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方法、阵列和其用途

阅读：580发布：2020-11-14

专利汇可以提供方法、阵列和其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种诊断或确定胰腺癌相关疾病状态的方法，其包含或由以下步骤组成：(a)提供来自待测试个体的样品；以及(b)通过测量选自表A中定义的群组的一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量来确定所述测试样品的生物标志物特征；其中选自表A中定义的群组的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量指示所述个体中的所述胰腺癌相关疾病；确定胰腺癌相关疾病状态的用途和方法，以及治疗胰腺癌的方法，以及用于其的阵列和试剂盒。，下面是方法、阵列和其用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于诊断或确定胰腺癌相关疾病状态的方法，其包含或由以下步骤组成：
(a)提供来自待测试个体的样品；以及
(b)测量选自表A中定义的群组的一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/或量；
其中选自表A中定义的群组的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在
和/或量指示所述个体中的所述胰腺癌相关疾病状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的所述样品是血液或血清。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)中的所述样品来自处于以下风险群组之一下的患者：
(a)有胰腺癌家族史的个体；
(b)被诊断患有新发II型糖尿病的个体；或
(c)具有暗示胰腺癌或与胰腺癌一致的症状的个体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量在表A、部分(i)和/或部分(iii)中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于：
(i)早期胰腺癌的诊断和/或分期；
(ii)识别处于患有或罹患胰腺癌的风险下的个体；
(iii)胰腺癌的诊断和/或分期；
(iv)区分胰腺癌与慢性胰腺炎；和/或
(v)检测导管内乳头状粘液性肿瘤的存在。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺癌(pancreatic
adenocarcinoma)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量在表A中列出的一种或多种生物标志物，例如在表A中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或全部29种所述生物标志物的存在和/或量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量以下各者的存在和/或量组成：
(i)表A中列出的所述生物标志物和补体C1q(C1q；例如Uniprot IDP02745、2746和/或
2747)；
(ii)表A中列出的所述生物标志物，排除白细胞介素-6(IL-6)和/或GTP结合蛋白GEM
(GEM)；或
(iii)表A中列出的所述生物标志物(排除IL-6和GEM)和C1q。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量以下生物标志物的存在和/或量组成：
DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q
(任选地包括来自表B的一种或多种生物标志物和/或IL-6和/或GEM)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量在表B中列出的一种或多种另外的生物标志物，例如在表B中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90种或所有所述生物标志物的存在和/或量。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌相关疾病状态是早期胰腺癌。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法用于I期和/或II期胰腺癌的诊断。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量在以下各者中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量组成：
(i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种所述生物标志物；和/或
(ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7种或所有所述生物标志物；和/或
(iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6种或所有所述生物标志物；和/或
(iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或所有所述生物标志物。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量在表C中列出的一种或多种生物标志物，例如在表C中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24种或所有所述生物标志物的存在和/或量。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌相关疾病状态是晚期胰腺癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法用于III期和/或IV期胰腺癌的诊断。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量在以下各者中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量组成：
(i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种所述生物标志物；和/或
(ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7种或所有所述生物标志物；和/或
(iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6种或所有所述生物标志物；和/或
(iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或所有所述生物标志物。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量在表D中列出的一种或多种生物标志物，例如在表D中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23种或所有所述生物标志物的存在和/或量。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于区分胰腺癌与慢性胰腺炎。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量在以下各者中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量组成：
(i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种所述生物标志物；和/或
(ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7种或所有所述生物标志物；和/或
(iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6种或所有所述生物标志物；和/或
(iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或所有所述生物标志物。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中步骤(b)包含或由以下组成：测量选自由以下组成的群组一种或多种生物标志物的存在和/或量：IL-4、C4、MAPK9、C1INH、VEGF、PTPRD、KCC4、TNF-α、C1q和BTK。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测导管内乳头状粘液性肿瘤，例如恶性IPMN的存在。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(b)包含或由测量在以下各者中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量组成：
(i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种所述生物标志物；和/或
(ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7种或所有所述生物标志物；和/或
(iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6种或所有所述生物标志物；和/或
(iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或所有所述生物标志物。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含测量在表A中列出的所有所述生物标志物的存在和/或量(例如，在蛋白质、mRNA和/或ctDNA层面上)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含测量以下各者的存在
和/或量：DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含或由以下步骤组成：
(c)提供一个或多个来自以下的对照样品：
i.未患胰腺癌的个体；和/或
ii.患有胰腺癌的个体，其中所述样品的分期与所述测试样品的分期不同；和/或
iii.患有慢性胰腺炎的个体；和
(d)通过测量步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在
和/或量来确定所述一种或多种对照样品的生物标志物特征；
其中如果步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/
或量不同于步骤(d)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量，则识别所述胰腺癌相关疾病状态。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含或由以下步骤组成：
(e)提供一个或多个来自以下的对照样品；
i.患有胰腺癌的个体；和/或
ii.患有胰腺癌的个体，其中所述样品与所述测试样品在同一分期；
(f)通过测量步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在
和/或量来确定所述对照样品的生物标志物特征；
其中如果步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述测试样品中的存在和/
或量对应于步骤(f)中测量的所述一种或多种生物标志物在所述对照样品中的存在和/或量，则识别所述胰腺癌相关疾病状态。
28.根据权利要求26所述的方法，其中未患胰腺癌的所述个体是健康个体。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述一个或多个患有胰腺癌的个体患有选自由以下组成的群组的胰腺癌：腺癌(例如，胰腺导管腺癌或管状乳头状胰腺癌)、胰腺肉瘤、恶性浆液性囊腺瘤、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌，和具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法经重复。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法使用在与所用的先前测试样品不同的时间段取自相同个体的测试样品重复。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法使用距所用的先前测试样品1天至104周之间，例如1周至100周之间、1周至90周之间、1周至80周之间、1周至70周之间、1周至60周之间、1周至50周之间、1周至40周之间、1周至30周之间、1周至20周之间、1周至10周之间、1周至9周之间、1周至8周之间、1周至7周之间、1周至6周之间、1周至5周之间、1周至4周之间、
1周至3周之间或1周至2周之间取得的测试样品重复。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述方法使用在选自由以下组成的群组的每个时段取得的测试样品重复：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、35周、40周、45周、50周、55周、60周、65周、70周、75周、80周、85周、90周、95周、100周、104周、105周、110周、115周、120周、125周和130周。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述方法重复至少一次，例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、
19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中重复所述方法直到使用常规临床方法在所述个体中诊断出胰腺癌。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含测量所述一种或多种生物标志物的蛋白质或多肽的表达。
38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或步骤(f)使用一种或多种能够结合表A中列出的生物标志物蛋白或多肽的第一结合剂进行。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一结合剂包含或由抗体或其抗原结合片段组成。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的群组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合结构域。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂固定在表面上。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中所述测试和/或对照样品中的所述一种或多种生物标志物用可检测部分标记。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的群组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶促部分。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述可检测部分是生物素。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或步骤(f)使用包含能够与所述一种或多种生物标志物结合的第二结合剂的测定进行，所述第二结合剂包含可检测部分。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第二结合剂包含或由抗体或其抗原结合片段组成。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的群组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合结构域。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的群组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶促部分。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述可检测部分是荧光部分(例如Alexa Fluor染料，例如Alexa647)。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含或由ELISA(酶联免疫吸附剂测定)组成。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或步骤(f)使用阵列进行。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述阵列选自由以下组成的群组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。
55.根据权利要求37至54中任一项所述的方法，其中所述方法包含：
(i)用生物素标记所述样品中存在的生物标志物；
(ii)使所述生物素标记的蛋白质与包含多个scFv的阵列接触，所述scFv固定在阵列表面上的离散位置，所述scFv对表A中的一种或多种蛋白质具有特异性；
(iii)使所述生物素标记的蛋白质(固定在所述scFv上)与包含荧光染料的抗生蛋白链菌素缀合物接触；和
(iv)检测所述阵列表面上离散位置处所述染料的存在
其中所述染料在所述阵列表面上的表达指示所述样品中来自表A的生物标志物的表
达。
56.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，步骤(b)、(d)和/或(f)包含测量编码所述一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸分子是mRNA分子。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸分子是DNA分子。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述核酸分子是cDNA或ctDNA分子。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中所述一种或多种生物标志物的表达的测量使用选自由以下组成的群组的方法进行：南方杂交、北方杂交、聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、自动射线照相术和原位杂交。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法，其中步骤(b)中所述一种或多种生物标志物的表达的测量使用DNA微阵列确定。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(d)和/或(f)中所述一种或多种生物标志物的表达的测量使用一个或多个结合部分进行，所述结合部分各自独立地能够选择性地与编码表A中所识别的所述生物标志物之一的核酸分子结合。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述一个或多个结合部分各自包含或由核酸分子组成。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述一个或多个结合部分各自包含或由以下组成：DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述一个或多个结合部分各自包含或由DNA组成。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述一个或多个结合部分的长度为5至100个核苷酸，例如长度为15至35个核苷酸。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述结合部分包含可检测部分。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述可检测部分选自由以下组成的群组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶促部分。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述可检测部分包含或由放射性原子组成。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述放射性原子选自由以下组成的群组：锝-
99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-
186、铼-188和钇-90。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述结合部分的所述可检测部分是荧光部分。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的所述样品选自由以下组成的群组：未分级的血液、血浆、血清、组织液、胰腺组织、乳汁、胆汁和尿液。
73.根据权利要求72所述的方法，其中步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的所述样品选自由以下组成的群组：未分级的血液、血浆和血清。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的所述样品是血清。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如通过ROC AUC值所确定，所述方法的预测准确度为至少0.50，例如至少0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、
0.96、0.97、0.98或至少0.99。
76.根据权利要求75所述的方法，其中如通过ROC AUC值所确定，所述方法的预测准确度为至少0.70。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含一个或多个进一步的临床研究(如测试活组织检查样品和/或所述患者的体内成像)以确认或确立诊断。
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果所述个体被诊断患有胰腺癌，则所述方法包含向所述个体提供胰腺癌治疗的步骤(g)。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述胰腺癌治疗选自由以下组成的群组：手术、化疗、放射疗法、免疫疗法、化学免疫疗法、热化学疗法和其组合。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述胰腺癌治疗包含或由以下组成：完全或部分地手术去除胰腺(例如使用胰十二指肠切除术(Whipple procedure)去除胰头或全胰切除)以及化疗(例如吉西他滨和/或5-氟尿嘧啶)。
81.一种用于确定个体中胰腺癌的存在或患胰腺癌风险的阵列，其包含一种或多种试剂，用于检测表A中定义的一种或多种所述生物标志物在来自所述个体的蛋白质和/或核酸样品中的存在。
82.根据权利要求81所述的阵列，其中用于检测表A中定义的一种或多种所述生物标志物在样品中的存在的所述一种或多种试剂是根据权利要求39至42或63至71中任一项所述的一种或多种结合剂。
83.根据权利要求81或82所述的阵列，其中所述阵列包含能够结合表A中定义的所有所述生物标志物的试剂。
84.根据权利要求81或82所述的阵列，其中所述阵列包含能够结合以下生物标志物的试剂：
DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q
(任选地包括来自表B的一种或多种生物标志物和/或IL-6和/或GEM)。
85.根据权利要求81至84中任一项所述的阵列，其中所述阵列包含能够在蛋白质层面上结合所有所述生物标志物的抗体或其抗原结合片段。
86.根据权利要求85所述的阵列，其中所述阵列包含表7中所识别的一种或多种所述抗体。
87.根据权利要求85所述的阵列，其中所述阵列包含或由表8中的所有所述抗体组成。
88.根据权利要求81至84中任一项所述的阵列，其中所述阵列包含能够在mRNA和/或
DNA层面上结合所有生物标志物的试剂。
89.根据权利要求81至88中任一项所述的阵列，其进一步包含阳性对照样品(如牛血清白蛋白)。
90.根据权利要求81至89中任一项所述的阵列，其进一步包含阴性对照样品(如磷酸盐缓冲盐水)。
91.一种选自表A中定义的群组的一种或多种生物标志物的用途，其用作用于确定个体中胰腺癌的存在或患胰腺癌风险的生物标志物。
92.根据权利要求91所述的用途，其中所述一种或多种生物标志物包含以下生物标志物：
DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q
(任选地包括来自表B的一种或多种生物标志物加上IL-6和GEM)。
93.根据权利要求91或92所述的用途，其中表A中定义的所有所述生物标志物一起用作诊断特征，用于确定个体中胰腺癌的存在。
94.一种用于确定胰腺癌的存在或患胰腺癌风险的试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求81至90中任一项所述的阵列，或用于制造其的组件；和
(b)用于进行根据权利要求1至80中任一项所述的方法的说明书。
95.一种治疗个体的胰腺癌的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至80中任一项所述的方法诊断胰腺癌；和
(b)向所述个体提供胰腺癌治疗。
96.根据权利要求95所述的方法，其中步骤(a)进一步包含一个或多个进一步的临床研究(如测试活组织检查样品和/或患者的体内成像)以确认或确立诊断。
97.根据权利要求95或96所述的方法，其中所述胰腺癌治疗选自由以下组成的群组：手术(例如切除)、化疗、免疫疗法、化学免疫疗法和热化疗。
98.根据权利要求95至97中任一项所述的方法，其中所述胰腺癌治疗包含完全或部分地手术去除所述胰(例如使用胰十二指肠切除术去除胰头或全胰切除术)以及化疗(例如吉西他滨和/或5-氟尿嘧啶)。
99.一种基本上如本文所述的确定个体中胰腺癌的存在的方法或用途。
100.一种基本上如本文所述的用于确定个体中胰腺癌的存在的阵列或试剂盒。

说明书全文

方法、阵列和其用途

发明领域

[0001] 本发明提供用于确定胰腺癌相关疾病状态的体外方法(如胰腺癌存在、胰腺癌风险、胰腺癌分期和/或相关病变(如导管内乳头状粘液性肿瘤)的存在)，以及用于此类方法的阵列和试剂盒。

背景技术

[0002] 胰腺导管腺癌(PDAC)的发病率正在增加，并且已成为全世界1330,400名患者死亡的原因。PDAC是最致命的癌症之一，其具有小于10％2-4的五年生存率。2030年PDAC被认为是引起癌症5死亡的第二大原因。这种令人沮丧的发展背后的一个因素是导致晚期诊断的弥2-4,6,7
漫性症状，此时仅约15％患者存在可切除的肿瘤。因此，由于手术切除是PDAC唯一可能治愈的治疗方法，因此需要进行早期检查。与此一致，如果可以切除局部肿瘤，则显示五年生存率从43％(II期)增加至超过50％(I期)8。此外，据报道，在临床诊断9,10前六个月，胰腺肿瘤可在无症状期下切除。最近一项对携带CDKN2A的无症状高风险患者进行的监测研究
11
产生75％的切除率和24％的五年生存率，其与偶发性PDAC患者相比有了很大的改善。综合而言，有理由相信早期诊断会使得具有PDAC12,13的患者的生存率增加，并且无症状的高风险患者将从有效监测14中受益。

[0003] 迄今为止评估最多的PDAC标志物血清CA19-9具有不足的特异性，在其它几种适应症中水平升高，以及在基因型路易斯a-b-(5％人群)的患者中完全缺失。因此，不建议将CA19-9本身用于筛查15，或作为复发16的证据，但建议在例如手术切除17之后进行疾病监测。因此，癌症诊断领域越来越关注诊断20,21和诊断前样品22,23中标志物的多参数分析18,19，因为这种方法产生改善的灵敏度和特异性，也与CA19-924,25组合。事实上，已经证明免疫调节和癌症相关的蛋白质生物标志物的组合可以区分晚期III/IV PDAC患者和健康对照26,27。

[0004] 然而，仍然需要改善的诊断胰腺癌如PDAC的方法，特别是在疾病的早期。

发明内容

[0005] 因此，本发明的第一方面提供诊断或确定胰腺癌相关疾病状态的方法，其包含以下或由以下步骤组成：

[0006] (a)提供来自待测个体的样品；和

[0007] (b)通过测量选自表A中定义的组的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量来确定测试样品的生物标志物特征；

[0008] 其中，选自表A中定义的组的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量指示个体中胰腺癌相关疾病状态。

[0009] 表A

[0010] 部分(i)

[0011] 磁盘大同源物1(DLG1；例如UniProt ID Q12959)

[0012] 蛋白激酶Cδ型(PRKCZ；例如UniProt ID Q05513)

[0013] 部分(ii)

[0014] 血管内皮生长因子(VEGF；例如UniProt ID P15692)

[0015] 补体C3(C3；例如UniProt ID P01024)

[0016] 血浆蛋白酶C1抑制因子(C1INH；例如UniProt ID P05155)

[0017] 白细胞介素-4(IL-4；例如UniProt ID P05112)

[0018] 干扰素γ(IFNγ；例如UniProt ID P01579)

[0019] 补体C5(C5；例如UniProt ID P01031)

[0020] 蛋白-酪氨酸激酶6(PTK6；例如UniProt ID Q13882)

[0021] 部分(iii)

[0022] 钙调磷酸酶B同源蛋白质1(CHP1；例如UniProt ID Q99653)

[0023] GTP-结合蛋白GEM(GEM；例如UniProt ID P55040)

[0024] Aprataxin和PNK样因子(APLF；例如UniProt ID Q8IW19)

[0025] 钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶IV型(CAMK4；例如UniProt ID Q16566)

[0026] 膜相关鸟苷酸激酶，含WW和PDZ结构域的蛋白质1(MAGI；例如UniProt ID Q96QZ7)[0027] 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MARK1(MARK1；例如UniProt ID Q9P0L2)

[0028] PR结构域锌指蛋白8(PRDM8；例如UniProt ID Q9NQV8)

[0029] 部分(iv)

[0030] 载脂蛋白A1(APOA1；例如UniProt ID P02647)

[0031] 细胞周期蛋白-依赖性激酶2(CDK2；例如UniProt ID P24941)

[0032] HADH2蛋白(HADH2；例如UniProt ID Q6IBS9)

[0033] 白细胞介素-6(IL-6；例如UniProt ID P05231)

[0034] 补体C4(C4；例如UniProt ID P0COL4/5)

[0035] 视觉系统同源盒2(VSX2/CHX10；例如UniProt ID P58304)

[0036] 细胞间粘附分子1(ICAM-1；例如UniProt ID P05362)

[0037] 白细胞介素-13(IL-13；例如UniProt ID P35225)

[0038] 路易斯x(路易斯x/CD15)

[0039] 肌间蛋白-2(MYOM2；例如UniProt ID P54296)

[0040] 备解素(Factor P；例如UniProt ID P27918)

[0041] 唾液酸化路易斯x(唾液酸化路易斯x)

[0042] 淋巴毒素-α(TNFβ；例如UniProt ID P01374)

[0043] 因此，在一个实施例中，所述方法包含确定测试样品的生物标志物特征，这使得能够针对从中获得样品的个体达到诊断。

[0044] 本发明的方法适用于测试来自怀疑患有胰腺癌相关疾病状态或有发展胰腺癌相关疾病状态风险的任何个体的样品。例如，个体可能来自患有或发展胰腺癌的较高风险的以下组之一：

[0045] (i)有胰腺癌家族史的个体(例如在母亲或父亲一方一代或两代内)；

[0046] (ii)被诊断患有新发糖尿病(例如II型)的个体，特别是50岁或以上的那些；和[0047] (iii)具有症状暗示或与胰腺癌一致的个体，例如上腹部或上背部疼痛、食欲不振、体重减轻、黄疸(皮肤和眼睛发黄并且尿液呈黑色)、消化不良、恶心、呕吐和/或极度疲倦(疲乏))。

[0048] “胰腺癌相关疾病状态”包括胰腺癌存在本身，患有或发展为胰腺癌，胰腺癌分期和存在相关病变(如导管内乳头状粘液性肿瘤)的风险(见下文)。特别地，包括胰腺导管腺癌(PDAC)的存在和/或分期。

[0049] 因此，在一个实施例中，本发明的方法提供了用于检测具有增加的发展PDAC风险的个体的胰腺异常的定性结果。

[0050] 在特定实施例中，本发明的方法允许：

[0051] (a)早期胰腺癌的诊断和/或分期；和

[0052] (b)晚期胰腺癌的诊断和/或分期。

[0053] 有利地，本发明的方法还能够区分个体中的胰腺癌和慢性胰腺炎。

[0054] 在另一个实施例中，本发明的方法可用于检测个体中导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)的存在。如果不进行治疗，这些病变可发展为侵袭性癌症。因此，重要的是检测这些病变，因为这可能提供去除癌前病变的机会。在一个实施例中，IPMN病变是恶性的。

[0055] “生物标志物”包括任何天然存在的生物分子或其组分或片段，其测量可提供用于胰腺癌诊断的信息。因此，在表A的上下文中，生物标志物可以是蛋白质，或其多肽片段或碳水化合物部分(或者，在唾液酸化路易斯x的情况下，本身是碳水化合物部分)。替代地，生物标志物可以是核酸分子，如mRNA、cDNA或循环肿瘤DNA分子，其编码蛋白质或其部分。

[0056] “诊断”包括确定个体中疾病状态的存在或不存在(例如，确定个体是否患有早期胰腺癌或晚期胰腺癌)。

[0057] “分期”包括确定胰腺癌的分期，例如，确定胰腺癌是否是I期、II期、III期或IV期(例如，I期、II期、I-II期、III-IV期或I-IV期)。

[0058] “早期胰腺癌”(或“早期胰腺癌(early stage pancreatic cancer)”)包括或意指包含以下或由以下组成的胰腺癌：I期和/或II期胰腺癌，例如由以下所确定：美国癌症联合委员会(AJCC)TNM系统(例如参见：

[0059] http://www.cancer.org/cancer/pancreaticcancer/detailedguide/pancreatic-cancer-staging

[0060] 和《AJCC癌症分期手册(AJCC Cancer Staging Manual)》(第7版)，2011，Edge等人，斯普林格(Springer)，其通过引用的方式并入本文中)。

[0061] TNM癌症分期系统基于3条关键信息：

[0062] ·T描述主要(原发)肿瘤的大小，以及所述肿瘤是否已在胰腺外生长并进入附近器官中。

[0063] ·N描述向附近(区域)淋巴结的扩散。

[0064] ·M指示癌是否已经转移(扩散)到身体的其它器官。(最常见的胰腺癌扩散部位是肝、肺和腹膜—消化器官周围的空间。)

[0065] 数字或字母出现在T、N和M之后，以提供更多关于这些因素中的每一种的详细信息。

[0066] T类别

[0067] TX:无法评估主要肿瘤。

[0068] T0:没有原发肿瘤的证据。

[0069] Tis:原位癌(肿瘤局限于胰腺导管细胞的顶层)。(在此分期很少发现胰腺肿瘤。)[0070] T1:癌症仍在胰腺内，并且宽2厘米(cm)(约3/4英寸)或更小。

[0071] T2:癌症仍在胰腺内，但宽大于2cm。

[0072] T3:癌症已生长到胰腺外进入附近的周围组织，但没有进入主血管或神经。

[0073] T4:癌症已生长到越过胰腺进入附近的大血管或神经。

[0074] N类别

[0075] NX:无法评估附近(区域)淋巴结。

[0076] N0:癌症未扩散到附近的淋巴结。

[0077] N1:癌症已扩散到附近的淋巴结。

[0078] M类别

[0079] M0:癌症未扩散到远处淋巴结(除邻近胰腺的淋巴结以外)或远处器官，如肝、肺、脑等。

[0080] M1:癌症已扩散到远处淋巴结或远处器官。

[0081] 一旦确定了T、N和M类别，就将此信息组合起来以指定0、I、II、III或IV的整个分期(有时后跟字母)。这个过程称为分期分组。

[0082] 0期(Tis、N0、M0):肿瘤局限于胰腺导管细胞的顶层且未侵入更深的组织。所述肿瘤未扩散到胰腺外。这些肿瘤有时称为原位胰腺癌。

[0083] IA期(T1、N0、M0):肿瘤局限于胰腺且宽2cm或更小(T1)。所述肿瘤未扩散到附近的淋巴结(N0)或远处部位(M0)。

[0084] IB期(T2、N0、M0):肿瘤局限于胰腺且宽大于2cm(T2)。所述肿瘤未扩散到附近的淋巴结(N0)或远处部位(M0)。

[0085] IIA期(T3、N0、M0):肿瘤生长到胰腺外但没有进入主血管或神经(T3)。所述肿瘤未扩散到附近的淋巴结(N0)或远处部位(M0)。

[0086] IIB期(T1-3、N1、M0):肿瘤局限于胰腺或生长到胰腺外但没有进入主血管或神经(T1-T3)。所述肿瘤已扩散到附近的淋巴结(N1)，但没有扩散到远处部位(M0)。

[0087] III期(T4、任何N、M0):肿瘤生长到胰腺外进入附近的主血管或神经(T4)。所述肿瘤可能已或可能未扩散到附近的淋巴结(任何N)。所述肿瘤未扩散到远处部位(M0)。

[0088] IV期(任何T、任何N、M1):癌已扩散到远处部位(M1)。

[0089] 替代地或另外，“早期胰腺癌”(或“早期胰腺癌”)包括或意指无症状的胰腺癌。胰腺癌的常见症状包括黄疸(对于胰头肿瘤)、腹痛、体重减轻、脂肪痢(steatorrhoea)和新发糖尿病。例如，胰腺癌可能在观察到症状或症状可观察(例如，常见症状)之前至少1周存在，例如在观察到症状或症状可观察之前≥2周、≥3周、≥4周、≥5周、≥6周、≥7周、≥8周、≥3个月、≥4个月、≥5个月、≥6个月、≥7个月、≥8个月、≥9个月、≥10个月、≥11个月、≥12个月、≥18个月、≥2年、≥3年、≥4年或≥5年。

[0090] 因此，“早期胰腺癌”(或“早期胰腺癌”)包括大小和/或发展阶段不足以通过常规临床方法诊断的胰腺癌。例如，“早期胰腺癌”或“早期胰腺癌”包括或意指在通过常规临床方法诊断胰腺癌或胰腺癌可诊断之前至少1周存在的胰腺癌，例如在通过常规临床方法诊断胰腺癌或胰腺癌可诊断之前≥2周、≥3周、≥4周、≥5周、≥6周、≥7周、≥8周、≥3个月、≥4个月、≥5个月、≥6个月、≥7个月、≥8个月、≥9个月、≥10个月、≥11个月、≥12个月、≥18个月、≥2年、≥3年、≥4年或≥5年。

[0091] 用于临床胰腺癌诊断的当代最佳实践将为本领域技术人员所众所周知的，然而，详细综述参见Ducreux等人，2015，《胰腺癌：用于诊断、治疗和随访的ESMO临床实践指南(Cancer of the pancreas:ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis,treatment and follow-up)》《肿瘤学年鉴(Annals of Oncology)》，26(补充5):第56版-第
68版，其以引用的方式并入本文中。

[0092] 常规临床诊断(例如，“通过常规临床方法诊断”)包括CT扫描、超声、内窥镜超声、活组织检查(组织病理学)和/或身体检查(例如，腹部和可能的局部淋巴结)。在一个实施例中，“常规临床诊断”(等)包括Ducreux等人，2015，同上所述的胰腺癌诊断手术。

[0093] 常规临床诊断(等)可包括或排除使用存在于体液(如血液、血清、间质液、淋巴液、尿液、粘液、唾液、痰液、汗液)和/或组织中的分子生物标志物。

[0094] 本领域的普通技术人员应了解，早期胰腺癌可以是可切除的胰腺癌。

[0095] “可切除的胰腺癌”包括或意指胰腺癌，其包含肿瘤或由肿瘤组成，所述肿瘤(和/或被认为)能够通过手术去除(即可切除)。例如，胰腺癌可局限于胰腺(即，其不延伸超出胰腺和/或没有转移)。

[0096] 在一个实施例中，早期胰腺癌包含在所有维度上为30mm或更小的肿瘤(即，在此实施例中，患有早期胰腺癌的个体不包含在任何维度上大于30mm的胰腺癌肿瘤)，例如，在所有维度上等于或小于29mm、28mm、27mm、26mm、25mm、24mm、22mm、21mm、20mm、19mm、18mm、17mm、16mm、15mm、14mm、13mm、12mm、11mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm或等于或0.1mm。替代或另外地，在所有维度上均为30mm或更小的胰腺癌肿瘤在一个维度上为至少2mm。替代或另外地，在所有维度上均为30mm或更小的胰腺癌肿瘤所有维度均为至少
2mm。

[0097] 通过本领域的普通技术人员应了解，本发明的方法通常用于提供初始诊断，例如以识别患有或发展有胰腺癌风险的个体，之后可以进行进一步的临床研究(如活组织检查测试、体内成像等)以证实诊断。

[0098] 但是，替代地，本发明的方法可以用作独立的诊断测试。

[0099] “待测样品”、“测试样品”或“对照样品”包括取自或衍生自个体的组织或液体样品，其中样品包含内源蛋白质和/或核酸分子和/或碳水化合物部分。优选地，待测样品由哺乳动物提供。哺乳动物可以是任何家养或农场动物。优选地，哺乳动物是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、马或灵长类动物。最优选地，哺乳动物是人。

[0100] 在本发明的方法中待测样品可以是包含以下或由以下组成的细胞、组织或流体样品(或其衍生物)：血液(分级的或未分级的)、血浆、浆细胞、血清、组织细胞或同样优选的蛋白质或核酸，其衍生自细胞或组织样品。应了解，测试和对照样品应衍生自相同物种。优选地，测试和对照样品与年龄、性别和/或生活方式相匹配。

[0101] 在一个实施例中，样品是胰腺组织样品。在替代或另外的实施例中，样品是胰腺细胞样品。

[0102] 替代地，样品可以是血液或血清样品。

[0103] 在本发明的方法中，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量表A中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量，例如表A中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或全部29种生物标志物。

[0104] 因此，步骤(b)可包含以下、由以下组成或排除以下：测量磁盘大同源物1(DLG1)的表达替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量蛋白激酶Cδ型(PRKCZ)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量血管内皮生长因子(VEGF)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量补体C3(C3)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量血浆蛋白酶C1抑制因子(C1INH)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量白细胞介素-4(IL-4)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量干扰素γ(IFNγ)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量补体C5(C5)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量蛋白-酪氨酸激酶6(PTK6)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量钙调磷酸酶B同源蛋白1(CHP1)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量GTP-结合蛋白GEM(GEM)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量Aprataxin和PNK样因子(APLF)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶IV型(CAMK4)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量膜相关鸟苷酸激酶，含WW和PDZ结构域的蛋白1(MAGI)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MARK1(MARK1)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量结构域锌指蛋白8(PRDM8)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量载脂蛋白A1(APOA1)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量细胞周期蛋白-依赖性激酶2(CDK2)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量HADH2蛋白(HADH2)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量白细胞介素-6(IL-6)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量补体C4(C4)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量视觉系统同源盒2(VSX2/CHX10)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量白细胞介素-13(IL-13)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量路易斯x(路易斯x/CD15)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量肌间蛋白-2(MYOM2)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量备解素(Factor P)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量唾液酸化路易斯x(唾液酸化路易斯x)的表达。替代地或另外，步骤(b)包含以下、由以下组成或排除以下：测量淋巴毒素-α(TNFβ)的表达。

[0105] 因此，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在以下中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量：

[0106] (i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种生物标志物；和/或

[0107] (ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7或所有生物标志物；和/或

[0108] (iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6或所有生物标志物；和/或

[0109] (iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有生物标志物。

[0110] 在进一步优选的实施例中，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量一种或多种以下生物标志物的存在和/或量：

[0111] (i)表A中列出的生物标志物和补体C1q(C1q；例如Uniprot ID P02745,2746和/或2747)；

[0112] (ii)表A中列出的生物标志物，排除白细胞介素-6(IL-6)和/或GTP-结合蛋白GEM(GEM)；和/或

[0113] (iii)表A中列出的生物标志物(排除IL-6和GEM)和C1q。

[0114] 在这个意义上，补体C1q可以被认为是表A、部分(iv)内的另外的生物标志物和/或IL-6和GEM可以被认为是表B(而不是表A)内的生物标志物。

[0115] 因此，在本发明所有方面的替代实施例中，本文对表A中的生物标志物的参考可被视为对表A中列出的生物标志物(排除IL-6和GEM)和C1q的参考。同样地，本文对表B中的生物标志物的参考可以被视为对表B中列出的生物标志物加上IL-6和GEM(但排除C1q)的参考。

[0116] 有利地，在本发明第一方面的方法中，步骤(b)包含以下或由以下组成：通过测量所有以下生物标志物在测试样品中的存在和/或量来确定测试样品的生物标志物特征：

[0117] DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q

[0118] (任选地包括来自表B的一种或多种生物标志物和/或IL-6和/或GEM；参见下文)，[0119] 其中所述生物标志物在测试样品中的存在和/或量指示个体中胰腺癌相关疾病状态。

[0120] 应了解，步骤(b)可另外包含测量表A中未列出的一种或多种其它生物标志物的存在和/或量，其中其它生物标志物可提供另外的诊断信息。

[0121] 例如，步骤(b)可包含以下或由以下组成：测量表B中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量。

[0122] 表B

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127] 例如，步骤(b)可包含以下或由以下组成：测量表B中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或所有生物标志物的存在和/或量。

[0128] 在本发明的一个实施例中，方法用于诊断早期胰腺癌(例如，I期和/或II期PDAC与健康相比)。

[0129] 例如，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在表A中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量，例如在表A中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或所有生物标志物。

[0130] 替代地或另外，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在表C中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量，例如在表C中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或所有生物标志物。

[0131] 表C

[0132] 选择的生物标志物用于非癌性与I和II期PDAC之间的分类

[0133]

[0134]

[0135] 在本发明的一个替代实施例中，方法用于诊断晚期胰腺癌(例如，III期和/或IV期PDAC与健康相比)。

[0136] 例如，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在表D中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量，例如在表D中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或所有生物标志物。

[0137] 表D

[0138] 选择的生物标志物用于非癌性与III和IV期PDAC之间的分类

[0139]

[0140] 在本发明的另一个实施例中，方法用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎。

[0141] 例如，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在以下中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量：

[0142] (i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种生物标志物；和/或

[0143] (ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7或所有生物标志物；和/或

[0144] (iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6或所有生物标志物；和/或

[0145] (iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有生物标志物。

[0146] 应了解，步骤(b)可另外包含测量表A中未列出的一种或多种其它生物标志物的存在和/或量，其中其它生物标志物可提供另外的诊断信息。

[0147] 例如，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量选自由以下组成的群组一种或多种生物标志物的存在和/或量：IL-4、C4、MAPK9、C1INH、VEGF、PTPRD、KCC4、TNF-α、C1q和BTK。

[0148] 在本发明的另一个实施例中，方法用于检测个体中的的导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)。换句话说，方法可以使具有IPMN的患者与没有IPMN的个体(例如健康个体)区分开来。在一个实施例中，IPMN病变是恶性的。

[0149] 例如，步骤(b)包含以下或由以下组成：测量在以下中列出的一种或多种生物标志物的存在和/或量：

[0150] (i)表A，部分(i)，例如表A(i)中列出的两种生物标志物；和/或

[0151] (ii)表A，部分(ii)，例如表A(ii)中列出的至少2、3、4、5、6、7或所有生物标志物；和/或

[0152] (iii)表A，部分(iii)，例如表A(iii)中列出的至少2、3、4、5、6或所有生物标志物；和/或

[0153] (iv)表A，部分(iv)，例如表A(iv)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有生物标志物。

[0154] 应了解，步骤(b)可以另外包含测量一种或多种其它生物标志物的存在和/或量，如表B、C和/或D中列出的那些，其中其它生物标志物可以提供另外的诊断信息。

[0155] 在本发明第一方面的一个优选实施例中，步骤(b)包含例如在蛋白质水平下测量表A中列出的所有生物标志物的存在和/或量。使用这种‘完整的’共识生物标志物特征允许在任何分期(包括疾病的早期)诊断胰腺癌(例如，PDAC)。

[0156] 本领域的普通技术人员应了解，除了测量来自待测个体的样品中的生物标志物之外，本发明的方法还可以包含测量一种或多种对照样品中的那些相同的生物标志物。

[0157] 因此，在一个实施例中，方法还包含以下步骤或由以下步骤组成：

[0158] (c)提供以下一个或多个(阴性)对照样品：

[0159] (i)未患胰腺癌的个体；和/或

[0160] (ii)患有胰腺癌的个体，其中样品的分期与测试样品的分期不同；和/或

[0161] (iii)患有慢性胰腺炎的个体；和

[0162] (d)通过测量步骤(b)中测量的所述一种或多种生物标志物在对照样品中的存在和/或量来确定一种或多种对照样品的生物标志物特征；

[0163] 其中，在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量不同于步骤(d)中测量的一种或多种生物标志物在对照样品中的存在和/或量的情况下，识别胰腺癌相关疾病状态。

[0164] “与对照样品中的存在和/或量不同”包括测试样品中一种或多种生物标志物的存在和/或量不同于一种或多种对照样品的存在和/或量(或不同于预定的表示相同的存在和/或量的参考值)。优选地，测试样品中的存在和/或量与一个或多个对照样品的存在或量相差(或对照样品的平均值)一个或多个对照样品(例如，阴性对照样品)的至少±5％，例如至少±6％、±7％、±8％、±9％、±10％、±11％、±12％、±13％、±14％、±15％、±16％、±17％、±18％、±19％、±20％、±21％、±22％、±23％、±24％、±25％、±26％、±27％、±28％、±29％、±30％、±31％、±32％、±33％、±34％、±35％、±36％、±37％、±38％、±39％、±40％、±41％、±42％、±43％、±44％、±45％、±41％、±42％、±43％、±44％、±55％、±60％、±65％、±66％、±67％、±68％、±69％、±70％、±71％、±72％、±73％、±74％、±75％、±76％、±77％、±78％、±79％、±80％、±81％、±82％、±83％、±84％、±85％、±86％、±87％、±88％、±89％、±90％、±91％、±92％、±93％、±94％、±95％、±96％、±97％、±98％、±99％、±100％、±125％、±150％、±175％、±200％、±225％、±250％、±275％、±300％、±350％、±400％、±500％或至少±1000％。

[0165] 替代地或另外，测试样品中的存在或量不同于对照样品中的平均存在或量，与对照样品中的平均存在或量相差至少>1标准差，例如与对照样品中的平均存在或量相差≥1.5、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、≥11、≥12、≥13、≥14或≥15标准差。可使用任何合适的手段来确定标准偏差(例如，Welford的直接平方和)，然而，在一个实施例中，使用直接方法(即[样品减去平均值的平方和，除以样品数]的平方根)确定标准偏差。

[0166] 替代地或另外，“与对照样品中的存在和/或量不同”包括以统计学上的显著方式，测试样品中的存在或量与对照样品中的量不相关。“以统计学上显著方式与对照样品中的量不相关”意指或包括测试样品中的存在或量与对照样品中的存在或量相关，其中p值为>0.001，例如>0.002、>0.003、>0.004、>0.005、>0.01、>0.02、>0.03、>0.04、>0.05、>0.06、>
0.07、>0.08、>0.09或>0.1。可以使用任何合适的用于确定技术人员已知的p值的手段，包括z-测试、t-测试、学生t-测试、f-测试、曼-惠特尼U测试(Mann-Whitney U test)、威尔科克森符号秩测试(Wilcoxon signed-rank test)和皮尔森卡方测试(Pearson's chi-squared test)。

[0167] 在一个实施例中，本发明的方法可以进一步包含以下步骤或由以下步骤组成：

[0168] (e)提供以下一个或多个(阳性)对照样品；

[0169] (i)患有胰腺癌的个体(即阳性对照)；和/或

[0170] (ii)患有胰腺癌的个体，其中样品与测试样品处于同一分期；和

[0171] (f)通过测量步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在对照样品中的存在和/或量来确定对照样品的生物标志物特征；

[0172] 其中，在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量对应于步骤(f)中测量的一种或多种生物标志物在对照样品中的存在和/或量的情况下，识别胰腺癌相关疾病状态。

[0173] 因此，本发明的方法可包含步骤(c)+(d)和/或步骤(e)+(f)。

[0174] “对应于对照样品中的存在和/或量”包括存在和/或量与阳性对照样品的存在和/或量一致；或比一个或多个阴性对照样品更接近于一个或多个阳性对照样品的存在和/或量(或对应于预定的表示相同的存在和/或量的参考值)。优选地，存在和/或量在一个或多个对照样品的存在和/或量(或对照样品的平均值)的±40％内，例如，在在一个或多个对照样品(例如，阳性对照样品)的±39％、±38％、±37％、±36％、±35％、±34％、±33％、±32％、±31％、±30％、±29％、±28％、±27％、±26％、±25％、±24％、±23％、±22％、±
21％、±20％、±19％、±18％、±17％、±16％、±15％、±14％、±13％、±12％、±11％、±
10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.05％内或0％内。

[0175] 替代地或另外，测试样品中的存在或量不同于对照样品中的平均存在或量，与对照样品中的平均存在或量相差≤5标准差，例如，≤4.5、≤4、≤3.5、≤3、≤2.5、≤2、≤1.5、≤1.4、≤1.3、≤1.2、≤1.1、≤1、≤0.9、≤0.8、≤0.7、≤0.6、≤0.5、≤0.4、≤0.3、≤0.2、≤0.1或0标准差，其条件是不同和相应的生物标志物表达的标准差范围不重叠(例如邻接但不重叠)。

[0176] 替代地或另外，“对应于对照样品中的存在和/或量”包括以统计学上的显著方式，测试样品中的存在或量与对照样品本中的量相关。“以统计学上显著方式与对照样品中的量相关”意指或包括测试样品中的存在或量与对照样品中的存在或量相关，其中p值≤0.05，例如≤0.04、≤0.03、≤0.02、≤0.01、≤0.005、≤0.004、≤0.003、≤0.002、≤0.001、≤0.0005或≤0.0001。

[0177] 可以通过技术人员已知的任何合适的手段来确定生物标志物的差异表达(上调或下调)或其缺乏。差异表达确定为至少小于0.05的p值(p＝<0.05)，例如，至少<0.04、<0.03、<0.02、<0.01、<0.009、<0.005、<0.001、<0.0001、<0.00001或至少<0.000001。例如，可以使用支持向量机(SVM)来确定差分表达。

[0178] 在一个实施例中，SVM是或衍生自下表6中描述的SVM。

[0179] 本领域的普通技术人员应了解，差异表达可以涉及单个生物标志物或视为组合的多个生物标志物(即作为生物标志物特征)。因此，p值可与单个生物标志物或一组生物标志物相关。实际上，当单独考虑时，具有大于0.05的差异表达p值的蛋白质在其表达水平视为与一种或多种其它生物标志物组合时仍可以用作本发明的生物标志物。

[0180] 如所附实例中所例示的，组织、血液、血清或血浆测试样品中某些蛋白质的表达可指示个体中的胰腺癌。例如，单个测试样品中某些血清蛋白的相对表达可指示个体中存在胰腺癌。

[0181] 在替代或另外的实施例中，可以将步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量与表示步骤(d)和/或(f)中的测量值的预定参考值进行比较，即，参考阴性和/或阳性对照值。

[0182] 如上所述，本发明的方法还可以包含在一个或多个阴性或阳性对照样品中测量步骤(b)中在测试样品中测量的一种或多种生物标志物的存在和/或量。

[0183] 例如，一个或多个阴性对照样品可来自在获得样品时没有患有以下的个体：

[0184] (a)胰腺癌，例如腺癌(例如，胰腺导管腺癌或管状乳头状胰腺癌)、胰腺肉瘤、恶性浆液性囊腺瘤、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌；和/或

[0185] (b)非癌性胰腺疾病或病症，例如急性胰腺炎、慢性胰腺炎和自身免疫性胰腺炎；和/或

[0186] (c)任何其它疾病或病症。

[0187] 因此，阴性对照样品可以从健康个体获得。

[0188] 同样，一个或多个阳性对照样品可能来自在获得样品时患有胰腺癌的个体，所述胰腺癌例如腺癌(例如胰腺导管腺癌或管状乳头状胰腺癌)、胰腺肉瘤、恶性浆液性囊腺瘤、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌；和/或非癌性胰腺疾病或病症，例如急性胰腺炎、慢性胰腺炎和自身免疫性胰腺炎；和/或任何其它疾病或病症。

[0189] 在本发明第一方面的一个优选实施例中，在个体上重复所述方法。因此，步骤(a)和(b)可以使用来自同一个体的样品重复，所述样品在不同时间采集到所测试的原始样品(或重复之前的方法)。此类重复测试可以评估疾病进展，例如以确定所选治疗方案的功效和(适当时)选择要采用的替代方案。

[0190] 因此，在一个实施例中，使用距所用的先前测试样品1天至104周之间取得的测试样品重复所述方法，例如，在1周至100周之间、在1周至90周之间、在1周至80周之间、在1周至70周之间、在1周至60周之间、在1周至50周之间、在1周至40周之间、在1周至30周之间、在1周至20周之间、在1周至10周之间、在1周至9周之间、在1周至8周之间、在1周至7周之间、在
1周至6周之间、在1周至5周之间、在1周至4周之间、在1周至3周之间或在1周至2周之间。

[0191] 替代地或另外，使用选自由以下组成的群组的每个时期取得的测试样品可重复所述方法：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、35周、40周、45周、50周、55周、60周、65周、70周、75周、80周、85周、90周、95周、100周、104周、105周、110周、115周、120周、125周和130周。

[0192] 替代地或另外，所述方法可重复至少一次，例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次。

[0193] 替代地或另外，连续重复所述方法。

[0194] 在一个实施例中，重复所述方法直至使用本发明的方法和/或常规临床方法在个体中诊断和/或分期胰腺癌(即，直到确认做出诊断)。

[0195] 合适的常规临床方法是本领域中众所周知的。例如，描述于Ducreux等人，2015，《胰腺癌：用于诊断、治疗和随访的ESMO临床实践指南》，《肿瘤学年鉴》，26(补充5):第56版-第68版和/或Freelove和Walling，2006，《胰腺癌：诊断和管理(Pancreatic Cancer:Diagnosis and Management)》，《美国家庭医生(American Family Physician)》，73(3):
485-492中的那些方法，其以引入的方式并入本文中。因此，可使用选自由以下组成的群组的一种或多种方法确认胰腺癌诊断：计算机断层扫描(优选双相螺旋计算机断层扫描)；经腹部超声波检查；内窥镜超声波检查引导的细针抽吸；内窥镜逆行胆管胰造影术；正电子发射断层扫描；磁共振成像；身体检查；以及活组织检查。

[0196] 替代地和/或另外，可使用用于胰腺癌诊断的已知生物标志物特征来确认胰腺癌诊断。例如，可使用由以下组成的群组中所描述的一种或多种生物标志物或诊断方法来诊断胰腺癌：WO 2008/117067 A9；WO 2012/120288 A2；和WO 2015/067969 A2。

[0197] 在本发明方法的一个优选实施例中，步骤(a)包含提供来自待测个体的血清样品和/或步骤(b)包含测量样品中一种或多种生物标志物的蛋白质或多肽的表达。因此，可以在蛋白质水平下确定用于样品的生物标志物特征。

[0198] 在此类实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)可以使用一种或多种能够结合表A中列出的生物标志物(即蛋白质)的第一结合剂来进行。本领域的普通技术人员应了解，第一结合剂可包含以下或由以下组成：对蛋白质生物标志物之一具有特异性的单一物质，或多种不同物质(每种物质都对不同的蛋白质生物标志物具有特异性)。

[0199] 可以基于结合剂结合给定靶分子的能力，从文库中选择合适的结合剂(也称作结合分子)，如下所论述。

[0200] 在一个优选的实施例中，至少一种类型的结合剂，且更通常所有类型，可包含以下或由以下组成：抗体或其抗原结合片段或其变体。

[0201] 产生和使用抗体的方法是本领域中众所周知的，例如参见《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，1988，Harlow和Lane，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，ISBN-13:978-0879693145，《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies：A Laboratory Manual)》，1998，Harlow和Lane，冷泉港出版社，ISBN-13:978-0879695446和《制作和使用抗体：实践手册(Making and Using Antibodies：A Practical Handbook)》，2006，Howard和Kaser，CRC出版社，ISBN-13:978-0849335280(其公开内容以引入的方式并入本文中)。

[0202] 因此，片段可含有可变重(VH)或可变轻(VL)结构域中的一个或多个。例如，术语抗体片段包括Fab样分子(Better等人(1988)《科学(Science)》240，1041)；Fv分子(Skerra等人(1988)《科学》240，1038)；其中VH和VL配对结构域通过柔性寡肽连接的单链Fv(ScFv)分子(Bird等人(1988)《科学》242，423；Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85，5879)和包含分离的V结构域的单结构域抗体(dAb)(Ward等人(1989)《自然(Nature)》341，544)。

[0203] 例如，结合剂可以是scFv分子。

[0204] 术语“抗体变体”包括任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交物，如但不限于：通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区域和/或恒定区域的噬菌体呈现产生的单链抗体分子，或本领域的普通技术人员已知的能够以免疫测定形式与抗原结合的其它免疫交互式分子。

[0205] 涉及保留抗体片段特异结合位点的抗体片段的合成的技术的一般性综述可见于Winter和Milstein(1991)《自然(Nature)》349，293-299。

[0206] 可以以分子文库，如抗体文库(Clackson等人，1991，《自然(Nature)》，352，624-628；Marks等人，1991《，分子生物学杂志(J Mol Biol)》，222(3):581-97)、肽文库(Smith，
1985《，科学(Science)》，228(4705):1315-7)、表达的cDNA文库(Santi等人，(2000)《分子生物学杂志(J Mol Biol)》296(2):497-508)、除抗体框架以外的其它支架，如亲和抗体的文库(Gunneriusson等人，1999，《应用环境微生物学(Appl Environ Microbiol)》65(9):
4134-40)，或基于适体的文库(Kenan等人，1999，《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》
118，217-31)，作为来源从其中选择对既定基序具有特异性的结合分子以用于本发明的方法。

[0207] 方便地，结合剂可以固定在表面上(例如，在多孔板或阵列上)；见以下实例。

[0208] 在本发明方法的一个实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)使用包含能够结合一种或多种生物标志物的第二结合剂的测定进行，所述第二结合剂包含可检测部分。例如，固定的(第一)结合剂可以最初用于将蛋白质生物标志物‘捕获’到微阵列的表面上，并且然后可以使用第二种结合剂来检测‘捕获的’蛋白质。

[0209] 第二结合剂可以如上文关于(第一)结合剂(如抗体或其抗原结合片段)所述。

[0210] 本领域技术人员应了解，在进行步骤(b)之前，可以用可检测部分标记测试样品中的一种或多种生物标志物(例如，蛋白质)。同样地，用可检测部分可标记对照样品中的一种或多种生物标志物。

[0211] 替代地或另外，第一和/或第二结合剂可以用可检测部分标记。

[0212] “可检测部分”包括以下含义：所述部分是可被检测的部分，并且可确定所述部分的相对量和/或位置(例如，阵列上的位置)。

[0213] 合适的可检测部分是本领域中众所周知的。例如，可检测部分可选自由以下组成的群组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶促部分。

[0214] 在一个优选的实施例中，可检测部分是生物素。

[0215] 因此，可检测部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分，其在暴露于特定条件时可被检测。例如，荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度的辐射(即光)以引起荧光部分的激发，从而使荧光部分能够以可以检测的特定波长发射可检测荧光。

[0216] 替代地，可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化成可以可视化和/或检测的可检测产物的酶。在下文中关于例如ELISA测定更详细地论述合适的酶的实例。

[0217] 在另一个替代方案中，可检测部分可以是放射性原子，其可用于成像。合适的放射性原子包括用于闪烁扫描研究的99mTc和123I。其它易于检测的部分包括例如，用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，如再次的123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，待检测的试剂(如本文所述的测试样品和/或对照样品中的一种或多种生物标志物和/或用于检测所选蛋白质的抗体分子)必须具有足够的合适的原子同位素以使可检测部分易于检测。

[0218] 用于检测血清或血浆蛋白的优选测定包括酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫辐射测量测定(IRMA)和免疫酶促测定(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定。例示性夹心测定由David等人在美国专利第4,376,110号和第4,486,530号中所描述，其以引用的方式并入本文中。载玻片上细胞的抗体染色可用于细胞学实验室诊断测试中众所周知(如本领域的普通技术人员众所周知的)的方法。

[0219] 方便地，所述测定是ELISA(酶联免疫吸附测定)，其通常涉及通常在固相测定中使用产生有色反应产物的酶。已经广泛使用如辣根过氧化物酶和磷酸酶的酶。扩增磷酸酶反应的一种方法是使用NADP作为底物产生NAD，其现在充当第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的焦磷酸酶提供了良好的缀合物，因为酶不存在于组织中，是稳定的并且产生良好的反应颜色。也可以使用基于如荧光素酶的酶的化学发光系统。

[0220] ELISA方法是本领本领域中众所周知的，例如参见《ELISA指南(分子生物学中的方法)(The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology))》，2000，Crowther，Humana Press，ISBN-13:978-0896037281(其公开内容以引用的方式并入)。

[0221] 替代地，经常使用与维生素生物素的缀合，因为这可以通过其与酶结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的反应容易地检测到，其以极大的特异性和亲和力与其结合。

[0222] 在一个优选的实施例中，步骤(b)、(d)和/或步骤(f)可以使用阵列进行。

[0223] 阵列本身是本领域中众所周知的。通常，其由线性或二维结构形成，所述线性或二维结构具有间隔开的(即离散的)区域(“斑点”)，每个区域具有有限的区域，其形成在固体载体的表面上。阵列也可以是珠粒结构，其中每个珠粒可以通过分子编码或颜色编码识别或者以连续流动识别。还可以依序进行分析，其中样品通过一系列斑点，每个斑点从溶液中吸附一类分子。固体载体通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体载体可呈以下形式：管状物、珠粒、盘状物、硅片、微孔板、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、其它多孔膜、无孔膜(尤其例如塑料、聚合物、有机玻璃、硅)、多个聚合物针或多个微量滴定孔，或任何其它适用于固定蛋白质、聚核苷酸和其它合适分子和/或进行免疫测定的表面。结合过程是本领域中众所周知的，并且一般由交联共价结合或物理吸附蛋白质分子、聚核苷酸等至固体载体组成。通过使用众所周知的技术，如接触或非接触印刷、掩模或光刻，可以定义每个斑点的位置。有关评论，请参见Jenkins、R.E.、Pennington、S.R.(2001，《蛋白质组研究(Proteomics)》，2,13-29)和Lal等人(2002，《今日药物发现(Drug Discov Today)》15；7(18补充):S143-9)。

[0224] 通常，阵列是微阵列。“微阵列”包括具有至少约100/cm2，并且优选至少约1000/cm2的离散区密度的区阵列的含义。微阵列中的区域具有典型维度，例如直径，在约10-250μm的范围内，并且与阵列中的其它区域分离约相同的距离。阵列也可以是宏阵列或纳米阵列。

[0225] 一旦识别和分离了合适的结合分子(如上所述)，技术人员可以使用分子生物学领域众所周知的方法制造阵列。

[0226] 阵列格式的实例描述与以下实例和其中引用的参考文献中；例如，参见Steinhauer等人，2002；Wingren和Borrebaeck，2008；Wingren等人，2005，Delfani等人，
2016(其公开内容以引入的方式并入本文中)。

[0227] 因此，在例示性实施例中，所述方法包含：

[0228] (i)用生物素标记样品(例如血清)中存在的生物标志物；

[0229] (ii)使生物素标记的蛋白质与包含多个scFv的阵列接触，所述scFv固定在其表面上的离散位置，所述scFv对表A中的蛋白质中的一种或多种具有特异性；

[0230] (iii)使生物素标记的蛋白质(固定在scFv上)与包含荧光染料的抗生蛋白链菌素缀合物接触；和

[0231] (iv)检测阵列表面上离散位置处染料的存在

[0232] 其中染料在阵列表面上的表达指示样品中来自表A的生物标志物的表达。

[0233] 在一个替代实施例中，步骤(b)、(d)和/或(f)包含测量编码一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。

[0234] 核酸分子可以是基因表达中间体或其衍生物，如mRNA或cDNA。

[0235] 因此，使用选自由以下组成的群组的方法进行步骤(b)、(d)和/或(f)中一种或多种生物标志物的表达的测量：南方杂交、北方杂交、聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、自动射线照相术和原位杂交。

[0236] 例如，使用一个或多个结合部分可进行步骤(b)、(d)和/或(f)中一种或多种生物标志物的表达的测量，所述结合部分能够各自独立地选择性地与编码表A中所识别的生物标志物之一的核酸分子结合。

[0237] 方便地，一个或多个结合部分各自包含核酸分子或由核酸分子组成，如DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO。

[0238] 有利地，一个或多个结合部分的长度为5至100个核苷酸。例如，长度为15至35个核苷酸。

[0239] 应了解，基于核酸的结合部分可包含可检测部分。

[0240] 因此，可检测部分可选自由以下组成的群组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如放射性原子)；或酶促部分。

[0241] 替代地或另外，可检测部分包含放射性原子或由放射性原子组成，所述放射性原子例如选自由以下组成的群组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。

[0242] 替代地或另外，结合部分的可检测部分可以是荧光部分。

[0243] 在进一步的实施例中，核酸分子是循环肿瘤DNA分子(ctDNA)。

[0244] 适合检测ctDNA的方法现在是行之有效的；例如，参见路易斯(Lewis)等人，2016，《胃肠病学世界杂志(World J Gastroenterol.)》22(32):7175-7185及其中引用的参考文献，其公开内容以引用的方式并入本文中)。

[0245] 如上所述，步骤(a)(和/或步骤(c)和/或(e))中提供的样品可选自由以下组成的群组：未分级的血液、血浆、血清、组织液、胰腺组织、乳汁、胆汁和尿液。

[0246] 方便地，步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的样品是血清。

[0247] 通过适当选择表A中的一些或所有生物标志物，任选地与一种或多种其它生物标志物结合，本发明的方法对于胰腺癌的诊断表现出高预测准确度。

[0248] 因此，如通过ROC AUC值所确定的，所述方法的预测准确度可为至少0.50，例如至少0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98或至少0.99。

[0249] 因此，在一个实施例中，如通过ROC AUC值所确定的，所述方法的预测准确度为至少0.90。

[0250] 在本发明的方法中，在步骤(b)(和/或步骤(d)和/或(e))中获得的‘原始’数据在达到诊断之前经历一个或多个分析步骤。例如，原始数据可能需要针对一个或多个控制值进行标准化(即，归一化)。

[0251] 通常，使用支持向量机(SVM)进行诊断，如可从http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html获得的那些(例如e1071 1.5-24)。然而，也可以使用任何其它合适的手段。

[0252] 支持向量机(SVM)是一组用于分类和回归的相关监督学习方法。给定一组训练实例，每个实例标志为属于两个类别之一，SVM训练算法构建模型，所述模型预测新实例是否落入一个类别或另一个类别之中。直观地，SVM模型将实例表示为空间中的点，映射使得单独类别的实例除以尽可能宽的明显空位。然后将新的实例映射到同一空间，并基于所述新实例落入的空位的一侧预测属于一个类别。

[0253] 更正式地，支持向量机在高维或无限维空间中构造超平面或超平面集，其可用于分类、回归或其它任务。直观地，通过与最接近的任何类型训练数据点具有最大距离(所谓的功能容限)的超平面来实现良好分离，因为通常容限越大，分类器的泛化误差越低。有关SVM的更多信息，参阅例如Burges，1998，《数据挖掘和知识发现(Data Mining and Knowledge Discovery)》，2:121-167。

[0254] 在本发明的一个实施例中，在使用来自具有已知疾病状态的个体的生物标志物谱(例如，已知患有胰腺癌的个体、已知患有急性炎性胰腺炎的个体、已知患有慢性胰腺炎的个体或已知健康的个体)进行本发明的方法之前，‘训练’SVM。通过运行此类训练样品，SVM能够了解哪些生物标志物谱与胰腺癌相关。一旦训练过程完成，SVM就能够确定所测试的生物标志物样品是否来自患有胰腺癌的个体。

[0255] 但是，可以通过使用必要的训练参数对SVM进行预编程来绕过此训练过程。例如，可以基于表A中列出的任何或所有生物标志物的测量，使用表6中详述的SVM算法，根据已知的SVM参数进行诊断。

[0256] 本领域技术人员应了解，可以通过使用适合的数据(即来自患有已知胰腺癌状态的个体的生物标志物测量)选择训练SVM机，来确定针对表A中所列出的生物标志物的任何组合的合适的SVM参数。替代地，可根据本领域已知的任何其它合适的统计方法使用实例和图示的数据来确定特定的胰腺癌相关疾病状态。

[0257] 优选地，本发明的方法的准确度为至少60％，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％准确度。

[0258] 优选地，本发明的方法的灵敏度为至少60％，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％灵敏度。

[0259] 优选地，本发明的方法的特异性为至少60％，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％特异性。

[0260] “准确度”意指方法的正确结果的比例，“灵敏度”意指被正确分类为阳性的所有胰腺癌阳性样品的比例，并且“特异性”意指被正确分类为阴性的所有胰腺癌阴性样品的比例。

[0261] 可以使用本领域技术人员已知的任何合适的手段来定量信号强度，例如使用Array-Pro(Media Cybernetics)。可对信号强度数据进行归一化(即调整技术变量)。可使用技术人员已知的任何合适的方法进行归一化。替代地或另外，使用经验贝叶斯(Bayes)算法ComBat(Johnson等人，2007)对数据进行归一化。

[0262] 可以使用本领域中众所周知的方法进行精制数据的进一步统计分析，如PCA，通过ANOVA的q值计算，和/或Qlucore Omics Explorer中的倍数变化计算。

[0263] 如上所述，第一(‘训练’)数据集可用于识别例如来自表A的生物标志物的组合，以用作胰腺癌诊断的生物标志物特征。可以使用已知算法(如反向消除或BE算法)来进行训练数据集的数学分析，以确定最合适的生物标志物特征。然后可以针对新的(‘验证’)数据集验证给定生物标志物组合(特征)的预测准确度。在实施例中详细描述了此方法。

[0264] 本领域的普通技术人员应了解，测试的个体可具有任何种族或地理来源。替代地，测试的个体可具有所定义的亚群，例如，基于种族和/或地理来源。例如，测试的个体可以是高加索人和/或中国人(例如，汉族人)。

[0265] 通常，在治疗胰腺癌(例如，切除、化学疗法、放射疗法)之前提供步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的样品。

[0266] 在一个实施例中，所测试的个体患有选自由慢性胰腺炎、遗传性胰腺导管腺癌和Peutz-Jeghers综合征组成的群组的一种或多种病症。

[0267] 待诊断的胰腺癌可选自由以下组成的群组：腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌和具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌。优选地，胰腺癌是胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma)。更优选地，胰腺癌是胰腺导管腺癌，也称为外分泌胰腺癌。

[0268] 本发明第一方面的一个优选实施例包括在对患有胰腺癌的个体进行阳性诊断之后，为个体提供胰腺癌治疗的附加步骤。

[0269] 因此，本发明的相关方面提供了治疗患有胰腺癌的个体的方法，其包含以下步骤：

[0270] (a)使用根据本发明的第一方面的方法诊断个体患有胰腺癌；和

[0271] (b)治疗被诊断出患有胰腺癌的个体(例如，参见Thota等人，2014，《肿瘤学(Oncology)》28(1):70-4，其公开内容以引入的方式并入本文中)。

[0272] 胰腺癌治疗可选自由以下组成的群组：手术、化学疗法、免疫疗法、化学免疫疗法、热化学疗法、放射疗法及其组合。例如，胰腺癌治疗可以是AC化学疗法；卡培他滨和多烯紫杉醇化学疗法 CMF化学疗法；环磷酰胺；EC化学疗法；ECF化学疗法；E-CMF化学疗法(Epi-CMF)；艾日布林 FEC化学疗法；FEC-T化学疗法；氟尿嘧啶(5FU)；
GemCarbo化学疗法；吉西他滨吉西他滨和顺铂化学疗法；(GemCis或
GemCisplat)；GemTaxol化学疗法；艾达霉素脂质体多柔比星
丝裂霉素(丝裂霉素C )；米托蒽醌；MM化学疗法；MMM化学疗法；紫杉醇
TAC化学疗法；克癌易和环磷酰胺(TC)化学疗法；长春碱长春新碱
长春地辛和长春瑞宾

[0273] 因此，本发明的另一方面提供了用于治疗胰腺癌的抗肿瘤剂(或其组合)，其中其剂量方案是基于本发明第一方面的方法的结果确定的。

[0274] 本发明的相关方面提供抗肿瘤剂(或其组合)在治疗胰腺癌中的用途，其中其剂量方案是基于本发明第一方面的方法的结果确定的。

[0275] 本发明的另一个相关方面提供抗肿瘤剂(或其组合)在制造用于治疗胰腺癌的药物中的用途，其中其剂量方案是基于本发明第一方面的方法的结果确定的。

[0276] 因此，本发明还提供了治疗胰腺癌的方法，其包含给患者投与有效量的抗肿瘤剂(或其组合)，其中有效治疗胰腺癌的抗肿瘤剂(或其组合)的量是基于本发明第一方面的方法的结果确定的。

[0277] 在一个实施例中，抗肿瘤剂包含或由以下组成：烷基化剂(ATC编码L01a)、抗代谢物(ATC编码L01b)、植物碱或其它天然产物(ATC编码L01c)、细胞毒性抗生素或相关物质(ATC编码L01d)，或另一种抗肿瘤剂(ATC编码L01x)。

[0278] 因此，在一个实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的烷基化剂组成：氮芥类似物(例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、甲川氯、异环磷酰胺、曲磷胺、泼尼莫司汀或苯达莫司汀)、烷基磺酸盐(例如白消安、曲奥舒凡或甘露舒凡)、乙烯亚胺(例如噻替派、三亚胺醌或卡波醌)、亚硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、福莫司汀、尼莫司汀或雷莫司汀)、环氧化物(例如依托格鲁)，或另一种烷基化剂(ATC编码L01ax，例如二溴甘露醇、哌泊溴烷、替莫唑胺或达卡巴嗪。

[0279] 在另一个实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的抗代谢物组成：叶酸类似物(例如甲氨蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞或普拉曲沙)、嘌呤类似物(例如巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨，氟达拉滨，氯法拉滨或奈拉滨)或嘧啶类似物(例如阿糖胞苷、氟尿嘧啶(5-FU)、喃氟啶、卡莫氟、吉西他滨、卡培他滨、阿扎胞苷或地西他滨)。

[0280] 在再一实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的植物碱或其它天然产物组成：长春花属生物碱或长春花属生物碱类似物(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或长春氟宁)、鬼臼毒素衍生物(例如依托泊苷或替尼泊苷)、秋水仙碱衍生物(例如秋水仙碱)、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇、多西紫杉醇或聚谷氨酸紫杉醇)或另一种植物碱或天然产物(ATC编码L01cx，例如曲贝替定)。

[0281] 在一个实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的细胞毒性抗生素或相关物质组成：放线菌素(例如放线菌素D)、蒽环霉素或相关物质(例如阿霉素、柔红霉素、表柔比星、阿克拉霉素、左柔比星、艾达霉素、米托蒽醌、吡柔比星、戊柔比星、氨柔比星或派蒽醌)或另一种(ATC编码L01dc，例如博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素或伊沙匹隆)。

[0282] 在又一实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的一种抗肿瘤剂组成：铂化合物(例如顺铂、卡铂、奥克赛铂、赛特铂或聚铂)、甲基肼(例如丙卡巴肼)、单克隆抗体(例如依决洛单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、吉妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、卡托莫西单抗或奥法木单抗)、用于光动力/放疗的敏化剂(例如卟吩姆钠、氨基乙酰丙酸甲酯、氨基乙酰丙酸、替莫泊芬或乙丙昔罗)或蛋白激酶抑制因子(例如伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、索拉非尼、达沙替尼、拉帕替尼、尼罗替尼、坦西莫司、依维莫司、帕唑帕尼、凡德他尼、阿法替尼、马赛替尼或托赛拉尼)。

[0283] 在再一实施例中，抗肿瘤剂包含或由选自由以下组成的群组的一种抗肿瘤剂组成：安吖啶、天冬酰胺酶、六甲蜜胺、羟基脲、氯尼达明、喷司他汀、米替福新、马索罗酚、雌氮芥、维甲酸、丙脒腙、拓朴替康、噻唑呋林、伊立替康(坎普土沙)、亚利崔托宁、米托坦、培门冬酶、贝瑟罗汀、三氧化二砷、地尼白介素、硼替佐米、塞内昔布、阿那格雷、奥利默森、塞西马集、伏立诺他、罗米地辛、高三尖杉酯、艾日布林或亚叶酸。

[0284] 在一个实施例中，抗肿瘤剂包含或由一种或多种抗肿瘤剂(例如本文所定义的一种或多种抗肿瘤剂)的组合组成。用于治疗胰腺癌的联合治疗的一个实例是FOLFIRINOX，其由以下四种药物构成：

[0285] ·FOL-亚叶酸(甲酰四氢叶酸)；

[0286] ·F-氟尿嘧啶(5-FU)；

[0287] ·IRIN-伊立替康(坎普土沙)；和

[0288] ·OX-奥克赛铂(奥沙利铂)。

[0289] 因此，通过组合来自上述方法的某些任选实施例，本发明可提供用于诊断和治疗个体中的胰腺癌(例如，I或II期)的方法，所述方法包含：

[0290] (a)获得或提供用于人类患者的血清或血浆样品；

[0291] (b)检测来自表A的一种或多种(例如所有)蛋白质生物标志物是否存在于样品中(例如通过使样品与一种或多种抗体或其抗原结合片段接触，每种抗体或其抗原结合片段对其中一种生物标志物具有特异性并检测所述抗体或片段与所述生物标志物的结合)；

[0292] (c)基于样品中一种或多种蛋白质生物标志物的量诊断患有胰腺癌(例如I或II期)的患者；和

[0293] (d)向诊断的患者投与有效量的化学治疗剂(例如吉西他滨)和/或全部或部分地手术除去胰腺和/或投与放射疗法。

[0294] 应了解，步骤(b)可以包含例如确定表A中列出的所有生物标志物(排除IL-6和GEM)与C1q一起的样品中的存在和/或量。此步骤可包含使用如本文所述的阵列，例如，包含多个scFv，其具有固定在阵列板表面上的生物标志物的特异性。

[0295] 应了解，步骤(c)可以包含一个或多个进一步的临床研究(如测试活组织检查样品和/或患者的体内成像)以确认或确立诊断。

[0296] 应了解，步骤(d)可包含投与化学治疗剂和/或手术和/或放射疗法的组合。

[0297] 在一个优选的实施例中，患者被诊断患有可切除的胰腺癌(例如，I或II期)，并且步骤(d)包含全部或部分地手术去除胰腺(例如，使用胰十二指肠切除术以去除胰头或全胰腺切除术)以及化学疗法(例如吉西他滨和/或5-氟尿嘧啶)。应了解，化学疗法可手术之前和/或之后投与。

[0298] 在一个实施例中，此类方法允许在疾病的表型呈现之前(即在可观察到的临床症状发展之前)诊断早期胰腺癌。因此，所述方法可用于诊断无症状患者的胰腺癌，尤其是那些患有胰腺癌的高风险患者，如具有疾病家族史的那些患者、吸烟者、肥胖个体、糖尿病个体和患有以下的个体：慢性胰腺炎、慢性乙型肝炎感、胆石症和/或相关的遗传易感性(例如Peutz-Jeghers综合症、家族性非典型多发性黑色素瘤综合征、Lynch综合征、BRCA1突变和/或BRCA2突变)。有效监测这些高风险个体可以早期诊断胰腺癌，从而大大提高生存机会。

[0299] 本发明的另一方面提供了用于治疗受试者中的胰腺癌相关疾病状态的方法，所述方法包含以下或由以下组成：对受试者投与胰腺癌治疗，其中所述受试者具有本发明的生物标志物特征表明受试者中的胰腺癌相关疾病状态的存在。胰腺癌治疗可以是切除、化学疗法和/或放射疗法。在一个实施例中，胰腺癌治疗包含投与至少一种抗肿瘤剂，如上所述。

[0300] 所述方法可以进一步包含(例如，在治疗之前)测量选自表A中定义的组的一种或多种生物标志物(例如，表A中的所有生物标志物)在测试样品中的存在和/或量。所述方法可以包含确定来自受试者的测试样品的生物标志物特征(例如，在治疗之前)，如上所述。

[0301] 本发明的另一个方面提供用于检测在生物样品中的或属于生物样品(例如血清样品)的临床显著性(例如诊断和/或预测预测)的生物标志物特征的方法，所述方法包含如上定义的与本发明的第一方面有关的步骤(a)和(b)。生物标志物特征包含以下或由以下组成：表A中的所有生物标志物。

[0302] 本发明的另一方面提供了用于诊断或确定个体中胰腺癌相关疾病状态的阵列，所述阵列包含一种试剂或多种试剂(如任何上述结合剂)，其用于检测表A中所定义的一种或多种生物标志物在样品中的存在。

[0303] 因此，阵列适合于进行根据本发明第一方面的方法。

[0304] 在蛋白质水平或核酸水平下，阵列包含一种或多种能够(单独地或共同地)结合表A中定义的一种或多种生物标志物的结合剂。

[0305] 在一个优选的实施例中，阵列包含一种或多种抗体或其抗原结合片段，其能够(单独地或共同地)在蛋白质水平下与表A中定义的一种或多种生物标志物结合。例如，阵列可包含scFv分子，其能够(共同地)在蛋白质水平下结合表A中定义的所有生物标志物。

[0306] 在一个替代实施例中，阵列包含一种或多种抗体或其抗原结合片段，其能够(单独地或共同地)结合以下生物标志物：

[0307] DLG1、PRKCZ、VEGF、C3、C1INH、IL-4、IFNγ、C5、PTK6、CHP1、APLF、CAMK4、MAGI、MARK1、PRDM8、APOA1、CDK2、HADH2、C4、VSX2/CHX10、ICAM-1、IL-13、路易斯x/CD15、MYOM2、Factor P、唾液酸化路易斯x、TNFβ和补体C1q

[0308] (任选地包括来自表B的一种或多种生物标志物和/或IL-6和/或GEM)。

[0309] 应了解，阵列可包含一个或多个阳性和/或阴性对照样品。例如，方便地，阵列包含牛血清白蛋白作为阳性对照样品和/或磷酸盐缓冲盐水作为阴性对照样品。

[0310] 方便地，阵列包含表7中的一种或多种，例如所有抗体。

[0311] 有利地，阵列包含表8中的一种或多种，例如所有抗体。

[0312] 本发明的另一方面提供了选自表A中定义的组的一种或多种生物标志物作为用于确定个体中胰腺癌相关疾病状态的生物标志物的用途。

[0313] 例如，表A中定义的所有生物标志物(例如蛋白质)可以一起用作用于确定个体中胰腺癌的存在的诊断特征。

[0314] 本发明的另一方面提供了用于诊断或确定个体中胰腺癌相关疾病状态的试剂盒，其包含：

[0315] (a)根据本发明的阵列或用于制造所述阵列的组件；和

[0316] (b)用于进行如上定义的方法(例如，在本发明的第一方面中)的说明书。

[0317] 本发明的另一方面提供了一种或多种与如本文所述的生物标志物(例如表A)的结合部分在制备用于诊断或确定个体中胰腺癌相关疾病状态的试剂盒中的用途。因此，在如试剂盒的制备中，可以使用多种不同的结合部分，每种结合部分靶向不同的生物标志物。在一个实施例中，结合部分是如本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)。

[0318] 本发明的另一方面提供了治疗个体中胰腺癌的方法，其包含以下步骤：

[0319] (a)根据本发明的第一方面任何中所定义的方法确定胰腺癌相关疾病状态；和

[0320] (b)为个体提供胰腺癌治疗。

[0321] 例如，胰腺癌治疗可选自由以下组成的群组：手术(例如切除)、化学疗法、免疫疗法、化学免疫疗法和热化学疗法(参见上文)。

[0322] 本发明的另一方面提供了用于操作本发明方法的计算机程序，例如，用于解释步骤(c)(和随后的表达测量步骤)的表达数据，从而诊断或确定胰腺癌相关疾病状态。计算机程序可以是编程SVM。计算机程序可以记录本领域的普通技术人员已知的合适的计算机可读载体上。合适的计算机可读载体可包括压缩盘(包括CD-ROM、DVD、蓝光等)、软盘、闪存驱动器、ROM或硬盘驱动器。计算机程序可以安装在适合于执行计算机程序的计算机上。

[0323] 现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选、非限制性实施例：

[0324] 图1.斯堪的纳维亚(Scandinavian)队列中个体PDAC分期的分类

[0325] 使用SVM LOO交叉验证，当使用所有349种抗体从不同PDAC分期的患者样品中分类NC时，得到所示数据。结果用(A)I期、(B)II期、(C)III期和(D)IV期PDAC的ROC曲线及其相应的AUC值展示。

[0326] 图2.使用生物标志物特征对斯堪的纳维亚队列中的PDAC分期进行分类

[0327] 利用来自斯堪的纳维亚研究的数据，建立了基于冻结SVM的预测模型。使用反向消除算法，将两个生物标志物特征定义为分别来自I/II期PDAC和(B)III/IV期PDAC的(A)NC样品的分类。结果展示为ROC曲线及其相应的AUC值。

[0328] 图3.验证来自美国队列的I/II期PDAC中的共识特征。

[0329] 通过对(A)NC与I/II期PDAC患者和(B)I/II期PDAC患者与慢性胰腺炎患者的分类，在独立的美国队列中验证了斯堪的纳维亚队列产生的共识特征。结果展示为代表性的ROC曲线及其相应的AUC值。

[0330] 图4.在不同PDAC分期之间差异表达的血清标志物

[0331] 通过多组ANOVA识别在I至IV期的进展中差异表达的血清标志物。展示的是最重要的标志物。罗马数字表示PDAC分期。*:p<0.05，q>0.05且**:p<0.05，q<0.05

[0332] 图5.糖尿病对NC与PDAC分类准确度的影响

[0333] 使用NC与PDAC上训练的SVM模型的决策值来分析发现队列中糖尿病和非糖尿病PDAC样品之间的差异。使用Wilcoxon符号秩测试计算显著性值。

[0334] 图6来自NC样品的IPMN分期的分类

[0335] 共识特征用于对NC与不同IPMN分期进行分类。来自美国队列的所有IPMN样品被进料到已经在NC与PDAC上训练的SVM模型中。使用Wilcoxon符号秩测试计算显著性值。产生的p值为：NC与PDAC：2.23×10-18；PDAC与良性IPMN：0.029；PDAC与边界IPMN：0.284；PDAC与恶性IPMN：0.401。

[0336] 实例

[0337] 摘要

[0338] 背景技术

[0339] 由于弥漫性症状导致晚期诊断，胰腺导管腺癌(PDAC)预后不良，其5年生存率小于10％。如果可以更早地检测到局部肿瘤，则存活率可以显著增加。血液样品的多参数分析用于获得早期PDAC的新型生物标志物特征。所述特征是从大队列明确定义的早期(I/II)PDAC患者开发的，且随后在独立患者队列中进行验证。

[0340] 方法

[0341] 利用重组抗体微阵列平台解密与PDAC相关的生物标志物血清特征。发现研究是来自斯堪的纳维亚的病例/对照研究，由16个I期、132个II期、65个III期、230个IV期患者和888个对照组成。随后在具有15个I期、75个II期、15个III期、38个IV期患者和219个对照的独立的美国病例/对照研究队列中验证所识别的生物标志物特征。

[0342] 结果

[0343] 使用斯堪的纳维亚病例/对照研究，创建了区分衍生自I/II期和III/IV期患者与对照的样品的特征，其ROC-AUC值分别为0.96和0.98。随后，基于所有PDAC分期和对照样品产生由29种生物标志物组成的共识特征。然后在独立的美国病例/对照研究中验证此特征，并使用从I/II期PDAC患者收集的样品产生0.96的ROC-AUC值。

[0344] 结论

[0345] 经验证的血清特征检测到早期局部PDAC具有高灵敏度和特异性，从而为早期诊断铺平了道路。

[0346] 缩略语

[0347] ANOVA，方差分析；AUC，曲线下面积；BE，反向消除；CP，慢性胰腺炎；CV，变量系数；GO，基因本体；IPMN，导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)；LOO，留一法；MT-PBS，磷酸盐缓冲盐水，含1％乳汁和1％吐温-20；NC，正常对照；PBS，磷酸盐缓冲盐水；NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值；PBST，含1％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水；PCA，主成分分析；PDAC，胰腺导管腺癌；
ROC，受试者操作特征；RT，室温；scFv，单链片段变量；SVM，支持向量机

[0348] 介绍

[0349] 在此研究中，I-IV期PDAC患者在大型回顾性斯堪的纳维亚队列中进行分析，然后在独立的美国队列中进行验证，旨在识别简单血液样品中的I/II期相关PDAC生物标志物。

[0350] 方法

[0351] 研究设计

[0352] 在斯堪的纳维亚和美国收集的PDAC血清样品进行的两个回顾性研究根据用于报导诊断准确度研究的标准(STARD)28进行。根据美国癌症联合委员会(AJCC)指南进行PDAC分期。在诊断时、手术前或化学疗法开始时收集并处理来自胰腺癌患者的血液样品。使用相同的标准操作程序(SOP)收集来自正常对照(NC)的血液样品。在两种情况下，随后利用包含针对156种抗原的349种人重组scFv的重组抗体微阵列平台将5μl血清样品用于分析(表5)(参见下文补充方法)。基本原理是靶向对疾病以及肿瘤分泌组的系统反应。因此，所选择的生物标志物主要参与免疫调节。

[0353] 研究队列的人口统计资料

[0354] 斯堪的纳维亚队列包含443个PDAC病例、888个NC和8个导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)(表1)。病例是诊断性的，并且整体切除率约为15％。十六个PDAC样品来自I期，132个来自II期，65个来自III期，并且230个来自IV期患者(表1)。在八个IPMN样品中，五个是良性的，并且三个是恶性的。

[0355] 美国队列包含143个PDAC，57个慢性胰腺炎(CP)和20个IPMN病例以及219个NC(表1)。十五个PDAC样品来自I期，75个来自II期，15个来自III期，并且38个来自IV期患者(表
1)。在20个IPMN案例中，八个是良性的，五个是边界的，并且七个是恶性的。病例是诊断性的，并且整体切除率为18-20％。

[0356] 结果

[0357] 亲和蛋白质组学提供了一些有吸引力的特征，如使用分钟量样品提供高灵敏的测定。本方法基于重组抗体微阵列平台，所述平台由针对156种抗原的349种人重组scFv构成(表5)。由于重点是询问对PDAC及其分泌组的系统反应，所选择的抗体主要靶向参与免疫调节的抗原。两个患者队列-一个斯堪的纳维亚人和一个北美人-包括明确定义的早期PDAC用于识别和验证用于检测I/II期癌症的生物标志物特征。

[0358] 首先，为了询问斯堪的纳维亚病例/对照发现研究中数据集的稳健性，使用LOO交叉验证策略将衍生自具有不同PDAC分期的患者的血清样品与匹配的健康对照进行比较。结果表明，可以高准确度地区分不同的PDAC分期。NC与IA、IB、IIA、IIB、III和IV期的AUC值分别为0.91、1.0、0.99、0.98、0.99和0.98(图1)。值得注意的是，当使用衍生自阵列上所有抗体的信息时，除IA期外，所得AUC水平达到0.98或更高。

[0359] 用定义的生物标志物特征分类I/II期PDAC

[0360] 为了识别最小的生物标志物特征，用最佳预测能力区分I/II期PDAC和NC，将基于SVM的反向消除算法施加到斯堪的纳维亚样品队列上26,29。使用此方法，消除了不改善分类的生物标志物，从而识别提供分离I/II期与NC的最高可能预测能力的特征。此分析产生仅包含排名最高的个体生物标志物的特征(表4)，并且获得用于I/II期与NC的AUC值为0.96(图2A)，其与用于NC与I/II期的94/95％的特异性/灵敏度组合相关。出于比较原因，所获得的用于III/IV期与NC的AUC值为0.98(图2B)。这些值基于对统计稳健性和分类模型稳定性的研究，其中使用四个随机产生的训练/测试集，导致NC与I/II期PDAC的分类的平均AUC值为0.963(范围为0.94-0.98)。NC与III/IV期的相应值为0.985(范围为0.98-0.99)。值得注意的是，最高的预测特征不包括例如CA19-9，一种通常参与PDAC分析的唾液酸化路易斯A抗原，因为其没有提供足够的正交信息。

[0361] 验证独立患者队列中早期I/II PDAC的检测

[0362] 为了在验证研究中获得最高的预测准确度，将排名最高的生物标志物(表4)组合以获得共识特征，其由29种生物标志物组成(表2)。为了验证用于检测早期I/II PDAC患者的共识特征，使用衍生自完全独立的美国队列的样品在连续验证研究中测试此特征。此验证分析证明了I/II期PDAC与NC的高准确区分，ROC-AUC值为0.963(范围为0.94-0.98)，其基于三个训练集(图3A)。这与I/II期的最佳特异性/灵敏度组合95/93％相关。对于III/IV期的相应的最优ROC-AUC值为0.97并且对于I-IV期为91/91％。

[0363] 还分析了区分慢性胰腺炎与PDAC的能力，因为胰腺炎与PDAC的鉴别诊断是潜在的混杂临床因素。来自I/II期PDAC样品的慢性胰腺炎的分类分析导致最佳ROC-AUC值为0.84(图3B)。

[0364] 糖尿病和黄疸对早期PDAC分类的影响

[0365] 还研究了糖尿病对分类准确度的影响。在收集样品时，斯堪的纳维亚队列中的103名(23.3％)PDAC患者为糖尿病患者(表3)，而美国队列中的38名(26.6％)PDAC患者患有糖尿病(表3)。在两个队列中，新发糖尿病(NOD)占糖尿病患者(n＝37)的26.2％。来自SVM模型的决策值用于分析发现队列中糖尿病和非糖尿病PDAC样品之间的任何显著差异。此分析表明，包括NOD在内的糖尿病不是NC与PDAC分类的混杂因素(分别为p＝0.47和0.96)(图3)。在验证队列中施加的相同方法表明黄疸不是一个混杂因素(p＝0.21)。

[0366] 与不同PDAC分期相关的个体血清标志物

[0367] 还分析了显示与I至IV期的进展相关的时间表达模式的个体生物标志物。通过用多组ANOVA询问数据，识别了几种在早期与晚期PDAC患者中差异表达的生物标志物。这些包括磁盘大同源物1、PRDM8，和MAGI-1，其在后期都表现出增加的表达，而备解素、淋巴毒素-α和IL-2在PDAC的早期表达更高(图4)。值得注意的是，除IL-2外，所有这些生物标志物也存在于共识特征(表2)。

[0368] 用经验证的生物标志物特征分类导管内乳头状粘液性肿瘤

[0369] 如果不进行治疗，IPMN经常会发展为侵袭性癌症。因此，临床上感兴趣的是检测这样的病变，使得其可以通过成像来监测，因为这可以提供早期切除癌前病变的机会。因此，测试共识特征是否适用于区分IPMN与NC的不同分期。使用经验证的生物标志物特征对衍生自美国患者队列(表1)的20个IPMN样品进行分类。值得注意的是，所述特征将边界和恶性IPMN分类为具有癌症概况，而良性IPMN被归类为非PDAC(p＝0.029)(图6)。

[0370] 讨论

[0371] 本研究的主要发现是，使用分钟量血清的蛋白质组多参数分析可以高准确度地区分具有早期I/II PDAC的患者和对照。这种诊断方法的临床效用和预期用途可能有几个方面，例如监测(i)高风险患者，如遗传PDAC、慢性胰腺炎和Peutz-Jeghers综合症患者；(ii)50岁以上的后发糖尿病患者，糖尿病前三年内患PDAC的风险增加八倍30,31，和(iii)腹部症状模糊、背部疼痛和体重减轻的患者。

[0372] WHO提出，如果早期进行诊断和治疗，可以使数百万癌症患者免于过早死亡。为实现此目标，必须开发更先进的诊断方法，并施加到早期检测特别致命的癌症，如PDAC。尽管论述32-34了PDAC疾病进展的演化轨迹的事实，但今天可获得临床数据支持以下结论：由于可切除肿瘤4,8-11,35的频率增加，早期诊断导致无症状患者的总存活率益处。为了证明PDAC早期诊断的临床效用，所述测试必须显示低频率的假阳性，否则这将不可避免地导致对患者的不良后果，包括焦虑、过度治疗和增加的成本。考虑到这一风险，我们对PDAC进行了一项大型蛋白质组学研究，包括超过1700个病例/对照样品，并分析了衍生自肿瘤分泌组或系统免疫反应的156种血清蛋白。为了确定人群中生物标志物特征的临床效用，PDAC的患病率影响阳性预测值(PPV)(阳性测试表明疾病的概率)和阴性预测值(NPV)(阴性测试的概率表示没有疾病)。在我们的美国验证队列中，结果表明，特异性高达99％，对于PDAC风险高于一般公众的患者，例如一级亲属(患病率3.75％)和55岁以上的新发糖尿病患者(患病率1.0％)36，PPV/NPV分别为0.75/0.99和0.46/1.0。这种特征对于从对照中区分I/II期具有最高的特异性/灵敏度，所述对照不包括CA19-9，一种通常参与PDAC分析的抗原，其可单独使用或与其它标志物18组合使用。实际上，CA19-9在抗体微阵列上进行了分析，但没有被选择，因为其在反向消除过程中没有提供足够的正交信息。

[0373] 55岁以上的新发糖尿病患者获得PDAC37的风险显著增加，这可被视为癌症的早期指示，这可能导致无症状早期PDAC38的及早检测。、因此，用PDAC诊断糖尿病患者将是重要的，因为其将有助于增加可切除性并增加这些患者的存活率。因此，我们测试了共识生物标志物特征，因为其能够在没有诊断出糖尿病的情况下区分糖尿病PDAC患者和PDAC。支持向量机分析，基于来自两个队列的总共141名患有PDAC的糖尿病患者，其中26.2％显示新发糖尿病，表明衍生自糖尿病与非糖尿病PDAC患者的样品之间没有显著差异(图5)。这意味着经验证的生物标志物特征可能有助于临床上排除糖尿病患者的PDAC，尽管这必须在关注糖尿病患者的临床研究中得到证实。

[0374] PDAC与胰腺炎的鉴别诊断有时很困难，但在先前研究中，我们证明晚期PDAC可区别于不同的胰腺炎性适应症27。先前对不同的胰腺炎亚型(如急性、慢性和自身免疫性胰腺炎)进行了随访研究，其中可以识别与这些亚型相关的生物标志物并区别于PDAC39。尽管目前的研究中慢性胰腺炎样品的数量有限，但我们可以证明慢性胰腺炎可以与早期I/II PDAC区分开来，现在ROC-AUC为0.84(图3B)。此外，胰腺癌前变(IPMN)的正确分类表示相当大的临床值。目前的共识生物标志物特征可以区分衍生自具有病理分期的良性IPMN的患者与I/II期PDAC的患者的样品(图6)，而边界和恶性分期的IPMN被分类为癌症相关，因此不能与PDAC区分。限制是这些结果基于相当少数量的临床样品，但是当在更大的IPMN病例/对照研究中得到验证时，可能有助于检测这些难以诊断的病变。

[0375] 与癌症进展相关的是可以反映血液中的生物标志物含量的肿瘤微环境的逐渐变化。因此，此处获得的数据用于识别其表达模式随分期进展而变化的标志物，即在衍生自早期或晚期PDAC患者的样品中显示不同水平。有趣的是，除了IL-2外，图4中显示的所有蛋白质都存在于共识特征中(表2)。从早期到晚期PDAC表现出最显著增加的表达的标志物之一是DLG1(磁盘大同源物1)，一种多功能支架蛋白，其与例如APC、β-连环蛋白和PTEN相互作用以调节细胞增殖、胞质分裂、迁移和粘附。尽管已报道候选肿瘤抑制因子DLG1表现出致癌功能40，但可能由晚期PDAC中的现有上调支持。MAGI-1(膜相关鸟苷酸激酶，含WW和PDZ结构域的蛋白1)在衍生自晚期PDAC患者的样品中也表现出增加的表达，并且是具有上皮细胞至细胞粘附中提出的功能的支架蛋白。文献中的癌症相关信息很少，但据报道MAGI-1在HPV诱导的恶性肿瘤41中抑制细胞凋亡并刺激细胞增殖。PRDM8(PR结构域锌指蛋白8)，也称为BLIMP-1，在来自晚期患者的样品中增加。这种DNA结合蛋白调节例如神经和类固醇相关的转录，并
42
且是垂体腺瘤中肿瘤发生的调节因子，其中其最有可能促进肿瘤侵袭性的增加。这与我们观察其在晚期患者样品中增加的表达一致。此外，淋巴毒素-α在晚期样品中表现出较低的表达。淋巴毒素-α由TH1型T细胞产生，以诱导吞噬细胞与内皮细胞结合。这种蛋白质的一些多态性有助于增加患腺癌43的风险，尽管先前的映射显示胰腺癌中的蛋白质表达低，这一发现可以解释其在我们的研究44中在PDAC进展期间表达降低。阳性补体调节因子备解素也显示来自晚期PDAC患者的样品中的表达降低。备解素通过增强补体的替代途径来支持炎症和吞噬作用。虽然本质上复杂，但补体活化通常被认为是对癌症的保护作用。不仅补体活化的抑制通常促进癌细胞免疫逃逸，而且也已经显示其阻碍癌症免疫疗法45,46的功效。备解素的表达降低与PDAC中观察到的免疫逃避一致。白细胞介素-2(IL-2)在晚期患者的样品中表现出降低的表达。IL-2刺激活化的T细胞的生长和反应，并用于针对例如肾癌和恶性黑素瘤的
47,48
免疫疗法。一些研究显示，IL-2治疗组合常规治疗可以减轻胰腺癌的进展。进一步研究与PDAC进展相关的血清蛋白可能揭示疾病进展生物学的机制信息。

[0376] 总之，本研究成功地基于PDAC患者的两个大型病例/对照研究来识别和验证生物标志物特征。发现显示此生物标志物特征可以高准确度检测衍生自I/II期PDAC患者的样品，其表明使用血清生物标志物特征在早期诊断胰腺癌的可能性。

[0377] 参考文献

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[0426] 表1.斯堪的纳维亚和北美队列的人口统计资料

[0427] (A)斯堪的纳维亚队列

[0428]

[0429] *代表集大小。其它信息参见生物信息学部分。

[0430] 表1(续)

[0431] (B)美国队列

[0432]

[0433] *代表集大小。其它信息参见生物信息学部分。

[0434] 表2.共识验证特征

[0435] 蛋白质

[0436] 载脂蛋白A1

[0437] Aprataxin和PNK样因子

[0438] 钙调磷酸酶B同源蛋白1

[0439] 钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶IV型

[0440] 补体C3

[0441] 补体C4

[0442] 补体C5

[0443] 细胞周期蛋白-依赖性激酶2

[0444] 磁盘大同源物1

[0445] GTP-结合蛋白GEM

[0446] HADH2蛋白

[0447] 细胞间粘附分子1

[0448] 干扰素γ

[0449] 白细胞介素-13

[0450] 白细胞介素-4

[0451] 白细胞介素-6

[0452] 路易斯x

[0453] 淋巴毒素-α

[0454] 膜相关鸟苷酸激酶，含WW和PDZ结构域的蛋白1

[0455] 肌间蛋白-2

[0456] 血浆蛋白酶C1抑制因子

[0457] PR结构域锌指蛋白8

[0458] 备解素

[0459] 蛋白激酶Cδ型

[0460] 蛋白-酪氨酸激酶6

[0461] 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MARK1

[0462] 唾液酸化路易斯x

[0463] 血管内皮生长因子

[0464] 视觉系统同源盒2

[0465] 补充信息

[0466] 方法

[0467] 研究队列的人口统计资料

[0468] 斯堪的纳维亚队列的对照获自哥本哈根一般人群研究，并根据性别、年龄、吸烟习惯、酒精摄入和采血日期进行匹配。每个案例匹配两个对照。在5年的随访期间，没有对照患有胰腺癌。在PDAC患者中男性与女性的性别平衡为57:43(％)，并且在NC中男性与女性为58:42(％)。PDAC和NC受试者的中值年龄均为68岁。烟草使用被定义为当前或过去的常规使用，而酒精滥用被定义为当前或过去的滥用。基于丹麦卫生局的指南，对于女性和男性，酒精滥用的分离点分别设定为168g和252g酒精/周。PDAC组、对照组和所有受试者的烟草使用者比率经组合分别为66％、60％和62％。酒精滥用的相应值分别为22％、24％和23％(表1)。
在斯堪的纳维亚队列中的所有PDAC患者中，23.3％在样品收集时患有糖尿病，而在血液采样时，I、II、III和IV期PDAC患者分别有25.0％、28.7％、26.2％和19.1％患有糖尿病(表3)。
无论糖尿病状态如何，70％的肿瘤位于头部，20％位于体内，吧10％位于胰尾(表3)。这些比例很好的对应于的肿瘤定位1上通常报告数据。所有其它参数，包括肝脏值和血细胞类型计数，在疾病分期之间是相当的(表3)。对于斯堪的纳维亚队列的分期是基于切除的患者中和活组织检查上和CT扫描用于非切除患者的切除的肿瘤和淋巴结和CT扫描(腹部和胸部)的病理状态。

[0469] 在靶向健康、非癌症对照的血液驱动期间或在非癌症个体的办公室访问期间收集美国队列的对照，并且在样品收集时与PDAC患者的性别和年龄相匹配。在5年的随访期间，没有对照患有胰腺癌。PDAC患者中的男性与女性的性别平衡为56:44(％)，NC中的男性与女性为53:47(％)，慢性胰腺炎(CP)患者的男性与女性的比例为48:52(％)，并且IPMN患者中男性与女性的比例为40:60(％)。PDAC、NC、CP和IPMN受试者的中值年龄分别为67岁、63岁、56岁和69岁。美国队列的分期基于病理状态，除了没有切除的情况，即通常是晚期疾病。对于那些患者，根据临床过程，分期是基于活组织检查或成像。在美国队列中的所有PDAC患者，26.6％在样品收集时患有糖尿病，而在血液采样时，I、II、III和IV期PDAC患者分别有
26.7％、26.7％、20.0％和28.9％患有糖尿病(表3)。两个队列中的IPMN诊断均基于手术获得的病理学。此外，慢性胰腺炎的诊断是通过以下制得：1)症状，即如由胰腺弹性蛋白酶确定的疼痛和/或胰腺功能不全，急性胰腺炎发作后用淀粉酶和脂肪酶测定进行生物化学确认，并用显示胰腺和非胰腺炎症的CT扫描进行腹部成像，和2)成像-所有患者的ERCP显示胰腺导管变化与慢性胰腺炎一致，并且都有CT和/或MRI成像。所有患者都进行了手术以进行引流程序。

[0470] 样品收集

[0471] 斯堪的纳维亚研究表明BIOPAC研究“具有胰腺癌的患者的生物标志物-可以提供疾病的新信息并改善患者的诊断和预后”，所述研究得到了哥本哈根地区伦理委员会(VEK ref.KA-2006-0113)和丹麦数据保护局(jr.no.2006-41-6848、jr.no.2012-58-004和HGH-2015-027、I-suite 03960)的批准。在2008年和2014年期间，在丹麦哥本哈根的Herlev医院和Rigshospitalet收集血清样品。在诊断时，收集血液并使其凝结至少30分钟，并且然后在
4℃下以2330g离心10分钟。将血清等分并储存在-80℃下直至进一步分析。使用相同的SOP收集和处理所有样品并分析血清CA19-9、肝酶和血细胞计数。在样品收集时收集临床数据。

[0472] 美国研究由俄勒冈健康与科学大学的机构审查委员会批准。在任何治疗之前收集血液，使其凝结至少30分钟，并在4℃下以1500g离心10分钟。使用相同的SOP收集和处理所有样品。将血清等分并储存在-80℃下直至进一步分析。

[0473] 数据采集、质量控制和预处理

[0474] 使用Array-Pro Analyzer 软件(Media Cybernetics，Rockville，MD，USA)定量来自抗体微阵列的信号强度。减去局部背景值，并且然后将调整后的强度值用于后续数据分析。数据采集由研究小组的训练有素的成员进行，他们对样品分类和临床数据不知情。除非重复变量系数(CV)超过15％，否则每个数据点表示三个重复斑点/抗体克隆的背景减去信号平均值。在这种情况下，省略了离平均值最远的重复斑点，并使用了两个剩余重复的平均信号。在斯堪的纳维亚和美国研究中，重复的平均CV分别为8.4％和6.7％。

[0475] 通过CV值分析、箱形图和3D主成分分析(PCA)以及方差分析(ANOVA)过滤(Qlucore Omics Explorer，Qlucore AB，Lund，Sweden)，在个体抗体水平上评估来自质量控制样品的原始数据的载玻片间和日间变量。一旦确保了数据集同质性，就将质量控制样品从进一步分析中去除。来自PDAC和对照样品的数据通过log2转化，然后在两个步骤中调整和归一化以减少天和载玻片之间的技术变化。通过施加ComBat(在统计软件环境R中的SVA 包装)(一种调整批处理效应的方法)来解决日常变化，使用经验贝叶斯框架，其中批处理协变量已知2,3。使用的协变量是微阵列测定的日子。在第二步骤中，通过计算每个阵列的缩放因子，最小化阵列到阵列的变化。此因子基于具有所有样品的最低标准差的20％抗体，并且通过每个阵列上的这些抗体强度总和除以所有阵列4的平均总和来计算。可根据要求从相应作者处获得数据。

[0476] 数据分析

[0477] 使用Qlucore Omics Explorer，使用R.PCA中的支持向量机(SVM)分析，通过ANOVA进行q值计算，并进行倍数变化计算，进行两组分类。多群ANOVA用于分析来自包括于斯堪的纳维亚队列中的各种PDAC分期的样品中的个体蛋白质标志物的差异表达。使用学生t测试，本亚明-霍赫贝格(Benjamini-Hochberg)程序评估个体标志物的性能，用于错误发现率控制(q值)和倍数变化。灵敏度、特异性是根据SVM决策值计算的。计算阳性(PPV)和阴性(NPV)预测值与风险组的患病率和生存期风险的关系，如55岁以上的新发糖尿病(NOD)患者和PDAC患者的一级亲属。

[0478] 定义区分NC与I/II期PDAC的生物标志物特征之前，基于所有抗体5使用R中的留一法(LOO)交叉验证方法评估对个体PDAC分期分类的能力。简而言之，设计了一个SVM，其中一个数据点被划分为一个单独的子集(测试集)，并且其余的数据点被用作训练集。所述过程一次重复一个样品，结果用于产生受试者操作特征(ROC)曲线，并计算相应的曲线下面积(AUC)值。

[0479] 接下来，为了解密浓缩的生物标志物特征，将数据分成包括3/4个样品(约1000个样品)的训练集和包括1/4个样品(约340个样品)的测试集。保留数据集内的病例与对照样品的比率，但以其它方式随机产生集。使用这种方法产生了四个独特的测试/训练集。个体样品仅包括在测试集中一次。为了识别生物标志物特征，将反向消除(BE)算法施加到R中的每个训练集，一次排除一个抗体。对于每次BE迭代，消除了在分类分析中获得的具有最高Kullback-Leibler(KL)发散值的抗体。基于KL发散值分析，表达最低值的抗体组合用于设计预测性生物标志物特征。因此，与其它生物标志物6相比，BE允许无偏性地选择提供正交信息的标志物。值得注意的是，BE过程有时导致先前定义的肿瘤标志物，如在PDAC的情况下，CA19-9和唾液酸化路易斯A不包括在特征中，因为其没有提供足够的正交信息。然后使用所识别的生物标志物特征通过仅使用训练数据集5的R中的冷冻SVM来构建预测模型。此外，为了避免过度拟合，在相应的测试集上测试模型，并使用ROC曲线和AUC值评估其性能。为了进一步减少过度解释并确保稳健性，此过程在所有四个训练和测试集上进行。以这种方式，建立了分类NC与I/II期PDAC患者的预测模型，并使用ROC曲线和AUC值评估其性能。作为比较，对于衍生自NC与III/IV期PDAC患者的样品也重复这一点。

[0480] 最后，为了获得具有最高预测分类准确度数据的共识特征，组合来自NC与I/II期PDAC患者以及NC与III/IV期PDAC的所有分类。然后在独立的美国样品队列中验证共识特征的预测准确度。

[0481] 在用于验证的美国研究中，数据被分成三个训练/测试集，具有约280个样品(训练)和约140个样品(测试)。保留数据集内的病例与对照样品的比率，但以其它方式随机产生集。斯堪的纳维亚研究的共识特征用于构建预测模型，其仅使用美国训练集。然后在相应的美国测试集上测试所述模型，并使用ROC曲线和AUC值评估性能。为了进一步减少过度解释并确保稳健性，此过程在所有三个训练和测试集上进行。使用冷冻SVM将相同的方法用于慢性胰腺炎与PDAC样品的分类，并计算ROC-AUC值。最后，共识特征用于对NC与IPMN患者进行分类。验证队列中的所有IPMN样品被送料至已经在NC与PDAC上训练的SVM模型中。为了研究胆红素水平或糖尿病是否是抗体微阵列分析中的混杂因素，将患有黄疸(49.7％)和糖尿病(26.6％)的患者分别与没有黄疸或无糖尿病的患者进行比较。

[0482] 样品标记

[0483] 在这两个研究中，使用针对血清蛋白质组6-8优化的方案，用生物素标记血清样品。简而言之，将5μl血清样品在PBS中以1:45稀释至～2mg蛋白质/ml，并用0.6mM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，Waltham，MA，USA)标记。通过使用3.5kDa MWCO透析膜(赛默飞世尔科技，Waltham，MA，USA)对PBS透析72小时除去未结合的生物素，每24小时更换缓冲液。将标记的血清样品等分并储存在-20℃下。为了控制标记质量，在每个生物素化轮次期间，将参考血清样品(LGC Standards，
Teddington，UK)与患者样品一起标记。将来自这些质量控制(QC)样品的信号与来自一批相同的先前标记的参考血清的信号进行比较(参见关于微阵列测定的部分)以验证所述过程已按预期工作。

[0484] 抗体微阵列生产

[0485] 在两项研究中使用相同的抗体微阵列。阵列包含针对156种已知抗原的339种人重组scFv(表5)。先前已经显示从噬菌体展示文库中选择和产生的scFv以显示稳固的晶片功7,9-12
能。除了scFv之外，在载玻片上印刷两种针对CA19-9的全长单克隆抗体(Meridian
Life Science，Memphis，TN，USA)。大多数抗体先前已在阵列应用10-12中进行了测试，并且使用充分表征的对照血清验证了其特异性。此外，正交方法如质谱、ELISA、
MesoScaleDiscovery细胞因子测定、细胞学珠粒测定，和加标和阻断ELISA已被用于评估抗
13-15
体特异性。所选择的scFv针对主要参与免疫调节和/或癌症生物学的血清蛋白。

[0486] His标记的scFv在大肠杆菌(E.coli)中产生并使用磁性Ni-颗粒蛋白质纯化系统(MagneHis，Promega，Madison，WI，USA)从周质中纯化。使用Zeba 96孔旋转板(Pierce，Rockford，IL，USA)将洗脱缓冲液更换为PBS。使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测量蛋白质产量。通过10％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)检查蛋白质纯度。使用非接触式打印机(SciFlexarrayer S11，Scienion，Berlin，Germany)在黑色MaxiSorp载玻片(NUNC，Roskilde，Denmark)上制作抗体微阵列。在印刷之前，为每个scFv克隆9定义最佳印刷浓度。为了允许随后的QC功能，将
0.1mg/ml Cadaverine Alexa Fluor-555(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)添加到印刷缓冲液中。在每个载玻片上以七阵列的两列打印十四个相同的阵列。每个阵列由具有
200m斑点至斑点中心距的34×36斑点和140m的斑点直径组成。每个阵列由三行相同的片段组成，所述片段由BSA-生物素斑点的行隔开。每个抗体以三个重复印刷，其中在每个片段中重复一次。另外两行生物素-BSA斑点位于每个子阵列的两侧，一个位于子阵列上方，并且一个位于其下方。在每个重复区段中印刷九个阴性对照斑点(PBS)。对于每轮分析，印刷十个载玻片(140个微阵列)。在斯堪的纳维亚发现研究中，在16个印刷日内共印刷了152各载玻片。在验证研究中，在五个印刷日中共印刷了48个载玻片。在微阵列测定之前，将载玻片在室温(RT)下储存8天。

[0487] 微阵列测定

[0488] 在每个载玻片上分析十个样品。样品的定位是随机的，但每个载玻片上的健康和PDAC样品的比例对于整个队列约相同。每个载玻片上的四个位置用于QC样品；三个用于参考血清(两个来自LGC标准，Teddington，UK，并且一个来自SeraCare Life Sciences，Milford，MA，USA)，并且一个用于含有来自研究中包括的健康和癌症样品的等分试样的混合物的样品。将每个微阵列载玻片安装在杂交垫片(Schott，Mainz，Germany)中，并在RT下在不断搅拌下用1％w/v乳汁、1％v/v吐温-20在无菌D-PBS(MT-PBS)中封闭1小时。同时，将等份的标记血清样品在冰上解冻，并且随后在MT-PBS中1:10稀释。将载玻片用无菌D-PBS(PBST)中的0.05％吐温-20洗涤四次，然后将稀释的血清样品添加到垫圈的孔中。将样品在RT下在不断搅拌下在载玻片上温育2小时。接着，将载玻片用PBST洗涤四次，与1g/ml抗生蛋白链菌素Alexa-647(Life Technologies Carlsbad，CA，USA)在MT-PBS中在RT下在不断搅拌下一起温育1小时，并且用PBST再次洗涤四次。最后，将载玻片从杂交垫圈上卸下，浸入dH20中并在N2气流下干燥。立即用共焦微阵列扫描仪(LS Reloaded，Tecan，Switzerland)在10m分辨率下扫描载玻片，首先在635nm下，然后在532nm下。第一扫描图像检测到Alexa-647(链霉抗生物素蛋白)信号，并用于定量斑点信号强度。第二扫描图像测量Alexa-555(尸胺)信号并用于质量控制目的。

[0489] 参考文献(补充资料)

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[0505] 表3.临床数据

[0506] 斯堪的纳维亚和美国队列的糖尿病和黄疸

[0507]

[0508]

[0509] 表3(续)

[0510] 斯堪的纳维亚队列中的肿瘤定位

[0511]

[0512] 表3(续)

[0513] 斯堪的纳维亚队列中的临床参数

[0514]

[0515] 表4.

[0516] 生物标志物特征区分I/II和III/IV期PDAC与NC

[0517] NC与I/II期PDAC

[0518] 1.血浆蛋白酶C1抑制因子

[0519] 2.白细胞介素-4

[0520] 3.蛋白-酪氨酸激酶6

[0521] 4.补体C3

[0522] 5.丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MARK1

[0523] 6.HADH2蛋白

[0524] 7.备解素

[0525] 8.补体C4

[0526] 9.细胞周期蛋白-依赖性激酶2

[0527] 10.干扰素γ

[0528] 11.钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶1

[0529] 12.补体C5

[0530] 13.血管内皮生长因子

[0531] 14.视觉系统同源盒2

[0532] 15.PR结构域锌指蛋白8

[0533] 16.细胞间粘附分子1

[0534] 17.泛素羧基-末端水解酶同工酶L5

[0535] 18.白细胞介素-6

[0536] 19.肌间蛋白-2

[0537] 20.Aprataxin和PNK样因子

[0538] 21.载脂蛋白A1

[0539] 22.无意义转录物3B的调节因子

[0540] 23.基膜聚糖

[0541] 24.白细胞介素-9

[0542] 25.C-C基序趋化因子13

[0543] 表4(续)

[0544] NC与III/IV期PDAC

[0545] 1.血浆蛋白酶C1抑制因子

[0546] 2.白细胞介素-4

[0547] 3.补体C3

[0548] 4.备解素

[0549] 5.补体C4

[0550] 6.唾液酸化路易斯X

[0551] 7.钙调磷酸酶B同源蛋白1

[0552] 8.HADH2蛋白

[0553] 9.蛋白-酪氨酸激酶6

[0554] 10.载脂蛋白A1

[0555] 11.C-C基序趋化因子13

[0556] 12.膜相关鸟苷酸激酶，含WW和PDZ结构域的蛋白1

[0557] 13.淋巴毒素-α

[0558] 14.磁盘大同源物1

[0559] 15.蛋白激酶Cδ型

[0560] 16.白细胞介素-13

[0561] 17.补体C5

[0562] 18.丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MARK1

[0563] 19.GTP-结合蛋白GEM

[0564] 20.IgM

[0565] 21.白细胞介素-8

[0566] 22.血管内皮生长因子

[0567] 23.白细胞介素-6

[0568] 24.白细胞介素-9

[0569] 表5

[0570] scFv特异性

[0571]

[0572]

[0573]

[0574]

[0575]

[0576] 表6：SVM脚本

[0577] (A)LOO(留一法)

[0578]

[0579]

[0580]

[0581] 表6：SVM脚本(续)

[0582] (B)BE(反向消除)

[0583]

[0584]

[0585]

[0586]

[0587]

[0588]

[0589] 表7-实例中使用的scFv抗体的氨基酸序列

[0590]

[0591]

[0592]

[0593]

[0594]

[0595]

[0596]

[0597]

[0598]

[0599]

[0600]

[0601]

[0602]

[0603]

[0604]

[0605]

[0606]

[0607]

[0608]

[0609]

[0610]

[0611]

[0612]

[0613]

[0614]

[0615]

[0616]

[0617]

[0618]

[0619]

[0620]

[0621]

[0622]

[0623]

[0624]

[0625]

[0626]

[0627]

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[0629]

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[0633] *scFv抗体的结构描述于等人，2000，《重组种系衍生的CDR序列以产生不同的单框架抗体文库(Recombining germline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries)》《自然生物技术(Nature
Biotechnol.)》，18(8):852-6，其以全文引用的方式并入本文中。

[0634] 表8

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标题	发布/更新时间	阅读量
治疗精神分裂症的方法	2020-05-12	601
鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒	2020-05-20	923
用作I型甘氨酸转运抑制剂的二环[3.1.0]杂芳酰胺	2020-05-19	239
喹硫平的代谢物	2020-05-18	728
治疗精神分裂症的药物制剂	2020-05-12	625
使用环酰胺衍生物治疗精神分裂症的方法	2020-05-12	40
用于治疗精神分裂症的包含2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪衍生物的组合物	2020-05-14	774
芳族羟苯基和芳族硫基苯基衍生物	2020-05-14	563
治疗风痹症以类风湿因子阴性为主的药物及制备方法	2020-05-16	572
喹硫平的代谢物	2020-05-18	235

方法、阵列和其用途

方法、阵列和其用途

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