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抗体制剂

阅读：1024发布：2020-11-30

专利汇可以提供抗体制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及抗CD20人单克隆抗体制剂，制备所述制剂的方法和其用途。，下面是抗体制剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种制剂，其包含：
-大约1至大约150mg/mL的II型抗CD20抗体，
-任选地大约0.001至大约1％w/v的至少一种表面活性剂，和
-大约1至大约100mM的缓冲液，
-pH为大约4.5至大约7.0。
2.根据权利要求1所述的制剂，其包含：
-大约1至大约150mg/mL的II型抗CD20抗体，
-大约0.005至大约0.05％w/v的至少一种表面活性剂，和
-大约1至大约100mM的缓冲液，
-pH为大约4.5至大约7.0。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，其包含：
-大约10至大约30mg/mL的II型抗CD20抗体，
-20mM的L-组氨酸，
-240mM的海藻糖，和
-0.02％w/v的聚山梨酯20，
-pH为大约6。
4.根据权利要求1或2所述的制剂，其包含：
-大约10至大约30mg/mL的II型抗CD20抗体，
-0.02％w/v的泊洛沙姆188，
-20mM的L-组氨酸，和
-240mM的海藻糖，
-pH为大约6。
5.根据权利要求1至4的制剂，其为液体形式、冻干形式或由冻干形式重构的液体形式。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制剂，其可以通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)或任何其它肠胃外给药施用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，其进一步包含大约5mM至大约350mM量的一种或多种等张剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述等张剂选自氯化钠(NaC1)、氯化钾、包括葡萄糖的糖、甘油、氨基酸及其组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其进一步包含大约25mM至大约500mM量的糖。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制剂，其中所述糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)、半乳糖胺、神经氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的制剂，其进一步包含选自以下可药用的一种或多种成分：抗氧化剂，抗坏血酸、谷胱甘肽、防腐剂，特别是间甲酚、苯酚、苄醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯代丁醇、硫柳汞、苯扎氯铵、聚乙二醇，特别是PEG 3000、3350、4000或
6000、人血白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、多元醇、甘油、乙醇、甘露醇、盐、乙酸盐，特别是乙酸钠，氯化镁、氯化钙、氨基丁三醇、EDTA，特别是Na-EDTA。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含：
15mg/mL的HuMab＜CD20＞，
20mM的L-组氨酸，
任选地0.001至1％w/v的表面活性剂，
pH 6.0；
或者
10mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.02％w/v的聚山梨酯20，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.02％w/v的聚山梨酯20，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的制剂，其中所述制剂为冻干形式并且包含：
10mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.02％w/v的聚山梨酯20，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含：
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
TM
0.02％w/v的泊洛沙姆188 ，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
TM
0.01％w/v的泊洛沙姆188 ，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
TM
0.1％w/v的泊洛沙姆188 ，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.02％w/v的聚山梨酯80，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.1％w/v的聚山梨酯80，
20mM的乙酸盐，和
240mM的海藻糖，
pH 5.5；
或者
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
0.1％w/v的聚山梨酯80，
20mM的乙酸盐，和
140mM的氯化钠，
pH 5.5；
或者
30mg/mL的HuMab＜CD20＞，
TM
0.01％w/v的泊洛沙姆188 ，
20mM的L-组氨酸，和
200mM的海藻糖，
pH 6.5。
15.根据权利要求14所述的制剂，其中所述制剂为液体形式并且包含：
25mg/mL的HuMab＜CD20＞，
TM
0.02％w/v的泊洛沙姆188 ，
20mM的L-组氨酸，和
240mM的海藻糖，
pH 6.0。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的制剂用于制备可用于治疗CD20-相关疾病的药物的用途。
17.根据权利要求16所述的制剂，其中所述疾病选自乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和前列腺癌。
18.如上文描述的发明。

说明书全文

抗体制剂

[0001] 本发明涉及抗CD20单克隆抗体制剂，制备所述制剂的方法和所述制剂的用途。

[0002] 发明背景

[0003] CD20分子(也被称为B-淋巴细胞-限制性分化抗原或Bp35)是位于前B及成熟B淋巴细胞上的分子量大约为35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine等人(1989)J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287和Einfield等人(1988)EMBO J.7(3)：711-717)。在超过90％的来自外周血或淋巴样器官的B细胞的表面上发现了CD20，其在早期前B细胞发育过程中被表达并且一直存在到浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。特别地，CD20表达于超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上(Anderson等人(1984)Blood63(6)：1424-1433)，但是在造血干细胞、原-B细胞、正常浆细胞或其它正常组织上没有被发现(Tedder等人(1985)J，Immunol.135(2)：973-979)。

[0004] CD20蛋白质的85个氨基酸羧基末端区域位于细胞质内。该区域的长度与其它B细胞-特异性表面结构(如IgM、IgD和IgG重链)或者组织相容性I1类抗原α或β链形成对比，其分别具有3、3、28、15和16个氨基酸的相对短的细胞质内区域(Komaromy等人(1983)NAR11：6775-6785)。在最后61个羧基末端氨基酸中，21个是酸性残基，而只有2个是碱性的，表明该区域具有强的净负电荷。GenBank登记号是NP-690605。认为CD20可能参与调节B细胞激活和分化过程中的早期阶段(Tedder等人(1986)Eur.J.Immunol.2516：881-887)并能起到钙离子通道的作用(Tedder等人(1990)J.Cell.Biochem.14D：195)。

[0005] 存在两种不同类型的抗CD20抗体，它们的CD20结合模式和生物活性明显不同(Cragg，M.S.，等人，Blood，103(2004)2738-2743和Cragg，M.S.，等人，Blood，101(2003)1045-1051)。I型抗体，如利妥昔单抗(Rituximab)，在补体介导的细胞毒性方面是有效的，而II型抗体，如托西莫单抗(Tositumomab)( B1)、11B8和AT80，通过具有伴随的磷脂酰丝氨酸外露的胱天蛋白酶-非依赖性细胞凋亡促使靶细胞死亡。

[0006] I型和II型抗CD20抗体的共享的共同特征总结于表1中。

[0007]I型抗CD20抗体 II型抗CD20抗体
I型CD20表位 II型CD20表位
使CD20定位于脂膜筏中不使CD20定位于脂膜筏中
增加的CDC(如果是IgG1同种减少的CDC(如果是IgG1同种
型) 型)
ADCC活性(如果是IgG1同种型) ADCC活性(如果是IgG1同种型)
完全的结合能力降低的结合能力
同型聚集更强的同型聚集
交联时诱导细胞凋亡没有交联时诱导强的细胞死亡

[0008] 表1：I型和II型抗CD20抗体的特性

[0009] 发明概述

[0010] 一个方面，本发明涉及药物制剂，其包含：

[0011] 1至150mg/mL的抗CD20抗体；

[0012] 1至100mM的缓冲液；

[0013] 任选地0.001至1％的表面活性剂；和

[0014] 任选地1至800mM的张度剂；

[0015] pH在4.5至7.0的范围内。

[0016] 优选地，所述抗CD20抗体是II型抗体。更优选地，所述抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。

[0017] 发明详述

[0018] 术语“抗体”包括各种不同形式的抗体，包括但不限于全抗体、人抗体、人源化抗体和遗传基因工程抗体(如单克隆抗体、嵌合抗体或重组抗体)以及此类抗体的片段，只要保留本发明的特有的特性。

[0019] “抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常至少包括其抗原结合部分或可变区。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、免疫毒素和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，抗体片段包括具有VH链的特征的单链多肽，即能与VL链装配在一起或者具有与CD20抗原结合的VL链的特征，即能与VH链装配成功能性抗原结合口袋。

[0020] “抗体片段”还包括这样的片段，其本身不能提供效应子功能(ADCC/CDC)，但是能在与适当的抗体恒定区结合后以根据本发明的方式提供此种功能。

[0021] 本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制剂。因此，术语“人单克隆抗体”指显示出单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包括从转基因非人动物(如转基因小鼠)获得的B细胞的杂交瘤制备，所述杂交瘤具有与无限增殖化细胞融合的包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。

[0022] 术语“嵌合抗体”指包含由一个来源或物种得到可变区(即结合区)和从不同来源或物种得到的至少部分恒定区的单克隆抗体，通常通过重组DNA技术制备。尤其优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。此种鼠/人嵌合抗体是免疫球蛋白基因的表达产物，所述免疫球蛋白基因包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是原始抗体的类或亚类经修饰或改变的形式。此种“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。嵌合抗体的制备方法涉及本领域已知的常规重组DNA和基因转染技术。参加例如Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。

[0023] 术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中构架或“互补决定区”(CDR)经修饰而包含特异性不同于亲代免疫球蛋白的免疫球蛋白CDR。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接到人抗体的构架区内以制备“人源化抗体”。参加例如Riechmann，L.等人，Nature332(1988)323-327和Neuberger，M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。对于嵌合和双功能抗体，特别优选的CDR对应于那些识别上述抗原的代表性序列。

[0024] 本文所用的术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于此种技术，能制备对抗各种各样的靶点的人抗体。人抗体的实例例如描述于Kellermann，S.A.等人，Curr Opin Biotechnol.13(2002)593-597中。

[0025] 本文所用的术语“重组人抗体”意欲包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如从宿主细胞(例如NSO或CHO细胞)或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体，或采用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此种重组人抗体具有重排形式的源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经过体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然源自人种系VH和VL序列并与其相关，却可以不天然存在于体内人抗体种系库内。

[0026] 本文所用的“特异性结合”指抗体特异性地与CD20抗原结合。优选地，结合亲和-9 -9 -10 -10 -10力是10 mol/l或10 mol/l以下(例如10 mol/l)的KD值，优选10 mol/l或10 mol/-12
l以下(例如10 mol/l)的KD值。用标准结合测定法测定结合亲和力，例如表面等离振子共振技术(Biacore )。

[0027] 本文所用的“核酸分子“意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。

[0028] “恒定区”不直接参与抗体与抗原的结合，但参与效应功能(ADCC、补体结合和CDC)。

[0029] 本文所用的“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))指直接参与抗体抗原结合的每一对轻链和重链。人轻链和重链的可变区具有相同的一般结构，每个区域包含四个构架(FR)区，其序列广泛保守，由三个“超变区”(或互补决定区，CDR)连接。构架区采取b-片层构象，CDR可形成连接b-片层结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构并与另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体结合特异性/亲和力中发挥重要的作用，因而提供了本发明的另一个目的。

[0030] 当用于本文时术语“超变区”或“抗体的抗原结合部分”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”区或“FR”区是除了本文所定义的超变区残基之外的那些可变区区域。因此，抗体的重链和轻链从N-端到C-端包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。尤其是，重链的CDR3是对抗原结合作出最大贡献的区域。根据Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学重要的蛋白质序列)，第五版.公共卫生服务处，国家卫生部，贝塞斯达，马里兰州.(1991))的标准定义和/或那些来自“超变环”的残基确定CDR区和FR区。

[0031] 本文可互换使用术语“CD20”和“CD20抗原”，并且其包括人CD20的任何变体、同种型和种同源物，其由细胞天然表达或表达于用CD20基因转染的细胞上。本发明的抗体和CD20抗原的结合通过失活CD20来介导杀死表达CD20的细胞(例如肿瘤细胞)。杀死表达CD20的细胞可通过以下一种或多种机理发生：

[0032] 现有技术已确认的CD20的同义词包括B-淋巴细胞抗原CD20、B-淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5和LF5。

[0033] 根据本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原的抗体。取决于抗CD20抗体对CD20抗原的结合特性和生物活性，根据Cragg，M.S.等人，Blood103(2004)2738-2743和Cragg，M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1051能将抗CD20抗体区分为两种类型，见表2。

[0034]I型抗CD20抗体 II型抗CD20抗体
I型CD20表位 II型CD20表位
使CD20定位于脂膜筏中不使CD20定位于脂膜筏中
增加的CDC(如果是IgG1同种减少的CDC(如果是IgG1同种
型) 型)
ADCC活性(如果是IgG1同种 ADCC活性(如果是IgG1同种型)
型)
完全的结合能力降低的结合能力
同型聚集更强的同型聚集
交联时诱导细胞凋亡没有交联时诱导强的细胞死亡

[0035] 表2：I型和II型抗CD20抗体的特性

[0036] I型和II型抗CD20抗体的一个重要特性是它们的结合模式。因此可通过所述抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率对I型和II型抗CD20抗体进行分类。

[0037] 如本文所用的，“抗CD20抗体”可以是I型或II型抗体。优选地，它是II型抗体。

[0038] 所述I型抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率为0.8至1.2、优选0.9至1.1。此种I型抗CD20抗体的实例包括例如利妥昔单抗、(WO94/11026)、1F5IgG2a(ECACC，杂交瘤；Press等人，Blood 69/2：584-591(1987))，H147IgG3(ECACC，杂交瘤)，2C6IgG1(如WO2005/103081中公开的)，
2F2IgG1(如公开的及WO 2004/035607和WO2005/103081)和2H7 IgG1(如WO 2004/056312中公开的)。优选地所述I型抗CD20抗体是与利妥昔单抗结合相同的表位的单克隆抗体。
所述II型抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率为0.3至0.6，优选0.35至0.55，更优选0.4至0.5。此种II型抗CD20抗体的实例包括例如托西莫单抗(B1 IgG2a)、人源化B-Ly1抗体IgG1(如WO2005/044859中公开的嵌合人源化IgG1抗体)、11B8 IgG1(如WO2004/035607中公开的)和AT80IgG1。
优选地所述II型抗CD20抗体是与人源化B-Ly1抗体结合相同的表位的单克隆抗体(如WO2005/044859中公开的)。

[0039] 使用所述缀合Cy5的抗CD20抗体和缀合Cy5的利妥昔单抗在FACSArray(Becton Dickinson)中用Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)通过直接免疫荧光测定(测定平均荧光强度(MFI))确定“抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率”，如实施例2中所述，并且如下计算：

[0040]

[0041]

[0042] MFI是平均荧光强度。如本文所用的“Cy5标记比率”意指每分子抗体Cy5标记分子的数量。

[0043] 所述第一抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率，典型地所述I型抗CD20抗体为0.8至1.2，优选0.9至1.1。

[0044] 所述第二抗CD20抗体相对于利妥昔单抗对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力的比率，典型地所述II型抗CD20抗体为0.3至0.6，优选0.35至0.55，更优选0.4至0.5。

[0045] 在优选的实施方案中，所述II型抗CD20抗体(优选人源化B-Ly1抗体)具有增加的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

[0046] “具有增加的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗体”意指如本文所定义的术语抗体，其具有如通过本领域普通技术人员已知的任何适宜的方法确定的增加的ADCC。体外ADCC测定法中接受的一种方法如下：

[0047] 1)所述测定法使用已知表达抗体的抗原-结合区能识别的靶抗原的靶细胞；

[0048] 2)所述测定法使用由随机选择的健康供者的血液分离的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞；

[0049] 3)根据以下方案进行所述测定法：

[0050] i)使用标准密度离心程序分离PBMC并将其以5×106个细胞/ml悬浮于RPMI细胞培养基中；

[0051] ii)通过标准组织培养方法使靶细胞生长，从具有大于90％的生活力的指数生长期收集，在RPMI细胞培养基中洗涤，用100微居里″CI-标记，用细胞培养基洗涤两次，然后以10′个细胞/ml的密度再悬浮于细胞培养基中；

[0052] iii)将上面的100微升最终的靶细胞混悬液转移到96-孔微量滴定板的各个孔中；

[0053] iv)在细胞培养基中将抗体从4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，然后将50微升得到的抗体溶液加入到96-孔微量滴定板的靶细胞中，一式三份测试包括上面整个浓度范围的不同的抗体浓度；

[0054] v)对于最大释放(MR)对照，将50微升2％(VN)的非离子型去污剂(Nonidet，Sigma，圣路易斯)水溶液代替抗体溶液(上面要点iv)添加到板中含有标记的靶细胞的3个另外的孔；

[0055] vi)对于自发释放(SR)对照，将50微升的RPMI细胞培养基代替抗体溶液(上面要点iv)添加到板中含有标记靶细胞的3个另外的孔；

[0056] vii)然后将96-孔微量滴定板以50x g离心1分钟并在4℃下温育1小时；

[0057] viii)将50微升的PBMC混悬液(上面的i点)添加到各个孔中以得到25∶1的效应细胞∶靶细胞比率，然后将板置于37℃、5％CO2气氛下的培养箱中4小时；

[0058] ix)从各个孔中收集不含细胞的上清液，使用γ计数器对实验释放(ER)的放射性进行定量；

[0059] x)根据公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100计算各个抗体浓度的特异性溶解百分率，其中ER是对于该抗体浓度量化的平均放射性(见上面要点ix)，MR是对于MR对照(见上面要点V)量化的平均放射性(见上面要点ix)，SR是对于SR对照(见上面要点vi)量化的平均放射性(见上面要点ix)；

[0060] 4)“增加的ADCC”定义为上面所测试的抗体浓度范围内观察到的最大特异性溶解百分率增加，和/或达到上面所测试的抗体浓度范围内观察到的最大特异性溶解百分率的一半需要的抗体浓度减小。ADCC增加是相对于ADCC，用上面测定法测定，由相同的抗体介导，由相同类型的宿主细胞产生，使用相同标准的制备、纯化、配制和储存方法，这些对于本领域的技术人员是已知的，但是其还没有被工程化以过表达GnTIII的宿主细胞产生。

[0061] 能通过对所述抗体进行糖工程化获得所述“增加的ADCC”，这意味着如Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999)和美国专利号6,602,684中所述的，通过对它们的寡糖成分进行工程化增强所述单克隆抗体的天然、细胞-介导的效应功能。

[0062] 术语“补体-依赖性细胞毒性(CDC)”指在补体存在下人肿瘤靶细胞被根据本发明的抗体溶解。优选通过在补体存在下用根据本发明的抗CD20抗体处理CD20表达细胞的制剂测定CDC。如果100nM浓度的抗体在4小时后诱导20％或20％以上的肿瘤细胞溶解(细51 51
胞死亡)，则发现CDC。优选用 Cr或Eu标记的肿瘤细胞并测定释放的 Cr或Eu进行测定法。对照包括用补体但不用抗体温育肿瘤靶细胞。

[0063] 典型地，IgG1同种型的I型和II型抗CD20抗体显示出特征性CDC特性。相对于彼此，I型抗CD20抗体具有增加的CDC(如果是IgG1同种型)，II型抗CD20抗体具有减少的CDC(如果是IgG1同种型)。优选I型和II型抗CD20抗体均为IgG1同种型抗体。

[0064] “利妥昔单抗”抗体是针对人CD20抗原的含有遗传工程化的嵌合人γ1鼠恒定区的单克隆抗体。这种嵌合抗体含有人γ1恒定区并由WO94/11026(Anderson等人)中的名称“C2B8”确定。利妥昔单抗获得批准用于治疗患有复发性或折射低度恶性或滤泡型、CD20阳性的B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。体外作用机理研究表明利妥昔单抗表现出人补体-依赖性细胞毒性(CDC)(Reff等人，Blood 83(2)：435-445(1994))。此外，利妥昔单抗在测定抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)的测试中表现出显著活性。

[0065] 术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO2005/044859中公开的人源化B-Ly1抗体，其是由鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1(鼠重链可变区(VH)：SEQID NO：1；鼠轻链可变区(VL)：SEQ ID NO：2-见Poppema，S.and Visser，L.，Biotest Bulletin 3：131-139(1987))通过与IgG1的人恒定区嵌合然后人源化获得的(见WO2005/044859)。WO2005/044859中详细地公开了这些“人源化B-Ly1抗体”。

[0066] 优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有选自SEQ ID No.3至SEQ ID No.20的重链可变区(VH)(WO2005/044859中的B-HH2至B-HH9和B-HL8至B-HL17)。尤其优选的是Seq.ID No.3、4、7、9、11、13和15(WO2005/044859中的B-HH2、BHH-3、B-HH6、B-HH8、B-HL8、B-HL11和B-HL13)。最优选地，所述VH是BHH6。优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有WO2005/044859中的SEQ ID No.20(B-KV1)的轻链可变区(VL)。而且，人源化B-Ly1抗体优选为IgG1抗体。优选地，此种人源化B-Ly1抗体的Fc区被根据WO2005/044859、WO 2004/065540、Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999)和WO 99/154342中描述的方法糖工程化(GE)。多少糖工程化的人源化B-Ly1抗体的Fc区具有改变的糖基化模式，优选具有减小的岩藻糖残基水平。优选地，Fc区中至少40％或40％以上(一个实施方案中在40％和60％之间，另一实施方案中至少50％，又一实施方案中至少70％或70％以上)的寡糖是非岩藻糖基化的。而且，Fc区中的寡糖优选是对分的。最优选地，“人源化B-Ly1抗体”包含WO2005/044859中的VH B-HH6和VL B-KV1。本文所用的，所述抗体也被称为“HuMab”。在另一最优选的实施方案中，所述抗体具有如上定义的减小的岩藻糖残基水平和/或Fc区中的寡糖最优选是对分的。在又一最优选的实施方案中，所述抗体表现出如本文定义的增加的ADCC。

[0067] 寡糖成分能明显影响与治疗性糖蛋白的效力相关的性质，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药代动力学和特定的生物活性。此种性质可能不仅取决于寡糖的存在或缺失，而且取决于寡糖特定的结构。可以对寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些概括。例如，某些寡糖结构通过与特定的糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除，而其它寡糖能被抗体结合并启动不期望的免疫反应(Jenkins等人，Nature Biotechnol.14：975-81(1996))。

[0068] 由于它们对人类应用以最相容的形式糖基化蛋白的能力，哺乳动物细胞是用于制备治疗性糖蛋白的优选宿主。(Cumming等人，Glycobiology1：115-30(1991)；Jenkins等人，Nature Biotechnol.14：975-81(1996))。细菌极少使蛋白质糖基化，并且象其它类型的常见宿主，如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞，产生伴随从血流中快速清除、不期望的免疫相互作用、和在一些特殊的情况中降低的生物活性的糖基化模式。在哺乳动物细胞中，在最近的二十年中最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。除了提供适宜的糖基化模式之外，这些细胞允许遗传上稳定的、高产克隆细胞系的一致产生。它们能在简易的生物反应器中使用不含血清的培养基培养至高密度，并且允许开发安全和可重现的生物工艺。其它通常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近，也对由转基因动物生产进行了试验。(Jenkins等人，Nature Biotechnol.14：975-981(1996))。

[0069] 所有的抗体在重链恒定区的保守位置含有糖结构，每个同种型具有不同排列的N-连接糖结构，其易变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。(Wright，A.和Monison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。附着的N-连接糖的结构变化相当大，这取决于加工程度，并且可以包括高甘露糖、多分枝以及双天线复杂型寡糖。(Wright，A.和Morrison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。典型地，在特定的糖基化位点处连接的核心寡糖结构存在异质加工，从而使单克隆抗体甚至以多糖形存在。同样，已经表明抗体糖基化中的主要差别出现在细胞系之间，甚至对于在不同的培养条件下生长的给定细胞系也看到较小的差别。(Lifely，M.R.等人，Glycobiology 5(8)：813-22(1995))。

[0070] 一个获得大的效力增加同时保持简单的生产工艺并潜在地避免明显的、不期望的副作用的方法是如Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999)和美国专利6,602,684号中所述的通过对它们的寡糖成分进行工程化而增强单克隆抗体的天然的、细胞-介导的效应功能。IgG1型抗体(癌症免疫治疗中最常使用的抗体)是在各个CH2结构域中的Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。两个与Asn297连接的双天线复杂型寡糖埋入CH2结构域之间，与多肽主链形成广泛的接触，并且它们的存在对于抗体介导效应功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是必不可少的(Lifely，M.R.，等人，Glycobiology
5：813-822(1995)；Jefferis，R.，等人，Immunol.Rev.163：59-76(1998)；Wright，A. 和Morrison，S.L.，Trends Biotechnol.15：26-32(1997))。

[0071] 先前证实中国仓鼠卵巢(CHO)细胞过表达β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶I11(″GnTII17y)(催化形成截开的寡糖的糖基转移酶)显著增加了由工程化CHO细胞产生的抗神经母细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见Umana，P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999)和WO 99/154342，其全部内容据此通过引用并入)。抗体chCE7属于未缀合的单克隆抗体的大类，其具有高度肿瘤亲和性和特异性，但是当在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中制备时具有太小潜能而在临床是无用的(Umana，P.，等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999))。该研究是第一个证实大的ADCC活性增加能通过对抗体生产细胞进行工程化以过表达GnTIII获得，其也导致恒定区(Fc)-结合的、截开型寡糖(包括截开型非岩藻糖基化寡糖)的比例增加超过天然存在的抗体中发现的水平。

[0072] 术语“CD20抗原的表达”用于表明CD20抗原在分别来自于肿瘤或癌症(优选非实体瘤)的细胞中、优选在T-或B-细胞的细胞表面上、更优选B-细胞的细胞表面上显著表达水平。可以通过本领域已知的标准测定法确定患有“CD20表达癌症”的患者。“CD20抗原的表达”也优选用于表明CD20抗原在自身免疫性疾病的细胞中、优选在T-或B-细胞的细胞表面上、更优选B-细胞的细胞表面上显著水平的表达。例如使用免疫组织化学(IHC)检测、FACS或基于PCR的检测相应的mRNA来测定CD20抗原表达。

[0073] 本文所用的术语“CD20表达癌症”优选指淋巴瘤(优选B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和淋巴细胞性白血病。此种淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡型淋巴瘤，b)小无核裂细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤、散发性伯基特淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤，MALT)、结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)外套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合型细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞性白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性白血病(SLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病，i)浆细胞赘生物、浆细胞性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤，j)何杰金氏病。

[0074] 优选地，CD20表达癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。CD20表达癌症尤其是外套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤、毛细胞性白血病、滤泡型淋巴瘤、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴增生性障碍(PTLD)、HIV相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或原发性中枢神经系统淋巴瘤。

[0075] 本文所用的，“自身免疫性疾病”涉及由患者自身组织产生并且针对患者自身组织的疾病或障碍。自身免疫性疾病或障碍的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死溶解、系统性硬皮病和硬化症、与15炎性肠病相关的反应、克隆病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、血管球性肾炎、过敏状况、湿疹、哮喘、涉及T细胞渗出和慢性炎症应答的状况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、青少年型糖尿病、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应有关的免疫反应、结核病、肉样瘤病、肉芽肿病(包括韦格纳肉芽肿病)、粒细胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血、免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍(PRCA)、第VIII因子缺乏症、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球减少症、全血细胞减少症、白血球减少症、涉及白血球渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性障碍、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞病、巨淋巴结增生综合征(Castleman′s syndrome)、古德帕斯丘综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、雷诺综合征、舍格伦综合征(Sjorgen′s syndrome)、斯-约综合征(Stevens Johnson syndrome)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌病、肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺机能减退、自身免疫性内分泌障碍性疾病(包括自身免疫性甲状腺炎)、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退、艾迪生病、格雷夫斯病(Grave′s disease)、自身免疫性多腺体综合征(或多腺体I内分泌病综合征)、I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和希恩综合征、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、梗阻性细支气管炎(非移植)相对于NSIP、吉-巴综合征、大血管性血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞性(高安)动脉炎)、中血管性血管炎(包括川畸病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、伯格氏病(IgA肾病)、急进性肾小球性肾炎、原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻(非热带性口炎性腹泻)、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、冠心病等。

[0076] 通过将具有所需纯度的抗体与任选的可药用的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))混合以冻干制剂或水溶液的形式制备根据本发明使用的抗体的治疗制剂用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对接受者是无毒的。

[0077] 本文所用的术语“表面活性剂”指可药用的表面活性剂。在本发明的制剂中，表面活性剂的量以重量/体积百分比表达。最常使用的重量/体积单位是mg/ml。适宜的可药用TM TM的表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂，如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
而且，所述表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯失水山梨醇醚脂肪酸酯、聚氧乙烯化聚丙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。优选的聚氧乙烯失水山梨醇是聚氧乙烯(20)失TM
水山梨醇酯(别名为聚山梨酯20，以商标吐温(Tween)20 销售)和聚氧乙烯(20)失水山TM
梨醇醚单油酸酯(别名为聚山梨酯80，以商标吐温80 销售)。优选的聚氧乙烯化聚丙二TM
醇是以普朗尼克(Pluronic) F68或泊洛沙姆(Poloxamer)188 销售的那些物质。最优选TM TM
的是泊洛沙姆188 。优选的聚氧乙烯硬脂酸酯是以商标Myrj 销售的那些物质。优选的TM
聚氧乙烯单月桂醚是以商标Brij 销售的那些物质。当使用聚氧乙烯失水山梨醇-聚氧乙TM TM
烯(20)失水山梨醇酯(吐温20 )和聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(吐温80 )时，它们通常的用量是大约0.001至大约1％，优选大约0.005至大约0.1％并且更优选大约
0.01％至大约0.04％w/v。

[0078] 本文所用的术语“缓冲液”指可药用的缓冲液。适宜的可药用的缓冲液包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液包括L-组氨酸或L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐和等张剂，并且可能用本领域已知的酸或碱调节pH。最优选的是L-组氨酸。上述的组氨酸-缓冲液通常以大约1mM至大约100mM、优选大约5mM至大约50mM并且还更优选大约20mM的量使用。不依赖所使用的缓冲液，通过用本领域已知的酸或碱调节或者通过使用适当的缓冲成分的混合物或者二者将pH调节至包括大约4.5至大约7.0、优选大约5.5至大约6.5并且更优选大约6.0的值。

[0079] 本文所用的术语“等张剂”指可药用的等张剂。使用等张剂以提供等张制剂。等张制剂是液体或由固体形式(例如冻干形式)重构的液体，并且指具有与同它相比的其它一些溶液(如生理盐水溶液和血清)相同的张度的溶液。适宜的等张剂包括但不限于盐，包括但不限于氯化钠(NaCl)或氯化钾；糖，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘油和来自氨基酸、糖、盐及其组合的任何成分。等张剂通常以大约5mM至大约350mM的总量使用。

[0080] 本文所用的与根据本发明的制剂有关的术语“液体”指一种制剂，其在至少大约2至大约8℃的温度下为液体。

[0081] 本文所用的与根据本发明的制剂有关的术语“冻干的”指一种制剂，其用本领域已知的任何冷冻干燥方法(例如市售的冷冻干燥装置)通过将制剂冷冻然后使冰从冷冻的内容物中升华来干燥。

[0082] 本文所用的术语“盐”指大约1mM至大约500mM量的盐。所述盐的非限制性实例包括阳离子钠、钾、钙或镁与阴离子氯、磷酸根、柠檬酸根、琥珀酸根、硫酸根的任何组合的盐或者其混合物。

[0083] 本文所用的术语“氨基酸”指大约1至大约100mg/mL量的氨基酸，其包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸。

[0084] 本文所用的术语“糖”指大约25mM至大约500mM量的可药用的糖。优选的是100至300mM。更优选的是220至260mM。最优选的是240mM。适宜的糖包括但不限于单糖和二糖。根据本发明的糖的非限制性实例包括海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(通常所说的“葡甲胺”)、半乳糖胺和神经氨酸及其组合。最优选的是海藻糖。

[0085] 术语“稳定剂”指可药用的稳定剂，像例如但不限于如上面部分描述的氨基酸和糖以及本领域已知的任何种类和分子量的市售的葡聚糖。

[0086] 术语“抗氧化剂”指可药用的抗氧化剂。这可以包括如甲硫氨酸、苄醇的赋形剂或者用来使氧化降到最低的其它赋形剂。

[0087] 术语“治疗方法”或它的同等表达当用于例如癌症时，指用来减少或消除患者体内癌细胞数目或减轻癌症的症状的程序或过程。癌症或另外的增生性障碍的“治疗方法”不一定指癌症细胞或其它障碍会实际上被消除，细胞或障碍的数目会实际上被减少或者癌症或其它障碍的症状会实际上被减轻。通常，即使只具有低的成功可能性也会进行治疗癌症的方法，但是考虑到患者的病史和估计的生存预期，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。

[0088] 在一个方面中，本发明涉及抗CD20抗体制剂，其包含：

[0089] -大约1至大约150mg/mL的抗CD20抗体，

[0090] -大约0.001至大约1％的至少一种表面活性剂，和

[0091] -大约1至大约100mM的缓冲液，

[0092] -pH为大约4.5至大约7.0。

[0093] 在一个更优选的实施方案中，根据本发明的制剂包含：

[0094] -大约1至大约150mg/mL的抗CD20抗体，

[0095] -大约0.005至大约0.05％的至少一种表面活性剂，和

[0096] -大约1至大约100mM的缓冲液，

[0097] -pH为大约4.5至大约7.0。

[0098] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的制剂包含：

[0099] -大约10至大约30mg/mL的II型抗CD20抗体，

[0100] -20mM的L-组氨酸，

[0101] -240mM的海藻糖，和

[0102] -0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0103] -pH为大约6。

[0104] 在又一优选的实施方案中，根据本发明的制剂包含：

[0105] -大约10至大约30mg/mL的II型抗CD20抗体，

[0106] -0.02％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0107] -20mM的L-组氨酸，和

[0108] -240mM的海藻糖，

[0109] -pH为大约6。

[0110] 优选地，抗CD20抗体是I型抗体。更优选地，抗CD20抗体是II型抗体。甚至更优选地，抗CD20抗体是如WO2005/044859中详细地公开的“人源化B-Ly1抗体”。更优选地，所述抗体是HuMab。所述制剂包含1至大约150mg/ml的所述抗体，更优选大约5至大约100mg/ml的所述抗体，甚至更优选大约10至大约30mg/ml的所述抗体，或者选自大约5、10、15、20、25或30mg/ml的所述抗体，并且最优选25mg/ml的所述抗体。

[0111] 根据本发明的制剂可以是液体形式、冻干形式或由冻干形式重构的液体形式。

[0112] 在一个实施方案中，根据本发明的制剂是冻干制剂。根据本发明的冻干制剂对于更高分子量的颗粒和聚集物的形成具有改善的稳定性的优点，这用相同浓度的所述抗CD20抗体的液体制剂通常是难以达到的。

[0113] 可通过静脉注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)或任何其它非肠道给药方式(如药学领域中已知的那些)施用根据本发明的制剂。

[0114] 而且，根据本发明的制剂可以包含防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；尼泊金烷基酯类，如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；螯合剂，如EDTA；盐形成抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)。

[0115] 也可以将活性成分分别包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚甲基丙烯酸甲酯微囊)、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊)或微乳中。此种技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980)中。

[0116] 可以制备缓释制剂。适宜的缓释制剂的实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该基质是成形制品的形式(例如薄膜或微囊)。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、或聚乙烯醇)、聚丙交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸TM共聚物如LUPRONDEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

[0117] 用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤容易实现。

[0118] 优选地，如上文确定的，本发明的制剂包含大约5mM至大约350mM量的一种或多种等张剂。

[0119] 优选地，如上文确定的，本发明的制剂包含大约25mM至大约500mM量的糖。

[0120] 还优选地，本发明的制剂进一步包含一种或多种以下成分：抗氧化剂、抗坏血酸、谷胱甘肽、防腐剂，例如间甲酚、苯酚、苄醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯代丁醇、硫柳汞、苯扎氯铵、聚乙二醇，例如PEG 3000、3350、4000、6000、人血白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、多元醇、甘油、乙醇、甘露醇、盐、乙酸盐(例如乙酸钠)、氯化镁、氯化钙、氨基丁三醇、EDTA(例如Na-EDTA)。

[0121] 还优选地，本发明的制剂进一步包含一种或多种如上文定义的稳定剂和本领域也被称为“冻干保护剂”的成分(如本领域中已知的糖、糖醇、氨基酸和葡聚糖)。

[0122] 在某一实施方案中，本发明的制剂包含以下的液体、冻干或由冻干形式重构的液体制剂：

[0123] 15mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0124] 0.01％w/v的聚山梨酯20，

[0125] 20mM的L-组氨酸，和

[0126] 140mM的氯化钠，

[0127] pH 6.0；

[0128] 或者

[0129] 10mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0130] 0.01％w/v的聚山梨酯20，

[0131] 20mM的L-组氨酸，和

[0132] 140mM的氯化钠，

[0133] pH 6.0；

[0134] 或者

[0135] 15mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0136] 任选地0.001至1％w/v的表面活性剂，

[0137] 20mM的L-组氨酸，

[0138] pH 6.0；

[0139] 或者

[0140] 10mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0141] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0142] 20mM的L-组氨酸，和

[0143] 240mM的海藻糖，

[0144] pH 6.0；

[0145] 或者

[0146] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0147] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0148] 20mM的L-组氨酸，和

[0149] 240mM的海藻糖，

[0150] pH 6.0；

[0151] 或者

[0152] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0153] 0.02％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0154] 20mM的L-组氨酸，和

[0155] 240mM的海藻糖，

[0156] pH 6.0；

[0157] 或者

[0158] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0159] 0.01％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0160] 20mM的L-组氨酸，和

[0161] 240mM的海藻糖，

[0162] pH 6.0；

[0163] 或者

[0164] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0165] 0.1％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0166] 20mM的L-组氨酸，和

[0167] 240mM的海藻糖，

[0168] pH 6.0；

[0169] 或者

[0170] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0171] 0.02％w/v的聚山梨酯80，

[0172] 20mM的L-组氨酸，和

[0173] 240mM的海藻糖，

[0174] pH 6.0；

[0175] 或者

[0176] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0177] 0.1％w/v的聚山梨酯80，

[0178] 20mM的乙酸盐，和

[0179] 240mM的海藻糖，

[0180] pH 5.5；

[0181] 或者

[0182] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0183] 0.1％w/v的聚山梨酯80，

[0184] 20mM的乙酸盐，和

[0185] 140mM的氯化钠，

[0186] pH 5.5；

[0187] 或者

[0188] 30mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0189] 0.01％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0190] 20mM的L-组氨酸，和

[0191] 200mM的海藻糖，

[0192] pH 6.5；

[0193] 在根据本发明的制剂的优选的实施方案中，所述制剂是冻干形式并且用适量的注射用水重构后包含：

[0194] 10mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0195] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0196] 20mM的L-组氨酸，和

[0197] 240mM的海藻糖，

[0198] pH 6.0；

[0199] 这种制剂在储存于2-8℃和25℃时表现出对于物理终点(如聚集)和化学终点(例如断裂)具有足够稳定性的良好的稳定性。

[0200] 在根据本发明的制剂的优选的实施方案中，所述制剂是液体形式：

[0201] 25mg/mL的II型抗CD20抗体、优选人源化B-Ly1抗体、最优选HuMab，[0202] 0.2％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0203] 20mM的L-组氨酸，和

[0204] 240mM的海藻糖，

[0205] pH 6.0；

[0206] 在优选的实施方案中，所述制剂用于预防或减少患有CD20表达癌症的患者体内转移或进一步的扩散。所述制剂用于增加此类患者的生存期、增加此类患者的无进展生存期、增加反应持续时间，引起被治疗患者统计学显著和临床上有意义的改善，如通过生存期、无进展生存期、应答率或反应持续时间测定。在优选的实施方案中，所述制剂用于增加一组患者的应答率。

[0207] 在本发明的上下文中，可以将其它另外的细胞毒性剂、化学治疗剂或抗癌剂，或者增强此种治疗剂的效应的化合物与根据本发明的抗CD20抗体制剂组合使用。

[0208] 此种治疗剂包括，例如：烷化剂或具有烷化作用的药物，如环磷酰胺(CTX；例如)、苯丁酸氮芥(CHL；例如 )、顺铂(CisP；例如 )、白消安(例如 )、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、链脲霉素、曲他胺(TEM)、丝裂霉素C等；抗代谢药，例如甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP16；例如 )、6-巯基嘌呤(6MP)、6-硫胍(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(例如)、达卡巴嗪(DTIC)等；抗生素，例如放线菌素D、多柔比星(DXR；例如 )、
柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、道诺霉素等；生物碱，例如长春花生物碱，如长春新碱(VCR)、长春碱等；和其它抗肿瘤剂，例如紫杉醇(例如 )和紫杉醇衍生物、细胞生长抑制剂、如地塞米松(DEX；例如 )的糖皮质激素和如泼尼松的皮质激素、核苷酶抑制剂如羟基脲、氨基酸消耗酶如天冬酰胺酶、亚叶酸和其它叶酸衍生物以及相似的、多种多样的抗肿瘤剂。以下药物也可用作另外的药物：氨磷汀(例如 )、更生霉素、氮芥、链脲霉素、环磷酰胺、罗氮芥(CCNU)、多柔比星脂质体(例如 )、吉西他滨(例如 )、柔红霉素脂质体(例如 )、丙卡巴肼、丝裂霉素、多西他赛
(例如 )、阿地白介素、卡铂、奥沙利铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT 11(伊立替康)、
10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌、拓扑替康、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巯嘌呤、普卡霉素、米托坦、天门冬酰胺酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酪、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春烯碱、苯丁酸氮芥。优选地，采用没有此种另外的药物的抗CD20抗体组合治疗。

[0209] 上述细胞毒性剂和抗癌剂以及抗增殖靶-特异性抗癌药(如蛋白激酶抑制剂)在化学治疗方案中的用途在癌症治疗领域中被很好地表征，并且本文它们的使用受到同样的考虑以监控耐受性和有效性以及控制施用途径和剂量，进行一些调整。例如，细胞毒性剂的实际剂量可根据通过使用组织培养方法确定的患者的培养细胞响应而变化。通常地，相对于不存在其它另外的药物时所使用的量会减小剂量。

[0210] 有效的细胞毒性剂的典型剂量可以在厂商推荐的范围内，并且在由体外反应或动物模型中的反应指明的情况中，能被减小高达约一个数量级浓度或量。因此，实际剂量将取决于医师的判断、患者的状况和治疗方法的有效性(基于原代培养的恶性细胞或组织培养的组织样品的体外反应性、或者在适当的动物模型中观察到的反应)。

[0211] 在本发明的上下文中，除了根据本发明的抗CD20抗体制剂之外，可以进行有效量的电离放射和/或可以使用放射药物。放射源对于治疗中的患者可以是外部的或内部的。当放射源对于患者是外部的时，治疗称为外线束放射疗法(EBRT)。当放射源对于患者是内部的时，治疗称为近距离放射疗法(BT)。用于本发明的上下文中的放射性原子可以选自，但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。也可能用此种放射性同位素标记抗体。优选地，在没有此种电离放射的情况下使用根据本发明的抗CD20抗体制剂。

[0212] 放射治疗是用于控制不能切除的或不能手术治疗的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。当放射治疗与化学治疗结合时已经看到改善的结果。放射治疗基于递送到靶区的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织中的增殖细胞死亡的原理。放射剂量方案通常根据辐射吸收的剂量(Gy)、时间和分级确定，并且必须由肿瘤学专家认真确定。患者接受的放射量将取决于各种不同的考虑，但最重要的两点是肿瘤相对于身体其它重要结构或器官的位置和肿瘤扩散的程度。经受放射治疗的患者的典型疗程是1至6周周期，一周5天以大约1.8至2.0Gy的单日分剂量施用给患者，总剂量为10至80Gy之间。在本发明优选的实施方案中，当用根据本发明的制剂和放射治疗人患者体内的肿瘤时存在协同作用。换言之，当与放射、任选与另外的化学治疗剂或抗癌剂结合时，增强了包含本发明的组合的药物对肿瘤生长的抑制。辅助放射治疗的参数例如包含于WO 99/60023中。

[0213] 通过作为推注的静脉注射或通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径的一段时间的连续输注，根据已知方法将抗体制剂施用给患者。优选静脉或皮下施用抗体。

[0214] 本发明进一步包含药盒，其特征在于包含容器、容器内包含所述抗CD20抗体制剂的组合物和指导制剂的使用者将所述抗CD20抗体制剂施用给患有CD20表达癌症的患者的包装说明书。

[0215] 术语“包装说明书”指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其可包括关于此种治疗产品使用的有关适应症、用法、剂量、给药、禁忌证和/或注意事项的信息。

[0216] 在优选的实施方案中，成品容器可进一步包括可药用的载体。成品可进一步包括无菌稀释剂，其优选储存于另外的单独容器中。

[0217] 如本文所用的，“可药用的载体”用来包括与药物施用相容的任何和所有的材料，包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂和其它与药物施用相容的材料和化合物。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容外，其在本发明的组合物中的使用被考虑。辅助的活性化合物也可掺入组合物。

[0218] 在本发明的又一实施方案中，根据本发明的制剂包含I型抗CD20抗体，其与根据本发明的II型抗CD20抗体共同施用。根据本发明的制剂对于每个抗CD20抗体可以是两个独立的制剂。备选地，本文的制剂也可以在一种制剂中含有两种抗体。

[0219] 在本发明的又一实施方案中，根据本发明的制剂包含抗CD20抗体，因为所述抗CD20抗体与抗Bcl-2活性剂共同施用。本文所用的术语“Bcl-2”指Bcl-2蛋白质(Swiss Prot ID No.P10415)，是Bcl-2蛋白质家族的成员。术语“抗Bcl-2活性剂”包含“抗Bcl-2反义核苷酸”和“Bcl-2抑制剂”。“抗Bcl-2反义核苷酸”下调Bcl-2mRNA水平并减少Bcl-2蛋白质表达。此种抗Bcl-2反义核苷酸的实例包括Oblimersen和SPC-2996。本文所用的ABT-737意指N-[4-[4-(4′-氯联苯-2-基甲基)哌嗪-1-基]苯甲酰基]-3-[3-(二甲氨基)-1(R)-(苯硫烷基甲基)丙氨基]-4-硝基苯磺酰胺；4-[4-(4′-氯联苯-2-基甲基)哌嗪-1-基]-N-[3-[3-(二甲氨基)-1(R)-(苯硫烷基甲基)丙氨基]-4-硝基苯磺酰基]苯甲酰胺(Bcl-2抑制剂)，其描述于WO 2006/099667或Corey，S.，等人，Cancer Cell(2005)5-6中。本文所用的BT-263意指Bcl-2抑制剂，其描述于US 2007027135中。优选地，抗Bcl-2活性剂选自Oblimersen、SPC-2996、TA-402、棉酚、AT-101、Obatoclax甲磺酸盐、A-371191、A-385358、A-438744、ABT-737、AT-101、BL-11、BL-193、GX-15-003、2-甲氧基抗霉素A3、HA-14-1、KF-67544、红紫棓精、TP-TW-37、YC-137和Z-24。优选地，抗Bcl-2活性剂是Bcl-2蛋白结合抑制剂，其抗Bcl-2抑制活性的IC50为5μM或5μM以下。此种Bcl-2蛋白结合抑制剂优选选自棉酚、AT-101、Obatoclax甲磺酸盐、ABT-263和ABT-737，更优选选自ABT-263或ABT-737。

[0220] 在本发明的又一实施方案中，根据本发明的制剂包含抗CD20抗体，因为所述抗CD20抗体与蛋白酶体抑制剂共同施用。本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”指抑制26S蛋白酶体活性的药物。此种蛋白酶体抑制剂包括尤其是例如肽衍生物，如肽醛(例如MG132、MG115、CEP-1615、PSI或免疫蛋白酶体特异性抑制剂IPSI-001(Cbz-LnL-CHO＝N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸，见US 20060241056)、肽硼酸盐(例如硼替佐米(bortezomib，PS-341)或DFLB)、肽环氧酮(例如epoxomicin、dihydroeponemycin或epoxomicin衍生物carfilzomib(PR-171))或肽乙烯基砜(例如NLVS)和非肽衍生物(例如salinosporamide A(NPI-0052)、salinosporamide A衍生物、乳胞素或乳胞素衍生物(例如clasto-乳胞素-L-内酯(omuralide)或PS-519)。所述蛋白酶体抑制剂的不同类型和结构描述于例如Kisselev，A.L.，等人，Chem Biol(2001)739-758；WO 2004/004749和Joazeiro，C.，等人，Res 66(16)(2006)7840-7842；Kanagasabaphy，等人，Curr Opin Investig Drugs8(2007)447-51；Adams，J.，Nat Rev Cancer 4(2004)349-360及US 20060241056中。

[0221] 优选地，此种蛋白酶体抑制剂选自肽醛(优选N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸(IPSI-001))、肽硼酸盐(优选硼替佐米(PS-341))、肽环氧酮(优选epoxomicin衍生物carfilzomib(PR-171))或salinosporamideA(NPI-0052)。更优选地，此种蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米(PS-341)、carfilzomib(PR-171)、salinosporamide A(NPI-0052)或选N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸(IPSI-001)。

[0222] 在优选的实施方案中，蛋白酶体抑制剂是选自肽醛(优选N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸(IPSI-001))、肽硼酸盐(优选硼替佐米(PS-341))或肽环氧酮的肽衍生物。在另一优选的实施方案中，蛋白酶体抑制剂是肽硼酸盐(优选硼替佐米(PS-341)；见例如Adams，Cur.Opin.Chem Biol.6(2002)493-500和US 5,780,454)。

[0223] 优选地，蛋白酶体抑制剂的抗蛋白酶体抑制活性的IC50是5μM或5μM以下，更优选1μM或1μM以下。用于鉴定此种蛋白酶体抑制剂和用于确定抗蛋白酶体抑制活性的IC50的基于细胞的测定法(通过系列稀释和使用非线性曲线拟合计算(XLfit 软件(ID Business Solution Ltd.，Guilford，Surrey，UK))描述于Moravec，等人，Cell Notes15(2006)4-7中，其使用来自Promega的Proteasome-GloTM基于细胞的测定法试剂与U266细胞(人血浆骨髓瘤)。这种“添加-混合-测定”方法测定培养的细胞中与蛋白酶体相关的糜蛋白酶样蛋白酶活性。

[0224] 除了IPSI-001(Cbz-LnL-CHO＝N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸)之外，US20060241056中的以下肽衍生物也是优选的蛋白酶体抑制剂：N-苄氧羰基-高苯丙氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-亮氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-丙氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-丙氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸硼酸、N-苄氧羰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-高苯丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-亮氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-亮氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-高苯丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-亮氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-亮氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-甘氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-苄氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-高苯丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-亮氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-甘氨酰基-脯氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮、N-苄氧羰基-亮氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸环氧酮和N-苄氧羰基-甘氨酰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸环氧酮。

[0225] 提供以下实施例和附图来帮助理解本发明，其真正的范围阐述于所附的权利要求中。应理解在不偏离本发明的精神的情况下可以在所给出的步骤中进行修改。实施例

[0226] 实施例1

[0227] 制备以下液体、冻干或由冻干形式重构的液体制剂：

[0228] 15mg/mL的HuMab，

[0229] 0.01％w/v的聚山梨酯20，

[0230] 20mM的L-组氨酸，和

[0231] 140mM的氯化钠，

[0232] pH 6.0；

[0233] 10mg/mL的HuMab，

[0234] 0.01％w/v的聚山梨酯20，

[0235] 20mM的L-组氨酸，和

[0236] 140mM的氯化钠，

[0237] pH 6.0；

[0238] 15mg/mL的HuMab，

[0239] 20mM的L-组氨酸，

[0240] pH 6.0；

[0241] 10mg/mL的HuMab，

[0242] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0243] 20mM的L-组氨酸，和

[0244] 240mM的海藻糖，

[0245] pH 6.0；

[0246] 25mg/mL的HuMab，

[0247] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0248] 20mM的L-组氨酸，和

[0249] 240mM的海藻糖，

[0250] pH 6.0。

[0251] 还制备了冻干形式，其用适量的注射用水重构后包含：

[0252] 10mg/mL的HuMab，

[0253] 0.02％w/v的聚山梨酯20，

[0254] 20mM的L-组氨酸，和

[0255] 240mM的海藻糖，

[0256] pH 6.0；

[0257] 该制剂在储存于2-8℃和25℃时表现出良好的稳定性，对于物理终点(如聚集)和化学终点(例如断裂)具有足够的稳定性。

[0258] 如下开发根据本发明用于肠胃外施用的液体和冻干药物产品制剂：

[0259] 液体制剂的制备

[0260] 通过将HuMab在制备缓冲液(例如pH大约为6.0的20mM组氨酸缓冲液或含有140mM氯化钠和0.01％(w/v)聚山梨酯20的pH大约为6.0的20mM组氨酸缓冲液)中的溶液匀化制备HuMab的制剂。还可以通过用缓冲液稀释将蛋白质浓度调节至所需浓度制备HuMab的制剂。按照需要添加用于稳定蛋白质和用于张度调节的赋形剂并且可以以溶解形式或者备选地以固体添加。按照需要将表面活性剂添加到制剂中作为贮备液。将全部的制剂通过0.22μm 过滤器过滤除菌，然后无菌等分至无菌玻璃瓶并用橡皮塞和铝质钳口盖(alucrimp cap)密封。将这些制剂储存在不同的温度不同的时程，在单个段落中标明的时间点取出用于分析。对制剂进行如下分析1)通过UV分光光度法，2)通过大小排阻层析(SEC)，3)通过可见和亚可见的颗粒，4)通过离子交换层析法(IEC)和5)通过溶液的浊度。

[0261] 冻干制剂的制备

[0262] 如上文对液体制剂所述制备HuMab的溶液，或通过将HuMab在pH大约为6.0的20mM组氨酸的HuMab溶液匀化制备，其含有糖和表面活性剂。将全部的制剂通过0.22μm过滤器过滤除菌，然后无菌等分至无菌玻璃瓶。用适用于冻干过程的橡皮塞部分密封玻璃瓶，然后转移至冷冻干燥器的干燥室中。本领域中已知的任何冻干方法都意欲包括在本发明的范围内。例如，本研究中采用的冻干过程包括将制剂从室温冷却至约5℃(预冷却)，然后以约1℃/分钟至5℃/分钟的降温速率在-40℃下冷冻(冷冻I)。第一干燥步骤可以以0.3至0.5℃/分钟的升温速率从-40℃至-30℃进行，然后在约75至
80毫托的室压力下-30℃保持至少50小时。第二干燥步骤可以以0.1至0.3℃/分钟的升温速率从-30℃至25℃进行，然后在约50至80毫托的室压力下25℃保持至少5小时(采用的干燥方案示于表1中)。发现使用描述的冻干过程干燥的HuMab制剂方便地具有大约2-3分钟的快速重构时间。根据卡尔-费歇尔法(Karl-Fischer method)，本研究中所有的冻干饼的残余含水量为约0.1至1.0％。将冻干小瓶储存于不同温度不同的时间间隔。用各自体积的注射用水(WFI)重构冻干制剂，然后1)通过UV分光光度法分析，2)确定重构时间，3)通过大小排阻层析法(SEC)分析，4)通过离子交换层析法(IEC)，5)测定亚可见和可见的颗粒和6)通过溶液的浊度。

[0263] 进行大小排阻层析(SEC)来检测制剂中高分子量物质(聚集体)和低分子量水解产物。该方法使用适宜的装配有UV检测器(检测波长：280nm)和Zorbax GF-250柱(9.4x250mm，安捷伦)的HPLC仪；该方法采用200mM pH 7.0的磷酸钠作为流动相。

[0264] 进行离子交换层析(IEC)来检测改变制剂中HuMab的净电荷的化学降解产物。该方法使用适宜的装配有UV检测器(检测波长为220和280nm)和Dionex ProPac WCX-10柱(4mmx250mm)的HPLC仪。分别采用10mM pH 6.0的磷酸钠在水中的缓冲液和10mM pH 6.0的磷酸钠缓冲液+0.75M NaCl作为流动相A和B，流速为1.0mL/分钟。

[0265] 在arian Cary Bio UV分光光度计上于280nm进行用于测定蛋白质浓度的UV分光光度法。

[0266] 为了测定浊度，使用HACH 2100AN浊度计在室温下以FTU(浊度单位)测量乳光。

[0267] 通过使用HIAC Royco PharmaSpec(HRLD-150)分析样品的亚可见颗粒，使用Seidenader V90-T视觉检测仪分析样品的可见颗粒。

[0268] 表1冷冻-干燥循环

[0269]升温速率保持时间真空设定点
步骤储存温度(℃)
(℃/分钟) (分钟) (毫托)
预冷却 5℃ 0.0 60 -
冷冻I -40℃ 1.0 120 -
初次干燥 -30℃ 0.5 3720 80
二次干燥 +25℃ 0.2 300 80

[0270] 根据本发明的液体HuMab药物产品制剂的稳定性数据

[0271] 制剂15mg/mL HuMab，20mM L-组氨酸，pH 6.0，

[0272]

[0273]

[0274] n/d：未测定

[0275] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0276] 制剂10mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.02％w/v聚山梨酯20、pH 6.0，

[0277]

[0278]

[0279] n/d：未测定

[0280] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0281] 根据本发明的冻干HuMab药物产品制剂的稳定性数据

[0282] 制剂10mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.02％w/v聚山梨酯20、pH 6.0，

[0283]

[0284] n/d：未测定

[0285] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0286] 实施例2

[0287] 制备以下液体、冻干或由冻干形式重构的液体的制剂：

[0288] 15mg/mL的HuMab，

[0289] 0.02％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0290] 20mM的L-组氨酸，和

[0291] 240mM的海藻糖，

[0292] pH 6.0；

[0293] 或者

[0294] 25mg/mL的HuMab，

[0295] 0.01％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0296] 20mM的L-组氨酸，和

[0297] 240mM的海藻糖，

[0298] pH 6.0；

[0299] 或者

[0300] 25mg/mL的HuMab，

[0301] 0.1％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0302] 20mM的L-组氨酸，和

[0303] 240mM的海藻糖，

[0304] pH 6.0；

[0305] 或者

[0306] 25mg/mL的HuMab，

[0307] 0.02％w/v的聚山梨酯80，

[0308] 20mM的L-组氨酸，和

[0309] 240mM的海藻糖，

[0310] pH 6.0；

[0311] 或者

[0312] 25mg/mL的HuMab，

[0313] 0.1％w/v的聚山梨酯80，

[0314] 20mM的乙酸盐，和

[0315] 240mM的海藻糖，

[0316] pH 5.5；

[0317] 或者

[0318] 25mg/mL的HuMab，

[0319] 0.1％w/v的聚山梨酯80，

[0320] 20mM的乙酸盐，和

[0321] 140mM的氯化钠，

[0322] pH 5.5；

[0323] 或者

[0324] 30mg/mL的HuMab，

[0325] 0.01％w/v的泊洛沙姆188TM，

[0326] 20mM的L-组氨酸，和

[0327] 200mM的海藻糖，

[0328] pH 6.5；

[0329] 如下制备用于肠胃外施用的液体和冻干药物产品制剂：

[0330] 液体制剂的制备

[0331] 通过将HuMab在制备缓冲液(例如含有240mM海藻糖和0.02％(w/v)泊TM洛沙姆188 的pH大约为6.0的20mM组氨酸缓冲液)中的溶液匀化制备HuMab的制剂。还可以通过切向流过滤对约10-40mg/ml HuMab在制备缓冲液(例如pH大约为6.0的20mM组氨酸缓冲液)中的溶液进行渗滤以使蛋白浓度增加至超过靶蛋白浓度并交换缓冲液来制备HuMab的制剂。还可以通过用缓冲液稀释将蛋白质浓度调节至所希望的浓度制备HuMab的制剂。可以以溶解形式或者备选地以固体添加用于稳定蛋白质和用于张度调节的赋形剂。按照需要将表面活性剂添加到作为贮备液的制剂中。将全部的制剂通过0.22μm过滤器过滤除菌，然后无菌等分至无菌玻璃瓶并用橡皮塞和铝质钳口盖密封。将这些制剂储存在不同的温度不同的时程，在单个段落中标明的时间点取出用于分析。对制剂进行如下分析1)通过UV分光光度法，2)通过大小排阻层析(SEC)，3)可见和亚可见的颗粒，4)通过离子交换层析(IEC)和5)通过溶液的浊度。

[0332] 冻干制剂的制备

[0333] 如上文对液体制剂所述制备的溶液。将全部的制剂通过0.22μm过滤器过滤除菌，然后无菌等分至无菌玻璃瓶。用适用于冻干过程的橡皮塞部分密封玻璃瓶，然后转移至冷冻干燥器的干燥室中。本领域中已知的任何冻干方法都意欲包括在本发明的范围内。例如，本研究中采用的冻干过程包括将制剂从室温冷却至约5℃(预冷却)，然后以约1℃/分钟至5℃/分钟的降温速率在-40℃下冷冻(冷冻I)。第一干燥步骤可以以0.3至
0.5℃/分钟的升温速率从-40℃至-30℃进行，然后在约75至80毫托的室压力下-30℃保持至少50小时。第二干燥步骤可以以0.1至0.3℃/分钟的升温速率从-30℃至25℃进行，然后在约50至80毫托的室压力下25℃保持至少5小时(采用的干燥方案示于表1中)。根据卡尔-费歇尔法，发现使用描述的冻干过程干燥的HuMab制剂的残余含水量为约0.1至1.0％。将冻干小瓶储存于不同温度下不同的时间间隔。用相应体积的注射用水(WFI)重构冻干制剂，然后1)通过UV分光光度法分析，2)通过大小排阻层析(SEC)分析，3)通过离子交换层析(IEC)，4)测定亚可见和可见的颗粒和5)通过溶液的浊度分析。

[0334] 进行大小排阻层析(SEC)来检测制剂中高分子量物质(聚集体)和低分子量水解产物。该方法使用适宜的装配有UV检测器(检测波长280nm)和Zorbax GF-250柱(9.4x250mm，安捷伦)或TSKgel G3000SWXL(7.8x300mm)的HPLC仪；该方法采用200mM pH7.0的磷酸钠或pH 7.0的200mM磷酸钾中的250mM氯化钾作为流动相。

[0335] 进行离子交换层析(IEC)来检测改变制剂中HuMab的净电荷的化学降解产物。该方法使用适宜的装配有UV检测器(检测波长为220和280nm)和Dionex ProPac WCX-10柱(4mmx250mm)的HPLC仪。分别采用10mM pH 6.0的磷酸钠在水中的缓冲液和10mM pH 6.0的磷酸钠缓冲液+0.75M NaCl作为流动相A和B，流速为1.0mL/分钟。

[0336] 在arian Cary Bio或Perkin Elmer UV分光光度计上于280nm进行用于测定蛋白质浓度的UV分光光度法。

[0337] 为了测定浊度，使用HACH 2100AN浊度计在室温下以FTU(浊度单位)测量乳光。

[0338] 通过使用HIAC Royco PharmaSpec(HRLD-150)分析样品的亚可见颗粒，通过使用Seidenader V90-T视觉检测仪分析样品的可见颗粒。

[0339] 表1冷冻-干燥循环

[0340]升温速率保持时间真空设定点
步骤储存温度(℃)
(℃/分钟) (分钟) (毫托)
预冷却 5℃ 0.0 60 -
冷冻I -40℃ 1.0 120 -
初次干燥 -30℃ 0.5 3720 80
二次干燥 +25℃ 0.2 300 80

[0341] 液体HuMab药物产品制剂的稳定性数据

[0342] 制剂25mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.02％w/v泊洛沙姆TM188 、pH 6.0，

[0343]储存条储存 SEC
时间蛋白质 SEC单 IEC主可见颗亚可见
件 (mg/mL) 体(％) HMW 浊度
(月) (％) 峰(％) 粒颗粒
最初 25.7 98.7 1.3 6.4 61.6 合格合格
2-8℃ 1 25.6 98.7 1.3 6.0 62.0 合格合格
3 26.1 98.6 1.3 5.9 61.0 合格合格
25℃ 1 25.7 98.5 1.4 6.5 62.0 合格合格
3 26.0 97.9 1.5 5.9 58.5 合格合格
40℃ 1 25.7 97.9 1.6 6.6 52.6 合格合格
3 25.7 91.0 2.4 6.7 33.6 合格合格
-80℃ 3 25.6 98.7 1.3 6.2 60.9 合格合格
-20℃ 3 25.5 98.7 1.3 6.3 60.8 合格合格

[0344]

[0345] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0346] 制剂25mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.01％w/v泊洛沙姆TM188 、pH 6.0，

[0347]

[0348] n/a：未分析

[0349] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0350] 制剂25mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.1％w/v泊洛沙姆TM188 、pH 6.0，

[0351]

[0352] n/a：未分析

[0353] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0354] 制剂25mg/mL HuMab、20mM乙酸盐、240mM海藻糖、0.1％w/v聚山梨酯80、pH 5.5，

[0355]储存条储存 SEC SEC IEC主可见颗亚可见
时间蛋白质单体 HMW 浊度
件 (mg/mL) 峰(％) 粒颗粒
(月) (％) (％)
最初 24.6 99.6 0.4 8.2 71.9 合格合格
2-8℃ 1 24.8 99.7 0.3 4.9 n/a 合格合格
2 24.5 99.4 0.6 5.2 72.6 合格合格
3 24.3 99.4 0.6 7.0 66.2 合格合格
25℃ 1 n/a 99.6 0.4 6.7 n/a 合格合格
2 n/a 99.3 0.7 7.0 71.9 合格合格
3 n/a 99.2 0.8 7.3 65.1 合格合格
40℃ 1 n/a 97.5 1.0 26.8 52.9 合格合格
2 n/a 96.0 2.1 27.8 42.1 合格合格
3 n/a 94.4 3.2 26.8 n/a 合格合格

[0356]

[0357] n/a：未分析

[0358] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0359] 制剂25mg/mL HuMab、20mM乙酸盐、140mM氯化钠、0.1％w/v聚山梨酯80、pH 5.5，

[0360]储存条储存 SEC SEC IEC主可见颗亚可见
时间蛋白质单体 HMW 浊度
件 (mg/mL) 峰(％) 粒颗粒
(月) (％) (％)
最初 23.7 99.5 0.5 11.4 70.9 合格合格
2-8℃ 1 24.4 99.6 0.4 11.4 n/a 合格合格
2 24.2 99.4 0.6 10.5 71.5 合格合格
3 24.2 99.3 0.7 12.5 71.3 合格合格
25℃ 1 n/a 99.5 0.5 12.0 n/a 合格合格
2 n/a 99.1 0.9 013.0 68.2 合格合格
3 n/a 99.1 0.9 13.2 64.6 合格合格
40℃ 1 n/a 96.9 1.2 26.8 54.0 合格合格
2 n/a 95.0 2.9 26.5 46.1 合格合格
3 n/a 93.1 4.2 26.1 n/a 合格合格

[0361] n/a：未分析

[0362] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0363] 制剂30mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.01％w/v泊洛沙姆TM188 、pH 6.5，

[0364]储存条储存蛋白质 SEC SEC IEC主可见颗亚可见
时间单体 HMW 浊度
件 (mg/mL) 峰(％) 粒颗粒
(月) (％) (％)
最初 32.0 98.4 1.6 6.4 61.0 合格合格
2-8℃ 1 32.2 98.3 1.6 6.6 62.3 合格合格
3 32.9 98.1 1.7 5.7 60.5 合格合格
25℃ 1 32.2 98.1 1.8 6.2 60.9 合格合格
3 32.1 97.6 2.0 6.2 56.5 合格合格
40℃ 1 32.0 97.3 2.1 6.3 50.9 合格合格
3 32.3 89.9 3.0 7.2 31.1 合格合格
-80℃ 3 31.8 98.3 1.6 6.2 61.0 合格合格
-20℃ 3 32.1 98.3 1.6 6.6 60.7 合格合格

[0365] 合格：基本上不含可见颗粒，最多6000个颗粒≥10μm/容器，最多600个颗粒≥25μm/容器

[0366] 冻干HuMab药物产品制剂的稳定性数据

[0367] 制剂25mg/mL HuMab、20mM L-组氨酸、240mM海藻糖、0.02％w/v泊洛沙姆TM188 ，

[0368]储存条储存 SEC SEC
时间蛋白质单体 HMW 浊度 IEC 可见亚可见
件 (mg/mL) 主峰(％) 颗粒颗粒
(月) (％) (％)
最初 25.5 98.9 1.0 6.2 61.2 合格合格
2-8℃ 1 25.2 99.0 1.0 5.8 63.1 合格合格
3 25.3 99.0 1.0 6.1 60.4 合格合格
25℃ 1 25.4 98.9 1.0 6.0 62.9 合格合格

标题	发布/更新时间	阅读量
用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠胃外非全身性施用	2020-05-16	623
含有单克隆抗独特型抗CA-125抗体和铝的药物组合物	2020-05-15	174
氟吡汀可注射盖伦剂型	2020-05-15	895
用于肠胃外给药的延迟释放制剂及其制备方法	2020-05-12	248
用于肠胃外给药的包含EPA甘油三酯和DHA甘油三酯的组合物	2020-05-14	527
肠胃道外给药的多恩达隆医药组合物	2020-05-11	346
肠胃外给药的对乙酰氨基酚	2020-05-11	544
肠胃道外给药的多恩达隆医药组合物	2020-05-11	353
一种医用肠胃外科给药装置	2020-05-13	537
中药应急宝盒	2020-05-16	203

抗体制剂

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