或多个NK细胞。
[0058] 在一些方面，所述CAR是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-
1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、或其任何组合。
[0059] 在一些方面，作为单剂量，施用为0.1-5μg IL-15超激动剂复合物。在进一步的方面，作为单剂量，施用为1μg的IL-15超激动剂复合物。在一些方面，施用为在施用重组腺病毒载体的1天之内、2天之内、3天之内、4天之内、5天之内或6天之内施用IL-15超激动剂复合物，该重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。在一些方面，该施用为重组腺病毒载体施
用后3天施用IL-15超激动剂复合物，该重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。在一些
方面，该施用为在21天的时间内多次施用单剂量的IL-15超激动剂复合物。
[0060] 在一些方面，该施用是在21天的时间内多次施用单剂量的重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。在一些方面，该施用是在第7天、第14天和第21天
施用重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码抗原的核酸序列。在一些方面，该施用是
在第10天和第17天施用IL-15超激动剂复合物。在一些方面，施用包括在8周的时间内施用。
[0061] 在一些方面，在第3周和第6周施用包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体。在进一步的方面，IL-15超激动剂复合物在第1、2、4、5、7和8周施用。在一些方面，施用是在给药方案中施用至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或至少五次的IL-15超激动剂复
合物。在一些方面，所述施用是在给药方案中施用至少一次，至少两次，至少三次，至少四次或至少五次包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体。
[0062] 在一些方面，CEA抗原诱导免疫应答。在进一步的方面，将免疫应答测量为抗原特异性抗体应答。在进一步的方面，免疫应答被测量为抗原特异性细胞介导的免疫(CMI)。在
进一步的方面，将免疫应答测量为抗原特异性IFN-γ分泌。在进一步的方面，将免疫应答测
量为抗原特异性IL-2分泌。在进一步的方面，通过ELISpot测定法测量针对抗原的免疫应
答。在进一步的方面，通过CAP-1致敏的抗原呈递细胞的T细胞裂解、来自肿瘤细胞系或自体
肿瘤的同种异体抗原表达细胞来测量免疫应答。在又一方面，复制缺陷型腺病毒感染受试
者的树突状细胞，并且其中被感染的树突细胞呈递抗原，从而诱导免疫应答。
[0063] 在一些方面，施用包括皮下、肠胃外、静脉内、肌肉内或腹膜内施用。在一些方面，受试者患有或未患有增生性疾病癌症。在一些方面，受试者患有结直肠腺癌、转移性结直肠癌、表达结直肠癌的晚期CEA、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌。在一些方面，受试者具有至少
1、2或3个转移性疾病部位。在一些方面，受试者包含过表达CEA的细胞。在进一步的方面，在非癌细胞中，过表达CEA的细胞相对于基线CEA表达，将CEA过表达至少2、3、4、5、6、7、8、9或
10倍。在又一方面，过表达CEA的细胞包括癌细胞。
[0064] 在一些方面，受试者携带有经诊断的疾病易感性。在一些方面，所述受试者患有稳定的病情。在一些方面，受试者携带有疾病的遗传易感性。在一些方面，该疾病为癌症。在进一步的方面，该癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、结肠癌、乳腺癌或胃癌。在进一步的方面，该癌症为前列腺癌。在进一步的方面，该癌症为结肠癌。在一些方面，受试者是人类。
通过引用的方式并入
[0065] 如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地通过引用的方式并入地指出一样，本说明书中涉及到的所有出版物、专利和专利申请均以相同的程度通过引用
的方式并入本文。
附图说明
[0066] 专利或申请文件包含至少一张彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。在所附的权利要求书
中对本发明的新颖特征进行具体阐述。通过参考以下阐述说明性实施例(其中利用了本发
明的原理以及包含以下内容的附图)的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点：
[0067] 图1示例了ALT-803超激动剂的示意图。
[0068] 图2示例了与ALT-803疗法相结合的Ad5[E1-]-CEA疫苗的研究设计和结果。
[0069] 图2A示例了用于评估在表达CEA的荷瘤小鼠中Ad5[E1-]-CEA疫苗和ALT-803疗法的联合施用的施用方案。
[0070] 图2B示例了一种存活曲线，该存活曲线示出表达CEA的荷瘤小鼠中的存活百分比，该荷瘤小鼠未接受治疗，在第10和17天仅接受ALT-803，在第7、14和21天接受了Ad5[E1-]-
CEA疫苗，或在第7、14和21天用Ad5[E1-]-CEA疫苗连同在第10和17天注射ALT-803)。
[0071] 图3示例了一种存活曲线，该存活曲线示出了表达CEA的荷瘤小鼠的存活百分比，该荷瘤小鼠仅接受Ad5[E1-,E2b-]-无效疫苗，Ad5[E1-,E2b-]-无效疫苗连同ALT-803，仅
Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗，或Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗连同ALT-803。

具体实施方式

[0072] 以下段落更详细地描述了某些实施例的不同方面。除非有明确相反地指出，否则每个方面可以与一个或多个其他方面进行组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可
以与指示为优选或有利的特征的任何其他特征进行组合。
[0073] 除非另有说明，否则任何实施例可以与任何其他实施例进行组合。可以以范围格式的形式呈现各种方面。应当理解的是，在范围格式上的描述仅仅是为了方便和简洁目的，
而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开
了所有可能的子范围和该范围内的各个数值，如同已明确写出。例如，对诸如从1到6的范围
描述应当被视为已明确公开的子范围，该子范围诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的广度怎么样，这都适用。当存在范围时，该范围包括范围端点。
[0074] 为了解决自身肿瘤抗原的免疫原性低，提出了各种先进的多组分疫苗接种策略，该策略包括与IL-15超激动剂、ALT-803进行的联合治疗。一些实施例涉及重组病毒载体，该
重组病毒载体提供先天的促炎信号，同时其被工程化为表达靶向抗原(诸如CEA)。基于腺病
毒血清5型(Ad5)的免疫疗法特别令人关注，该免疫疗法能够用于人类以诱导稳健的T细胞
介导的免疫(CMI)应答，同时，保持了广泛的安全特性。
[0075] 与第一代腺病毒载体相比，第二代E2b缺失的腺病毒载体的某些实施例包含在DNA聚合酶基因(pol)中附加的缺失以及在前末端蛋白质(pTP)中的缺失。与第一代腺病毒载体
的5kb至6kb容量相比，E2b缺失的载体具有多达13kb的基因携带容量，从而容易为编码多种
靶抗原中任何一种的核酸序列提供空间。与第一代腺病毒载体相比，E2b缺失的腺病毒载体
还具有减少的不良反应。
[0076] 据发现，在抗原特异性免疫应答的诱导方面，Ad5[E1-,E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，而且似乎优于Ad5[E1-]载体，这使它们更适合用作提供可导致临床应答的CEA
疫苗的平台。在其他情况下，免疫诱导可能需要几个月的时间。在诱导抗原特异性免疫应答
方面，Ad5[E1-,E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，而且似乎优于Ad5[E1-]载体，使它
们更适合用作提供可导致临床应答的CEA疫苗的平台。
[0077] 某些实施例使用新的Ad5[E1-,E2b-]载体系统来提供开发针对CEA的治疗性疫苗的长期以来探索后的需求，克服其他Ad5系统发现的障碍，并允许之前接触过Ad5的人们进
行免疫。
[0078] 对野生型Ad的先天免疫应答可能很复杂，并且看来腺病毒载体表达的Ad蛋白起着重要的作用。具体而言，在E2b缺失的载体中的前末端蛋白质和DNA聚合酶的缺失似乎在注
射后的最初24至72小时内缓解了炎症，而第一代腺病毒载体则在此期间刺激了炎症。另外，
据报道，由E2b缺失产生的附加的复制块也引起Ad晚期基因的表达降低10,000倍，这远远超
过仅由E1、E3缺失所提供的复制块。通过E2b缺失的腺病毒载体产生的Ad蛋白的降低水平有
效地降低了对Ad抗原产生富有有竞争力的、不希望的免疫应答、防止在接受Ad免疫或接触
的个体中重复使用平台的反应的可能性。通过第二代E2b缺失的载体对炎症应答的降低的
诱导作用导致载体在抗原呈递细胞(即树突状细胞)感染期间表达所需疫苗抗原的可能性
增加，从而降低了抗原竞争力的可能性，与第一代腺病毒载体的相同尝试相比，这导致疫苗
对抗所期望抗原的更大免疫力。E2b缺失的腺病毒载体提供了一种改进的基于Ad的疫苗候
选物，比起之前描述的使用第一代腺病毒载体的候选疫苗，该疫苗候选物比先前描述的疫
苗候选物更安全、更有效、更通用。
由于Ad特异性中和了抗体，第一代载体的功效可能降低。在不受理论的束缚的情况下，
具有E1和E2b区域(Ad5[E1-,E2b-])的缺失的基于Ad5的载体(后者编码DNA聚合酶和前末端
蛋白，例如，由于晚期病毒蛋白表达的减少)可以避免免疫清除，并诱导对抗Ad-免疫宿主中
编码的肿瘤抗原转基因的更有效的免疫应答。
[0079] 一些实施例涉及用于产生对抗靶抗原的免疫应答的方法和组合物(例如病毒载体)，特别是那些与传染病或增生性细胞疾病(诸如癌症)有关或相关的靶抗原。一些实施例
涉及用于在个体中产生对抗靶抗原的免疫应答的方法和组合物，特别是那些与细胞增殖性
疾病(诸如癌症)有关的靶抗原。在一些实施例中，本文所述的组合物和方法涉及在个体中
产生对抗表达细胞的免疫应答和/或呈现包含至少一种靶抗原的靶抗原或靶抗原标记。
[0080] 该组合物和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的靶抗原的免疫应答。例如，所述组合物和方法可用于产生对抗癌胚抗原(CEA)，诸如细胞表达或呈递的CEA。例如，
该组合物和方法能够用于对抗细胞表达或呈现的CEA(6D)而产生免疫应答。例如，该组合物
和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的粘蛋白1(MUC1)的免疫应答。例如，该组合
物和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的MUC1c的免疫应答。例如，该组合物和方
法能够用于产生对抗由细胞表达和/或呈递的Brachyury(T蛋白(T))的免疫应答。
[0081] 该组合物和方法可用于产生对抗细胞表达和/或呈递的多种靶抗原的免疫应答。例如，该组合物和方法能够用于产生对抗CEA的免疫应答。
[0082] CEA的经修饰形式可以用于这样的疫苗中：该疫苗针对增强对抗CEA的免疫应答或者表达和/或呈递CEA的细胞。特别地，一些实施例提供了改进的基于Ad的疫苗，使得可以实
现对抗一个或多个抗原靶实体的多次疫苗接种。在一些实施例中，改进的基于Ad的疫苗包
含复制缺陷型腺病毒，该复制缺陷型腺病毒携带其靶抗原、片段、变体或变体片段，诸如Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)。可以基于包括免疫原性的多种因素选择靶抗原的变体或片段(诸如
CEA)。相对于CEA(WT)，能够利用突变的CEA，CEA(6D)来提高其增强免疫应答的能力。重要的是，在预先存在对Ad的免疫的情况下，能够进行疫苗接种，或者可以将疫苗接种给事先用本
文所述的Ad载体或其他Ad载体多次免疫的受试者。可将Ad载体多次施用给受试者，以诱导
对抗目标抗原(诸如CEA)的免疫应答，其包括但不限于产生对抗一个或多个靶抗原的抗体
和CMI应答。
[0083] 如本文所使用，除非另外指出，否则冠词“一”(“a”)是指一个或多个，除非另有明确规定。如本文所用，除非另外指出，否则诸如“含”(“contain”)、“含有”(containing)、“包括”(include)、“包括有”(including)等词语的意思是“包含”(comprising)。如本文所用，除非另外指出，否则词语“或”(or)可以是连接的或分离的。如本文所使用的，除非另外指出，否则任何实施例可以与任何其他实施例进行组合。
[0084] “腺病毒”(Ad)是指来自腺病毒科的非包膜DNA病毒。这些病毒可以在但不限于人类、禽类、牛、猪和犬类中找到。一些实施例预期使用来自腺病毒科的四个属中的任何属的
任何Ad(例如，禽腺病毒(Aviadenovirus)、马斯特腺病毒属(Mastadenovirus)、腺胸腺病毒
属(Atadenovirus)和唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus))作为E2b缺失的病毒载体或包含
本文所述的其他缺失的载体的基础。另外，在每个物种中发现了几种血清型。Ad还涉及任何
这些病毒血清型的遗传衍生物，其包括但不限于遗传突变、缺失或转换物。
[0085] “辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指能够提供特定宿主细胞无法提供的病毒功能(宿主可以提供Ad基因产物，诸如E1蛋白)的Ad。该病毒用于反式提供第二病毒或辅助依赖性病
毒(例如去病毒基因或病毒基因的病毒，或针对特定区域(例如E2b或其他如本文所述的区
域)缺失的病毒)缺乏的功能(例如蛋白质)；据说第一无复制能力的病毒“有助于”第二辅助
依赖性病毒，从而允许在细胞中产生第二病毒基因组。
[0086] “腺病毒5无效(Ad5-无效)”是指不复制的Ad，其不包含用于表达的任何异源核酸序列。
[0087] “第一代腺病毒”是指已经缺失的早期区域1(E1)的Ad。在其他情况下，也可以缺失早期区域3(E3)。
[0088] “去病毒基因(Gutted)”或“无病毒基因(gutless)”是指已经在所有病毒编码区域中缺失的Ad载体。
[0089] “转染”是指将外来核酸引入到真核细胞内。转染的示例性方式包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚乙烯介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹药。
[0090] “稳定的转染”或“稳定地转染”是指将外来核酸、DNA或RNA引入并整合到转染细胞的基因组中。词语“稳定的转染”是指已经将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
[0091] “报告基因”表示编码报告分子(例如酶)的核苷酸序列。在各种检测系统中的任何一种中系统中，都可检测到“报告分子”，其包括但不限于酶基的检测测定法(例如ELISA、组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统。大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因、绿色荧光蛋白
(GFP)、人胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因；以及可以使用的其他报告基
因。
[0092] “异源序列”是指与自然界中未与之连接或自然界中不同位置与之连接的核酸序列连接或被操作连接的核苷酸序列。异源核酸可以包括天然存在的核苷酸序列，或者可以
包括相对于天然存在序列的一些修饰。
[0093] “转基因”是指引入受试者的细胞或基因组中的任何基因编码区域、天然或异源核酸序列或融合的同源或异源核酸序列。转基因可以携带在用于将转基因引入受试者细胞的
任何病毒载体上。
[0094] “第二代腺病毒”是指从病毒中缺失(去除)全部或部分的E1、E2、E3并且在某些实施例中E4 DNA基因序列的Ad。
[0095] “受试者”是指任何动物，其包括但不限于：人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、老鼠和禽类。
[0096] “免疫原性片段”是指被B细胞和/或T细胞表面抗原受体(其导致产生针对该片段的免疫应答)特异性识别(即特异性结合)的多肽的片段。
[0097] “靶抗原”或“靶蛋白”是指诸如蛋白质的分子，针对该分子进行定向免疫应答。
[0098] “E2b缺失”是指以阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的方式进行突变的DNA序列。因此，在某些实施例中，相对于从Ad基因组中缺失(去除)的特定DNA序列来使用
“E2b缺失”。E2b缺失或“在E2b区域内包括缺失”是指Ad基因组的E2b区域内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施例中，缺失了一个以上的碱基对，并且在其他实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，缺失是Ad基因组的E2b区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。
E2b缺失可以是阻止至少一种E2b基因产物表达和/或功能的缺失，并且因此涵盖了E2b特异
性蛋白的编码部分的外显子内的缺失和启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E2b
缺失是阻止E2b区域的DNA聚合酶和前末端蛋白之一或二者的表达和/或功能的缺失。在进
一步的实施例中，“E2b缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使
得一个或多个编码的蛋白质为不起作用的。此类突变包括用不同残基替换的残基，这引起
导致不起作用蛋白的氨基酸序列的变化。
[0099] “E1缺失”是指DNA序列，其以阻止至少一种E1基因产物的表达和/或功能的方式进行突变。因此，在某些实施例中，相对于从Ad基因组中缺失(去除)的特定DNA序列来使用“E1缺失”。E1缺失或“在E1区域内包括缺失”是指Ad基因组的E1区域内的至少一个碱基对的缺
失。因此，在某些实施例中，缺失了一个以上的碱基对，并且在其他实施例中，缺失至少20、
30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，缺失是Ad基因组的E1区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。E1缺失可以是阻止至少一种E1基因产物表达和/或功能的缺失，因此，其涵盖E1特异性蛋白的编码部
分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E1缺失是阻止E1
区域的反式转录调节因子之一或两者的表达和/或功能的缺失。在另一个实施例中，“E1缺
失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一个或多个编码的蛋白
质是不起作用的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导致不起作用蛋白的氨基酸
序列改变。
[0100] “产生免疫应答”或“诱导免疫应答”是指统计学上显著的变化(例如增加或减少)，该变化发生在一种或多种免疫细胞(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等)的数量或一种或多种这些免疫细胞的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌状况的变化等)中。
[0101] 在本文中大体上可互换使用词语“核酸”和“多核苷酸”。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是DNA(例如基因组，cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子可以包括
HnRNA分子和mRNA分子，HnRNA分子包含内含子并以一对一方式对应于DNA分子，mRNA分子不
包含内含子。如本文所述，附加的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸内，并且多
核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。如本文所用，分离的多核苷酸是指多核
苷酸大体上远离其他编码序列。例如，本文所用的分离的DNA分子不包含大部分不相关的编
码DNA，比如大的染色体片段或其他功能基因或多肽编码区域。这是指最初分离的DNA分子，
并不排除后来在实验室中重组添加到该片段中的基因或编码区域。
[0102] 如本领域技术人员所理解的那样，多核苷酸能够包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小的工程化基因片段，它们表达或可以被调适以表达本文所述的靶抗
原、抗原片段、肽等等。可以将这样的片段自然分离，也可以将其通过人工方式进行修饰。
[0103] 一般而言，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地，使得通过变体多核苷酸编码的多肽表位具有免疫原性，或者使得相对于由天然多核苷酸序
列编码的多肽的异源靶蛋白的免疫原性大体上不减少。在一些情况下，一种或多种取代、添
加、缺失和/或插入可导致增加变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性。如本文其他地
方所述，多核苷酸变体能够编码靶抗原的变体或其片段(例如，表位)，其中变体多肽或其片
段(例如，表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽基本
上没有减少。多核苷酸变体可以编码靶抗原的变体或其片段，其中相对于天然多肽，变体多
肽或其片段与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向显著增加。
[0104] 词语“变体”也应理解为涵盖异种来源的同源基因。在特定的实施例中，靶抗原的变体或片段被修饰成使得它们具有一种或多种降低的生物学活性。例如，可以修饰致癌蛋
白靶抗原以减少或消除该蛋白的致癌活性，或者可以修饰病毒蛋白以减少或消除一种或多
种活性或病毒蛋白。修饰的CEA蛋白的实例是具有N610D突变的CEA，这导致具有增加的免疫
原性的变体蛋白。
[0105] 当比较多核苷酸序列时，如下文所述，如果两个序列中的核苷酸序列在为了最大对应性而对齐时而相同，则这两个序列“相同”。两个序列之间的比较通过这样的方式进行：
通常通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较局部序列区域相似性。如本文所用，“比较窗
口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为30至约75、40至约50个，其中两个序列最佳比
对后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。通过使用Lasergene生物信
息学软件套件中的Megalign程序(其使用默认参数)，可以对序列对齐进行最优比对。可替
代地，可以通过Smith和Waterman,Add.APL.Math 2:482(1981)通过Needleman和Wunsch,
J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性对齐算法、通过Pearson和Lipman,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的类似性搜索方法、通过这些算法的计算机实施
(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA)或通过检查来对序列对齐进行最优比对。算法的一
个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，该实例适合确定序列同一性和序列相似性百分比。可以
使用BLAST和BLAST 2.0(例如其具有此处描述的参数)来确定多核苷酸的序列同一性百分
比。可通过国家生物技术信息中心公开获得实施BLAST分析的软件。在一个示例性实例中，
使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得
分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：由于累积了一个或多个负得分残基
比对，累积比对得分从其最大实现值下降了数量X，累积比分变为零或以下。或到达任一序
列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序默认使用字长
(W)为11，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵对齐方式(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-
4和两条链的比较。
[0106] “序列同一性百分比”能够通过以下比较方式进行确定：比较至少20个位置的窗口上的两个最佳对齐序列，其中比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(即缺
口)与参考序列(不包括添加或缺失)相比，两个序列的最优比对通常为20％或更少，通常为
5％到15％，或10％到12％。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸
碱基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参考序列中的位置的总
数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
[0107] 本领域普通技术人员将理解是，由于遗传密码的简并性，如本文所述，存在许多编码特定目的抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸
序列具有最小的同源性。然而，由于密码子用法的差异，特别考虑了变化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在一些实施例的范围内。等位基因是由于
一种或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)被改变的内源基因。得到的mRNA和蛋
白质可以但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库
序列比较)鉴定等位基因。
免疫疗法和疫苗的病毒载体
[0108] 重组病毒载体可用于表达蛋白质编码基因或抗原(例如，TAA(肿瘤相关抗原)和/或IDAA(感染性疾病相关抗原))。基于重组病毒载体的疫苗和免疫疗法的优势包括高效的
基因转导、高特异性地向靶细胞传递基因、诱导强大的免疫应答和增强细胞免疫力。某些实
施例提供了重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含病毒基因组关键区域的缺失或插入。
本文提供的病毒载体能够包含编码一种或多种目标靶抗原或其变体、片段或融合体的异源
核酸序列，期望针对其产生免疫应答。
[0109] 可以与本文提供的方法和组合物一起使用的合适的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、原病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、自身互补腺伴随病毒、巨细胞病毒、仙台病毒、HPV病毒或腺病毒。在一些实施例中，病毒载体可以是具有复制能力。在一些实施例中，病毒载体可以是复制缺陷的。可以缺失复制缺陷型病毒载体的编码区，该编码区
用于编码参与复制和包膜的蛋白质。这些病毒能够感染细胞并提供有效载荷而不会杀死细
胞。根据病毒载体的不同，复制缺陷型病毒载体中允许的DNA或cDNA插入片段的典型最大长
度约为8-10千个碱基(kB)。
[0110] 逆转录病毒已用于表达抗原，例如含有逆转录酶的包膜单链RNA病毒。逆转录病毒载体可以是复制缺陷的。逆转录病毒载体可以是来源于鼠类或禽类。逆转录病毒载体可以
来自莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)。可以使用需要基因组整合以表达基因的逆转录病毒
载体。逆转录病毒载体可用于提供长期的基因表达。例如，逆转录病毒载体的基因组大小约
为7kb-11kb，载体可容纳7kb-8kb长的外源DNA插入片段。逆转录病毒载体可用于显示低免
疫原性，并且大多数患者不显示对逆转录病毒载体的预先存在的免疫力。逆转录病毒载体
可用于感染分裂细胞。逆转录病毒载体可用于不感染非分裂细胞。
[0111] 慢病毒载体可用于表达抗原。慢病毒可以构成逆转录病毒的亚类慢病毒载体可以感染非分裂细胞。慢病毒载体可用于感染分裂细胞。慢病毒载体可用于感染非分裂和分裂
细胞。慢病毒比逆转录病毒可以表现出更广泛的嗜性。几种蛋白质，诸如tat和rev调节慢病
毒的复制。这些调节蛋白通常在逆转录病毒中不存在。HIV是经基因修饰以递送转基因的示
例性慢病毒载体。慢病毒载体的优点类似于逆转录病毒载体的优点。例如，可以通过缺失
HIV病毒包膜和载体生产过程中不需要的某些调节基因来生成HIV基的载体。代替亲本包
膜，产生了几个嵌合或修饰的包膜载体，因为它决定了细胞和组织的特异性。
[0112] 巨细胞病毒(CMV)载体已用于表达抗原，并且是疱疹病毒的成员。可以使用物种特异性的CMV(例如人CMV(HCMV)，例如人疱疹病毒5型)。HCMV包含被衣壳包围的235kb的双链
线性DNA基因组。包膜含有与细胞受体结合的糖蛋白gB和gH。
[0113] 仙台病毒(SeV)载体已用于表达抗原。SeV病毒是副粘病毒家族的成员。SeV是有包膜的单链RNA病毒。SeV基因组编码6种蛋白和2种包膜糖蛋白、HN和F蛋白，它们介导细胞进
入并决定其嗜性。缺乏F蛋白的SeV载体可用作复制缺陷型病毒，以提高载体的安全性。包装
细胞中产生的SeV载体可用于表达F蛋白。可以将缺失F基因并且插入转基因的基因组可以
转染到包膜细胞中。SeV包含RNA依赖性RNA聚合酶，并且病毒基因组定位于细胞质。这样可
确保在感染后立即发生快速基因表达，并确保SeV的遗传毒性优势。SeV载体可用于显示高
效的基因转移。SeV载体可用于转导分裂细胞和非分裂细胞。SeV载体可用于转导非分裂细
胞。SeV载体可用于转导分裂细胞。SeV载体可以用于例如有效地转导人气道上皮细胞。SeV
载体可以例如通过粘膜(例如，口服和经鼻)途径施用。与肌肉内施用相比，鼻内施用可用于
潜在地降低先前对SeV的免疫力的影响。与其他病毒载体相比，其转基因能力(3.4kb)低。
SeV与人副流感1型(hPIV-1)病毒高度同源；因此，预先存在的针对hPIV-1的免疫可以对抗
SeV的使用。
腺病毒载体
[0114] 一般而言，腺病毒在临床上很有吸引力，因为它们能够具有广泛的嗜性，可以感染多种分裂和非分裂细胞类型，可以全身使用，也可以通过哺乳动物体内更具选择性的粘膜
表面使用。另外，它们的相对热稳定性进一步促进了其临床使用。腺病毒是DNA病毒家族，其特征在于包含线性双链基因组的二十面体，无包膜衣壳。一般而言，腺病毒作为非包膜病毒
而被发现，其包含约30-35千个碱基的双链DNA基因组。在人类Ad中，没有与任何肿瘤性疾病
有关，并且只会在具有免疫能力的个体中引起相对轻度的自我限制疾病。病毒表达的第一
个基因是E1基因，其作用是从野生型基因组中存在的其他Ad5基因启动子启动高水平的基
因表达。病毒DNA复制和后代病毒粒子的组装发生在受感染细胞的核内，并且整个生命周期
大约需要36个小时，每个细胞输出约104个病毒粒子。野生型Ad5基因组约为36kb，其编码的
基因分为早期和晚期病毒功能，这具体取决于它们是在DNA复制之前还是之后表达。早期/
晚期的描述几乎是绝对的，因为已经证明，先前用Ad5感染的细胞进行超感染会导致超级感
染病毒缺乏晚期基因表达，直到它复制了自己的基因组为止。在不受理论的束缚的情况下，
这很可能是由于Ad5主要晚期启动子(MLP)的复制依赖性顺式激活，这阻止了晚期基因表达
(主要是Ad5衣壳蛋白)，直到将复制的基因组封装为止。在一些实施例中，本文所述的组合
物和方法利用了先进的Ad载体/疫苗的开发中的特征。腺病毒的线性基因组能够两侧都有
两个DNA复制(ITR)起点，并且能够有8个单元用于RNA聚合酶II介导的转录。基因组可以携
带五个早期区域，这五个早期区域包括E1A、E1B、E2、E3、E4和E5，病毒复制开始后表达的两个区域(IX和IVa2)和信号晚期区域(L)可细分为L1-L5。一些腺病毒能够进一步编码一种或
两种称为病毒相关(VA)RNA的RNA。
[0115] 提供了在人类患者中诱导先天和适应性免疫应答的腺病毒。通过病毒基因组的关键区域的缺失或插入，从而提供了重组载体，该重组载体经过工程化处理，以增强其可预测
性，并且减少不期望的副作用。在一些方面，提供了一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含选
自以下组成的组的基因组缺失或插入：E1A、E1B、E2、E3、E4、E5、IX、IVa2、L1、L2、L3、L4、和L5及其任何组合。
[0116] 某些实施例提供了一种重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含改变的衣壳。一般而言，腺病毒的衣壳主要包含二十面体的20个三角面片，每个二十面体含有12个六聚体
副本。此外，还存在其他一些附加的小衣壳蛋白，即IIIa、VI、VIII和IX。
[0117] 某些实施例提供了一种重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含一种或多种改变的纤维蛋白。一般而言，还将形成三聚体的纤维蛋白在12个顶点处插入五聚体五邻体碱基
中。纤维可以包括细的N末端尾、杆和杵结构域。杆可包含可变数量的β链重复(序列)。杵可以包括一个或多个环A，B，C，D，E，F，G，H，I，J。纤维杵能够与细胞受体结合。某些实施例提供了在疫苗系统中用于治疗癌症和传染病的腺病毒载体。
[0118] 可以与本公开内容的本发明方法和组合物一起使用的合适的腺病毒包括但不限于物种特异性腺病毒，该物种特异性腺病毒包括如本文所提供的人类亚组A，B1，B2，C，D，E和F或它们的关键基因组区域，那些亚组可以进一步分为免疫学上不同的血清型。此外，可
以与本公开内容的本发明方法和组合物一起使用的合适的腺病毒包括但不限于物种特异
性腺病毒或其从灵长类、牛、禽类、爬行动物或青蛙中鉴定的关键基因组区域。
[0119] 一些腺病毒的血清型优先靶向不同的器官。诸如AdHu1、AdHu2和AdHu5(C亚属)的血清型通常影响感染上呼吸道，而A和F亚属对胃肠道器官有影响。某些实施例提供了重组
腺病毒载体，其可优先用于针对不同器官的治疗，用于治疗器官特异性癌症或器官特异性
传染病。在一些应用中，改变重组腺病毒载体，以减少哺乳动物中特定器官的嗜性。在一些
应用中，改变重组腺病毒载体，以增加对哺乳动物中特定器官的嗜性。
[0120] 腺病毒的嗜性能够通过它们附着于宿主细胞受体的能力来确定。在一些情况下，宿主细胞附着的过程能够涉及纤维的远端杵结构域与宿主细胞表面分子的初始结合，然后
是五邻体碱基内的RGD基序与αV整联蛋白的结合。某些实施例提供了具有改变的嗜性的重
组腺病毒载体，使得能够对该重组腺病毒载体进行基因工程化，以感染宿主的特定细胞类
型。某些实施例提供了具有改变的嗜性的重组腺病毒载体，用于治疗细胞特异性癌症或细
胞特异性传染病。某些实施例提供了重组的腺病毒载体，该腺病毒载体具有来自亚组A，B，
C，D或F的一种或多种腺病毒或其组合的改变的纤维杵或RGD序列插入。在一些应用中，包含
改变的纤维杵的重组腺病毒载体产生一种或多种特定细胞类型的嗜性降低的载体。在一些
应用中，包含改变的纤维杵的重组腺病毒载体产生一种或多种特定细胞类型的嗜性增加的
载体。在一些应用中，包含改变的纤维杵的重组腺病毒载体产生具有降低的产物特异性B或
T细胞应答的载体。在一些应用中，包含改变的纤维杵的重组腺病毒载体产生具有增强的产
物特异性B或T细胞应答的载体。
[0121] 某些实施例提供了这样的重组腺病毒载体：该重组腺病毒载体用其他分子包被，以避免病毒中和抗体的影响，或者改善向宿主细胞的转导。某些实施例提供了这样的重组
腺病毒载体：该重组腺病毒载体被衔接子分子包被，该衔接子分子有助于载体与宿主细胞
受体进行连接。举例来说，腺病毒载体能够用连接柯萨奇Ad受体(CAR)和CD40L的衔接子分
子包被，这引起树突状细胞的转导增加，从而增强受试者的免疫应答。还考虑了类似地工程
化用于增强与其他靶细胞类型附着的其他腺病毒载体。
Ad5病毒载体
[0122] 对人类和动物的研究表明，对抗Ad5的预先存在的免疫力可能是基于Ad的疫苗商业应用的抑制因素。人类主要具有抗Ad5的抗体，其为人类疫苗中使用最广泛的亚型，研究
的三分之二的人对Ad5有淋巴增殖应答。这种预先存在的免疫力能够使用典型的Ad5疫苗抑
制免疫或重新免疫，并且可以阻止以后使用Ad5载体对抗第二抗原的疫苗免疫。克服预先存
在的抗载体免疫性的问题一直是深入研究的主题。使用其他人类(非基于Ad5的)Ad5亚型，
甚至非人类形式的Ad5的调查均已进行了检查。即使这些方法在最初的免疫接种中成功了，
由于对新Ad5亚型的免疫应答，后续的疫苗接种可能会出现问题。为了避免Ad5免疫屏障，并
改善第一代Ad5[E1-]载体诱导最佳免疫应答的有限功效，一些实施例涉及基于下一代Ad5
载体的疫苗平台。
[0123] 构建第一代或缺失E1的腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅替代基因的E1区域。一般而言，约90％的野生型Ad5基因组保留在载体中。Ad5[E1-]载体的复制能力降低，并且
在感染不表达Ad5 E1基因的细胞后无法产生传染性病毒。重组Ad5[E1-]载体在人细胞(例
如293细胞)中繁殖，允许Ad5[E1-]载体复制和包膜。Ad5[E1-]载体具有许多积极属性。其中
最重要的一项是它们相对易于扩展规模和生产cGMP。目前，超过220项人类临床试验使用了
Ad5[E1-]载体，超过两千名受试者接受了sc、im或iv病毒。此外，Ad5载体没有整合；它们的基因组保持游离状态。一般而言，对于没有整合到宿主基因组中的载体，插入诱变和/或种
系传递的风险非常低。常规的Ad5[E1-]载体的携带能力接近7kb。
[0124] 通过减少晚期病毒蛋白的表达，基于Ad5的载体(其具有E1和E2b区域的缺失(Ad5[E1-,E2b-])，后者编码DNA聚合酶和末端蛋白)提供了这样的机会：在抗Ad免疫宿主中避免
免疫清除并诱导针对编码的肿瘤抗原转基因的更有效的免疫应答。新的Ad5平台在E2b区域
有其他缺失，从而移除了DNA聚合酶和前末端蛋白质基因。Ad5[E1-,E2b-]平台具有足够的
克隆能力，其足以允许包含许多可能的基因。与Ad5[E1-]载体的7kb容量相比，Ad5[E1-,
E2b-]载体具有高达约12kb的基因携带容量，并在需要时为多个基因提供了空间。在一些实
施例中，将超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11kb的插入片段引入Ad5载体，例如Ad5[E1-,E2b-]载体。E2b区域的缺失使Ad5载体具有有利的免疫特性，其通常引起对靶转基因抗原的
有效免疫应答，同时使对Ad病毒蛋白的免疫应答最小化。
[0125] 在各种实施例中，Ad5[E1-,E2b-]载体诱导有效的CMI，并且甚至在存在Ad免疫力的情况下，诱导抗载体表达的疫苗抗原的抗体。与Ad5[E1-]载体相比，Ad5[E1-,E2b-]载体
还具有减少的不良反应，特别是肝毒性和组织损伤的出现的情况下。这些Ad5载体的关键方
面是大大降低Ad晚期基因的表达。例如，可以在体内检测Ad5[E1-]载体衣壳纤维蛋白的产
生，而从Ad5[E1-,E2b-]载体疫苗中去除纤维表达。对野生型Ad的先天免疫应答是复杂的。
从Ad5[E1-,E2b-]载体中缺失的蛋白质通常起重要作用。具体地，与Ad5[E1-]载体相比，在
注射后的前24至72小时内，具有前末端蛋白或DNA聚合酶缺失的Ad5[E1-,E2b-]载体显示出
减少的炎症。在各种实施例中，缺乏Ad5基因表达使得被感染的细胞对于抗Ad活性不可见，
并允许被感染的细胞长时间表达转基因，从而增强对靶标的免疫力。
[0126] 一些实施例考虑增加针对Ad5的能力[E1-,E2b-]载体可转导树突状细胞，这通过利用针对Ad5[E1-,E2b-]载体病毒蛋白的
减少的炎症应答以及避免先前存在的Ad免疫来改善疫苗中的抗原特异性免疫应答。
复制缺陷Ad5载体
[0127] 克服抗Ad免疫力的尝试已经包括使用替代的Ad血清型和/或Ad5病毒衣壳蛋白的改变，每种均具有有限的成功以及显著改变所得疫苗的生物分布的潜力。因此，通过进一步
减少来自E1缺失的Ad5载体的病毒蛋白(已知蛋白质是预先存在的Ad免疫的靶标)的表达，
尝试了一种全新的方法。具体而言，已描述了一种新型重组Ad5平台，该平台在早期1(E1)基
因区域具有缺失，并且在早期2b(E2b)基因区域(Ad5[E1-,E2b-])具有其他缺失。E2b区域
(编码DNA聚合酶和前末端蛋白)的缺失导致病毒DNA复制减少和后期病毒蛋白表达降低。该
载体平台可用于在癌症和传染病动物模型中诱导CMI反应，更重要的是，此重组Ad5基因递
送平台克服了Ad5免疫障碍，可用于预先存在的和/或载体诱导的Ad免疫情况中，因此可以
实现疫苗的多个同源施用。在特定实施例中，一些实施例涉及血清型5的复制缺陷型腺病毒
载体，其包含编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可以是突变体、天然变体或其片段。
[0128] 在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包含编码与野生型免疫原性多肽或其片段具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，99.5％，
99.9％或100％同一性的多肽的修饰序列。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包含编
码野生型多肽的亚基的修饰序列。在一些实施例中，所述组合物和方法涉及腺病毒来源的
载体，其与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:100具有至少60％的序列同一性。
[0129] 在一些实施例中，腺病毒衍生的载体(任选地与复制缺陷腺病毒有关)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:100具有至少75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，99.5％，
99.8％或99.9％的同一性的序列，或者包含通过替代密码子替换从SEQ ID NO:3或SEQ ID 
NO:100生成的序列。在各种实施例中，本文所述的腺病毒来源的载体在E2b区域中具有缺
失，并且任选地在E1区域中，该缺失赋予载体如本文所述的在免疫疗法中的使用的多种优
点。
[0130] 在一些实施例中，本公开的CEA抗原可与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，编码用于本公开内容的CEA抗原的核酸序列能够与SEQ ID NO:1，
SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:2的位置1057至3165具有至少80％、至少85％、至少87％、至少
90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，编码用于CEA抗原的复制缺陷型腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])能够与SEQ ID NO:2或SEQ ID 
NO:2的位置1057至3165具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少
95％、至少97％，或至少99％的序列同一性。
[0131] 腺病毒基因组内的某些区域起着重要的作用，并且在构建复制缺陷型腺病毒载体时可能需要充分保存。这些区域还在Lauer等人,J.Gen.Virol.,85,2615-25(2004),Leza等
人,J.Virol.,p.3003-13(1988),和Miralles等人.,J.Bio Chem.,Vol.264,No.18,
p.10763-72(1983)中进一步描述，其通过引用的方式整体并入。在一些实施例中使用重组
核酸载体，所述重组核酸载体包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:100的一部分(例如包含SEQ 
ID NO:3或SEQ ID NO:100的至少约100、250、500、1000或更多个碱基的部分)具有至少为
50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、或100％的序列同一性值的序列。
[0132] 某些实施例考虑了使用E2b缺失的腺病毒载体，诸如美国专利号6,063,622、6,451,596；6,057,158；6,083,750；和8,298,549描述的那样，其各自通过引用的方式整体并
入本文。在许多情况下，在E2b区域中缺失的载体削弱了病毒蛋白的表达和/或降低了产生
复制能力的Ad(RCA)的频率。这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖可以利用表达缺失的E2b基
因产物的细胞系来完成。本文提供了此类包膜细胞系。例如来自HEK-2p3细胞系的E.C7(以
前称为C-7)。
[0133] 此外，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可以与E1基因产物一起在E.C7或类似细胞中组成型表达。将基因片段从Ad基因组转移到生产细胞系具有直接的益处：(1)增加
的承载能力；和(2)产生RCA的潜力降低，通常需要两个或多个独立的重组事件才能产生
RCA。在一些实施例中使用的E1，表达Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白的细胞系可以使携带
能力接近13kb的腺病毒载体繁殖，而不需要污染性辅助病毒。此外，当缺失了对病毒生命周
期至关重要的基因(例如E2b基因)时，进一步削弱Ad复制或表达其他病毒基因蛋白。这可以
降低对感染细胞的免疫识别，并延长外源转基因表达的持续时间。
[0134] E1、DNA聚合酶和末端蛋白质缺失的载体通常无法表达E1和E2b区域的相应蛋白质。此外，它们可能显示出大多数病毒结构蛋白缺乏表达。例如，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责晚期结构蛋白L1至L5的转录。尽管MLP在Ad基因组复制之前的活性最小，但只有在病毒
基因组复制发生后，才会从mLP转录并转录高毒性的Ad晚期基因。晚期基因转录的这种顺式
依赖性激活通常是DNA病毒的特征，例如多瘤病毒和SV-40的生长。DNA聚合酶和末端蛋白对
于Ad复制非常重要(与E4或IX蛋白不同)。它们的缺失可能对腺病毒载体晚期基因表达以及
该表达在诸如APC的细胞中的毒性作用极为不利。
[0135] 腺病毒载体可以在Ad基因组的E2b区域和任选的E1区域中包括缺失。在一些情况下，这种载体没有缺失Ad基因组的任何其他区域。腺病毒载体可以包括在Ad基因组的E2b区
域中的缺失以及在E1和E3区域中的缺失。在一些情况下，此类载体没有其他区域被缺失。腺
病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区域中的缺失和在E1、E3中的缺失以及E4区域的部分或
完全去除。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区
域中的缺失和在E1和/或E4区域中的缺失。在一些情况下，此类载体不包含其他缺失。腺病
毒载体可以包括Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区域的缺失。在一些情况下，这种载体没有其
他缺失。腺病毒载体可以具有E2b区域的E1和/或DNA聚合酶功能缺失。在一些情况下，这种
载体没有其他缺失。腺病毒载体可具有E1和/或E2b区域的末端蛋白功能缺失。在一些情况
下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以使E1、DNA聚合酶和/或末端蛋白功能被缺失。
在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以具有E2b区域和/或E1区域的至少
一部分。在一些情况下，此类载体不是去病毒基因的腺病毒载体。在这方面，载体可以缺失
E2b区域的DNA聚合酶和末端蛋白功能。腺病毒载体可以在腺病毒基因组的E1、E2b和/或
100K区域中具有缺失。腺病毒载体可包括E1、E2b和/或蛋白酶功能缺失的载体。在一些情况
下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以缺失E1和/或E2b区域，而纤维基因已经通过突
变或其他改变(例如改变Ad嗜性)进行了修饰。从E3或E4区域去除基因可以被应用于所提到
的任何腺病毒载体。在某些实施例中，腺病毒载体可以在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中具有缺失。在某些实施例中，腺病毒载体可以是去病毒基因的腺病毒载体。
[0136] Ad基因组的其他区域可以被缺失。Ad基因组特定区域中的“缺失”是指以这种方式突变或去除的特定DNA序列，从而防止该区域编码的至少一种基因产物的表达和/或起作用
(例如，DNA聚合酶的E2b功能或末端蛋白功能)。缺失可以包括编码蛋白质部分的外显子内
的缺失，以及启动子和前导序列内的缺失。在特定区域内的缺失是指在Ad基因组的该区域
内的至少一个碱基对的缺失。可以缺失多个碱基对。例如，可以从特定区域缺失至少20、30、
40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。该缺失可以在Ad基因组的特定区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。这些缺失可以阻止该区域编码的基因产物的表达和/或功能。例如，Ad基因组的特定区域可以包括一个或多个点突变，使
得一个或多个编码的蛋白质是不起作用的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导
致不起作用蛋白的氨基酸序列改变。Ad基因组中的示例性缺失或突变包括E1a、E1b、E2a、
E2b、E3、E4、L1、L2、L3、L4、L5、TP、POL、IV、和VA区中的一个或多个。缺失的腺病毒载体可以例如使用重组技术来制备。
[0137] 在某些实施例中，使用组成型地表达E2b基因产物和任何必需基因的产物的适当的包装细胞系将Ad载体成功地生长至高滴度。可以使用不仅组成型表达E1和DNA聚合酶蛋
白，而且也表达Ad-前末端蛋白的HEK-293来源的细胞。E.C7细胞可用于例如培养高滴度的
腺病毒载体。
[0138] 为了从自我繁殖的腺病毒载体中去除关键基因，由靶向基因编码的蛋白质首先可以与E1蛋白质一起在HEK-293细胞或类似物中共表达。例如，可以选择性地利用当组成型共
表达时无毒的那些蛋白质(或诱导表达的毒性蛋白质)。E1和E4基因在HEK-293细胞中的共
表达是可能的(例如，利用诱导型而非组成型启动子)。E1和蛋白质IX基因(其为一种病毒粒
子结构蛋白)可以共表达。E1、E4和蛋白质IX基因的进一步共表达也是可能的。E1和100K基
因可以在反式互补细胞系中表达，E1和蛋白酶基因也可以表达。
[0139] 可以使用共表达E1和E2b基因产物的细胞系，用于生长高滴度的E2b缺失的Ad颗粒。有用的细胞系组成型表达约140kDa的Ad-DNA聚合酶和/或约90kDa的前末端蛋白。期望
细胞系(其具有E1、DNA聚合酶和末端蛋白的高水平组成型共表达而无毒性的蛋白(例如
E.C7))用于繁殖Ad以用于多疫苗接种。这些细胞系允许缺失E1、DNA聚合酶和末端蛋白质的
腺病毒载体的繁殖。
[0140] 重组Ad能够使用例如含有在适当的MOI(例如5)下感染了Ad载体病毒储备物的E.C7细胞的组织培养板进行繁殖，并在37℃下孵育40-96h。可以对感染的细胞进行收集，将
其重悬于10mM Tris-Cl(pH 8.0)中，然后进行超声处理，并且可以通过两轮氯化铯密度离
心来纯化病毒。可以将含有病毒的条带在柱上脱盐，可以添加蔗糖或甘油，并将等分试样保
存在-80℃下。可以将病毒放入旨在增强其稳定性的溶液中，诸如A195。可以测定储备物的
滴度(例如，通过测量裂解后病毒等分试样在260nm处的光密度)。可以将涵盖整个重组E2b
缺失的腺病毒载体的线性或环状质粒DNA转染到E.C7或类似细胞中，并在37℃下孵育直至
出现病毒产生的迹象(例如，细胞病变效应)。来自细胞的条件培养基可用于感染更多细胞，
以扩大纯化前产生的病毒数量。纯化可以例如通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来完
成。可以使用市售产品或定制色谱柱通过色谱法纯化病毒。
[0141] 本文所述的组合物可包含足够的病毒，以确保待感染的细胞面对一定数量的病毒。因此，一些实施例提供了重组Ad的储备物，例如无RCA的重组Ad的储备物。病毒储备物的滴度可能有很大差异，这主要取决于病毒的基因型以及制备它们的方法和细胞系。病毒储
备物的滴度可以为至少约106、107、或108pfu/mL，或更高，例如至少约109、1010、1011、或
1012pfu/mL。根据重组病毒和包装细胞系的性质，病毒储备物的滴度甚至可达到约1013个颗
粒/ml或更高。
[0142] 复制缺陷型腺病毒载体(例如，SEQ ID NO:2)可以在合适的位置包含编码靶抗原的序列、其片段或其变体。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体(例如，SEQ ID NO:2)可以在替换编码CEA或变异CEA的核酸序列(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100)的位置包含
编码本文所述靶抗原的序列或其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，复制缺陷型腺病
毒载体(例如，SEQ ID NO:2)可以在替换编码CEA或变异CEA的核酸序列(例如，SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:100)的位置包含编码本文所述靶抗原的序列或
其片段、变体或变体片段。
编码抗原靶标的多核苷酸和变体
[0143] 某些实施例提供了核酸序列，在本文中也称为编码一种或多种目的靶抗原或其片段或变体的多核苷酸。这样，一些实施例提供了编码如本文进一步描述的来自任何来源的
靶抗原的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体和用此类表达载体转化或转染的宿主细胞。
为了表达所需的靶抗原多肽，可以将编码该多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的Ad
载体中(例如，使用重组技术)。合适的腺病毒载体可包含插入的编码序列的转录和翻译以
及所需的任何连接的必要元件。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建这些腺病
毒载体，所述载体包含编码目的多肽的序列以及合适的转录和翻译控制元件。这些方法包
括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
[0144] 多核苷酸可包含天然序列(即，编码靶抗原多肽/蛋白质/表位或其一部分的内源序列)或可包含编码该序列的变体、片段或衍生物的序列。多核苷酸序列可以编码靶抗原蛋
白。在一些实施例中，多核苷酸代表针对在特定细胞类型中表达而优化的新基因序列，其可
以与天然核苷酸序列或变体有很大不同，但是编码相似的蛋白质抗原。
[0145] 在其他相关的实施例中，多核苷酸变体与编码蛋白质(例如，目的靶抗原)的天然序列具有实质同一性，例如与编码多肽的天然多核苷酸序列相比包含至少70％序列同一
性，优选包含至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％或更高序列同一性的那些(例如，使用标准参数的BLAST分析)。通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等可以适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。多核苷
酸可以编码包含例如与由天然多核苷酸序列编码的蛋白质序列相比至少70％的序列同一
性，优选地至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％或更高的序列同一性的序列。
[0146] 多核苷酸可包含至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、11、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、
270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或1000或更多个连续的核苷酸，这些核苷酸编码多肽(例如靶蛋白抗原)，以及介于它们之间的所有
中间长度。在本文中，“中间长度”是指介于引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；
21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括从200至500的所有整数；500至1,000等等。多核苷酸序列可以在一端或两端被在编码多肽
的天然序列(诸如表位或异源靶蛋白)中未发现的额外核苷酸延伸。该额外序列可由1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多核苷酸组成，位于本公开的序列的任一端或本公开的序列的两端处。
[0147] 不管编码序列本身的长度如何，多核苷酸都可以与其他DNA序列组合，诸如启动子、表达控制序列、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶切位点、多个克隆位点、其他编码片段等，使得它们的总长度可能会有很大变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的核酸片段，
该总长度优选地受制于预期的重组DNA方案中的制备和使用的容易性。总长度为约1000、
2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对的示例性多核苷酸片段等(包括所有中间长度)在许多实施例中被认为是有用的。
[0148] 诱变方法(诸如位点特异性诱变)可用于制备靶抗原序列。能够通过诱变编码多肽序列的基础多核苷酸来对多肽序列进行特异性修饰。通过使用寡核苷酸序列，位点特异性
诱变可用于制备突变体，该寡核苷酸序列编码所需突变的DNA序列，以及足够数量的相邻核
苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在被穿越的缺失连接的两侧形
成稳定的双链体。例如，可以采用长度约14至约25个核苷酸的引物，在序列的连接的两侧上
约5个至约10个残基被改变。可以在选定的多核苷酸序列中进行突变以改善、改变、减少、修饰或以其他方式改变多核苷酸的特性，和/或改变所编码多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
[0149] 多核苷酸序列的诱变能够用于改变编码多肽的一种或多种特性，诸如多肽中包含的表位的免疫原性或靶抗原的致癌性。测试多肽免疫原性的分析法包括但不限于T细胞细
胞毒性分析法(CTL/铬释放分析法)、T细胞增殖分析、细胞内细胞因子染色、ELISA、ELISpot等。其他获得序列的方法可以采用肽的变体和编码其DNA序列。例如，可以用诱变剂(诸如羟
胺)处理编码所需肽序列的重组载体，以获得序列变体。
[0150] 编码本文所述多肽的多核苷酸区段或片段可以容易地通过例如通过化学方法直接合成片段来制备。这些片段可以通过应用核酸复制技术获得，诸如PCR，通过将选择的序
列引入重组载体中用于重组生产。
[0151] 可以利用多种载体/宿主系统来包含和产生多核苷酸序列。示例性的系统包括微生物，诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌；用酵母载体转化的酵母；用病毒载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV烟草花
叶病毒TMV)或细菌载体(例如钛或pBR322质粒)；或动物细胞系统。
[0152] 在Ad载体中存在的控制元件或调控序列可包括载体增强子、启动子以及5'和3'非翻译区域的那些非翻译区域。此类元件在强度和特异性方面可能有所不同。根据所采用的
载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件(其包括组成型和诱导型启
动子)。例如，可以将编码目的多肽的序列连接到由晚期启动子和三方前导序列组成的Ad转
录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必需E1或E3区域可用于获得能够在被感染的宿主
细胞中表达多肽的活病毒。另外，转录增强子(诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子)可用于增加
在哺乳动物宿主细胞中的表达。
[0153] 特定的起始信号也可用于实现编码目的多肽的序列(例如，ATG起始密码子和相邻序列)的更有效翻译。外源翻译元件和起始密码子可能有多种来源(天然和合成的)。通过包
含适用于所使用的特定细胞系统的增强子可以提高表达的效率。也可以掺入用于转录或翻
译的特定终止序列，以实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
[0154] 可以使用多种用于检测和测量多核苷酸编码产物(例如靶抗原)表达的方案(例如，使用对该产物特异的多克隆或单克隆抗体)。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射
免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。对于某些应用而言，利用对给定多肽上的两个
非干扰性表位具有反应性的单克隆抗体的基于双位点、基于单克隆的免疫测定法可能是优
选的，但也可以采用竞争性结合测定。
[0155] Ad载体可包含能被检测或选择的产物，诸如报告基因，该报告基因的产物可被检测，诸如通过荧光、显色或荧光底物上的酶活性等，或通过生长条件选择。示例性的报告基
因包括绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、新霉素磷酸转移酶、分泌性碱性磷酸酶(SEAP)和人生长激素(HGH)。示例性的选择标志物包括耐药
性，诸如新霉素(G418)、潮霉素等。
[0156] Ad载体也能够包含启动子或表达控制序列。启动子的选择将部分取决于靶细胞类型和所需控制的程度或类型。合适的启动子包括但不限于组成型、诱导型、组织特异性、细
胞类型特异性、时间特异性或事件特异性。组成型或非特异性启动子的实例包括SV40早期
启动子、SV40晚期启动子、CMV早期基因启动子、牛乳头瘤病毒启动子和腺病毒启动子。除病毒启动子外，细胞启动子在一些实施例中也是合适的和有用的。尤其是，所谓管家基因的细
胞启动子是有用的(例如，β-肌动蛋白)。病毒启动子通常是比细胞启动子更强的启动子。也可以使用诱导型启动子。这些启动子包括地塞米松可诱导的MMTV LTR、重金属可诱导的金
属硫蛋白、以及cAMP可诱导的具有cAMP应答元件的启动子、热休克启动子。通过使用诱导型
启动子，可以将核酸递送至细胞并将保持静止直至添加诱导剂。这允许进一步控制目的蛋
白质的产生时间。可以使用事件类型特异性启动子(例如，HIV LTR)，该启动子仅在事件发
生时才有活性或上调，例如(诸如致瘤性或病毒感染)。除非存在tat基因产物，否则HIV LTR
启动子是非活性的，tat基因产物是在病毒感染后发生的。一些事件类型的启动子也是组织
特异性的。优选的事件类型特异性启动子包括在病毒感染后激活的启动子。
[0157] 启动子的实例包括α-甲胎蛋白、α-肌动蛋白、myo D、癌胚抗原、VEGF-受体的启动子；FGF受体；TEK或tie 2；tie；尿激酶受体；E-和P-选择素；VCAM-1；内皮糖蛋白；内皮唾液酸蛋白；αV-β3整联蛋白；内皮素-1；ICAM-3；E9抗原；von Willebrand因子；CD44；CD40；血管内皮钙粘蛋白；notch 4，高分子量黑素瘤相关抗原；前列腺特异抗原-1、probasin、FGF受体、VEGF受体、erb B2；erb B3；erb B4；MUC-1；HSP-27；int-1；int-2、CEA、HBEGF受体；EGF受体；酪氨酸酶、MAGE、IL-2受体；前列腺酸性磷酸酶、前列腺素、前列腺特异性膜抗原、α-晶体蛋白、PDGF受体、整联蛋白受体、α-肌动蛋白、SM1和SM2肌球蛋白重链、钙蛋白-h1、SM22α-血管紧张素受体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和CD4。
[0158] 可以插入阻遏物序列、负调节子或组织特异性沉默子以减少多核苷酸的非特异性表达。多个阻遏元件可以插入启动子区域。转录的抑制与阻遏元件的方向或与启动子的距
离无关。阻遏序列的一种类型是绝缘子序列。此类序列抑制转录并且可以使背景转录沉默。
负调控元件可以位于许多不同基因的启动子区域。在没有诸如类固醇的因素的情况下，阻
遏元件可以用作转录的阻遏物，卵清蛋白基因启动子区域的NSE也是如此。这些负调控元素
可以结合输卵管的特定蛋白质复合物，而这些复合物都不对类固醇敏感。卵清蛋白基因的
启动子中有三个不同的元件。在一些实施例中，对应于这些元件的部分的寡核苷酸可以抑
制TK报道基因的病毒转录。例如，此类沉默子元件之一是TCTCTCCNA(SEQ ID NO:11)，该
TCTCTCCNA与存在于其他基因中的沉默子具有序列同一性。
[0159] 可将增加所需靶抗原表达的元件掺入本文所述的Ad载体的核酸序列中。示例性元件包括内部核糖体结合位点(IRES)。IRES可以提高翻译效率。同样，其他序列可以增强表
达。对于一些基因，尤其是5'端的序列可能会抑制转录和/或翻译。这些序列通常是可以形
成发夹结构的回文。在一些情况下，待递送的核酸中的此类序列被缺失。可以测定转录产物
或翻译产物的表达水平，以确认或确定哪些序列影响表达。转录物水平可以通过任何已知
方法测定，包括Northern印迹杂交、RNase探针保护等。蛋白质水平可以通过任何已知的方
法来测定，包括ELISA。
抗原特异性免疫疗法和疫苗
[0160] 某些实施例利用本文提供的此类载体和其他载体提供针对CEA的单抗原免疫。某些实施例提供了针对CEA的预防性疫苗。此外，在各种实施例中，本文提供的组合物和方法
可导致临床应答，诸如改变的疾病恶化或预期寿命。
[0161] 编码多种抗原的Ad5[E1-]载体可用于将95％的体外暴露的DC有效地转导至高滴度的载体。在某些实施例中，发现DC中外源基因表达水平的增加与载体感染的多重性(MOI)
的增加相关。用Ad5[E1-]载体感染的DC可以编码多种抗原(包括肿瘤抗原MART-1、MAGE-A4、
DF3/MUC1、p53、hugp100黑色素瘤抗原、多瘤病毒中间-T抗原)，在混合淋巴细胞反应中，这些抗原可诱导抗原特异性CTL应答，具有增强的抗原呈递能力和/或具有增强的启动T细胞
增殖的能力。当用表达各自抗原的肿瘤细胞攻击时，预先用编码肿瘤特异性抗原的Ad5载体
转导的树突细胞(DC)对动物进行免疫可用于诱导对动物的显著保护水平。有趣的是，肿瘤
内注射编码IL-7的Ad在诱导抗肿瘤免疫性方面不如用IL-7编码Ad5载体转导的DC有效。在
某些实施例中，设想了Ad5载体对DC的体外转导。体外DC转导策略可用于诱导受体宿主耐
受。例如，Ad5介导的CTLA4Ig向DC的递送可以阻断DC CD80与存在于T细胞上的CD28分子的
相互作用。
[0162] Ad5载体与DC的衣壳相互作用可触发几种有益的应答，这可能增强了DC呈递Ad5载体编码的抗原的倾向。例如，未成熟的DC尽管专门吸收抗原，但却是相对无效的T细胞活化
效应物。DC成熟与DC驱动T细胞免疫的能力增强相一致。在一些情况下，这些组合物和方法
利用了Ad5感染，这导致小鼠未成熟骨髓衍生DC的DC成熟Ad载体感染的直接诱导可以上调
通常与DC成熟相关的细胞表面标志物(MHC I和II、CD40、CD80、CD86和ICAM-1)，以及下调
CD11c，而CD11c是髓样DC成熟时下调的整合素。在一些情况下，Ad载体感染触发DC产生IL-
12，这是DC成熟的标志物。不受理论的约束，这些事件可能是由于Ad5触发的NF-κB途径激活所致。成熟的DC可以通过Ad载体有效地转导，并且不会丧失其以较低的MOI刺激幼稚T细胞
增殖的功能潜力，如成熟的CD83+人DC(来自外周血单核细胞)所证明的。但是，成熟的DC可
能也比未成熟的DC更不易感染。衣壳蛋白的修饰可以用作优化Ad载体对DC感染以及增强功
能成熟的策略，例如使用CD40L受体作为病毒载体受体，而不是使用正常的CAR受体感染机
制。
[0163] 在一些实施例中，包含一个或多个Ad5[E1-,E2b-]载体CEA疫苗的组合物和方法在技术安全的范围内具有增加的总存活率(OS)的作用。在一些实施例中，包含一个或多个Ad5
[E1-,E2b-]载体CEA疫苗的组合物和方法在技术安全的范围内具有增加的总存活率(OS)的
作用。在某些实施例中，包含一个或多个Ad5[E1-,E2b-]载体CEA疫苗的组合物和方法在技
术安全范围内具有增加的总存活率(OS)的作用。
[0164] 在一些实施例中，抗原靶标与良性肿瘤相关。在一些实施例中，靶向的抗原与癌前肿瘤相关。
[0165] 在一些实施例中，靶抗原与癌、原位癌、转移性肿瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肌肉瘤、平滑肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、肝癌、横纹肌肉瘤、浆细胞瘤、腺瘤、胶质瘤、胸腺瘤或骨肉瘤相关。在一些实施例中，靶向的抗原与特定类型的癌症相关，例如神经系统癌症、脑癌、甲状腺癌、头颈癌、黑色素瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、生殖细胞肿瘤、睾丸癌、胃癌或其他癌症，或其任何临床(如TNM病、组织病理学、分期或分级系统或其组合)或分子亚型。在一些实施
例中，靶向的抗原与癌症的特定临床或分子亚型相关。举例来说，乳腺癌可分为至少四种分
子亚型，包括Luminal A、Luminal B、三阴性/基础样和HER2型。举例来说，可以将前列腺癌细分为TNM、格里森评分或PSA蛋白的分子表达。
[0166] 如上文所述，腺病毒载体包含编码一种或多种目的靶蛋白或抗原的核酸序列。在这方面，载体能够包含编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的核酸或更多不同的目标靶抗原。靶抗原可以是全长蛋白质或可以是其片段(例如表位)。腺病
毒载体可以含有编码来自一种目的靶蛋白的多个片段或表位的核酸序列，或者可以含有来
自多种目的靶蛋白的一个或多个片段或表位。靶抗原能够包含期望针对其产生免疫应答的
任何物质，但是一般而言，靶抗原为蛋白质。靶抗原可包含全长蛋白、蛋白的亚基、蛋白的同工型或其诱导免疫应答的片段(即，免疫原性片段)。可以修饰靶抗原或其片段，例如以降低
靶抗原的一种或多种生物学活性或增强其免疫原性。靶抗原或靶蛋白可以是CEA。
[0167] 在某些实施例中，免疫原性片段结合至MHC I类或II类分子。如果可以使用本领域已知的任何测定法检测到此类结合，则免疫原性片段可以“结合”I类或II类MHC分子。例如，可通过监测促进将125I标记的β-2-微球蛋白(β-2m)掺入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物中的能力来间接评估多肽与I类MHC结合的能力。或者，可以采用本领域已知的功能性肽竞
争测定法。多肽的免疫原性片段通常可以使用众所周知的技术来鉴定。鉴定免疫原性片段
的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。特定靶
多肽的免疫原性片段为这样的片段：该片段为与此类抗血清和/或T细胞在以下水平进行反
应，该水平大体上不小于全长靶多肽的反应性(例如，在ELISA和/或T细胞反应性测定中)。
换言之，免疫原性片段可以在此类测定法中以类似于或大于全长多肽的反应性的水平进行
反应。可以使用本领域已知的方法来执行此类筛选。
[0168] 在一些实施例中，病毒载体包含编码可调节免疫应答的一种或多种蛋白质、其变体、其融合体或其片段的异源核酸序列。在一些实施例中，病毒载体编码一种或多种针对特
定抗原(诸如炭疽保护性抗原)的抗体，从而允许被动免疫疗法。在一些实施例中，病毒载体
包含编码具有治疗作用(例如，抗病毒、抗细菌、抗寄生虫或抗肿瘤功能)的一种或多种蛋白
质的异源核酸序列。在一些实施例中，第二代E2b缺失的腺病毒载体包含异源核酸序列。在
一些实施例中，异源核酸序列是CEA、变体、部分或其任何组合。
[0169] 靶抗原包括但不限于衍生自多种肿瘤蛋白的抗原。在一些实施例中，肿瘤蛋白的部分或变体被用作靶抗原。在一些实施例中，用作靶抗原的肿瘤蛋白的部分或变体具有修
饰的，例如增强的针对肿瘤蛋白或含有该蛋白的细胞的作用和免疫应答的能力。疫苗可以
针对抗原进行疫苗接种。疫苗也可以靶向表位。抗原可以是肿瘤细胞抗原。表位可以是肿瘤
细胞表位。此类肿瘤细胞表位可以衍生自多种肿瘤抗原，诸如来自突变产生的肿瘤的抗原、
共有的肿瘤特异性抗原、分化抗原和在肿瘤中过表达的抗原。肿瘤相关抗原(TAA)可以是宿
主通常不表达的抗原；它们可以是宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或以其他方
式异常表现；它们可以与正常表达但异常高水平表达的分子相同；或者它们可以在异常的
场景或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经
节苷脂、半抗原、核酸、其他生物分子或其任何组合。
[0170] 例示性的有用肿瘤蛋白包括但不限于以下中的一种或多种：CEA、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生
长因子受体4(HER4)、MUC1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
[0171] 在一些实施例中，病毒载体包含编码修饰的多肽的靶抗原序列，该多肽选自CEA、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3
(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、MUC1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA(即PSM)、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-
10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1，其中多肽或其片段与相应的天然序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、
99％、99.5％或99.9％的同一性。
[0172] 其他有用的例示性有用肿瘤蛋白包括但不限于α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-
3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARalpha融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1-或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A9、MAGE-C2、mucink、NA-
88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-
1b、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、
RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、亲脂素(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶和/或VEGF。
[0173] 肿瘤相关抗原可以是来自与人类恶性肿瘤相关的传染原的抗原。与人类恶性肿瘤相关的传染原的实例包括Epstein-Barr病毒、幽门螺杆菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、
人类疱疹病毒-8、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、人类T细胞白血病病毒、肝吸虫和血吸虫病。
CEA抗原靶标
[0174] CEA表示有吸引力的免疫疗法靶抗原,因为它几乎在-所有的结肠直肠癌和胰腺癌中过表达,也被一些肺癌和乳腺癌、甲状腺髓样癌等常见肿瘤所表达,但并没有在身体的其
他细胞中表达，除了胃肠道上皮细胞中低表达。CEA包含可能被T细胞以MHC限制方式识别的
表位。
[0175] 研究发现，尽管出现早先存在或诱导的Ad5-中和抗体，用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)(其编码肿瘤抗原CEA)进行多次同源免疫在小鼠中诱导具有抗肿瘤活性的CEA特异性细胞
介导的免疫(CMI)应答。在目前的I/II期研究中，用逐步增加Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)的剂
量对晚期结直肠癌患者进行免疫。尽管大多数(61.3％)患者存在预先存在的Ad5免疫，但仍
观察到CEA特异性CMI应答。重要的是，它的毒性很小，而且不管先前存在的Ad5中和抗体滴
度如何，患者的总体存活率(12个月时为48％)是相似的。结果表明，在癌症患者中，新型Ad5[E1-,E2b-]基因递送平台在自然获得和免疫诱导的Ad5特异性免疫的情况下，对肿瘤抗原
CEA产生显著的CMI应答。
[0176] 例如，每106个人外周血单核细胞(PBMC)中，CEA抗原特异性CMI可以有大于10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000或更多IFN-γ点形成细胞(SFC)。在一些实施例中,用先前存在的人体Ad5中和抗体滴度大于50、100、150、200、
300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、
6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000或更高在人类受试者中产生免疫应答。免疫应答可包括如本文所述的细胞介导免疫和/或体液免疫。免疫应答可通过一个或多个细胞内细
胞因子染色(ICS)ELISpot、增殖测定、细胞毒性T细胞测定(其包括铬释放或等价测定)，和
使用任意数量的聚合酶链反应(PCR)或基于RT-PCR的测定进行的基因表达分析(如本文所
描述的并且其程度上使本领域技术人员可得)，以及本领域已知的用于测量免疫应答的任
何其他合适的测定进行测量。
[0177] 在一些实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括编码与野生型多肽亚基的亚基至少具有75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的修饰序列。
[0178] 该免疫原性多肽可能是突变的CEA或其片段。在一些实施例中，免疫原性多肽包括突变的CEA，其在位置610具有Asn->Asp替换。在某些实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括编
码与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的序列。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100
的序列。
[0179] 在一些实施例中,免疫原性多肽的序列编码包含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100至少70％75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％同一性的序列或通过替换密码子从SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100产生的序列。在一些实施例中，与野生型相
比人类CEA序列相比，腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多的点突变,诸如单一的氨基酸取代或缺失。
[0180] 在一些实施例中，腺病毒免疫原性多肽包括来自SEQ ID NO:2的序列或者修饰版本，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100的高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变,例如单个氨基酸的取代或缺失。
[0181] CEA基因家族成员根据序列相似性、发育表达模式及其生物学功能可分为三个亚组：CEA相关细胞粘附分子(CEACAM)亚组(包含12个基因(CEACAM1、CEACAM3-CEACAM8、
CEACAM16和CEACAM18-CEACAM21))，妊娠特异性糖蛋白(PSG)亚组(包含11个密切相关基因
(PSG1-PSG11))和11个假基因(CEACAMP1-CEACAMP11)的亚组。CEACAM亚组的多数成员有类
似的结构，其由以下组成：细胞外类Ig结构域(其包含单个氨基端V-set结构域，与免疫球蛋
白可变结构域具有结构同源性)，接着是不同数量的A或B亚型的C2-set结构域)、跨膜域和
胞质结构域。CEACAM亚组有两名成员(CEACAM16和CEACAM20)，它们在组织结构上有一些例
外。CEACAM16在其N和C末端包含两个类Ig V型结构域，并且CEACAM20包含截短的类Ig V型1
结构域。CEACAM分子可以通过其跨膜结构域(从CEACAM5到CEACAM8)或直接与糖磷脂酰肌醇
(GPI)脂质部分(CEACAM5、从CEACAM18到CEACAM21)连接固定于细胞表面。
[0182] CEA家族成员在不同的细胞类型中进行表达，具有广泛的生物学功能。CEACAM在大多数上皮细胞上显著存在，并存在于不同的白细胞上。在人类中，CEACAM1是CEA家族的祖先
成员，表达于上皮细胞和内皮细胞的顶面、以及淋巴细胞和髓细胞上。CEACAM1通过嗜血(从
CEACAM1到CEACAM1)和异质(例如，CEACAM1到CEACAM5)的相互作用调节细胞与细胞的粘附。
此外，CEACAM1还参与许多其他生物学过程，例如血管生成、细胞迁移和免疫功能。CEACAM3
和CEACAM4的表达在很大程度上局限于粒细胞，它们能够传递几种致病菌的摄取和破坏，包
括奈瑟氏菌、莫拉氏菌和嗜血杆菌物种。
[0183] 因此，在各种实施例中，组合物和方法涉及提高对抗CEA的免疫应答，所述CEA选自由CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9和PSG11组成的组。使用该方法和组合物可对抗细胞(诸如癌细胞)表达或过表达一个或多个
CEA而引起免疫应答。在一些实施例中，与非癌细胞相比，一个或多个CEA在这些癌细胞中的
过表达超过5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多。
[0184] 在某些实施例中，这里使用的CEA抗原是野生型CEA抗原或修饰的CEA抗原，其在CEA的CAP1表位YLSGANLNL(SEQ ID NO:3)中至少有一个突变。突变可以是保守的或非保守
的、取代、添加或缺失。在某些实施例中，此处使用的CEA抗原具有YLSGADLNL(SEQ ID NO:4)中规定的氨基酸序列，即突变的CAP1表位。在进一步的实施例中，第一复制缺陷载体或者表
达CEA的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:2(表达修饰的CEA抗原的腺病毒载体的预测序列)
的任何一部分(诸如例如SEQ ID NO:2的从位置1057至3165)或全长SEQ ID NO:2至少50％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％同一性的核苷酸序列。
粘蛋白家族抗原靶标
[0185] 人体粘蛋白家族(MUC1至MUC21)包括分泌的粘蛋白和跨膜粘蛋白，该分泌的粘蛋白和跨膜粘蛋白在人体上皮表面形成保护性的粘液屏障中发挥作用。这些蛋白的作用是保
护呼吸道、胃肠道和重要器官(如乳腺、肝脏、胃、胰腺和肾脏)内的上皮细胞
[0186] MUC1(CD227)是在大多数人类癌症和一些血液恶性肿瘤中过表达的TAA。MUC1(GenBank:X80761.1、NCBI:NM_001204285.1)和激活许多重要的细胞途径已涉及人类疾病。
MUC1是由两个亚基组成的异二聚体蛋白，通常在几种人类癌症中过表达。MUC1通过自身蛋
白水解产生两个亚基MUC1n和MUC1c，进而形成稳定的非共价异二聚体。
[0187] MUC1 C末端亚基(MUC1c)可包括58个氨基酸胞外结构域(ED)、28个氨基酸跨膜结构域(TM)和72个氨基酸胞质结构域(CD)。MUC1c还能够包含“CQC”基序，其能够实现MUC1的
二聚作用，它也能够对细胞赋予致癌作用。在某些情况下，MUC1能够经由MUC1c诱导细胞信
号传导部分致癌作用。MUC1c可与EGFR、ErbB2等受体酪氨酸激酶进行相互作用，并且有助于
激活PI3K→AKT和MEK→ERK的细胞途径。在细胞核内，MUC1c激活Wnt/β-连环蛋白，STAT和
NF-κB RelA细胞途径。在某些情况下，MUC1能够经由MUC1n通过诱导传导细胞信号，进而发
挥致癌功能。MUC1 N末端亚基(MUC1n)能够包含可变数量的20个可糖基化氨基酸串联重复
序列。MUC1通常在腺上皮细胞表面上进行表达，并且在癌症中过表达且糖基化异常。MUC1是
能够用作肿瘤免疫疗法靶向的TAA。几项临床试验已经并且正在进行，以评估MUC1在免疫疗
法疫苗中的使用。重要的是，这些试验表明MUC1靶向免疫疗法是安全的，并且可能提供存活
的益处。
[0188] 然而，临床试验也表明MUC1是相对较差的免疫原。为了克服这一点，本发明提供了在MUC1癌蛋白(MUC1-C或MUC1c)C末端区域中的T淋巴细胞免疫增强肽序列。与原生肽序列
相比，修饰的MUC1-C中的激动剂：(a)在较低的肽浓度下结合HLA-A2；(b)对HLA-A2表现出较
高的亲和力；(c)当与抗原呈递细胞一起使用时，比使用天然肽诱导T细胞产生更多的IFN-
γ；和(d)能够从癌症患者更有效地产生MUC1特异性人类T细胞系。重要的是，使用激动剂表
位生成的T细胞系比使用天然表位生成的T细胞系在裂解使用天然表位的靶细胞和裂解表
达MUC1的HLA-A2人肿瘤细胞方面更有效。此外，本发明还提供了MUC1-C的额外CD8+细胞毒
性T淋巴细胞免疫增强剂激动剂序列表位。
[0189] 某些实施例提供了有效的修饰MUC1-C，用于增强免疫能力(mMUC1-C或MUC1-C或MUC1c)。某些实施例提供了针对免疫增强剂功能有效修饰的MUC1-C，用于将其免疫疗法融
入到重组Ad5[E1-,E2b-]平台中，以产生新型且更有效的疫苗。例如，免疫疗法疫苗可以是
Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C，用于治疗表达MUC1的癌症或感染性疾病。
[0190] 翻译后修饰在控制人体和人类疾病中的蛋白质功能中发挥着重要作用。例如，除了上文讨论的蛋白水解裂解外，MUC1还可以有一些译后修饰，诸如糖基化、唾液酸化、棕榈
酰化，或其在特定氨基酸残基上的组合。本文提供了MUC1的靶向糖基化、唾液酸化、磷酸化
或棕榈酰化修饰的免疫疗法。
[0191] MUC1能够被高度糖基化(在每个串联重复序列中在丝氨酸和苏氨酸残基上不同程度的N-和O-链碳水化合物和唾液酸，从单链糖基化到戊糖基化)。在乳腺癌中的具有3,4-连
接的GlcNAc的不同的O-糖基化。N-糖基化包括高甘露糖、分泌型MUC1/SEC的酸性复合型和
混合型糖基，以及跨膜型MUC1/TM.4的中性复合型。某些实施例提供了靶向不同的O-糖基化
形式的MUC1的免疫疗法。
[0192] 此外，可以对MUC1进行唾液酸化。从肾脏和乳腺癌细胞中分离出的膜糖蛋白优先唾液酸化核心1结构，而从相同组织中分泌的糖蛋白主要表现为核心2结构。在这两个组织
中，O-糖基化的含量与末端的半乳糖、2-和3-连接的半乳糖、3-和3,6-连接的GalNAc-ol和
4-连接的GlcNAc重叠。某些实施例提供了靶向MUC1的各种唾液酸化形式的免疫疗法。CQC基
序中半胱氨酸残基上的双棕榈酰化是从核内体回收到质膜需要的。某些实施例提供了靶向
MUC1的各种棕榈酰化形式的免疫疗法。
[0193] 磷酸化可以影响MUC1诱导特定细胞信号应答的能力，这对人类健康很重要。某些实施例提供了靶向MUC1的各种磷酸化形式的免疫疗法。例如，MUC1可以在C末端结构域中的
酪氨酸和丝氨酸残基上磷酸化。C末端结构域中酪氨酸的磷酸化可以增加MUC1和β-连环蛋
白的核定位。PKCδ磷酸化可以诱导MUC1与β-连环蛋白/CTNNB1结合并减少β-连环蛋白/E-钙粘蛋白复合物的形成。Src介导的MUC1磷酸化可抑制与GSK3B的相互作用。Tyr-1229上MUC1
的Src和EGFR介导的磷酸化可以增加与β-连环蛋白/CTNNB1的结合。GSK3B介导的MUC1在
Ser-1227上的磷酸化可以减少这种相互作用，但可以恢复β-钙粘蛋白/E-钙粘蛋白复合物
的形成。MUC1的PDGFR介导的磷酸化可以增加MUC1CT和CTNNB1的核共定位。某些实施例提供
靶向已知调节其细胞信号传导能力的MUC1、MUC1c和MUC1n的不同磷酸化形式的免疫疗法
法。
[0194] 本发明提供了调节MUC1c细胞质结构域及其在细胞中的功能的免疫疗法。本发明提供了包括调节MUC1c中的CQC基序的免疫疗法。本发明提供包括调节MUC1c的胞外结构域
(ED)、跨膜结构域(TM)、胞质结构域(CD)或其组合的免疫疗法。本发明提供了包括调节
MUC1c诱导通过EGFR、ErbB2或其他受体酪氨酸激酶的细胞信号传导的能力的免疫疗法。本
公开提供了包括调节MUC1c诱导PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-连环蛋白、STAT、NF-κB RelA细胞途径或其组合的能力的免疫疗法。在一些实施例中，MUC1c免疫疗法可进一步包括CEA。
[0195] 本发明还提供了调节MUC1n及其细胞功能的免疫疗法。本发明还提供了包括MUC1n串联重复序列、MUC1n串联重复序列上的糖基化位点或其组合的免疫疗法。在一些实施例
中，MUC1n免疫疗法进一步包括CEA。
[0196] 本发明还提供包含MUC1n、MUC1c、CEA或其组合的疫苗。本发明提供包括MUC1c和CEA的疫苗。本发明还提供靶向MUC1n和CEA的疫苗。在某些实施例中，抗原组合包含在本发
明提供的一个载体中。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的分开的载体中。
[0197] 一些实施例涉及血清型5的复制缺陷腺病毒载体，该载体包含编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可以是MUC1的同工型或其亚基或片段。在某些实施例中，复制缺陷腺
病毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、
99.5％或99.9％同一性的序列。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID 
NO:102的序列。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:5的序列。在某
些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括下列序列，这些序列由SEQ ID NO:6表示。在某
些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括下列序列，这些序列由SEQ ID NO:9表示。在一
些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:102的序列。在一些实施例中，免疫
原性多肽的序列编码包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:102至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％同一性的序列或由SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102通过替
代密码子替换产生的序列。在一些实施例中，与野生型人类MUC1序列相比，本文所述的腺病
毒载体编码的免疫原性多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、25、30、35、40或更多点突变，诸如单个氨基酸取代或缺失。
[0198] 在某些实施例中，此处使用的MUC1抗原为野生型MUC1抗原或修饰的MUC1抗原。在某些实施例中，修饰的MUC1抗原与SEQ ID NO:7(突变的MUC1蛋白序列)或SEQ ID NO:101
(修饰的MUC1核苷酸序列)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
98％、99％、99.5％、99.9％、100％同一性。在某些实施例中，MUC-1抗原是在SEQ ID NO:7的位置93、141-142、149-151、392、404、406、422、430-431、444-445或460处具有一个或多个突变的经修饰的抗原。突变可以是保守的或非保守的、取代、添加或缺失的。进一步的实施例
中，MUC-1抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合相结合。在某些实施例中，第三复制缺陷载体或表达MUC1的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:5(MUC_1野生型核苷酸序列)至少50％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。在进一步的实施例中，第三复制缺陷载体或表达MUC1的复制缺陷载体具有
与SEQ ID NO:6(突变的MUC1核苷酸序列)至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。在进一步的实施例中，第三复制缺陷载体或表达MUC1的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:101(修饰的MUC1核苷
酸序列，在本文中也称为MUC1-c)至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，第三复制缺陷载体或表达MUC1的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:8(表达修饰MUC-1抗原的腺病毒载体的
预测序列)的任何一部分(诸如SEQ ID NO:8的位置1033至2858)或者全长至少50％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。
[0199] 在一些实施例中，本文公开的MUC1抗原可以是MUC1-C抗原。在一些实施例中，MUC1-C抗原能够具有与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，编码本文公开的MUC1-C抗
原的核酸序列能够具有与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:101或者SEQ ID NO:8的
位置1105到2532位至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少
97％或至少99％序列同一性。在一些实施例中，MUC-1C抗原是修饰的MUC1抗原。修饰的MUC1
抗原能够具有与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少
95％、至少97％或至少99％的序列同一性。修饰MUC1抗原能够通过核酸序列进一步编码，所
述核酸序列具有与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8位置1105至2532或SEQ ID NO:
101至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。能够通过在SEQ ID NO:7的位置93、141-142、149-151、392、404、406、422、430-
431、444-445或460中的任何地方具有突变的方式来修饰MUC-1抗原。
[0200] 在一些实施例中，编码本公开内容的MUC-1抗原的重组腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])能够具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8位置1105至2532至少80％、至少85％、
至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％，或至少99％的序列同一性。
Brachyury抗原靶标
[0201] 某些实施例提供包含一种或多种Brachyury细胞抗原的免疫疗法。Brachyury(在人类中也被称为“T”蛋白)是T-box转录因子家族中的一员，在早期发育过程中起着关键作
用，主要是在正常中胚层的形成和分化过程中，其特征是被命名为T结构域的高度保守的
DNA结合结构域。上皮细胞向间质转化(EMT)是原发肿瘤向转移状态发展的关键步骤，在此
过程中Brachyury起着至关重要的作用。Brachyury在人癌细胞中的表达可引起EMT的改变，
包括间质标志物上调、上皮标志物下调、细胞迁移和侵袭增加。与此相反，抑制Brachyury生长则会导致间质标志物的下调，细胞迁移和侵袭能力的丧失，从而降低了人类肿瘤细胞形
成转移的能力。Brachyury可介导上皮-间质转化，促进细胞侵袭。
[0202] 本公开还提供了调节Brachyury效应对细胞增殖疾病(如癌症)中上皮-间质转化功能的免疫疗法。本公开还提供了调节Brachyury促进细胞增殖疾病(诸如癌症)侵袭能力
的免疫疗法。本公开还提供了调节Brachyury T-box结构域DNA结合功能的免疫疗法。在一
些实施例中，Brachyury免疫疗法可进一步包含CEA或MUC1、MUC1c或MUC1n的一个或多个抗
原。
[0203] Brachyury表达在大多数正常人体组织中几乎检测不到，在人类肿瘤中高度受限，常常过表达，使其成为免疫疗法的一个有吸引力的靶抗原。在人类中，Brachyury由T基因
(GenBank:AJ001699.1,NCBI:NM_003181.3)进行编码。在人类身上发现了通过选择性剪接
产生的至少两种不同的同工型。每种同工型都有许多自然变体。
[0204] Brachyury具有免疫原性，Brachyury特异性的CD8+T细胞可裂解表达Brachyury淋巴细胞的肿瘤细胞。Brachyury的这些特征使其成为一种有吸引力的免疫疗法TAA。
Brachyury蛋白是一种T-box转录因子。它可以结合到特定的DNA元件，该DNA元件为通过其N
端的区域的近回文序列“TCACACCT”，将其称为T-box，以激活与该位点结合的基因转录。
[0205] 本发明还提供了包括一种疫苗，该疫苗包含Brachyury、CEA或其组合。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的一个载体中。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明
提供的分开的载体中。
[0206] 在具体实施例中，还提供了一种血清型5的复制缺陷腺病毒载体，该载体包含编码免疫原性多肽的序列。该免疫原性多肽可以是Brachyury的同工型或亚基或片段。在某些实
施例中，复制缺陷腺病毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少70％、75％、80％、85％、
90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％同一性的序列。在某些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括下列序列，这些序列由SEQ ID NO:101表示。在某些实施例中，编码免疫原性
多肽的序列包括下列序列，这些序列由SEQ ID NO:7表示。在某些实施例中，复制缺陷腺病
毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、
99.5％、或99.9％同一性的序列。在某些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括下列序
列，这些序列由SEQ ID NO:102表示。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ 
ID NO:8的序列。在某些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包含与SEQ ID NO:7、SEQ ID 
NO:101、SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或
99.9％同一性的序列或由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:8通过替代密码子替
换产生的序列。在一些实施例中，与野生型人类Brachyury序列相比，本文所述的腺病毒载
体编码的免疫原性多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、25、30、35、40或更多点突变，诸如单个氨基酸取代或缺失。
[0207] 在某些实施例中，此处使用的Brachyury抗原为野生型Brachyury抗原或修饰的Brachyury抗原。在某些实施例中，Brachyury抗原与HLA-A2结合。在进一步的实施例中，
Brachyury抗原是包含WLLPGTSTV(SEQ ID NO:15)中所述的氨基酸序列(Brachyury抗原的
HLA-A2表位)的Brachyury抗原。在进一步的实施例中，Brachyury抗原是修饰的Brachyury
抗原，其氨基酸序列具有与SEQ ID NO:14(修饰的Brachyury蛋白序列)具有至少50％、至少
60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者100％的同一性。在某些实施例中，复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的位置1033至2283至少80％同一性的核苷酸序列。在进
一步的实施例中，第二复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:13(腺病毒载体的预测序列表达修
饰Brachyury抗原)的任意一部分(例如SEQ ID NO:13的位置1033至2283)或全长至少50％、
至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，Brachyury抗原是修饰的Brachyury抗原，该修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:12(另
一种突变的Brachyury蛋白序列)至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，第二复
制缺陷载体或表达Brachyury的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:9(野生型Brachyury)的位
置520至1824、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102至少50％、至少60％、至少
65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，第二复制缺陷载
体或表达Brachyury的复制缺陷载体具有与SEQ ID NO:102至少50％、至少60％、至少65％、
至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少
99.5％、至少99.9％或100％同一性的核苷酸序列。
[0208] 在一些实施例中，本公开的Brahcyury抗原可与SEQ ID NO：12或SEQ ID No：14具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。本公开的Brachyury抗原能够具有与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:
13的位置1045至2277或SEQ ID NO:102至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少
92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，Brachyury抗原可以是修饰的Brachyury抗原。修饰的Brachyury抗原能够具有与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:13
的位置1045至2277或SEQ ID NO:102至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，编码用于本文披露的
Brachyury抗原的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])能够具有与SEQ ID NO:13或SEQ ID 
NO:13的位置1045至2277至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％，或至少99％的序列同一性。
与传染病相关的抗原靶标
[0209] 靶抗原包括但不限于源自各种病原体(如寄生虫、细菌、病毒、朊病毒等)的抗原。病原体可以指任何能够感染宿主的生物。病原体包括例如细菌、任何种类的病毒，例如单链
核糖核酸病毒、单链脱氧核糖核酸病毒、真菌、寄生虫以及原生生物。
[0210] 可与组合物和方法一起使用的传染性疾病相关靶抗原的实例可从以下来源获得：放线杆菌属、放线菌属、腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、6型以及7型)、腺病毒(40型和41型)、气球菌属、嗜水气单胞菌、十二指肠钩虫、广州管圆线虫、蛔虫、蛔虫属、曲霉属、巴贝斯虫属、微小芽孢杆菌、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、拟杆菌属、结肠小袋纤毛虫、杆状巴尔通体、皮炎芽生菌、蓝舌病病毒、支气管败血病博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、莱姆病螺旋体，伯氏莱姆病螺旋体，加里尼莱姆病螺旋体、卡他布兰汉氏菌、布鲁氏菌属(流产布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪布鲁氏菌)、布鲁线虫属、伯克霍尔德氏菌、鼻疽杆菌、伯克霍尔德氏菌(假单胞菌属)、加利福尼亚血清群、胎儿弯曲杆菌亚种、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆
菌、胎儿弯曲杆菌空肠亚种、白色念珠菌、嗜囊细胞虫属、基孔肯雅病毒、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、柠檬酸杆菌、华支睾吸虫、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、梭菌属(以上所列物种除外)、粗球类芽生菌、科罗拉多蜱传热病毒、白喉棒状杆菌、贝氏柯克斯
体、柯萨基病毒、克雅氏病剂、库鲁剂、克里米亚-刚果出血热病毒、新生隐球菌、微小隐孢子虫、巨细胞病毒、环孢菌、登革热病毒(1、2、3、4)、类白喉、东方(西方)马脑炎病毒、埃博拉病毒、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、埃可病毒、迟缓爱德华氏菌、溶组织内阿米巴、肠杆菌属、肠道病毒70型、絮状表皮癣菌、埃利希菌属、腺热埃里希体、小孢子菌属、毛癣菌属、EB病毒、大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒素大肠杆菌、肝片吸虫、土拉弗朗西斯菌、梭杆菌属、溶血孪生球菌、兰伯氏贾第虫、瓜纳里托病毒、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌(B组)、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、猴疱疹病毒、荚膜组织胞浆菌、人冠状病毒、HIV、人乳头瘤病毒、人轮状病毒、人类T淋巴病毒、包括H5N1的流感病毒、胡宁病毒/马秋波病毒、克雷伯氏菌属、科萨努尔森林病病毒、乳杆菌属、拉沙病毒、嗜肺军团菌、利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、利什曼原虫属、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特菌、淋巴细胞性脉络丛
脑膜炎病毒、马秋波病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、微球菌属、莫拉氏菌属、分枝杆菌(牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、麻风分枝杆菌除外)、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、人型支原体、口腔分枝杆菌、唾液分枝杆菌、发酵分枝杆菌、福氏纳格里阿米巴原虫、美洲钩虫、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟氏球菌属(淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌除外)、诺卡氏菌属、
诺沃克病毒、鄂木斯克出血热病毒、盘尾丝虫、后睾吸虫属、细小病毒B19、巴氏杆菌属、消化球菌属、消化链球菌属、恶性疟原虫、间日疟原虫、疟原虫属、类志贺邻单胞菌、波瓦桑脑炎病毒、变形杆菌属、假单胞菌属(除鼻疽假单胞菌、伪鼻疽假单胞菌)、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、小蛛立克次氏体、普氏立克次氏体、加拿大立克次氏体、裂谷病毒、罗斯河病毒/奥绒绒病毒、风疹病毒、猪霍乱沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌属(以上所列物种除外)、血吸虫属、瘙痒剂、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申克孢子丝菌、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、金黄色葡萄球菌、念珠状链杆菌、无乳链球菌、粪链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、唾液链球菌、牛带绦虫、猪带绦虫、犬弓形虫、猫弓形虫、锥虫弓形虫、鼠弓形虫、梅毒螺旋体、旋毛虫属、阴道毛滴虫、鞭虫、布氏锥虫、克氏锥虫、解脲脲原体、牛痘病毒、水痘带状疱疹病毒、东方马脑炎病毒(EEEV)、严重急性呼吸系统病毒(SARS)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、水泡性口炎病毒、霍乱弧菌、血清型01、副溶血弧菌、西尼罗病毒、班氏丝虫、黄热病病毒、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌以及鼠疫耶尔森菌。靶抗原可以包括由任何传染性生物产生的蛋白质或其变体或片段。
[0211] 许多病毒与病毒性出血热有关，其包括丝状病毒(如埃博拉、马尔堡以及莱斯顿)、沙粒病毒(如拉沙、胡宁以及马秋波)以及布尼亚病毒。此外，白蛉热病毒(phleboviruses)，包括例如裂谷热病毒，其已被确定为病毒性出血热的病原体。出血热和相关炎症的病原体
也可能包括副粘病毒，特别是呼吸道合胞病毒。此外，引起人类出血热的其他病毒已被鉴定
为属于以下病毒组：披膜病毒(基孔肯雅病毒)、黄病毒(登革热、黄热病、夸赛纳森林病、鄂木斯克出血热)、内罗病毒(克里米亚-刚果出血热)以及汉坦病毒(肾综合征出血热、肾病性
流行病)。此外，将辛诺柏病毒确定为1993年美国西南部汉坦病毒肺综合征爆发的病原体。
[0212] 靶抗原可以包括病毒外壳蛋白，即流感神经氨酸酶和血凝素、HIV gp160或其衍生物、HIV Gag、HIV Nef、HIV Pol、SARS外壳蛋白、疱疹病毒粒子蛋白、WNV蛋白等。靶抗原还可以包括细菌表面蛋白，该细菌表面蛋白包括肺炎球菌PsaA、PspA、LytA、细菌病原体的表面
或毒力相关蛋白，诸如尼氏乳链菌、外膜蛋白或表面蛋白酶。
个性化肿瘤相关抗原
[0213] 在某些实施例中，与本文所述的组合物和方法共同使用的肿瘤相关抗原可以直接从患有增殖性疾病或癌症的个体中鉴定出来。在某些实施例中，癌症可以包括良性肿瘤、转
移性肿瘤、癌或肉瘤等等。在一些实施例中，个性化的肿瘤抗原包含以患者为特征的CEA，并且进一步作为整体、部分或变体用作靶抗原。
[0214] 在这方面，能够使用各种已知技术进行筛选，以从个体中鉴定肿瘤靶抗原。例如，在一个实施例中，对患者进行肿瘤活检术，从肿瘤细胞中分离RNA，并使用基因芯片(例如，
从加利福尼亚州圣克拉拉的Affymetrix公司)进行筛选，并鉴定出肿瘤抗原。一旦鉴定出肿
瘤靶抗原，就可以使用本领域已知的技术对其进行克隆、表达以及纯化。
[0215] 然后，该靶抗原能够连接到一个或多个表位，或者结合或连接到本文所述的盒或病毒载体，并施用于患者，以改变对从肿瘤分离的靶分子的免疫应答。用这种方式，在某些
实施例中，考虑了“个性化”免疫疗法和疫苗。例如，当癌症是基因性的(即遗传性的)时，患者被鉴定具有BRAC1或BRAC2突变，则能够预防性地使用疫苗。当癌症为散发性的时，这种免
疫疗法能够用于减小肿瘤的大小，提高总体存活率，并且减少受试者体内癌症的复发。
用Ad5-CEA疫苗和IL-15超激动剂进行的联合免疫疗法
[0216] 某些实施例提供了用于治疗癌症的联合免疫疗法组合物。在一些方面，本文提供的联合免疫疗法能够包括对抗与癌症的发展相关的抗原(诸如肿瘤相关抗原(TAA))或已知
与特定传染病有关的抗原(诸如传染病相关抗原(IDAA))的多靶向免疫疗法方法。在一些方
面，本文提供的联合免疫疗法和疫苗能够包括对抗与癌症发展相关的抗原的多靶向抗原标
记免疫疗法方法。在各种实施例中，组合物和方法提供了表达CEA或CEA变体的基于病毒的
载体，用于如本文所提供的疾病的免疫。这些载体可以提高对CEA的免疫应答。
联合疗法中基于Ad5的疫苗
[0217] 在一些方面，载体能够包含至少一种抗原，例如CEA。在一些方面，载体能够包含至少两种抗原。在一些方面，载体能够包含至少三种抗原。在一些方面，载体能够包含三种以
上的抗原。在一些方面，疫苗制剂能够包含1:1的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:2的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:3的载体与抗原比例。在一些方面，
疫苗能够包含1:4的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:5的载体与抗原比例。在
一些方面，疫苗能够包含1:6的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:7的载体与抗
原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:8的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:9
的载体与抗原比例。在一些方面，疫苗能够包含1:10的载体与抗原比例。
[0218] 在一些方面，疫苗可以是单抗原疫苗，例如Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗。在一些方面，疫苗能够包含联合疫苗，其中疫苗能够包含至少两种载体，每种载体包含至少一种抗原。在
一些方面，疫苗可以是联合疫苗，其中疫苗能够包含至少三种载体，每种载体包含至少一个
抗原靶位。在一些方面，疫苗能够包含联合疫苗，其中疫苗能够包含三种以上的载体，每种
载体包含至少一种抗原。
[0219] 在一些方面，疫苗可以是联合疫苗，其中疫苗能够包含至少两种载体，其中至少两种载体中的第一载体能够包含至少一种抗原，并且其中至少两种载体中的第二载体能够包
含至少两种抗原。在一些方面，疫苗能够包含联合疫苗，其中疫苗能够包含至少三种载体，
其中至少三种载体中的第一载体能够包含至少一种抗原，并且其中至少三种载体中的第二
载体能够包含至少两种抗原。在一些方面，疫苗可以是联合疫苗，其中疫苗能够包含三种或
更多种载体，其中三种或更多种载体中的第一载体能够包含至少一种抗原，并且其中三种
或更多种载体中的第二载体能够包含至少两种抗原。在一些方面，疫苗可以是联合疫苗，其
中疫苗能够包含三种以上的载体，每种载体包含至少两种抗原。
[0220] 在个体中，当不同抗原的混合物从相同或不同的载体同时施用或表达时，它们彼此之间可能进行竞争。因此，在联合免疫疗法或疫苗中包含不同浓度和比例的表达抗原的
制剂必须针对个体或个体群进行评估和定制，以确保施用后发生有效和持续的免疫应答。
[0221] 包含多种抗原的组合物可以按照不同的比例存在。例如，载体以外的制剂能够具有不同的比例。例如，免疫疗法或疫苗能够具有化学计量比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、
1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、2:1、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、3:1、3:3、3:4、3:5、
3:6、3:7、3:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、4:1、4:3、4:5、4:6、4:7、4:8、5:1、5:3、5:4、
5:6、5:7、5:8、6:1、6:3、6:4、6:5、6:7、6:8、7:1、7:3、7:4、7:5、7:6、7:8、8:1、8:3、8:4、8:5、
8:6、或8:7的两种不同载体。例如，免疫疗法或疫苗能够具有化学计量比为：1:1:1、1:2:1、
1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:6:1、1:7:1、1:8:1、2:1:1、2:3:1、2:4:1、2:5:1、2:6:1、2:7:1、2:8:
1、3:1、3:3:1、3:4:1、3:5:1、3:6:1、3:7:1、3:8:1、3:1:1、3:3:1、3:4:1、3:5:1、3:6:1、3:7:
1、3:8:1、4:1:1、4:3:1、4:4:1、4:5:1、4:6:1、4:7:1、4:8:1、5:1:1、5:3:1、5:4:1、5:5:1、5:
6:1、5:7:1、5:8:1、6:1:1、6:3:1、6:4:1、6:5:1、6:6:1、6:7:1、6:8:1、7:1:1、7:3:1、7:4:1、
7:5:1、7:6:1、7:7:1、7:8:1、8:1:1、8:3:1、8:4:1、8:5:1、8:6:1、8:7:1、8:8:1、1:1:2、1:2:
2、1:3:2、1:4:2、1:5:2、1:6:2、1:7:2、1:8:2、2:1:2、2:3:2、2:4:2、2:5:2、2:6:2、2:7:2、2:
8:2、3:1:2、3:3:2、3:4:2、3:5:2、3:6:2、3:7:2、3:8:2、3:1:2、3:3:2、3:4:2、3:5:2、3:6:2、
3:7:2、3:8:2、4:1:2、4:3:2、4:4:2、4:5:2、4:6:2、4:7:2、4:8:2、5:1:2、5:3:2、5:4:2、5:5:
2、5:6:2、5:7:2、5:8:2、6:1:2、6:3:2、6:4:2、6:5:2、6:6:2、6:7:2、6:8:2、7:1:2、7:3:2、7:
4:2、7:5:2、7:6:2、7:7:2、7:8:2、8:1:2、8:3:2、8:4:2、8:5:2、8:6:2、8:7:2、8:8:2、1:1:3、
1:2:3、1:3:3、1:4:3、1:5:3、1:6:3、1:7:3、1:8:3、2:1:3、2:3:3、2:4:3、2:5:3、2:6:3、2:7:
3、2:8:3、3:1:3、3:3:3、3:4:3、3:5:3、3:6:3、3:7:3、3:8:3、3:1:3、3:3:3、3:4:3、3:5:3、3:
6:3、3:7:3、3:8:3、4:1:3、4:3:3、4:4:3、4:5:3、4:6:3、4:7:3、4:8:3、5:1:3、5:3:3、5:4:3、
5:5:3、5:6:3、5:7:3、5:8:3、6:1:3、6:3:3、6:4:3、6:5:3、6:6:3、6:7:3、6:8:3、7:1:3、7:3:
3、7:4:3、7:5:3、7:6:3、7:7:3、7:8:3、8:1:3、8:3:3、8:4:3、8:5:3、8:6:3、8:7:3、8:8:3、1:
1:4、1:2:4、1:3:4、1:4:4、1:5:4、1:6:4、1:7:4、1:8:4、2:1:4、2:3:4、2:4:4、2:5:4、2:6:4、
2:7:4、2:8:4、3:1:4、3:3:4、3:4:4、3:5:4、3:6:4、3:7:4、3:8:4、3:1:4、3:3:4、3:4:4、3:5:
4、3:6:4、3:7:4、3:8:4、4:1:4、4:3:4、4:4:4、4:5:4、4:6:4、4:7:4、4:8:4、5:1:4、5:3:4、5:
4:4、5:5:4、5:6:4、5:7:4、5:8:4、6:1:4、6:3:4、6:4:4、6:5:4、6:6:4、6:7:4、6:8:4、7:1:4、
7:3:4、7:4:4、7:5:4、7:6:4、7:7:4、7:8:4、8:1:4、8:3:4、8:4:3、8:5:4、8:6:4、8:7:4、8:8:
4、1:1:5、1:2:5、1:3:5、1:4:5、1:5:5、1:6:5、1:7:5、1:8:5、2:1:5、2:3:5、2:4:5、2:5:5、2:
6:5、2:7:5、2:8:5、3:1:5、3:3:5、3:4:5、3:5:5、3:6:5、3:7:5、3:8:5、3:1:5、3:3:5、3:4:5、
3:5:5、3:6:5、3:7:5、3:8:5、4:1:5、4:3:5、4:4:5、4:5:5、4:6:5、4:7:5、4:8:5、5:1:5、5:3:
5、5:4:5、5:5:5、5:6:5、5:7:5、5:8:5、6:1:5、6:3:5、6:4:5、6:5:5、6:6:5、6:7:5、6:8:5、7:
1:5、7:3:5、7:4:5、7:5:5、7:6:5、7:7:5、7:8:5、8:1:5、8:3:5、8:4:5、8:5:5、8:6:5、8:7:5、
8:8:5、1:1:6、1:2:6、1:3:6、1:4:6、1:5:6、1:6:6、1:7:6、1:8:6、2:1:6、2:3:6、2:4:6、2:5:
6、2:6:6、2:7:6、2:8:6、3:1:6、3:3:6、3:4:6、3:5:6、3:6:6、3:7:6、3:8:6、3:1:6、3:3:6、3:
4:6、3:5:6、3:6:6、3:7:6、3:8:6、4:1:6、4:3:6、4:4:6、4:5:6、4:6:6、4:7:6、4:8:6、5:1:6、
5:3:6、5:4:6、5:5:6、5:6:6、5:7:6、5:8:6、6:1:6、6:3:6、6:4:6、6:5:6、6:6:6、6:7:6、6:8:
6、7:1:6、7:3:6、7:4:6、7:5:6、7:6:6、7:7:6、7:8:6、8:1:6、8:3:6、8:4:6、8:5:6、8:6:5、8:
7:6、8:8:6、1:1:7、1:2:7、1:3:7、1:4:7、1:5:7、1:6:7、1:7:7、1:8:7、2:1:7、2:3:7、2:4:7、
2:5:7、2:6:7、2:7:7、2:8:7、3:1:7、3:3:7、3:4:7、3:5:7、3:6:7、3:7:7、3:8:7、3:1:7、3:3:
7、3:4:7、3:5:7、3:6:7、3:7:7、3:8:7、4:1:7、4:3:7、4:4:7、4:5:7、4:6:7、4:7:7、4:8:7、5:
1:7、5:3:7、5:4:7、5:5:7、5:6:7、5:7:7、5:8:7、6:1:7、6:3:7、6:4:7、6:5:7、6:6:7、6:7:7、
6:8:7、7:1:7、7:3:7、7:4:7、7:5:7、7:6:7、7:7:7、7:8:7、8:1:7、8:3:7、8:4:7、8:5:7、8:6:
5、8:7:7、或8:8:7的三种不同载体。
[0222] 某些实施例提供了一种联合免疫疗法，该联合免疫疗法包含针对TAA的多靶向免疫疗法。某些实施例提供了一种联合免疫疗法，该联合免疫疗法包含针对IDAA的多靶向免
疫疗法。
[0223] 某些实施例提供了一种联合免疫疗法或疫苗，该联合免疫疗法或疫苗包括：至少两种、至少三种或三种以上不同的靶抗原，其包含编码修饰的CEA的序列。例如，联合免疫疗法或疫苗能够包含至少两种、至少三种或三种以上不同的靶抗原，这些靶抗原包含编码修
饰的CEA的序列，其中修饰的CEA包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:100具有至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少
99.9％同一性值的序列。在一些实施例中，修饰的CEA包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、至
少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少
99.9％或100％同一性值，并且在位置610具有Asn->Asp取代的序列。在一些实施例中，CEA
包含YLSGANLNL(SEQ ID NO:3)、CEA的CAP1表位或YLSGADLNL(SEQ ID NO:4)、突变的CAP1表
位的序列。表达载体的Ad5-CEA能够具有如SEQ ID NO:2中所述的序列。
用IL-15超激动剂与Ad5疫苗进行的联合疗法
[0224] 本发明提供了用于联合疗法的组合物，该组合物包括Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗和IL-15超激动剂复合物。在某些实施例中，本发明提供了一种治疗受试者体内表达CEA的癌
症的方法，该方法包括：向个体施用包含复制缺陷载体的第一药物组合物，该复制缺陷载体
包含编码CEA抗原或任何合适抗原的核酸序列；和向个体施用IL-15超激动剂。在一些实施
例中，IL-15超激动剂为结合并激活IL-15受体的任何分子或分子复合物。在某些实施例中，
IL-15超激动剂为ALT-803，该ALT-803为IL-15N72D、IL-15RαSu结构域以及IgG1 Fc结构域
的分子复合物。在美国专利申请公开2015/0374790中描述了ALT-803的组合物以及生产和
使用ALT-803的方法，该专利申请以引入的方式并入本文。
[0225] 白介素15(IL-15)是在病毒感染后，分泌出的一种天然存在的炎性细胞因子。分泌的IL-15可通过效应免疫细胞上的同源受体发出信号来实现其功能，因此可导致效应免疫
细胞活性的整体增强。
[0226] 基于IL-15的刺激和维持细胞免疫应答的广泛能力，将其认为是一种具有潜力的免疫疗法药物，这种免疫疗法药物有望治愈某些癌症。然而，IL-15的临床研究的主要局限
性能够包括在标准哺乳动物细胞表达系统的低产量和短血清半衰期。此外，IL-15:IL-15Rα
复合物(其包括由同一细胞共同表达的蛋白质，而不是游离的IL-15细胞因子)能够负责刺
激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
[0227] 为了克服这些缺点，鉴定出一种新型的IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)，其具有增强的结合IL-15Rβγc的能力和增强的生物活性。将小鼠或人类IL-15Rα和Fc融合蛋白
(免疫球蛋白的Fc区)加入等摩尔浓度的IL-15N72D能够进一步提高IL-15的生物活性，使得
IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物显示出支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度
(EC50)，该浓度比游离的IL-15细胞因子低10倍以上。
[0228] 因此，在一些实施例中，本公开提供了具有针对支持IL-15依赖性细胞生长的EC50的IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，所述EC50比游离IL-15细胞因子低2倍以上、低3
倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
[0229] 在一些实施例中，已经利用IL-15N72D、可溶性IL-15Rα和Fc融合蛋白的相互作用来产生生物活性蛋白复合物ALT-803。众所周知，在N末端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶性IL-15Rα片段携带大部分负责高亲和力细胞因子结合的结构元件。可溶性融合蛋白
能够通过将人类IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的1-65个氨基酸)与含有Fc结构域
(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接而产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白具
有经由IgG1结构域二硫键形成二聚体和易于使用标准蛋白A亲和层析方法纯化的优点。在
图1中示出了ALT-803超激动剂的示意图
[0230] ALT-803是一种可溶性复合物，该可溶性复合物由与二聚IL-15Rαsushi结构域/人IgG1 Fcfusion蛋白以高亲和力关联的人IL-15变体的2个蛋白质亚基(两个IL-15N72D)组
成。IL-15变体是一种114氨基酸多肽，其包含成熟的人IL-15细胞因子序列，在螺旋C N72D
的72位具有Asn-Asp取代。人类IL-15R sushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白包括IL-15R亚
基的sushi结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，其与含有Fc区域(232个氨基酸)
的人类IgG1 CH2-CH3区域连接。除了N72D取代，所有的蛋白质序列都是人类的。基于亚基的
氨基酸序列，包含两个IL-15N72D多肽和二硫键连接的同二聚IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白的复
合物的计算分子量为92.4kDa。每个IL-15N720多肽的计算分子量约为12.8kDa，IL-15RαSu/
IgG 1Fc融合蛋白的计算分子量约为33.4kDa。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1Fc蛋白都被糖
基化，通过尺寸排阻色谱法得到表观分子量约为114kDa的ALT-803。为ALT-803测定的等电
点(pI)可以在大约5.6到6.5的范围内。因此，融合蛋白在pH 7时可以带负电荷。计算出ALT-
803在A280时的摩尔消光系数为116,540M，换言之，一个OD280相当于ALT-803溶液的
0.79mg/mL。
[0231] 此外，已经证明，与IL-15Rα的细胞内复合物形成防止在内质网中的IL-15降解，并促进其分泌。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中采用共表达方法，可高水平产生IL-15N72D和IL-
15RαSu/IgG1 Fc蛋白，形成可溶性、稳定的复合物。在用IL-15依赖性细胞系进行体外效价
测定中，CHO产生的ALT-803复合物的生物活性可与体外组装的IL-15N72D:IL-15RαSu/IgG1 
Fc复合物相当。因此，本文提供的方法代表了一种产生活性的、完全表征的cGMP级IL-15:
IL-15Rα复合物的更好方法，该方法优于单独产生的和在某些情况下重折叠的蛋白质的体
外组装目前采用的策略。
[0232] 最近的研究表明，ALT-803(1)促进先天表型的高效效应NK细胞和CD8+T细胞应答者的发育，(2)能够增强NK细胞的功能，(3)能够在减少肿瘤转移和最终存活方面发挥重要
作用，特别是与检查点抑制剂联用时，下面将进一步介绍。
[0233] 在一些实施例中，IL-15超激动剂或IL-15超激动剂复合物ALT-803可以肠胃外、皮下、肌内、静脉输注、植入、腹膜内或膀胱内施用。在一些实施例中，可以单剂量施用0.1μg-5μg IL-15超激动剂。在一些实施例中，0.1μg-0.2μg、0.2μg-0.3μg、0.3μg-0.4μg、0.4μg-0.5μg、0.5μg-0.6μg、0.6μg-0.7μg、0.7μg-0.8μg、0.8μg-0.9μg、0.9μg-1μg、1μg-1.5μg、1.5μg-
2μg、2μg-2.5μg、2.5μg-3μg、3μg-3.5μg、3.5μg-4μg、4μg-4.5μg、或4.5μg-5μg IL-15超激动剂可单剂量施用。在某些实施例中，1μg ALT-803可以单剂量施用。在一些实施例中，ALT-
803可以以约0.1μg/kg至约100mg/kg体重的有效剂量施用，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、
0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800或900μg/kg体重或者1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或者100mg/kg体重。在一些实施例中，IL-15超激动剂可与Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗一起施用。在一些实施例中，IL-15超激动剂可以作为Ad5
[E1-,E2b-]-CEA疫苗的混合物施用。在其他实施例中，IL-15超激动剂可以在Ad5[E1-,
E2b-]-CEA疫苗之前或之后作为单独剂量施用。在其他实施例中，在施用Ad5[E1-,E2b-]-
CEA疫苗的1天内、2天内、3天内、4天内、5天内或6天内施用ALT-803。在一些实施例中，在Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗接种3天后施用ALT-803。在一些实施例中，每天连续或数次给予ALT-
803，例如，每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每次
9小时、每10小时、每11小时或每12小时。ALT-803的日有效剂量包括0.1μg/kg与100μg/kg体重之间，例如0.1、0.3、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、或99μg/kg体重。在一些实施例中，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、或每周七次施用ALT-803。ALT-803的有效每周剂量包括0.0001mg/kg与4mg/
kg体重之间，例如0.001、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、
0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、或4mg/kg体重。ALT-803的剂量可从约0.1μg/kg体重到约5000μg/kg体重；或从约1μg/kg体重到约4000μg/kg体重或从约10μg/kg体重到约3000μg/kg体重。在其他实施例中，ALT-803可以约0.1，0.3、0.5、1、3、5、10、25、
50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、
950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、
1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，ALT-
803可以约0.5μg化合物/kg体重到约20μg化合物/kg体重的剂量施用。在其他实施例中，剂
量可以是大约0.5、1、3、6、10或20mg/kg体重。在一些实施例中，或肠胃外施用的实例中，ALT-803可以以约0.5μg/kg-约15μg/kg(例如，0.5、1、3、5、10或15μg/kg)的剂量施用。
[0234] 在一些实施例中，在21天的时间内给需要接受与Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗和ALT-803联合治疗的受试者施用一剂或多剂Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗和ALT-803。例如，如在图2A
中示出，有此需要的受试者能够在第7天、第14天和第21天施用Ad-CEA疫苗。此外，有此需要的受试者可以在第10天和第17天施用IL-15超激动剂(ALT-803)。在一些实施例中，需要接
受Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗和ALT-803联合治疗的受试者在8周期间接受一次或多次Ad5
[E1-,E2b-]-CEA疫苗和ALT-803联合治疗。在一些实施例中，受试者可在第3周和第6周接种
Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗，并可在第1周、第2周、第4周、第5周、第7周和第8周接种IL-15超激动剂(ALT-803)。因此，在一些实施例中，在完整的给药方案中给予受试者一剂以上的ALT-
803。在一些实施例中，可以给予受试者至少1剂、至少2剂、至少3剂、至少4剂或至少5剂IL-
15超激动剂。在某些实施例中，受试者可以比Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗少施用一剂ALT-803。
[0235] 在一些实施例中，IL-15超激动剂(诸如ALT-803)能够编码为与CEA抗原的免疫融合。例如，在一些实施例中，Ad5[E1-,E2b-]疫苗能够编码CEA和ALT-803(Ad5[E1-,E2b-]-
CEA/ALT-803)。在这些实施例中，当给需要的受试者用药时，编码CEA和ALT-803的Ad5[E1-,
E2b-]载体诱导CEA和ALT-803作为免疫融合物的表达，其具有治疗活性。
[0236] 与编码CEA和ALT-803的Ad5[E1-,E2b-]载体联合治疗可增强免疫应答，因此两种治疗部分的联合作用比单独治疗有协同增强免疫应答的作用。例如，与编码CEA和ALT-803
的Ad5[E1-,E2b-]载体联合治疗可协同增强对抗原特异性效应细胞CD4+和CD8+T细胞的刺
激，刺激NK细胞对被感染细胞的反应，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体
依赖性细胞吞噬(ADCP)机制刺激嗜中性粒细胞或单核细胞应答定向杀伤感染细胞。用编码
CEA和ALT-803的Ad5[E1-,E2b-]载体的联合治疗可以协同促进上述反应中的任何一种，或
上述反应的组合，从而在给予有需要的受试者后极大地改善存活结果。
Ad5-疫苗与进一步免疫疗法的联合治疗
[0237] 在进一步实施例中，本发明提供用于进一步组合疗法的组合物，其包括Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗、IL-15超级激动剂(例如ALT-803)和一种或多种以下制剂：化疗剂、共刺激
分子、检查点抑制剂、针对特定抗原(如CEA)的抗体、工程化NK细胞或其任何组合。例如，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗表达CEA的癌症的方法，该方法包括:给个体施用包
含复制缺陷载体的第一药物组合物，所述复制缺陷载体包含编码CEA抗原或任何合适抗原
的核酸序列，给个体施用IL-15超激动剂如ALT-803，并给个体施用抗CEA抗体和工程化NK细
胞。在一些实施例中，该方法还可包括向个体施用VEGF抑制剂、化疗或其组合。在其他实施
例中，该方法可以进一步包括对个体工程NK杀伤细胞和检查点抑制剂施用。任何化疗剂、共
刺激分子、检查点抑制剂、针对特定抗原(例如CEA)的抗体或工程化NK细胞的组合都能够包
括在与编码抗原(诸如CEA)的Ad5[E1-,E2b-]疫苗和IL-15超级激动剂或超级激动剂复合物
(如ALT-803)的联合治疗中。
[0238] 在某些实施例中，本文使用的化疗是卡培他滨、亚叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂、氟嘧啶、伊立替康、丝裂霉素、雷戈拉非尼、西妥昔纳、帕尼图马、阿西替诺芬或其组合。在特定实施例中，本文使用的化疗是FOLFOX(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)或卡培他滨。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗。在某些实施例中，VEGF抑制剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。下文将进一步详细描述可与复制缺陷载体和ALT-803
一起用于联合治疗的试剂。
FOLFOX(5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂)
[0239] 一项随机试验(其比较了伊立替康和大剂量氟尿嘧啶加亚叶酸(IFL，对照组合)、奥沙利铂和输注氟尿嘧啶加亚叶酸(FOLFOX)或伊立替康和奥沙利铂(IROX))建立了FOLFOX
组合，共施用6个月，作为转移性结直肠癌(mCRC)患者一线治疗的护理标准。虽然已经验证
了多个FOLFOX的输注时间表，通常命名为“修饰的FOLFOX”，但在该方案的组成细胞毒性剂
中没有本质的变化。其中，mFOLFOX6是使用最广泛的一种。
[0240] 然而，由于渐进性神经毒性，奥沙利铂对患者来说接受6个月以上(12个周期)是非常困难的。尽管6个月的联合治疗仍然是mCRC的护理标准，但临床判断可能会影响到在治疗
结束时限制含奥沙利铂周期数的决定。其他试验，包括CAIRO3研究，已经证明在3个月的“诱导”期后停用奥沙利铂的可行性和益处，同时继续使用5-FU和亚叶酸作为“维持”治疗。
贝伐单抗( )
[0241] 在一线含5-FU和奥沙利铂的治疗方案中加入贝伐单抗证明可以增加mCRC患者的进展时间，且副作用易于控制，毒性不重叠。后来的试验表明，通过KRAS突变状态，比伐单抗在首次进展后继续使用(与随后的化疗相结合)提高了未选择的一组患者的总体存活率，这
导致了其在维持治疗中得到批准使用。
卡培他滨
[0242] 该药剂是一种前药，口服后通过3步酶法转化为5-氟尿嘧啶。作为口服活性氟嘧啶，卡培他滨已批准用于佐剂环境。在晚期结肠癌的情况下，它已与5-氟尿嘧啶同样有效，
尽管手足口综合征的发病率更高。这种药物提供了口服途径的便利性，其优点是减少了患
者在维持环境中的输注量，同时在肿瘤内达到高浓度，因为与正常组织相比，肿瘤中胸苷磷
酸化酶的浓度更高。
共刺激分子
[0243] 除了使用含有靶抗原(诸如CEA抗原或表位)的重组腺病毒载体疫苗外，还可以将共刺激分子并入所述疫苗中以增加免疫原性。免疫应答的启动需要至少两个APCs激活初始
T细胞的信号(Damle等人J Immunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82
(1994)；Hellstrom等人Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44(1996)；Hodge等人
Cancer Res 39:5800-07(1999))。抗原特异性第一信号通过肽/主要组织相容性复合物
(MHC)通过T细胞受体(TCR)传递，并使T细胞进入细胞循环。可以传递第二个或共刺激信号
用于细胞因子的产生和增殖。
[0244] 据报道，通常在专门的抗原呈递细胞(APC)表面发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化至关重要的第二信号:B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)、和LFA-3(人CD58)(Damle
等人.J Immunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Wingren等人
Crit Rev Immunol15:235-53(1995)；Parra等人Scand.J Immunol 38:508-14(1993)；
Hellstrom等人Ann NY Acad Sci 690:225-30(1993)；Parra等人J Immunol 158:637-42
(1997)；Sperling等人J Immunol 157:3909-17(1996)；Dubey等人J Immunol 155:45-57
(1995)；Cavallo等人Eur J Immunol 25:1154-62(1995))。
[0245] 这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1/β2整合素)复合物相互作用，LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作
用。因此，在一个优选的实施例中，希望有一种分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当与含有一种或多种编码靶抗原如HER2/neu抗原或表位的核酸的重组腺病毒载体疫
苗组合时，将进一步增加/增强针对特定靶抗原的抗肿瘤免疫应答。
自然杀伤(NK)细胞
[0246] 在某些实施例中，可以将天然或工程化的NK细胞与基于腺病毒载体的组合物和IL-15超激动剂或本文所述的其他免疫疗法结合施用于需要的受试者。
[0247] 免疫系统是由不同种类的免疫细胞组成的织锦，每一种免疫细胞在防止感染和疾病方面都有其独特的作用。在这些免疫细胞中，自然杀伤细胞(NK)是人体的第一道防线。在
没有事先被其他支持分子接触或者激活的情况下，NK细胞具有快速寻找和破坏异常细胞
(诸如癌症或病毒感染细胞)的先天能力。与适应性免疫细胞(诸如T细胞)相比，NK细胞已在
第一阶段临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗方法，并已显示出对癌症的肿瘤杀伤能
力。
aNK细胞
[0248] 除了天然NK细胞之外，还可以提供NK细胞，用于对不表达杀伤抑制性受体(KIR)的患者施用，其经常利用那些病变细胞来逃避NK细胞的杀伤功能。这种独特的激活的NK或aNK
缺少这些抑制性受体，同时保留了能够选择性靶向和杀死病变细胞的大量激活的受体。aNK
细胞还携带较大的颗粒酶和穿孔素颗粒。从而使它们能够将致命的酶有效载荷传递给多个
靶向。
taNK细胞
[0249] 嵌合抗原受体(CAR)技术是目前正在开发的最新型癌症治疗方法之一。CAR为能够使免疫效应细胞对显示特定的表面抗原(靶向激活的天然杀伤剂)的的肿瘤细胞进行靶向
的蛋白，靶向肿瘤细胞可视为这样的平台：其中用一个或多个CAR工程化的aNK细胞来靶向
在癌症上发现的蛋白，并且然后与广谱CAR整合。与使用患者或供体来源的效应细胞(诸如
自体T细胞)的其他CAR方法相比，该策略具有多个优点，尤其是在可扩展性、质量控制和一
致性方面。
[0250] 大部分癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，其中效应免疫细胞附着到抗体上，其反过来结合到靶向癌细胞上，从而通过效应细胞促进杀伤癌症。NK细
胞是体内针对ADCC的关键效应细胞，利用特殊的的受体(CD16)结合到抗体。
haNK细胞
[0251] 研究表明，也许只有20％的人群一致地表达CD16“高亲和力”变体，其与“低亲和力”CD16患者相比常会得出更有利的治疗结果。此外，由于化疗、疾病本身或其他因素，许多癌症患者的免疫系统严重衰弱。
[0252] 在某些方面，对haNK细胞进行修饰，以表达高亲和力的CD16。正因如此，haNK细胞可能会增强对抗癌细胞的广谱抗体治疗效果。
抗CEA抗体
[0253] 在一些实施例中，用一种或多种抗体靶向CEA抗体或抗CEA抗体进行施用组合物。在一些实施例中，该组合物包含复制缺损型载体，该复制缺损型载体包含编码靶抗原(诸如
CEA、MUC1、Brachyury或其组合物或者任何合适的抗原)的核苷酸序列。
[0254] 抗CEA抗体能够用于产生对抗细胞表达和/或呈现的靶抗原的免疫应答。在某些实施例中，该组合物和方法能够用于产生对抗癌胚抗原(CEA)的免疫应答，诸如由细胞表达或
呈现的CEA。例如，组合物和方法可用于对抗细胞表达或呈现的CEA(6D)产生免疫应答。
[0255] CEA在多种癌症上显示出现过表达。在一些实施例中，施用抗CEA抗体治疗的靶患者人群可以是表达CEA的结直肠癌、头颈部癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌患者个体。
[0256] 本发明提供了一种特异性结合CPAA的新型单克隆抗体。该单克隆抗体(标识为“16C3”)是指分配给其杂交瘤克隆的编号。在此，16C3也指单克隆抗体的部分，即抗体结合部位或CDR，因为其具有结合16C3抗体的能力，所以该部分可特异性结合鉴定为16C3的CPAA
表位。此处描述的几种16C3重组和人源化形式可以用相同的名称表示。
[0257] 本发明其范围内包含编码本发明抗CPAA抗体的轻链和重链可变区DNA序列。编码16C3抗体轻链可变区的核酸序列见SEQ ID NO:16。编码16C3抗体轻链可变区的核酸序列见
SEQ ID NO:17。
[0258] 本发明其范围内包含16C3轻链肽，其包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19氨基酸序列；和16C3重链肽，其包含SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:20氨基酸序列。此外，本发明包含
16C3κ轻链CDR区，其为SEQ ID NO:18的加有下划线的残基，具有CDR 1的氨基酸：
GASENIYGALN(SEQ ID NO:21)；CDR 2:GASNLAD(SEQ ID NO:22)；和CDR 3:QNVLSSPYT(SEQ 
ID NO:23)；以及SEQ ID NO:19的加有下划线的轻链的氨基酸，其包括CDR 1：QASENIYGALN
(SEQ ID NO:24)；CDR 2：GASNLAT(SEQ ID NO:25)；和CDR 3：QQVLSSPYT(SEQ ID NO:26)。本发明类似地鉴定重链的CDR区域(在图5中下划线区域)，其包括CDR 1氨基酸：GYTFTDYAMH
(SEQ ID NO:27)；CDR 2：LISTYSGDTKYNQNFKG(SEQ ID NO:28)；和CDR 3：GDYSGSRYWFAY(SEQ ID NO:29)；以及图12加有下划线的重链的氨基酸，其中包括CDR 1：GYTFTDYAMH(SEQ ID 
NO:27)；CDR 2：LISTYSGDTKYNQKFQG(SEQ ID NO:30)；和CDR 3：GDYSGSRYWFAY(SEQ ID NO:
31)。
[0259] 在本申请中，16C3抗体也称之为NEO-201抗体。
[0260] 某些实施例中，使用的抗CEA抗体可以为COL1、COL2、COL3、COL4、COL5、COL6、COL7、COL8、COL9、COL10、COL11、COL12、COL13、COL14、COL15、阿奇单抗、贝西单抗、拉贝妥单抗、阿尔托玛单抗或NEO-201。某些实施例中，抗CEA抗体可以是鼠化抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0261] 某些实施例中，抗CEA抗体与过表达(超过非癌细胞中基线CEA表达2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或10倍以上)CEA的细胞结合。
免疫途径检查点调节剂
[0262] 在一些实施例中，组合物与一种或多种免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂)一起施用。一些实施例中，组合物包括复制缺陷载体，该载体含编码靶抗原(诸如CEA)或
合适抗原的核苷酸序列。
[0263] 激活和抑制信号之间的平衡调节T淋巴细胞和疾病细胞之间的相互作用，其中T细胞应答通过T细胞受体(TCR)抗原识别启动。抑制途径和信号称为免疫检查点。在正常情况
下，免疫检查点在控制和预防自身免疫中发挥关键作用，也保护组织免受病原感染损伤。
[0264] 在某些方面，提供了基于病毒载体的疫苗和用于调节免疫检查点抑制途径的组合物的组合性免疫疗法，用于治疗癌症和感染性疾病。在一些实施例中，调节增加了基因或蛋
白质的表达或活性。在另一些实施例中，调节降低了基因或蛋白质的表达或活性。在一些实
施例中，调节影响了基因或蛋白质家族。
[0265] 某些实施例采用了联合免疫疗法，其包含含针对TAA的多靶向免疫疗法剂和分子组合物，该组合物由免疫途径检查点调节剂构成，该调节剂靶向途径上至少一种免疫检查
点蛋白。某些实施例提供了联合免疫疗法，其包含含针对IDAA的多靶向免疫疗法剂和分子
组合物，该组合物由免疫途径检查点调节剂构成，该调节剂靶向免疫抑制途径的至少一种
免疫检查点蛋白。某些实施例提供了联合免疫疗法或疫苗，包括：至少两种、至少三种或三
种以上靶抗原(其包含编码修饰的CEA的序列)；和至少一种分子组合物(其包含免疫途径检
查点调节剂)。例如，联合免疫疗法或疫苗能够包含至少两种、至少三种或三种以上不同靶
抗原(其包含编码修饰的CEA的序列，其中修饰的CEA包含这样的序列：其与SEQ ID NO:1或
SEQ ID NO:100具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性值序列)和至少一种包含免疫途径检查点调节剂的分子组合物。在一些实施例中，所
述修饰的CEA包括与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、
99.5％、99.9％或100％的同一性值序列，在SEQ ID NO:100的位置610处具有Asn->Asp取
代。
[0266] 一般情况下，免疫抑制途径由配体-受体相互作用触发。现在，已经很清楚的是，疾病可将免疫检查点途径作为诱导受试者免疫对抗的机制。
[0267] 由给定疾病引起的受试者免疫对抗或免疫抑制途径诱导可由分子组合物阻断，诸如干扰RNA(siRNA)、抗转录疗法、小分子、模拟物、配体、受体或蛋白质重组形式，或已知可调节一种或多种免疫抑制途径或其组合的抗体(可以是Ig融合蛋白)。例如，初步临床发现
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)等免疫检查点蛋白阻
断剂有希望增强抗肿瘤免疫活性。
[0268] 由于病变细胞可表达多种抑制性配体，而疾病浸润的淋巴细胞表达多种抑制性受体，所以双重或三重阻断免疫检查点蛋白可能增强抗病免疫能力。本文提供的联合免疫疗
法可包含以下免疫检查点蛋白的一种或多种分子组合物：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、
CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(又称CD276)、B7-H4(又称B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(又称CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(又称CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(又称HAVcr2)、GAL9和A2aR。在一些实施例中，该分子组合物包括siRNA。
在一些实施例中，该分子组合物包括小分子。在一些实施例中，该分子组合物包括配体的重
组形式。在一些实施例中，该分子组合物包括受体的重组形式。在一些实施例中，该分子组
合物包括抗体。在一些实施例中，所述组合疗法包括一个以上的分子组合物和/或一种以上
的分子组合物。如本领域技术人员将认识到的，在某些方面，还可以预期涵盖未来发现的免
疫检查点抑制途径的蛋白质。
[0269] 在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节CTLA4的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节PD1的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用
于调节PDL1的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节LAG3的分子组合
物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节B7-H3的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节B7-H4的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调
节TIM3的分子组合物。在一些实施例中，调节是表达的增加或增强。在其他实施例中，调节
是表达的缺失或减少。
[0270] 两种示例性的免疫检查点抑制剂包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)。CTLA-4仅在T细胞上表达，其中它调节T细胞活化的早期阶
段。CTLA-4与共刺激T细胞受体CD28进行相互作用，这能够产生抑制T细胞活性的信号。一旦
TCR抗原识别发生，CD28信号可能增强TCR信号，某些情况下导致T细胞活化，CTLA-4抑制
CD28的信号活性。某些实施例采用了本文中提及的免疫疗法，其与抗CTLA-4单克隆抗体组
合用于治疗增生性疾病和癌症。某些实施例采用了本文中提及的免疫疗法，与CTLA-4分子
组合物组合用于治疗增生性疾病和癌症。
[0271] 程序性死亡细胞蛋白配体-1(PDL1)是B7家族的成员之一，并且其分布在各种组织和细胞类型中。PDL1能够与PD1进行相互作用，进而抑制T细胞活化和CTL介导的裂解。PDL1
在多种人类肿瘤中的显著表达已被证实，并且PDL1表达是肿瘤逃避宿主抗肿瘤免疫应答的
关键机制之一。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)作为免疫检查点相
互作用。这种相互作用可能是导致抗肿瘤免疫应答减弱和随后肿瘤进展的主要耐受机制。
PD1存在于激活的T细胞上，PD1的主要配体PDL1通常在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及
包括B细胞在内的其他细胞上表达。PDL1与PD1在T细胞上进行相互作用，进而抑制T细胞活
化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解。某些实施例提供了与抗PD1或抗PDL1单克隆抗
体结合的免疫疗法，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供了与PD1或抗PDL1分子组
合物结合的免疫疗法，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供了与抗CTLA-4和抗PD1
单克隆抗体结合的免疫疗法，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供了与抗CTLA-4
和PDL1单克隆抗体结合的免疫疗法，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供了与抗
CTLA-4、抗PD1、PDL1、单克隆抗体或其组合相结合的免疫疗法，用于治疗增殖性疾病和癌
症。
[0272] 某些实施例结合针对PD-L1/PD-1途径的多个抗体提供本文提供的免疫疗法，这些抗体正处于癌症治疗的临床发展中。在某些实施例中，可以使用抗PD-L1抗体。与靶向T细胞
的抗PD-1抗体相比，靶向肿瘤细胞的抗PDL1抗体预期具有较少的副作用，包括较低的自身
免疫相关安全问题的风险，因为阻断PD-L1使PD-L2/PD-1途径保持完整，以促进外周自我耐
受。
[0273] 为此，研制了一种全人IgG1抗PDL1抗体阿维鲁单抗(药物代码MSB0010718C)。阿维鲁单抗选择性地与PD-L1结合，竞争性地阻断其与PD-1的相互作用。
[0274] 阿维鲁单抗也与鼠PD-L1交叉反应，因此允许在正常实验室小鼠中进行体内药理学研究。然而，由于针对完整人阿维鲁单抗分子的免疫原性，给药方案限于一周内施用三
次。在一些实施例中，阿维鲁单抗可以1mg/kg-20mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，阿维
鲁单抗也可以以1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和20mg/kg施用。在一些实施例中，在给药方案中
加入阿维鲁单抗或任何其他免疫途径检查点调节剂可将免疫应答增加至少2、至少3、至少
4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20或至少25倍。在一些实施例中，阿维鲁单抗每周至少一次、至少两次或至少三次施用于所述受试者。在一些实施例中，
在第1周的第1天、第2周的第1天、第4周的第1天、第8周的第1天、第12周的第1天和第16周的第1天施用阿维鲁单抗。阿维鲁单抗可以在用本公开的Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗免疫的同一
天施用。在这些情况下，阿维鲁单抗输注发生在用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗免疫后。
[0275] 阿维鲁单抗的主要临床前药理学发现总结如下。阿维鲁单抗在体外表现出对抗原特异性和抗原非特异性刺激的初级T细胞活化的功能增强；以及作为单一疗法显著抑制体
内肿瘤生长(表达MC38结肠癌的PD-L1)。它的体内功效是由CD8+T细胞驱动的，当这种细胞
类型全身耗尽时，抗肿瘤活性完全丧失就证明了这一点。它与局部分割放疗的结合导致已
建立的肿瘤完全消退，并产生抗肿瘤免疫记忆。它在化疗组合中的应用也显示出有希望的
活性：当与奥沙利铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)(FOLFOX[奥沙利铂、5-FU和亚叶酸的核心成分)联
合使用时，对MC38结肠肿瘤的加性联合作用；当与吉西他滨联合治疗PANC02胰腺肿瘤时，存
活率显著提高。其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在体外被证明是针对人类肿瘤细
胞的；此外，在ADCC体内缺陷环境中的研究支持ADCC对抗肿瘤功效的贡献。阿维鲁单抗的其
他发现包括：体外未观察到补体依赖性细胞毒性。与临床转化相关的免疫监测分析进一步
支持免疫作用机制：荧光激活细胞分选仪(FACS)测量的CD8+PD-1+T细胞和CD8+效应记忆T
细胞的持续增加；通过五聚体染色和酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)测定，增强了肿瘤抗原特
异性CD8+T细胞反应。
[0276] 尽管有报道表明在结直肠癌中使用干扰PD-1-PD-L1结合的药物不太可能产生抗肿瘤放射反应，但仍有放射反应的报道。此外，在多个临床试验中证明了相关性，表明肿瘤
组织上的局部PD-L1表达水平预测放射反应的可能性。然而，很明显，目前测量的PD-L1表达
并不是抗肿瘤疗效的决定性要求。已经注意到结肠直肠肿瘤很少表达PD-L1，而其他肿瘤更
有可能对PD-1-PD-L1阻断产生反应。然而，众所周知，产生IFN-γ的强抗肿瘤T细胞应答将
诱导PD-L1表达。
[0277] 在一些实施例中，不受理论的约束，预期潜在的免疫应答对于PD-1-PD-L1阻断具有抗肿瘤效果是必要的。不受理论的约束，进一步设想免疫检查点抑制剂与标准疗法和腺
病毒载体组合物(如Ad-CEA免疫或Ad-CEA免疫)的这种组合能够诱导PD-L1表达，从而增加
PD-1-PD-L1阻断的抗肿瘤活性。
[0278] 免疫检查点分子可以由T细胞表达。免疫检查点分子可以有效地作为下调或抑制免疫应答的“制动器”。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(PD1，也称为PDCD1或
CD279，登录号:NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)，LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)，Tim3(也称为HAVCR2，GenBank登录号：JX049979.1)，BTLA(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)，BY55(也称为CD160，
GenBank登录号：CR541888.1)，TIGIT(也称为IVSTM3，登录号：NM_173799)，LAIR1(也称为
CD305，GenBank登录号：CR542051.1)，SIGLECIO(GenBank登录号：AY358337.1)，2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)，PPP2CA，PPP2CB，PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM，SIGLEC7，SIGLEC9，TNFRSF10B，TNFRSF10A，CASP8，CASP10，CASP3，CASP6，CASP7，FADD，FAS，TGFBRII，TGFRBRI，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMAD10，SKI，SKIL，TGIFl，ILIORA，IL10RB，HMOX2，IL6R，IL6ST，EIF2AK4，CSK，PAG1，SIT1，FOXP3，PRDM1，BATF，GUCY1A2，GUCY1A3，GUCY1B2，GUCY1B3，其直接抑制免疫细胞。例如，PD1可以与腺病毒疫苗联合治疗有此需要的患者。表1并非详尽
无遗，其显示了可灭活以提高腺病毒疫苗效率的示例性免疫检查点基因。免疫检查点基因
可以选自表1中所列的基因和其他涉及共抑制受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精
氨酸色氨酸饥饿、TCR信号传导、诱导性T-reg抑制、控制衰竭或无能的转录因子以及低氧介
导的耐受性的基因。
表1-示例性免疫检查点基因
[0279] 与单独使用任何一种药物相比，基于腺病毒的疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可减少接受治疗的患者的癌症复发。在另一个实施例中，与单独使用任一种药物相比，腺
病毒疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可减少治疗患者中转移或微转移的存在或出现。
在另一个实施例中，与单独使用任一种制剂相比，腺病毒疫苗和免疫途径检查点调节剂的
组合可提高治疗患者的总体存活率。在某些情况下，与单独使用任何一种药物相比，腺病毒
疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可增加患者肿瘤特异性T细胞应答的频率或强度。
[0280] 一些实施例还公开了使用免疫检查点抑制来改善基于腺病毒载体的疫苗的性能。免疫检查点抑制可以在接种疫苗时进行。免疫检查点抑制也可以在接种疫苗后进行。免疫
检查点抑制可能与腺病毒疫苗施用同时发生。免疫检查点抑制可能发生在接种疫苗后1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或60分钟。免疫检查点抑制也可以在接种疫苗后1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时发生。在某些情况下，免疫抑制可能发生在接种疫苗后1、2、3、4、5、6或7天。免疫检查点抑制可能发生在接种疫苗之前或之后的任何时间。
[0281] 另一方面，提供了包含抗原和免疫途径检查点调节剂的疫苗。一些实施例涉及了一种治疗以下受试者的方法：该受试者患有将受益于免疫检查点(例如PD1)及其在受试者
细胞上的一个或多个天然结合配偶体的下调的疾病。
[0282] 免疫途径检查点调节剂可以与包含编码任何抗原的核苷酸序列的腺病毒疫苗组合。例如，抗原可以是MUC1c、HER3、Brachyury、HER2NEU、CEA、PMSA或PSA。当与疫苗结合时，免疫途径检查点调节剂可以产生协同效应。当与疫苗结合时，免疫途径检查点调节剂也可
以产生加性效应。
[0283] 在特定实施例中，检查点免疫抑制剂可与包含编码任何抗原的核苷酸序列的载体组合，任选地与化疗或任何其他癌症护理或治疗(例如VEGF抑制剂、血管生成抑制剂、辐射、其他免疫疗法或任何适当的癌症治疗或护理)组合。
免疫融合配偶体抗原靶标
[0284] 本文所描述的病毒载体或组合物可进一步包含编码蛋白质的核酸序列，或“免疫融合配偶体”，其可增加靶抗原如肿瘤新抗原或新表位的免疫原性。在这方面，在用含有该
蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是包含所述目的靶抗原的融合蛋白，所述靶抗
原融合到增加所述目的靶抗原的免疫原性的蛋白质上。
[0285] 在一个实施例中，这种免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属，诸如结核分枝杆菌来源的Ra12片段。来源于分枝杆菌属的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:40
中列出的任何一个序列。Ra12组合物及其用于增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免
疫原性的方法在美国专利第7,009,042号中有描述，该专利全文通过引入的方式并入本文。
简言之，Ra12是指结核分枝杆菌MTB32A核酸的一个子序列的多核苷酸区域。MTB32A是一种
32kDa的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌强毒株和无毒株中的基因编码。已经描述了MTB32A
的核苷酸序列和氨基酸序列(参见，例如，美国专利号7,009,042；Skeiky等人,Infection 
and Immun.67:3998-4007(1999)，其在此通过引用的方式并入本文)。MTB32A编码序列的C
末端片段可以高水平表达，并在整个纯化过程中保持为可溶性多肽。此外，Ra12可增强与之
融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽能够包含与MTB32A的氨基酸残基192-
323相对应的14kDa C末端片段。其他Ra12多核苷酸通常能够包含编码Ra12多肽一部分的至
少约15、30、60、100、200、300或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可以包含天然序列(即编码
Ra12多肽或其一部分的内源序列)，或者可以包含这种序列的变体。Ra12多核苷酸变体可以
包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物活性相对于包含
天然Ra12多肽的融合多肽而言不会显著降低。变体可以与编码天然Ra12多肽或其一部分的
多核苷酸序列具有至少约70％、80％或90％或更多的同一性。
[0286] 在某些方面，免疫融合配偶体能够衍生自蛋白D，即革兰氏阴性杆菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白。由蛋白D衍生的免疫融合配偶体能够为SEQ ID NO:41中所示的序列。在某些
情况下，蛋白质D衍生物包含蛋白质的大约前三分之一(例如，N末端前100-110个氨基酸)。
蛋白质D衍生物可以脂质化。在某些实施例中，脂蛋白D融合配偶的前109个残基包含在N端，
以向多肽提供额外的外源性T细胞表位，这可以增加在大肠杆菌中的表达水平，并且可以起
到表达增强子的作用。脂质尾可以确保抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其他融合配偶可
以包括流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般而言，使用N-末端81个氨基酸，尽管可以
使用包括T-辅助表位的不同片段。
[0287] 在某些方面，免疫融合配偶体可以是被称为LYTA的蛋白质或其一部分(特别是C末端部分)。衍生自LYTA的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:42中列出的任何一个序列。LYTA
来源于肺炎链球菌，肺炎链球菌合成一种被称为酰胺酶LYTA(由LytA基因编码)的N-乙酰
基-L-丙氨酸酰胺酶。LYTA是一种自溶蛋白，其专门降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白
的C末端结构域负责对胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和力。这一特性已探索用于表达
大肠杆菌C-LYTA的质粒的开发，该质粒可用于融合蛋白的表达。可以使用在氨基末端含有
C-LYTA片段的杂交蛋白的纯化。在另一个实施例中，LYTA的重复部分可以掺入融合多肽中。
例如，可以在从残基178开始的C末端区域中发现重复部分。一个特定的重复部分包含残基
188-305。
[0288] 在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。靶抗原融合可产生与IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF中的一种或多种基本相同的蛋白质。靶抗原融合可以编码核酸，该核酸编码与
IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-
11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-
29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF中的一种或多种基本相同的蛋白质。在一些实施例中，靶抗原融合进一步包含一种或多种免疫融合配偶体，在本文中也被称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-
17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-
30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。IFN-γ的序列可以是但不限于SEQ ID NO:43中规定的序列。TNFα的序列可以是但不限于SEQ ID NO:44中规定的序列。IL-2的序列可以是但不限于SEQ ID 
NO:45中规定的序列。IL-8的序列可以是但不限于SEQ ID NO:46中规定的序列。IL-12的序
列可以是但不限于SEQ ID NO:47中规定的序列。IL-18的序列可以是但不限于SEQ ID NO:
48中规定的序列。IL-7的序列可以是但不限于SEQ ID NO:49中规定的序列。IL-3的序列可
以是但不限于SEQ ID NO:50中规定的序列。IL-4的序列可以是但不限于SEQ ID NO:51中规
定的序列。IL-5的序列可以是但不限于SEQ ID NO:52中规定的序列。IL-6的序列可以是但
不限于SEQ ID NO:53中规定的序列。IL-9的序列可以是但不限于SEQ ID NO:54中规定的序
列。IL-10的序列可以是但不限于SEQ ID NO:55中规定的序列。IL-13的序列可以是但不限
于SEQ ID NO:56中规定的序列。IL-15的序列可以是但不限于SEQ ID NO:57中规定的序列。
IL-16的序列可以是但不限于SEQ ID NO:103中规定的序列。IL-17的序列可以是但不限于
SEQ ID NO:104中规定的序列。IL-23的序列可以是但不限于SEQ ID NO:105中规定的序列。
IL-32的序列可以是但不限于SEQ ID NO:106中规定的序列。
[0289] 在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，在本文中也称为“免疫原性组分”，其包含选自IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF的细胞因子。在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体共表达，在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-
32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-
20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-
34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。在一些实施例中，免疫原性组分选自IL-7、编码IL-7的核酸、与IL-7基本相同的蛋
白质和编码与IL-7基本相同的蛋白质的核酸。在一些实施例中，佐剂选自IL-15、编码IL-15
的核酸、与IL-15基本相同的蛋白质和编码与IL-15基本相同的蛋白质的核酸。
[0290] 在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，包括CpG ODN(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:58中)、霍乱毒素(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:59中)、
来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的亚基编码区(非限制性实例序列显示在SEQ ID 
NO:60中)，来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区(非限制性实例序列显示
在SEQ ID NO:61中)、Hp91(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:62中)、CCL20(非限制性实
例序列显示在SEQ ID NO:63中)、CCL3(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:64中)、GM-CSF
(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:65中)，G-CSF(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:
66中)、LPS肽模拟物(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:67-SEQ ID NO:78中)、志贺毒素
(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:79中)、白喉毒素(非限制性实例序列显示在SEQ ID 
NO:80中)或CRM197(非限制性实例序列显示在SEQ ID NO:83中)。
[0291] 在一些实施例中，靶抗原(例如，CEA)与包含IL-15超激动剂复合物的免疫融合配偶体融合或连接，其中靶抗原和免疫融合配偶体(例如，IL-15超激动剂复合物)一起在一个
腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])中编码。在一些实施例中，将编码靶抗原的腺病毒载体
与编码免疫融合配偶体(例如，IL-15超激动剂复合物的区域)的单独腺病毒载体共同递送。
在一些实施例中，IL-15超激动剂可以是一种新的IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)。在某
些实施例中，将小鼠或人类IL-15Rα和Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区域)添加至相等摩尔
浓度的IL-15N72D可进一步增强IL-15生物学活性，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复
合物显示出针对支持IL-15依赖性细胞生长的中位有效浓度(EC50)比游离IL-15细胞因子低
10倍以上。
[0292] 在一些实施例中，IL-15超级激动剂是IL-15N72D、可溶性IL-15Rα和Fc融合蛋白的生物活性蛋白复合物，也称为ALT-803。众所周知，在N末端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶性IL-15Rα片段携带大部分负责高亲和力细胞因子结合的结构元件。可溶性融合蛋
白能够通过将人类IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的1-65个氨基酸)与含有Fc结构
域(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接而产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白
具有通过IgG1区域二硫键合形成二聚体和易于使用标准蛋白A亲和层析方法纯化的优点。
[0293] 在一些实施例中，ALT-803能够具有由与二聚体IL-15Rαsushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白高亲和力相关联的人类IL-15变体的2个蛋白质亚基组成的可溶性复合物。IL-
15变体是一种114氨基酸多肽，其包含成熟的人IL-15细胞因子序列，在螺旋C N72D的72位
具有Asn-Asp取代。人类IL-15Rsushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的
sushi结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，其与含有Fc区域(232个氨基酸)的人
类IgG1 CH2-CH3区域连接。除了N72D取代，所有的蛋白质序列都是人类的。基于亚基的氨基
酸序列，计算出的包含两个IL-15N72D多肽的复合物(示例的IL-15N72D氨基酸序列示于SEQ 
ID NO:81，示例的IL-15N72D核苷酸序列示于SEQ ID NO:107)和二硫键连接的同型二聚体
IL-15RαSu/IgG1 Fc蛋白(IL-15RαSu/Fc结构域的示例氨基酸序列示于SEQ ID NO:82和IL-
15RαSu/Fc结构域示例氨基酸序列示于SEQ ID NO:108)的分子量为92.4kDa。在一些实施例
中，IL-15RαSu/Fc的两条链成为二聚物。
[0294] 在一些实施例中，本文所述的重组载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])可为IL-15超激动剂复合物的每个区域编码。例如，IL-15N72D多肽链可在腺病毒载体(例如Ad5[E1-,E2b-])
中编码，其中腺病毒载体编码的序列包含与SEQ ID NO:107的至少80％、至少85％、至少
90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。另外，IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白可在不同腺病毒载体(例如Ad5[E1-,E2b-])中编码，其中腺病毒载体编码包含与SEQ ID 
NO:108的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。这些腺病毒载体可以与编码CEA的单独的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])一起递
送。一旦在细胞中进行表达，两个IL-15N72D多肽和两个IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白则可以结
合在一起，以形成IL-15超原细胞复合物(ALT-803)。
[0295] 在其他实施例中，本文所述的单个重组载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])可由IL-15N72D和IL-l5RαSu/IgG1 Fc编码，其由Gly-Ser-Gly连接子和Thosea asigna病毒的2A序
列(EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:111)分开。该腺病毒载体可以与编码CEA的单独的腺
病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])一起递送。一旦在细胞中进行表达，两个IL-15N72D多肽和
两个IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白可以结合形成IL-15超原细胞复合物(ALT-803)。
[0296] 每个IL-15N720多肽的计算分子量约为12.8kDa，IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白的计算分子量约为33.4kDa。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1的Fc蛋白能够被糖基化，从而通过大
小排阻色谱法得到约114kDa的表观分子量的ALT 803。针对ALT-803进行测定的等电点(pI)
的范围能够大约介于5.6到6.5之间。因此，融合蛋白在pH 7时可以带负电荷。
[0297] 使用本文所述的任何重组载体，通过在同一重组载体中表达免疫原性增强剂和靶抗原，可以将本文所述的任何免疫原性增强剂融合或连接至靶抗原。
[0298] 编码此类免疫原性增强剂的核酸序列可以是SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:103-SEQ ID NO:110中的任何一个，并在表2中进行了概述。
表2：免疫原性增强剂的序列
[0299] 在一些实施例中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列不被任何核酸分开。在其他实施例中，可将编码接头的核酸序列插入编码本文所述的任何靶抗原的核酸序列和编码
本文所述的任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施例中，在用含有靶抗
原、接头和免疫融合配偶体的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，其包含靶抗
原，随后是接头并以免疫融合配偶体结束，从而将靶抗原连接至免疫融合配偶体，该免疫融
合配偶体通过接头增加了靶抗原的免疫原性。在一些实施例中，接头核酸的序列的长度可
以为约1至约150个核酸长、约5至约100个核酸长，或为约10至约50个核酸长。在一些实施例
中，核酸序列可以编码一个或多个氨基酸残基。在一些实施例中，接头氨基酸序列的长度可
以是约1至约50，或约5至约25个氨基酸残基。在一些实施例中，接头的序列包含少于10个氨
基酸。在一些实施例中，接头可以是聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头或具有丙氨酸和甘氨酸两
者的接头。
[0300] 编码此类接头的核酸序列可以是SEQ ID NO:84-SEQ ID NO:98中的任何一个，并在表3中进行了概述。
表3：接头的序列
疫苗或ALT-803的配制
[0301] 一些实施例提供了包含疫苗接种和ALT-803方案的药物组合物，该药物组合物能够通过任何途径单独施用或与药学可接受的载体或赋形剂一起施用，并且这种施用可以单
剂量和多剂量进行。更具体地，药物组合物可以与片剂、胶囊剂、锭剂、含片、手糖果、粉末、喷雾、水悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆剂、用于植入的药物递送装置等等各种药学上可接受的惰性载体进行组合。这样的载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水介质和各种无毒的
有机溶剂等。此外，这种口服药物制剂可以通过常用的用于该目的的各种类型的试剂适当
地进行甜化和/或调味。全文中描述的成分可以配制成药物，并用于需要治疗的人或哺乳动
物，其诊断为疾病，例如癌症。
[0302] 对于施用，病毒载体或ALT-803储备物能够与适当的缓冲液、生理上可接受的载体、赋形剂等进行组合。在某些实施例中，以在适当的缓冲液(诸如如无菌PBS或盐水)中施
加适当数量的病毒载体颗粒(VP)或ALT-803蛋白。在某些实施例中，本文公开的载体组合物
和ALT-803组合物以特定制剂提供，用于皮下、肠胃外、静脉、肌内或甚至腹膜内施用。在某些实施例中，活性化合物溶液的制剂作为游离碱或药理学上可接受的盐可在与表面活性剂
(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇、角鲨烯基乳液、角
鲨烯基水包油乳液、水包油乳液、水包油乳液、非水乳液、水包石蜡油乳液及其混合物和油
中制备分散体。在其它实施例中，可以为病毒载体提供特定配方，例如通过吞咽或栓剂进行
药丸形式进行施用。
[0303] 适用于注射用途的示例性药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(参见，例如，美国专利号：5,466,468)。以易于注射性的流体的形式可能是优选的。在一些实施例中提供了在制造和储存条件下稳定的形式。在各种
实施例中，保持形式以防止微生物如细菌、霉菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介
质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。例如，可通过使用涂层(例如，卵磷脂)、在分散的情况下保持所需的粒径和/
或通过使用表面活性剂保持适当的流动性。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸
酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞，可促进微生物作用的预防。它可能包括适合的等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用一些成分延迟试剂的吸收，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注
射成分的吸收。
[0304] 在一个实施例中，对于在水溶液中的肠胃外施用，如有必要，可适当缓冲该溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类特定的水溶液特别适用于在静脉
内、以及肌内、皮下腹膜内施用。有鉴于此，依据当前公开信息，本领域技术人员将了解该可使用的无菌水介质。例如，可以将一剂量的药物溶于1mL等渗氯化钠溶液中，然后添加到
1000mL皮下注射液或在建议的输注部位进行注射(见《雷明登氏药学全书》第15版，第1035
至1038页以及第1570至1580页)。根据治疗对象的情况，剂量可能会有些许变化。
[0305] 制剂的载体能够包含任何溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体、悬浮剂、增溶剂、稳定剂、PH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液)、张力调节剂、防腐剂(例如甲基，乙基或正丙基-羟基苯甲酸酯)等。除非有任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则可考虑将其用于治疗组合物中。补充性活性成分也
可以被用入组合物中。
[0306] 药物制剂可以单位剂量提供(例如在单剂量安瓿瓶、注射器或注射袋中)，也可在包含数个剂量的小瓶中提供，并且可在其中添加适量防腐剂(见下文)。可以将治疗部分配
制成微球、微胶囊、纳米颗粒或脂质体。
病毒载体与免疫刺激剂的配制
[0307] 在某些实施例中，可以将病毒载体与一种或多种免疫刺激剂(诸如佐剂)结合施用。免疫刺激剂实质上是指能增强或强化对抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任
何物质。有一类免疫刺激剂中包含佐剂。许多佐剂均包含旨在保护抗原免于快速分解代谢
的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及刺激免疫应答的物质，诸如脂质A、百日咳博德特氏菌或结核分枝杆菌衍生的蛋白质。某些佐剂可从市场购得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂
(Difco实验室)；默克佐剂65(默克股份有限公司(Merck and Company,Inc.))AS-2(史克必
成公司(SmithKline Beecham)))；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(铝)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；
酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的
微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子，诸如GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-
18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-
21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-
35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、MIF等，像生长因子，也可以用作佐剂。
[0308] 在一些实施例中，佐剂选自IL-15、编码IL-15的核酸、与IL-15基本相同的蛋白质和编码与IL-15基本相同的蛋白质的核酸。
[0309] 在某些实施例中，佐剂组合物可以是主要诱导Th1型免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导细胞介导的针对所
施用抗原的免疫应答。相反，高水平的th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于
诱导体液免疫应答。在应用本文提供的疫苗后，患者可能会产生包括Th1和/或th2型应答在
内的免疫应答。在应答主要为Th1型的某些实施例中，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞
因子的水平有更大程度的提升。此类细胞因子的水平可以很容易地用标准测定法来评估。
因此，各种实施例涉及使用细胞因子引起对抗靶抗原例如CEA的免疫应答的疗法，所述细胞
因子是例如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-
10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和/或与复制缺陷型病毒载体治疗同时提供的MIF。在某些实施例中，将细胞因子或编码细胞因子的核酸与本文所述的复制缺陷型病毒一起施用。
在某些实施例中，细胞因子在病毒载体施用之前或之后进行施用。在某些实施例中，能够引
起对抗靶抗原(例如CEA)免疫应答的复制缺陷型病毒载体还包含有编码细胞因子的序列。
[0310] 引起主要的Th1型应答的某些示例性佐剂包括了例如单磷酰基脂质A，诸如3-脱-O-酰化的单磷酰基脂质A与铝盐的组合。 佐剂是可商购的(参见，例如，美国专利号
4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲
基化)也主要诱导Th1应答。(参见，例如，WO 96/02555，WO 99/33488和美国专利号6,008,
200以及5,856,462)。也可以使用免疫刺激性DNA序列。使用的另一种佐剂包括皂苷，诸如
Quil  A或其衍生物，其包括QS21和QS7(阿奎拉生物制药有限公司(Aquila 
Biopharmaceuticals Inc.))，七叶树皂苷；洋地黄皂苷；或满天星或藜麦皂苷。其他制剂可以在佐剂组合中包括超过一种的皂苷，例如，以下组中至少两种的组合，所述组包括QS21，
QS7，Quil A，β-七叶皂苷或洋地黄皂苷。
[0311] 在某些实例中，所述组合物可通过鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他喷雾剂设备进行施用。也可采用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰甘油复合物进行施用(例如可参见，美国专利号
5,725,871)。同样，还可采用聚四氟乙烯支持基质形式的示例性透粘膜进行施用(例如可参
见，美国专利号5,780,045)。
[0312] 脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡等可用于将组合物引入合适的热细胞/生物中。本文所述的组合物可通过被配制用于包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米
颗粒等之内进行施用。另外，本文所述的组合物可以以共价键或非共价键绑定到此类运载
工具的表面。脂质体可有效地用于将基因、各种药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应子等引入各种培养的细胞系和动物中。此外，脂质体的使用似乎与全身免疫后的自身免疫
应答或不可接受的毒性无关。在某些实施例中，脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并
自发形成多层同心双层囊泡(即多层囊泡(MLV))。
[0313] 在某些实施例中，供有从药物学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以稳定且可重复的方式截留化合物。为了避免由于细胞内聚合物过度堆积所引起的副作用，将
使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)。
[0314] 在某些实施例中，组合物包含或与化疗剂(例如，可用于治疗癌症的化合物)一起施用。可以与公开的T细胞组合使用的化学治疗癌症试剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长
春花生物碱)，例如长春新碱、长春碱、长春地辛以及NaelbineTM(长春瑞滨，5’-去甲肾上腺素)。拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物(如CamptosarTM(伊立替康HCL)，HycamtinTM
(拓扑替康HCL)和其他衍生自喜树碱及其类似物的化合物)；鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷，
替尼泊苷和米托泊齐德；诸如顺氯氨铂、环磷酰胺、氮芥末、三亚甲基硫代磷酰胺、卡马斯
汀、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁斯汀、尿嘧啶芥子、氯苯丙嗪和达卡巴嗪的烷化剂；诸如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴嗪的抗代谢物；诸如阿霉素、博来霉素、放线菌素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和柔红霉素的抗生素；
抗肿瘤抗体；达卡巴嗪；氮杂胞苷；氨茶碱；美法仑；异环磷酰胺；和米托蒽醌。
[0315] 本文公开的组合物可以与其他抗肿瘤剂(其包括细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂)组合施用。细胞毒性/抗肿瘤药可以定义为攻击和杀死癌细胞的药物。一些细胞毒性
剂/抗肿瘤剂是使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化的烷化剂，该烷化剂例如顺铂、环磷酰胺、
氮芥、三亚甲基噻替派、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司丁(belustine)、乌拉莫司汀(uracil mustard)、chlomaphazin和达卡嗪(dacabazine)。其他细胞毒性剂/抗瘤形成剂是
针对肿瘤细胞的抗代谢物，例如，胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤
(mercaptopuirine)、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性剂/抗瘤形成剂是抗生素，例如多
柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、霉菌素C、和道诺霉素。对于这些化合物，有许多脂质体配制品可商购。还有其他细胞毒性剂/抗瘤形成剂是有丝分裂抑制
剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。杂类细胞毒性剂/抗瘤形成剂
包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪，氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌、和长春地辛。
[0316] 也可采用抗血管生成剂。依据已公开的方法和组合物，可使用且合适的抗血管生成剂包括了抗VEGF抗体(其包括了人源化和嵌合抗体)，抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他
血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸以及金属蛋白酶-1和-2(TIMP-1和-2)的组织抑制剂。还可以使用小分子，包括拓扑异构酶
如雷佐生(razoxane)，该雷佐生是具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
Ad5疫苗的制备方法
[0317] 在一些实施例中，组合物和方法利用了人体溶细胞T细胞(CTL)，诸如那些识别CEA表位并与选定的MHC分子(如HLA-A2、A3和A24)结合的细胞。可以使用本文所述的方法和组
合物选择表达某些血清型(例如HLA-A2，A3和A24)的MHC分子的个体进行治疗。例如，表达某
些血清型(例如HLA-A2、A3和A24)的MHC分子的个体可被选择用于治疗，其包括使用本文所
述的方法和组合物针对CEA的免疫应答。
[0318] 在各种实施例中，这些T细胞可以通过利用目的表位致敏的抗原递呈细胞刺激外周血单核细胞，在体外培养产生。此外，T细胞系也可通过以CEA乳胶珠，CEA蛋白致敏的塑料粘附的外周血单个核细胞或用CEAsRNA敏化的DC刺激后来产生。对编码CEA免疫原的疫苗载
体免疫的患者也可产生T细胞。还可在原发性胃肠道肿瘤中进一步发现来自CEA的HLA A2呈
递的肽。
[0319] 一些实施例涉及CEA的HLA A2限制性表位，即CAP-1，一段含有九个氨基酸的序列(YLSGANLNL；SEQ ID NO:3)，其具有刺激疫苗-CEA免疫的癌症患者的CTL的能力。Cap-1(6D)
(YLSGADLNL；SEQ ID NO:4)是CAP-1的肽类似物。它的序列包括一个异位(非锚位置)突变，
导致氨基酸从Asn变为Asp，从而增强了T细胞受体的识别能力。Asn至Asp突变似乎不会引起
肽与HLA A2结合过程造成任何变化。与未-突变的CAP-1表位相比，Cap-1(6D)可以使CTL的
敏感性提高100到1,000倍。CTL系可以通过对Cap-1(6D)肽进行体外敏化而从健康志愿者的
外周血单核细胞中诱导，但该方法对CAP-1肽却不太有效。这些细胞系可以裂解表达内源性
CEA的人类肿瘤细胞。因此，包含CAP-1或CAP-1(6D)的多肽序列，编码这些序列的核酸序列，即腺病毒载体；例如，包含此类核酸序列的复制缺陷腺病毒载体在一些实施例中提供。
Ad5疫苗的治疗方法
[0320] 在多种疫苗设置中能够使用腺病毒载体，用于产生针对一种或多种靶抗原的免疫应答，如本文所述。一些实施例提供了产生针对任何靶抗原的免疫应答的方法，例如本文其
他地方描述的那些。腺病毒载体之所以特别重要，是因为出乎意料的发现，它们可用于在对
Ad已有免疫力的受试者中产生免疫应答，并且可以用于包括使用腺病毒载体进行多轮免疫
的疫苗接种方案(使用上一代腺病毒载体不可能进行的方案)。
[0321] 在一些实施例中，第一复制缺陷型腺病毒或第二复制缺陷型腺病毒感染人的树突细胞，并且其中被感染的树突细胞呈递抗原，从而诱导免疫应答。
[0322] 一般而言，产生免疫应答包括体液应答和/或细胞介导的应答的诱导。可能需要增加针对靶抗原的免疫应答。产生免疫应答可以涉及免疫系统的某些细胞的活性和/或数量
的减少或某些细胞因子或其他效应分子的水平和/或活性的降低。在一些实施例中，能够使
用任何检测免疫应答的改变(例如，细胞数目、细胞因子表达、细胞活性)的合适方法。在这
种情况下，有用的示例性方法包括细胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖测定，包括铬
释放或等效测定的细胞毒性T细胞测定，以及使用任何数量的基于聚合酶链反应(PCR)或
RT-PCR的分析进行基因表达测定。
[0323] 与对照相比，产生免疫应答可包括在施用如本文所述的腺病毒载体的受试者中靶抗原特异性CTL活性增加1.5至5倍。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括约
施用腺病毒载体的受试者中2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍的靶特异性CTL活性的增加。
[0324] 与合适的对照相比，产生免疫应答可包括在施用腺病毒载体(其包含编码靶抗原的核酸)的受试者中靶抗原特异性HTL活性增加(诸如增殖辅助T细胞)1.5至5倍之间。在另
一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、
5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、
12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的靶特异性HTL活性的增加。在这个前提下，HTL活性可包括上述特定细胞因子产量的增加或减少，诸如干扰素-γ(IFN-γ)、白介
素-1(IL-1)、IL-2，IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他细胞因子。在这方面而言，
产生免疫应答可以包括从Th2型应答向Th1型应答的转变，或者在某些实施例中，包括从Th1
型应答向Th2型应答的转变。在其他实施例中，产生免疫应答可以包括激活主要Th1或Th2型
应答。
[0325] 与合适的对照相比，产生免疫应答可以包括在施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产生的介于1.5和5倍之间的增加。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包
括在施用腺病毒载体的受试者中约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更高的靶特异性抗体的产生的增加。
[0326] 在一些实施例中，重组病毒载体影响抗原在转染细胞中的过表达。在一些实施例中，重组病毒针对人中表达抗原的细胞诱导特异性免疫应答，其是基础的少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或25倍。在一些实施例中，在施用步骤之前，人具有大于50、75、100、125、150、160、175、200、225、250、275或300的逆Ad5中和抗体滴度。在一些实施例中，人具有大于250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或4767的逆Ad5中和抗体滴度。在一些实施例中，免疫应答被测量为抗原特异性抗体应答。
[0327] 在一些实施例中，免疫应答被测量为抗原特异性细胞介导的免疫(CMI)。在一些实施例中，免疫应答被测量为抗原特异性IFN-γ分泌。在一些实施例中，免疫应答被测量为抗
原特异性IL-2分泌。在一些实施例中，通过ELISpot测定法测量针对抗原的免疫应答。在一
些实施例中，每106个外周血单核细胞(PBMC)的抗原特异性CMI大于25、50、75、100、150、
200、250或300个IFN-γ点形成细胞(SFC)。在一些实施例中，免疫应答通过CAP-1致敏的抗
原呈递细胞，来自肿瘤细胞系或自体肿瘤的同种异体抗原表达细胞的T细胞裂解来测量。
[0328] 因此，一些实施例提供了用于产生针对靶抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含以下内容的腺病毒载体：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体
在E2b区域有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；和至少一次将腺病毒载体重新施用给个体；从
而产生对抗靶抗原的免疫应答。在某些实施例中，施用个体的载体不是去病毒基因的载体。
在特定的实施例中，靶抗原可以是其野生型蛋白、片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包含CEA、其片段、变体或变体片段。
[0329] 在进一步的实施例中，提供了在个体内产生对抗靶抗原的免疫应答的方法，其中通过向个体施用腺病毒载体，使个体具有对Ad的预先存在的免疫力，所述方法包括：a)复制
缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；和至少一
次将腺病毒载体重新施用给个体；从而产生对抗靶抗原的免疫应答。在特定的实施例中，靶
抗原可以是野生型蛋白、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包含CEA、其片段、变体或变体片段。
[0330] 关于预先存在的对Ad的免疫，可以使用任何合适的方法来确定，诸如基于抗体的测定法来测试Ad抗体的存在。此外，在某些实施例中，该方法包括首先确定个体对Ad具有预
先存在的免疫力，然后如本文所述施用E2b缺失的腺病毒载体。
[0331] 一种实施例提供了一种在个体内针对一种或多种靶抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向个体施用第一腺病毒载体，第一腺病毒载体包括出复制缺陷型腺病毒载体，其
中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，并具有编码至少一种靶抗原的核酸。向个体施用第二种
腺病毒载体，第二种腺病毒载体包含复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具
有缺失，和具有编码至少一种靶抗原的核酸，其中第二腺病毒载体的至少一个靶抗原与第
一腺病毒载体的至少一个靶抗原相同或不同。在特定的实施例中，靶抗原可以是野生型蛋
白、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包含CEA、其片段、变体或变体片段。
[0332] 因此，在一些实施例中，考虑用相同的E2b缺失的腺病毒载体进行多次免疫或用不同的E2b缺失的腺病毒载体进行多次免疫。在每种情况下，腺病毒载体可包含编码一种或多
种靶抗原的核酸序列，如本文其他地方所述。在某些实施例中，该方法包括用编码一种靶抗
原的缺失E2b的腺病毒进行多次免疫，并多次再次施用相同的腺病毒载体，从而诱导对抗靶
抗原的免疫应答。在一些实施例中，靶抗原包含CEA、其片段、变体或变体片段。
[0333] 在另一个实施例中，该方法包括用编码一种或多种靶抗原的第一腺病毒载体免疫，然后与编码一种或多种靶抗原的第二种腺病毒载体一起施用，该抗原与第一腺病毒载
体编码的那些抗原可以相同或不同。在这方面而言，一个编码的靶抗原可以不同，或者所有
编码的抗原可以不同，或者某些可以相同，而有些可以不同。此外，在一些实施例中，该方法包括多次施用第一腺病毒载体和多次施用第二腺病毒。就这方面而言，该方法包括施用第
一腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次，以及施用第二腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。施用顺序可以包括连续一次或多次施用第一腺病毒，然后连续一次或多次施用第二腺病毒载体。在某些实施例中，该方法包括
将第一腺病毒载体和第二腺病毒载体交替施用为每次一次施用，每次两次施用，每次三次
施用，等等。在某些实施例中，同时施用第一腺病毒载体和第二腺病毒载体。在其他实施例
中，第一腺病毒载体和第二腺病毒载体是按顺序的方式施用。在一些实施例中，靶抗原包含
CEA、其片段、变体或变体片段。
[0334] 如本领域技术人员将容易理解的，在该方法中可以使用两种以上的腺病毒载体。三种，4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的腺病毒载体可用于本文所述的方法。在某些实施例中，该方法包括一次施用一种以上的E2b缺失的腺病毒载体。关于这方面，可以通过同时施
用多种不同的腺病毒载体来产生对抗多种靶抗原的免疫应答，每种应答包含编码一种或多
种靶抗原的核酸序列。
[0335] 能够使用腺病毒载体，以产生对抗癌症的免疫应答，诸如癌瘤或肉瘤(例如实瘤、淋巴瘤和白血病)。腺病毒载体能够用于产生对抗传染病的免疫应答，诸如任何表达CEA的
癌症、表达Brachyury的癌症、表达MUC1的癌症、上皮癌、神经系统癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病
(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、胃肠道癌或其他癌症。
[0336] 在一个方面，提供了一种针对施用组合物来选择人的方法，该方法包括：确定人的HLA亚型；如果确定HLA亚型是HLA亚型的预选亚组之一，则将该组合物施用于该人。在一些
实施例中，HLA亚型的预选亚组包含HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24中的一种或多种。
[0337] 在一些实施例中，人没有同时接受类固醇、皮质类固醇和免疫抑制剂中的任何一种治疗。在一些实施例中，人未患有自身免疫性疾病。在一些实施例中，人未患有炎症性肠
病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化症、病毒性肝炎或HIV。在一些实施例中，人患有传染病，或者未来可能患有传染病。在一些实施例中，人患有自身免疫相关的
甲状腺疾病或白癜风。在一些实施例中，人患有增生性疾病癌症，或者将来可能患有增生性
疾病癌症。在一些实施例中，人患有结肠直肠腺癌、转移性结肠直肠癌、晚期CEA表达结肠直肠癌、晚期MUC1-C、Brachyury或CEA表达结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌。在一些实施例中，人具有至少1个、2个或3个转移性疾病位点。在一些实施例中，人包含过表达
CEA的细胞。在一些实施例中，在非癌细胞中，过表达CEA的细胞相对于基线CEA表达，将CEA
过表达至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施例中，过表达CEA的细胞包括癌细胞。在一些实施例中，人包含过表达MUC1-C、Brachyury或CEA的细胞。在一些实施例中，过表达MUC1-C、Brachyury或CEA的细胞过表达MUC1-C、Brachyury或CEA是在非癌细胞中的基线MUC1-C、
Brachyury或CEA水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施例中，过表达MUC1-C、Brachyury或CEA的细胞包含癌细胞。在一些实施例中，受试者具有诊断的疾病易感性。在一
些实施例中，受试者病情稳定。在一些实施例中，受试者具有疾病的遗传易感性。在一些实
施例中，该疾病为癌症。在一些实施例中，癌症选自前列腺癌、结肠癌、乳腺癌或胃癌。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。
[0338] 一些实施例提供了提供组合的多靶向疫苗、免疫疗法和方法，用于增强对传染病和癌症等复杂疾病的治疗应答。例如，在一些实施例中，在治疗期间，除免疫策略外，还可以向受试者施用联合Ad5疫苗。例如，在一些实施例中，能够施用第一和第二复制缺陷型腺病
毒载体，其各自编码不同的抗原。在一些实施例中，第一复制缺陷型腺病毒载体或第二复制
缺陷型腺病毒载体包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施例中，
第一复制缺陷型腺病毒载体或第二复制缺陷型腺病毒载体包含与SEQ ID NO:2中的选自
26048-26177、26063-26141、1-103、54-103、32214-32315，和32214-32262的区域具有至少
80％序列同一性的区域。在一些实施例中，第一复制缺陷型腺病毒载体或第二复制缺陷型
腺病毒载体包含与SEQ ID NO:2中的位置1057和3165之间的区域具有至少80％序列同一性
的区域。在一些实施例中，第一复制缺陷型腺病毒载体或第二复制缺陷型腺病毒载体包含
编码MUC1-C，Brachyury或CEA抗原的序列；其中，MUC1-C抗原由与SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:
6或SEQ ID NO:101具有至少80％序列同一性的序列编码；其中Brachyury抗原由与SEQ ID 
NO:9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:102具有至少80％序列同一性的序列编码；其中，CEA抗原
由与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:100具有至少80％序列同一性的序列编码。
[0339] 还提供了用于治疗或改善本文所述的任何传染性疾病或癌症的症状的方法。治疗方法包括将腺病毒载体一次或多次施用给患有本文所述的传染病或癌症或有患传染病或
癌症的风险的个体。因此，一些实施例提供这样的方法：该方法在患上这种疾病风险的个体
中，对抗传染性疾病或癌症而进行疫苗接种。危险中的个体可以是可能在某些时候接触到
传染原或先前已接触但尚未出现感染症状的个体，或者是具有遗传易感性癌症或特别容易
感染传染原的个体。可确定患有本文所述传染病或癌症的个体表达和/或呈现靶抗原，可用
于指导本文的治疗方法。例如，可以发现表达和/或呈现靶抗原的示例，并且随后可以施用
编码靶抗原、其变体、片段或变体片段的腺病毒载体。
[0340] 一些实施例考虑使用腺病毒载体用于在体内递送编码靶抗原或其片段、变体或变体片段的核酸。一旦注射到受试者体内，核酸序列被表达，从而导致对该序列编码的抗原的
免疫应答。腺病毒载体疫苗可以以“有效量”施用，即在选定的一条或多条施用途径中有效
的腺病毒载体的量，以引发如本文别处所述的免疫应答。有效量可诱导免疫应答有效地促
进宿主对目标感染因子或癌症的保护或治疗。每个疫苗剂量中载体的量被选择为诱导免
疫、免疫保护或其他免疫疗法反应而没有通常与典型疫苗相关的显著副作用的量。一接种
疫苗后，可以对受试者进行监测，以确定疫苗治疗的效果。可以通过本领域普通技术人员已
知的任何方法来监测疫苗接种的效果。在一些实施例中，以分析血液或液体样品以检测抗
体水平。在其他实施例中，可以进行ELISpot试验来检测来自循环血液细胞或淋巴组织细胞
的细胞介导的免疫应答。
[0341] 本文所述的治疗组合物的施用途径和频率以及剂量可以因人而异，因疾病而异，可以很容易地使用标准技术建立。一般而言，药物组合物和疫苗可以通过注射(例如，皮内
注射、肌内注射、静脉内注射或皮下注射)，鼻内(例如，通过抽吸)，以丸剂形式(例如吞咽，用于阴道或直肠递送的栓剂)来施用。在某些实施例中，在52周内施用1至10剂。在某些实施
例中，每隔1个月施用6剂，此后可定期进行进一步的强化疫苗接种。替代方案可能适合个别
患者。因此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20剂或更多剂量可以在1年或更短或更长的周期内施用，例如超过35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100周。剂量可以每隔1、2、3、4、5或6周或更长的时间间隔施用。
[0342] 疫苗可以在少于约4小时的时间内输注，更优选地，在少于约3小时的时间内输注。例如，前25-50毫克可以在30分钟内输注，优选地在15分钟内输注，剩余部分的在接下来的
2-3小时内输注。一般地，施用的疫苗构建体的剂量可以为每2周或每3周施用一次，重复总
共至少3次剂量。或者，该构建体可以每周施用两次，持续4-6周。剂量时间表可以选择性地
以其他时间间隔重复，并且可以通过各种肠胃外途径施用，同时适当调整剂量和时间表。组
合物可以结合(例如，之前、同时或之后)任意数量的相关治疗模式施用给患者。
[0343] 合适的剂量是腺病毒载体的量，当如上所述施用时，其能够促进如本文别处所述的靶抗原免疫应答。在某些实施例中，免疫应答比基础水平(即，未治疗水平)高至少10％-
50％。在某些实施例中，免疫应答比基础水平高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500或更多。这种应答可以通过测量患者体内的靶抗原抗体或通过能够在体外杀死患者肿瘤或受
感染细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生，或本领域已知的用于监测免疫应答的其他
方法来监测。与未接种疫苗的患者相比，这种疫苗还应该能够引起免疫应答，从而改善接种
疫苗的患者的相关疾病的临床结果。在一些实施例中，改善的临床结果包括治疗疾病、减轻
疾病症状、改变疾病恶化或延长寿命。
[0344] 一般而言，合适的剂量和治疗方案提供的腺病毒载体的量足以提供治疗和/或预防益处。与未治疗的患者相比，可以通过为治疗的患者中的特定疾病建立改善的临床结果
来监测这种应答。监测数据可以随着时间的推移进行评估。随着时间的推移，疾病的进展是
可以改变的。临床结果的这种改善将很容易被治疗医生所认识到。对于靶蛋白预先存在的
免疫应答的增加通常与临床结果的改善相关。这种免疫应答通常可以使用标准的增殖、细
胞毒性或细胞因子分析来评估，这可以使用在治疗前后从患者获得的样品来进行。
[0345] 虽然一个优点是能够用相同或不同的腺病毒载体进行多次疫苗接种，特别是在对Ad具有预先免疫的个体中，但是腺病毒疫苗也可以作为引发和增强方案的一部分进行接
种。混合模式的引发和增强接种方案可能引起增强的免疫应答。因此，一方面是一种用质粒
疫苗(例如包含靶抗原的质粒载体)引发受试者的方法，该方法通过施用质粒疫苗至少一
次，允许预定长度的时间过去，然后通过施用腺病毒载体来增强。可以进行多次引发，例如
1-4次，尽管可以使用更多。引发和增强之间的时间长度通常可以从大约四个月到一年不
等，但是也可以使用其他时间周期。在某些实施例中，受试者可以用质粒疫苗接种1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10次或更多次，然后在4个月后用腺病毒载体增强。
[0346] 可以给个体施用本文提供的任何组合物。“个体”可以与“受试者”或“患者”互换使用。个体可以是哺乳动物，例如人或动物，诸如非人灵长类动物、啮齿动物、兔子、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、牛、猪或羊。在实施例中，个体为人。在实施例中，个体为胎儿、胚胎或儿童。在某些情况下，本文提供的组合物以离体的方式施用于细胞。在某些情况下，本文提供的组合物作为治疗疾病或病症的方法而施用于个体。在一些实施例中，个体患有遗传
病。在某些情况下，个体有患病的风险，例如本文所述的任何疾病。在一些实施例中，个体患有由蛋白质量不足或蛋白质活性不足引起的疾病或病症的风险增加。如果个体患有疾病或
病症的“风险增加”，则该方法涉及预防性或预防性治疗。例如，由于家族病史，个体患有这种疾病或病症的风险会增加。一般而言，患有这种疾病或病症风险增加的个体受益于预防
性治疗(例如，通过预防或延迟疾病或病症的发作或进展)。
[0347] 在某些情况下，受试者没有疾病。在某些情况下，治疗是在疾病发作前进行的。受试者可能患有未被发现的疾病。受试者可能疾病负担较轻。受试者也可能疾病负担较重。在
某些情况下，可以根据分级标准给受试者施用如本文所述的治疗。分级标准可以为格里森
分类法。格里森分类法反映了肿瘤组织与正常前列腺组织的不同。其评分范围为从1至5。医
师根据癌细胞的模式和生长情况给癌症评出一个数字。该数字越小，癌细胞看起来越正常，
等级越低。该数字越大，癌细胞看起来越不正常，等级越高。在某些情况下，可以对格里森分数低的患者进行治疗。特别地，格里森分数为3或更低的患者可以施用如本文所述的治疗。
在一些实施例中，受试者的格里森分数为6分或更低。在一些实施例中，受试者的格里森分
数高于6分。
[0348] 各种实施例涉及用于在选定的患者群体中提高针对CEA抗原的免疫应答的组合物和方法。因此，方法和组合物可以靶向癌症患者，所述癌症包括但不限于癌症或肉瘤，例如
神经系统癌症、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、胃肠癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)以及慢性淋巴细胞白血病(CLL)或其他可以靶
向治疗的癌症。在某些情况下，靶向患者群体可能限于患有结肠直肠癌、转移性结肠直肠
癌、表达CEA的晚期结肠直肠癌、头颈癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌的个体。可以使用组织学确诊选定的癌症，例如结肠直肠腺癌。可以选择特定的疾病阶段或进展，例如，
可以选择患有转移性、复发性、III期或IV期癌症中的一种或多种的患者来用该方法和组合
物进行治疗。在一些实施例中，患者可能需要接受其他治疗，并且任选地通过其他治疗进
行，其包括但不限于含氟嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼图单抗的治疗。在某些情况下，个体拒绝接受此类治疗可能会使患者被包括在使用该方法和组合物
的治疗合格池中。在一些实施例中，接受使用方法和组合物的治疗的个体可能需要具有至
少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、21或24个月的估计预期寿命。接受使用方法和组合物的治疗的患者池可能受到年龄的限制。例如，年龄大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、60岁或年龄更大的个体可以有资格使用方法和组合物进行治疗。再如，年龄小于75、70、65、60、55、50、40、35、30、25、20岁或年龄更小的个体可以有资格使用方法和组合物进行治疗。
[0349] 在一些实施例中，接受使用方法和组合物的治疗的患者限于具有足够血液功能的个体，例如以下情况的一种或多种：每微升的WBC计数至少为1000、1500、2000、2500、3000、
3500、4000、4500、5000或更多，血红蛋白水平至少为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14g/dL或更高，每微升的血小板计数至少为50,000、60,000；70,000；75,000；90,000；100,000；110,
000；120,000；130,000；140,000；150,000或更多；其中，PT-INR值小于或等于0.8、1.0、1.2、
1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0或更高，PTT值小于或等于ULN的1.2、1.4、1.5、1.6、
1.8、2.0倍或更高倍。在各种实施例中，对于不同性别和年龄组的个人，例如0-5岁、5-10岁、
10-15岁、15-18岁、18-21岁、21-30岁、30-40岁、40-50岁、50-60岁、60-70岁、70-80岁或80岁以上，血液功能指标限值的选择是不同的。
[0350] 在一些实施例中，接受使用方法和组合物的治疗的患者限于具有足够肾功能和/或肝功能的个体，例如以下情况的一种或多种：血清肌酸酐水平小于或等于0.8、0.9、1.0、
1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更高、胆红素水平为0.8、
0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更高，同时允许更高的吉尔伯特综合症上限，例如，小于或等于1.5、1.6、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4mg/dL，ALT和AST值小于或等于正常值上限(ULN)的1.5、2.0、2.5、3.0倍或更高倍。在各种实施例中，对于不同性别和年龄组的个体，例如0-5岁、5-10岁、10-15岁、15-18岁、18-21岁、21-
30岁、30-40岁、40-50岁、50-60岁、60-70岁、70-80岁或80岁以上，肾功能或肝功能指标限值的选择是不同的。
[0351] 在一些实施例中，可以确定使用本文所述方法和组合物进行治疗的候选个体的K-ras突变状态。具有预选K-ras突变状态的个体可以被包括在合格的患者池中，用于使用本
文所述的方法和组合物进行治疗。
[0352] 在各种实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的治疗的患者限于以下个体，其没有同时进行细胞毒性化疗或放疗、脑转移史或当前病史、自身免疫性疾病史(例如
但不限于炎症性肠病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、甲状腺疾病和白癜风)、严重的并发慢性或急性疾病(例如心脏病(NYHA III级或IV级))或肝病、对可能遵
守方案的医学或心理障碍、并发的(或在过去5年内)第二恶性肿瘤(非黑色素瘤皮肤癌、原
位宫颈癌、受控浅表膀胱癌或其他-已治疗的原位癌)、活动性急性或慢性感染，包括：泌尿
道感染、HIV(如，通过ELISA确定并通过Western Blot确认)、慢性肝炎或同时进行类固醇治
疗(或其他免疫抑制剂，如硫唑嘌呤或环孢菌素A)。在某些情况下，停止任何类固醇治疗至
少3、4、5、6、7、8、9或10周的患者(用作化疗或对比增强研究的术前用药除外)可被包括在使用本文所述方法和组合物进行治疗的合格个体的池中。
[0353] 在一些实施例中，使用本文所述方法和组合物接受治疗的患者包括患有甲状腺疾病和白癜风的个体。
[0354] 在各种实施例中，可以收集来自个体或候选个体的样品，例如血清或尿液样品，用于使用本文所述方法和组合物的治疗。可以在治疗之前、期间和/或之后收集样品，例如，在治疗开始之前的2、4、6、8、10周内，在治疗开始之后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内，在治疗开始之前的2、4、6、8、10周内，在治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内，在治疗期间的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周时间间隔内，在治疗之后的1个月、3个月、6个月、1年、2年时间间隔内，在治疗之后的1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内，持续6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。可以对样品进行本文所述的任何血液、肾功能或肝功能指标的测试，以及本领域已
知的合适的其他指标的测试，例如用于有生育潜力的妇女的β-HCG。在这方面，在一些实施
例中可以使用血液和生化测试，包括具有差异的血细胞计数、PT、INR以及PTT，测量钠、钾、氯、二氧化碳、BUN、肌酐、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT以及葡萄糖的测试。在一些实施例中，使用本文所述的方法和组合物，在来自个体或候选个体的用于治疗
的样品中测定HIV抗体、肝炎BsAg或丙型肝炎抗体的存在或量。可以使用本文所述的方法和
组合物在来自个体或候选个体的用于治疗的样品，如血清中测试生物标志物(例如CEA抗体
或Ad5载体的中和抗体)。在某些情况下，可以使用本文所述的方法和组合物从个体或候选
个体收集一个或多个样品(例如血液样品)并存档，以用于治疗。收集的样品可用于免疫评
估。使用本文所述方法和组合物进行治疗的个体或候选个体在成像研究中进行评估，例如
使用胸部、腹部或骨盆的CT扫描或MRI。成像研究可以在使用本文所述的方法和组合物进行
治疗之前、期间或之后进行，例如，在治疗开始之前的2、4、6、8、10周内，在治疗开始之后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内，在治疗开始之前的2、4、6、8、10周内，在治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内，在治疗期间的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周时间间隔内，在治疗之后的1个月、3个月、6个月、1年、2年时间间隔内，在治疗之后的1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内，持续6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。
[0355] 在一个方面，关于用编码CEA、MUC1-C和Brachyury的Ad5载体治疗疾病，提供了一种在人体内产生对每种抗原或其任意组合的免疫应答的方法，包括给人体施用该组合物。
在一些实施例中，施用步骤重复至少一次。在一些实施例中，在前一个施用步骤后约2、3、4、
5或6周重复施用步骤。在一些实施例中，在前一个施用步骤后约2、3、4、5或6个月重复施用步骤。在一些实施例中，施用步骤重复两次。
[0356] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，以大约3周的时间间隔，对人总共施用3次第一组合物，第一组合物包含编码
MUC1-C抗原的第一复制缺陷型腺病毒载体；以及在第二阶段期间，以大约3个月的时间间
隔，对人总共施用3次第二组合物，所述第二组合物包含编码抗原的第二复制缺陷型腺病毒
载体，所述抗原诱导人体对表达MUC1-C抗原的细胞产生免疫应答。
[0357] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，以大约3周的时间间隔，对人总共施用3次第一组合物，所述第一组合物包含编
码Brachyury抗原的第一复制缺陷型腺病毒载体；以及在第二阶段期间，以大约3个月的时
间间隔，对人总共施用3次第二组合物，所述第二组合物包含编码抗原的第二复制缺陷型腺
病毒载体，所述抗原诱导人体对表达Brachyury抗原的细胞产生免疫应答。
[0358] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，以大约3周的时间间隔，对人总共施用3次第一组合物，所述第一组合物包含编
码至少两种抗原的第一复制缺陷型腺病毒载体，所述至少两种抗原选自MUC1-C抗原、
Brachyury抗原以及CEA抗原；以及在第二阶段期间，以大约3个月的时间间隔，对人总共施
用3次第二组合物，所述第二组合物包含编码抗原的第二复制缺陷型腺病毒载体，所述抗原
诱导人体对表达至少两种抗原的细胞产生免疫应答。在一些实施例中，第二阶段在第一阶
段结束后大约3个月时开始。
[0359] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，对人总共施用n次第一组合物，所述第一组合物包含编码Brachyury抗原的第
一复制缺陷型腺病毒载体；在第二阶段期间，对该人总共施用m次第二组合物，所述第二组
合物包含编码抗原的第二复制缺陷型腺病毒载体，所述抗原诱导人体对表达Brachyury抗
原的细胞产生免疫应答。
[0360] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，对人总共施用n次第一组合物，所述第一组合物包含编码MUC1-C抗原的第一复
制缺陷型腺病毒载体；在第二阶段期间，对该人总共施用m次第二组合物，所述第二组合物
包含编码抗原的第二复制缺陷型腺病毒载体，所述抗原诱导人体对表达MUC1-C抗原的细胞
产生免疫应答。
[0361] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在第一阶段期间，对人总共施用n次第一组合物，所述第一组合物包含编码至少两种抗原的第一
复制缺陷型腺病毒载体，所述至少两种抗原选自MUC1-C抗原、Brachyury抗原以及CEA抗原；
在第二阶段期间，对该人总共施用m次第二组合物，所述第二组合物包含编码至少两种抗原
的第二复制缺陷型腺病毒载体，所述至少两种抗原诱导人体对表达至少两种抗原的细胞产
生免疫应答。在一些实施例中，n大于1。在一些实施例中，n为3。在一些实施例中，m大于1。在一些实施例中，m为3。在一些实施例中，第一阶段是至少2、3、4、5、6、7或8周。在一些实施例中，第二阶段是至少2、3、4、5、6、7或8个月。在一些实施例中，第二阶段在第一阶段结束后3-
16周时开始。在一些实施例中，在第一阶段，复制缺陷型腺病毒的两次施用间隔至少18天。
在一些实施例中，在第一阶段，复制缺陷型腺病毒的两次施用间隔约21天。在一些实施例
中，在第一阶段，复制缺陷型腺病毒的两次施用最多相隔24天。在一些实施例中，在第二阶
段，复制缺陷型腺病毒的两次施用间隔至少10周。在一些实施例中，在第二阶段，复制缺陷
型腺病毒的两次施用间隔约13周。在一些实施例中，在第二阶段，复制缺陷型腺病毒的两次
施用最多相隔16周。在一些实施例中，该方法进一步包括施用包括免疫途径检查点调节剂
的分子组合物。
[0362] 在一方面，提供了一种治疗方法，包括：选择第一治疗阶段和第二治疗阶段；在在第一阶段，对人施用总共n次第一组合物，所述第一组合物包括编码抗原的第一复制缺陷型
腺病毒载体，所述抗原诱导人对表达MUC1-C、Schruchy或CEA抗原的细胞的免疫应答；以及
在在第二阶段，给人施用总共m次的第二组合物，所述第二组合物包括编码抗原的第二复制
缺陷型腺病毒载体，所述抗原能够诱导针对在人体内表达MUC1-C、Brachyury或CEA抗原的
细胞的免疫应答；其中在第一阶段、第二阶段或两者期间施用包括免疫途径检查点调节剂
的分子组合物。
[0363] 一方面，提供了一种治疗有此需要的受试者的方法，包括给受试者施用：(a)重组复制缺陷型腺病毒载体，其编码(I)MUC1-C抗原，(ii)Brachyury抗原，或(iii)至少两种选
自MUC1-C抗原、Brachyury抗原和CEA抗原的抗原；和(b)包括免疫途径检查点调节剂的分子
组合物；从而在受试者中产生免疫应答。在一些实施例中，(a)和(b)是串联施用的。在一些
实施例中，(a)和(b)同时施用。在一些实施例中，(a)和(b)间隔一个月施用。
Ad5疫苗的剂量和施用
[0364] 本文所述的组合物和方法考虑了治疗期间的各种剂量和施用方案。患者可以接受一种或多种复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体，例如Ad5[E1-,E2B-]-CEA(6D)，其能够在个体
中靶向本文所述的靶抗原产生免疫应答。患者还可以接受一种或多种复制缺陷型腺病毒或
腺病毒载体，例如Ad5[E1-,E2B-]-CEA(6D)、Ad5[E1-,E2b-]-MUC1、Ad5[E1-,E2b-]-MUC1c、
Ad5[E1-,E2b-]-MUC1n、或Ad5[E1-,E2b-]-T(i.e.,Ad5[E1-,E2b-]-短尾)，其能够在个体中
针对本文所述的靶抗原产生免疫应答。在各种实施例中，复制缺陷型腺病毒以适于实现这
种免疫应答的剂量施用。在一些情况下，复制缺陷型腺病毒的施用剂量应大于或等于每次
免疫1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x 109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 
1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010、1x 1011、2x 1011、3x 
1011、4x 1011、5x 1011、6x 1011、7x 1011、8x 1011、9x 1011、1x 1012、1.5x 1012、2x 1012、3x 
1012、4x 1012、5x 1012或更多个病毒颗粒(VP)。在一些情况下，复制缺陷型腺病毒的施用剂量应小于或等于每次免疫1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x 109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 
109、1x 1010、2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010、1x 1011、
2x 1011、3x 1011、4x 1011、5x 1011、6x 1011、7x 1011、8x 1011、9x 1011、1x 1012、1.5x 1012、2x 
1012、3x 1012、4x 1012、5x 1012或更多个病毒颗粒。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒以每次免疫1x 109-5x 1012个病毒颗粒的剂量施用。在一些实施例中，组合物包括至少1.0x 
11 11 11 11 11 11 11 11
10 、2.0x 10 、3.0x 10 、3.5x 10 、4.0x 10 、4.5x 10 、4.8x 10 、4.9x 10 、4.95x 
1011或4.99x 1011个病毒颗粒，所述病毒颗粒包括重组核酸载体。在一些实施例中，组合物
包括至多7.0x 1011、6.5x 1011、6.0x 1011、5.5x 1011、5.2x 1011、5.1x 1011、5.05x 1011或
5.01x 1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括1.0x 1011-7.0x 1011或1.0-5.5x1011
11 11
个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.5x 10 -5.5x 10 个病毒颗粒。在一些实施例
中，组合物包括4.8x 1011-5.2x 1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.9x 1011-
5.1x 1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.95x 1011-5.05x 1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.99x 1011-5.01x 1011个病毒颗粒。
[0365] 在各种实施例中，本文所述的所需剂量在合适体积制剂缓冲液中施用，例如约0.1-10mL、0.2-8mL、0.3-7mL、0.4-6mL、0.5-5mL、0.6-4mL、0.7-3mL、0.8-2mL、0.9-1.5mL、
0.95-1.2mL、或1.0-1.1mL的体积。本领域技术人员可以理解，体积可以落在由这些值中的
任何一个限定的任何范围内(例如，大约0.5mL到大约1.1mL)。可以通过多种合适的施用途
径施用病毒颗粒，例如可以通过注射(例如皮内、皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如抽吸)、丸剂形式(例如吞咽、阴道或直肠施用栓剂)施用。在一些实施例中，皮下递送可能是优选的，并且可以提供对树突细胞的更大接触。
[0366] 可以重复给个体施用病毒颗粒。病毒颗粒的重复递送可以按照时间表进行，或者可以根据需要进行。例如，个体对靶抗原(例如CEA)的免疫力可以在必要时通过额外的递送
进行测试和补充。在一些实施例中，递送时间表包括定期施用病毒颗粒。联合施用方案可以
设计为包括一个或多个在施用前评估的具有时间表的时期和/或基于需要的施用时期。例
如，治疗方案可以包括施用，例如每三周皮下施用一次，然后每三个月进行另一次免疫疗
法，直到由于包括死亡在内的任何原因而退出治疗。另一个实施例方案包括每三周三次施
用，然后每三个月另一组三次免疫疗法。另一个实施例方案包括具有第一频率的第一施用
次数的第一时段、具有第二频率的第二施用次数的第二时段、具有第三频率的第三施用次
数的第三时段等，以及根据需要任选地一个或多个施用次数不确定的时期。每个时期的施
用次数可以独立选择，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20或更多。每个时期的施用频率也可以独立选择，例如可以是大约每天、每隔一天、每三天、每周两次、每周一次、每隔一周一次、每隔三周一次、每月一次、每隔六周一次、每隔一个月一次、每隔三个月一次、每隔四个月一次、每隔五个月一次、每隔六个月一次、每年一次等。
该治疗可持续长达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、30、36个月或更长时间。免疫接种之间的预定间隔可以修改，使得免疫接种之间的间隔
修改高达间隔的五分之一、四分之一、三分之一或一半。例如，对于3周的间隔时间表，免疫接种可以在20到28天(3周-1天到3周+7天)之间重复。对于前3次免疫接种，如果第二次和/
或第三次免疫接种延迟，则随后的免疫接种可以改变，从而在两次免疫接种之间允许最小
量的缓冲。例如，对于三周间隔时间表，如果免疫接种延迟，则后续免疫接种可安排为不早
于前一次免疫接种后的17、18、19或20天进行。
[0367] 诸如Ad5[E1-,E2B-]-CEA(6D)病毒颗粒的组合物能够在各种状态下提供，例如在室温、冰上或冷冻下。组合物可以在合适尺寸的容器(例如2mL小瓶)中提供。在一个实施例
中，装有1.0mL可提取疫苗的2ml小瓶容纳5x 1011个总病毒颗粒/mL。包含温度和湿度的储存
条件可能会有所不同。例如，用于治疗的组合物可以储存在室温、4℃、-20℃或更低的温度
下。
[0368] 在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物，对接受治疗的个体进行一般评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。
[0369] 一般评估可包括以下中的一项或多项：病史、ECOG表现评分、Karnofsky表现状态和主治医生的完整的体重体检。可以记录患者自上次就诊以来正在接受或已经接受的任何
其他治疗、药物、生物制品或血液制品。在接受疫苗以监测任何不良反应后，可以在诊所对
患者进行适当的随访，例如大约30分钟。可在选定的时间内每天评估每剂疫苗后的局部和
全身反应性，例如3天(免疫当天和之后2天)。日记卡可以用来报告症状，尺子可以用来测量
局部反应性。可以评估免疫注射部位。可以对胸部、腹部和骨盆进行CT扫描或MRI。
[0370] 在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物，对接受治疗的个体进行血液学和生物化学评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、
3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测
试。血液学和生化评估可包括一项或多项血液化学和血液学测试、CBC鉴别、钠、钾、氯、二氧化碳、BUN、肌酐、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT、葡萄糖和ANA。
[0371] 在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行生物标志物评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。
相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。
[0372] 生物标志物评估可以包括从足够体积的血清样品中测量针对CEA或Ad5载体的抗体中的一种或多种，例如，如果确定并且可用，可以检查大约5ml的生物标志物(例如CEA或
CA15-3)。
[0373] 在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行免疫评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。
[0374] 例如，可以在每次免疫之前和至少一些免疫之后的某个时间抽取大约90mL的外周血，以确定在研究期间和/或特定数量的免疫之后的特定时间点是否对免疫应答有影响。免
疫学评估可以包括使用ELISpot、增殖分析、多参数流式细胞分析和细胞毒性分析中的一种
或多种来分析外周血单核细胞(PBMC)对CEA的T细胞应答。每次采血的血清可以存档、发送
和测定。
[0375] 在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行肿瘤评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。肿瘤评估可
以包括在治疗前、在至少一些免疫接种后以及在完成选定数量的第一次治疗(例如2、3或4
次)后的大约每三个月，然后对胸部、腹部或骨盆进行一次或多次CT或MRI扫描，例如直到从
治疗中移除为止。
[0376] 针对本文所述的靶抗原如CEA的免疫应答可以使用一种或多种合适的免疫应答测试，如ELISpot、细胞因子流式细胞术或抗体应答，从样品如个体的外周血样品中评估。阳性免疫应答可以通过测量T细胞反应来确定。如果六个有抗原的孔中根据背景调节的斑点的
平均数量比六个对照孔中的斑点数量多10个，并且使用学生的T检验，六个有抗原的孔和六
个对照孔的单个值之间的差异在p≤0.05的水平上具有统计学意义，则可以认为是阳性的。
在每次免疫前和治疗期间的预定时间点可以进行免疫原性分析。例如，即使此时不进行计
划免疫，也可以在大约第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第18周、第20周、第24周、第30周、第36周或第
48周计划免疫原性分析的时间点。在某些情况下，如果个体接受了至少最低数量的免疫接
种，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次免疫接种，则可以认为该个体的免疫应答是可评估的。
[0377] 在一些实施例中，在患有可测量/可评估疾病的患者中，根据RECIST 1.1标准进行疾病恶化或临床反应确定。在一些实施例中，使用本文所述的方法和成分的治疗影响接受
治疗的个体的完全应答(CR；靶向病变的所有靶向病变消失或所有非靶向病变消失以及非
靶向病变的肿瘤标志物水平的正常化)。在一些实施例中，使用该方法和组合物的治疗影响
部分应答(PR；在接受治疗的个体中，目标病变的总LD至少减少30％，以目标病变的基线和
LD作为参考)。
[0378] 在一些实施例中，使用该方法和组合物的治疗在接受治疗的个体中影响稳定疾病(SD；既没有足够的收缩以符合PR，也没有足够的增加以符合PD，以自针对靶病变的治疗开
始以来的最小总和LD作为参考)。在一些实施例中，使用本文所述方法和组合物的疗法影响
不完全应答/稳定疾病(SD；接受该疗法的个体持续存在一种或多种非靶病变或/和维持肿
瘤标志物水平高于非靶病变的正常限度)。在一些实施例中，使用本文所述方法和组合物的
疗法影响渐近性疾病(PD；在接受治疗的个体中，靶病变的总LD至少增加20％，以自治疗开
始以来记录的最小LD总和或出现一个或多个靶病变的新病变或一个或多个非靶病变的持
续或/和肿瘤标志物水平维持在非靶病变的正常极限之上为参考)。
使用Ad5疫苗和ALT-803进行联合治疗的试剂盒
[0379] 可以试剂盒的形式提供组合物、免疫疗法或疫苗。某些实施例提供了用于在个体中产生免疫应答以对抗传染病和癌症的组合物、方法和试剂盒。某些实施例提供了用于产
生针对靶抗原或表达或呈递靶抗原或包含至少一种靶抗原的靶抗原标记的细胞的免疫应
答的组合物、方法和试剂盒。试剂盒还可以包括关于剂量和/或施用的说明，包括治疗方案
信息。在一些实施例中，说明书是说明治疗增殖性疾病或癌症。在一些实施例中，说明书是
说明治疗传染病。
[0380] 在一些实施例中，试剂盒包括用于提供联合Ad5-CEA疫苗和ALT-803的组合物和方法。在一些实施例中，试剂盒还可以包括用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备组分
的说明。在一些实施例中，试剂盒还可以包括用于在治疗前后通过适当的实验室测试对患
者进行监测，或者与医务人员交流结果和患者数据的软件。在一些实施例中，试剂盒包括多
个有效剂量的Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗和多个有效剂量的ALT-803。
[0381] 一方面，提供了一种用于诱导人体免疫应答的试剂盒，其包括：组合物，该组合物包括体积在0.8mL-1.2mL范围内的治疗溶液，该治疗溶液包括至少1.0×1011个病毒颗粒；其
中病毒颗粒包括重组复制缺陷型腺病毒载体；组合物，该组合物包括分子组合物的治疗溶
液，该分子组合物包括免疫途径检查点调节剂和；说明。
[0382] 在一些实施例中，治疗溶液包括1.0x 1011-5.5x 1011个病毒颗粒。在一些实施例中，腺病毒载体能够在转染细胞中实现修饰的CEA的过表达。在一些实施例中，治疗溶液包
括第一复制缺陷型腺病毒载体、第二复制缺陷型腺病毒载体和第三复制缺陷型腺病毒载
体，每个载体包括选自CEA及其组合的抗原。在一些实施例中，腺病毒载体包括编码抗原的
核酸序列，所述抗原诱导靶向人体内表达CEA的细胞的特异性免疫应答。
[0383] 在一些实施例中，试剂盒进一步包括免疫原性组分。在一些实施例中，免疫原性组分包含选自IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-
10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。在一些实施例中，免疫原性组分选自IL-7、编码IL-7的核酸、与IL-7基本相同的蛋白质和编码与IL-7基本相同的蛋白质的核酸。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括IL-15、编码IL-15的核酸、与IL-14基本相同的蛋白质
或编码与IL-15基本相同的蛋白质的核酸。
[0384] 组成试剂盒的组分可以是干的或液体的形式。如果它们是干的形式，试剂盒可以包括溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可以包括液体或干的形式的转移因子。如果转移因子
为干的形式，试剂盒将包括溶解转移因子的溶液。所述试剂盒还可以包括用于混合和制备
所述组分的容器。所述试剂盒还可以包括用于辅助施用的仪器，例如针头、导管、敷贴器、吸入器、注射器、移液管、镊子、测量勺、滴管或任何此类经医学批准的载体。在一些实施例中，本文所述的试剂盒或药物递送系统还包括用于容纳本文所公开的组合物的装置，该组合物
封闭用于商业销售和分销。
实例
[0385] 以下实例被包括在内以进一步描述本发明的一些方面，并且不应当用来限制本披露的范围。
实例1
肽和载体
[0386] 本实施例描述了肽和载体。以下HLA-A2和HLA-A24结合肽用于本实例和其他实例:(a)HLA-A2结合CEA激动肽CAP1-6D(YLSGADLNL(SEQ ID NO:4))。所有肽的纯度都大于96％。
[0387] 构建和产生Ad5[E1-,E2b-]-CEA。简言之，使用基于同源重组的方法将转基因亚克隆到Ad5[E1-,E2b-]载体的E1区。复制缺陷病毒在E.C7包装细胞系中繁殖，CsCl2纯化，并进
行效价测定。将病毒感染滴度确定为E.C7细胞单层上的噬斑形成单位(PFU)。采用十二烷基
硫酸钠(SDS)破坏法和分光光度法在260nm和280nm处测定VP浓度。CEA转基因也包含修饰的
CEA，其包含高度免疫原性的表位CAP1-6D。
实例2
临床级多靶向疫苗的GLP生产
[0388] 本例显示了使用良好实验室规范(GLP)标准生产临床级多靶疫苗。以前，Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)产物是根据良好的生产实践标准，在GLP条件下使用5L细胞生物反应器生产
的。该实例表明，可以在5L细胞生物反应器中使用类似方法生产Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C和
Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury产品。
[0389] 简而言之，将E.C7生产细胞系的小瓶解冻，转移到T225烧瓶中，并最初在37℃下在含有10％FBS/4mM L-谷氨酰胺的DMEM 5％CO2中培养。扩增在之后，E.C7细胞将使用10层细
胞堆(CS-10)进行扩增，并转移到自由式无血清培养基(SFM)。E.C7细胞将在SFM中培养24小
时，在37℃、5％CO2中培养至细胞生物反应器中的目标密度为5x 105个细胞/mL。然后将E.C7细胞分别用Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C或Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury感染，并培养48小时。
[0390] 中流处理将以与根据IND14325制备临床级Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)产品相同的方式进行。收获前30分钟，将全能核酸酶加入培养物中，以促进更好的细胞沉淀浓缩。离心沉
淀后，丢弃上清液，在室温下将颗粒重新悬浮在含1％聚山梨酯-20的裂解缓冲液中90分钟。
然后用核酸酶处理裂解液，并通过添加5M NaCl使反应猝灭。将对浆液进行离心，并丢弃沉
淀。将通过过滤澄清裂解液，并进行双柱离子交换程序。
[0391] 为了纯化疫苗产物，将进行双柱阴离子交换程序。第一个柱将用Q Sepharose XL树脂填充，消毒，并用加载缓冲液平衡。将澄清后的裂解液装入柱，并用缓冲液清洗。对疫苗产物进行洗脱，并将包括Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C或Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury在内的主要
洗脱峰(洗脱液)转入下一步。第二个柱将用源15Q树脂填充，消毒，并用加载缓冲液平衡。将第一个阴离子交换柱的洗脱液装载到第二个柱上，疫苗产物以梯度洗脱，从100％缓冲液A
(20mM Tris，1mM MgCl2，pH 8.0)开始，运行到50％缓冲液B(20mM Tris，1mM MgCl2，2M 
NaCl，pH 8.0)。将收集包括Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C或Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury在内的洗
脱峰，并在2℃-8℃下储存过夜。峰洗脱部分将通过切向流过滤(TFF)系统进行浓缩，并用配
制缓冲液(20mM Tris、25mM NaCl、2.5％(v/v)甘油、pH 8.0)进行透析。最后的疫苗产物经
处理后，无菌过滤，分装成等分样品，并在≤-60℃下贮存。通常生产接近100％纯度的高纯
度产品，并预测这些产品的类似结果。
[0392] 用分光光度法测定VP产品的浓度和总量。用高效液相色谱法测定产品纯度。通过使用试剂盒对感染颗粒进行Ad5 hexon染色检测来确定感染活性。
[0393] 将使用来自载体转染的A549细胞的裂解液进行蛋白质印迹，以验证mMUC1-C或Brachyury表达。将进行质量控制测试，以确定最终疫苗产物不含支原体，没有微生物生物
负担，并显示内毒素水平低于每mL 2.5个内毒素单位(EU)。为了证实免疫原性，将如下所述
在小鼠中测试单个载体(实例8)。
实例3
Ad5[E1-]-CEA(6D)疫苗联合ALT-803治疗的临床前研究
[0394] 本实例描述了Ad5[E1-]-CEA(6D)疫苗联合ALT-803治疗的临床前研究。于携带CEA表达肿瘤的CEA转基因小鼠中对商业化获得的与ALT-803注射组合的含有CEA的Ad5载体
(Ad5[E1-]-CEA)进行评估。图2A举例说明了本研究中使用的肿瘤植入和给药方案。将表达
鼠MC32-CEA肿瘤细胞的CEA植入各组小鼠(第0天)。一组没有接受治疗。第二组分别在第10
天和第17天单独注射ALT-803(1μg SC)。第三组分别在第7、14和21天注射Ad5[E1-]-CEA
(1x1010 VP SC)。第四组分别(A)在第7、14和21天注射Ad5[E1-]-CEA，(B)在第10和17天注射ALT-803。
[0395] 监测所有小鼠的肿瘤生长，并在35天内测量肿瘤体积。当肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠实施安乐死。如图2B所示，当小鼠在第10天和第17天单独注射ALT-803时，与未经治疗的对照小鼠相比，存活率没有差异。同样，当小鼠在第7、14和21天单独注射Ad5[E1-]-
CEA时，与未经治疗的对照小鼠相比，存活率没有差异。然而，当小鼠在第7、14和21天首先注射Ad5[E1-]-CEA，然后在第10和17天注射ALT-803时，观察到存活率的差异。20％未治疗的
对照小鼠在35天存活，相比之下，60％的Ad5[E1-]-CEA/ALT-803治疗的小鼠存活。这些结果
表明，先用Ad5[E1-]-CEA疫苗诱导针对CEA的抗肿瘤免疫应答，然后用ALT-803治疗，可以增
强抗肿瘤免疫应答。
实例4
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗联合ALT-803治疗的临床前研究
[0396] 本实施例描述了Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗联合ALT-803治疗的临床前研究。在携带表达CEA的肿瘤的CEA转基因小鼠中对与ALT-803注射组合的含CEA的Ad5载体(Ad5
[E1-,E2b-]-CEA)进行了评估。各组小鼠植入106个表达CEA的鼠MC38-CEA肿瘤细胞(第0
天)。将小鼠分成4个独立的组(每组n＝10)。一组在第1天、第7天和第14天皮下注射不含抗
原的Ad5[E1-,E2b-]-无效载体，剂量为1x1010 VP(SC)。第二组在第1天、第7天和第14天以1x 
1010VP SC的剂量注射不含抗原的Ad5[E1-,E2b-]-无效载体，并在第4天、第11天和第18天单
独注射ALT-803(4μg SC)。第三组在第1天、第7天和第14天接受1x 1010VP SC剂量的Ad5
[E1-,E2b-]-CEA载体注射。第四组在第1天、第7天和第14天接受了1x 1010VP SC剂量的Ad5
[E1-,E2b-]-CEA载体注射，并在第4天、第11天和第18天单独接受了ALT-803(1μg SC)的注
射。
[0397] Ad5[E1-,E2b-]-无效和Ad59E1-，E2b-]-CEA疫苗分别在第1天、第7天和14天进行施用。ALT-803分别在第4天、第11天和第18天进行施用。监测所有小鼠的肿瘤生长，并在35
3
天内测量肿瘤体积。当肿瘤的体积大于1500mm时，将对小鼠实施安乐死。在图3中示出了55
天时段的存活率。以含有ALT-803的Ad5[E1-,E2b-]-无效进行施用的组的存活率为50％。仅
施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗施用的组的存活率为70％。以含有ALT-803的Ad5[E1-,E2b-]-
CEA疫苗施用的组的存活率最高，为90％。这些结果表明，可以通过首先用Ad5[E1-,E2b-]-
CEA疫苗免疫以诱导针对CEA的抗肿瘤免疫应答，再用ALT-803治疗可以增强免疫应答。
实例5
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗与ALT-803联合疗法的第1b阶段和2阶段临床研究
[0398] 本实例描述了评估Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和IL-15超激动剂ALT-803组合治疗的第1b阶段和第2阶段的临床研究。参加临床研究的受试者患有表达癌胚抗原(CEA)的癌
症。先前已对受试者于先前接受过针对局部晚期或表达CEA的转移性癌症的治疗。临床研究
包括1b期组，其中Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗以固定剂量施用，除非需要降低剂量，否则
将配合使用ALT-803进行剂量加大。第2阶段组将包括额外的对MTD(MTD)的安全性研究和已
知表达CEA的几种适应症的初步疗效数据。第1b阶段研究的主要目标是：在经过标准护理后
肿瘤复发的具有表达CEA的的癌症受试者中确定Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803联
合治疗的剂量极限毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)。第2阶段研究的主要目的是：在经过标
准护理后肿瘤复发的具有表达CEA的的癌症受试者中，确定Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗加
ALT-803联合治疗的MTD剂量的总体安全性和耐受性。在下列已知表达CEA的适应症中，初步
评估Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗加ALT-803联合治疗的MTD剂量的总体应答率(ORR)：(1)
组织学上证实了不可切除的局部晚期或转移性CEA表达型甲状腺髓样癌，并至少在卡博替
尼或凡德他尼的药物治疗下进展，(2)组织学上证实了不可切除的局部晚期或转移性CEA表
达型结肠癌，并已至少在一种FOLFIRI或基于FOLFOX的先前标准治疗中有所进展，(3)组织
学上证实了不可切除的局部晚期或转移性CEA表达型卵巢癌，并已至少在一种先前基于标
准疗法的联合疗法上有所进展，(4)组织学上证实了不可切除的局部晚期或转移性CEA表达
型乳腺癌，并已至少在一种先前基于标准疗法的联合疗法上有所进展，(5)组织学上证实了
不可切除的局部晚期或转移性CEA表达型肺癌，并已至少在一种先前基于标准疗法的联合
疗法上有所进展，(6)组织学上证实了不可切除的局部晚期或转移性CEA表达型胰腺癌，并
已至少在一种先前基于标准疗法的联合疗法上有所进展，而且(7)组织学上还证实了其他
不可切除的局部晚期或转移性CEA表达型癌症，并已至少在一种先前基于标准疗法的联合
疗法上有所进展。
[0399] 临床研究的次要目标包括上述适应症中Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803联合疗法的MTD剂量的应答持续时间，无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)的初步评估。
临床研究的探索性目标包括评估Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803联合疗法治疗的
过程中针对CEA的免疫原性，以及确定受试者肿瘤的基因组，转录组和蛋白质组学特征以鉴
定基因突变、扩增、RNA和蛋白质的表达水平。评估了基因组、转录组和蛋白质组学特征与疗效结果之间的相关性。其他探索性目标包括确定肿瘤分子谱以及与安全性和功效的相关
性，以及使用基因组学评估循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA)的变化。
[0400] 剂量递增。研究依据药物临床试验质量管理规范(GCP)进行，并涉及之前确定的Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗的安全剂量(5x 1011个病毒颗粒(VP)/剂量)。在第1b阶段研究
中，ALT-803剂量依据标准3+3设计逐步增加。剂量水平包括(1)1级：Ad5[E1-,E2b-]-CEA
11
(6D)疫苗(5×10 个VP/剂量)与ALT-803(10μg/kg/剂量)和(2)2级：Ad5[E1-,E2b-]-CEA
(6D)疫苗(5×1011个VP/每剂量)与ALT-803(15μg/kg/剂量)。如果需要的话，Ad5[E1-,
E2b-]-CEA(6D)疫苗的剂量可依据需要降低至1×1011个VP/剂量。如果需要的话，ALT-803的
剂量可依据需要降低为6μg/kg/剂量。
[0401] 3至6名受试者按顺序接受了Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗固定剂量的施用，并逐步增加ALT-803的施用剂量。准备了两种ALT-803剂量水平，分别为10ug/kg/剂量和15ug/
kg/剂量(可依据需要降低降级剂量)。在每个检验组登记期间，连续受试者之间至少有7天
的登记间隔期。治疗过程中对DLT进行持续监测。在第2阶段中，具有CEA表达型症状的受试
者将接受MTD的治疗。
[0402] 结束点。第1b阶段研究的主要终点包括DLT和MTD。第2阶段研究的主要终点包括治疗紧急不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)、安全实验室测试、体检、心电图(ECG)和生命体
征的临床显著变化。次要终点包括应答持续时间，无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)。
探索性终点包括通过T细胞的频率、激活状态、细胞因子谱和CEA抗体、腺病毒抗体水平、针
对IL-15N72D:IL-15RαSu/IgG1 Fc复合物的潜在抗体的形成情况的流式细胞术和ELISpot
分析来评估Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗的免疫性和，肿瘤分子谱(基因组，转录组和蛋白
质组学)与安全性和有效性的相关性，以及由基因专家组评估循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环
肿瘤RNA(ctRNA)的变化。
[0403] 受试者人数。有12名受试者被纳入第1b阶段研究，从1级剂量开始，3至6名受试者依次被纳入研究。在第2阶段研究中，每种适应症最多招募20名受试者，并按照第1b阶段确
定的MTD进行治疗。在MTD下接受治疗的，来自第1b阶段研究的受试者适当纳入了第2阶段的
纳入目标。
[0404] 治疗持续时间。受试者在三周的周期内接受计划的三个周期的治疗(总共八周)。除非受试者正经历进行性疾病(PD)、DLT、撤回同意书或者若确定其不再符合自身在医学上
最佳利益，否则将继续接受治疗。
[0405] 终点评估安全终点包括DLT和MTD的评估，紧急治疗中的治疗紧急不良事件(AE)、严重不良事件(SAE)以及安全实验室测试的临床上显着变化，例如ECG，体检和生命体征的
变化。使用国家癌症研究(NCI)所常见不良事件评价标准(CTCAE)4.03版确定毒性。
[0406] 根据实体肿瘤疗效评价标准(RECIST)1.1版本来确定肿瘤反应；还评估了应答持续时间，无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)。探索性免疫分析包括了通过流式细胞仪和
ELISpot来检测和定量T细胞免疫应答。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定CEA，腺病毒抗
体水平和针对IL-15N72D:IL-15RαSu/IgG1 Fc复合物的潜在抗体形成情况。分子做谱和分
析以如下步骤进行。对来自组织的肿瘤细胞相对于来自全血的非肿瘤细胞的基因组测序进
行分析，以鉴定可能有助于反应或疾病进展的基因组变异，并提供对分子异常的更深理解。
进行RNA测序可提供表达数据并将其与DNA突变相关联。进行定量蛋白质组学分析以确定特
定蛋白质的确切数量，并确认与应答和疾病进展相关的基因表达。所有基因组，转录组和蛋
白质组学分子的分析均具有可回顾性和探索性。收集血浆，用PCR检测表达水平且直接检测
循环DNA和RNA的融合基因和突变。
受试者合格性
[0407] 受试者的合格性由纳入选准和排除标准确定。受试者入选标准包括以下条件:(1)年龄≥18岁，(2)经组织学确诊患有局部晚期或转移性恶性肿瘤，先前曾接受过至少一种已
知可能具有存活益处的标准治疗方法或拒绝过这种治疗，(3)肿瘤必须依据免疫组织化学
染色的定义进行CEA表达(即至少50％的肿瘤具有至少中等程度的染色强度)，或者必须已
知其普遍为CEA阳性(即结肠癌和直肠癌)。对于入选标准(3)，如果CEA表达型癌症是结直肠
癌，则需要腺癌的病理或临床确认。数据应从原发部位或可获得的最新转移活检样品中得
出。重要的是，受试者必须(4)：在最近一次抗癌治疗结束后获得的FFPE肿瘤活检样本，并愿意将该标本进行肿瘤分子做谱。若无可用样本，试验对象应于筛选期内自愿接受活体组织
检查。本研究中，采集用于基因筛查的肿瘤组织以及全血，对于第1b阶段是选择性的，对于
第2阶段则是必须的。进一步的入选标准包括以下条件：(5)试验对象若在先前接受过CEA靶
向免疫疗法(即接种疫苗或抗体)，该治疗应于试验对象参加本次试验至少3个月前终止，试
验对象方可参加本次试验，(6)确认先前所接受之化疗、放疗、以及手术的毒副反应相对于
国家癌症研究所常见不良事件评价标准(NCI CTCAE)≤1，(7)能够理解并提供一份遵循伦
理审查委员会(IRB)方针的，签署姓名的知情同意书，(8)ECOG活动状态评分为0或1，(9)正
在服药的试验对象，若无已知的免疫抑制史，则可参加本次试验，(10)筛选期血液功能充
足，具体要求如下：白细胞≥3000/μL、血红蛋白≥9g/dL(可通过输血或促红细胞生成素达
到此水平)、血小板≥75000/μL、凝血酶原(PT)国际标准化比值(INR)<1.5、部分凝血酶原时间(PPT)<1.5×正常上限值(ULN)、以及(11)筛选期肝肾功能充足，具体要求如下：血肌酐<
2.0mg/dL、胆红素<1.5mg/dL(除开因Gilbert综合症导致的胆红素≤2.0mg/dL的试验对
象)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)≤2.5×ULN、以及谷草转氨酶(AST)≤2.5×ULN。入选标准
(12)包含的条件有：有生育能力的女性以及绝经时间小于12个月的女性，在研究期间以及
最后一次研究药物注射后的7个月内，研究对象必须同意采取可接受的措施以避免受孕。如
要采用避孕措施，以下措施中必须同时采用两种：配偶采取输精管切除术、女性采取输卵管
结扎术、阴道避孕隔膜、子宫避孕装置、避孕套以及具有杀精作用的(凝胶、泡沫、乳霜、阴道栓剂)，或者完全禁欲。男性试验对象必须进行绝育手术或同意与配偶使用避孕套以及其他
的可接受的避孕措施。已经历了更年期，且被确定持续停经大于12个月的女性试验对象。最
后，根据入选标准(13)的要求，所有试验对象必须能够参加要求的研究访问并且反馈足够
的跟进信息。
[0408] 排除标准如下：(1)在本研究筛选期30天内参加了其他药物或设备试验，(2)怀孕或处于哺乳期的妇女，(3)正在接受依维莫司或其他干扰免疫应答的抗癌药物治疗的受试
者，和(4)接受具有细胞毒性的化疗或放疗的受试者。根据(4)，研究对象所接受的化疗或放
疗必须与本研究的治疗之间间隔至少一个月。任何接受CEA靶向免疫疗法(疫苗)的对象，必
须于本研究治疗开始前至少3个月停止接受治疗。在进入本研究的筛选期之前，研究对象必
须已从上一次治疗的毒副作用中完全恢复。进一步的排除标准包括：(5)活跃的脑部或中枢
神经系统癌细胞扩散患者，使用抗惊厥药物的癫痫患者，6个月内有脑血管突发疾病的患
者，以及短暂性脑缺血患者，(6)有自身免疫性疾病或相关病史的患者，包括但不限于炎症
性肠病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、或多发性硬化(允许自身免疫性相关甲状腺疾病与白癜风患者)，(7)患有并发慢性或急性疾病者，如心肺部疾病、肝部疾病、或其他
研究人员认为在药物研究治疗中具有高风险性的疾病患者，(8)有心脏病史的患者，如心力
衰竭(纽约心脏病协会功能评级心功能II、III、IV级)，不稳定或不受控制的心绞痛，或病史小于1年的心律不齐，(9)因医学障碍或精神障碍而无法接受根据协议进行的试验治疗、访
问或过程，或无法遵循协议的患者，(10)恶性肿瘤病史患者，以下除外：经充分治疗的分黑
色素瘤皮肤癌患者、宫颈原位癌患者、表浅性膀胱癌患者以及其他处于缓解期且超过五年
未进行其他治疗的癌症患者，(11)存在活跃的急性或慢性感染病患者，包括人体免疫缺陷
病毒(HIV，由酶联免疫吸附试验[ELISA]和蛋白质印记法测定),以及乙型肝炎病毒和丙型
肝炎病毒(HBV/HCV，由乙型肝炎表面抗原[HBsAg]和丙型肝炎血清学测定)，以及(12)接受
静脉注射或口服类固醇治疗(或其他免疫抑制剂，诸如硫唑嘌呤或环孢霉素A)的患者，基于
潜在免疫抑制的因素而被排除在外。根据排除标准(12)，研究对象在参加研究前，应停止接
受任何类固醇治疗(化疗或造影增强研究的术前用药除外)6周或6周以上。排除标准包含，
(13)对试验药物有任何已知过敏症状或过度敏感反应的患者，(14)患有干扰皮肤注射或潜
在皮肤反应评估的急性或慢性皮肤病患者，以及(15)于预计剂量Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)
疫苗或ALT 803接种或注射的28天内接种活体疫苗(如 )，或14天内接种灭活/亚
基疫苗(如 )的患者。
治疗程序
[0409] Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗以一瓶2mL的单次剂量瓶提供。每单次剂量瓶包含针对单剂量施用的5x 1011个VP的Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗无菌悬浮液以及包含ARM配制
缓冲液(TRIS 20mM、NaCl 25mM、甘油2.5％、pH值8.0)。每瓶容纳疫苗约1.3mL。
[0410] ALT-803为用于皮下注射的无菌溶液形式。ALT-803浓度为每1mL 1.2mg(1.2mg/mL)，并含有磷酸盐缓冲液(氯化钠8.18g/L(USP))；磷酸氢二钠1.43g/L(USP)；磷酸二氢钾
1.36g/L，pH值7.4(NF)。每瓶含有ALT-803约1.2mL。药品在使用前，在2℃-8℃下贮存。
[0411] 贮存。Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗使用前，在≤-20℃的冷柜中贮存。ALT-803使用前，在2℃-8℃环境中贮存。
[0412] 剂量制备。准备注射的Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗是5×1011个VP(组1及2)或1x 1011个VP(剂量水平-1)/1mL。注射前，将符合条件的瓶从冰箱中取出，使其在温度受控室内
(20℃-25℃)解冻至少20分钟且不超过30分钟，然后将其温度保持在2℃-8℃。每个瓶都用
橡胶塞堵住，并带有白色翻盖。瓶的橡胶塞经过铝压封口处理。将解冻的瓶摇匀后，在无菌
技术条件下，用1mL注射器在符合条件的瓶中抽取适量体积。使用1到1/2英寸，20到25规格
的针头，尽快注射疫苗试剂。在瓶中，2℃-8℃储存的疫苗储存时长不超过12小时，并且疫苗一经解冻，就不会再次冷冻。
[0413] 剂量制备：5x 1011个病毒颗粒。从瓶中抽取1mL试剂且注射部位经过酒精处理。该剂量通过在大腿皮下(SC)注射接种到受试者体内，无需任何进一步的操作。
[0414] 剂量制备：1x 1011个病毒颗粒。使用1mL结核菌素注射器，从具有0.9％无菌生理盐水的5.0mL的瓶中除去1.0mL流体，剩余4mL。使用另外一支1.0mL结核菌素注射器，抽从装有
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗的小瓶中取出1mL，然后添加到5mL无菌盐水瓶中剩余的4mL无
菌盐水中。通过倒置5mL稀释的Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗溶液来混合内容物。抽取1mL 
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗稀释溶液且注射部位经酒精处理，通过在大腿皮下(SC)注射
接种到受试者体内。
[0415] ALT-803剂量制备。ALT-803剂量计算基于实际体重。将计算出的ALT-803的量吸入注射器/或皮下注射。储备物浓度为1mg/mL。将剂量直接吸入注射器进行注射。
[0416] 施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗对门诊患者在第0、3和6周进行总计三(3)次免疫。所有研究药物施用治疗均在计划随访日期的±5天内发生。在用酒精处理部位后，通过
在大腿内SC注射来进行疫苗的所有免疫接种。在之前的第1/2阶段研究中报告了用Ad5
[E1-,E2b-]-CEA(6D)进行注射部位反应，并在研究过程中对其进行了监测。左右侧大腿都
可用于最初的注射。之后也在同一侧大腿上注射，且两次注射部位至少相距5厘米。经第一
次注射后，受试者接受60分钟的临床观察；之后的注射后，受试者接受30分钟临床观察，用
以评估受试者的生命表征和监控注射部位的反应。第一次注射30分钟和60分钟后评估生命
体征。在随后的注射的30分钟后评估生命体征。Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗治疗后，每周
注射ALT-803一次，共两周。如果出现日程安排问题(例如，假期，恶劣的天气或其他日程安
排问题)，则允许每周一次ALT-803剂量的窗口为-1/+3天。跳过该窗口中无法容纳的任何剂
量，并且不补充该剂量。注射部位应与Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗不在同一侧肢体，并且
每个注射部位应至少间隔5厘米。ALT-803的剂量在门诊患者基础上施用。如果在监测2小时
后对第一个周期的第一剂药物耐受良好，治疗监测后30分钟施用随后的剂量。Ad5[E1-,
E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803均通过皮下(SC)注射施用。
剂量限制性毒性和最大耐受剂量
[0417] DLT定义为：(1)国家癌症研究所(NCI)不良事件评价标准(CTCAE)4.03版定义的任何3级或更高级别的毒性；或(2)任何2级或更高级别的自体免疫反应或速发型超敏反应。此
外，适用以下标准：与3级的研究治疗药物并没有明显的关系且不能在使用医疗干预后一周
内分解为1级或更低(或若受试者以2级或更高的毒性进入研究)的任何毒性，或4级毒性，但
以下情况除外：(1)任何在14天内恢复的3级或4级淋巴细胞减少症、白细胞减少症和中性粒
细胞减少症都不是DLT，(2)感染等级≥3的中性粒细胞减少症为DLT，(3)任何在14天内恢复
的3级或4级血小板减少症或贫血都不是DLT，(4)4级血小板减少症(无临床后遗症)持续时
间小于或等于1周，且/或恢复到2级或更低，都不会引发DLT，(5)≥3级伴有出血的血小板减
少为DLT，(6)72小时内用抗吐药控制的恶心或呕吐不属于DLT，(7)持续时间有限(小于72小
时)的<3级的低血压(收缩压<90mm Hg)或可采用第5.9.1章节所述的水合作用措施来控制，
不属于DLT，(8)持续>4小时，且需要住院的3级低血压为DLT。持续≤4小时及的3级低血压预
防性入院观察不是DLT，(9)等级>3的所有类型的心律失常均为DLT，(10)持续14天绝对淋巴
细胞计数(ALC)≥50000/μL为DLT，(11)持续14天白细胞(WBC)计数≥60000/μL为DLT。MTD被定义为在组中<33％的受试者中观察到的DLT发生率情况下的最高剂量水平。
[0418] 剂量递增。剂量递增如表4所示。表4-剂量水平
[0419] 组1Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗，浓度为5x 1011个VP，加10μg/kg/剂量的ALT-803。如果最初3个受试者均未经历DLT，则对组2开始剂量递增。如果最初的3个受试者中有1
个经历了DLT，则将另外3个受试者纳入组1，总共6个受试者。如果6名受试者中≤1名经历了
DLT，则对组2开始递增。如果最初的3个受试者或总6个受试者中有≥2个经历了DLT，则开始
组-1递减。
[0420] 组2Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗，浓度为5x 1011VP，加15μg/kg/剂量的ALT-803。如果最初的3个受试者中有≤1个经历了DLT，则将另外3个受试者纳入组2，总共6个受试者。
如果6个受试者中≤1个经历DLT，则此剂量水平定义为MTD。如果最初的3个受试者中有≥2
个或总6个受试者中有≥2个经历了DLT，则继续纳入更低的剂量水平。(1)如果有6个受试者
已在组1接受治疗，则该剂量被定义为MTD；(2)如果有3个受试者已在组1接受治疗，将另外3
个受试者纳入该剂量水平，共6个受试者。如果6个受试者中≤1个经历了DLT，则将该剂量定
义为MTD。如果6个受试者中≥2个经历了DLT，则开始纳入递减组-1。如果DLT与Ad5[E1-,
E2b-]-CEA(6D)疫苗相关，则剂量应减少至1×1011个VP/剂量。如果DLT与ALT-803相关，则剂
量应减少至6μg/kg/剂量。
功效评估
[0421] 存活率。受试者完成或退出研究后，每3个月追踪一次其存活状况，持续12个月，此后大约每6个月追踪一次，持续12个月。
[0422] 抗肿瘤应答肿瘤评估可能包含以下评估：体检(如可以，提供照片和皮肤病变的测量值)；使用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)扫描胸部、腹部和骨盆的横断面成像
(骨盆扫描任选，除非基准上存在已知的盆腔疾病)；对已知/疑似骨病变的受试者进行核素
骨扫描；以及对脑的CT或MRI扫描(仅基于症状/发现的临床依据)。疾病评估的优选方法是
使用造影剂的CT。如果对使用造影剂的CT禁忌，优选无造影剂的胸部CT与腹部/骨盆使用造
影剂的MRI扫描。在基线处，选择肿瘤病变并将其分类为靶病变或非靶病变。靶病变包括那
些可以在至少一维上准确测量到的病变，如常规技术≥20mm或CT扫描≥10mm。短轴直径≥
15mm的恶性淋巴结可被视为靶病变。在基线处，最多可识别出每个器官最多2个靶病变，总
共识别出5个靶病变。这些病变应代表所有涉及的器官，并应基于其大小(直径最长的器官)
及其对准确重复测量结果的适用性进行选择。计算所有靶病变的最长病变直径的总和，并
将其报告为基线总和LLD。对于识别为靶病变的恶性淋巴结，短轴直径用于LLD计算的总和。
所有其他病变(或疾病部位)应识别为非靶病变(包括骨病变)。所有基线后应答评估均遵循
基线处识别的相同病变。除非受试者的安全性需要改变(如对造影剂的过敏反应)，否则在
整个研究过程中，使用在基线时识别/评估病变相同的评估模式(例如CT)。
[0423] RECIST应答标准。根据以下概述的RECIST 1.1版，用靶病变和/或非靶病变评估抗肿瘤活性。
[0424] 靶应答。通过以下公式评估靶病变尺寸的百分比变化：(1)确定完全应答或部分应答时：[(后值-基线值)/基线值]x 100，(2)确定进展性疾病时：[(后值-自治疗开始后的最
小值)/(自治疗开始后的最小值)]x 100。根据表5中的RECIST 1.1版靶病变应答标准对靶
点应答进行分类。
表5：RECIST靶应答标准
[0425] 非靶应答根据表6中的RECIST 1.1版非靶病变应答标准进行分类。表6：RECIST非靶应答标准
[0426] 总体应答根据表7中RECIST 1.1版总体应答标准进行分类。表7：RECIST总体应答标准
探索性药效学评估
[0427] 外周血采集。受试者抽取约90mL外周血，以评估研究药物在研究期间和/或特定注射后特定时间点对免疫应答的影响。在基线处以及第3周、6周、8周、9周、18周或其任何组合进行免疫监测采血。
[0428] 样品采集。抽取了五到六个用于PBMC样品的10mL绿色顶部肝素管和两个用于血清样品的8mL红色顶部肝素管。处理样品以进行后续分析。
[0429] 免疫样品分析。血液中PBMC的分析如下进行：在暴露于CEA肽后使用针对IFN-γ或颗粒酶B分泌物的ELISpot测定，分析通过Ficoll-Hypaque密度梯度分离法分离出的治疗前
和治疗后的PBMC的抗原特异性免疫应答。流式细胞计数用于在暴露于CEA肽后使用针对
IFN-γ或TNF-α表达的细胞内细胞因子染色测定评估T细胞应答。利用分析细胞上CD107a的
表达的流式细胞计数来检测脱颗粒细胞，诸如CD8+T细胞和NK细胞(例如活化的NK细胞)。用
编码肿瘤相关抗原CEA的重叠的15-mer肽库体外刺激PBMC。对照肽库涉及使用无关的抗原
肽库作为阴性对照，并且使用CEFT肽混合物作为阳性对照。CEFT是CMV、Epstein-Barr病毒、流感和破伤风毒素的肽的混合物。CD4和CD8 T细胞的刺激后分析将涉及IFN-γ、TNF-α和
CD107a表达的产生。对于针对CEA的抗体，中和抗体对腺病毒(血清型5)的滴度以及针对IL-
15N72D:IL-15RαSu/IgG1 Fc复合物的潜在抗体开发，分析了治疗前后的血清。
基因组学、转录组学和蛋白质组学分子分析
[0430] 肿瘤分子做谱的基本原理。对来自组织的肿瘤细胞相对于来自全血的非肿瘤细胞的基因组测序进行分析，以鉴定可能有助于应答或疾病进展的基因组变异，并提供对分子
异常的更深理解。进行RNA测序可提供表达数据并将其与DNA突变相关联。进行定量蛋白质
组学分析以确定特定蛋白质的确切数量，并确认与反应和疾病进展相关的基因表达。所有
基因组、转录组和蛋白质组学分子的分析均具有可回顾性和探索性。
[0431] 样品采集与分析。通过下一代测序和基于质谱的定量蛋白质组学，对福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织和全血(受试者与肿瘤组织匹配的正常对照)进行了探索性
的基因组学、转录组学和蛋白质组学分子做谱。筛选时采集肿瘤组织和全血对于第1b阶段
是任选的，对于本研究的2期是强制性的。根据组织样本试剂盒和血液样本试剂盒中包含的
说明卡采集肿瘤组织和全血样品。这些试剂盒包括采集和运送FFPE肿瘤组织和全血样品所
需的材料。
[0432] 提取肿瘤DNA、肿瘤RNA和肿瘤蛋白需要单个FFPE肿瘤组织块(表8)。提取受试者正常DNA需要全血样品。
[0433] 循环肿瘤DNA和RNA测定。基于血液的ctRNA和ctDNA测试鉴定靶并监控靶的变化。在治疗期间，在基线处以及第3周、6周和8周采集20mL全血，用于分析循环DNA和RNA。将全血分别抽入含有RNA或DNA稳定剂的无细胞RNA 管或无细胞DNA 管中(表8)。
表8-探索性分子做谱的采集时间表
a筛选时采集全血，仅用于基因组测序。需要将2.5mL受试者全血放入血液样本盒中提
供的1个PAXgene血DNA管中。
b在基因组测序、RNA测序和蛋白质组分析筛选时采集的FFPE组织块。需要满足基因组
学、转录组学和蛋白质组学最低要求的单一块。如果样本是在受试者完成最新的抗癌治疗
之后取得的，则具有历史意义的FFPE组织块是可以接受的。否则，将需要获取新鲜的活检样
本，并将其制备成FFPE组织块，并按照当地病理实验室程序进行采集。在第8周会要求提供
任选的组织。
统计方面考虑
[0434] 安全分析。在组中连续评估DLT。在前一组的最后一名受试者接受第一次注射后至少3周，对是否升级到下一个剂量水平进行总体评估。如果以一定剂量水平治疗的受试者中
有<33％(即3个受试者中有0个、6个受试者中≤1个、9个受试者中≤2个、12个受试者中≤3
个，15个受试者中≤4个或18个受试者中≤5个)经历DLT，则认为该剂量水平是安全的。在研
究的剂量递增组成部分中，对3名或6名受试者的每个剂量水平进行安全性评估。将在研究
的剂量扩展组成部分中继续监测在MTD接受治疗的其他受试者中的安全性。如果使用至少
一个注射剂接受治疗，则认为受试者的安全性可评估。持续9周观察DLT，以适应多次治疗的
安全性评估。
[0435] 总体安全性通过描述性分析进行评估，其使用剂量组中CTCAE4.03版的AE按等级列表的频率，并根据治疗中出现的AE、SAE以及安全性实验室测试、体检、ECG、生命体征的临床显著变化针对总体研究群体进行。
[0436] 功效分析-客观肿瘤应答和疾病控制率。通过剂量组和总体评估使用RECIST 1.1版达到客观确认的全部或部分总体肿瘤应答的受试者百分比。评估应答率的95％置信区
间。以相似的方式分析疾病控制(确认的反应或持续至少4个月的SD)。
[0437] 功效分析-应答持续时间。通过剂量组和总剂量评估总体应答的持续时间。从满足CR或PR测量标准的时间(以先记录的为准)直到客观记录复发或PD第一天(将自治疗开始以
来记录的最小测量值作为PD的参考值)，测量总体应答的持续时间。
[0438] 功效分析-无进展存活率。通过剂量组和总体使用Kaplan-Meier方法评估PFS。PFS定义为从首次治疗日期到疾病进展或死亡(任何原因)日期之间(以先者为准)的时间。没有
疾病进展或在随访结束时未死亡的受试者在该受试者无进展的最后一个公知日期接受检
查。
[0439] 功效分析-总体存活率。使用Kaplan-Meier方法，通过剂量组和总体评估OS。OS定义为从首次治疗日期到任何原因死亡日期之间的时间。随访结束时还活着的受试者会在最
后一个公知活着的日期接受检查。
[0440] 功效分析-探索性免疫应答分析。免疫应答阳性的受试者百分比通过剂量组和总体进行评估。阳性免疫应答通过流式细胞计数读数(细胞因子产生或CD107a表达)或
ELISpot分析或体外刺激试验中的CMI反应性来定义。
[0441] 功效分析-统计能力和分析计划。对于ELISpot CMI研究，在第1阶段组中至少有五份来自单个患者的总PBMC样品组可为该研究提供适当动力。假设非特异性和/或背景活性
导致从基线PBMC样品中产生10(±10SD)IFN-γ点形成细胞(SFC)，而相比之下在ELISpot 
CMI测定中从治疗PBMC样品中观察到至少50(±10SD)SFC，则95％置信区间的统计能力大于
95％。在流式细胞计数法研究中，并基于对小鼠脾细胞样品的先前研究，对于来自PBMC基线
样品的CD4+/CD8+淋巴细胞，表达TNF-α和/或IFN-γ的细胞假设背景应答约为0.1％(±
0.4SD)。治疗后，检测到至少0.6％(±0.4SD)的TNF-α、IFN-γ和/或CD107a表达。在这些流
式细胞计数法研究的第1阶段组中，至少有5个来自单个患者的总样品的组将在95％的置信
区间内提供80％的统计能力。
[0442] 对数据进行统计分析。对于单个PBMC样品的ELISpot分析，在处理样品之间进行了Student T测试(PRISM软件)以确定任何显著的差异。对于单个PBMC样品的流式细胞计数分
析，对处理样品之间的表达TNF-α、INF-γ和/或CD107a和/或IFN-γ细胞的百分比进行了
Student T测试，以确定细胞群中的任何显著的差异。
[0443] 样品量的测定。预计将有多达12位受试者参与第1b阶段研究，而从剂量水平1开始依次有3至6位受试者参与。在第2阶段研究中，每个适应症的20名受试者参与并按照第1b阶
段确定的MTD进行治疗。以MTD接受治疗的第1b阶段研究受试者包括在第2阶段纳入靶中。
实例6
使用Ad5[E1-E2b-]-CEA(6D)疫苗与ALT-803疗法结合治疗癌症
[0444] 该实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法在有需要的受试者中治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达CEA的肿瘤的受试者进行免疫。通过
皮下(SC)注射以5x 1011个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗。在3周的期间
内重复接种总共多达3次。Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别在第7天、14天和21天施用。在第10
天和第17天，还分别以1μg SC的剂量给受试者施用超激动剂/超激动剂复合物，诸如ALT-
803。
[0445] 有此需要的受试者具有表达CEA的癌细胞，诸如表达CEA的结直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。
实例7
使用Ad5[E1-E2b-]-CEA(6D)疫苗与ALT-803疗法以及工程化NK细胞结合治疗癌症
[0446] 该实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法以及工程化NK细胞在有需要的受试者中治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达CEA的肿瘤的受试
者进行免疫。通过皮下(SC)注射以5x 1011个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA
疫苗。Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别在第7天、14天和21天施用。还分别在第10天和第17天以
1μg SC的剂量给受试者施用ALT-803。
[0447] 另外向受试者施用aNK细胞。aNK细胞在第9天、11天、18天、22天、27天和33天静脉输注，每次治疗剂量为2x 109个细胞。有此需要的受试者具有表达CEA的癌细胞，诸如结肠
直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。
实例8
Ad5[E1-E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法和抗CEA抗体治疗癌症
[0448] 该实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法和抗CEA抗体在有此需要的受试者中治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达CEA的肿瘤的受试者进
行免疫。通过皮下(SC)注射以5x 1011个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗。
Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别在第7天、14天和21天施用。还分别在第10天和第17天以1μg 
SC的剂量给受试者施用ALT-803。
[0449] 另外向受试者施用抗CEA抗体，诸如NEO-201抗体。在第1天、15天和22天，以3mg/kg的剂量给受试者静脉输注NEO-201抗体。这种情况会持续2到3个月。有此需要的受试者具有
表达CEA的癌细胞，诸如结肠直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类
动物。
实例9
用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法和FOLFOX-B、阿维鲁单抗以及NK细胞
疗法治疗癌症
[0450] 本实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法和FOLFOX-B、阿维鲁单抗、NEO-201抗体以及NK细胞疗法来治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达
CEA的肿瘤的受试者进行免疫。通过皮下(SC)注射以5x 1011个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5
[E1-,E2b-]-CEA疫苗。在3周的期间内重复接种总共多达3次。Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别
在第7天、14天和21天施用。在第10天和第17天，还分别以1μg SC的剂量给受试者施用超激
动剂/超激动剂复合物，诸如ALT-803。
[0451] 为了增强疫苗效果，输注了(阿维鲁单抗)抗PD-1单克隆抗体(一种检查点抑制剂)。作为常规预防措施，在有复苏设备和急救人员的区域中，在输注后1小时观察参加该试
验的受试者。在阿维鲁单抗治疗期间的任何时候，都必须确保根据机构标准立即紧急处理
输注相关反应或严重的超敏反应。为了治疗可能的过敏反应，例如，可以使用地塞米松10mg
和以1:1000稀释的肾上腺素或等效物以及辅助通气设备。受试者经1小时(-10分钟/+20分
钟，即50分钟至80分钟)接受静脉输注阿维鲁单抗，剂量为10mg/kg。使用阿维鲁单抗的治疗
开始于首次疫苗注射后3周的第二次疫苗治疗。或者，在首次疫苗治疗的同时开始使用阿维
鲁单抗治疗。诱导针对CEA肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答，然后通过注射抗PD-1来增强免
疫应答，该抗PD-1会干扰免疫检查点途径的抑制作用。在第3周开始疫苗接种后，以3mg/kg
的剂量向受试者注射抗PD-1抗体。在第9周和第12周重复进行该输注(注射)程序。
[0452] 在阿维鲁单抗施用后，FOLFOX疗法是静脉内施用。在第1或2天经2小时静脉内施用奥沙利铂85mg/m2，在第1或2天经2小时静脉内施用Leucovorin*400mg/m2，在第1或第2天静
2 2
脉内施用5-FU*400mg/m ，从第1天或第2天开始，经46小时静脉内施用5-FU*2400mg/m 。5-氟尿嘧啶和亚叶酸应分开施用，以避免形成沉淀。对于每个包装插入，首先施用亚叶酸。
[0453] 在第9天、11天、18天、22天、27天和33天，以每次治疗2x109个细胞的剂量输注工程化的NK细胞，特别是aNK细胞。
[0454] 在输注上述递送给患者的haNK细胞后的第1天、15天和22天，以3mg/kg的剂量静脉内注射NEO-201抗体。这种情况会持续2到3个月。
[0455] 有此需要的受试者具有疾病进展的任何阶段，包括转移性结直肠癌或晚期结直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。通过输注或皮下静脉内施
用。每种疗法的施用时间为数天、数周或数月。根据所递送的药剂，治疗可以一次或多次施
用。
实例10
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803疗法与Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury以及Ad5
[E1-,E2b-]-MUC1结合治疗癌症
[0456] 本实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗和ALT-803疗法与Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1结合治疗癌症，在本实例和其他实例中使用了以下HLA-
A2和HLA-A24结合肽：(a)HLA-A2结合CEA激动剂肽CAP1-6D(YLSGADLNL(SEQ ID NO:4))；(b)
HLA-A2 MUC1激动剂肽P93L(ALWGQDVTSV(SEQ ID NO:112))；(c)HLA-A24结合MUC1激动剂肽
C6A(KYHPMSEYAL(SEQ ID NO:113))；以及(d)HLA-A2结合brachyury激动剂肽(WLLPGTSTV
(SEQ ID NO:15))。所有肽的纯度均大于96％。构建并产生了Ad5[E1-,E2b-]-brachyury，
Ad5[E1-,E2b-]-CEA和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1。简而言之，使用基于同源重组的方法将转基因
亚克隆到Ad5[E1-,E2b-]载体的E1区域。复制缺陷病毒在E.C7包装细胞系中繁殖，CsCl2纯
化，并进行效价测定。将病毒感染滴度确定为E.C7细胞单层上的噬斑形成单位(PFU)。采用
十二烷基硫酸钠(SDS)破坏法和分光光度法在260nm和280nm处测定VP浓度。CEA转基因也包
含修饰的CEA，其包含高度免疫原性的表位CAP1-6D。通过引入增强子T细胞HLA-A2表位
(WLLPGTSTV；SEQ ID NO:15)并去除涉及DNA结合的25个氨基酸片段来修饰编码人
Brachyury蛋白(T，NM_003181.3)的序列。随后将得到的构建体亚克隆到Ad5载体中以产生
Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury构建体。MUC1分子由两个区域组成：N末端(MUC1-n)是MUC1的大
胞外结构域，C末端(MUC1-c)具有三个区域：小的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾。细胞质尾含有与信号蛋白相互作用的位点，并作为癌基因和癌症运动、侵袭性和转移性的驱
动器。为了构建Ad5[E1-,E2b-]-MUC1，将包括8个激动剂表位的整个MUC1转基因亚克隆到
Ad5载体中。Ad5[E1-,E2b-]-MUC1载体中包含的激动剂表位与HLA-A2(N末端的表位P93L、
VNTR区域的V1A和V2A以及C末端的C1A、C2A和C3A)、HLA-A3(表位C5A)以及HLA-A24(C末端的
表位C6A)结合。通过以1:1:1(总共3x 1010个VP)的比例将Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury、Ad5
[E1-,E2b-]-CEA和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1的1010个VP组合来生产Tri-Ad5疫苗。
[0457] 具有表达CEA的肿瘤的受试者通过皮下注射5x 1011个Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗病毒颗粒(VP)、5x 1011个Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury疫苗病毒颗粒和5x 1011个Ad5[E1-,
E2b-]-MUC1疫苗病毒颗粒的混合物进行免疫。在3周的期间内重复接种总共多达3次。Ad5
[E1-,E2b-]-CEA、Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-MUC1疫苗混合物分别在第7
天、14天和21天施用。在第10天和第17天，还分别以1μg SC的剂量给受试者施用超激动剂/
超激动剂复合物，诸如ALT-803。有此需要的受试者具有表达CEA的癌细胞，诸如表达CEA的
结直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。
实例11
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗与ALT-803和检查点抑制剂结合治疗癌症
[0458] 该实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803疗法以及检查点抑制剂联合治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达CEA的肿瘤的受试者进行免疫。通
过皮下(SC)注射以5x 1011个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗。在3周的期
间内重复接种总共多达3次。Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别在第7天、14天和21天施用。在第
10天和第17天，还分别以1μg SC的剂量给受试者施用超激动剂/超激动剂复合物，诸如ALT-
803。
[0459] 结合治疗中使用的检查点抑制剂是抗PD-1单克隆抗体，诸如阿维鲁单抗。为了增强疫苗效果，输注抗PD-1单克隆抗体(阿维鲁单抗)。作为常规预防措施，在有复苏设备和急
救人员的区域中，在输注后1小时观察参加该试验的受试者。在阿维鲁单抗治疗期间的任何
时候，都必须确保根据机构标准立即紧急处理输注相关反应或严重的超敏反应。为了治疗
可能的过敏反应，例如，可以使用地塞米松10mg和以1:1000稀释的肾上腺素或等效物以及
辅助通气设备。在适用的情况下，受试者以10mg/kg的剂量接受经1小时(-10分钟/+20分钟，
即50至80分钟)的阿维鲁单抗静脉内输注。在第一次注射疫苗后3周，从第二次疫苗治疗开
始使用阿维鲁单抗进行治疗。或者，在首次疫苗治疗的同时开始使用阿维鲁单抗治疗。诱导
针对CEA肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答，然后通过注射抗PD-1来增强免疫应答，该抗PD-1
会干扰免疫检查点途径的抑制作用。在第3周开始疫苗接种后，以3mg/kg的剂量向受试者注
射抗PD-1抗体。在第9周和第12周重复进行该输注(注射)程序。
[0460] 有此需要的受试者具有疾病进展的任何阶段，包括转移性结直肠癌或晚期结直肠癌。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。通过输注或皮下静脉内施
用。每种疗法的施用时间为数天、数周或数月。根据所输送的药剂，治疗可以一次或多次施
用。
实例12
Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗与ALT-803、低剂量化疗和低剂量放疗相结合治疗癌症
[0461] 该实例描述了用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)疫苗结合ALT-803治疗、低剂量化疗和低剂量放疗治疗癌症。用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗对具有表达CEA的肿瘤的受试者进行免疫。
11
通过皮下(SC)注射以5x 10 个病毒颗粒(VP)的剂量施用Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗。在3周的
期间内重复接种总共多达3次。Ad5[E1-,E2b-]-CEA疫苗分别在第7天、14天和21天施用。在
第10天和第17天，还分别以1μg SC的剂量给受试者施用超激动剂/超激动剂复合物，诸如
ALT-803。
[0462] 还向受试者施用低剂量化疗。化疗为环磷酰胺。化疗为口服或静脉内施用，剂量低于临床标准的护理剂量。例如，化疗在第1至5天和第8至12天以50mg一天两次(BID)施用，每
两周一次，共8周。
[0463] 任选地，还向受试者施用低剂量辐射。低剂量辐射的剂量低于护理剂量的临床标准。在第8天、22天、36天、50天(每2周施用4剂)以8Gy同步进行立体定向体放疗(SBRT)。使用SBRT对所有可行的肿瘤部位施用放疗。有此需要的受试者患有表达CEA的癌症，并且该癌症
已被消除。受试者为任何哺乳动物，诸如人类或非人类动物。
[0464] 尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人
员现在将清楚许多变型、改变和替代。应当理解，本文所述的本发明的实施例的各种替代方
案可以用于实施本发明。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要
求及其等同物的范围内的方法和结构。
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