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抗PAR2抗体及其用途

阅读：1018发布：2021-06-14

专利汇可以提供抗PAR2抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本披露提供了能够结合PAR2的 抗体 和 抗原 结合 片段 。在一些 实施例 中，这些抗PAR2抗体或其抗原结合片段以pH依赖性的方式结合PAR2。本披露进一步提供了用于制备和使用这些抗体和抗原结合片段的方法。，下面是抗PAR2抗体及其用途专利的具体信息内容。

1.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和
轻链可变结构域(VL)，其中该VH包含：
i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:3的序列中的VH-CDR1；
ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:4的序列中的VH-CDR2；和
iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:5的序列中的VH-CDR3；
并且其中该VL包含：
i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:8的序列中的VL-CDR1；
ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:9的序列中的VL-CDR2；和
iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:10的序列中的VL-CDR3；
其中当在PAR2结合测定中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和
SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，这些氨基酸取代、缺失或插入使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低不超过1000、800、700、500、400、
300、200、100、50或10倍。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中这些氨基酸取代、缺失或插入包含
同源取代。
3.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和
轻链可变结构域(VL)，其中该VH包含：
i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1；
ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:4
的位置1-17的任一个或多个氨基酸位置上的VH-CDR2；和
iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:
5的位置1-8的任一个或多个氨基酸位置上的VH-CDR3；
并且其中该VL包含：
i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1；
ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2；和
iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID 
NO:10的位置1-14的任一个或多个氨基酸位置上的VL-CDR3。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：
i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1，
ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH-CDR2，
iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH-CDR3，
并且其中该VL包含：
i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1，
ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2，
iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR3。
5.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：
i)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH-CDR1，
ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH-CDR2，
iii)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH-CDR3，
并且其中该VL包含：
i)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL-CDR1，
ii)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL-CDR2，
iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL-CDR3。
6.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4
的位置5、8、12、16、和17的氨基酸位置上；并且其中组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置2和3的氨基酸位置上。
7.如权利要求3或5-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对应
于SEQ ID NO:4的位置5的氨基酸位置上。
8.如权利要求3或5-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对应
于SEQ ID NO:4的位置7的氨基酸位置上。
9.如权利要求3或5-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对应
于SEQ ID NO:4的位置8的氨基酸位置上。
10.如权利要求1或5-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置12的氨基酸位置上。
11.如权利要求3或5-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置15的氨基酸位置上。
12.如权利要求3或5-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置16的氨基酸位置上。
13.如权利要求1或5-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置17的氨基酸位置上。
14.如权利要求3或5-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置5和8的氨基酸位置上。
15.如权利要求3或5-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置5、8、12、和16的氨基酸位置上。
16.如权利要求3或5-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:4的位置5、8、12、16和17的氨基酸位置上。
17.如权利要求3或5-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:5的位置2的氨基酸位置上。
18.如权利要求3或5-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:5的位置3的氨基酸位置上。
19.如权利要求3或5-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:5的位置2和3的氨基酸位置上。
20.如权利要求3或5-19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:10的位置1的氨基酸位置上。
21.如权利要求3或5-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:10的位置5的氨基酸位置上。
22.如权利要求3或5-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:10的位置6的氨基酸位置上。
23.如权利要求3或5-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中组氨酸存在于对
应于SEQ ID NO:10的位置14的氨基酸位置上。
24.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含选自由以下组成
的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、
154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、
344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、
534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、
724、734、744、754、764、774、784、794、和811-818。
25.如权利要求3或24所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR3包含选自由以下
组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、
145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、
335、345、355、365、375、385、395、405、415、425、435、445、455、465、475、485、495、505、515、
525、535、545、555、565、575、585、595、605、615、625、635、645、655、665、675、685、695、705、
715、725、735、745、755、765、775、785、795、和819-820。
26.如权利要求3、24或25所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VL-CDR3包含选自由以
下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、
140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、
330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、
520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、
710、720、730、740、750、760、770、780、790和800。
27.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含对应于SEQ ID 
NO:14的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
28.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含对应于SEQ ID 
NO:811的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:819的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。
29.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含对应于SEQ ID 
NO:814的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:820的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。
30.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含对应于SEQ ID 
NO:816的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。
31.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH-CDR2包含对应于SEQ ID 
NO:818的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。
32.如权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与SEQ ID 
NO:803-806中的每一个具有至少90％同一性的框架区。
33.如权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与SEQ ID 
NO:803-806中的每一个具有至少95％同一性的框架区。
34.如权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含对应于SEQ 
ID NO:803-806的框架区。
35.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含与SEQ ID 
NO:807-810中的每一个具有至少90％同一性的框架区。
36.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含与SEQ ID 
NO:807-810中的每一个具有至少95％同一性的框架区。
37.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含对应于SEQ 
ID NO:807-810的框架区。
38.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与选自由以下组成的组
的序列具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、
172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、
362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、
552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、
742、752、762、772、782、792、和821-831。
39.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VL包含与选自由以下组成的组
的序列具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、
177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、
367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、
557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、
747、757、767、777、787、和797。
40.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含对应于SEQ ID NO:821
的氨基酸序列，并且其中该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。
41.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含对应于SEQ ID NO:824
的氨基酸序列，并且其中该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。
42.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含对应于SEQ ID NO:827
的氨基酸序列，并且其中该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。
43.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含对应于SEQ ID NO:831
的氨基酸序列，并且其中该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。
44.如权利要求3-39中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含与SEQ ID 
NO:12具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且其中该VL包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
45.如权利要求1-44中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段是抗原结合片段。
46.如权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗原结合片段是scFv。
47.如权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗原结合片段是Fab’。
48.如权利要求1-44中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段是抗体。
49.如权利要求48所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是单克隆抗体。
50.如权利要求48或49所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是IgG抗体。
51.如权利要求1-50中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段是人源化的。
52.如权利要求1-50中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段是人的。
53.如权利要求1-52中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核
酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、
171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、
361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、
551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、
741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。
54.如权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核酸包含与
SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、
191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、
381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、
571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、
761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少95％同一性的核苷酸序列。
55.如权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核酸包含SEQ 
ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、
201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、
391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、
581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、
771、781、791、和833-841中任一项的核苷酸序列。
56.如权利要求1-55中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核
酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、
176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、
366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、
556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、
746、756、766、776、786、和796中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。
57.如权利要求56所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核酸包含与
SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、
196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、
386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、
576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、
766、776、786、和796中的任一项具有至少95％同一性的核苷酸序列。
58.如权利要求56所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核酸包含SEQ 
ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、
206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、
396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、
586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、
776、786、和796中任一项的核苷酸序列。
59.如权利要求1-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核
酸包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。
60.如权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核酸包含与
SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核苷酸序列。
61.如权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，其中该VH由核酸编码，该核酸包含SEQ 
ID NO:11的核苷酸序列。
62.如权利要求1-61中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核
酸包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的核苷酸序列。
63.如权利要求62所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核酸包含与
SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的核苷酸序列。
64.如权利要求62所述的抗体或抗原结合片段，其中该VL由核酸编码，该核酸包含SEQ 
ID NO:16的核苷酸序列。
65.如权利要求1-64中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段结合至PAR2。
66.如权利要求1-65中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段防止胰蛋白酶、类胰蛋白酶和/或蛋白裂解酶与PAR2相互作用。
67.如权利要求1-66中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段防止胰蛋白酶、类胰蛋白酶和/或蛋白裂解酶切割PAR2。
68.如权利要求1-67中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段防止PAR2细胞外结构域的切割。
69.如权利要求1-68中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段抑制系链配体的暴露。
70.如权利要求1-69中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段防止系链配体与PAR2的第二跨膜环的相互作用。
71.如权利要求1-70中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段在pH 7.4比在pH 6.0以更大的亲和力结合至PAR2。
72.如权利要求1-70中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段在pH 7.4以小于约5nM、1nM、900pM、800pM、700pM、650pM、600pM、500pM、200pM、100pM或
50pM的KD结合PAR2。
73.如权利要求72所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段在pH 7.4
以小于约700pM的KD结合PAR2。
74.如权利要求1-70中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段在pH 6.0以大于约1nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、60nM、80nM、或
100nM的KD结合PAR2。
75.如权利要求1-70中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片
段在pH 6.0以大于约30nM的KD结合PAR2。
76.如权利要求1-75中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于100nM的IC50。
77.如权利要求1-76中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于50nM的IC50。
78.如权利要求1-77中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于40nM的IC50。
79.如权利要求1-78中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于500nM的IC50。
80.如权利要求1-79中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于1000nM的IC50。
81.如权利要求1-80中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于1100nM的IC50。
82.如权利要求1-81中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过20倍的IC50。
83.如权利要求1-82中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过25倍的IC50。
84.如权利要求1-83中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定中
与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过30倍的IC50。
85.如权利要求1-84中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在人
A549细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于3.0x 10-10M的IC50。
86.如权利要求1-85中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在人
A549细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于1.5x 10-10M的IC50。
87.如权利要求1-86中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在大
鼠KNRK细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于7.0x 10-10M的IC50。
88.如权利要求1-87中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在大
鼠KNRK细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于5.5x 10-10M的IC50。
89.如权利要求1-88中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在食
蟹猴CYNOM-K1细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于7.0x10-11M的IC50。
90.如权利要求1-89中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在食
蟹猴CYNOM-K1细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于5.0x10-11M的IC50。
91.如权利要求1-90中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在鼠
科LL/2细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于6.0x 10-11M的IC50。
92.如权利要求1-91中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在钙内流测定中在鼠
科LL/2细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于4.0x 10-11M的IC50。
93.如权利要求92中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段
比缺乏组氨酸修饰的抗体或抗原结合片段从治疗的患者的血清中更缓慢地清除。
94.如权利要求3和5-93中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中当在PAR2结合测定
中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，该任选存在的一个或多个组氨酸使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低不超过1000、800、700、500、400、300、200、100、50或10倍。
95.一种能够表达如权利要求1-94中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸。
96.一种核酸，该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、
121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、
311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、
501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、
691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。
97.如权利要求96所述的核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、
71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、
271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、
461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、
651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少95％同一性的核苷酸序列。
98.如权利要求96所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、
81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、
271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、
461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、
651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中任一项的核苷酸序列。
99.一种核酸，该核酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、
126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、
316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、
506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、
696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。
100.如权利要求99所述的核酸，其中该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID 
NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、
216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、
406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、
596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、
786、和796中的任一项具有至少95％同一性。
101.如权利要求99所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、
76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、
276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、
466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、
656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中任一项的核苷酸序列。
102.一种核酸，该核酸包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。
103.如权利要求102所述的核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一
性的核苷酸序列。
104.如权利要求102所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
105.一种核酸，该核酸包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的核苷酸序列。
106.如权利要求105所述的核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一
性的核苷酸序列。
107.如权利要求105所述的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
108.一种载体，该载体包含如权利要求95-107中任一项所述的核酸。
109.包含以下项的载体的组：a)如权利要求96-98或102-104中任一项所述的核酸；和
b)如权利要求99-101和105-107中任一项所述的核酸。
110.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求108或109所述的载体中的一个或多
个。
111.一种组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和如权利要求1-94中任一项所述
的抗体或抗原结合片段。
112.一种冻干组合物，该冻干组合物包含如权利要求1-94中任一项所述的抗体或其抗
原结合片段。
113.一种重构的冻干组合物，该重构的冻干组合物包含如权利要求1-94中任一项所述
的抗体或其抗原结合片段。
114.如权利要求111-113中任一项所述的组合物，其中该组合物配制用于通过锭剂、喷
雾、口服给予、延迟释放或持续释放、透黏膜给予、糖浆、黏膜黏附剂、颊制剂、黏膜黏附片剂、局部给予、肠胃外给予、注射、皮下给予、口服溶液、直肠给予、颊给予或透皮给予来给予。
115.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1-94中任一项所述的抗体或抗原结合片段
或如权利要求111-114中任一项所述的组合物。
116.一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，该方法包括向该受试者给予药学上有效
量的如权利要求1-94中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
117.一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，该方法包括向该受试者给予药学上有效
量的如权利要求111-114中任一项所述的组合物。
118.如权利要求116或117所述的方法，其中该疼痛选自由以下组成的组：伤害性疼痛、
神经性疼痛、和混合型疼痛。
119.如权利要求116或117中任一项所述的方法，其中该疼痛与以下相关：头痛、慢性头
痛、偏头痛、癌症、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病、肝病、多发性硬化、脊髓损伤、疱疹后神经痛、糖尿病性神经病变、下腰疼痛、炎性心脏病、肾病、胃炎、齿龈炎、牙周疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肠易激综合征、纤维肌痛、腿痛、不宁腿综合征、糖尿病性神经病变、过敏症、外科手术、急性或慢性身体损伤、骨折或挤压伤、脊髓损伤、炎性疾病、非炎性神经性或功能失调性疼痛病症、或其组合。
120.如权利要求119所述的方法，其中该疼痛是骨关节炎疼痛。
121.如权利要求116-120中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
122.一种用于产生如权利要求1-94中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，该方
法包括如下步骤：
在培养的细胞中表达如权利要求95-106中任一项所述的核酸，
纯化该抗体或抗原结合片段。

说明书全文

抗PAR2抗体及其用途

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年3月16日提交的美国临时申请号62/472,462、和于2018年3月2日提交的美国临时申请号62/637,766的优先权权益。将前述申请以其全文通过引用并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII复本创建于2018年3月8日，命名为1848081-0002-093-WO1_SL.txt且大小为
351,668字节。

背景技术

[0005] 慢性疼痛是一种可以影响任何人并对患者、医疗保健系统和经济造成负担的病症。在美国有大约1亿人罹患慢性疼痛并且由于疼痛，医疗保健每年总增量成本(包括医疗费用和损失的时间和工资的经济成本)估计在5600至6350亿美元之间(美国国家科学院医
学研究所(Institute of Medicine of The National Academies)，2011)。然而，在一项对慢性疼痛受害者的调查中，超过一半的人认为他们几乎无法或者根本无法控制疼痛(2006年慢性疼痛调查之声(2006Voices of Chronic Pain Survey)，美国疼痛基金会(American Pain Foundation))。疼痛可以由多种病症和疾病(从癌症到糖尿病，再到关节炎)导致，并且可分为几类：伤害性疼痛、神经性疼痛、和混合型疼痛。伤害性疼痛通过刺激神经纤维(例如通过热刺激、机械刺激或化学刺激)来定义，而神经性疼痛是由多种原因导致的疼痛，例如神经损伤、疾病、以及重要的是，炎症。炎症(生物体募集免疫细胞并将免疫因子释放到损伤或感染部位的过程)因此可以是修复损伤的有用过程和疼痛的原因。
[0006] 许多疼痛的治疗抑制炎症。两种常见的抗炎性疼痛疗法是甾体抗炎药和非甾体抗炎药(NSAID)。甾体抗炎药通常抑制前列腺素和白三烯，前列腺素和白三烯是炎症的产物。此类药物可靠且有效，但是具有严重副作用的风险，包括例如骨密度降低、体重波动、免疫系统抑制和生长/青春期不规律(Irving,P.M.等人(2007)Aliment Pharmacol Ther.[营养药理学与治疗学]26(3):313-329；Goodman等人J Am Acad Orthop Surg.[美国骨科医师学会杂志]2007年8月；15(8):450-60)。NSAID抑制环氧酶-1和/或2(COX-1和/或COX-2)，其本身催化花生四烯酸反应成为前列腺素。慢性疼痛和炎症可能需要长期治疗，并且长期抑制COX酶可引起胃肠道问题，例如胃出血和溃疡。鉴于与此类抗炎症疼痛治疗相关的风险，存在对治疗疼痛的替代方法的需要。
[0007] G蛋白偶联受体(GPCR)是膜蛋白家族，该家族共同具有七个跨膜结构域的共同结构基序，其连接N-末端细胞外结构域和C-末端细胞内结构域(Granier等人，Nat ChemBiol.[自然化学生物]2012年8月；8(8):670-673)。GPCR感知胞外信号例如光子、激素、趋化因子等并且活化细胞内G蛋白。存在许多GPCR家族，例如卷曲蛋白(Frizzled)家族、视紫红质(Rhodopsin)家族、促胰液素(Secretin)家族、粘附蛋白(Adhesion)家族、和蛋白酶活化受体(PAR)家族(Zhang等人Nature.[自然]2012年12月20日；492(7429):387-392；Zhang等人Mol Cells.[分子和细胞]2015年10月；38(10):836-42)。虽然该各个GPCR家族共有总的结构特征，但这些家族表现出不同的功能，与不同的配体结合，并且通过不同的机制活化。
GPCR的PAR家族的活化与炎症和伤害感受相关(Gieseler等人Cell Commun Signal.[细胞
通讯与信号转导]2013；11:86)。
[0008] 已经鉴定了四种PAR受体：PAR1、PAR2、PAR3、和PAR4(Macfarlane等人.Pharmacol Rev.[药理学综述]2001年6月；53(2):245-82；Gieseler等人Cell Commun Signal.[细胞通讯与信号转导]2013；11:86)。已示出PAR2活化增强炎症和伤害感受，使PAR2活化的抑制成为抗炎性疼痛疗法的有吸引力的靶标。PAR，不同于其他的GPCR，通过其细胞外结构域的蛋白水解切割来活化，活化后暴露了作为系链活化配体(tethered-activating ligand)的N-末端序列。PAR2，具体地，由胰蛋白酶和类胰蛋白酶切割并活化。
[0009] 已在血管化组织、气道、成骨细胞、心血管组织、角质形成细胞、外分泌腺、白细胞、肥大细胞、肠上皮、肾、神经元、胰腺和各种平滑肌类型中检测到PAR2表达(Macfarlane同上)。PAR2还涉及与神经源性炎症、伤害感受和疼痛传导相关的各种疾病或病症。PAR2可以被若干种宿主和病原体衍生的丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶、组织激肽释放酶、或凝结级联TF-FVIIa和FVa-FXa的成员)活化。
[0010] 已经示出单克隆抗体可用于多种治疗应用并且目前在市场上有许多抗体疗法(Maggon,Curr Med Chem.[当代药物化学]2007；14(18):1978-87；Brekke和Sandlie,Nat Rev Drug Discov[自然评论·药物发现]2:52-62,2003)。血流中流动的最常见的抗体类型是免疫球蛋白G(IgG)。IgG抗体用于治疗目的的有用性取决于若干因素，包括抗体对其靶标的特异性、其与靶标结合的强度、以及抗体产生的效率和抗体从血清中清除的速度(抗体的血清半衰期)。抗体的血清半衰期常常由FcRn(新生儿Fc受体)调节，FcRn结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域。在体内IgG被认为是被流体相胞饮非特异性摄取的(Pyzik等人,J 
Immunol.[免疫学杂志]2015年5月15日；194(10):4595-603)。一旦进入内体，IgG与FcRn结合，这将使IgG分选进再循环内体并返回至细胞表面，远离了溶酶体和降解。虽然IgG的回收率据估计为分级分解率的44％，但抗体疗法仍可在给予后不过数天内耗尽(Kim,Jonghan等人Clin.Immunol.[临床免疫学]122.2(2007):146-155)。
[0011] 与炎症相关的疼痛常常是慢性病症。最小化治疗分子的给予剂量和频率是所希望的。因此，需要新的抗炎症疼痛疗法。标准单克隆抗体是有吸引力的候选物，但在某些情况下可能受其血清半衰期的限制。因此，可能希望替代性的治疗。发明内容
[0012] 本披露提供了结合PAR2的抗体。本披露的抗体尤其可用于抑制PAR2介导的信号转导和用于治疗由PAR2活性和/或信号转导导致或与PAR2活性和/或信号转导相关的疾病和障碍。
[0013] 在一些实施例中，本披露提供了在pH 7.4比在pH 6.0以更大的亲和力结合至PAR2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4以比在pH 6.0大至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍的亲和力结合至PAR2。在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:3的序列中的VH-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:4的序列中的VH-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:5的序列中的VH-CDR3；并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:8的序列中的VL-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:9的序列中的VL-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:10的序列中的VL-CDR3；其中当在PAR2结合测定中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，这些氨基酸取代、缺失或插入使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低不超过
1000、800、700、500、400、300、200、100、50或10倍。在一些实施例中，这些氨基酸取代、缺失或插入包含同源取代。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:2的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VH CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:7的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VL CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，该1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失是用组氨酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个取代。
[0014] 在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:4的位置1-17(例如，位置4、5、和7-17)的任一个或多个氨基酸位置上的VH-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:5的位置1-8的任一个或多个氨基酸位置上的VH-CDR3；并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:10的位置1-14的任一个或多个
氨基酸位置上的VL-CDR3。在一些实施例中，该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH-CDR3，并且该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:
14的氨基酸序列的VH-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH-CDR3，并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5、8、12、16、和17的氨基酸位置上；并且其中组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置2和3的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置7的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置8的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置12的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置15的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置16的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置17的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5和8的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5、8、12、和16的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5、8、12、16和17的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置2的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置3的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置2和3的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:10的位置1的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:10的位置5的氨基酸位置上。
在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:10的位置6的氨基酸位置上。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:10的位置14的氨基酸位置上。在一些实施例中，该VH-CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、
84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、
274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、
464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、
654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、和811-818。在一些实施例中，该VH-CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45、
55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、
255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、385、395、405、415、425、435、
445、455、465、475、485、495、505、515、525、535、545、555、565、575、585、595、605、615、625、
635、645、655、665、675、685、695、705、715、725、735、745、755、765、775、785、795、和819-
820。在一些实施例中，该VL-CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、
230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、
420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、
610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790和
800。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:14的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:811的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:819的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或
20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:814的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:820的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:
10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:816的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:818的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含与SEQ ID NO:803-806中的每一个具有至少90％同一性的框架区。在一些实施例中，该VH包含与SEQ ID NO:803-806中的每一个具有至少95％同一性的框架区。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:803-806的框架区。在一些实施例中，该VL包含与SEQ ID NO:807-810中的每一个具有至少90％同一性的框架区。在一些实施例中，该VL包含与SEQ ID NO:807-810中的每一个具有至少95％同一性的框架区。在一些实施例中，该VL包含对应于SEQ ID NO:807-810的框架区。在一些实施例中，该VH包含与选自由以下组成的组的序列具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、
97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、
92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、
282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、
472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、
662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、和792。在一些实施例中，该VL包含与选自由以下组成的组的序列具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、
107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、
297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、
487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、
677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、和797。在一些实施例中，该VH包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、92％、93％、95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且其中该VL包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、85％、90％、92％、93％、
95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:12的氨基酸序列并且其中该VL包含对应于SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:821的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:824的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:827的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:831的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸
序列。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。在一些实施例中，该抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，该抗原结合片段是Fab’。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是抗体。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是IgG抗体。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是人的。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、
31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、
241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、
431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、
621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和
833-841中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、
151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、
341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、
531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、
721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、
71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、
271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、
461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、
651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中任一项的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、
46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、
246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、
436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、
626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中的任一项具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、
196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、
386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、
576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、
766、776、786、和796中的任一项具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、
146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、
336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、
526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、
716、726、736、746、756、766、776、786、和796中任一项的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段结合至PAR2。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段防止胰蛋白酶、类胰蛋白酶和/或蛋白裂解酶与PAR2相互作用。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段防止胰蛋白酶、类胰蛋白酶和/或蛋白裂解酶切割PAR2。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段防止该PAR2细胞外结构域的切割。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制系链配体的暴露。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段防止系链配体与PAR2的第二跨膜环的相互作用。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH6.0以更大的亲和力结合至PAR2。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于100nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于50nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 7.4与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有小于40nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于500nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于1000nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 6.0与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段具有大于
1100nM的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过20倍的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过25倍的IC50。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中与具有SEQ ID NO:3-5和8-10的CDR的抗体或抗原结合片段竞争时，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4比在pH 6.0具有低超过30倍的
IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在人A549细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于
3.0x 10-10M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在人A549细胞中，该抗体或抗原结合-10
片段具有小于1.5x 10 M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在大鼠KNRK细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于7.0x 10-10M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在大鼠KNRK细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于5.5x 10-10M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在食蟹猴CYNOM-K1细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于7.0x 10-11M的
IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在食蟹猴CYNOM-K1细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于5.0x10-11M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在鼠科LL/2细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于6.0x 10-11M的IC50。在一些实施例中，在钙内流测定中在鼠科LL/
2细胞中，该抗体或抗原结合片段具有小于4.0x 10-11M的IC50。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段比缺乏组氨酸修饰的抗体或抗原结合片段从治疗的患者的血清中更缓慢地
清除。在一些实施例中，当在PAR2结合测定中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，该任选存在的一个或多个组氨酸使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低不超过1000、
800、700、500、400、300、200、100、50或10倍。
[0015] 在一些实施例中，本披露提供了能够表达本文所披露的任一该抗体或抗原结合片段的核酸。在一些实施例中，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、
241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、
431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、
621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和
833-841中的任一项具有至少90％同一性。在一些实施例中，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、
171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、
361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、
551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、
741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一项具有至少95％同一性。在一些实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、
171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、
361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、
551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、
741、751、761、771、781、791、和833-841中任一项的核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了包含核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、
96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、
286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、
476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、
666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中的任一项具有至少
90％同一性。在一些实施例中，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:6、16、
26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、
236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、
426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、
616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中的任一项具有至少95％同一性。在一些实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:6、16、26、36、
46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、
246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、
436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、
626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、和796中任一项的核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了包含核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性。在一些实施例中，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性。在一些实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了包含核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性。在一些实施例中，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性。在一些实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
[0016] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一核酸的载体。在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一个或多个核酸的一组载体。
[0017] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一个或多个载体的宿主细胞。
[0018] 在一些实施例中，本披露提供了包含药学上可接受的载体和本文所披露的任一抗体或抗原结合片段的组合物。
[0019] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一抗体或其抗原结合片段的冻干组合物。
[0020] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一抗体或其抗原结合片段的重构的冻干组合物。在一些实施例中，该组合物配制用于通过锭剂、喷雾、口服给予、延迟释放或持续释放、透黏膜给予、糖浆、黏膜黏附剂、颊制剂、黏膜粘附片剂、局部给予、肠胃外给予、注射、皮下给予、口服溶液、直肠给予、颊给予或透皮给予来给予。
[0021] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一抗体或抗原结合片段或本文所披露的任一组合物的试剂盒。
[0022] 在一些实施例中，本披露提供了用于治疗有需要的受试者的疼痛的方法，该方法包括向受试者给予药学上有效量的本文所披露的任一抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，本披露提供了用于治疗有其需要的受试者的疼痛的方法，该方法包括向受试者给予药学上有效量的本文所披露的任一组合物。在一些实施例中，该疼痛选自由以下组成的组：伤害性疼痛、神经性疼痛、和混合型疼痛。在一些实施例中，该疼痛与以下相关：头痛、慢性头痛、偏头痛、癌症、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病、肝病、多发性硬化、脊髓损伤、疱疹后神经痛、糖尿病性神经病变、下腰疼痛、炎性心脏病、肾病、胃炎、齿龈炎、牙周疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病、肠易激综合征、纤维肌痛、腿痛、不宁腿综合征、糖尿病性神经病变、过敏症、外科手术、急性或慢性身体损伤、骨折或挤压伤、脊髓损伤、炎性疾病、非炎性神经性或功能失调性疼痛病症、或其组合。在一些实施例中，该疼痛是骨关节炎疼痛。在一些实施例中，该受试者是人。
[0023] 在一些实施例中，本披露提供了产生本文所披露的任一抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：在培养的细胞中表达本文所披露的任一核酸，纯化该抗体或抗原结合片段。附图说明
[0024] 提交的本专利或专利申请含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
[0025] 图1A和图1B是说明相比于Par0067的相同CDR，各种克隆的VH CDR2(按出现的顺序分别为SEQ ID NO 4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、
374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、
564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、
754、764、774、784、和794)和CDR3(按出现的顺序分别为SEQ ID NO 5、15、25、35、45、55、65、
75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、
275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、385、395、405、415、425、435、445、455、
465、475、485、495、505、515、525、535、545、555、565、575、585、595、605、615、625、635、645、
655、665、675、685、695、705、715、725、735、745、755、765、775、785、和795)的序列差异的表。
CDR1和框架区对于Par0067和全部指示的克隆是相同的(即，Par0067和每个克隆包含SEQ ID NO:3和803-806的序列)。
[0026] 图2A和图2B是说明相比于Par0067的相同CDR，各种克隆的VL CDR3(按出现的顺序分别为SEQ ID NO 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、
370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、
560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、
750、760、770、780、790、和800)的序列差异的表。CDR1、CDR2和框架区对于Par0067和全部指示的克隆是相同的(即，克隆包含SEQ ID NO:8、9和807-810的序列)。
[0027] 图3提供了来自使用各种基于IgG的抗体的细胞效力测定的IC50数据。指明了在每个细胞测定中使用的细胞类型。NI＝非抑制性。
[0028] 图4A提供了相对于在同等浓度下对抗体的激动应答，在A549细胞中PaB670129对胰蛋白酶的IC50曲线。图4B提供了PaB670129对不同PAR2蛋白酶活化剂的IC50曲线。
[0029] 图5A-图5F说明了实验结果，在这些实验中，大鼠背根神经节(DRG)感觉神经元或非神经元细胞用蛋白裂解酶在PaB670129(在本文中还称为PaB670129)的存在或不存在下治疗。用同种型对照(20nM)预处理的大鼠DRG感觉神经元展示出蛋白裂解酶诱导的钙瞬变(5A)。用PaB670129 IgG1TM(20nM)预处理的感觉神经元对蛋白裂解酶(5B)无应答；对蛋白裂解酶应答的神经元％在(5C)中量化。用同种型对照(20nM)预处理的DRG的非神经元细胞展示处蛋白裂解酶诱导的钙瞬变(8D)，但是用PaB670129 IgG1TM(20nM)预处理的非神经元细胞则不会(5E)；对蛋白裂解酶应答的非神经元细胞％在(5F)中量化。图5A-图5E披露了“LIGRLO”作为SEQ ID NO:832。
[0030] 图6说明了在人A549细胞中PaB670129(相对于抗PAR1抗体或沃拉帕沙(Vorapaxar))对凝血酶诱导的PAR1活化的作用。
[0031] 图7A描绘了说明在大鼠中不同的治疗(包括PAR2抗体、Par0067)对由单碘乙酸盐(MIA)诱导的同侧的/对侧的超敏反应百分比的作用的图。图7B描述了说明在大鼠中不同剂量的PaB670129或同种型对照抗体对由MIA诱导的同侧的/对侧的超敏反应百分比的作用的图。“i.v.”意思是静脉内，并且“p.o.”意思是通过口(口服)。
[0032] 图8描绘了说明在小鼠中不同剂量的PaB670129或同种型对照抗体对由外围神经部分结扎诱导的同侧的/对侧的超敏反应百分比的作用的图。“s.c.”意思是皮下。N＝9-10只/组。使用双向ANOVA分析数据，其中时间和治疗作为相依因子。采用Tukey事后检验法(Tukey’s Post Hoc test)获得后续的统计显著性。各个比较显示*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001vs.Op+同种型对照10mg/kg。

具体实施方式

[0033] 在描述本披露之前，应理解本披露不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件会变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制。
[0034] 除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。
[0035] 尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本披露的实践或测试，但现在描述了优选的方法和材料。
[0036] A.定义
[0037] 如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
[0038] 氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们的通常接受的单字母代码来提及。
[0039] 这里方便指出的是当在此使用时，与或不与另一者一起，“和/或”被看作是这两种特定的特征或组分中的每种的特定披露。例如，“A和/或B”被看作是(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每种的特定披露，就好像在此各自单独陈述一样。
[0040] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。
[0041] 如本文所用的表述“蛋白酶活化受体2”、“PAR2”等是指具有氨基酸序列或其生物活性片段的人PAR2蛋白，该氨基酸序列与SEQ ID NO:801的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性。
[0042] 术语“系链配体”是指结合至并活化PAR2受体本身的PAR2的N-末端部分的区域。在一些实施例中，直到蛋白酶(例如，凝血酶或胰蛋白酶)蛋白水解切割PAR2酶的部分，PAR2的该系链配体部分才暴露出来。在一些实施例中，该系链配体对应于与SEQ ID NO:802的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％一致性的多肽。
[0043] 如本文所使用的，“结合PAR2的抗体”、“抗PAR2抗体”等包括结合膜结合PAR2或其片段的抗体和其抗原结合片段。在一些实施例中，抗PAR2抗体或其抗原结合片段结合至PAR2的系链配体部分。
[0044] B.抗体和其抗原结合片段
[0045] 如本文所使用的，“本披露的抗体或抗原结合片段”是指本文所提供的任一个或多个抗体和抗原结合片段。本披露的抗体和抗原结合片段包含了含有重链可变结构域的重链(VH)和含有轻链可变结构域的轻链(VL)。VH结构域包含三种CDR，例如本文所提供的和如乔西亚(Chothia)、卡巴特(Kabat)或IMGT系统所定义或鉴别的任一CDR。这些CDR通常间插入框架区(FR)，并且同时包含VH结构域。相似地，VL包含三种CDR，例如本文所提供的和如乔西亚(Chothia)、卡巴特(Kabat)或IMGT系统所定义的任一CDR。这些CDR通常间插入框架区(FR)，并且同时包含VL结构域。这些FR区(例如FR1、FR2、FR3、和/或FR4)可以类似地通过乔西亚(Chothia)、卡巴特(Kabat)或IMGT系统来定义或鉴别。在整个申请中，当CDR被指示为由乔西亚、卡巴特或IMGT系统鉴别或定义时，这意味着CDR与该系统一致(例如，乔西亚CDR、卡巴特CDR或IMGT CDR)。这些术语中的任一个都可用于指示是否是指乔西亚、卡巴特或
IMGT CDR。
[0046] 如本文所用的术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”以及等等包括任何天然存在的、酶法可获得的、合成的、或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。使用任何合适的标准技术例如涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操作和表达的蛋白水解消化或重组基因工程技术，抗体的抗原结合片段可衍生自例如全抗体分子。此类DNA是已知的并且/或可容易地获得自例如，商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)，或可以合成。DNA可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术进行测序和操作，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或以引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰，添加或缺失氨基酸等。
[0047] 在一些实施例中，本披露提供了在pH 7.4比在pH 6.0以更大的亲和力结合至PAR2的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段在pH 7.4以比在pH 6.0大至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍的亲和力结合至PAR2。在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:3的序列中的VH-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:4的序列中的VH-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:5的序列中的VH-CDR3；并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:8的序列中的VL-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:9的序列中的VL-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:10的序列中的VL-CDR3；其中当在PAR2结合测定中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，该氨基酸取代、缺失或插入使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低了不超过
1000、800、700、500、400、300、200、100、50、10或5倍。在一些实施例中，这些氨基酸取代、缺失或插入包含同源取代。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:2的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VH CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:7的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VL CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，该1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失是用组氨酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个取代。
[0048] 在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:13的序列中的VH-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:14的序列中的VH-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或15个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:15的序列中的VH-CDR3；并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:18的序列中的VL-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:
19的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:19的序列中的VL-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列但是其中1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或插入任选地存在于SEQ ID NO:20的序列中的VL-CDR3；其中当在PAR2结合测定中在pH 7.4测试时，与具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH和SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL的抗体或抗原结合片段相比，该氨基酸取代、缺失或插入使该抗体或其抗原结合片段对人PAR2的结合亲和力降低了不超过1000、800、700、500、400、300、200、100、50、
10或5倍。在一些实施例中，这些氨基酸取代、缺失或插入包含同源取代。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:12的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VH CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，与在SEQ ID NO:17的序列中存在的CDR氨基酸序列相比，该抗体或抗原结合片段在VL CDR中具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH-CDR3，并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施例中，该1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代、插入或缺失是用组氨酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个取代。
[0049] 在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VH结构域包含SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、
222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、
412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、
602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、和792中的任一者所示的氨基酸序列的CDR(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)的至少一种、两种或全部三种。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；
其中该VH结构域包含SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、
152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、
342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、
532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、
722、732、742、752、762、772、782、和792中任一者所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VH结构域包含SEQ ID NO:2或12所示的氨基酸序列的CDR(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)的至少一种、两种或全部三种。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变
(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VL结构域包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、
67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、
267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、
457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、
647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、和797中的任一者所示的氨基酸序列的CDR(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)的至少一种、两种或全部三种。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VL结构域包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、
197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、
387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、
577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、
767、777、787、和797中任一者所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VL结构域包含SEQ ID NO:7或17所示的氨基酸序列的CDR(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)的至少一种、两种或全部三种。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VH结构域包含SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、
112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、
302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、
492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、
682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、和792中任一者所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)，并且其中该VL结构域包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、
157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、
347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、
537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、
727、737、747、757、767、777、787、和797中任一者所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)。在一些实施例中，本披露提供了抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；其中该VH结构域包含SEQ ID NO:2或12所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)，并且其中该VL结构域包含SEQ ID NO:7或17所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3(例如，如使用乔西亚、IMGT或卡巴特系统中的任一者所测量的)。
[0050] 一旦编码此类抗体的核苷酸序列被测定，嵌合的或人源化抗体可通过重组方法产生。将编码抗体的核酸引入宿主细胞中并且使用本领域通常已知的和如本文所披露的材料和程序表达。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、
251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、
441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、
631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、和833-841中的任一者具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VH由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:1或11具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、
206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、
396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、
586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、
776、786、和796中的任一者具有至少至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该VL由核酸编码，该核酸包含与SEQ ID NO:6或16具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
[0051] 本披露包括结合PAR2的抗PAR2抗体和其抗原结合片段。在一些实施例中，该抗体中和和/或阻断抗PAR2抗体或抗原结合片段。如本文所用的“中和”或“阻断”抗体或抗原结合片段旨在是指抗体或抗原结合片段，其与PAR2的结合：(i)干扰PAR2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶、类胰蛋白酶和/或蛋白裂解酶)之间的相互作用；(ii)通过蛋白酶抑制PAR2的切割；(iii)抑制PAR2信号转导或PAR2活化；和/或(iv)导致PAR2的至少一种生物学功能的抑制。
在一些实施例中，本披露的抗体或抗原结合片段抑制PAR2的活化。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制无活性的、未切割的PAR2转化为有活性的、切割的PAR2。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制该系链配体的暴露。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制PAR2受体通过其系链配体的活化。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制该系链配体结合至PAR2的第二跨膜结构域。由抗PAR2中和或阻断抗体导致的抑制不需完全，只要其是使用适当的测定可检测的。在一些实施例中，与未抑制的活性PAR2相比，该抗体或其抗原结合片段使PAR2活性抑制了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％或100％。用于检测代表性抗PAR2抗体或抗原结合片段的活性的测定的一些实例描述于例证部分。技术人员知晓另外的抗PAR2抗体活性测定。
[0052] 在具体的实施例中，本文所披露的任一抗体或抗原结合片段干扰PAR2和蛋白酶之间的相互作用。在一些实施例中，该蛋白酶是胰蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶是中性粒细胞弹性蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶是中性粒细胞蛋白酶3。在一些实施例中，该蛋白酶是肥大细胞类胰蛋白酶。在一些实施例中，该蛋白酶是组织因子/因子VIIa/因子Xa。在一些实施例中，该蛋白酶是激肽释放酶相关肽酶。在一些实施例中，该蛋白酶是膜系链的丝氨酸蛋白酶-1/蛋白裂解酶1。在一些实施例中，该蛋白酶是寄生半胱氨酸蛋白酶。在一些实施例中，该抗PAR2抗体或抗原结合片段阻断PAR2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)之间的体外相互作用，其IC50值小于约15nM，如结合测定如例证部分中所述进行测量的。在某些实施例中，本披露的抗体或抗原结合片段阻断在pH 7.4下PAR2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)之间的体外相互作用，其IC50值小于约200nM、150nM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、
500pM、400pM、200pM、100pM、50pM、5pM、1pM或0.1pM。在某些实施例中，本披露的抗体或抗原结合片段阻断在pH 6.0下PAR2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)之间的体外相互作用，其IC50值大于约300nM、500nM、750nM、1000nM、1100nM、或1200nM。在某些实施例中，抗PAR2抗体或其片段的IC50在表位竞争测定(例如本文所提供的例证部分中所述的表位竞争测定)中测量。在一些实施例中，抗PAR2抗体或其片段的IC50在细胞效力测定中测量。在一些实施例中，该细胞效力测定使用人细胞(例如，A549细胞)、大鼠细胞(例如，KNRK细胞)、食蟹猴细胞(例如，CYNOM-K1细胞)或鼠科细胞(例如，LL/2细胞)。在一些实施例中，该细胞效力测定使用钙内流测定(例如，本文所提供的例证部分中所述的钙内流测定)。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制钙内流测定中的钙内流，其IC50小于1nM、500pM、400pM、200pM、100pM、50pM、
10pM、5pM、1pM或0.1pM。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段防止胰蛋白酶对PAR2的异常活化。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段抑制/减少炎症诱导的疼痛。
[0053] 在具体的实施例中，本文所披露的任一抗体或抗原结合片段干扰PAR2和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)之间的相互作用。在一些实施例中，该抗体防止蛋白酶(例如，胰蛋白酶)结合，切割，和/或活化PAR2。本披露提供了抗PAR2抗体和其抗原结合片段，其以高亲和力，在生理学、细胞外pH(即，pH 7.4)下，结合PAR2分子。在一些实施例中，抗体和抗体的抗原结合片段在pH 7.4(例如，在25℃或37℃)下结合PAR2，其KD小于约5nM、1nM、900pM、800pM、
700pM、650pM、600pM、500pM、200pM、100pM或50pM。在一些实施例中，抗体和抗体的抗原结合片段在微酸性pH(例如pH 6.0)(例如，在25℃或37℃)结合PAR2，其KD大于约1nM、5nM、10nM、
15nM、20nM、25nM、30nM、40nM、50nM、60nM、80nM、或100nM。在一些实施例中，该微酸性pH是内体小室的pH。在一些实施例中，KD可以根据目前的标准方法进行测量，例如使用表面等离子体共振(SPR)或石英晶体微天平(QCM)。
[0054] 本披露还包括抗PAR2抗体和其抗原结合片段，所述抗PAR2抗体和其抗原结合片段以解离半衰期(t1/2)大于约1.5分钟、1.75分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、或30分钟特异性结合至PAR2，如使用测定例如表面等离子体共振在25℃或37℃在pH 7.4所测量。在一些实施例中，抗PAR2抗体和其抗原结合片段结合至PAR2，其中解离半衰期(t1/2)小于约1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、13秒、7秒、5秒、或3秒，如使用测定例如表面等离子体共振在25℃或37℃在微酸性pH(例如，pH 6)所测量。在一些实施例中，该微酸性pH是内体小室的pH。在一些实施例中，KD可以根据目前的标准方法进行测量，例如使用表面等离子体共振(SPR)或石英晶体微天平(QCM)。
[0055] 本披露的抗体或抗原结合片段可具有一个或多个上述生物学特征、或其任何组合。通过回顾本披露(包括本文所提供的例证部分)，本披露的抗体的其他生物学特征将对于本领域的普通技术员人是显而易见的。
[0056] 当应用于多肽时，术语“实质相似性”或“实质上相似的”意思是两个肽序列(当以最佳方式对齐时，例如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认缺口权重)，共同具有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。在一些实施例中，与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、7、12或17的氨基酸序列中任一者)相比，本文所披露的任一抗体或抗原结合片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。进行这一调节的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]24:307-331。具有带有相似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸盐，和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0057] 可替代地，保守性置换是Gonnet等人(1992)Science[科学]256:1443-1445中披露的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中等保守性”置换是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0058] 根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分配到不同的类别中。免疫球蛋白有五个主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的若干个可进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的并且通常描述于例如，Abbas等人Cellular andMol.Immunology[细胞与分子免疫学],第4版(W.B.桑德斯公司(W.B.Saunders,Co.)，2000)。抗体可以是较大的融合分子的一部分，所述融合分子通过抗体与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价缔和形成。
[0059] 抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)Fab’片段；(iii)F(ab’)2片段；(iv)Fd片段；(v)Fv片段；(vi)单链Fv(scFv)分子；(vii)dAb片段；和(viii)由氨基酸残基组成的最小识别单元，其模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)例如CDR3肽)、或限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如结构域特异性的抗体、单结构域抗体、骆驼科抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、adnectin、小模块免疫药物
(SMIP)、和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所用的表述“抗原结合片段”中。
[0060] 抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域(例如，VH或VL中至少一个)。该可变结构域可以是任何大小或是任何氨基酸组成并且将通常包含至少一个CDR，该CDR与一个或多个框架序列相邻或与其同框。在具有与VL结构域缔和的VH结构域的抗原结合片段中，该VH和VL结构域可以相对于彼此处于任何合适的排列中。例如，该可变区可以是二聚体的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的该抗原结合片段可包含单体VH或VL结构域。
[0061] 在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可含有共价连接至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可于本披露的抗体的抗原结合片段中发现的可变和恒定结构域的非限制性的、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(V)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何构型(包括如上列出的示例性构型中的任一者中)，该可变和恒定结构域可直接连接至彼此或可通过全部或部分铰链区或接头区连接。铰链区可由至少2(例如，5、10、
15、20、40、60或更多)个氨基酸组成，其导致在单个多肽分子的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。在一些实施例中，该铰链区包含甘氨酸-丝氨酸接头。
[0062] 此外，本披露的抗体的抗原结合片段可包含如上列出的任一可变和恒定结构域构型与彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过一个或多个二硫键)处于非共价缔和的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
[0063] 正如全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性的抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合至不同的抗原或结合至相同抗原上的不同表位。任何多特异性的抗体型式(包括本文所披露的示例性双特异性抗体型式)可使用本领域可获得的常规技术调整以用于本披露的抗体的抗原结合片段的上下文中。
[0064] 在本披露的某些实施例中，本披露的抗PAR2抗体是人抗体。如本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体。本披露的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞诱变引入的突变)，例如在CDR中，并且在一些实施例中为在CDR3中。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不旨在包括以下抗体：在该抗体中衍生自其他哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上。
[0065] 在一些实施例中，本披露的抗体可以是重组人抗体。如本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备，表达，产生或分离的全部人抗体，例如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(如下进一步所述的)、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体(如下进一步所述的)、从进行人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.[核酸研究]20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至DNA序列的任何其他的方法制备，表达，产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体经受体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：它们虽然衍生自人类种系VH和VL序列并与它们相关，但可能并不天然地存在于体内的人抗体种系表达谱内。
[0066] 人抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一个形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二形式中，二聚体不是通过链间二硫键连接的并且形成了约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。这些形式极其难易分离，甚至在亲和力纯化之后也是如此。
[0067] 第二形式在各种完整IgG同种型中出现的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。在人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代可显著地减少第二形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology[分子免疫学]30:105)至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。当前披露考虑了在铰链、CH2或CH3区具有一个或多个突变的抗体，这例如，在生产中对于改善所希望的抗体形式的产量是所希望的。
[0068] 本披露的抗体可以是分离的抗体或分离的抗原结合片段。如本文所用的“分离的抗体”或“分离的抗原结合片段”意思是与其天然环境的至少一个组分鉴别和分离和/或回收的抗体或抗原结合片段。例如，出于本披露的目的，与生物体的至少一个组分，或从抗体在其中天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体或抗原结合片段是“分离的抗体”或“分离的抗原结合片段”。分离的抗体还包括在重组细胞中的原位抗体。分离的抗体或抗原结合片段是已经受至少一个纯化或分离步骤的抗体或抗原结合片段。根据某些实施例，分离的抗体或抗原结合片段可基本上不含其他的细胞材料和/或化学品。
[0069] 与抗体从其中衍生的相应的种系序列相比，本文所披露的抗PAR2抗体或抗原结合片段在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中可包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。本披露包括衍生自本文所披露的任一氨基酸序列的抗体、和其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸突变为抗体或抗原结合片段衍生
自其中的种系序列的相应的一个或多个残基，或突变为另一人种系序列的相应的一个或多个残基，或突变为相应的一个或多个种系残基的保守性氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员，从本文所披露的重链和轻链可变区序列开始，可容易地产生多种抗体和抗原结合片段，这些抗体和抗原结合片段包含一个或多个单个的种系突变或其组合。在某些实施例中，VH和/或VL结构域中的全部框架和/或CDR残基突变回在抗体衍生自其中的原始种系序列中可发现的残基。在其他实施例中，只有某些残基突变回原始种系序列，例如，仅仅是在FR1的前8个氨基酸中或在FR4的最后8个氨基酸中发现的突变的残基，或仅仅是在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变的残基。在其他实施例中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同的种系序列(即，与抗体最初从其中衍生的种系序列不同的种系序列)的相应的一个或多个残基。在一些实施例中，该VH框架区1包含与SEQ ID NO:803的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH框架区2包含与SEQ ID NO:
804的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH框架区3包含与SEQ ID NO:805的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH框架区4包含与SEQ ID NO:806的序列具有至少
80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VL框架区1包含与SEQ ID NO:807的序列具有至少80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VL框架区2包含与SEQ ID NO:808的序列具有至少80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VL框架区3包含与SEQ ID NO:809的序列具有至少80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该VL框架区4包含与SEQ ID NO:810的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO:803-806中的任一者的参考序列相比，该VH框架包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代。在一些实施例中，与SEQ ID NO:807-810中的任一者的参考序列相比，该VL框架包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代。
[0070] 此外，本披露的抗体在框架和/或CDR区中可含有两个或更多个系突变的任何组合，例如，其中某些单个残基突变为特定种系序列的相应残基而不同于原始种系序列的某些其他的残基保留或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段可容易地测试一个或多个所希望的特性例如，改善的结合特异
性、提高的结合亲和力、改善的或提高的拮抗的或激动的生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这一通用的方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本披露中。
[0071] 本披露还包括抗PAR2抗体，其包含本文所披露的VH、VL、和/或CDR氨基酸序列中任一者的变体，这些变体具有一个或多个保守性取代。例如，本披露包括具有VH、VL、和/或CDR氨基酸序列的抗PAR2抗体，相对于本文所披露的VH、VL、和/或CDR氨基酸序列中的任一者，这些氨基酸序列具有例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个保守性氨基酸取代。
[0072] 术语“表位”是指与在抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点(称为互补位)相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有多于一个表位。因此，不同抗体可结合至同一抗原上的不同区域并且可具有不同的生物作用。表位可以是构象的或线性的。构象的表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生。线性的表位是通过多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酸基、或磺酰基部分。
[0073] 应当指出的是本披露的抗体或抗原结合片段中的任一者的任何部分可相似地例如用表位标签、一个或多个PEG部分及等等修饰。此外，该抗体或抗原结合片段可包含多于一个表位标签，例如2个表位标签，或者可包括0个表位标签。
[0074] 术语“实质上的同一性”或“实质上同一的”，当指代核酸或其片段时，指示当在适当的核苷酸插入或缺失情况下以最佳方式与另一核酸(或其互补链)对齐时，在至少约95％、和更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基上存在核苷酸序列同一性，如通过任何已知的序列同一性算法所测量的，例如FASTA、BLAST或Gap，如下文所讨论。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质上的同一性的核酸分子编码多肽，该多肽与参考核酸分子编码的多肽具有相同或实质上相似的氨基酸序列。
[0075] 多肽的序列相似性(也称为序列同一性)通常使用序列分析软件来测量。使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度，蛋白质分析软件匹配相似的序列。例如，GCG软件含有程序例如Gap和Bestfit，其可以默认参数使用以测定密切相关的多肽(例如来自不同生物体物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG版本6.1。还可使用FASTA(GCG版本6.1的程序)使用默认或推荐的参数，比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠的区域的对齐和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本披露的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库比较时，另一优选的算法是电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见，例如Altschul等人(1990)
J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.
[核酸研究]25:3389-402。在一些实施例中，使用EMBOSS Needle成对序列对齐，比较了这些序列。
[0076] 在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是抗原结合片段。在一些实施例中，该抗原结合片段是scFv。在一些实施例中，该抗原结合片段是Fab’。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是抗体。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。
[0077] 随着单克隆抗体的发展，抗体作为药剂变得有用并且引起了兴趣。使用通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何方法来产生单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的合适的方法的实例包括Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature[自然]256:495-497)和人类B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.[免疫学杂志]133:3001；和Brodeur等人,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications[单克隆抗体产生技术与应用],(Marcel Dekker,Inc.[马塞尔·德克尔公司],纽约),第51-63页)。在许多情况
下，杂交瘤用于产生鼠科或啮齿动物来源的初始抗体。这一初始抗体然后可例如使用重组技术进行修饰以产生啮齿动物变体、嵌合抗体、人源化抗体及等等。存在其他的方法来产生初始抗体，并且此类的方法是本领域已知的。然而，无论用于产生初始抗体或甚至该初始抗体的变体的方法如何，然后都可修饰非人来源的任何给定抗体以提高其人性。
[0078] 可以通过使用组合的文库来制备本披露的抗体或抗原结合片段以筛选具有所希望的一种或多种活性的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和筛选此类文库以获得具有所希望的结合特征的抗体。此类的方法通常描述于：Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]178:1-37(O’Brien等人,编者,Human Press[人类出版社],新泽西州托托瓦,2001)。例如，产生目的抗体的一个方法是通过使用噬菌体抗体文库，如下所述：Lee等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](2004),340(5):
1073-93。
[0079] 原则上，合成的抗体克隆通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库来选择，该文库展示融合至噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)的不同片段。通过在所希望的抗原上的亲和力色谱法来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合至所希望的抗原上的Fv片段的克隆被吸附在抗原上并且因此与文库中的非结合性克隆分离。然后从抗原中洗脱出结合性克隆，并且结合性克隆可进一步通过抗原吸附/洗脱的另外的循环来富集。可通过以下来获得任一本披露的抗体：设计合适的抗原筛选程序以选择目的噬菌体克隆，随后使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗体克隆，可见描述于Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学目的的蛋白质的序列],第五版,NIH出版91-3242,马里兰州贝塞斯达(1991),第1-3卷。无论是用于诊断、治疗还是研究目的，增加非人抗体的人性以使其更适合用于人受试者和细胞可以是有利的。可以修饰抗体以作为治疗剂使用。此类抗体(包括抗体片段)的实例包括嵌合、人源化、和全人抗体。本领域存在多种方法用于产生嵌合、人源化和人抗体。在本披露的上下文中，如果VH结构域或VL结构域中的至少一个是人源化的，则抗体被认为是人源化的。此外，如果至少一个FR区的至少一部分的氨基酸序列相对于亲本非人(例如，鼠科)抗体被修饰，使得该部分的氨基酸序列对应于人抗体或人共有序列的氨基酸序列，VH或VL结构域是人源化的。在某些实施例中，VH结构域的至少一个、两个、三个或四个FR区和/或VL结构域的至少一个、两个、三个或四个FR区被修饰(整体上或部分)使得它们的序列与人序列更加密切相关。至于在某些实施例中的任一前述情况，人源化抗体片段可在人或非人轻链和/或重链恒定区(例如，包含CL以及CH1、铰链、CH2、和/或CH3结构域中的一个或多个)的上下文中提供。在某些实施例中，在人轻链和/或重链恒定结构域的上下文中提供本披露的人源化抗体或抗原结合片段(当存在时)。组合了本文所述的人源化轻链可变结构域和/或重链可变结构域的任一者的抗体和抗体结合片段是示例性的本披露的抗体和抗原结合片段。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是嵌合的。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是人的。
[0080] 根据本披露的某些实施例，提供了包含Fc结构域的抗PAR2抗体，该Fc结构域包含一个或多个突变，该突变提高或降低了例如与中性pH相比在酸性pH下抗体与FcRn受体的结合。例如，本披露包括在Fc结构域的CH2或CH3区包含突变的抗PAR2抗体，其中该一个或多个突变在酸性环境(例如，在内体中，其中pH的范围为约5.5至约6.0)中提高了Fc结构域与FcRn的亲和力。此类突变可导致抗体(当给予动物时)的血清半衰期的提高。此类Fc修饰的非限制性实例包括，例如在位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置
307或308(例如，308F、V308F)、和434的修饰。在一个实施例中，该修饰包含428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)、和308F(例如，V308F)修饰；
433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T、和256E)修饰；
250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。在又另一个实施例中，该修饰包含265A(例如，D265A)和/或297A(例如，D297A)修饰。在本披露的范围中考虑了在本文所披露的抗体可变结构域中的前述Fc结构域突变、和其他的突变的全部可能的组合。在一些实施例中，抗体包含三重突变L234F/L235E/P331S(“TM”)。TM导致人IgG1分子与人C1q、CD64、CD32A和CD16的结合活性大大降低。参见例如，Oganesyan等人,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.[晶体学报D卷生物晶体学]64:700-704(2008)。
具有增加的半衰期的抗体还可通过修饰被鉴定为涉及Fc与FcRn受体之间的相互作用的氨
基酸残基而产生。例如，将三重突变M252Y/S254T/T256E(’YTE’)引入人类免疫球蛋白G(IgG)分子的CH2结构域中，使其与人类新生儿Fc受体(FcRn)的结合增加。参见美国专利号
7,083,784，将其内容通过引用以其全文并入本文中。在一些实施例中，该抗体包含YTE修饰。
[0081] 根据本披露的某些实施例，提供了在VH和/或VL结构域中含有一个或多个突变的抗PAR2抗体，该突变提高或降低了例如与中性pH相比在酸性pH下抗体与PAR2的结合。例如，本披露包括在VH结构域的CDR2(SEQ ID NO:4)或CDR3(SEQ ID NO:5)区中和/或在VL结构域的CDR3(SEQ ID NO:10)中包含突变的抗PAR2抗体，其中该一个或多个突变用组氨酸置换了一个或多个氨基酸并且在酸性环境(例如，在内体中，其中pH的范围为约5.5至约6.0)中降低了VH和/或VL结构域与PAR2的亲和力。此类突变可导致抗体(当给予动物时)的血清半衰期的提高。此类VH修饰的非限制性实例包括，例如，在CDR2(SEQ ID NO:4)的氨基酸位置4、
5、7、8、10、11、12、14、15、16、和17处的修饰和在CDR3(SEQ ID NO:5)的1、2、4、5、和7处的修饰。此类VL修饰的非限制性实例包括，例如，在CDR3(SEQ ID NO:10)的位置1、2、4、5、6、7、8、
9、12、和14处的修饰。在又另一个实施例中，该VH包含在CDR2(SEQ ID NO:4)的位置5、8、12、
16、和17处和在CDR3(SEQ ID NO:5)的位置2和3处的修饰。在本披露的范围中考虑了本文所披露的Fc结构域中的前述VH和VL结构域突变、和其他的突变的全部可能的组合。
[0082] 在一些实施例中，本披露提供了包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:4的位置1-17(例如，4、5、和7-17)的任一个或多个氨基酸位置上的VH-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:5的位置1-8的任一个
或多个氨基酸位置上的VH-CDR3；并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1；ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2；和iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列但是其中组氨酸任选地存在于对应于SEQ ID NO:10的位置1-14的任一个或多个氨
基酸位置上的VL-CDR3。在一些实施例中，该VH包含：i)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH-CDR3，并且其中该VL包含：i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL-CDR1，ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL-CDR2，iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施例中，该抗体或其抗原片段在对应于SEQ ID NO:4的位置7、8、12、15、16、或17中的任一个或多个的氨基酸位置上具有组氨酸。在一些实施例中，该抗体或其抗原片段在对应于SEQ ID NO:5的位置2、或3中的任一个或多个的氨基酸位置上具有组氨酸。在一些实施例中，该抗体或其抗原片段在对应于SEQ ID NO:10的位置1、5、6、或14中的任一个或多个的氨基酸位置上具有组氨酸。在一些实施例中，组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:4的位置5、8、
12、16、和17的氨基酸位置上；并且其中组氨酸存在于对应于SEQ ID NO:5的位置2和3的氨基酸位置上。在一些实施例中，该VH-CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、
214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、
404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、
594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、
784、794、和811-818。在一些实施例中，该VH-CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、
195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、
385、395、405、415、425、435、445、455、465、475、485、495、505、515、525、535、545、555、565、
575、585、595、605、615、625、635、645、655、665、675、685、695、705、715、725、735、745、755、
765、775、785、795、和819-820。在一些实施例中，该VL-CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、
170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、
360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、
550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、
740、750、760、770、780、790和800。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:14的氨基酸序列；其中该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且其中该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:811的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:819的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:814的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:820的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:816的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH-CDR2包含对应于SEQ ID NO:818的氨基酸序列；该VH-CDR3包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且该VL-CDR3包含对应于SEQ ID NO:10或20的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含多个框架区，这些框架区各自与SEQ ID NO:803-806具有至少80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施例中，该VL包含多个框架区，这些框架区各自与SEQ ID NO:807-810具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施例中，该VH包含与选自由以下组成的组的序列的任一者具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、
92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、
282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、
472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、
662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、和792。在一些实施例中，该VL包含与选自由以下组成的组的序列的任一者具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、17、27、37、
47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、
247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、
437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、
627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、和797。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:12的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:821的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:824的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:827的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。在一些实施例中，该VH包含对应于SEQ ID NO:831的氨基酸序列并且该VL包含对应于SEQ ID NO:7或17的氨基酸序列。
[0083] 本披露还包括包含嵌合重链恒定(CH)区的抗PAR2抗体，其中该嵌合CH区包含衍生自多于一种免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如，本披露的抗体可包含嵌合CH区，其包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部CH2结构域与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部CH3结构域的组合。根据某些实施例，本披露的抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合CH区。例如，嵌合铰链可包含衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号的位置216至227的氨基酸残基)与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号的位置228至236的氨基酸残基)的组合。
[0084] 根据某些实施例，该嵌合铰链区包含衍生自人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和衍生自人IgG2下铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，如本文所述的包含嵌合CH区的抗体可表现出修饰的Fc效应子功能，而不会不利地影响抗体的治疗或药代动力学特性。(参见，例如US 2015-0203591A1)。
[0085] 本披露包括与PAR2的一个或多个氨基酸相互作用的抗PAR2抗体或抗原结合片段。该抗体所结合的表位可由PAR2的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。可替代地，该表位由PAR2的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
[0086] 本领域普通技术人员已知的各种技术可用于测定抗体是否与多肽或蛋白质中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括，例如，常规交叉阻断测定(例如如下所述：
Antibodies[抗体],Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约
冷泉港))、丙氨酸筛选突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol[分子生物学方法]248:443-463)、和肽切割分析。此外，可使用例如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science[蛋白质科学]9:487-496)。可用于鉴别与抗体相互作用的多肽中的氨基酸的另一方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般地说，该氢/氘交换方法涉及氘-标记目的蛋白，随后使该抗体与氘-标记的蛋白质结合。接下来，将该蛋白质/抗体复合物转移至水中以允许氢-氘交换在除了抗体保护的残基(其仍为氘-标记的)之外的所有残基上发生。在抗体解离之后，该靶蛋白经受蛋白酶切割和质谱法分析，由此显示出与抗体相互作用的具体氨基酸对应的氘-标记的残基。参见，例如Ehring(1999)
Analytical Biochemistry[分析生物化学]267(2):252-259；Engen and Smith(2001)
Anal.Chem.[分析化学]73:256A-265A。
[0087] 本披露进一步包括抗PAR2抗体或其抗原结合片段，其结合至与本文所述的任一抗体或抗原结合片段(例如，抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:12和17的氨基酸序列)相同的表位。同样地，本披露还包括抗PAR2抗体和抗原结合片段，其与本文所述的任一抗体或抗原结合片段(例如，抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:12和17的氨基酸序列)竞争与PAR2结合。通过使用本领域已知的和本文示例的常规方法，技术人员可容易地测定抗体是否与参考抗PAR2抗体结合相同的表位，或与参考抗PAR2抗体竞争结合。例如，为测定测试抗体是否结合至与本披露的参考抗PAR2抗体相同的表位，允许该参考抗体结合至PAR2蛋白。接下来，评估测试抗体结合至PAR2分子的能力。如果在该参考抗PAR2抗体饱和结合后该测试抗体能够结合至PAR2，随后可以得出结论：该测试抗体结合至与参考抗PAR2抗体不同的表位。在另一方面，如果在该参考抗PAR2抗体饱和结合后该测试抗体不能结合至该PAR2分子，那么该测试抗体可结合至与本披露的参考抗PAR2抗体结合的表位相同的表位。然后可进行另外的常规实验法(例如，肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合的缺失事实上是否由于与参考抗体相同的表位的结合或空间阻断(或另一现象)是否是所观察的结合的缺失的原因。可以使用本领域中可获得的ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或任何其他的定量或定性抗体结合测定进行此类的实验。根据本披露的某些实施例，如果例如
1、5、10、20或100倍过量的一种抗体使与另一种抗体的结合抑制至少50％不过优选地为
75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定中所测量，则两种抗体结合至相同的(或重叠的)表位上(参见，例如Junghans等人,Cancer Res.[癌症研究]1990:50:1495-1502)。
[0088] 可替代地，如果减少或消除一种抗体的结合的抗原中的基本上全部氨基酸突变减少或消除了另一抗体的结合，则两种抗体被认为结合至相同的表位。如果仅仅一个亚组的减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除另一抗体的结合，则两种抗体被认为具有“重叠表位”。
[0089] 为测定抗体是否与参考抗PAR2抗体竞争结合(或交叉竞争与其结合)，上述结合方法以两种方向进行：在第一种方向中，允许参考抗体在饱和条件下结合至PAR2蛋白，随后评估测试抗体与PAR2分子的结合。在第二种方向中，允许测试抗体在饱和条件下结合至PAR2分子，随后评估参考抗体与PAR2分子的结合。如果在两种方向中，仅有第一(饱和)抗体能够结合PAR2分子，那么可以得出结论测试抗体和参考抗体竞争与PAR2结合。如本领域普通技术人员所理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可不必须地结合至与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻表位空间阻断参考抗体的结合。
[0090] 用于产生单克隆抗体(包括完全人单克隆抗体)的方法是本领域已知的。在本披露的上下文中可使用任何此类已知的方法，以制备特异性结合至人PAR2的人抗体。
[0091] 使用例如VELOCIMMUNETM技术，或任何其他已知用于产生完全人单克隆抗体的方法，初始分离具有人可变区和小鼠恒定区的与PAR2的高亲和力嵌合抗体。如下文的实验部分，表征和选择了抗体的所希望的特征，包括亲和力、选择性、表位等。必要的话，将小鼠恒定区用所希望的人恒定区，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4置换以产生完全人抗PAR2抗体。
尽管所选择的恒定区可根据具体用途而变化，高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区。在某些情况下，完全人抗PAR2抗体从抗原阳性B细胞中直接分离。
[0092] 本披露的抗PAR2抗体和抗体片段涵盖具有以下氨基酸序列的蛋白质，这些氨基酸序列在所述那些抗体之间是不同的但是保留了与PAR2结合的能力(例如，SEQ ID NO:801)、或更具体地在一些实施例中，与PAR2系链配体结合的能力(例如，SEQ ID NO:802)。此类变体抗体和抗体片段当与亲本序列相比时包含一个或多个氨基酸添加、缺失、或取代，但是表现出与所述抗体基本上相等的生物活性。同样地，本披露的抗PAR2抗体编码的DNA序列涵盖如下序列，该序列与所披露的序列相比包含一个或多个核苷酸添加、缺失、或取代，但是编码与本披露的抗PAR2抗体或抗体片段基本上生物等效的抗PAR2抗体或抗体片段。此类变体氨基酸和DNA序列的实例如上所述。
[0093] 如果例如两种抗体或抗原结合片段是药学上的等效物或药学上的可替代物，当以相同的摩尔剂量在相似的试验条件下，以单剂量或多剂量给予时，它们的吸收速率和程度不示出显著的差异，则该两种抗体或抗原结合片段被认为是生物等效的。如果一些抗体或抗原结合片段在其吸收程度上是相等的，但是其吸收速率不相等并且仍然可被看作是生物等效的，则这些抗体或抗原结合片段将被认为是等效物或药学上的可替代物，因为此类吸收速率中的差异是有意的并且反应在标记上，对于例如在长期使用中有效的身体药物浓度的实现不是关键的，并且对于被研究的特定药物产品被认为是医学上不显著的。
[0094] 在一些实施例中，如果在其安全性、纯度和效力上没有临床上有意义的差异，则两种抗体或抗原结合片段是生物等效的。
[0095] 在一些实施例中，如果患者可以在参考产品和生物产品之间改变一次或多次而没有预期的不良反应风险(包括免疫原性的临床上显著的变化、或有效性降低)的增加(如与无此类改变的连续疗法相比)，则两种抗体或抗原结合片段是生物上等效的。
[0096] 在一些实施例中，如果两种抗体或抗原结合片段通过针对条件或使用条件的一种常见机制或多种作用机制起作用达到此类机制被知晓的程度，则这两种抗体或抗原结合片段是生物上等效的。
[0097] 生物等效性可通过体内和体外方法来证明。生物等效性量度包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中在血液、血浆、血清或其他生物流体中抗体或其代谢物的浓度作为时间的函数测量；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理地预测人体内生物利用度数据的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中抗体(或其靶标)的适当的急性药理学作用作为时间的函数测量；和(d)在良好控制的临床试验中，其确认了抗体的安全性、效力、或生物利用度或生物等效性。
[0098] 本披露的抗PAR2抗体的生物上等效的变体可以通过例如进行残基或序列的各种取代或缺失生物活性不需要的末端或内部残基或序列来构建。例如，可以缺失对于生物活性不必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸对其置换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫键。在其他的情况下，生物上等效的抗体或抗原结合片段可包括抗PAR2抗体变体，该抗PAR2抗体变体包含修饰抗体或抗原结合片段的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或去除糖基化的突变。
[0099] 根据某些实施例，本披露提供了结合至人PAR2但是不结合至另一物种的PAR2的抗PAR2抗体或抗原结合片段。本披露还包括结合至人PAR2并且结合至来自一个或多个非人物种的PAR2的抗PAR2抗体。例如，本披露的抗PAR2抗体可结合至人PAR2并且视情况而定可结合或不结合小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩PAR2中的一个或多个。根据某些实施例，抗体或抗原结合片段结合至人A549细胞、大鼠KNRK细胞、食蟹猴CYNOM-K1细胞或小鼠LL/2细胞中的PAR2。
[0100] 本披露涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)(例如细胞毒素、化学治疗剂、免疫抑制剂或放射性同位素)缀合的抗PAR2单克隆抗体。用于形成免疫缀合物的合适细胞毒素剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的(参见例如，WO05/103081)。
[0101] 在一些实施例中，本披露的抗体可以是单特异性的、双特异性的、或多特异性的。多特异性的抗体可以对一个靶多肽的不同表位是特异性的，或者可以含有对多于一个靶多肽特异的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等人,1991,J.Immunol.[免疫学杂志]147:60-
69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]22:238-244。本披露的抗PAR2抗体或抗原结合片段可以与另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白质)连接或共表达。例如，抗体或其抗原结合片段可以与一个或多个其他分子实体(例如另一个抗体或抗原结合片
段)功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔和或其他方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本披露包括双特异性的抗体，其中免疫球蛋白的一个臂对人PAR2或其片段是特异性的，并且免疫球蛋白的另一个臂对第二治疗靶是特异性的或与治疗部分缀合。
[0102] 可用于本披露的上下文中的示例性双特异性的抗体或抗原结合片段型式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig Ch3结构域与彼此的差异在于至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施例中，该第一Ig Ch3结构域结合蛋白质A并且该第二Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白质A结合的突变例如
H95R修饰(通过IMGT外显子编号；H435R通过EU编号)。该第二CH3可进一步包含Y96F修饰(通过IMGT；Y436F通过EU)。在第二CH3中可发现的进一步的修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、和V82I(通过IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、和V422I，通过EU)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N、和V82I(IMGT；N384S、K392N、和V422I，通过EU)；和在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、和V82I(通过IMGT；
Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、和V422I，通过EU)。上述双特异性抗体型式的变化涵盖在本披露的范围内。
[0103] 在本披露的上下文中可使用的其他的示例性双特异性型式包括但不限于，例如基于scFv的或双抗体双特异性型式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、突起入孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有突起入孔的共同轻链，等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链(leucine zipper)、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG、和Mab<2>双特异性型式(参见，例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11，和其中引用的参考文献，为对前述型式的综述)。双特异性抗体或抗原结合片段还可以使用肽/核酸缀合来构建，例如，其中使用了具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，其然后自组装成具有确定组成、化合价和几何结构的多聚体复合物。(参见，例如Kazane等人,J.Am.C em.Soc.[美国化学学会杂志][电子出版：
2012年12月4日])。
[0104] C.核酸及表达系统
[0105] 在一些实施例中，本披露提供了能够表达本文所披露的抗体或抗原结合片段中任一者的核酸。核酸可以是单链或双链DNA或RNA分子。在另外的实施例中，该抗体或抗原结合片段核酸序列可以是分离的、重组的、和/或与异源核苷酸序列融合、或在DNA文库中。在一些实施例中，该核酸包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、
321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、
511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、
701、711、721、731、741、751、761、771、781、和/或791中的任一者具有至少80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，该核酸包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、
146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、
336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、
526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、
716、726、736、746、756、766、776、786、和/或796中的任一者具有至少80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在具体的实施例中，该核酸包含与SEQ ID NO:1、6、11和/或16具有至少80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
[0106] 在某些实施例中，编码抗体或抗原结合片段的核酸还包括核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与编码上述抗体或抗原结合片段核苷酸序列、或其互补序列中任一者的多核苷酸杂交。在一些实施例中，该核酸在高严格条件下与多核苷酸杂交，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、
372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、
562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、
752、762、772、782、和792中的任一者具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该核酸在高严格条件下与多核苷酸杂交，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、
97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、
287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、
477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、
667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、和797中的任一者具有至少
80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。本领域的普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当的严格条件。
例如，可以在约45℃下于6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下进行杂交，接着在50℃下以2.0x SSC洗涤。例如，可以从在50℃下的约2.0x SSC的低严格性至在50℃下的约0.2x SSC的高严格性选择在该洗涤步骤中的盐浓度。另外，可以从在室温(约22℃)下的低严格条件至在约
65℃的高严格条件增加在该洗涤步骤中的温度。温度和盐两者都可以改变，或温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量可以变化。在一个实施例中，本披露提供了这样的核酸，其在室温下在6x SSC的低严格条件下杂交，接着在室温下以2x SSC洗涤。
[0107] 由于遗传密码的简并性而与编码抗体或其抗原结合片段的核酸有区别的分离的核酸也在本披露的范围内。例如，大量氨基酸由一个以上的三联体命名。指定相同氨基酸或同义词(例如，CAU和CAC为组氨酸的同义词)的密码子可以导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预期的是，确实导致主题蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域的技术人员应当理解的是，由于天然等位基因变化，在编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(高达约3％-5％的核苷酸)的这些变化可以存在于给定物种的个体中。任何和所有此类的核苷酸变化和产生的氨基酸多态性均在本发明的范围之内。
[0108] 在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一核酸的载体。在一些实施例中，本披露提供了包含本文所披露的任一载体的宿主细胞。
[0109] 无论何时本披露的抗体是全长抗体或抗原结合片段，本披露的抗体和抗原结合片段可以在细胞系中重组表达。在这些实施例中，编码特定抗体或抗原结合片段的序列可用于转化合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞或酵母宿主细胞。根据这些实施例，可以使用任何已知的将多核苷酸引入宿主细胞的方法实现转化，包括例如将多核苷酸包装在病毒(或在病毒载体)中并用具有该病毒(或载体)转导宿主细胞或通过本领域已知的转染过程。通常地，所使用的转化过程可取决于有待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一个或多个多核苷酸在脂质体中的包裹、以及DNA到核中的直接显微注射。
[0110] 根据本披露的某些实施例，使用标准连接技术，将编码本披露的重链恒定区(全部或部分)、重链可变区、本披露的轻链恒定区或轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子插入适当的表达载体中。在优选的实施例中，将重链或轻链恒定区附加到适当可变区的C-末端并连接到表达载体中。通常选择载体以在所使用的特定宿主细胞中起作用(即，该载体与宿主细胞机器相容，使得基因的扩增和/或基因的表达可以发生)。关于表达载体的综述，参见Goeddel(编者),1990,Meth.Enzymol.[酶学方法]第185卷,Academic Press[学术出版社].纽约。在抗体表达的上下文中，重链和轻链均可以从相同的载体上表达(例如，从相同载体上存在的相同或不同的启动子表达)，或者重链和轻链可以从不同的载体上表达。在某些实施例中，重链和轻链从不同的载体上表达，这些载体被转染到相同的宿主细胞中并且共表达。无论何时重链和轻链在相同宿主细胞中从相同或不同载体上表达，这些链随后可以缔和形成抗体(或抗体片段，这取决于表达的重链和轻链的部分)。
[0111] 通常，在任何宿主细胞中使用的表达载体将含有用于质粒维持和用于外源核苷酸序列克隆和表达的序列。此类序列(统称为“侧翼序列”)在某些实施例中将通常包括以下核苷酸序列的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区、和可选择的标志物元件。载体的这些部分是众所周知的，并且可以选择并使用许多通常可用的载体表达蛋白质。人们可以基于所需的宿主细胞和用途容易地选择载体。
[0112] 复制起点通常是商业上购买的那些原核表达载体的一部分，并且该起点有助于载体在宿主细胞中扩增。如果选择的载体不含有复制起点位点，可以基于已知序列化学合成一个，并连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，马萨诸塞州贝弗利)的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌并且各种病毒起点(例如，SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或乳头瘤病毒例如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(例如，通常仅使用SV40起点，因为其还含有病毒早期启动子)。
[0113] 本披露的表达和克隆载体将通常含有被宿主生物体识别并与编码重链和/或轻链的分子可操作地连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(即5’)的非转录序列，其(通常在约100-1000bp内)控制结构基因的转录。启动子通常可分成两个类别之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子应答于培养条件的某些变化(例如营养物的存在或不存在或温度的变化)在其控制下启动从DNA的增加的转录水平。在另一方面，组成型启动子启动连续的基因产物生产；即，对基因表达的控制很少或根本没有。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。合适的启动子与编码重链或轻链的DNA可操作地连接，该重链或轻链包含本披露的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，相同的启动子用于重链和轻链。在其他实施例中，分别使用不同启动子(存在于相同或不同载体上)。
[0114] 与酵母宿主一起使用的合适的启动子也是本领域熟知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适的启动子是众所周知的并且包括但不限于从病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选地，猿病毒40(SV40))基因组中获得的那些。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。
[0115] 可能感兴趣的另外的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon,1981,Nature[自然]290:304-10)；CMV启动子；包含在劳斯肉瘤病毒(Rous 
sarcoma virus)的3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell[细胞]22:
787-97)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]78:1444-45)；金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,1982,Nature[自然]
296:39-42)；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-31)；或tac启动子(DeBoer等人,
1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。同样感兴趣的是以下动物转录控制区，其展示出组织特异性并已用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,1984,Cell[细胞]38:639-46；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港会议上定量生物学]50:399-409(1986)；
MacDonald,1987,Hepatology[肝脏学]7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature[自然]315:115-22)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人,1984,Cell[细胞]38:647-58；Adames等人,1985,Nature[自然]
318:533-38；Alexander等人,1987,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7:1436-44)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人,1986,Cell[细胞]45:485-95)；在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人,1987,Genes and 
Devel.[基因与发育]1:268-76)；在肝脏中有活性的α-胎儿球蛋白基因控制区(Krumlauf等人,1985,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:1639-48；Hammer等人,1987,Science[科学]
235:53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,1987,Genes 
andDevel.[基因与发育]1:161-71)；在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人,1985,Nature[自然]315:338-40；Kollias等人,1986,Cell[细胞]46:89-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人,1987,Cell[细胞]
48:703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature[自然]
314:283-86)；和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人,1986,
Science[科学]234:1372-78)。
[0116] 载体还可以包括增强子序列以提高编码轻链或重链的DNA的转录。
[0117] 本披露的表达载体可以从起始载体(例如可商购的载体)构建。此类的载体可含有或不含全部的所希望的侧翼序列。当本文所述的一个或多个侧翼序列尚未存在于载体中时，其可以单独获得并连接到载体中。用于获得每一个侧翼序列的方法是本领域技术人员熟知的。
[0118] 在构建了载体并且将编码包含本披露的抗体或抗原结合片段的轻链或重链或轻链和重链的核酸分子插入载体的适宜位点后，可以将完整的载体插入合适的宿主细胞用于扩增和/或多肽表达。表达载体向所选择的宿主细胞的转化可以通过众所周知的方法(包括转染、感染、磷酸钙共沉淀法、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术)来完成。所选择的方法将部分地取决于要使用的宿主细胞类型。这些方法和其他合适的方法是技术人员所熟知的。
[0119] 当在适当条件下培养时，宿主细胞合成本披露的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段随后可以从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果其不是分泌的)。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所希望的表达水平、活性所希望的或所需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和易于折叠成生物活性分子。
[0120] 作为用于表达的宿主细胞可获得的哺乳动物细胞系是在本领域中已知的，并且包括但不限于许多可从美国典型培养物保藏中心(A.T.C.C.)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、以及多种其他细胞系。在另一个实施例中，可以从B细胞谱系中选择不产生其自身抗体但具有产生和分泌异源抗体的能力的细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系NS0和SP2/0)。在其他实施例中，使用哺乳动物细胞以外的细胞，例如酵母细胞系(例如毕赤酵母属(Pichia))。
[0121] 在某些实施例中，细胞系稳定地表达本披露的抗体或抗原结合片段。在其他实施例中，细胞瞬时表达本披露的抗体或抗原结合片段。
[0122] D.治疗制剂和给予
[0123] 本披露提供了包含本披露的抗PAR2抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本披露的药物组合物与合适的载体、赋形剂和其他提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一起配制。在所有药物化学家都知道的处方集中可以发现许多适当的制剂：Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],Mack Publishing Company[马克出版公
司],宾夕法尼亚州伊斯顿。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有小泡的脂质(阳离子或阴离子)(例如LIPOFECTINTM，生命科技公司(Life 
Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、无水吸收糊剂、水包油乳剂和油包水乳剂、乳剂卡波蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“Compendium ofexcipients forparenteral formulations[肠胃外制剂的辅料纲要]”PDA(1998)J Pharm Sci Technol[医药科学和技术杂志]52:238-311。
[0124] 给予患者的抗体剂量可以依据患者的年龄和身材、目标疾病、病症、给予途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。根据病症的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于给予抗PAR2抗体或抗原结合片段的有效剂量和时间安排可凭经验确定；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的种间类推(例如，Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.[药物研究]8:
1351)。
[0125] 各种递送系统是已知的并且可用于给予本披露的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见，例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于，皮内、鞘内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、以及口服途径。可以通过任何方便的途径给予该组合物，例如通过输注或快速注射(bolus injection)、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘
膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可以将其与其他生物活性剂一起给予。给予可以是全身性的或局部的。
[0126] 在一些实施例中，抗体及其抗原结合片段可用于治疗与中枢神经系统相关的病症和障碍，特别是与脑相关的病症和障碍。当向受试者的脑给予大分子例如抗体或抗原结合片段时，必须考虑各种因素，即抗体或抗原结合片段穿过血脑屏障(BBB)的能力，技术人员意识到将这些大分子给予大脑的方法。例如，在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段用一种或多种阳离子聚胺例如六亚甲基二胺或四亚甲基二胺共价修饰，以提高抗体或抗原结合片段穿过BBB内化的可能性。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段靶向PAR2并且还靶向有利于穿过BBB转运的受体(例如转铁蛋白受体、胰岛素受体和TMEM30A)。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段与靶向有助于穿过BBB转运的受体(例如转铁蛋白受体、胰岛素受体和TMEM30A)的试剂缀合。在一些实施例中，在给予抗体或片段之前或期间，BBB暂时被破坏。在一些实施例中，通过超声、放射、生化处理(例如，用KCa受体激动剂例如，NS-1619)或动脉内输注浓缩的高渗溶液暂时破坏BBB。
[0127] 可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本披露的药物组合物。此外，关于皮下递送，笔(pen)递送装置容易应用于递送本披露的药物组合物。此类的笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用含有药物组合物的可置换的柱筒。一旦给予了柱筒内的所有药物组合物并且柱筒是空的，就可以容易地丢弃空柱筒并用含有药物组合物的新柱筒置换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性使用的笔递送装置中，没有可置换的柱筒。相反，一次性笔递送装置预装有保持在装置内的储液器中的药物组合物。一旦储液器清空药物组合物，就丢弃整个装置。
[0128] 许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置可用于本披露的药物组合物的皮下递送。实例包括但不限于：AUTOPENTM(欧文·芒福德公司(Owen Mumford,Inc.)，英国伍德斯TM
托克)、DISETRONIC 笔(pen)(Disetronic医疗系统公司(Disetronic Medical Systems)，瑞士古德曼)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(礼来公司(Eli Lilly and Co.)，印第安纳州印第安纳波利斯)、NOVOPENTMI、II和III(诺和诺德公司(Novo Nordisk)，丹麦哥本哈根)、NOVOPEN JUNIORTM(诺和诺德公司(Novo Nordisk)，丹麦哥本哈根)、BDTM笔(贝迪公司(Becton Dickinson)，新泽西州富兰克林湖)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM、和OPTICLIKTM(赛诺菲-安万特公司(sanofi-aventis)，德国法兰克福市)，仅举几个例子。可用于本披露的药物组合物的皮下递送的一次性的笔递送装置的实例包括但不限于：SOLOSTARTM笔(赛诺菲-安万特公司(sanofi-aventis))、FLEXPENTM(诺和诺德公司(Novo Nordisk))、和KWIKPENTM(礼来公司(Eli Lilly))、SURECLICKTM自动注射器(安进公司(Amgen)，加利福尼亚州千橡市)、PENLETTM(Haselmeier公司，德国斯图加特)、TM
EPIPEN(Dey公司(Dey,L.P.))、和HUMIRA 笔(雅培公司(Abbott Labs)，雅培科技园(Abbott Park)，伊利诺伊州)，仅举几个例子。
[0129] 在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.[CRC关键引用生物医学工程]14:201)。在另一个实施例中,可以使用聚合物材料；参见，Medical Applications of Controlled Release[控释的医学应用],Langer和Wise(编者),1974,CRC Pres.[CRC出版
社],佛罗里达州波卡拉顿。在又另一个实施例中，控释系统可以放置在组合物靶标的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson,1984,在Medical Applications of 
Controlled Release[控释的医学应用],同上,第2卷,第115-138页)。其他控释系统在
Langer,1990,Science[科学]249:1527-1533的综述中进行了讨论。
[0130] 可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、鞘内、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法来制备。例如，可注射制剂可以例如通过将本文披露的任何抗体或抗原结合片段或如上所述的其盐在无菌含水介质或常规用于注射的油性介质中溶解、悬浮或乳化来制备。作为注射用含水介质的有例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)，非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。因此制备的注射剂优选地填充在适当的安瓿中。
[0131] 有利地，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合一个剂量的活性成分的单位剂量的剂型。单位剂量的此类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。前述抗体的量通常为单位剂量中每剂量约5mg至约500mg；特别是在注射形式中，对于其他剂型，优选的是前述抗体或抗原结合片段以约5mg至约100mg，和约10mg至约250mg被包含。
[0132] E.抗体的治疗用途
[0133] 针对本文所述的任一方法，本披露考虑了本披露的任何抗体或抗原结合片段的用途。
[0134] 在一些实施例中，本披露提供了治疗受试者中涉及不希望的和/或异常的PAR2活性的障碍的方法，该方法包括给予本文所述的任何抗体或抗原结合片段。如本文所使用的，“障碍”、“病症”和“疾病”可互换使用以指代本文所披露的任何障碍、病症或疾病。在一些实施例中，涉及不希望的和/或异常的PAR2活性的疾病/障碍/病症是与异常或不希望的炎症相关的疾病/障碍/病症。涉及异常的或不希望的PAR2活性的疾病/障碍/病症的实例包括急性或慢性疼痛、急性或慢性瘙痒、急性或慢性炎症(例如，关节、肺部、脑、胃肠道、牙周组织、皮肤和脉管系统的急性或慢性炎症)、自身免疫性障碍、牙周炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病、关节炎、银屑病、肥胖症、糖尿病、心血管疾病、胰腺炎、癌症(例如，乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌或前列腺癌)、哮喘、纤维化、胃溃疡、纤维化或纤维化障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、接触性皮炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管球性肾炎、和脑膜炎。在一些实施例中，本披露提供了治疗患有代谢综合征或与代谢综合征相关的一种或多种病症(例如内脏脂肪沉积、高血压、葡萄糖和胰岛素稳态受损、胰岛素抗性、内皮损伤、心血管肥厚、炎症、血管炎症、动脉粥样硬化、心室收缩功能障碍、纤维化和脂肪肝病)的受试者的方法。在具体的实施例中，本披露提供了治疗疼痛(例如与本文披露的任何疾病/障碍/病症相关的疼痛(例如，骨关节炎疼痛))的方法。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。
[0135] 在一些实施例中，本披露提供了提供了干扰蛋白酶(例如胰蛋白酶)和PAR2之间相互作用的方法，该方法包括将本文所述的任何抗体或抗原结合片段给予细胞的步骤。在一些实施例中，本披露提供了抑制细胞上的PAR2的系链配体暴露的方法，该方法包括将本文所述的任何抗体或抗原结合片段给予细胞的步骤。在一些实施例中，本披露提供了抑制PAR2的系链配体与PAR2蛋白的第二跨膜环之间的相互作用的方法，该方法包括将本文所述的任何抗体或抗原结合片段给予细胞的步骤。在一些实施例中，本披露提供了抑制细胞上的PAR2受体活化的方法，该方法包括将本文所述的任何抗体或抗原结合片段给予细胞的步骤。在一些实施例中，该细胞是神经元(例如，感觉神经元)。在一些实施例中，该细胞是体外的。在其他实施例中，该细胞在受试者中。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是人。在一些实施例中，受试者患有本文所披露的任何障碍。
[0136] 针对本文所述的任一方法，本披露考虑了一种方法的任一个或多个步骤与另一种方法的任一个或多个步骤的组合。这些方法涉及向有需要的个体给予有效量的适用于特定疾病或病症的本披露的化合物。在具体的实施例中，这些方法涉及将本文披露的任何抗体或抗原结合片段递送至有需要的受试者的细胞中。
[0137] 本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“缓解(alleviation)”等通常意思是获得所希望的药理学和/或生理学作用，并且还可以用于指代改善，缓解和/或降低被治疗的病症的一种或多种症状的严重程度。就完全或部分延迟疾病、病症或其症状的发病或复发而言，作用可以是预防性的，并且/或者就部分或完全治疗疾病或病症和/或归因于疾病或病症的不良反应而言，作用可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”包括哺乳动物(特别是人)的疾病或病症的任何治疗，并且包括以下中的任一个或多个：(a)在可能易患疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病/病症的受试者中预防该疾病或病症发生；(b)抑制疾病或病症(例如，遏制其发展)；或(c)减轻疾病或病症(例如，导致疾病或病症消退，改善一种或多种症状)。例如，疼痛(例如，骨关节炎疼痛)的“治疗”涉及治疗的受试者中疼痛症状的减轻、停止、缓解或消除。经该疾病的方法治疗的受试者群体包括罹患不希望的病症或疾病的受试者以及处于产生该病症或疾病风险的受试者。
[0138] 针对本文所述的任一方法，本披露考虑了整个申请中所述的任何抗体或抗原结合片段的用途。此外，针对本文所述的任一方法，本披露考虑了一种方法的任一个或多个步骤与另一种方法的任一个或多个步骤的组合。
[0139] 在某些实施例中，本发明提供了治疗与本文披露的任何疾病/病症/障碍相关的病症(例如急性或慢性疼痛(例如，骨关节炎疼痛))的方法。这些方法涉及向个体给予治疗有效量的如上所述的任何抗体或抗原结合片段。这些方法是特别针对动物(并且更具体地是人)的治疗或预防性治疗的。本披露期望任何前述方面和实施例的所有组合，以及与在详细描述中提出的任何实施例和实例的组合。
[0140] 术语“治疗有效剂量”表示对给予对象产生所希望的作用的剂量。精确的剂量将取决于治疗目的，并且可以由本领域的技术人员使用已知的技术来确定(参见，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding[药物配制工艺、科学和技术])。
[0141] 在某些实施例中，本发明的任何抗体或抗原结合片段可以单独给予或与一种或多种另外的化合物或疗法组合给予，用于治疗本文披露的任何疾病/病症/障碍，例如急性或慢性疼痛(例如，骨关节炎疼痛)。例如，本文所披露的任一抗体或抗原结合片段可以与一种或多种治疗化合物联合共同给予。当指示了共同给予时，组合疗法可以涵盖同时或交替给予。另外，组合可以涵盖急性或慢性给予。任选地，抗体/抗原结合片段和另外的化合物以加成或协同的方式起作用，用于治疗本文披露的任何疾病/病症/障碍，例如急性或慢性疼痛(例如，骨关节炎疼痛)。用于组合疗法中的另外的化合物包括但不限于小分子、多肽、抗体、反义寡核苷酸和siRNA分子。在一些实施例中，另外的化合物是如下中的任一个或多个：抗炎药物、镇痛剂、非甾体抗炎药(NSAID)、皮质类固醇、透明质酸、对乙酰氨基酚、可待因、洛尔塞(lorcet)、洛他布(lortab)、维柯丁(vicodin)、氢可酮(hydrocodone)、吗啡、奥施康定(oxycontin)、盐酸羟考酮制剂(Roxicodone)、Percocet、阿司匹林、塞来昔布(celecoxib)、普瑞巴林(pregabalin)、关节融合、关节置换、阿巴西普(abatacept)、阿达木单抗(adalimumab)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、依那西普
(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔(infliximab)、利妥昔单抗
(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)和托法替尼(tofacitinib)。依据组合疗法的性质，可以在给予其他疗法时和/或之后继续给予本披露的抗体或抗原结合片段。抗体或抗原结合片段的给予可以以单剂量或多剂量进行。在一些情况下，抗体或抗原结合片段的给予是在其他疗法之前至少若干天开始的，而在其他情况下，正好在给予其他疗法之前或同时开始给予。在一些实施例中，本文披露的任何另外的化合物与本文披露的任何抗体或抗原结合片段缀合。
[0142] 在组合疗法的另一个实例中，本披露的任何抗体或抗原结合片段可以用作与一种或多种另外的治疗方式组合的治疗方案的一部分。举例来说，此类的其他治疗方式包括但不限于：食疗、职业疗法、物理疗法、精神疗法、按摩、针灸、针压法、助行器、辅助动物等。
[0143] 注意，尽管本文所述的抗体或抗原结合片段可以与其他疗法组合使用，但在某些实施例中，提供抗体或抗原结合片段作为唯一的治疗形式。无论是单独给予还是与其他药物或治疗方案组合给予，抗体或抗原结合片段的剂量、频率、给予途径和给予时间由医师基于患者的病情和需要确定。
[0144] 根据本披露的某些实施例，可以在确定的时间过程中给予多剂量的抗PAR2抗体或其抗原结合片段(或包含抗PAR2抗体和本文提及的任何另外的疗法的组合的药物组合物)。根据本披露的这一方面，这些方法包括依次向受试者给予多剂量的本披露的抗PAR2抗体或抗原结合片段。如本文所使用的，“依次给予”意思是将每个剂量的抗PAR2抗体或抗原结合片段在不同时间点给予受试者，例如，在以预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)隔开的不同日期。本披露包括以下方法：这些方法包括向患者依次给予单一初始剂量的抗PAR2抗体或抗原结合片段，随后给予一个或多个第二剂量的抗PAR2抗体或抗原结合片段，并且任选地随后给予一个或多个第三剂量的抗PAR2抗体或抗原结合片段。
[0145] 术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本披露的抗PAR2抗体或抗原结合片段的给予的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时给予的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是初始剂量后给予的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量后给予的剂量。初始、第二和第三剂量可以全部含有相同量的抗PAR2抗体或抗原结合片段，但通常在给予频率方面可以不同于彼此。然而，在某些实施例中，初始、第二和/或第三剂量中含有的抗PAR2抗体或抗原结合片段的量在治疗过程中彼此不同(例如，根据需要向上或向下调整)。在某些实施例中，在治疗方案开始时给予两个或更多(例如，2、3、4或5)个剂量作为“负荷剂量”，随后以较不频繁的频率给予后续的剂量(例如，“维持剂量”)。
[0146] F.抗体或抗原结合片段的诊断用途或其他用途
[0147] 本披露的抗PAR2抗体还可以用于检测和/或测量样品中的表达PAR2或PAR2的细胞，例如用于诊断的目的。例如，抗PAR2抗体、或其抗原结合片段可用于诊断以PAR2的异常表达(例如，过表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的病症或疾病。PAR2的示例性诊断测定可包括，例如，使获得自患者的样品与本披露的抗PAR2抗体接触，其中抗PAR2抗体用可检测的标记或报道分子进行了标记。
[0148] 可替代地，未标记的抗PAR2抗体可以与第二抗体组合用于诊断用途，该第二抗体本身是经可检测地标记的。该可检测的标记或报道分子可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、或125I；荧光部分或化学发光部分例如异硫氰酸荧光素、或罗丹明；或酶例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶、或萤光素酶。可用于检测或测量样品中PAR2的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、和荧光激活细胞分选
(FACS)。
[0149] 本披露的该组合物具有多种用途。例如，本披露的抗体和抗原结合片段可用于研究体外和/或体内细胞和组织中的优先细胞和组织分布。相似地，单独或与异源试剂缀合的抗体和抗原结合片段可用作成像剂，例如用于离体或体内诊断用途。例如，与放射性部分缀合的抗体或抗原结合片段可用于离体或体内成像研究。相似地，本披露的任何抗体或抗原结合片段具有相似的用途。
[0150] 当在体外使用时，本披露的抗体和抗原结合片段适用于鉴别所递送的抗体或抗原结合片段的结合配偶体(例如，鉴别结合抗体或抗原结合片段的蛋白质或肽)，并用于评估定位和转运。相似地，当在体内使用时，抗体或抗原结合片段可用于鉴别所递送的抗体或抗原结合片段的结合配偶体(例如，鉴别结合抗体或抗原结合片段的蛋白质或肽)，用于评估定位和转运，用于评估生物分布和半衰期，并且用于评估免疫原性。
[0151] G.动物/细胞模型
[0152] 本领域技术人员已知可用于检查任何抗体或其片段的许多动物模型。参见，例如Kuyinu等人,2016,J Orthop Surg Res[骨科外科与研究杂志],11(19):10.1186/s13018-016-0346-5。在一些实施例中，动物模型是基于疼痛的模型，该模型通过用化学物质(例如碘乙酸单盐(MIA)或角叉菜胶)处理动物而产生。在一些实施例中，将化学物质注射到有待在动物体内引起疼痛的部位。在一些实施例中，动物模型是一种动物，其中术后(例如，切口)引入损伤，例如前十字韧带横切、半月板切除术或内侧半月板横切。在一些实施例中，动物模型是与炎性病症(例如下食道刺激、结肠炎症、胃溃疡、膀胱炎症、胰腺炎症和子宫炎症)相关的动物模型。参见，例如，在National Research Council Committee  on 
Recognition and Alleviation ofPain in Laboratory Animals[实验动物疼痛的识别与缓解国家研究委员会],“Models of Pain[疼痛模型],”2009中所指的动物模型。
[0153] H.试剂盒
[0154] 在某些实施例中，本披露还提供了药物包或试剂盒，其包含装有本披露的至少一种抗体或抗原结合片段的一个或多个容器。任选地，与此类的一个或多个容器相关的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告反映(a)该机构针对人类给予，对制造、使用或销售的许可，(b)使用说明书，或两者。
[0155] 实例
[0156] 给出以下的实例是为了给本领域的普通技术人员提供如何准备和使用本披露的方法和组合物的一个完整的披露和说明，并不是旨在限制诸位发明人认为的自己披露的范围。已经努力确保了关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑存在一些实验误差和偏离。除非另外指明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，且压力为大气压或接近大气压。
[0157] 实例1：具有对PAR2的pH敏感性结合的抗体的产生
[0158] 重组人、大鼠和食蟹猴PAR2和PAR1蛋白的产生.
[0159] 包含细胞外残基1-75的人、大鼠和食蟹猴(Macaca fascicularis)PAR2(蛋白酶-活化受体2)构建体用N-末端AviTagTM(亲和力LLC公司(Avidity LLC))和C-末端Flag和聚组氨酸标签来设计并且克隆进载体pDEST12.2OriP FH(生命科技公司(Life Technologies))中。包含细胞外残基1-102的人PAR1(蛋白酶-活化受体1)构建体用C-末端Flag和聚组氨酸标记来设计并且克隆进载体pDEST12.2OriP FH(生命科技公司(Life Technologies))中。
将构建体在HEK293细胞中表达，并使用标准亲和力和尺寸排阻色谱纯化法从培养基中纯
化。为了产生生物素化的蛋白质，根据制造商的说明书对AviTagTM进行酶促生物素化。
[0160] 组合的组氨酸筛选文库的构建
[0161] 设计分池(split pool)寡核苷酸以在Par0067的VHCDR2、VHCDR3或VLCDR3中的每一个位置上引入组氨酸或野生型氨基酸。相继构建三个Par0067scFv噬菌体展示文库，其中在VHCDR2、VHCDR3或VLCDR3中存在0％和100％之间的组氨酸残基。
[0162] pH敏感性Par0067变体scFv的选择
[0163] 组合的组氨酸筛选文库经受基于亲和力的噬菌体展示选择，其目标是分离在pH 7.4结合至PAR2但是在pH 6.0具有降低的结合的Par0067变体。为了实现这一点，使用降低浓度的生物素化的重组人PAR2对每个文库进行四轮选择(Hawkins,RE等人,1992年8月5日；
226(3):889-96)。在每轮中，将噬菌体与链霉亲和素包被的顺磁珠 预孵育1
小时以除去任何链霉亲和素结合物。随后用 磁体除去链霉亲和素珠并丢弃，并在
pH 7.4将剩余的噬菌体添加到生物素化的重组人PAR2中。选择进行2小时，然后添加链霉亲和素包被的顺磁珠以捕获生物素化的重组人PAR2结合的噬菌体。用PBS吐温(PBST)洗涤珠5次，然后在低pH缓冲液(pH 5.5-pH 6.0)中洗脱特异性scFv。然后如前所述(Osbourn JK.等人Immunotechnology[免疫技术],2(3):181-96,1996)拯救选择的scFv-噬菌体颗粒，并在降低浓度的生物素化PAR2的存在下重复该选择过程(1nM-0.05nM，经4轮)。
[0164] 将scFv重新型式化为IgG1-TM
[0165] 基本上如Persic等人(1997,Gene[基因],187,9-18)所述，将抗体从scFv转化为完整的免疫球蛋白G1三重突变体(IgG1-TM，并入突变L234F、L235E和P331S的IgG1Fc序列)抗体型式，其具有以下修饰。在表达载体中包括了OriP片段，以便促进在CHO瞬态细胞中使用并且允许游离型复制。将可变重链(VH)结构域克隆至含有人重链恒定结构域和调控元件的载体中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG1-TM重链。相似地，将可变轻链(VL)结构域克隆进用于表达人轻链(λ)恒定结构域和调控元件的载体中，以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。为了获得IgG，将表达重链和轻链IgG的载体转染到CHO-瞬态哺乳动物细胞中(Daramola等人Biotechnol Prog[生物技术进展]30(1):132-41(2014))。IgG被表达并分泌到培养基中。纯化前过滤收获物，然后使用蛋白质A色谱法纯化IgG。将培养物上清液装载至陶瓷蛋白质A(Ceramic Protein A)(BioSepra公司)的适当大小的柱子上，并用50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl洗涤。将结合的IgG使用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)从柱上洗脱并且通过添加Tris-HCl(pH 9.0)进行中和。洗脱材料使用Nap10柱(阿默舍姆公司(Amersham)，#
17-0854-02)缓冲交换至PBS中，并使用基于IgG的氨基酸序列的消光系数通过分光光度法来确定IgG的浓度(Mach等人,AnalBiochem.[分析生物化学]200(1):74-80(1992))。使用
SEC-HPLC和SDS-PAGE对经纯化IgG进行聚集和降解纯度的分析。
[0166] pH敏感性Par0067变体scFv和IgG的筛选
[0167] 为了筛选和分析具有潜在pH依赖性结合的抗体，使用生物化学表位竞争测定型式。设计了使用均相时间分辨荧光(HTRFTM)技术的测定以评估测试抗体(scFv或IgG)抑制亲本Par0067IgG抗体结合至人PAR2细胞外结构域(ECD)的相互作用的能力。重要的是，该测定在两种不同的pH值(pH 7.4和pH 6.0)下进行。
[0168] 在pH 7.4和pH 6.0(如上所述)下的平行测定首先用于在单点384孔高通量筛选(HTS)中筛选粗制的未纯化的scFv(细菌提取物)。该单点平行HTS型式使得能够筛选数以千计的测试scFv，并且那些在pH 6.0比在pH 7.4下导致亲本Par0067IgG与人PAR2结合的相互作用的抑制降低的抗体被用于进行进一步的表征。随后，则以多点剂量应答IC50型式进行相同的表位竞争测定方法，以测试纯化的scFv和纯化的IgG(在后一种情况下，如C部分所述，需要对测定设计进行微小的修改)。再次在pH 7.4和pH 6.0下进行测定，然而，在这些实验中，我们对如下测试抗体最感兴趣，其中相对于在pH 7.4下观察到的相应的剂量应答抑制曲线，在pH 6.0下，剂量响应抑制曲线示出大的向右移位(即，显著增加的IC50值)。
[0169] 以下方案包括用于粗制的未纯化的scFv的单点测试和随后的纯化的scFv和IgG的测试的方法。
[0170] 部分A：通用测定条件：
[0171] 测定缓冲液：
[0172] 在使用当天，新鲜制备测定缓冲液。对于在pH 7.4下的实验，将DPBS(Gibco 14190-086)用KF(0.4M)(VWR公司，103444T)和BSA(0.1％w/v)(PAA公司，K05-013)补充，随后再检查该pH并按照需要将其微调至pH 7.4。对于在pH 6.0下的实验，在保持所有其他缓冲液组分与上述pH 7.4测定缓冲液相同的同时，使用200mM MES(西格玛公司(Sigma)，M-
5287)的基础缓冲液(与DPBS相反)配制pH 6.0测定缓冲液。添加KF(0.4M)和BSA(0.1％w/v)后，然后用HCL将200mM基于MES的缓冲液调节至pH 6.0。
[0173] 测定板：使用黑色浅孔384板(圆底，非结合)(康宁公司(Corning)，4514)进行测定[0174] 测定体积：20μl
[0175] 孵育和板读取：将测定板在RT孵育2小时，然后在Envision读板仪上使用标准HTRFTM读取方案进行读取。
[0176] 部分B：测试scFv：(未纯化的细菌裂解物和纯化的scFv)
[0177] 添加顺序和测定组分：
[0178]
[0179] Par0067IgG准备/添加：
[0180] 在前面A部分(pH 7.4和pH 6.0)中所述的两种测定缓冲液的每一种中，将未标记的纯化的Par0067IgG(内部产生)制成4.44nM(1.11nM最终[测定])的浓度。将5μl/孔的适当pH的4.44nM Par0067IgG溶液添加到相关测定板(pH7.4和pH 6.0)的所有孔中。
[0181] 测试scFv准备/添加：
[0182] a)对于在pH 7.4和pH 6.0下粗制的未纯化的细菌裂解物scFv样品的平行单点HTS，首先使用适当的pH 7.4或pH 6.0测定缓冲液将样品预稀释至其纯净浓度的40％。随后将5μl的40％预稀释的样品转移到适当的测定(pH 7.4或pH6.0)中，以给出10.0％的最终测定样品浓度(在20μl最终测定体积中)。将亲本Par0067scFv作为对照包括在所有HTS实验中，作为如变得可用(用于确定基准点)的那些的特异性pH依赖性抗体。
[0183] b)对于纯化的scFv抗体的多点剂量应答IC50测试，从1/4纯净未稀释样品的最高最终测定中测试了样品(即，未进行预稀释步骤)。然后在两个测定缓冲液(pH 7.4&6.0)的每一个中，在384孔聚丙烯Greiner板上制备重复的11点1:3连续稀释液。将5μl/孔的每个连续稀释液从相关的pH scFv稀释板上转移至相应的测定板(pH 7.4和pH 6.0)。将5μl适当的pH测定缓冲液添加到总孔和非特异性孔中。将亲本Par0067纯化scFv包括在全部多点剂量应答IC50实验中作为对照，作为如变得可用(用于确定基准点)的那些的特异性pH依赖性纯化scFv。数据呈现于表1中。
[0184] 生物素化人PAR2ECD准备/添加：
[0185] 将内部产生的生物素化的人PAR2ECD稀释到两种测定缓冲液(pH 7.4&pH 6.0)的每一种中以给出4.0nM的工作溶液(1nM最终测定浓度)。然后将5μl/孔的适当的4.0nM生物素化的人PAR2ECD工作溶液添加到相应测定板(pH 7.4和pH 6.0)的所有孔中，除了阴性结合对照孔。将5μl/孔的适当的pH测定缓冲液添加到阴性结合孔中。
[0186] HTRF检测试剂制备/添加：
[0187] 将铕穴状化合物标记的链霉亲和素(CisBio公司，610SAKLB)和XL665标记的抗人-Fc(CisBio公司，61HFCXLB)各自稀释到每个pH测定缓冲液(pH7.4&pH 6.0)中，以给出浓度为6.0nM(铕穴状化合物标记的链霉亲和素)和40nM(XL665标记的抗人-Fc)的组合的工作溶液。允许4倍稀释到测定中，这导致最终测定浓度为1.5nM(铕穴状化合物标记的链霉亲和素)和10nM(XL665标记的抗人-Fc)。然后将5μl/孔的相关pH结合HTRFTM检测试剂工作溶液添加到相应测定板(pH 7.4和pH 6.0)的所有孔中。
[0188] 部分C：纯化的IgG的测试：
[0189] 添加顺序和测定组分：
[0190]
[0191] Par0067IgGDylight650标记：
[0192] 使用Dylight650标记的试剂盒(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号84536)进行Par0067IgG的Dylight650标记。根据制造商推荐的标记程序，进行内部产生的纯化的Par0067IgG的标记。最终的Dylight650标记的Par0067IgG浓度测定为0.56mg/ml，在平均Dylight650与IgG染料掺入比为2.7摩尔染料/摩尔IgG。
[0193] Dylight650标记的Par0067IgG准备/添加：
[0194] 在如在材料部分中如前所述的两种测定缓冲液(pH 7.4&pH 6.0)中的每一个中将Dylight650标记的Par0067IgG(0.56mg/ml，3,733nM)的浓度制备为4.44nM(以给出1.11nM最终[测定])。将5μl/孔的适当pH的4.44nM Dylight650Par0067IgG溶液添加到相关测定板(pH 
7.4和pH 6.0)的所有孔中。
[0195] 测试IgG连续稀释液/添加：
[0196] 将亲本Par0067IgG(在所有测定中作为参考/对照使用)预稀释以在两种不同pH测定缓冲液的每一种中给出2000nM原液(为了给出500nM的最高最终测定IgG浓度)。从1/4纯净未稀释样品的的最高最终测定浓度中测试了所有测试或其他参考/对照IgG(即，未进行预稀释步骤)。然后在两个测定缓冲液(pH 7.4&6.0)的每一个中，在384孔聚丙烯Greiner板上制备重复的11点1:3连续稀释液。将5μl/孔从相关的pH IgG稀释板上转移至相应的测定板上(pH7.4和pH 6.0)。将5μl的适当的pH测定缓冲液添加到总孔和非特异性孔中。
[0197] 生物素化人PAR2ECD准备/添加：
[0198] 将内部产生的生物素化的人PAR2ECD稀释到两种测定缓冲液(pH 7.4&pH 6.0)的每一种中以给出4.0nM的工作溶液(1nM最终测定浓度)。然后将5μl/孔的适当的4.0nM生物素化的人PAR2ECD工作溶液添加到相应测定板(pH 7.4和pH 6.0)的所有孔中，除了阴性结合对照孔。将5μl/孔的适当的pH测定缓冲液添加到阴性结合孔中。
[0199] HTRF检测试剂制备/添加：
[0200] 铕穴状化合物标记的链霉亲和素(CisBio公司,610SAKLB)稀释到各pH测定缓冲液(pH 7.4&pH 6.0)中，以给出浓度为6.0nM的工作溶液。允许4倍稀释到测定中，这导致最终测定铕穴状化合物标记的链霉亲和素浓度为1.5nM。然后将5μl/孔的相关pH铕穴状化合物标记的链霉亲和素工作溶液添加到相应测定板(pH 7.4和pH 6.0)的所有孔中。
[0201] 部分D：数据分析：
[0202] 首先将665nm和620nm计数转换为665/620比值。然后根据以下等式计算ΔF(％)：
[0203] ΔF(％)＝((样品比率-阴性比率)/阴性比率)*100
[0204] 在不存在来自相关阴性结合对照孔的Par0067IgG的情况下，计算了阴性比率值。
[0205] 然后根据以下等式计算％特异性结合：
[0206] ％特异性结合＝{(样品％ΔF-阴性结合％ΔF)/(总结合％ΔF-阴性结合％ΔF)}*100
[0207] 对于单点HTS，在pH 6.0相比于pH 7.4下，％特异性结合分别绘制在x和y轴上，以可视化scFv的分布，相对于pH 7.4，其在pH 6.0下具有降低的抑制(更高的％特异性结合)。
[0208] 对于多点剂量应答曲线，将％特异性结合值对比测试纯化的抗体浓度(scFv或IgG)进行作图。使用Graphpad Prism软件通过S形剂量应答抑制可变斜率曲线拟合(4参数逻辑方程)确定了IC50值。
[0209] 表1
[0210]
[0211]
[0212] 将多个组氨酸重组合进入单个scFv
[0213] 使用定点突变，将来自在Par0067表位竞争结合测定中示出pH依赖性结合的scFv的组氨酸残基重新组合(Reikofski J和Tao BY,1992,Biotechnol Adv[生物技术进展],10(4):535-547)。在竞争结合测定中将在两个不同CDR中含有组氨酸的所得scFv作为完整免疫球蛋白G1三重突变体(IgG1-TM)(表2)重新测试，以鉴别与亲本抗体Par0067相比pH依赖性结合具有进一步改善的变体。
[0214] 图1A-1B和图2A-2B中提供了与参考Par0067抗体CDR序列相比，每个组氨酸修饰的克隆的序列对齐。
[0215] 表2
[0216]
[0217] IC＝不完整曲线；ND＝未示出
[0218] 通过BIACORETM测定的抗PAR2Fab对人、大鼠和食蟹猴PAR2的亲和力
[0219] 表达了抗PAR2抗体的抗原结合片段(Fab)(Spooner J.等人(2015)Biotechnol Bioeng.[生物技术与生物工程]112:1472-7)并通过Biacore测定了对各种物种(人、大鼠和食蟹猴)的重组PAR2的亲和力。
[0220] Biacore亲和力分析
[0221] 使用Biacore T100在25℃，在各种pH(pH 7.4、pH 6.0和pH 5.6)下测量了抗PAR2Fab的亲和力。使用具有N-末端Avi标签和C-末端Flag-His标签的重组人、大鼠和食蟹猴PAR2进行实验。
[0222] 使用标准胺偶联技术使在10mM乙酸钠pH 4.5中呈4μg/ml浓度的链霉亲和素共价固定于C1芯片表面上。实现了大约30-100RU的最终链霉亲和素表面。将重组生物素化的
PAR2种类(内部产生)在HBS-EP+缓冲液中以4μg/ml滴定到链霉亲和素芯片表面上以实现在饱和状态下的Fab结合(Rmax)。此分析物低结合水平确保最小质量输送作用。
[0223] 将抗PAR2Fab在HBS-EP+缓冲液pH 7.4或MES-BS-EP+pH 6.0缓冲液中或在MES-BS-EP+pH 5.6缓冲液中连续稀释(0.39nM-25nM)并以50μl/流过芯片，其中3分钟结合，并且最多30分钟解离。在同一条件下进行多次仅缓冲液注射以允许双参考减去最终传感图集，使用了BiaEval软件(2.0.1版本)进行分析。芯片表面通过4M MgCl2的脉冲完全再生。
[0224] 在下表3-13中提供了选择克隆的BiaCore亲和力结果。
[0225] 表3：Par0067Fab.
[0226]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 6.66E+6 4.96E-5 7.5 50.1
6.0 人类 3.12E+6 9.72E-5 31.2 39.3
7.4 大鼠 5.16E+6 1.94E-4 37.6 111
6.0 大鼠 3.21E+6 5.44E-4 170 100
[0227] 表4：PaB670048Fab.
[0228]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 4.20E+6 5.19E-4 124 69.0
6.0 人类 1.94E+6 4.97E-3 2569 58.3
7.4 大鼠 5.24E+6 3.07E-3 586 124.7
6.0 大鼠 4.00E+6 2.05E-2 5120 105.2
[0229] 表5：PaB670084Fab.
[0230]
[0231]
[0232] 表6：PaB670076Fab.
[0233]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 5.84E+6 1.21E-3 207 63.5
6.0 人类 1.11E+6 5.14E-3 4,611 99.51
7.4 大鼠 6.34E+6 1.07E-2 1,689 87.9
6.0 大鼠 1.66E+6 5.10E-2 30,730 82.61
[0234] 表7：PaB670120Fab.
[0235]-1 -1 -1
pH 物种 ka(M s ) kd(s ) KD(pM) Rmax
7.4 人类 5.54E+6 1.37E-3 247 61.62
6.0 人类 3.48E+6 2.10E-2 6,047 94.67
7.4 大鼠 5.62E+6 1.46E-2 2,606 84.23
6.0 大鼠 8.26E+6 0.281 34,040 73.35
[0236] 表8：PaB670128Fab.
[0237]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 5.95E+6 3.65E-3 613 59.57
6.0 人类 2.22E+6 4.57E-2 20,062 79.4
7.4 大鼠 6.49E+6 1.96E-2 3,023 80.86
6.0 大鼠 1.79E+6 6.89E-2 38,520 63.26
[0238] 表9：PaB670048Fab.
[0239]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 5.59E+6 5.80E-4 104 58.53
6.0 人类 1.84E+6 4.58E-3 2,488 93.02
7.4 大鼠 7.46E+6 3.25E-3 435 81.2
6.0 大鼠 4.84E+6 2.17E-2 4,483 80.14
[0240] 表10：PaB670129Fab.
[0241]
[0242]
[0243] 表11：PaB670136Fab.
[0244]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 5.17E+6 4.95E-3 957 50.27
6.0 人类 7.92E+8 14.9 18,840 67.97
7.4 大鼠 7.57E+6 3.14E-2 4,149 73.24
6.0 大鼠 1.57E+6 5.89E-2 37,550 47.7
[0245] 表12：PaB670103Fab.
[0246]pH 物种 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(pM) Rmax
7.4 人类 3.52E+6 1.11E-4 32.5 46.3
6.0 人类 3.36E+5 6.07E-4 1,805 70.66
7.4 大鼠 3.04E+6 5.58E-4 184 74.2
6.0 大鼠 5.31E+5 5.42E-3 10,200 69.58
[0247] 表13：在3个不同pH下的PaB670129Fab.
[0248]
[0249] 实例2：基于细胞的PAR2和PAR1活性测定
[0250] 在PDL包被的组织培养板(Greiner Bio-One公司)上，将表达内源性PAR2的人A549细胞、大鼠KNRK、小鼠LL/2或食蟹猴CYNOM-K1细胞或过表达人PAR2的人1321N1-hPAR2-cl8细胞以5,000(人、食蟹猴)或7,000(小鼠、大鼠)个细胞/孔进行接种。用Fluo-Screen QuestTMFluo-8无洗涤钙染料(AAT Bioquest公司(AAT Bioquest,Inc))装载细胞。在室温下，用在测定缓冲液(HBSS，0.1％BSA，20mM HEPES)中稀释的IgG或Fab预处理细胞1小时。对于小鼠和食蟹猴测定，分别用0.5nM或10nM凝血酶预处理细胞，以使PAR1活性失敏。在荧光成像读板仪(FLIPR)Tetra(分子仪器公司(Molecular Devices))上测量了对11nM(人)、
400nM(小鼠)或80nM(大鼠、食蟹猴)胰蛋白酶(Polymun公司)的PAR2钙应答。为了测定对人PAR1的功能活性，还在FLIPR tetra上测定了A549人细胞系中凝血酶驱动的钙应答，并且在这些测定中，中和性抗PAR1IgG WEDE15(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和ATAP2
(生命科技公司(Life Technologies))被用作阳性对照。为了测定对多种蛋白酶的功能活性，在用0.5nM胰蛋白酶，500nM类胰蛋白酶或1nM蛋白裂解酶刺激钙释放之前，用PaB670129预处理过表达人PAR2的1321N1-hPAR2-cl8细胞。在添加蛋白酶之前，期间和之后测量荧光量度并且计算了每孔峰值RFU。针对抗体浓度计算％应答(相对于单独的蛋白酶)，并使用GraphPad Prism软件测定IC50。
[0251] 图3(分别地，A、B、C和D)提供了在这些测定中来自人、食蟹猴、大鼠和小鼠细胞的结果，图3E和图6(PAR1特异性数据)提供了计算的PAR2IC50。IC50计算示出PaB670129在表达内源性PAR2的人、小鼠、大鼠和食蟹猴细胞中有效抑制胰蛋白酶诱导的PAR2钙应答(图3E)。此外，在人A549细胞中，凝血酶诱导的PAR1活化不受PaB670129的抑制，但可被沃拉帕沙(Vorapaxar)和抗PAR1单克隆抗体有效地阻断(图6)。这些数据示出PaB670129是PAR2的有效和特异性的拮抗剂。单独将PaB670129应用于表达PAR2的细胞对基础细胞钙水平没有作用，这示出了PaB670129在PAR2处缺乏任何激动活性(图4A)。此外，PaB670129有效拮抗PAR2诱发的对多种蛋白酶(包括胰蛋白酶、类胰蛋白酶和蛋白裂解酶)的应答(图4B)。
[0252] 初级DRG胶质-神经元PAR2钙测定
[0253] 制备斯普拉-道来大鼠幼崽背根神经节(DRG)的解离培养物，并使其在层粘连蛋白和PDL包被的组织培养板(Greiner Bio-One公司)上生长。在用于测定之前，将板在37度孵育24-72小时。用2μM Fura-2钙染料(生命科技公司(Life Technologies))装载细胞。将细胞在20nM下的含有PAR2抗体的成像缓冲液(HBSS，20mM HEPES，0.1mM磺吡酮，10μM的PAR1拮抗剂沃拉帕沙(Vorapaxar))中孵育。然后，通过Fura-2比率成像在装配有氙弧灯(该氙弧灯在340nm和380nm激发)的Olympus IX81显微镜上，定量应答于激动剂凝血酶(西格玛公司(Sigma))和蛋白裂解酶(R&D系统公司(R&D Systems))PAR2活化肽LIGRLO(SEQ ID NO:
832)、(Peptides International公司)和高细胞外钾(50mM)的应用的细胞内钙。计算每个视野的神经元和神经胶质的数量(神经元定义为示出对高钾的应答)。然后计算每个视野的总蛋白裂解酶敏感性神经元和神经胶质。图5A-F提供了钙测定的结果，并且这些结果说明PaB670129抗体在DRG神经元(图5A-C)和非神经元细胞(图5D-F)中有效降低了对蛋白裂解
酶的敏感性。
[0254] 实例3：抗PAR2抗体在大鼠炎性关节疼痛模型中的作用
[0255] 在斯普拉-道来大鼠的同侧膝关节内进行的关节内给予碘乙酸单盐(MIA)导致最初与炎症反应相关的强烈且持久的痛觉过敏和异常性疼痛的发展。这一动物模型中这些迹象的发展被认为是临床相关的；这反映了表现出与潜在的病症例如骨关节炎(OA)或类风湿性关节炎相关的慢性炎症性疼痛的患者示出的症状(Bove等人,2003；Fernihough等人,
2004；Kalbhen 1987)。先前已经示出(使用负重作为终点)MIA诱导的痛觉过敏的时间过程遵循两阶段模式，其中早期的主要是炎性组分，其对Cox-2敏感；并且被黄金标准-塞来昔布显著地降低。这一早期炎症阶段让位于更慢性的疼痛表型，即普瑞巴林(PGB)敏感和塞来昔布不敏感的，这表明是潜在的更加神经性类型的组分。
[0256] 负重：初始大鼠在两只后爪之间平均分配体重。然而，当注射的(左)后膝发炎和/或疼痛时，重量被重新分配，从而受影响肢体的负重更小(受伤肢体的负重降低)。使用大鼠失能测试仪(林顿仪器公司(Linton Instruments)，英国)测量了通过每个后肢的负重。
[0257] 将斯普拉-道来大鼠置于失能测试仪中，将其后爪放在分开的传感器上，并在经4秒记录两个后肢施加的平均力。
[0258] 程序：在递送后，大鼠在研究开始前经历了7天的最小习惯期。初始大鼠适应了栖息笼里的操作室，食物和水随时可获得。经若干天进行对负重室的习惯。在最后一天进行基线负重读数。
[0259] 在第0天，在最终基线读数之后，使用3:1混合的异氟醚和氧气在无菌条件下麻醉动物。将左膝区域剃毛并用稀释的hibiscrub溶液清洁。
[0260] 通过将MIA(西格玛公司(Sigma)，I2512)溶液(25μl的80mg/ml，(2mg))注射到左后腿的膝关节中诱导骨关节炎(OA)。假组动物注射生理盐水。允许动物在温暖的环境中恢复，然后返回其栖息笼中。
[0261] 动物在MIA后发生炎症应答并且可警戒和舔受影响的区域。因此，仔细监测大鼠的意外痛苦迹象或剧烈疼痛，以便可以立即挑选任何示出这些迹象的动物。
[0262] 第一周每天给动物称重，并且在之后每隔几天称重一次。在注射MIA后第3、7、10和14天评估负重，以了解慢性疼痛的发展。在第18天，进行负重测量并且根据其拉丁方设计中的MIA窗口对动物进行分级并随机分配至治疗组。
[0263] 抗体给药方案：在第18天，将动物用Par0067(PAR2+ve)10mg/kg或同种型对照(PAR2-ve)10mg/kg i.v.治疗并且在抗体给药后4小时和1、2、6、8、10和14天进行进一步的负重测量。
[0264] 普瑞巴林和塞来昔布给药方案：在MIA注射后第24、25、26、27和28天，每天向动物给药PGB(30mg/kg p.o；2ml/kg)或塞来昔布(50mg/kg p.o；2ml/kg)。在第24、26和28天给药后1小时进行负重评估，并在第32天停止药物治疗后进行进一步读数。
[0265] 在给药后第1、2、6、10和14天，在负重评估后，通过尾静脉获取400μl血液用于来自抗体和同种型对照治疗组(n＝5只/组)的pk分析。
[0266] 研究评估：对右后爪和左后爪进行负重(g)读数并计算差值。数据表示为同侧/对侧的％比率((WB左/WB右)*100)(平均值±s.e.m.)。
[0267] 计算：同侧读数/对侧读数x 100.初始WB差值-剂量前WB差值被定义为MIA窗口。
[0268] 统计分析：重复量度ANOVA，随后使用InVivoStat(invivostat公司(invivostat.co.uk))进行计划比较测试，(p<0.05认为是显著的)。在每个时间点上通过将治疗组与媒介物对照组进行比较来分析数据。
[0269] 从第3天开始，向膝关节注射2mg MIA引起明显的炎症和超敏应答，如通过受伤和未受伤的后爪之间的负重变化所检测到的。直到第18天(并且媒介物治疗的对照动物时间更长)，这一MIA诱导的活动过度应答在所有组中仍然明显，此时给予第一测试药剂。注射生理盐水对负重没有作用。
[0270] 如图7A所示，在从第24-28天每天给予普瑞巴林(30mg/kg)后观察到重大且显著的超敏反应逆转，并且在第32天先前治疗停止后弱残留作用仍然可见。相比之下，从第24-28天每天给予塞来昔布(50mg/kg)，示出最多只有微弱的超敏反应逆转。该药理学特征表明，在MIA应答的这一阶段期间观察到的活动过度本质上主要是神经性的，而不是炎性的。
[0271] 还如图7A所示，从Par0067给药后4小时至第28天(给药后10天)可见超敏反应的显著逆转。在同一时期内，同种型对照未见作用。图7B说明用不同浓度的Par0067治疗的作用。
[0272] 实例4：雌性C57BL/6小鼠中PAR2抗体PaB670129对部分神经结扎-诱导的机械性痛觉过敏的逆转的作用
[0273] 介绍
[0274] 如Seltzer(1990)所述，坐骨神经的部分结扎(PNL)是许多神经结扎模型之一，据报道其用作神经性疼痛的临床前模型。它产生严重的机械性痛觉过敏，这可以使用如Randall和Selitto(1957)所述的无痛量器(analgysemeter)来测量。这一实例描述了抗
PAR2抗体PaB670129的给予对这一神经损伤/神经性疼痛模型中的痛觉过敏的作用。
[0275] 程序
[0276] 在研究开始前至少5天，出于鉴别目的，六十只雌性C57BL/6小鼠经受转调器的插入。使用analgysemeter(兰德尔(Randall)和Selitto，1957)(乌戈巴西莱公司(Ugo Basile))测定机械性痛觉过敏。对每个后爪的背侧面轮流应用逐渐增加的力直至观察到缩回应答。在这个点上停止力的应用，并记录以克计的重量。对于同侧和对侧爪子，将数据表示为以克计的缩回阈值。在建立基线读数后，将小鼠分为具有大约相同的同侧/对侧比值的
2组，这2组经历手术以部分结扎坐骨神经或充当假手术对照。将手术的小鼠用异氟烷麻醉。
在此之后，通过在大腿中部水平切开由钝性分离暴露大约1cm左侧坐骨神经。然后，将手术缝合线(8/0维珍丝线(Virgin Silk)，爱惜康公司(Ethicon))穿过背部第三神经并绑紧。然后使用黏合剂闭合切口，并在测试开始之前允许小鼠恢复至少六天。假手术小鼠经历相同的方案，但是神经暴露后将小鼠缝合并允许其恢复。
[0277] 在手术后7天和10天，测试小鼠对痛觉过敏的发作。显示出大于80％的同侧/对侧比值的任何小鼠被归类为无应答者，并从研究中移除。继测试10天后，将小鼠进一步细分为多个组，产生最终治疗组；
[0278] A.第1组：假手术的+同种型对照10mg/kg s.c(N＝10)
[0279] B.第2组：神经结扎的+同种型对照10mg/kg s.c(N＝9)
[0280] C.第3组：神经结扎的+依那西普0.3mg/kg s.c.(N＝9)
[0281] D.第4组：神经结扎的+PaB6701293mg/kg s.c.(N＝9)
[0282] E.第5组：神经结扎的+PaB67012910mg/kg s.c.(N＝9)
[0283] F.第6组：神经结扎的+PaB67012950mg/kg s.c.(N＝9)
[0284] 在第13天，向小鼠给予在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的对照或测试分子，并在给药后4小时以及给药后第1、2、4和7天再次测试机械性痛觉过敏的变化。
[0285] 数据分析
[0286] 在每个测试时间对每只动物进行同侧和对侧读数。将通过同侧和对侧后肢的负重表示为比率，并且使用双向ANOVA分析组数据(PRISM)，并且在适当的情况下使用Tukey检验进行成对比较。
[0287] 结果
[0288] 坐骨神经的部分结扎引起机械性痛觉过敏，相比假手术对照，其示出在第7天和第10天同侧/对侧比值显著减少。用同种型对照治疗后，手术小鼠没有示出与给药前水平相比的机械性痛觉过敏水平的任何变化，这表明缺乏作用。给予内部金标准依那西普(0.3mg/kg s.c.)，从给药后4小时至第7天，引起痛觉过敏的显著逆转，这与先前研究中可见的结果一致。PaB670129以剂量相关的方式引起同侧/对侧比率的逆转，在10mg/kg和50mg/kg下均可见峰值效应。3mg/kg的最低剂量虽然在给药后第1、2和7天显著，但示出较小的作用(参见图
8)。
[0289] 坐骨神经的部分结扎诱导了持久的机械性痛觉过敏，这与先前报道的结果一致。不希望受理论束缚，这被认为充当了在神经性疼痛中观察到的疼痛的临床前相关性。
PaB670129的给予示出这种痛觉过敏的显著且剂量相关的逆转，这表明PAR2抗体用于治疗神经性疼痛的潜在用途。
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[0315]
[0316]
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[0339]
[0340]
[0341]
[0342]
[0343] SEQ ID NO:801-人PAR2前原蛋白(GenBank登录号NP_005233.3)
[0344]
[0345] SEQ ID NO:802-人PAR2系链配体
[0346] SLIGKVDGTSHVTGKGVTVETVFSVDEFSASVLTGKLTT
[0347] SEQ ID NO:803-示例性VH框架区1
[0348] EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
[0349] SEQ ID NO:804-示例性VH框架区2
[0350] WVRQAPGKGLEWVS
[0351] SEQ ID NO:805-示例性VH框架区3
[0352] RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
[0353] SEQ ID NO:806-示例性VH框架区4
[0354] WGQGTLVTVSS
[0355] SEQ ID NO:807-示例性VL框架区1
[0356] SIELTQPPSVSVSPGQTASITC
[0357] SEQ ID NO:808-示例性VL框架区2
[0358] WYQQKPGQSPVLVIY
[0359] SEQ ID NO:809-示例性VL框架区3
[0360] GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
[0361] SEQ ID NO:810-示例性VL框架区4
[0362] FGGGTKLTVL
[0363] SEQ ID NO:811-示例性VH CDR2
[0364] TISYSGSHISYHDSVHH
[0365] SEQ ID NO:812-示例性VH CDR2
[0366] TISYHGSLISYHDSVHH
[0367] SEQ ID NO:813-示例性VH CDR2
[0368] TISYHGSHISYADSVHH
[0369] SEQ ID NO:814-示例性VH CDR2
[0370] TISYHGSHISYHDSVKH
[0371] SEQ ID NO:815-示例性VH CDR2
[0372] TISYHGSHISYHDSVHG
[0373] SEQ ID NO:816-示例性VH CDR2
[0374] TISYHGSLISYADSVKG
[0375] SEQ ID NO:817-示例性VH CDR2
[0376] TISYSGSHISYADSVKG
[0377] SEQ ID NO:818-示例性VH CDR2
[0378] TISYHGSHISYADSVKG
[0379] SEQ ID NO:819-示例性VH CDR3
[0380] IHNDPMDV
[0381] SEQ ID NO:820-示例性VH CDR3
[0382] INHDPMDV
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[0384]
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[0386]
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[0400]
[0401] SEQ ID NO:830--示例性VH
[0402]
[0403] SEQ ID NO:831--示例性VH
[0404]
[0405] 通过引用结合
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