发明概述

本发明涉及去铁胺-1-癸-磺酸盐的新多晶型结晶体及其制备 方法和药物组合物，本发明还涉及该结晶体用于治疗目的的用途 及其药物组合物的制备方法；本发明也涉及其它的晶形。总的来 讲，本发明还涉及新的含有去铁胺-B盐作为活性组分的药物组合 物。 发明背景

在US3247197中描述了去铁胺-B及其药物上可接受的加成盐 的制备方法。诸如在上述美国专利中描述的该胺及其盐具有与三 价金属离子，尤其是铁离子形成稳定配合物的突出能力。因此， 在诸如β-地中海贫血症的铁过量疾病的治疗中，作为药物铁螯合 剂，去铁胺-B(甲磺酸盐形式，商品名Desferal)是极其重要的。 它是目前市场上可购得的极少数用于治疗地中海贫血症的药物之 一。

作为控制β-地中海贫血症中的输血铁过量所必需的方法，目 前广泛采用的是经缓慢皮下输注(8-12小时)进行去铁胺-B(甲 磺酸盐的形式)给药。然而，这种治疗方法对病人而言显得麻烦、 不舒服和不方便，并且费用高。病人适应性差，即对铁螯合疗法 的不适应性已被认为是导致地中海贫血症病人死亡的最重要原 因。因此急需一种更为简单和方便且费用更低的铁螯合疗法用于 治疗铁过量。

长期以来，这种需求是显而易见的，并且，为了获得一种形 式的去铁胺-B(当采用更为方便的方法实施给药时，该形式的去 铁胺-B在铁过量治疗中是有效的)，多年来已进行了大量的尝试。 在W093/24451中描述了用于口服给药的去铁胺-B有机磺酸盐。

在有机化学物质的化学和药物研制中，有机化学物质的形态 和多晶型现象是极其重要的。仅有单一晶形的物质是已知的，同 样，也存在具有两个、三个甚至是更多个多晶型物的物质。基于 应用数学，不能计算或预测可能的形态和结构变体以及各自的物 化关系曲线，尤其是热力学稳定性曲线。就晶形数目及其稳定性 而言，相关的有机化学物质的多晶型现象是如此惊人。

如果物质的两种、三种或更多种晶形是已知的，那么一般来 讲，它们的绝对和相对物化稳定性是可以测定的。在整个化学和 药物制备过程中，不稳定晶形会带来很多不利，这是因为在制备 过程的各个步骤中或在各中间储存过程中，不稳定晶形可能会部 分或全部转化为稳定晶形。由于亚稳性，不稳定晶形可以长期保 持并最终可能在某个不确定的时候发生自然转变。这种向更稳定 晶形转化的可能性与各制备批次有关，并且不能逐一预见。因而， 可能又对化学研究和药物临床研究造成困难。例如，通过诸如溶 解度的变化，这些晶形转变可使药物的生物利用率产生剧变。

在例如US3247197中描述了去铁胺-B和其药物上可接受的盐 的制备方法。诸如在上述美国专利中描述的该胺及其盐具有与三 价金属离子，尤其是铁离子Fe3+形成稳定配合物的突出能力。因 此，在例如与铁过量有关的疾病，如β-地中海贫血症的治疗中， 作为药物上可采用的铁螯合剂，去铁胺-B(甲磺酸盐形式，商品 名Desferal)是极为重要的。它是目前市场上可购得的极少数用 于治疗地中海贫血症的药物之一。

作为控制由输血引起的β-地中海贫血症患者铁过量的方法， 目前广泛采用的是经缓慢皮下输注(8-12小时)进行去铁胺-B (甲磺酸盐的形式)给药。然而，这种治疗方法对病人而言显得 麻烦、不舒服和不方便，并且费用高。因此急需一种更为简单和 方便且费用更低的铁螯合疗法。

根据本发明，现已发现，某些去铁胺-B脂族磺酸盐可以持续 释放制剂进行混合，并且这种制剂可采用方便的注射法按适当的 时间间隔以较小的剂量进行肠胃外给药，去铁胺-B盐在注射间隔 时间内逐渐释放。因此，本发明提供了含有悬浮于肠胃外给药用 油中的具有至少8个碳原子的脂族磺酸去铁胺-B盐颗粒的肠胃外 注射组合物。

作为对长期使用的Desferal的改进，EP 643690中特别公开 了以去铁胺-B的1-癸磺酸盐作为铁螯合剂。然而，其中未记载 去铁胺-1-癸磺酸盐是否存在其它的晶体变型。令人吃惊的是， 现已发现了该物质的一些新晶形。因此，本发明还涉及去铁胺-1 -癸磺酸盐的新稳定结晶体及其制备方法。 附图说明

附图1/3是去铁胺癸磺酸盐的结晶体A2的X-射线图。横坐 标(X-轴)：衍射角2θ(范围3°-30°)；纵坐标(Y-轴)：相 对强度。

附图2/3是去铁胺癸磺酸盐的结晶体A1的X-射线图。横坐 标(X-轴)：衍射角2θ(范围3°-30°)；纵坐标(Y-轴)：相 对强度。

附图3/3是去铁胺癸磺酸盐的结晶体B(与结晶体A11-A13的 混合物)的X-射线图。横坐标(X-轴)：衍射角2θ(范围3° -30°)；纵坐标(Y-轴)：相对强度。 发明详述

本发明的第一优选方案涉及含有悬浮于肠胃外给药油中的具 有至少8个碳原子的脂族磺酸的去铁胺-B盐颗粒的肠胃外注射组 合物。

一般，去铁胺-B盐可以是具有8-20个碳原子的脂族磺酸的 盐。所述酸包括烃基磺酸，例如，链烷磺酸、链烯磺酸和炔基磺 酸，如辛烷-1-磺酸、辛烷-2-磺酸、壬烷-1-磺酸、壬烷-2-磺酸、 正癸磺酸、正十二磺酸、十四磺酸、十六磺酸、十八磺酸、辛烯 -1-磺酸、癸烯-1-磺酸、十二碳烯-1-磺酸、十四碳烯-1-磺酸、 十六碳烯-1-磺酸或癸基乙炔基磺酸，以及烃基被诸如羟基、C1- C4烷氧基、酰氧基、C1-C4烷氧羰基、卤素或氨基取代的上述酸。 可以按WO93/24451中的描述制备该盐。

去铁胺-B盐优选为具有8-20个碳原子，优选8-10个碳原 子的脂族磺酸的盐，尤其是正辛磺酸或正癸磺酸的盐。本发明使 用的去铁胺-B正癸磺酸盐的优选的特别稳定晶形为晶体变型A2， 下文将对该晶形进行更详细描述。

本发明使用的去铁胺-B正癸磺酸盐的其它优选晶形为晶体变 型A1，用DSC(差示扫描量热法)测得该晶形熔点为140-153℃ 并且在其X-射线衍射图样中具有下述特征衍射线(2θ衍射角 ±0.1°)：4.1°、6.3°、8.4°、10.5°、12.6°、16.9°、18.0°、19.8°、 20.8°、22.1°、25.0°、25.6°和26.4°(参见下文的详细说明)。 结晶体A1不及结晶体A2稳定，尤其是在水和极性溶剂或其混合物 存在的条件下更是如此。然而，在本发明组合物的肠胃外给药油 中，结晶体A1是动力学稳定的。

在低于室温，优选在0-5℃的温度下，通过将正癸磺酸碱金 属盐的水溶液逐渐加入到去铁胺-B甲磺酸盐的水溶液中，可以制 得结晶体A2。然后，将该混合物加热至升高的温度，优选温度范 围为室温-该混合物的沸点，更优选30-80℃。

适用于本发明组合物的另一种去铁胺-B正癸磺酸盐晶形是结 晶体A1与结晶体B的混合物。结晶体B熔点为大约142℃(用DSC 法测定)并且在其X-射线衍射图样中具有下述特征衍射线(2θ 衍射角±0.1°)：3.5°、7.1°、8.9°、9.9°、11.3°、12.3°、19.0°、 21.7°、22.1°和23.8°。结晶体B不及结晶体A1稳定，当升温速 率为10℃/min时，它转化为结晶体A1。如WO93/24451中实施例 1所述，将癸烷-1-磺酸与去铁胺-B游离碱反应生成粗盐，将粗盐 溶解在含水乙醇中进行重结晶，过滤所得溶液，并在减压条件下 除去部分乙醇直至产物析出，由此可制得结晶体A1和结晶体B的 混合物。

悬浮于油中的去铁胺-B盐颗粒平均粒径一般为1-1000微 米，优选3-500微米，尤其是5-100微米，更优选5-10微米。

肠胃外给药用油可以是任何药物上可接受的油或药物上可接 受油的混合物，其粘度应适合于注射给药。所述油包括矿物油、 植物油和动物油以及由这些油得到的脂肪酸酯，优选植物油或由 植物油得到的脂肪酸酯，例如，精制石蜡油、蓖麻油、芝麻油、 棉籽油、葵花油、椰子油、棕榈仁油、花生油、麦胚油、油酸乙 酯、肉豆蔻酸异丙酯、椰子脂肪酸酯和棕榈仁脂肪酸酯，即，辛 酸和癸酸与甘油或丙二醇的酯，以及上述两种或多种油的混合 物。肠胃外给药油优选包括油酸乙酯、油酸乙酯与芝麻油的混合 物或辛酸与癸酸混合物的甘油三酯。在特别优选的实施方案中， 肠胃外给药油含有25-100重量％油酸乙酯和0-75重量％芝麻 油，或者肠胃外给药油含有辛酸与癸酸混合物的甘油三酯，辛酸 与癸酸的重量比为10∶9-13∶6。所述甘油三酯可从市场上购 得，例如，从德国Hls AG购得的Miglyol 812。

在本发明组合物中，去铁胺-B盐一般以治疗有效量存在，对 于每毫升肠胃外给药用油，去铁胺-B盐的量通常为0.05-0.4g， 优选0.1-0.3g。组合物适于以肠胃外注射剂量存在于诸如玻璃或 塑料注射器或小瓶或聚乙烯容器的适当容器中，所述肠胃外注射 剂量一般为0.5-10ml，优选3-7ml。优选将组合物装在预装 (prefilled)注射器或封口(bottlepack)聚乙烯容器中并从该 注射器或容器中给药。

在某些情况下，本发明组合物最好还含有表面活性剂(乳化 剂)。组合物中含有乳化剂(含量优选为组合物的0.1-3体积％) 可防止固体去铁胺-B盐颗粒的聚集倾向并有利于盐颗粒在油中更 均匀分散。合适的表面活性剂包括药物上可接受的非离子表面活 性剂，优选亲脂性表面活性剂，例如，脱水山梨糖醇脂肪酸酯， 特别是脱水山梨糖醇一月桂酸酯、脱水山梨糖醇一油酸酯和脱水 山梨糖醇三油酸酯，聚山梨醇酯，如聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐 一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯 (20)山梨糖醇酐一油酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸 酯，聚氧化亚乙基二醇的C10-C20烷基醚，如聚氧乙烯(4)十二 烷基醚，和磷脂表面活性剂，如大豆卵磷脂。

本发明组合物中还可以含有其它的诸如在常规肠胃外注射给 药组合物中使用的赋形剂，例如，渗透压调节剂，如葡萄糖和氯 化钠，防腐剂，如苯甲醇、苯甲酸苄酯和对羟基苯甲酸的甲酯和 丙酯，以及抗氧剂，如丁化甲酚和生育酚。

本发明还提供了如上所述的本发明组合物的制备方法，该方 法包括将去铁胺-B盐颗粒与肠胃外给药用油和表面活性剂(如果 存在的话)混合。在适宜的实施方案中，分两阶段进行混合，其 中(a)将盐与部分油进行研磨，和(b)将剩余的油加入到磨过 的混合物中，如果使用表面活性剂，则在阶段(a)和/或阶段(b) 中添加表面活性剂。如果给药用油含有粘度不同的油的混合物， 例如，含有芝麻油和油酸乙酯的混合物，那么可以在加入较低粘 性油之前，将盐与较高粘性油方便地混合。在优选的实施方案中， 将去铁胺-B盐加入到油或油与表面活性剂的混合物中，采用药学 上可接受的研磨法优选在胶体磨等中均化所得混合物，直至获得 所需盐粒径。或者，可以使用空气喷射磨将去铁胺盐微粉化，使 用utraturrax混合器将该盐悬浮于油相中，随后填充到所需容器 中并用γ或β射线(10-100kGy千戈瑞放射剂量)或热处理对容器 和药物消毒。

在无菌条件下提纯去铁胺-B盐，使用常规方法，例如，使用 孔径为0.22μm的过滤器过滤或在170℃加热至少2小时将油消 毒，并在无菌条件下将无菌油与纯化的去铁胺-B盐混合，由此可 确保制得本发明无菌组合物。

通过例如肌肉或皮下注射可以进行本发明组合物的肠胃外给 药。在进行本发明组合物肠胃外给药后，去铁胺-B可以经48小时 缓慢释放。向患者给药的去铁胺-B盐剂量可高达每天大约4g，例 如，每天500mg-4g。通过每天或每两天进行一次快速浓注可以方 便地完成该剂量的输注。本发明包括治疗铁过量疾病、铝过量、 阿尔茨海默氏病、疟疾、再输注损伤(reperfusion injury)或 癌症的方法，该方法包括对需要进行上述治疗的温血哺乳动物， 尤其是人类肠胃外注射上文定义的本发明组合物。

本发明还涉及去铁胺-1-癸磺酸盐(该盐优选用于上文提及的 组合物及其制备中)的新稳定晶形及该晶形的制备方法。

本发明涉及式1所示的去铁胺-1-癸磺酸盐晶形(N-[5-{3- [(5-氨基戊基)-羟氨基甲酰基]-丙酰氨基}-戊基]-3-[{5-(N-羟 基乙酰氨基戊基}-氨基甲酰基]-丙酰基异羟肟酸-1-癸磺酸盐)， 在氮气下，以10℃/min的加热速率进行差示扫描量热法，测得该 结晶体的熔点范围为154-158℃，并且在其X-射线图中具有下 述特征衍射线(2θ衍射角±0.1°)：3.1°、7.3°、9.4°、13.7°和 23.7°。

本发明尤其涉及去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体，在氮气下，以 10℃/min的加热速率进行差示扫描量热法，测得该结晶体的熔点 范围为154-158℃，并且在其X-射线图中具有下述特征衍射线 (2θ衍射角±0.1°)：3.1°、4.2°、7.3°、8.4°、9.4°、10.5°、 13.7°、16.8°、17.4°、18.0°、18.4°、19.6°、20.1°、20.9°、 22.3°、23.7°、25.1°和25.6°。

该新特定晶形(本发明称作“结晶体A2”)的特性优于去铁 胺-1-癸磺酸盐的所有其它已知晶形的特性。在通常的温度范围 内，结晶体A2的物化和热力学稳定性优于其它的已知晶形，因而 更适合于固态化学物质的生产和药物制剂的开发、生产及治疗应 用。更准确地讲，与结晶体A2相比，所有已知的晶形是亚稳态的。 因此，不论在生产、储存中和在治疗应用过程中(例如在贮存注 射之后)使用的分散剂是什么，只有结晶体A2不会发生固态转变。 而且，结晶体A2比结晶体A1易于研磨。

在熔点范围内，结晶体A2具有良好的热稳定性。在10℃/min 的加热速率下，结晶体A2在148-162℃的温度范围内(包括熔点 温度范围154-158℃在内)熔化。

特别优选由附图1/3X射线图表征的结晶体A2。

除了结晶体A2外，本发明还提供了其它不太稳定的结晶体。 结晶体A1的熔点范围为140-153℃。它相当于EP643690中记载 的晶形。更精确的差示扫描量热法(DSC)表明，结晶体A1是由4 个熔点为148℃、150℃、152℃和153℃的亚晶形A11、A12、A13和 A14组成。这些亚晶形是在物质的制备过程中以不同的数量比获得 并一起生成结晶体A1。

结晶体B可同样出现在去铁胺-1-癸磺酸盐的制备过程中。 DSC表明其熔点为大约142℃，并且在10℃/min的加热速率下， 可以观察到结晶体B转化为A1的一种或几种亚晶形，即A11-A14。

具体地说，由DSC获得了有关不同晶形的下列数据：

去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A2的DSC图，样品重：2.177mg， 在氮气下，以10℃/min的加热速率，测得熔点为T42熔点＝155℃。

去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A11、A12和A13的DSC图，样品重： 2.747mg，在氮气下，以10℃/min的加热速率，测得下列熔点： TA11熔点＝148℃；TA12熔点＝150℃和TA13熔点＝152℃。

去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A1的DSC图，样品重：2.683mg， 在氮气下，以10℃/min的加热速率，测得下列熔点：TA12熔点＝149 ℃；TA13熔点＝151℃和TA14熔点＝153℃。

去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体B(与结晶体A11-A13的混合物) 的DSC图，样品重：2.285mg，在氮气下，以10℃/min的加热速 率，测得下列熔点：TB熔点＝142℃。

除了熔点外，还可以根据X射线粉末图区分晶形。在透射几 何形状(transmission geometry)的纪尼叶相机中用Cu-Kα1射 线拍得的X射线粉末图优选用于表征有机物固体。特别是X-射线 衍射图样已被成功地用于测定物质的不同晶形。为了表征本发明 的去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A2，在室温下进行检测并在3°- 30°的衍射角(2θ)范围内记录X射线照片。对于Cu-Kα1射线，列 出了本发明所有的衍射角2θ。 表1： 去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A2的X射线衍射图样(最重要衍射线 的衍射角和强度)(图5)     2θ     强度     3.1°     强     4.2°     强     7.3°     弱     8.4°     弱     9.4°     弱     10.5°     强     13.7°     弱     16.8°     弱     17.4°     很弱     18.0°     强     18.4°     很弱     19.6°     很强     20.1°     中等     20.9°     中等     22.3°     弱     23.7°     弱     25.1°     强     25.6°     弱

表2和3重述了上述结晶体A1和结晶体B的X射线衍射图样。 表2 去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A1的X射线衍射图样(最重要衍射线 的衍射角和强度)(图6)     2θ     强度     4.1°     很强     6.3°     弱     8.4°     弱     10.5°     强     12.6°     弱     16.9°     弱     18.0°     中等     19.8°     强     20.8°     中等     22.1 °     很弱     25.0°     中等     25.6°     很弱     26.4°     很弱 表3 去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体B的X射线衍射图样(最重要衍射线 的衍射角和强度)(图6)     2θ     强度     3.5°     弱     7.1°     弱     8.9°     很弱     9.9°     很弱     11.3°     很弱     12.3°     弱     19.0°     强     21.7°     中等     22.1°     强     23.8°     中等

X射线衍射图样证明了用A1、A2和B表示的去铁胺-1-癸磺酸 盐的结晶体是完全不同的多晶型晶体。X射线衍射图样与可测得结 晶体A1的4个不同熔点的DSC法(参见上文)相比，其区别在于X 射线衍射图样太小，不能反映出对应于表2的反射角2θ值的明显 偏差。

用于区分结晶体的另一个合适的参数通常是它们的收湿性， 由此可判断结晶体的稳定性。例如，在已知相对湿度的气氛，优 选氮气氛中，通过称重水蒸气吸收率可测得试验物质的吸水性。 表4： 在25℃，结晶体A1和A2的吸水百分数 相对湿度     (％)     A1 吸水性(％)     A2 吸水性(％)     0     0     0     10     0.1    ＜0.1     20     0.2    ＜0.1     30     0.2     0.1     40     0.3     0.1     50     0.3     0.1     60     0.4     0.1     70     0.5     0.2     80     0.6     0.2     90     0.9     0.3     95     2.1     0.5     98     4.7     0.8

与结晶体A1相比，结晶体A2具有明显较低的吸水性，这表明 本发明的结晶体A2的稳定性更高。

本发明还涉及生产本发明去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A2的 方法。

该方法的特征在于，在至少一个工序中，将未知或未详细说 明晶型组成的去铁胺-1-癸磺酸盐在极性溶剂中的悬浮液保持在 升高的温度下；或者在至少一个工序中，在升高的温度下制得去 铁胺-1-癸磺酸盐在极性溶剂中的浓溶液，然后在2℃/min或更低 的冷却速率下进行结晶。

极性溶剂是例如极性有机化合物，例如，低级醇、低级酮、 低级腈和低级环醚，和水或其混合物。术语“低级”是指含有1 -4个碳原子和一个或两个诸如氧、氮和/或硫的杂原子的有机化 合物。优选的极性有机溶剂是水溶性有机溶剂，例如，甲醇、乙 醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、乙基甲基酮、乙腈、四氢呋喃或对 二氧杂环己烷。水或水溶性有机溶剂，特别是甲醇、乙醇、正丙 醇和/或异丙醇与水的混合物尤其有利于制备本发明的结晶体 A2。最优选水。

所述“升高的温度”是指“室温-溶剂或溶剂混合物沸点” 的温度范围，优选30-80℃，或者是指“室温-极性溶剂沸点” 的温度范围，该温度范围一般也较低，优选35-60℃。

所述“浓溶液”是指含有一定量溶解物质的溶液，当冷却该 溶液至较低温度时，溶解的物质将会部分结晶。优选的浓溶液是 饱和或稍稍过饱和的溶液。如果不升高温度，则物质的饱和或过 饱和溶液将不会再溶解任何物质。比如，通过将饱和溶液快速冷 却至稍稍较低的温度下即可制得过饱和溶液。使用饱和溶液是特 别有利的。

优选的溶液冷却速率为2℃/min或更低。1℃/min或更低的 冷却速率是尤其有利的。

在该方法的优选实施方案中，加入至少一粒晶种。

例如，通过将悬浮液保持在所述升高的温度下，由不太稳定 的晶形或几种不太稳定晶形的混合物可制得适当的晶种。

在该方法特别优选的实施方案中，制备极性溶剂中的去铁胺 甲磺酸盐溶液，加热至所需温度，然后将在同样的或别的极性溶 剂中的等摩尔1-癸磺酸盐溶液的一部分加入到其中，加入至少一 粒晶种，保持此状态直至发生结晶作用，然后将在同样的或别的 极性溶剂中的等摩尔1-癸磺酸盐溶液的剩余部分缓慢加入其中， 之后维持所需温度；或者在升高的温度下制得极性溶剂中的去铁 胺-1-癸磺酸盐的热饱和溶液，在加入至少一粒晶种后，以1℃/min 或更低的冷却速率冷却至较低的升高温度，在此期间发生结晶作 用，将晶体悬浮液保持在该较低温度下。

所述“1-癸磺酸盐”可以是例如在选用的极性溶剂中比去铁 胺-1-癸磺酸盐具有更好溶解性的所有1-癸磺酸的盐。这些盐可以 是与碱的盐，例如，相应的碱金属盐，如钠盐或钾盐或氨或有机 胺的盐，所述氨或有机胺是例如，环胺，如一、二或三烷基胺， 如羟基-低级烷基胺，如一、二或三羟基-低级烷基胺，羟基-低级 烷基-低级烷基胺或多羟基-低级烷基胺。环胺是例如吗啉、硫代 吗啉、哌啶或吡咯烷。一低级烷基胺可以是例如乙基和叔丁基胺， 二低级烷基胺可以是例如二乙基和二异丙基胺，三低级烷基胺可 以是例如三甲基和三乙基胺。相应的羟基-低级烷基胺是例如一、 二和三乙醇胺，羟基-低级烷基-低级烷基胺是例如N，N-二甲基氨 基和N，N-二乙基氨基乙醇，多羟基-低级烷基胺可以是例如葡糖 胺。优选药物上可接受的盐，尤其是钠盐。

用基本已知的方式从母液中分离收集晶体，例如，在或不在 加压和/或抽真空条件下进行过滤，或进行离心，并随后进行干 燥。

本发明还涉及含有作为活性组分的去铁胺-1-癸磺酸盐的结 晶体A2和药物上可接受的载体的药物制剂，优选如上文和下文所 述。本发明还涉及该药物制剂的制备方法，优选如上文所述。本 发明还涉及去铁胺-1-癸磺酸盐的结晶体A2在治疗选自铁过量疾 病、铝过量、阿尔茨海默氏病、疟疾、再输注损伤(reperfusion injury)和癌症的疾病，尤其是治疗地中海贫血症中的用途或在 制备治疗上述疾病的药物制剂中的用途。本发明进一步涉及治疗 选自铁过量疾病、铝过量、阿尔茨海默氏病、疟疾、reperfusion injury和癌症的疾病的方法，尤其涉及治疗地中海贫血症的方 法，该方法包括对需要上述治疗的患者使用一定剂量的去铁胺-1- 癸磺酸盐结晶体A2，使用的剂量在所述疾病的治疗中为药物有效 量。

在所有情况下，活性组分的剂量和百分比与常规剂量和百分比 相一致，尤其为上文和下文所述的剂量和百分比。 实施例：

本发明用下述实施例描述，其中除非另有说明，份用重量表 示。但本发明不受实施例的限制。 实施例中所用的去铁胺-B正癸磺酸盐，样品I制备如下：在0-5 ℃，经60分钟，将10％的1-癸磺酸钠盐水溶液加入到20％的去 铁胺-B甲磺酸盐水溶液中，癸磺酸盐与甲磺酸盐的摩尔比为1∶1。 沉淀出去铁胺-B正癸磺酸盐。在过滤收集产物前，于0-5℃，将 该悬浮液再搅拌1-2小时。用水洗涤产物，并在40℃真空干燥20 小时，最后过筛防止产物结块。 实施例中所用的去铁胺-B正癸磺酸盐，样品II制备如下：在30-40 ℃，将去铁胺-B甲磺酸盐(12.3份)溶解于水(47份)中，在50℃， 经几分钟，向其中加入正癸磺酸钠(0.7份)的水(12.0份)溶液。 加入去铁胺-B正癸磺酸盐(0.08份)使溶液结晶，在50℃搅拌所 得悬浮液30分钟，然后，在50-52℃，在搅拌条件下，经3-4小 时，再次缓慢加入正癸磺酸钠(3.8份)的水(64份)溶液。在50- 52℃，将所得悬浮液再搅拌1-2小时并冷却过夜至40℃。过滤收 集产物，用水洗涤，在50℃真空干燥20小时，最后过筛防止产物 结块。 实施例中所用的去铁胺-B正癸磺酸盐，样品III制备如下：在40 ℃，将由正癸磺酸与WO93/24451的实施例1中描述的去铁胺-B 游离碱(548g)反应制得的粗去铁胺-B正癸磺酸盐溶解在乙醇 (3000ml)和水(600 ml)的混合物中。过滤溶液并在40℃减压(40 mbar)蒸馏浓缩滤液。用水(3000)稀释得到的浓悬浮液，过滤收集 产物，用水洗涤，在50℃/20mbar真空干燥20小时，最后过筛 防止产物结块。

在实施例1-16中，得到所述的去铁胺-B盐肠胃外注射组合 物。并给出了所得的各种悬浮去铁胺-B盐的平均粒径和颗粒大小 分布的结果。 实施例1：组合物A

将去铁胺-B正癸磺酸盐样品I(1g)与芝麻油(3.75ml)和聚氧 乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯(0.02ml)混合直至得到无块悬浮 液。向所得悬浮液中加入油酸乙酯(1.25ml)并随即用研棒和研钵 将其充分混合。结果：平均粒径为59.18μm；颗粒大小分布为： 90％小于113.19μm，50％小于50.08μm和10％小于5.41μm。 实施例2：组合物B

用2.5ml芝麻油和2.5ml油酸乙酯代替其在实施例1中的 用量，重复实施例1。结果：平均粒径为66.34μm；颗粒大小分 布为：90％小于121.78μm，50％小于62.34μm和10％小于6.49 μm。 实施例3：组合物C

用1.25ml芝麻油和3.75ml油酸乙酯代替其在实施例1中 的用量，重复实施例1。结果：平均粒径为68.97μm；颗粒大小 分布为：90％小于119.31μm，50％小于66.97μm和10％小于 7.97μm。 实施例4：组合物D

用0.043ml聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯代替其在实施 例2中的用量，重复实施例2。结果：平均粒径为57.02μm；颗 粒大小分布为：90％小于107.45μm，50％小于54.65μm和10 ％小于4.99μm。 实施例5：组合物E

不用聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯，重复实施例2。结 果：平均粒径为60.04μm；颗粒大小分布为：90％小于112.84 μm，50％小于56.42μm和10％小于5.25μm。 实施例6：组合物F

用2.5ml芝麻油、2.5ml油酸乙酯和0.043ml聚氧乙烯 (20)山梨糖醇酐一油酸酯代替其在实施例1中的用量，并且在制 备的第一阶段中将上述组份与脱水山梨糖醇三油酸酯(0.057ml) 混合，重复实施例1。结果：平均粒径为60.36μm；颗粒大小分 布为：90％小于109.36μm，50％小于58.14μm和10％小于5.12 μm。 实施例7：组合物G

用大豆卵磷脂(0.011g)代替实施例2中使用的聚氧乙烯(20) 山梨糖醇酐一油酸酯，重复实施例2。结果：平均粒径为43.13μ m；颗粒大小分布为：90％小于93.62μm，50％小于34.26μm和 10％小于4.98μm。 实施例8：组合物H

用0.027g大豆卵磷脂代替其在实施例7中的用量，重复实施 例7。结果：平均粒径为52.07μm；颗粒大小分布为：90％小于 117.62μm，50％小于39.98μm和10％小于5.99μm。 实施例9：组合物I

将去铁胺-B正癸磺酸盐样品II(1g)与芝麻油(2.5ml)和聚氧 乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯(0.02ml)混合直至得到无块悬浮 液。向所得悬浮液中加入油酸乙酯(2.5ml)并随即将其充分混合。 结果：平均粒径为41.48μm；颗粒大小分布为：90％小于99.19 μm，50％小于26.31μm和10％小于5.24μm。 实施例10：组合物J

用0.004ml聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯代替其在实施 例9中的用量，重复实施例9。结果：平均粒径为43.60μm；颗 粒大小分布为：90％小于104.11μm，50％小于26.63μm和10 ％小于5.22μm。 实施例11：组合物K

用0.043ml聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯代替其在实施 例9中的用量，重复实施例9。结果：平均粒径为30.60μm；颗 粒大小分布为：90％小于73.40μm，50％小于17.18μm和10％ 小于5.22μm。 实施例12：组合物L

不用实施例9中使用的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯， 重复实施例9。结果：平均粒径为43.75μm；颗粒大小分布为： 90％小于104.80μm，50％小于25.32μm和10％小于5.3μm。 实施例13：组合物M

用3.75ml芝麻油和1.25ml油酸乙酯代替其在实施例9 中的用量并且不用实施例9中使用的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一 油酸酯，重复实施例9。结果：平均粒径为50.52μm；颗粒大小 分布为：90％小于118.97μm，50％小于31.87μm和10％小于 6.91μm。 实施例14：组合物N

用1.25ml芝麻油和3.75ml油酸乙酯代替其在实施例9中 的用量并且不用实施例9中使用的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油 酸酯，重复实施例9。结果：平均粒径为35.83μm；颗粒大小分 布为：90％小于86.60μm，50％小于19.85μm和10％小于5.92 μm。 实施例15：组合物0

不用实施例9中使用的聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯，重 复实施例9。结果：平均粒径为39.50μm；颗粒大小分布为：90 ％小于96.33μm，50％小于22.08μm和10％小于6.23μm。 实施例16：组合物P

用5.00ml油酸乙酯代替其在实施例9中的用量并且不使用实 施例9中使用的芝麻油，重复实施例9。结果：平均粒径为35.44 μm；颗粒大小分布为：90％小于79.52μm，50％小于19.79μm 和10％小于5.85μm。 实施例17：在仓鼠中的血浆浓度I

在三辊磨中将去铁胺-B正癸磺酸盐样品I(1g)与缓慢加入的 芝麻油(2.5ml)、油酸乙酯(2.5ml)、聚氧乙烯(20)单月桂酸酯 (0.057ml)和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯(0.043ml)的混 合物研磨。如下所述，将所得的肠胃外注射悬浮液用于进行去铁 胺-B盐的体内释放试验：

按1ml/kg的剂量在100±20g的雄性金黄仓鼠的颈背处皮下 注射上述悬浮液。以不同的时间间隔定期麻醉动物，通过心脏穿 刺得到血样，将血液收集在肝素化注射器中并离心。除去血浆， 免疫测定血浆中去铁胺-B和代谢产物B的总浓度。对于不同的时 间间隔，以三只动物的平均值所表示的结果如下：

时间(小时)         血浆中去铁胺-B

               和代谢产物B的总浓度(μg/ml)

3                  24.57

6                  14.36

24                 0.53

30                 0.58

48                 2.31

54                 0.77

72                 0.48

168                0.45

采用固相酶免疫测定法进行免疫测定，所述固相酶免疫测定法 能检测到诸如血浆和尿的生物流体中铁螯合物DesferalTM及其主 要代谢产物B(MetB)的存在。为此，研制了多克隆兔抗体。该抗 体能辨别母体分子去铁胺(DFO)及其螯合物形式—铁胺(FO)。该方 法的主要原理如下：通过生物素/链霉抗生物素的连接将FO涂于 96孔板(Nunc Maxisorb)的孔中。用含有柠檬酸铁(1mM)作为 铁源的稀释(1/20缓冲液)生物流体(血清、尿等)绘制DFO或代谢 产物B的标准曲线。在同样的流体中，对试验样品进行相应稀释。 加入适当稀释的抗铁胺抗体并进行反应。洗涤除去未结合抗体。 使用与抗体结合的山羊抗兔lgG Fc片段辣根过氧化酶和过氧化酶 底物检测结合抗体。产生的色量与样品中的DFO/MetB的量成反 比。

抗体制备如下：

根据标准方法制备致免疫的牛血清白蛋白(BSA)/去铁胺缀合 物(用N-琥珀酰亚氨基(succinimidyl)3-(2-吡啶基二硫代)- 丙酸酯(proprionate)(SPDP)活化BSA，通过渗析除去过量的 DPDP，用二硫苏糖醇还原，得到结合了巯基的BSA，渗析，然后加 入SPDP、DFO和N-甲基吗啉，一小时后，在1000g离心5分钟， 并在4℃对磷酸盐缓冲液(PBS)渗析17小时，在-80℃保存所得 溶液。用类似的方法可得到匙孔血蓝蛋白(KLH)/DFO缀合物)。然 后将分别与弗氏不完全佐剂混合的BSA-DFO缀合物和KLH-DFO缀 合物(按1∶1混合)经皮下交替注射至荷兰兔(Harlan-Olac)体内 (450μg BSA-DFO 0月，300μg KLD-DFO 1月，250μg BSA-DFO 2月，150μg KLH-DFO 3月，150μg BSA-DFO 6月，150μg KLH-DFO 10月)。分离血液，在-20℃保存制得的血清。用常规方法在蛋白 质A-琼脂糖上分离抗体。

在N-甲基吗啉存在下，通过水/二甲基甲酰胺中的生物素- LC-NHS与FO反应，制备生物素-FO/DFO缀合物。

竞争分析法是基于样品中的药物与结合药物为结合抗体而相 互竞争，而抗体可用结合了抗种抗体的辣根过氧化酶来检测。通 过在适当的生物流体/缓冲液混合物中稀释的DFO的标准曲线和代 谢产物B(MetB)的标准曲线(摩尔当量浓度)测定药物的浓度。抗 体仅能识别铁结合型DFO或任何铁螯合型代谢产物，通过向样品 缓冲液中加入1mM柠檬酸铁它们可就地进行转化。在两种不同的 缓冲液中进行检测，两种不同的缓冲液为0.3M的PBS pH6.4或 0.3M硼酸盐pH7.4。加入1mM柠檬酸铁(1/2)也可使血浆或尿样 转化为铁结合形式。

在pH为9.6的0.1M碳酸盐涂浸缓冲液(carbonate coating buffer)中，将链霉抗生物素稀释至0.1μg/ml，并将其加入到 微滴定板的孔(100μl/孔)中，然后在22℃培养过夜。用PBS/吐 温(Tween)(吐温20，Sigma，Poole，Dorset)洗涤孔四次。在 37℃，用含有0.1％酪蛋白的200μl PBS培养1小时以饱和板上 残余的吸附部位。用PBS/Tween洗涤孔四次。用PBS/酪蛋白将生 物素-FO(427μg/ml)稀释至1ng/ml并在22℃下在孔(100μl/ 孔)中培养2小时。用PBS/Tween洗涤孔四次。将DFO和MetB的 标样(2.80500-0.00273/0.00000μM)加入到12套一式二份的孔 (50μl/孔)中。用pH 6.4或7.4的缓冲液按1∶800的比例稀释兔 抗铁胺抗体，并将其加入到同一套孔(50μl/孔)中，在小型摇动 器中混合30秒并在22℃培养2小时。用任意一种缓冲液稀释样品 并如FO标准样用同样的方法进行处理。用PBS/Tween洗涤孔四 次。按1∶2500的比例稀释结合了抗兔IgG Fc抗血清的辣根过氧 化酶(Biogenesis，Poole，Dorset)并于4℃在孔(100μl/孔) 中培养过夜。用PBS/Tween洗涤孔四次。在暗处用100μl/孔的 二盐酸邻苯二胺将板培养20分钟，可得到洗涤后仍具有残余结合 力的结合了抗血清的酶。加入1M盐酸(100μl/孔)终止反应。 用Dynatech MR600光度计在490μm处测定色度。 实施例18：在仓鼠中的血浆浓II

用玛瑙研棒和玛瑙研钵代替实施例17中的三辊磨，研磨盐和 悬浮液的其它组份，重复实施例17。如实施例17，用所得的肠胃 外注射悬浮液进行试验。结果如下：

时间(小时)               血浆中去铁胺-B

                   和代谢产物B的总浓度(μg/ml)

  3                        18.19

  6                        10.72

  24                     0.91

  30                     0.63

  48                     0.53

  54                     1.06

  72                     0.51

  168                    1.69 实施例19：在仓鼠中的血浆浓度III

用去铁胺-B正癸磺酸盐的样品III(1g)代替实施例17中使用 的去铁胺-B盐I，重复实施例17。如实施例17，用所得肠胃外注 射悬浮液进行试验。结果如下：

时间(小时)               血浆中去铁胺-B

                    和代谢产物B的总浓度(μg/ml)

  3                         20.05

  6                         18.03

  24                         1.06

  30                         1.09

  48                         1.05

  54                         1.96

  72                         0.84

  168                        0.78 实施例20：在仓鼠中的血浆浓度IV

用去铁胺-B正癸磺酸盐的样品III(1g)代替实施例18中使用 的去铁胺-B盐I，重复实施例18。如实施例17，用所得肠胃外注 射悬浮液进行试验。结果如下：

时间(小时)                血浆中去铁胺-B

                    和代谢产物B的总浓度(μg/ml)

  3                           17.61

  6                           17.15

  24                       0.67

  30                       0.41

  48                       0.60

  54                       0.88

  72                       0.50

  168                      0.47 实施例21：在仓鼠中的血浆浓度V

用玛瑙研棒和玛瑙研钵将去铁胺-B正癸磺酸盐样品III(1g) 与缓慢加入的芝麻油(2.5ml)、油酸乙酯(2.5ml)、脱水山梨糖醇 三油酸酯(0.075ml)和聚氧乙烯-4-十二烷基醚(0.025ml)的混合 物研磨。如实施例17，用所得肠胃外注射悬浮液进行试验。结果 如下：

时间(小时)                血浆中去铁胺-B

                     和代谢产物B的总浓度(μg/ml)

  3                           5.93

  6                           14.10

  24                           7.91

  30                           0.41

  48                           4.91

  54                           0.89

  96                           0.17 实施例22：组合物Q

将去铁胺-B正癸磺酸盐样品II(12.15份)加入到Miglyol 812(47.25份)中。所得悬浮液用胶体磨均化直至悬浮盐的平均粒 径为5-10微米，从而制得肠胃外注射悬浮液。 实施例23：对胆汁分泌的影响

用19.8份去铁胺-B正癸磺酸盐样品II和99份Miglyol 812 代替其在实施例22中的用量，重复实施例22。用所得肠胃外注射 悬浮液进行试验，测定其对胆管插套管大鼠的铁分泌影响。在收 集对照用胆汁和尿样3小时后，将悬浮液(591μl/kg，相对于去 铁胺的剂量为117mg/kg)经皮下注射到大鼠(雄性费歇尔)体内。 然后每隔3小时收集胆汁样品并测定其中铁含量。注射了悬浮液 的大鼠的试验结果如下(三只大鼠的平均值)：              

注射后的时间(小时)    胆汁中Fe含量(mg/kg)

      0                       11.0

      3                       86.9

      6                       111.8

      9                       105.1

      12                      96.1

      15                      92.7

      18                      88.2

      21                      86.2

      24                      92.0

      27                      76.7

      30                      67.0

      33                      52.7

      36                      35.5

      39                      16.1

      42                      9.6

      45                      8.4

      48                      7.2 实施例24：组合物R

用空气喷射磨研磨(正中颗粒大小为5-10μm)去铁胺-B正癸 磺酸盐样品II后，将所得物料在油相(比例和组份如实施例22或 23)中混合。将均相悬浮液装入容器(玻璃小瓶，预装(prefilled) 注射器或封口(bottlepack)容器)中，用γ或β射线热处理灭菌。 实施例25：仓鼠体内铁的排除

将芝麻油(2.0ml)、油酸乙酯(2.0ml)、脱水山梨糖醇三油酸 酯(7.5μl)和聚氧乙烯-4-十二烷基醚(25μl)的混合物缓慢加入 到去铁胺-B正癸磺酸盐中，同时用玛瑙研棒和玛瑙研钵研磨，得 到肠胃外注射悬浮液。测试该悬浮液对载负铁的雄性金黄仓鼠体 内的铁排除的影响，试验经静脉注射了59Fe示踪铁蛋白。在铁蛋 白给药1小时后，将悬浮液经皮下注射给药，其中去铁胺的剂量 为150μmol/kg。24或48小时后，用γ-计数器测定尿和粪便中 的59Fe含量。注射了悬浮液的仓鼠的试验结果(6只动物的平均值) 和未接受铁螯合剂的对照用仓鼠的试验结果(5只动物的平均值) 如下：

排除                    59Fe的量(％)

                       注射仓鼠       对照仓鼠

24小时尿样              0.74           0.026

24小时粪便              7.09           1.14

48小时尿样              0.052          0.037

48小时粪便              2.59           1.00 实施例26：结晶体A2

为制备晶种，将由结晶体B和结晶体A1的混合物组成的84g 去铁胺-1-癸磺酸盐加入到含有痕量tinovetin(十二烷基醚硫酸 酯(lauryl ether sulphate)和乙氧基化壬基酚的混合物)作 为湿润剂的820ml蒸馏水中。在80℃水浴中将形成的悬浮液保温 1小时，同时搅拌。随后用吸滤器趁热过滤悬浮液。在通氮气氛中， 室温干燥过滤的物质。测定所得晶种的化学纯度和形态均匀性， 如果结晶体A2不纯，则重复上述过程。这样可得到标题化合物。 实施例27：结晶体A2

将145mg去铁胺-1-癸磺酸盐结晶体B和结晶体A1(由少量的 A11和约等份的A12和A13组成)的混合物悬浮在含有痕量tinovetin 作为湿润剂的1.2ml蒸馏水中。在80℃水浴中将悬浮液保温2小 时，同时搅拌。随后用吸滤器趁热过滤悬浮液。在通氮气氛中室 温干燥过滤的物质。这样可得到标题化合物。 实施例28：结晶体A2

在室温，将20.1kg去铁胺甲磺酸盐溶解于水中并将其加热至 50℃。将7.3kg1-癸磺酸钠的一部分(15％)溶解于50℃水中，并 将得到的溶液一次加入到去铁胺甲磺酸盐溶液中。在溶液中引入 A2晶种，随后在50℃搅拌30分钟，出现结晶。然后，将另外一部 分(85％)1-癸磺酸钠水溶液经3-4小时加入到热悬浮液中完成结 晶。在50℃将悬浮液再搅拌90分钟，然后缓慢冷却至40℃。经 过滤干燥器滤出产物，用水洗涤产物并真空干燥，得到标题化合 物。 实施例29：结晶体A2

在30-40℃，将12.3kg去铁胺甲磺酸盐溶解于47.0kg水中。 将溶液除菌过滤，滤液转移至结晶釜中。在45-50℃，用几分钟的 时间向其中加入在12.0kg水中的0.7kg1-癸磺酸钠的无菌水溶 液，加入0.08kg去铁胺-1-癸磺酸盐结晶体A2，开始结晶。在50 ℃搅拌30分钟后，在约50-52℃，经3-4小时将另外的在64.0kg 水中的3.8kg1-癸磺酸钠的无菌水溶液加入其中，同时轻轻搅拌。 然后在50-52℃下，将悬浮液再放置1-2小时，随后冷却过夜至约 40℃。在无菌条件下抽滤出产物，用54kg水分几次洗涤产物，并 在50℃减压(＜20hPa)干燥24-40小时。得到标题化合物。 实施例30：结晶体A2

在回流温度(约78℃)下，将20.0kg去铁胺-1-癸磺酸盐溶解 于80.0kg无水乙醇中，过滤溶液。将补充了8.0kg乙醇冲洗液的 滤液经1-2小时冷却至40℃，这样即可在约75℃时向澄清液中引 入少量的去铁胺-1-癸磺酸盐结晶体A2作晶种，从而发生结晶。将 悬浮液在40℃保持30分钟，然后用大约1小时将悬浮液冷却至0 ℃，在此温度下再搅拌1-2小时。抽滤出产物，产物用24.0kg乙 醇分几次洗涤，在50℃下减压(＜20hPa)干燥。得到标题化合物。 实施例31：结晶体A2

在回流温度(约78℃)下，将20.0kg去铁胺-1-癸磺酸盐溶解 于80.0kg无水乙醇中，除菌过滤溶液。将补充了8.0kg乙醇冲洗 液的滤液经大约2小时逐步冷却至44℃，这样即可在约68℃时向 澄清液中引入少量的去铁胺-1-癸磺酸盐结晶体A2作晶种，从而发 生结晶。将悬浮液在44℃保持30分钟，然后用大约1-2小时将悬 浮液冷却至0℃，并在此温度下再搅拌约1小时。抽滤出产物，产 物用乙醇分几次洗涤，并在50℃减压(＜20hPa)干燥。