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用于治疗继发性结核和非结核分枝杆菌感染的组合物和方法

阅读：994发布：2020-08-24

专利汇可以提供用于治疗继发性结核和非结核分枝杆菌感染的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种分枝杆菌抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种分枝杆菌抗原是强效应记忆T细胞激活剂。本文还提供了制造此种融合多肽的方法和使用此种融合多肽以预防或治疗哺乳动物中的继发性结核分枝杆菌感染以及预防或治疗非结核分枝杆菌感染的方法。，下面是用于治疗继发性结核和非结核分枝杆菌感染的组合物和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b、Rv2608b、Rv2389-b或Rv1886-b具有至少90％序列同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b、Rv2608b、Rv2389-b或Rv1886-b的序列。
4.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述强效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619或Rv3620具有至少90％序列同一性的序列。
5.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述强效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619或Rv3620的序列。
6.根据权利要求1所述的融合多肽，其进一步包括第三抗原，其中所述第三抗原是强中枢记忆T细胞激活剂。
7.根据权利要求1所述的融合多肽，其进一步包括第三抗原，其中所述第三抗原是强效应记忆T细胞激活剂。
8.根据权利要求1所述的融合多肽，其包括与Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b具有至少90％序列同一性的抗原。
9.根据权利要求1所述的融合多肽，其包括Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b。
10.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97具有至少90％序列同一性。
11.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97。
12.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至11所述的融合多肽中的任何一种和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
13.一种在受试者中激活强分枝杆菌中枢记忆T细胞反应和强分枝杆菌效应记忆T细胞反应的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至11所述的融合多肽中的任何一种或根据权利要求12所述的组合物。
14.一种预防或治疗受试者的继发性结核感染的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至11所述的融合多肽中的任何一种或根据权利要求12所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法用于预防受试者中的继发性结核感染。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法用于治疗受试者中的继发性结核感染。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述结核感染是非结核分枝杆菌(NTM)继发性感染。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述结核感染是潜伏性Mtb或NTM感染的再激活。
19.一种预防或治疗受试者中非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至11所述的融合多肽中的任何一种或根据权利要求12所述的组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法用于预防受试者中的NTM感染。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法用于治疗受试者中的NTM感染。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述NTM感染是原发性感染。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述NTM感染是继发性感染。
24.一种减少受试者中活动性TB疾病的征象或症状的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至11所述的融合多肽中的任何一种或根据权利要求12所述的组合物。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述受试者是定量干扰素阳性。
26.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述受试者是定量干扰素阴性。
27.一种预防或治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％序列同一性的融合多肽。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述融合多肽是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。
29.一种降低受试者中NTM细菌负荷的方法，其包括使所述受试者的细胞与以下相接触：(i)TLR4激动剂，(ii)与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％序列同一性的融合多肽或(iii)其组合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述TLR4激动剂是GLA。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述TLR4是SLA。
32.根据权利要求29、30或31所述的方法，其中所述融合多肽是ID93-1、ID93-2、ID83-
1、ID83-2、ID97或ID91。

说明书全文

用于治疗继发性结核和非结核分枝杆菌感染的组合物和方法

[0001] 相关申请的交叉引用

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[0005] 结核(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)感染引起的慢性传染病。TB是发展中国家的一种主要大范围流行疾病，也是世界发达地区日益严重的问题，每年夺去170万至200万人的生命。虽然感染可能在相当长的一段时间内无症状，但该疾病最常表现为肺部的急性炎症，导致发烧和干咳。如果不治疗，通常会导致严重的并发症和死亡。多药耐药性TB(MDR-TB)的增加进一步加剧了这种威胁(Dye，《自然综述微生物学(Nat Rev Microbiol)》，2009；7：81-7)。

[0006] 非结核分枝杆菌(NTM)菌种引起一系列疾病，包含肺部疾病(类似TB)，淋巴系统、皮肤、软组织、骨感染，和全身性疾病。NTM感染有所增加。此种感染，尤其是免疫受损患者中的此种感染，会在先前感染和药物治疗的Mtb感染个体中造成继发性感染储源的增加。目前有超过150种不同种类的NTM，但更常见的传染性菌种是鸟分枝杆菌复合体(MAC)、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌(综述于《非结核分枝杆菌肺部感染(Nontuberculous mycobacterial pulmonary infections)》，Margaret M.Johnson和John A.Odell，《胸部疾病杂志(Journal of Thoracic Disease)》，第6卷，第3期，2014年3月；CDC(http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/nontb_mycobacterium/techni
cal.html)指出多种NTM菌种可归因于各种疾病，包含莫尔门分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、楚尔盖分枝杆菌、蟾分枝杆菌(与肺炎相关)；瘰疬分枝杆菌(与淋巴腺炎相关)；和脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、溃疡分枝杆菌(皮肤和软组织感染)。在一些热带地区，由溃疡分枝杆菌感染引起的布鲁里溃疡病是严重发病和致残的常见原因。

[0007] TB的过程基本上分3个阶段进行。在急性期或活跃期期间，细菌在器官中以指数、对数或半对数速率增殖或活跃繁殖，直至免疫反应增加至其可控制感染的程度，此时细菌负荷达到峰值并开始下降。尽管对该机制尚未完全了解，但据信与干扰素γ(IFN-γ，IFNγ)合作的致敏CD4+ T细胞介导对感染的控制。一旦主动免疫反应降低细菌负荷并在稳定和低水平下保持检查，就建立潜伏期。此前，研究报告称，在潜伏期期间，Mtb从活跃繁殖变为休眠，基本上变为非复制性的并保留在肉芽肿内。然而，最近的研究已经证明即使在潜伏期中，至少部分细菌群体仍然处于活跃新陈代谢状态。(Talaat等人，2007，《细菌学杂志(J of Bact)》，189，4265-74)。

[0008] 因此，这些细菌能够存活，维持活跃的新陈代谢，并在面对强免疫反应时极少复制。因此，在潜伏期期间受感染的个体中，非复制性细菌(免疫系统可能非常难以检测，因为它们位于细胞内)和缓慢复制细菌之间存在平衡。在一些情况下，潜伏性感染进入再激活，其中休眠细菌再次开始复制，尽管其速率略低于初始感染。有人提出，Mtb从原发性感染到潜伏期的转变伴随着基因表达的变化(Honerzu Bentrup，2001)。免疫反应的抗原特异性也可能发生变化，因为细菌在从活动性复制转变到休眠期间调节基因表达。控制潜伏性感染的免疫反应的全部性质和导致再激活的因素在很大程度上是未知的。然而，有一些证据表明，负责的主要细胞类型发生了变化。虽然CD4+ T细胞在急性期期间是控制感染所必需且足以控制感染，但一些研究表明CD8+ T细胞反应在潜伏期更为重要。这一阶段的细菌通常不是TB领域目前正在开发的大多数预防性疫苗的目标，例如当对潜伏性感染的实验动物给予经典预防性疫苗时缺少活性(Turner等人，2000《，感染与免疫(Infect Immun.)》，68：6：3674-9)。

[0009] 与由Mtb菌种引起的TB的诊断(其中临床标本中细菌的分离即为疾病的诊断)不同，临床分离物中NTM菌种的存在与疾病无关。NTM与Mtb菌种共有多种特性，使得细菌在资源匮乏的环境中难以分化。诊断TB的标准方法是通过痰涂片的显微镜检查，但是当使用本方法时，NTM看起来与Mtb相同。不使用分子方法，这些生物很难区分。通常认为患者患有Mtb感染，因为多种NTM的临床表现可能类似TB的临床表现。美国胸科学会(ATS)和美国传染病学会(IDSA)在2007年联合发布的指南要求出现症状，放射学异常和微生物培养并排除其它潜在病因以诊断NTM肺部感染(M.Johnson和John A.Odell，《胸部疾病杂志(Journal of Thoracic Disease)》，第6卷，第3期，2014年3月)。多种NTM菌种存在于饮用水、家庭管道、富含泥炭的土壤、咸水沼泽、排水、医院、血液透析中心和牙科诊所的水系统中，使得它们在环境中特别普遍存在。

[0010] 虽然Mtb通常可以使用延长的抗生素疗法来控制，但是此治疗不足以预防疾病的传播。受感染的个体可能在一段时间内无症状，但具有传染性。目前潜伏性TB(无症状和非传染性)的临床实践是用6至9个月的异烟肼或其它抗生素治疗，或者用4个月的利福平治疗。活动性Mtb感染用4种药物的组合治疗6至8周(期间，据信大部分杆菌被杀死)，随后用两种药物治疗，总持续时间为6至9个月。治疗的持续时间取决于每周给予的剂量数。此外，尽管遵守治疗方案至关重要，但患者行为难以监测。由于副作用或极端治疗时间(6-9个月)，一些患者没有完成治疗过程，研究表明这可能导致无效治疗和耐药性的发展。此外，越来越多的人担心抗生素耐药性菌株，尤其是Mtb菌种的多药耐药性(MDR)菌株的增加，可能使耐药性NTM菌种的出现增加。标准TB治疗通常对NTM感染无效。抗TB药物的反应率为大约50％。在NTM相关疾病中。

[0011] 无论继发性结核病和NTM感染的因果关系的年表如何，TB疾病发病率增加以及Mtb菌种和NTM菌种的MDR菌株的出现的风险都是发展中国家和发达国家的严重健康问题。因此，为了减少全球TB传播并且减少耐药性和多药耐药性Mtb和NTM菌种的出现，迫切需要继发性Mtb感染和NTM菌种感染的更有效的预防性和治疗性治疗。本文提供的方法和组合物可用于治疗和预防继发性Mtb感染，以及用于预防和治疗NTM感染。发明内容

[0012] 本公开提供了用于预防或治疗受试者中由Mtb引起的继发性结核(TB)的组合物和方法，以及用于预防或治疗受试者中由NTM引起的感染(包含治疗患有先前存在的结构性肺部疾病的受试者(例如，有既往TB、慢性阻塞性肺部疾病或囊性纤维化病史的受试者))的组合物和方法。

[0013] 本文所述的用于治疗TB的组合物和方法能够引发强中枢记忆T细胞反应和强效应记忆T细胞反应。本文提供了施用任何一种本文所述的融合多肽的方法。此种融合多肽包括至少两种分枝杆菌抗原，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。

[0014] 在一个方面，本文提供了包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b、Rv2608b、Rv2389-b或Rv1886-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b、Rv2608b、Rv2389-b或Rv1886-b的序列。在一些实施例中，强效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619或Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619或Rv3620的序列。在一些实施例中，融合多肽进一步包括第三抗原，其中第三抗原是强中枢记忆T细胞激活剂。在一些实施例中，融合多肽进一步包括第三抗原，其中第三抗原是强效应记忆T细胞激活剂。在一些实施例中，融合多肽包括与Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的抗原。在一些实施例中，融合多肽包括Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b。在一些实施例中，融合多肽与ID93-1、ID93-
2、ID83-1、ID83-2或ID97具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID93-
1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97。在一些实施例中，融合多肽是ID91。

[0015] 在另一方面，本文提供了药物组合物，其包括任何一种本文提供的融合多肽，和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

[0016] 在另一方面，本文提供了一种在受试者中激活强分枝杆菌中枢记忆T细胞反应和强分枝杆菌效应记忆T细胞反应的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，受试者是定量干扰素(Quantiferon)阳性。在一些实施例中，受试者定量干扰素阴性。

[0017] 在另一方面，本文提供了一种预防或治疗受试者中的继发性结核感染的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于预防受试者中的继发性结核感染。在一些实施例中，所述方法用于治疗受试者中的继发性结核感染。在一些实施例中，结核感染是潜伏性Mtb感染的再激活。在一些实施例中，肺部感染是潜伏性NTM感染的再激活。受试者可以是定量干扰素阳性或定量干扰素阴性。

[0018] 在另一方面，本文提供了一种预防或治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于预防受试者中的NTM感染。在一些实施例中，所述方法用于治疗受试者中的NTM感染。在一些实施例中，NTM感染是原发性感染。在一些实施例中，NTM感染是继发性感染。受试者可以是定量干扰素阳性或定量干扰素阴性。

[0019] 在另一方面，本文提供了一种减少受试者中活动性TB疾病的征象或症状的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。

[0020] 在另一方面，本文提供了一种预防或治疗受试者中非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的融合多肽，所述融合多肽与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性，或者是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91。

[0021] 在另一方面，本文提供了一种降低受试者中NTM细菌负荷的方法，其包括使受试者的细胞与以下相接触：(i)TLR4激动剂，(ii)与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性的融合多肽或(iii)其组合

[0022] 应理解，本文所述的各个实施例的一个、一些或所有性质可以组合以形成本发明的其它实施例。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。附图说明

[0023] 图1示出了在基线处和接种后2周测量的ID93抗原特异性CD4+ T细胞的动力学。对于任何抗原特异性标志物(IFNg、TNF、IL-2、CD154、IL-22和/或IL-17)呈阳性的CD4+ T细胞的频率，如通过抗原(肽池)刺激PBMC减去未刺激值的细胞内细胞因子染色所测量。在第0天、第28天和第56天进行接种。

[0024] 图2示出了全血的CD4+ T细胞反应至用含有Rv1813(Rv1813-a或Rv1813-b)、Rv2608(Rv2608-a或Rv2608-b)、Rv3619或Rv3620肽/抗原的池刺激的中值总定量变化。误差条表示每次刺激的四分位数范围(IQR)。ID93-2接种和安慰剂受试者按群组分类，并且反应在纵向上按研究天数分类。减去了本底值(未受刺激)。数据表明用ID93-2免疫在接种的受试者中产生免疫反应，其大体上在免疫后第14至42天达到峰值。Rv2608(从顶部数第三个堆积条)和Rv3619(从顶部数第二个堆积条)对ID93-2的抗原亚单位蛋白产生定量最高的免疫反应。ID93+GLA-SE接种后的对每种特异性抗原的反应的幅度和动力学在各群组中有所不同。无论哪个群组，在所有ID93+GLA-SE接种参与者中，接种均诱导高于基线的Rv2608特异性CD4 T细胞反应。在所有群组中，无论剂量如何，在两次施用疫苗后均观察到对Rv1813和Rv2608的最大CD4 T细胞反应。第三次施用疫苗未将反应提高到第二次施用所观察的那些之上。在群组2、3和4中，单次施用ID93+GLA-SE快速诱导对Rv3619和Rv3620的CD4 T细胞反应，最可能是对潜在的潜伏性M.tb感染的提高作用。然而，在QFT阴性群组1参与者中，接种后的Rv3619和Rv3620反应与基线或安慰剂(曼-惠特尼(Mann-Whitney))反应没有统计学差异(例如，第42天的Rv3619和Rv3620的威尔科克森(Wilcoxon)p值，峰值测量反应，分别为
0.9453和0.6875)，表明在没有用M.tb自然感染引发的个体中，ID93+GLA-SE不能诱导对Rv3619和Rv3620的反应。

[0025] 图3描绘了执行FDS分析的一般方法。

[0026] 图4A-B示出了在用ID93-2的抗原亚单位蛋白(Rv1813(a或b)、Rv2608(a或b)、Rv3619和Rv3620)刺激的PBMC的细胞内染色分析后，在QFT+(先前感染了引起TB的病原体的受试者，左图，定量干扰素阳性)和QFT-(无TB病史，右图，定量干扰素阴性)受试者中的来自临床研究的群组2和4的接种ID93-2+GLA-SE的受试者中的CD4+ T细胞群的FDS定性分析。数据显示Rv1813和2608是强中枢记忆CD4+抗原，并且用ID93-2接种无结核病史受试者可以驱使T细胞谱分化为对这些抗原的强中枢记忆反应(FDS评分为1或更低)。相反，Rv3619和Rv3620是强效应记忆CD4+抗原(FDS评分为3或更高)，并且用ID93-2接种无结核病史受试者可以驱使CD4+T细胞谱分化为对这些抗原的强效应记忆反应。

[0027] 图5A-B示出了在用来自临床试验的群组2和4的用ID93-2+GLA-SE免疫的受试者中的用ID93-2最后一次接种后6个月的FDS谱。图5A中的数据显示了不同TB群体中的ID93-2亚单位蛋白的FDS评分的分析。在QFT+和QFT-受试者中接种三种ID93-2+GLA-SE剂量后6个月，数据显示ID93-2的Rv2608和Rv1813蛋白是强CD4+ T细胞中枢记忆抗原，并且ID93-2的Rv3619和Rv3620蛋白是强CD4+ T细胞效应记忆抗原。图5B大体上示出了Rv2608和Rv1813是强CD4+ T细胞中枢记忆抗原，并且Rv3619和Rv3620都是强CD4+ T细胞效应记忆抗原，无论群体的结核状态如何。

[0028] 图6示出了GLA-AF和QS21对NTM鸟分枝杆菌的生长抑制。TLR4制剂抑制NTM鸟分枝杆菌分枝杆菌的生长。

[0029] 图7示出了ID91-GLA-SE或ID91对NTM鸟分枝杆菌的生长抑制。

具体实施方式

[0030] 本公开提供了用于预防或治疗由Mtb引起的继发性结核(TB)的组合物和方法。本公开还提供了用于预防或治疗由NTM引起的原发性和继发性感染(包含类似TB的肺部感染)的组合物和方法。在示例性实施例中，用于治疗此种TB和NTM感染的组合物和方法能够在施用任何一种本文提供的融合多肽时引发强中枢记忆T细胞反应和强效应记忆T细胞反应，所述融合多肽包括至少两种分枝杆菌抗原，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。

[0031] 本公开尤其基于以下令人惊讶的发现：某些分枝杆菌抗原能够激活强分枝杆菌中枢记忆T细胞反应，并且某些分枝杆菌抗原能够激活强分枝杆菌效应记忆T细胞反应。同样地，令人惊讶地发现包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽(对于受试者，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂)引起强分枝杆菌中枢记忆T细胞反应和强分枝杆菌效应记忆T细胞反应。

[0032] 本公开尤其还基于以下发现：所述的分枝杆菌抗原能够在已经患有TB并且已成功治疗TB的受试者(例如，先前感染的受试者)中预防或治疗TB。

[0033] 如本文所述，本公开一般涉及用于预防或治疗受试者中的继发性结核病(TB)以及用于预防或治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的组合物和方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽。在示例性实施例中，一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。

[0034] 如本文所述，TLR4激动剂还可用于预防或治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染。本文提供了方法，其包括向受试者施用有效量的用于治疗NTM感染的TLR4激动剂。还提供了降低受试者中NTM细菌负荷的方法，其包括使受试者的细胞与以下相接触：(i)TLR4激动剂(ii)任何本文所述的融合多肽或(iii)其组合。受试者的细胞可以在受试者体内，并且通过向受试者施用TRL4激动剂和/或任何本文所述的融合多肽来进行接触。

[0035] 定义

[0036] 在本说明书中，除非另有说明，否则术语“约”和“基本上由……组成”是指所示范围、值或结构的±20％。应当理解，本文使用的术语“一个(a/an)”是指所列举部件中的一个或多个。替代方案(例如，“或”)的使用应被理解为是指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文使用，术语“包含”、“具有”和“包括”被同义使用，这些术语及其变体旨在被解释为非限制性的。

[0037] “个体”或“受试者”是哺乳动物，例如人类哺乳动物或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包含但不限于农场动物(例如，牛、猪、马)、运动动物、宠物(例如，猫、狗、马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。

[0038] “结核分枝杆菌(M.tuberculosis)”和“Mtb”是指在哺乳动物中可以引起TB疾病的类型的细菌，即结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

[0039] 本文可互换使用的“非结核分枝杆菌”或“NTM”包含可能在哺乳动物中引起NTM相关感染(包含肺部感染，例如类似TB的肺部感染)的那些细菌菌种。NTM被定义为除Mtb或麻风分枝杆菌之外的任何分枝杆菌病原体。NTM引起一系列疾病，包含肺部感染(例如，TB样肺部疾病)，淋巴系统、皮肤、软组织或骨骼感染，和全身性疾病。例如，NTM可以感染无先前存在的疾病的受试者、患有先前存在的结构性肺部疾病的受试者(例如，有既往TB、慢性阻塞性肺部疾病或囊性纤维化病史的受试者)以及免疫受损患者(例如，患有AIDS的患者和患有原发性Mtb感染的患者)。NTM包含但不限于牛分枝杆菌、或非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种(参见例如《哈里森内科学(Harrison's Principles of Internal Medicine)》，第150章，第953-966页(第16版，Braunwald等人编辑，2005)。多种NTM菌种存在于饮用水、家庭管道、富含泥炭的土壤、咸水沼泽、排水、医院、血液透析中心和牙科诊所的水系统中，使得它们在环境中特别普遍存在。

[0040] 如本文使用，“分枝杆菌感染(Mycobacterial infection)”或“分枝杆菌感染(infection with a Mycobacterium)”是指Mtb和/或NTM感染。

[0041] 如本文使用，“分枝杆菌抗原”是指来自Mtb或NTM的抗原。如本文使用，“Mtb抗原”是指来自Mtb的抗原。

[0042] 如本文使用，“NTM抗原”是指来自NTM的抗原，例如来自鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、莫尔门分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、楚尔盖分枝杆菌、蟾分枝杆菌(与肺炎相关)；瘰疬分枝杆菌(与淋巴腺炎相关)；和脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、或嗜血分枝杆菌、或溃疡分枝杆菌的抗原。

[0043] 本文使用的“原发性结核”或“原发性TB”或“原发性TB感染”或“原发性结核感染”或“原发性感染”或“原发性分枝杆菌感染”是指在最初接触并感染结核分枝杆菌后由于宿主免疫系统未能充分控制初始感染而在最初几年内发展的TB疾病。一些原发性感染从未经过治疗。

[0044] 本文使用的“继发性结核”或“继发性TB”或“继发性TB感染”或“继发性结核感染”或“继发性感染”、“继发性分枝杆菌感染”是指(i)由于来自原发性Mtb感染的潜伏性菌株的再激活而发生的TB疾病，(ii)由于第二Mtb菌株的第二次随后再感染而发生的TB疾病，其中引起原发性Mtb感染的菌株和引起继发性Mtb感染的菌株不是相同的菌株或(iii)表征为来自原发性Mtb感染的潜伏性菌株的再激活和第二Mtb菌株的第二次随后再感染的TB疾病[0045] 继发性TB包含用在初级临床分离株中未标识的次级分枝杆菌菌株感染宿主。与原发性TB分离株相比，继发性TB还包含在次级临床分离株中以更高频率存在的分离株。例如，继发性TB可能发生在具有潜伏性TB感染的宿主中。

[0046] 如本文使用，“NTM感染”是指NTM的原发性或继发性感染。

[0047] “耐药性”分枝杆菌感染是指Mtb感染或非结核分枝杆菌(NTM)感染，其中感染菌株对一种或多种有效治疗Mtb或NTM感染的所谓的“前线”化学治疗剂(例如，异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺)不保持静止或杀死(对其具有抗性)。

[0048] “多药耐药性”感染是指Mtb或NTM感染，其中感染菌株对两种或更多种有效治疗Mtb或NTM感染的“前线”化学治疗剂具有抗性。本文使用的多药耐药性感染还指在2006年10月由世界卫生全球工作组定义的“广泛耐药性结核”(“XDR-TB”)，其作为多药耐药性TB，对任何一种氟喹诺酮(FQ)和至少一种可注射药物(例如，卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素)具有耐药性。

[0049] 本文使用的“活动性结核”、“活动性TB”、“TB疾病”、“TB”或“活动性TB感染”是指哺乳动物(例如，灵长类动物，如人类)中的疾病、病状或状态，其中Mtb细菌活跃繁殖并侵入哺乳动物的器官并引起症状或即将引起征象、症状或其它临床表现，最常见于肺部(肺部活动性TB)。活动性TB的临床症状可以包含虚弱、疲劳、发烧、发冷、体重减轻、食欲不振、厌食或盗汗。肺部活动性TB症状包含持续数周(例如，至少3周)的咳嗽、粘稠的粘液、胸痛和咯血。本文使用的“再激活结核”是指在患有LTBI并且其休眠感染病灶的激活导致Mtb细菌活跃繁殖的个体中发展的活动性TB。本文使用的“活跃繁殖”是指在受感染的宿主的器官中以指数、对数或半对数速率增殖、生殖、扩增或活跃繁殖的Mtb细菌。在某些实施例中，受感染的哺乳动物(例如，人类)具有受抑制的免疫系统。免疫抑制可能是由于年龄(例如，非常年轻或年长)或由于其它因素(例如，物质滥用、器官移植)或其它病状，例如另一种感染(例如，HIV感染)、多尿症(例如，糖尿病)、硅肺病、头颈癌、白血病、霍奇金病、肾脏疾病、低体重、皮质类固醇治疗、或关节炎(例如，类风湿性关节炎)或克罗恩病等的治疗。

[0050] 用于确定由Mtb或NTM细菌引起的肺部疾病或由活跃繁殖的Mtb或NTM细菌引起的病状的存在的试验是本领域已知的，包含但不限于痰的酸性快速染色(AFS)和直接显微镜检查、支气管肺泡灌洗、胸腔积液、组织活检、脑脊液积液；细菌培养，例如BACTEC MGIT 960(Becton Dickinson，富兰克林湖，新泽西州，美国)；IGR试验，包含 -Gold或 -Gold In-tube T SPOTT M.TB，皮肤试验，例如TST曼托皮肤试验(TST)；抗原刺激后全血或分离的PBMC的细胞内细胞因子染色。美国胸科学会(ATS)和美国传染病学会(IDSA)在2007年联合发布的指南要求出现症状，放射学异常和微生物培养并排除其它潜在病因以诊断NTM肺部感染(M.Johnson和John A.Odell，《胸部疾病杂志(Journal of Thoracic
Disease)》，第6卷，第3期，2014年3月)。

[0051] 本文使用的“潜伏性感染”、“潜伏期”或“潜伏性疾病”、“休眠感染”是指导致休眠的由宿主免疫系统控制的Mtb或NTM感染，其特征在于恒定低细菌数量但也可以含有至少一部分细菌群体，其保持活跃新陈代谢状态，包含在稳定维持状态下的繁殖。在没有活动性TB疾病的征象、症状或影像学证据的情况下，临床上通过阳性TST或IGRA确定潜伏性TB感染。潜伏性感染的哺乳动物不具有“传染性”，并且由于与潜伏性感染相关的非常低的细菌计数而不能传播疾病。潜伏性结核感染(LTBI)用一种或多种药物治疗以杀死休眠细菌。治疗LTBI大大降低了感染在生命后期进展为活动性结核(TB)的风险(例如，进行治疗以防止再激活)。

[0052] 本文公开的“预防方法(method of prevention/method of preventing)”通常是指使用预防性组合物(例如，预防性疫苗)预防哺乳动物中的继发性TB或NTM感染的方法。通常，施用预防性组合物的初始步骤将在受试者感染Mtb或NTM之前和/或在受试者表现出与感染相关的任何临床症状或阳性测定结果之前发生。

[0053] 本文公开的“治疗方法(method of treatment/method of treating)”通常是指单独使用治疗性组合物(例如，治疗性疫苗)或与化学治疗方案联合使用来治疗受试者中的继发性TB或NTM感染(原发性NTM感染或继发性NTM感染)的方法。在本公开的本方法和相关方法中将理解，施用治疗性组合物的至少一个步骤，通常是施用治疗性组合物的初始步骤，将在哺乳动物被Mtb或NTM活动性感染和/或表现出至少一种与活动性感染相关的临床症状或阳性测定结果时发生。还应当理解，本公开的方法可以进一步包括在其后的一个或多个另外的时间点施用本公开的相同或另一种治疗性组合物的额外步骤，而不管活动性感染或其症状是否仍然存在在受试者中，并且不管与活动性感染相关的测定结果是否仍为阳性，以提高化学治疗方案的疗效。还应理解，本公开的方法可以包含单独施用治疗性组合物或与其它药剂联合施用，因此，治疗性组合物可以作为更广泛的治疗方案的一部分的多种治疗组分之一。

[0054] “化疗剂”、“化学治疗剂”或“化学治疗方案”是用于治疗感染或暴露于任何引起TB的分枝杆菌的患者或在其治疗中使用的药物或药物组合，包含但不限于阿米卡星、氨基水杨酸、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼(INH)、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福喷汀和利福布汀)、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和氟喹诺酮以及本领域的其它衍生物类似物或生物仿制药。“一线”化学治疗剂是用于治疗非耐药性的分枝杆菌感染的化学治疗剂，包含但不限于异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺以及本领域的其它衍生物类似物或生物仿制药。用于治疗已证实对一种或多种“一线”药物具有耐药性的分枝杆菌感染的“二线”化学治疗剂包含但不限于氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素以及本领域的其它衍生物类似物或生物仿制药。

[0055] 如本文使用，“改善化学治疗方案的疗效”是指缩短实现期望的临床结果所需的治疗持续时间，减少实现期望的临床结果所需的不同化疗剂的数量，减少实现期望临床结果所需的化疗剂的剂量，减少与活动性临床感染相关的宿主或宿主器官的病理，改善由该方法治疗的宿主或宿主器官的活力，减少MDR-TB菌株的发展或发生，和/或增加患者的化学治疗方案依从性。

[0056] 本文提供的治疗性TB组合物是指当向患有活动性TB感染的宿主施用时能够引发对分枝杆菌感染的有益免疫反应的组合物。“有益免疫反应”是指减少活动性TB疾病的征象或症状，减少杆菌计数，减少与活动性TB疾病相关的病理，引发与疾病消退相关的适当细胞因子谱，扩展抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞，或改善化学治疗方案的疗效的反应。本文提供的治疗性TB组合物是指能够在受试者中引发免疫反应的组合物，所述免疫反应例如抗原特异性T细胞的总体定量数目的增加或受试者T细胞分化状态的定性变化，这可以通过本发明的方法凭经验测量或通过产生有益免疫反应(例如，减少症状征象)来测量。

[0057] 本公开的治疗性TB组合物包含但不限于抗原、融合多肽和编码抗原和融合多肽的多核苷酸，其通过本领域已知的方法以药学上可接受的制剂递送。

[0058] 如本文使用，“FDS”是指功能性分化评分。FDS通过下式计算：[％IFN-γ+CD4+ T细胞/％IFN-γ-CD4+ T细胞]。

[0059] “IFN-γ+CD4+ T细胞”是产生IFN-γ的CD4+ T细胞。例如，此种细胞表现出IFN-γ的细胞内染色，如通过本领域已知的方法测量，包含细胞内细胞因子染色(ICS)；或分泌IFN-γ，如通过本领域已知的方法测量，包含ELISA。

[0060] “IFN-γ-CD4+ T细胞”是不产生IFN-γ的CD4+ T细胞。例如，此种细胞不表现出IFN-γ的细胞内染色，如通过本领域已知的方法测量，包含ICS；并且不分泌IFN-γ，如通过本领域已知的方法测量，包含ELISA。

[0061] FDS可以用于：(1)测量受试者对一种或多种抗原(例如，包括抗原的组合物、制剂或疫苗)的CD4+ T细胞谱状态的定性变化；(2)限定基线(t＝0)处或施用一种或多种抗原(例如，包括抗原的组合物、制剂或疫苗)后CD4+ T细胞百分比的定量变化；和(3)分析总群体(无论TB状态如何，例如诸如先前感染或暴露于引起TB的细菌的个体或从未感染过引起TB的细菌的无病史个体；或者例如在QFT-或QFT+或混合群体中)对一种或多种抗原(例如，包括抗原的组合物、制剂或疫苗)的CD4+ T细胞谱状态的定性变化。

[0062] 如本文使用，在一次或多次免疫后，当受试者的FDS小于或等于约1.0时，引发“强中枢记忆T细胞反应”。

[0063] 如本文使用，在一次或多次免疫后，当受试者的FDS小于或等于约1.0时，引发“强效应记忆T细胞激活剂反应”。

[0064] 低FDS代表中枢记忆T细胞的T细胞分化或扩增的早期阶段的细胞，而高FDS表示效应T细胞的更大分化或扩增。

[0065] 融合多肽组合物

[0066] 本文提供了能够引发强中枢记忆T细胞反应的分枝杆菌抗原和能够引发强效应记忆T细胞反应的分枝杆菌抗原。本文还提供了包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是用于治疗继发性TB感染和NTM感染的强效应记忆T细胞激活剂。

[0067] 本文提供的融合多肽可以包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或甚至至少十种分枝杆菌抗原，其中融合多肽在施用后能够引发强中枢记忆和效应记忆T细胞反应。

[0068] 融合多肽和分枝杆菌抗原可以使用常规重组和/或合成技术制备。

[0069] 本文还提供了用于筛选能够引发强中枢记忆T细胞反应和强效应记忆T细胞反应的分枝杆菌抗原的选择的测定物和方法。

[0070] 本文提供了Mtb和NTM抗原和包括至少两种抗原的融合多肽。融合多肽是指具有至少两种异源分枝杆菌抗原(例如，Mtb抗原和/或NTM抗原)的多肽。在本文提供的融合多肽中，各个抗原可以直接或间接通过氨基酸连接子共价连接。连接子的长度可以为1个氨基酸至100个氨基酸。形成融合多肽的各个抗原通常为C末端至N末端连接，但是它们也可以为C末端至C末端、N末端至N末端或N末端至C末端连接。无论如何呈现或叙述，抗原可以以任何顺序连接。

[0071] 融合多肽还可以包含构成融合蛋白的抗原的保守修饰变体、多态变体、等位基因、突变体、亚序列、种间同源物和免疫原性片段。Mtb抗原描述于Cole等人，《自然(Nature)》，393：537(1998)，其公开了整个结核分枝杆菌基因组。可以例如使用如本文所述的序列比较算法、交叉反应性测定或本领域技术人员已知的其它方法(例如，杂合测定和抗体结合测定)来标识来自其它NTM菌种的抗原。

[0072] 本公开的融合多肽通常包括至少两种本文所述的抗原多肽，并且可以进一步包括其它无关序列，例如有助于提供T辅助表位(免疫融合配偶体)、人类识别的T辅助表位，或者有助于以比天然重组蛋白更高的产率表达蛋白质(表达增强子)的序列。某些示例性融合配偶体是免疫学融合配偶体和表达增强融合配偶体。可以选择其它融合配偶体以增加蛋白质的溶解度或使蛋白质能够靶向所需的细胞内区室。另外的融合配偶体包含亲和标签，其促进了蛋白质的纯化。

[0073] 通常可以使用标准技术制备融合蛋白。在一些实施例中，融合蛋白表达为重组蛋白。例如，编码所需融合体的多肽组分的DNA序列可以单独组装，并连接到合适的表达载体中。编码一种多肽组分的DNA序列的3'末端在有或没有肽连接子的情况下与编码第二多肽组分的DNA序列的5'末端连接，使得序列的阅读框同相。这允许翻译成保留两种组分多肽的生物活性的单个融合蛋白。

[0074] 如果需要，可以使用肽连接子序列将第一和第二抗原(或后续抗原)分开足够的距离，以确保每种抗原折叠成其二级和三级结构。使用本领域熟知的标准技术将此肽连接子序列掺入融合蛋白中。可以基于以下因素选择某些肽连接子序列：(1)它们能够采用柔性延伸构象；(2)它们不能采用可以与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺少可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。在一些实施例中，肽连接子序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala，也可以用于连接子序列中。可用作连接子的氨基酸序列包含Maratea等人，《基因(Gene)》，40：39 46(1985)；Murphy等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，83：8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些。连接子序列的长度通常可以是1至约100个氨基酸。当第一和第二多肽具有可以用于分开功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区域时，不需要连接子序列。

[0075] 连接的DNA序列与合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5'端。类似地，终止翻译和转录终止信号所需的终止密码子仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3'端。

[0076] 在一些实施例中，用于本公开的融合多肽的免疫融合配偶体衍生自蛋白D，即革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白(WO 91/18926)。在一些实施例中，蛋白D衍生物包括蛋白质的大约前三分之一(例如，N-末端的前100 110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以被脂化。在某些一些实施例中，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含在N-末端上以为融合多肽提供额外的外源T细胞表位并增加大肠杆菌中的表达水平(因此用作表达增强子)。脂质尾部确保抗原最佳呈递给抗原呈递细胞。其它融合配偶体包含来自流感病毒的非结构蛋白，NS1(血凝素)。通常，使用N-末端的81个氨基酸，但是可以使用包含T辅助表位的不同片段。

[0077] 在另一实施例中，免疫融合配偶体包括衍生自称为LYTA的蛋白质或其部分(例如C-末端部分)的氨基酸序列。LYTA衍生自肺炎链球菌，其合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；《基因(Gene)》，43：265-292(1986))。LYTA是一种自溶素，其可特异性地降解肽聚糖骨架中的某些键。LYTA蛋白的C末端结构域引起对胆碱或一些胆碱类似物(例如，DEAE)的亲和力。本性质已被用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了在氨基末端含有C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参见《生物技术(Biotechnology)》，10：795-798(1992))。在一个示例性实施例中，LYTA的重复部分可以掺入融合蛋白中。从在残基178处开始的C末端区域中发现了重复部分。示例性重复部分掺入残基188-305。

[0078] 通常，抗原和融合多肽(以及它们的编码多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其原始环境中除去的多肽或多核苷酸。例如，如果天然存在的蛋白质与天然系统中的一些或所有共存材料分离开，则该天然存在的蛋白质是分离的。在一些实施例中，此种多肽具有至少约90％的纯度，至少约95％的纯度或甚至约99％的纯度。例如，如果将多核苷酸克隆到不是天然环境一部分的载体中，则认为该多核苷酸是分离的。

[0079] 表1中提供了示例性分枝杆菌抗原的序列。表2中提供了示例性融合多肽的序列。在一些实施例中，本公开提供了本文所述序列的变体。通常涵盖在本公开中的多肽变体通常表现出沿其长度的与本文所述的多肽序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性。本文使用的术语多肽“变体”是通常在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同于本文具体公开的多肽的多肽。此种变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰本公开的一种或多种上述多肽序列，并使用本领域熟知的多种技术中任何一种评价本文所述的免疫原性活性。

[0080] 例如，本公开的多肽的某些说明性变体包含其中已除去一个或多个部分(例如，N-末端前导序列或跨膜结构域)的那些变体。其它说明性变体包含其中已从成熟蛋白质的N-末端和/或C-末端除去一小部分(例如，约1-30个氨基酸)的变体。

[0081] 在许多情况下，变体将包含保守取代。“保守取代”是其中氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸的取代，使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水/疏水性质基本上不变。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失相互作用的结合能力。在进行此种改变时，可以考虑氨基酸的亲水/疏水指数。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。

[0082] 变体还可以或可替代地含有非保守变化。在一个示例性实施例中，变体多肽与天然序列的不同之处在于五个或更少氨基酸的取代、缺失或添加。变体也可以(或可替代地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水/疏水性质具有最小影响的氨基酸的缺失或添加进行修饰。

[0083] 如上所述，多肽可以包括在蛋白质的N-末端处的信号(或前导)序列，其与翻译同时或在翻译后指导蛋白质的转移。多肽还可以与连接子或其它序列缀合，以便于合成、纯化或标识多肽(例如，聚-His)，或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。

[0084] 当比较多肽序列时，如果两个序列中的氨基酸序列在最大对应性比对时是相同的，则称两个序列是“相同的”，如下所述。

[0085] 用于比较的序列的最佳比对可以使用生物信息学软件Lasergene套件(DNASTAR，Inc.，麦迪逊，威斯康星州)中的Megalign程序，使用默认参数进行。本程序体现了以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)《蛋白质进化变化模型——检测远距离关系的矩阵(A model of evolutionary change in proteins–Matrices for detecting distant relationships)》。在Dayhoff,M.O.(编辑)，《蛋白质序列和结构图谱(Atlas of Protein Sequence and Structure)》，国家生物医学研究基金会，华盛顿特区，第5卷，副刊3，345-358；Hein J.(1990)，《比对和系统发育的统一方法》，626-645，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，第183卷，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)，《生物科学中的计算机应用(CABIOS)》，5：151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)《生物科学中的计算机应用(CABIOS)》，4：11-17；Robinson,E.D.(197 1)，《组合理论(Comb.Theor)》，11：105；Santou,N.Nes,M.(1987)，《分子生物学与进化
(Mol.Biol.Evol.)》，4：406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)，《数值分类——数值分类的原理与实践(Numerical Taxonomy–the Principles and Practice of Numerical Taxonomy)》，弗里曼出版社，旧金山，加利福尼亚州；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)，《美国科学院院报(Proc.Nat'l Acad.,Sci.USA)》，80：726-730中。

[0086] 可替代地，用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman(1981)，《Add.APL.Math》，2：482的局部同一性算法；通过Needleman和Wunsch(1970)，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，48：443的同一性比对算法；通过Pearson和Lipman(1988)，《美国科学院院报(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA)》，85：2444的相似性检索方法；通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，遗传学计算机课题组(GCG)，科学大道575号，麦迪逊，威斯康星州)；或通过检查进行。

[0087] 适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，25：3389-
3402和Altschul等人(1990)《，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215：403-410。可以使用BLAST和BLAST 2.0，例如使用本文所述的参数，以确定本公开的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。

[0088] 在一种方法中，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性百分比”，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)相比，多肽序列在比较窗口中的部分可以包括20％或更少，通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(即，缺口)。百分比通过确定两个序列中存在相同氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置的总数量(即，窗口大小)并将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。

[0089] 示例性融合多肽

[0090] 本文尤其提供了包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种抗原是强效应记忆T细胞激活剂。在一些实施例中，融合多肽进一步包括另外的分枝杆菌抗原，例如融合多肽包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至十种分枝杆菌(Mtb或NTM)抗原。

[0091] 示例性分枝杆菌抗原在表1中提供。应注意，在整个本公开中，包含附图、实例和权利要求，当提及本发明的抗原时，如果不使用具体后缀，例如，如果简单地称为“Rv1813”，则这种使用是指1813-a和1813-b中的任一个或两个。

[0092] 示例性融合多肽在表2中提供。应注意，在整个本公开中，包括附图、实例和权利要求，当提及本发明的融合多肽时，如果不使用具体后缀，例如，如果简单地称为“ID93”，则这种使用是指ID93-1和ID93-2中的任何一个或两个。

[0093] 在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与NTM抗原具有交叉反应性的序列。

[0094] 在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与NTM抗原具有交叉反应性的序列。

[0095] 在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-a、Rv1813-b、Rv1886-a、Rv1886-b、Rv2389-a、Rv2389-b、Rv2608-a或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b、Rv2389-b、Rv1886b或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv2608-b具有至少
90％的序列同一性的序列。

[0096] 在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-a、Rv1813-b、Rv1886-a、Rv1886-b、Rv2389-a、Rv2389-b、Rv2608-a或Rv2608-b的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b、Rv2389-b、Rv1886b或Rv2608-b的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b或Rv2608-b的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv2608-b的序列。

[0097] 在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619或Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。

[0098] 在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619或Rv3620的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619的序列。在一些实施例中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3620的序列。

[0099] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619或Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。

[0100] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619或Rv3620的序列。

[0101] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。

[0102] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619的序列。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-a、Rv1813-b、Rv2608-a或Rv2608-b的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3620的序列。

[0103] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3619具有至少90％的序列同一性的序列。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv1813-b或Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括与Rv3620具有至少90％的序列同一性的序列。

[0104] 在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b或Rv2608-b的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3619的序列。在一些实施例中，强中枢记忆T细胞激活剂抗原包括Rv1813-b或Rv2608-b的序列，并且强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原包括Rv3620的序列。

[0105] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是非结核分枝杆菌(NTM)抗原。

[0106] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是结核分枝杆菌(Mtb)抗原。

[0107] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是NTM抗原。

[0108] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是Mtb抗原。

[0109] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是Mtb抗原，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是Mtb抗原。

[0110] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是NTM抗原，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是Mtb抗原。

[0111] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是Mtb抗原，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是NTM抗原。

[0112] 在一些本文提供的融合多肽中，强分枝杆菌中枢记忆T细胞激活剂抗原是NTM抗原，强分枝杆菌效应记忆T细胞激活剂抗原是NTM抗原。

[0113] 在一些实施例中，融合多肽包括与Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b具有至少90％的序列同一性的抗原。

[0114] 在一些实施例中，融合多肽Rv3619、Rv3620、Rv2389-b和Rv2608-b。

[0115] 在一些实施例中，融合多肽与表2中提供的任何融合多肽的序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是表2中提供的融合多肽中的任一种。

[0116] 在一些实施例中，融合多肽与ID93-1或ID93-2具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID93-1或ID93-2。

[0117] 在一些实施例中，融合多肽与ID93-1或ID93-2具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID93-1或ID93-2。

[0118] 在一些实施例中，融合多肽与ID93-1或ID93-2具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID93-1或ID93-2。

[0119] 在一些实施例中，融合多肽与ID83-1或ID83-2具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID83-1或ID83-2。

[0120] 在一些实施例中，融合多肽与ID97具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，融合多肽是ID97。

[0121]

[0122]

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[0133] 多核苷酸组合物

[0134] 在另一方面，本公开还提供了分离的多核苷酸，其编码本文提供的融合多肽。

[0135] 如本文使用，术语“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指已经分离出不含特定菌种的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段是指含有一个或多个编码序列的DNA区段，但是基本上从获得DNA区段的菌种的总基因组DNA中分离或纯化。术语“DNA区段”和“多核苷酸”包含DNA区段和此种区段的较小片段，以及重组载体，包含例如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。

[0136] 如本领域技术人员将理解，本公开的多核苷酸序列可以包含基因组序列、基因组外和质粒编码序列、以及表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的较小工程化基因区段。此种片段可以是天然分离的，或通过人工合成修饰的。

[0137] 如本领域技术人员将认识到，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包括天然序列(即，编码Mtb抗原、NTM抗原或其部分的内源序列)或可以包括此序列的变体或生物或抗原功能等同物。多核苷酸变体可以含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，如下文进一步描述，使得编码的多肽的免疫原性相对于天然蛋白质不会降低。通常可以如本文所述评估对编码的多肽的免疫原性的影响。术语“变体”还涵盖异种来源的同源基因。

[0138] 在另外的实施例中，本公开提供了分离的多核苷酸，其包括与一个或多个本文公开的序列相同或互补的各种长度的连续序列段。例如，本公开提供了包括一个或多个本文公开的序列的至少约15个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个、500个或1000个或更多个连续核苷酸以及它们之间的所有中间长度的多核苷酸。容易理解的是，在这种情况下，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200
500；500 1,000等的所有整数。

[0139] 无论编码序列本身的长度如何，本公开的多核苷酸或其片段可以与其它DNA序列组合，例如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等，使得它们的总体长度可以显著不同。因此预期，可以使用几乎任何长度的多核苷酸片段，其中总长度可以受制备简易性和在预期的重组DNA方案中的使用所限。

[0140] 此外，本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在多种编码本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，本公开特别考虑了由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。此外，包括本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是内源基因，其由于一个或多个突变(例如，核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变。所得的mRNA和蛋白质可以但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如，杂合、扩增和/或数据库序列比较)标识等位基因。

[0141] 可以使用本领域已知和可获得的各种成熟技术中的任何一种来制备、操作和/或表达编码Mtb抗原和NTM抗原的多核苷酸；编码本文提供的融合多肽的多核苷酸。

[0142] 例如，编码本文提供的融合多肽的多核苷酸序列或其片段或其功能等同物可以用于重组DNA分子中以指导多肽在合适的宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以产生编码基本上相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。

[0143] 如本领域技术人员所理解，在一些情况下产生具有非天然存在的密码子的多肽编码核苷酸序列可能是有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主优选的密码子以增加蛋白质表达速率或产生具有所需性质的重组RNA转录物，所需性质例如半衰期长于由天然存在的序列产生的转录物的半衰期。

[0144] 此外，可以使用本领域通常已知的方法改造本公开的多核苷酸序列，以便出于多种原因改变多肽编码序列，包含但不限于改变基因产物的克隆、加工、表达和/或免疫原性的改变。

[0145] 为了表达所需的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体，即含有插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含有编码目标多肽的序列和适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包含体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。此种技术描述于Sambrook等人，《分子克隆——实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》(1989)和Ausubel等人《，现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(1989)。多种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以用于容纳和表达多核苷酸序列。这些包含但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

[0146] 存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区域——增强子、启动子、5'和3'非翻译区域——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。取决于使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包含组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，拉霍亚，加利福尼亚州)或PSPORT1质粒(Gibco BRL，盖瑟斯堡，马里兰州)等的杂合lacZ启动子。在哺乳动物细胞系统中，可以使用来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，则基于SV40或EBV的载体可以有利地与适当的可选择标志物一起使用。

[0147] 在细菌系统中，可以根据表达多肽的预期用途而选择多种表达载体。例如，当需要大量时，可以使用指导易于纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此种载体包含但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码目标多肽的序列可以与氨基末端Met的序列和(3-半乳糖苷酶的后续7个残基在框内连接到载体中，从而产生杂合蛋白；连接在pIN载体(Van Heeke和Schuster《，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，264：5503 5509(1989))等中。pGEX载体(Promega，麦迪逊，威斯康星州)也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此种融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上并随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。可以将在此种系统中制造的蛋白质设计成包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，使得克隆的目标多肽可以随意从GST部分释放。

[0148] 在酵母(酿酒酵母)中，可以使用多种含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。关于综述，参见Ausubel等人(同上)和Grant等人，《酶学方法(Methods Enzymol.)》，153：516-544(1987)。

[0149] 在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可以由多种启动子中的任何一个驱动。例如，病毒启动子，诸如CaMV的35S和19S启动子，可以单独使用或与来自TMV的ω前导序列组合使用(Takamatsu，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》，6：307-311(1987))。可替代地，可以使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚单位或热休克启动子(Coruzzi等人，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》，3：1671-1680(1984)；Broglie等人，《科学(Science)》，
224：838-843(1984)；和Winter等人，《细胞分化的结果与问题(Results Probl.Cell Differ.)》，17：85-105(1991))。可以通过直接DNA转化或病原体介导转染将这些构建体引入植物细胞中。此种技术描述于多个通常可获得的综述(参见例如McGraw Hill的Hobbs，《科技年鉴(Yearbook of Science and Technology)》，第191-196页(1992))。

[0150] 昆虫系统也可以用于表达目标多肽。例如，在一个此种系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆到病毒的非必需区域，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入多肽编码序列将使多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后可以使用重组病毒感染例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，可以在其中表达目标多肽(Engelhard等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》，91：3224-3227(1994))。

[0151] 在哺乳动物宿主细胞中，通常可获得多种基于病毒的表达系统。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将编码目标多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必需E1或E3区域可以用于获得能够在受感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan和Shenk，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》，81：3655-3659(1984))。另外，转录增强子，例如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。

[0152] 特异性起始信号也可以用于实现编码目标多肽的序列的更有效翻译。此种信号包含ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列被插入合适的表达载体的情况下，可能不需要另外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况下，应该提供包含ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应该在正确的阅读框内，以确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源的，即可以是天然的，又可以是合成的。表达效率可以通过包含适合于所用特定细胞系统的增强子来增强，例如文献中描述的那些(Scharf等人《，细胞分化的结果与问题(Results Probl.Cell Differ.)》，20：125-162(1994))。

[0153] 另外，可以针对其调节插入序列的表达或以所需方式加工表达的蛋白质的能力来选择宿主细胞株。多肽的此种修饰包含但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白质的“前原”形式的翻译后加工也可以用于促进正确插入、折叠和/或功能。可以选择具有特异性细胞机制和针对此种翻译后活性的特性机制的不同宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138，以确保外源蛋白的正确修饰和加工。

[0154] 对于重组蛋白的长期高产率的生产，通常需要稳定表达。例如，可以使用表达载体转化稳定表达目标多核苷酸的细胞系，所述表达载体可以在相同或不同的载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件和可选择标志物基因。在引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们切换到选择性培养基。可选择标志物的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和恢复。可以使用适合细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性克隆。

[0155] 可以使用任何数量的选择系统来恢复转化的细胞系。这些包含但不限于可以分别用于tk-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，《细胞(Cell)》，11：223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，《细胞(Cell)》，22：817-823(1990))基因。此外，抗代谢物，抗生素或除草剂抗性可以用作选择的基础；例如，dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》，77：3567-70(1980))；npt，其赋予对氨基糖苷、新霉素和G-418的抗性(ColbereGarapin等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，150：1-14(1981))；和als或pat，其分别赋予对氯磺隆和草胺膦乙酰转移酶的抗性(Murry，同上)。已经描述了另外的可选择基因，例如trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；或hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman和Mulligan《，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》，85：8047-51(1988))。因花青素、(3-葡萄糖醛酸酶及其底物GUS、荧光素酶及其底物荧光素等标志物不仅被广泛用于标识转化株，而且还用于量化可归因于特定载体系统的瞬时或稳定的蛋白质表达的量(Rhodes等人《，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》，55：121-131(1995))，可见标志物的使用已经普及。

[0156] 使用对产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体检测和测量多核苷酸编码产物表达的各种方案是本领域已知的。实例包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其它测定描述于Hampton等人，《血清学方法——实验室手册(Serological Methods a Laboratory Manual)》(1990)和Maddox等人《，实验医学学报(J.Exp.Med.)》158：1211-1216(1983)等。

[0157] 多种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于各种核酸和氨基酸测定。用于产生用于检测与多核苷酸相关的序列的标记杂交或PCR探针的手段包含寡标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或使用标记的核苷酸的PCR扩增。可替代地，可以将序列或其任何部分克隆到用于产生mRNA探针的载体中。此种载体是本领域已知的，可商购获得，并且可以用于通过添加适当的RNA聚合酶(例如，T7、T3或SP6)和标记的核苷酸来体外合成RNA探针。可以使用各种市售试剂盒进行这些程序。可以使用的合适的报告分子或标记包含放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。

[0158] 用目标多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适于从细胞培养物中表达和回收蛋白质的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白质可以在细胞内分泌或包含在细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。如本领域技术人员理解，含有本公开的多核苷酸的表达载体可以设计为含有指导编码多肽通过原核或真核细胞膜分泌的信号序列。其它重组构建体可以用于将编码目标多肽的序列与编码多肽结构域的核苷酸序列连接，所述多肽结构域将促进可溶性蛋白质的纯化。

[0159] 除了重组生产方法之外，本公开的多肽及其片段可以通过使用固相技术的直接肽合成来生产(Merrifield，《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》，85：2149-2154(1963))。可以使用人工技术或通过自动化进行蛋白质合成。例如，可以使用Applied Biosystems 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。可替代地，可以分别化学合成各种片段，并使用化学方法组合以产生全长分子。

[0160] 表3提供了编码用于构建本文提供的融合多肽的示例性Mtb抗原的示例性核苷酸序列。同样，表4提供了编码本发明的示例性融合多肽的示例性核苷酸序列。

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[0177] 预防性和治疗性组合物

[0178] 在另一方面，本公开涉及一种或多种本文公开的多核苷酸、多肽或其它组合物在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中的制剂，其用于向细胞或受试者单独或与一种或多种其它治疗方式组合施用。此种药物组合物可以用于预防性或治疗性实施例。当用合适的免疫刺激剂/佐剂系统配制时，制剂可以进一步使用疫苗。

[0179] 还应理解，如果需要，本公开的组合物也可以与其它试剂组合施用，诸如例如其它蛋白质或多肽或各种药物活性剂。实际上对也可以包含的其它组分没有限制，条件是另外的试剂不会对根据本公开的目标造成显著的不利影响。

[0180] 在某些实施例中，本公开的组合物与一种或多种免疫刺激剂组合配制。免疫刺激剂可以是增强或加强对外源抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包含佐剂、可生物降解的微球(例如，聚乳酸半乳糖)和脂质体(其中掺入化合物；参见例如Fullerton，美国专利第4,235,877号)。疫苗制备通常描述于例如Powell和Newman编辑，《疫苗设计(亚单位和佐剂进展)(Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach))》(1995)。

[0181] 任何各种免疫刺激剂可以用于本公开的组合物中。例如，可以包含佐剂。多种佐剂含有设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，以及免疫反应刺激剂，例如脂质A(天然或合成的)、百日咳博德特氏菌或分枝杆菌菌种或分枝杆菌衍生的蛋白质。合适的佐剂可商购获得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，底特律，密歇根州)；默克佐剂65(Merck and Company，Inc.，罗威，纽约州)；AS-2及其衍生物(SmithKline Beecham，费城，宾夕法尼亚州)；CWS、TDM、Leif、铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性混悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰基脂质A和植物皂苷(quil A)。细胞因子，例如GM-CSF或白细胞介素-2、-7或-12，也可以用作佐剂。

[0182] 可用于本公开的背景的其它说明性佐剂包含Toll样受体激动剂，例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR7/8、TLR9激动剂等。其它说明性佐剂包含咪喹莫特、加地喹莫特、瑞喹莫德和相关化合物。

[0183] 某些示例性组合物采用设计用于诱导主要为Th1型免疫反应的佐剂系统。高水平的Th1型细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)趋于有利于诱导对施用的抗原的细胞介导的免疫反应。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)趋于有利于诱导体液免疫反应。在施用本文提供的组合物后，患者可以支持包含Th1和Th2型反应的免疫反应。在其中反应主要是Th1型的一个示例性实施例中，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平增加更多。使用标准测定可以容易地评估这些细胞因子的水平。关于细胞因子家族的综述，参见Mossman和Coffman，《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)》，7：145-173(1989)。

[0184] 用于引发主要为Th1型的反应的某些佐剂包含例如单磷酰基脂质A(例如，3-脱氧酰化的单磷酰基脂质A(3D-MPLTM))与铝盐(美国专利第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号；和第4,912,094号)的组合。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导主要的Th1反应。此种寡核苷酸是公知的，并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/
33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号。免疫刺激DNA序列也描述于例如Sato等人，《科学(Science)》，273：352(1996)。另一种说明性佐剂包括皂苷，例如植物皂苷，或其衍生物，包含QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，弗雷明汉，马萨诸塞州)；七叶树皂苷；毛地黄皂苷；或满天星(Gypsophila)或藜(Chenopodium quinoa)皂苷。其它说明性制剂包含本公开的佐剂组合中的一种以上皂苷，例如包括以下的组中的至少两种的组合：
QS21、QS7、植物皂苷、0-七叶树皂苷或毛地黄皂苷。

[0185] 在其它实施例中，佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)佐剂，如美国专利申请公开第2008/0131466号中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。

[0186] 在一个特定实施例中，佐剂系统包含单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，例如WO 94/00153中所述的QS21和3D-MPLTM佐剂的组合，或如WO 96/33739中所述的其中QS21用胆固醇淬灭的反应原性较低的组合物。其它制剂包括水包油乳液和生育酚。在水包油乳液中使用QS21、3DMPLTM佐剂和生育酚的另一种佐剂制剂描述于WO 95/17210。

[0187] 另一种增强的佐剂系统涉及含CpG的寡核苷酸和如WO 00/09159中公开的皂苷衍生物的组合。其它说明性佐剂包含Montanide ISA 720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，加利福尼亚州，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如，SBAS-2、AS2'、AS2、"SBAS-4、或SBAS6，可购自SmithKline Beecham，里克桑萨尔，比利时)、Detox、RC-529(Corixa，汉密尔顿，蒙大拿州)和其它氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)，例如在未决的美国专利申请系列第08/853,826号和第09/074,720号中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文，和聚氧乙烯醚佐剂，例如WO 99/52549A1中描述的那些。

[0188] 本公开的组合物还可以或可替代地包括对分枝杆菌抗原具有特异性的T细胞。此种细胞通常可以使用标准程序在体外或离体制备。例如，T细胞可以从患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血的一部分中分离。可替代地，T细胞可以衍生自相关或不相关的人类、非人类哺乳动物，细胞系或培养物。

[0189] 可以用本公开的多肽、编码此多肽的多核苷酸和/或表达此多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。此刺激在足以允许产生对多肽具有特异性的T细胞的条件和时间下进行。在一些实施例中，多肽或多核苷酸存在于递送媒剂(例如，微球)内，以促进特异性T细胞的产生。

[0190] 如果T细胞特异性地增殖、分泌细胞因子，或杀死包被有多肽或表达编码多肽的基因的靶细胞，则认为T细胞对本公开的多肽具有特异性。可以使用多种标准技术中的任何一种来评价T细胞特异性。例如，在铬释放测定或增殖测定中，与阴性对照相比，裂解和/或增殖中的刺激指数增加超过2倍，表明T细胞特异性。可以进行此种测定，例如Chen等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，54：1065-1070(1994))。可替代地，可以通过各种已知技术完成T细胞增殖的检测。例如，可以通过测量DNA合成的增加速率来检测T细胞增殖(例如，通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞的培养物并测量掺入DNA中的氚化胸苷的量)。与本公开的多肽(100ng/ml 100μg/ml，或甚至200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天可导致T细胞增殖至少增加2倍。如上所述接触2-3小时应该导致T细胞的激活，如使用标准细胞因子测定测量，其中细胞因子释放水平增加两倍(例如，TNF或IFN-γ)指示T细胞激活(参见Coligan等人《，现代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》，第1卷(1998))。响应于多肽、多核苷酸或表达多肽的APC而被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以使用标准技术扩增蛋白质特异性T细胞。在一些实施例中，T细胞衍生自患者、相关供体或无关供体，并在刺激和扩增后施用于患者。

[0191] 在本公开的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的配制是本领域技术人员公知的，在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案的开发也是如此，包含例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内和肌肉内施用和配制。

[0192] 在某些应用中，本文公开的药物组合物可以通过口服施用而向受试者递送。因此，这些组合物可以用惰性稀释剂或可吸收的可食用载剂配制，或者它们可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可以压制成片剂，或者它们可以直接掺入饮食的食物中。

[0193] 在某些情况下，可能需要肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、阴道内、直肠或甚至腹膜内递送本文公开的药物组合物，例如如美国专利第5,543,158号；美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号(各自具体地通过引用整体并入本文)中所述。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适当地与表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

[0194] 适于注射使用的药物形式包含无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，其具体地通过引用整体并入本文)。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是易于注射的流体。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如，细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用涂层(例如，卵磷脂)，在分散的情况下通过维持所需的粒度，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以促进对微生物作用的预防。在一些实施例中，可能需要包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

[0195] 例如，对于以水溶液在肠胃外施用，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并将其加入到1000ml皮下注射液中或在建议的输注部位注射(参见例如《雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第15版，1035-1038和1570-1580)。取决于所治疗的受试者的病状，剂量必然会有一些不同之处。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、致热原性以及一般安全性和纯度标准。

[0196] 通过将所需量的活性化合物按需掺入含有上面列举的各种其它成分的适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。

[0197] 本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)以及与无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。用游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。在配制时，溶液可以以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。

[0198] 如本文使用，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、混悬液、胶体等。此种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。考虑了任何常规介质或试剂在治疗性组合物中的用途，其与活性成分不相容的情况除外。补充的活性成分也可以掺入组合物中。

[0199] 短语“药学上可接受的”是指当施用于人类时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本领域中是公知的。通常，将此种组合物制备成注射剂，或液体溶液或混悬液；也可以制备适于注射中溶液或混悬液或注射前液体的固体形式。制剂也可以乳化。

[0200] 在某些实施例中，药物组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送媒剂递送。通过鼻气溶胶喷雾将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺部的方法已描述于例如美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(各自具体地通过引用整体并入本文)。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,
725,871号，具体地通过引用整体并入本文)的药物递送也是制药领域中公知的。同样地，以聚四氟乙烯支撑基质形式的透粘膜药物递送描述于美国专利第5,780,045号(具体地通过引用整体并入本文)。

[0201] 在某些实施例中，递送可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等进行，以将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，本公开的组合物可以配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中的递送。可以使用已知和常规技术进行这种递送媒剂的配制和使用。

[0202] 使用方法

[0203] 发明人已发现某些分枝杆菌抗原能够引发强中枢记忆T细胞反应，并且某些分枝杆菌抗原能够引发强效应记忆T细胞反应。包含在单一组合物中的T细胞表型的此双重功能可以极大地有益于改善预防性或治疗性组合物用于预防或治疗继发性TB或原发性或继发性NTM感染的疗效。因此，本文提供了包括至少两种分枝杆菌抗原的融合多肽，其中一种分枝杆菌抗原是强中枢记忆T细胞激活剂，并且其中一种分枝杆菌抗原是强效应记忆T细胞激活剂。示例性融合多肽在表2中提供。

[0204] 当受试者的FDS在单次免疫后300天内小于或等于约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.125、0.1或甚至约0.0625时，引发强中枢记忆T细胞激活剂反应。

[0205] 当受试者的FDS在一次或多次免疫后大于或等于约3.0、4、5、6、7、8、9、10、16或甚至约32时，引发强效应记忆T细胞激活剂反应。

[0206] 本文提供了融合多肽(和包括融合多肽的组合物，例如药物组合物)的几种用途。

[0207] 在一些实施例中，本文提供了一种在受试者中激活强分枝杆菌中枢记忆T细胞反应和强分枝杆菌效应记忆T细胞反应的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者定量干扰素阴性。

[0208] 在一些实施例中，本文提供了一种治疗继发性结核感染(例如，潜伏性Mtb感染的再激活)的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于治疗潜伏性Mtb感染的再激活。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。在一些实施例中，受试者正在经历第一次再激活。在一些实施例中，受试者正在经历第三次、第四次或甚至第五次再激活。

[0209] 在一些实施例中，本文提供了一种预防受试者中的继发性结核感染(例如，防止潜伏性Mtb感染的再激活)的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于防止潜伏性Mtb感染的再激活。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。在一些实施例中，受试者正在经历第一次再激活。在一些实施例中，受试者正在经历第三次、第四次或甚至第五次再激活。

[0210] 在一些实施例中，本文提供了一种治疗受试者中的继发性结核感染(例如，Mtb的第二次感染)的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于预防Mtb的第二次感染，其中第一次感染是不同菌株(不同临床分离株)的Mtb感染。在一些实施例中，第二次感染是多药耐药性(MDR)Mtb菌株感染。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。

[0211] 在一些实施例中，本文提供了一种预防受试者中的继发性结核感染(预防Mtb的第二次感染)的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，所述方法用于预防Mtb的第二次感染，其中第一次感染是不同菌株(不同临床分离株)的Mtb感染。在一些实施例中，第二次感染是多药耐药性(MDR)Mtb菌株感染。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。

[0212] 在一些实施例中，本文提供了一种治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。在任何这些实施例中，NTM感染可以是初次NTM感染或第二次NTM感染(例如，继发性感染)。NTM可以是任何一种NTM菌种，包含例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、李氏分枝杆菌(M.lilandii)、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种。融合多肽可以是任何一种本文所述的融合多肽，包含例如与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性的融合多肽。融合多肽可以是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。

[0213] 在一些实施例中，本文提供了一种预防受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。在任何这些实施例中，NTM感染可以是初次NTM感染或第二次NTM感染(例如，继发性感染)。NTM可以是任何一种NTM菌种，包含例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、李氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种。融合多肽可以是任何一种本文所述的融合多肽，包含例如与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性的融合多肽。融合多肽可以是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。

[0214] 在一些实施例中，本文提供了一种治疗或预防由Mtb或NTM感染引起的肺部感染的方法，其中肺部疾病是原发性NTM感染、继发性NTM感染或潜伏性NTM感染的再激活的结果。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。
在一些实施例中，受试者先前已经接受过TB感染治疗，并且在治疗时没有活动性疾病(例如，TB或NTM疾病)。在一些实施例中，受试者先前已经接受过NTM感染治疗，并且在治疗时没有活动性疾病(例如，TB或NTM疾病)。NTM可以是任何一种NTM菌种，包含例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、李氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种。

[0215] 在一些实施例中，本文提供了一种减少受试者中的活动性疾病(例如，活动性肺部感染)的征象或症状的方法，其包括向受试者施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。活动性疾病可能与继发性Mtb或NTM感染有关。活动性疾病可能与NTM感染有关。活动性疾病可能是TB并与继发性Mtb感染有关。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阳性。在一些实施例中，受试者是定量干扰素阴性。

[0216] 在一些实施例中，在施用化学治疗剂之前，同时或之后施用有效量的任何一种融合多肽或包括本文提供的融合多肽的药物组合物。

[0217] 试剂盒和制品

[0218] 在某些实施例中还考虑了试剂盒，其包括例如本文提供的融合多肽、Mtb抗原、NTM抗原和药物组合物；编码本文提供的融合多肽、Mtb抗原和NTM抗原的多核苷酸；和本文提供的免疫佐剂，其可以在一个或多个容器中提供。在一个实施例中，组合物的所有组分一起存在于单个容器中，但是本发明的实施例并不限于此并且还考虑两个或更多个容器，其中例如免疫佐剂与融合多肽组合物组分分开，而不是与之接触。

[0219] 本发明的试剂盒可以进一步包括如本文所述的使用说明书或用于混合小瓶中所容纳的材料的说明书。在一些实施例中，小瓶中的材料是干燥的或冻干的。在一些实施例中，小瓶中的材料是液体。

[0220] 根据此种试剂盒实施例的容器可以是任何合适的容器、器皿、小瓶、安瓿、管、杯、盒、瓶、烧瓶、罐、盘、单孔或多孔设备的孔、贮存器、槽等，或其中可以放置、存储和/或运输本文公开的组合物并且可以接近以移除内容物的装置。通常，此容器可以由与预期用途相容的材料制成，并且可以容易地从中回收所容纳的内容物。此种容器的非限制性实例包含玻璃和/或塑料密封或可再密封的管和安瓿，包含具有橡胶隔膜或其它密封装置的那些，所述橡胶隔膜或其它密封装置与使用针和注射器取出内容物相容。此种容器可以例如由玻璃或化学相容的塑料或树脂制成，其可以由一种材料制成或可以涂覆有该材料，该材料允许从容器中有效回收材料和/或保护材料免受例如降解条件(例如紫外线或极端温度)或不需要的污染物(包含微生物污染物)的引入的影响。容器优选是无菌的或可灭菌的，并且由可以与任何载剂、赋形剂、溶剂、媒剂等相容的材料制成，例如其可以用于混悬或溶解本文所述的融合多肽、抗原和药物组合物。

[0221] TLR4激动剂

[0222] 本文提供了可用于本文所述组合物和方法的TLR4激动剂(toll样受体4激动剂)。TLR4激动剂可以包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，例如美国专利公开第US2007/021017号、第US2009/045033号、第US2010/037466号和第US2010/0310602号中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。

[0223] 例如，TLR4激动剂可以是具有以下式(IV)结构的合成GLA佐剂：

[0224]

[0225] 或其药学上可接受的盐，其中：

[0226] L1、L2、L3、L4、L5和L6相同或不同并且独立地为-O-、-NH-或-(CH2)-；

[0227] L7、L8、L9和L10相同或不同并且独立地不存在或为-C(＝O)-；

[0228] Y1是酸官能团；

[0229] Y2和Y3相同或不同并且独立地为-OH、-SH或酸官能团；

[0230] Y4是-OH或-SH；

[0231] R1、R3、R5和R6相同或不同并且独立地为C8-13烷基；和

[0232] R2和R4相同或不同并且独立地为C6-11烷基。

[0233] 在合成GLA结构的一些实施例中，R1、R3、R5和R6是C10烷基；R2和R4是C8烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C9烷基。

[0234] 例如，在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(V)结构的合成GLA佐剂：

[0235]

[0236] 在一个具体实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；R2和R4是C12-C20烷基。

[0237] 在另一具体实施例中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C13烷基。

[0238] 在另一具体实施例中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C10烷基；R2和R4是C8烷基。

[0239] 在另一具体实施例中，GLA具有上述通式，其中R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C9烷基。

[0240] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(V)结构的合成GLA佐剂：

[0241]

[0242] 在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C9烷基。

[0243] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(VI)结构的合成GLA佐剂：

[0244]

[0245] 在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；R2和R4是C9-C20烷基。在某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C9烷基。

[0246] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(VII)结构的合成GLA佐剂：

[0247]

[0248] 在上述GLA结构的某些实施例中，R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；R2和R4是C9-C20烷基。1 3 5 6 2 4
在某些实施例中，R、R、R和R是C11烷基；R和R是C9烷基。

[0249] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构(SLA)的合成GLA佐剂：

[0250]

[0251] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：

[0252]

[0253] 在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构的合成GLA佐剂：

[0254]

[0255] 在另一实施例中，TLR4激动剂是掺入本文所述的组合物中的减毒脂质A衍生物(ALD)。ALD是脂质A样分子，其已经被改变或构建，使得分子显示出较小或不同的脂质A的不利影响。这些不利影响包含致热原性、局部施瓦茨曼反应性和毒性，如以鸡胚50％致死剂量测定(CELD50)评价。根据本公开有用的ALD包含单磷酰基脂质A(MLA)和3-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MLA)。MLA和3D-MLA是已知的，不需要在本文详细描述。参见例如1984年3月13日授权的美国专利第4,436,727号，该专利被转让给Ribi ImmunoChem Research,Inc.，其公开了单磷酰基脂质A及其制造。授权于Myers等人的美国专利第4,912,094号和复审证书B1美国专利第4,912,094号，也被转让给Ribi ImmunoChem Research,Inc.，其体现了3-脱酰基单磷酰基脂质A及其制造方法。关于MLA和3D-MLA的这些专利中的每一个的公开内容通过引用并入本文。

[0256] 在上述TLR4激动剂化合物中，总电荷可以根据分子中的官能团确定。例如，磷酸根基团可以带负电或为中性，这取决于磷酸根基团的电离状态。

[0257] TLR4激动剂可以使用本领域已知的方法配制，例如，作为水性纳米混悬液、水包油乳液、脂质体和明矾吸附制剂。(参见例如Misquith等人，《胶体和表面B：生物界面(Colloids Surf B Biointerfaces.)》，2014年1月1日；113中的GLA-AF、GLA-SE、GLA-LS和GLA-明矾)

[0258] 本文提供了预防或治疗受试者中的非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法，其包括单独地或与任何一种本文所述的融合多肽相组合地向受试者施用有效量的TLR4激动剂(即，任何本文所述的TLR激动剂)。受试者可以是定量干扰素阳性或阴性。在任何这些实施例中，NTM感染可以是初次NTM感染或第二次NTM感染(例如，继发性感染)。NTM可以是任何一种NTM菌种，包含例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、李氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种。融合多肽可以是任何一种本文所述的融合多肽，包含例如与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性的融合多肽。融合多肽可以是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。在示例性实施例中，TLR是具有式(IV)结构的SLA或GLA，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C13烷基。

[0259] 本文还提供了降低受试者中NTM细菌负荷的方法，其包括使受试者的细胞与以下相接触：(i)TLR4激动剂(即，任何本文所述的TLR4激动剂)，(ii)任何本文所述的融合多肽或(iii)其组合。受试者的细胞可以在受试者体内，并且通过向受试者施用TRL4激动剂和/或任何本文所述的融合多肽来进行接触。NTM可以是任何一种NTM菌种，包含例如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、热那亚分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、李氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、牡牛分枝杆菌、偶发分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌菌种。融合多肽可以是任何一种本文所述的融合多肽，包含例如与ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2、ID97或ID91具有至少90％的序列同一性的融合多肽。融合多肽可以是ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。在示例性实施例中，TLR是具有式(IV)结构的SLA或GLA，其中R1、R3、R56 2 4
和R是C11烷基；R和R是C13烷基。

[0260] 还提供了药物组合物，其包括本文所述的TLR4激动剂(例如，配制的GLA)与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合，并且可以进一步包括一种或多种本文提供的组分，其选自例如抗原、另外的TLR激动剂和辅助佐剂。

[0261] 还提供了药物组合物，其包括本文所述的TLR4激动剂(例如，配制的GLA)与任何本文所述的融合多肽的组合，包含例如ID93-1、ID93-2、ID83-1、ID83-2或ID97或ID91。

[0262] 向受试者施用TLR4激动剂(包含GLA)以治疗疾病的一般方法是本领域已知的，并且可以在本文中用于确定用于治疗受试者中的NTM和用于减少受试者中细菌负荷的优化制剂。例如，通常通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或通过其它途径，按约0.001μg/kg至约100mg/kg体重施用。在一个更具体的实施例中，剂量为约0.001μg/kg至约1mg/kg。在另一具体实施例中，剂量为约0.001至约50μg/kg。在另一具体实施例中，剂量为约0.001至约15μg/kg。在另一具体实施例中，施用的GLA的量为约0.01μg/剂至约5mg/剂。在另一具体实施例中，施用的GLA的量为约0.1μg/剂至约1mg/剂。在另一具体实施例中，施用的GLA的量为约
0.1μg/剂至约100μg/剂。在另一具体实施例中，施用的GLA为约0.1μg/剂至约10μg/剂。

[0263] 对于本领域技术人员显而易见的是，施用的次数和频率将取决于宿主的反应。用于治疗用途的“药学上可接受的载剂”在制药领域中是公知的，并且描述于例如《雷明登氏药学全书(Remingtons Pharmaceutical Sciences)》，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)。例如，可以使用生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料、甚至调味剂。药物组合物可以是本领域已知的允许向患者施用组合物的任何形式。配制药物组合物以便在向患者施用组合物时使其中含有的活性成分具有生物利用度。

[0264] 提供以下实例是为了说明而不是为了限制。

[0265] 实例

[0266] 实例中使用的GLA具有式(IV)的结构，其中R1、R3、R5和R6是C11烷基；R2和R4是C13烷基。

[0267] 实例1：ID93-2表达载体的构建

[0268] 使用克隆策略将选择的Mtb抗原分别从Mtb HRv37基因组DNA克隆到pET-28a载体(Invitrogen)中(Bertholet等人，2008；《标识人T细胞抗原用于开发针对结核分枝杆菌的疫苗(Identification of human T cell antigens for the development of vaccines against Mycobacterium tuberculosis)》)，所述克隆策略产生N末端6xHis标签，用于纯化ID93-2的研究批次。设计克隆引物以引入适当的限制性位点以允许定向克隆。用于扩增四种抗原的引物的序列列于表5中。

[0269] 表5：ID93-2组分抗原的克隆引物

[0270]

[0271] 对于临床生产，使用设计用于在没有任何添加的氨基酸标签的情况下表达的策略将ID93-2的整个序列亚克隆到pET-29a载体中。使用标准分子生物学技术，如下构建ID93-2/pET-29a表达载体。从HRv37基因组DNA中PCR扩增Rv1813，用NdeI/SacI酶切，并连接到空的pET-28a载体中以产生pET-28a/Rv1813构建体。接下来，从HRv37基因组DNA PCR扩增Rv3620，用SacI/SalI酶切，并连接到pET-28a/Rv1813构建体中以产生pET-28a/Rv1813/Rv3620构建体。从HRv37基因组DNA PCR扩增Rv2608，用SalI/HindIII酶切，并连接到pET-
28a/Rv1813/Rv3620构建体中以产生pET-28a/Rv1813/Rv3620/Rv2608构建体。从HRv37基因组DNA PCR扩增Rv3619，用NdeI/KpnI酶切，并连接到pET-28a/Rv1813/Rv3620/Rv2608构建体中以产生pET-28a/Rv1813/Rv3620/Rv2608/Rv3619构建体。将所得的四抗原融合构建体(ID93-2)用NdeI/HindIII酶切，将ID93-2序列亚克隆到异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型pET-29a表达载体中。pET-29a载体具有T7启动子并赋予卡那霉素耐药性。通过测序和限制性片段分析确认ID93-2表达构建体。将ID93-2/pET-29a表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)HMS174细胞中，制造主细胞库(MCB)。

[0272] 根据本领域已知的方法通过标准发酵生产ID93-2。收获细胞培养物并沉淀。将细胞沉淀重混悬于裂解缓冲液(25mM Tris，5mM EDTA，pH 8.0)中，并使用M-110Y破坏细胞。将细胞在15,000-18,000psi的压力下通过微流化器两次。将混
悬液以16,000g离心2小时。在这些条件下，含有ID93-2蛋白的包涵体(IB)沉淀，而大部分细胞碎片保留在上清液中。通过柱色谱法在阴离子交换柱上结合来纯化ID93-2蛋白，并用DEAE洗脱缓冲液洗脱。将DEAE琼脂糖凝胶FF洗脱液加载到另一个平衡的阴离子交换柱Q琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱上。将含有蛋白质的流过物收集在单个容器中。将5％甘油硫酸铵加入Q琼脂糖凝胶FF流过物(含有ID93蛋白)并温育1小时。将含有甘油的蛋白池加载到平衡的疏水相互作用色谱柱上，用苯基琼脂糖凝胶HP的洗脱缓冲液洗脱柱子。将β-巯基乙醇加入到洗脱液池中至终浓度为5mM并温育30分钟以减少蛋白质样本，并将该池渗滤至20mM Tris pH 8.0，将蛋白质浓度调节至0.5mg/mL，用0.22μm滤膜过滤灭菌，并储存在<65℃。

[0273] 实例2：ID93-2GLA-SE的临床试验，用于评估ID93-2+GLA-SE在向已接种BCG并且生活在TB流行地区的成年人施用时是否具有免疫原性，其中TB流行地区有80％的成年人潜伏性感染结核分枝杆菌。

[0274] BCG是目前唯一获准用于人类的TB疫苗，似乎可有效预防新生儿和幼儿中的严重播散性疾病，但无法抵御成年人中的肺部TB(Andersen P，Doherty TM。《BCG的成功和失败——新型结核疫苗的意义(The success and failure of BCG-implications for a novel tuberculosis vaccine)》。《自然综述微生物学(Nat Rev Microbiol)》，2005；3：656-662)。尽管在人体试验中的BCG接种已显示出易变的疗效，但BCG不太可能在不久的将来被替换，并且是所有其它实验疫苗进行比较的参考标准。包含美国在内的一些TB发病率较低的国家尚未采用或已退出常规BCG接种，而更愿意使用抗生素筛查和治疗TB。

[0275] 临床试验

[0276] 进行1b期、随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增评价试验，在第0天、第28天和第112天，与2μg GLA-SE佐剂剂量组合，将两种剂量水平的ID93-2组合物肌肉内(IM)施用给群组1、2和3(分别为10μg、2μg和10μg)。在第0天，与5μg GLA-SE佐剂剂量组合，用10μg ID93-2组合物IM免疫群组4。本研究是在先前进行了BCG接种的66名HIV阴性、健康的南非受试者中进行的。用于免疫南非受试者的BCG疫苗缺少ID93-2蛋白中发现的抗原组分RV 3619和RV
3620。QFT-(群组1-4)(QFT阴性作为非潜伏性感染结核分枝杆菌的受试者的指示)受试者和QFT+阳性群组2、3、4)参与者都参加了该研究。

[0277] 在第0天、第28天和第112天，将受试者以3：1的比例(群组1)或5：1的比例(群组2-4)随机分配至安慰剂或治疗组，以接受ID93-2+GLA-SE或盐水安慰剂。

[0278] 表6中示出了对血液样品进行的免疫测定的总结。

[0279] 表6：进行的免疫学分析的总结

[0280]

[0281] 用于分析受试者样本的免疫学方法

[0282] 短期全血刺激和低温保存的方法。使用1μg/ml/Rv1813(a或b)、Rv2608(a或b)、Rv3619或Rv3620池的多肽，在75分钟的静脉切开术中刺激来自每个研究受试者的1mL新鲜全血。对于每个参与者和时间点，使用5μg/ml PHA作为阳性对照，并使用未受刺激的管作为阴性对照。在所有测定条件下包含共刺激抗体抗-CD28和抗-CD49d(BD Biosciences，1μg/mL)。将全血在37℃下温育12小时，并加入布雷菲德菌素-A(Sigma，10μg/mL)进行最后5小时的温育。然后用EDTA(Sigma，2μM)收获血液，裂解红细胞，并用FACS裂解溶液(BD Biosciences)固定白细胞。将白细胞沉淀并用10％DMSO(Sigma)的40％胎牛血清(HyClone)溶液冷冻保存。细胞内细胞因子染色(ICS)的方法。

[0283] 细胞内细胞因子染色(ICS)是一种广泛使用的基于流式细胞术的测定，其检测响应于抗原刺激的细胞内质网内的细胞因子的表达和累积。ICS可以与多种与细胞因子和细胞标志物结合的抗体组合使用，以对复杂细胞群(例如，外周血)内的单个细胞进行深入的表型和功能分析。在本研究中，我们在完成随访研究期后对来自每个个体的冷冻保存的、受刺激的白细胞进行分批分析，以进行ICS抗体染色，以确保结果中较少的技术测定改变。在这些对本研究中的固定白细胞的分析之前是一个优化过程，其估计以下内容：最佳抗体浓度、最佳抗体-荧光染料组合、最佳光电倍增管(PMT)电压、荧光减一(FMO)对照和最佳门控策略。在配置用于4个激光器和18个检测器的BD LSR II细胞计上进行染色细胞的采集。

[0284] 将来自全血的受刺激的、固定的和冷冻的白细胞在37μC的水浴中解冻短时间。然后将解冻的细胞转移到含有磷酸盐缓冲盐水(PBS，BioWhittaker)的标记管中，并使用破膜/洗涤溶液(BD Biosciences)洗涤和破膜。然后用以下抗人抗体对细胞染色：CD3-BV421(UCHT1)、CD4-BV786(SK3)、CD8-PerCP-Cy5.5(SK1)、CCR7-PE(150503)、CD45RA-BV605(HI100)、CD14-BV650(M5E2)、CD16PE-CF594(3G8)、IFN-g-AF700(B27)、IL-2-FITC(5344.111)、IL-17-AF647(SCPL1362)(BD Biosciences)和TNF-α-PE-Cy7(MAb11)(eBioscience)。

[0285] 分批对样本染色、采集并分析。对于每个ICS测定实验，包含补偿对照(单染阳性和阴性小鼠κ补偿珠)。在染色和采集过程期间，这些对照与研究样本并行加工，以允许采集后数据补偿。

[0286] 流数据分析方法。将样本在BD LSRII细胞计上运行，使用FlowJo软件(v.9.9，TreeStar)进行数据分析。数据文件上传到预先设计的分析模板。调整个体门以仅包含预定义以产生目标结果的细胞群。应用以下入选/排除标准来确定在最终分析中包含哪些数据：

[0287] 1.对于来自某一研究日的每组样本，必须存在阴性(未受刺激的)对照，并且其为可解释的。

[0288] 2.CD4+ T细胞的PHA诱导的(阳性对照)总细胞因子反应必须大于该研究所有参与者的阴性(未受刺激的)对照的CD4+ T细胞的总细胞因子反应的中值加上三个中值绝对偏差(3MAD)。

[0289] 3.对于每个样本，CD4+ T细胞中的PHA诱导的总细胞因子反应必须大于其阴性(未受刺激的)对照的CD4+ T细胞中的总细胞因子反应。

[0290] 数据分析和统计。使用基于次序统计的中值DMSO减细胞因子/功能(单独的CD107a、CD154、IFN-γ、白细胞介素[IL]-2、IL-17A、IL-22或肿瘤坏死因子[TNF]或其任何组合[不包含CD107a单一阳性事件])反应和相关的95％置信区间(CI)，通过治疗方案、T细胞类型(CD4+和CD8+)和刺激抗原(Rv1813(a或b)、Rv2608(a或b)、Rv3619和Rv3620)来总结使用PBMC的ICS测定中的T细胞反应百分比。

[0291] ICS反应也分析如下：通过T细胞类型和刺激抗原来总结每个治疗方案中反应者的数量(百分比)，其使用由HIV/AIDS研究和预防统计中心(SCHARP)制定以评估疫苗“服用”的临时反应者定义(在本文中称为SCHARP方法)来确定。使用通过Holm方法调整多重性的费希尔精确检验，进行反应者数量(百分比)的治疗方案之间的成对比较。用于确定每个参与者的反应者状态的SCHARP方法基于对功能子集(IFN-g TNFα、IL-2和/或CD154)的多重性调整(Holm方法)费希尔精确检验，并将基线反应者状态考虑在其中，该功能子集为这些功能中的一个或多个的阳性组合。

[0292] 基于每次随访的克鲁斯卡-沃利斯检验，在治疗方案中比较中值DMSO减功能反应，以标识4种治疗方案之间的任何差异。如果标识出显著差异，则进行威尔科克森-曼-惠特尼检验，以进行治疗方案之间的成对比较。通过Holm方法调整威尔科克森-曼-惠特尼p值的多重性。总结了一种或多种功能IFN-γ、TNF、IL-2和/或CD154的阳性组合以及仅CD154的结果。

[0293] 通过IFN-γELISpot测定对免疫反应的评估基于响应于用四种抗原肽池(Rv1813、Rv2608、Rv3619和Rv3620)之一的刺激的每106个PBMC的IFN-γ斑点形成单位(SFU)的数量。使用中值和95％CI(CI基于次序统计)来呈现DMSO减抗原特异性结果。

[0294] 如下分析IFN-gELISpot反应：通过刺激抗原来总结使用SCHARP方法确定的每种治疗方案中反应者的数量(百分比)。使用通过Holm方法调整多重性的费希尔精确检验，进行反应者数量(百分比)的治疗方案之间的成对比较。用于确定每个参与者的反应者状态的SCHARP方法基于多重性调整(Holm方法)费希尔精确检验，并将基线反应者状态考虑在其中。

[0295] IgG抗体ELISA数据被呈现为具有95％CI的终点滴度(log10)的几何平均值，并且相较于基线的平均倍数变化被呈现为(注射后随访时的终点滴度[log10]结果-基线处的终点滴度[log10]结果的)抗对数。

[0296] 在用Rv1813-、Rv2608-、Rv3619-、RV3620-肽池和PHA刺激样本中的细胞因子表达的频率减去阴性对照(即，仅用共刺激抗体温育的血液)中的细胞因子表达T细胞的频率后，报告特异性细胞因子表达T细胞的流式细胞术分析。如果比较分析涉及超过2组和几个时间点，我们使用克鲁斯卡-沃利斯(组间)或弗里德曼(组内)检验。如果从这些检验中显示出显著性，我们使用曼-惠特尼U(组间)或威尔科克森匹配配对检验(组内)进行检验后分析。在所有统计检验中，p值<0.05被认为是显著的。

[0297] 实例3：在ID93-2+GLA-SE接种后QFT-和QFT+参与者中的ID93-2特异性CD4 T细胞反应的多种功能分化谱：融合蛋白中的强中枢记忆和强效应记忆T细胞抗原

[0298] 图1示出了对ID93的每个单独抗原组分具有特异性的ID93特异性CD4+ T细胞(TH1细胞)的％。在本研究中，在第0天、第28天和第56天施用不同剂量的ID93或ID93+GLA-SE。在每次注射后两周收集外周血单核细胞，并用包括ID93：Rv2608(Rv2608-a或Rv2608-b，所有实例)、Rv1813、Rv3619或Rv3620的抗原亚单位刺激(图1)。使用ICS测定和如实例2中所列的检验组分析CD4+ T细胞分泌任何Th1细胞因子(TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-17)的能力。数据表明疫苗是免疫原性的，引发所需的Th1型反应，并且当包含GLA-SE时反应更高。图2中的数据分析了如实例2中所述进行的ICS测定中针对ID93-2融合多肽的每种抗原组分接种后的免疫反应。数据以堆积条形图呈现，其中％CD4+ T细胞表达任何一种以下标志物：CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA、CD14-、CD16，并且对于Th1细胞因子(TNF-α、IFNγ、IL-2、IL-17)是ICS阳性的。每个条代表全血对用含有Rv1813-、Rv2608-、Rv3619-或Rv3620-肽的池的刺激的中值总CD4+ T细胞反应。误差条表示每次刺激的四分位数范围(IQR)。疫苗接种者和安慰剂接受者按群组分类，并且反应在纵向上按研究天数分类。群组1仅包括QFT-个体，其它群组主要包括QFT+个体。减去了本底值(未受刺激)。堆积条(从上到下)被描绘为当用Rv3620(最上或顶部框)刺激，然后顺序地用Rv3619、Rv2608和Rv1813(底部条)刺激时的细胞因子反应者。数据表明，在所有接种组中，在第42天观察到峰值中值测量总CD4 Th1细胞因子对所有抗原的反应，作为其各个部分的累积组分。然而，对于四个单独抗原中的每一个的峰值反应在整个群组中有所不同，在第14天群组2和群组4中对Rv3619的反应最高，并且在第14天群组2中对Rv3620的反应最高。在群组2、3和4中，针对Rv2608观察到特别稳健的CD4 T细胞反应，接着是对Rv3619和Rv3620的近似等同的反应。在群组1中，在所有接种后时间点处CD4 T细胞对Rv2608的反应具有较低的幅度，但与群组3中的反应没有统计学差异，群组3是ID93-2和GLA-SE剂量匹配组，主要是QFT+个体(第14天、第42天和第126天的曼-惠特尼p值分别为
0.3472、0.2152和0.8078)。然而，在群组1中，无论是按照给定的施用次数还是按照仅适度的施用次数，Rv3620和Rv3619反应(分别为最上条和从上数第二条)通常是定量干扰素阴性组。此外，当用Rv1813(Rv1813-a或Rv1813-b，在所有实例中)(堆积条的底部或最低条)刺激时，CD4 T细胞反应最低，与组无关。在安慰剂接种的参与者中，在施用后未观察到对ID93-2特异性抗原的统计学上显著的CD4 T细胞反应。该疫苗能够将受感染个体中的免疫反应提高到更高水平。

[0299] 还从PBMC分析疫苗诱导的反应。在所有三种ID93-2+GLA-SE方案中观察到抗原特异性CD4+DMSO减ICS反应(即，表达单独的CD107a、CD154、IFN-γ、IL-2、IL-17A、IL-22或TNF或其任何组合[不包含CD107a单一阳性事件]的细胞)，其中在研究第42天(第二次注射后14天)出现峰值中值反应。在ID93-2 2μg+GLA-SE 2μg剂量中观察到所有四种疫苗抗原中在研究第42天的最强中值反应(任何细胞因子的总反应为0.278％)。在最终研究注射后6个月(研究第294天)检测到CD4+抗原特异性反应，其中在ID93-2 2μg+GLA-SE 2μg剂量中所有四种疫苗抗原的中值反应再次最高(任何细胞因子的总反应为0.148％)。Rv2608是最具免疫显性的抗原，其次是Rv3619和Rv3620，其中可观察到相似的反应；对Rv1813的反应普遍较低。全血ICS测定结果通常与使用PBMC的这些ICS测定结果一致，只是在全血测定中中值反应幅度更高。此外，全血ICS测定结果显示出稳健、持久和多功能的CD4 T细胞反应。本测定的结果还证明：通过QFT测量的先前通过自然感染的Mtb致敏改变了ID93-2疫苗中CD4 T细胞对个体抗原的反应的动力学、幅度和质量。

[0300] 在ID93-2+GLA-SE接种组中所有时间点都观察到相较于安慰剂的统计学上显著不同的CD4+总反应者率(包含被认为是四种疫苗抗原中至少一种的反应者的参与者，基于SCHARP方法)：93.3％(2μg ID93-2+2μg GLA-SE)，100％(10μg ID93-2+2μg GLA-SE)和93.3％(10μg ID93-2+5μg GLA-SE)，而安慰剂剂量中为41.7％。通常，对于个体抗原，在任何时间点，三种不同ID93-2+GLA-SE剂量之间的成对比较的CD4+反应者率没有统计学上显著的差异。研究第42天和第294天的最高中值CD4+(IFN-g、TNFα、IL-2和/或CD154)反应在ID93-2 2μg+GLA-SE 2μg剂量中，对于抗原Rv2608(分别为0.1259％和0.0496％)。ID93-2 2μg+GLA-SE 2μg剂量与其它两种ID93-2+GLA-SE剂量相比，更频繁地观察到相较于安慰剂的统计学上显著更高的(基于威尔科克森-曼-惠特尼检验)中值CD4+(IFN-g、TNFα、IL-2和/或CD154)反应。对于ID93-2+GLA-SE剂量的成对比较，仅在ID93-2,2μg+GLA-SE 2μg剂量中观察到统计学上显著更高的中值CD4+(IFN-g、TNFα、IL-2和/或CD154)反应。中值CD4+(仅CD154)反应的分析显示出与CD4+(IFN-g、TNF、IL-2和/或CD154)反应相似的趋势。

[0301] 接下来，将抗原特异性CD4+ DMSO减ICS数据与来自IFN-γDMSO减ELISpot的数据进行比较。在所有三种ID93-2+GLA-SE剂量中均观察到IFN-γDMSO减ELISpot反应，其中在ID93-2,2μg+GLA-SE 2μg剂量的研究第42天出现所有四种疫苗抗原的峰值中值反应(1156.7个细胞/106个PBMC)。在最终研究注射后6个月(研究第294天)检测到IFN-g ELISpot反应，其中在ID93-2,10μg+GLA-SE 5μg剂量中的所有四种疫苗抗原的中值反应最高(830个细胞/106个PBMC)。最强反应是对抗原Rv2608、Rv3619和Rv3620的反应；对Rv1813的反应最小。在ID93-2+GLA-SE剂量中任何时间点的总反应者率(包含被认为是四种疫苗抗原中至少一种的反应者的参与者没有相较于安慰剂的统计学显著差异(92.9％[2μg ID93]-2+2μg GLA-SE]，91.3％[10μg ID93-2+2μg GLA-SE]和100.0％[10μg ID93-2+5μg GLA-SE]，而安慰剂剂量中为75.0％)。QFT+与QFT-反应的比较表明，QFT+(阳性)受试者与QFT-(阴性)受试者相比，在ID93-2+10μg+GLA-SE 2μg剂量中有朝向更强的中值IFN-γELISpot反应的趋势。10μg ID93-2+5μg GLA-SE和2μg ID93-2+2μg GLA-SE剂量具有不成比例的更高数量的QFT+受试者，因此统计分析没有意义，但证明了相同的模式。此外，全细胞ICS测定显示，QFT阳性参与者与QFT阴性参与者相比，在单次接种ID93-2+GLA SE后有显著升高的CD4+ T细胞反应，反映出ID93-2+GLA-SE能够在患有既往结核病的患者中引发免疫反应。与安慰剂相比，ID93-2+GLA-SE在先前未感染过结核分枝杆菌的QFT-群组1受试者中没有诱导对Rv3619或Rv3620的大量特异性CD4+ T细胞反应，这表明对于这些抗原，该疫苗可能特别有助于增强先前感染结核的受试者中的免疫反应。

[0302] 总之，数据表明，通过QFT阳性测量的先前通过自然感染的结核致敏改变了CD4 T细胞免疫反应的动力学、幅度和质量，并且ID93-2疫苗在无结核病史受试者和结核感染受试者中都表现出强免疫反应性。有趣的是，研究期间的一名受试者的QFT状态在研究期间从阳性变为阴性。

[0303] 由于在本研究中IFN-γ的细胞内表达与CCR7和CD45RA测量的分化水平相关，我们试图开发一种T细胞分化为中枢记忆细胞和效应记忆细胞的程度的简单测量法。在抗原特异性Th1细胞中，IFNg、TNF-α和IL-2表达的模式在T细胞分化期间从早期中枢记忆细胞通过效应记忆进化为终末分化的效应细胞(《自然综述免疫学(Nat Rev Immunol)》，2008年4月；8(4)：247-58。《记忆和保护中的T细胞质量：对疫苗设计的影响(T-cell quality in memory and protection:implications for vaccine design)》。Seder RA1，Darrah PA，Roederer M)。基于这些原理，“功能分化评分”(FDS)计算为IFNγ+表达CD4+ T细胞的部分与不表达IFNγ的CD4+ T细胞的部分(IFNγ-；即表达TNF-α和/或IL-2)的比例。

[0304] 图3描绘了通过FDS分析ICS数据的一般方法。饼图的各个区段表示CD4+T细胞，其表达各种其它标志物，所述其它标志物可以通过其IFNγ状态(环绕的粗体线)另外分组。然后，FDS评分简单地计算为IFN-g+细胞的百分比除以IFNγ细胞的百分比。低FDS评分(1或更低)表示T细胞分化早期细胞，强中枢记忆群体，而高FDS评分(>3)表明更强的分化为强效应记忆群体。FDS评分>1但<3表示具有中间表型的那些细胞。先前的研究试图评价FDS评分是否可以用于评价对新型融合蛋白的免疫反应，但到目前为止，尚未发表过关于融合抗原的单个亚单位蛋白的贡献的研究。(《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》，2004年8月；291(1-2)：185-95。《全血细胞内细胞因子检测测定在现场研究中定量特异性T细胞频率的新型用途(Novel application of a whole blood intracellular cytokine detection assay to quantitate specific T-cell frequency in field studies)》。Hanekom WA1，Hughes J，Mavinkurve M，Mendillo M，Watkins M，Gamieldien H，Gelderbloem SJ，Sidibana M，Mansoor N，Davids V，Murray RA，Hawkridge A，Haslett PA，Ress S，Hussey GD，Kaplan G)l(《《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》，2015年2月；417：22-33。《通过流式细胞术限定全血细胞内细胞因子染色测定以测量分枝杆菌特异性CD4和CD8T细胞免疫(Qualification of a whole blood intracellular cytokine staining assay to measure mycobacteria-specific CD4 and CD8T cell immunity by flow cytometry)》。Kagina BM1，Mansoor，Kpamegan，Penn-Nicholson，Nemes，Smit，Gelderbloem，Soares，Abel，Keyser，Sidibana，Hughes，Kaplan，Hussey，Hanekom，Scriba)。

[0305] 可以使用FDS分析以通过分析相较于基线反应的免疫后FDS评分的任何变化(图4线图)来分析CD4+ T细胞谱状态随时间的定性变化，并估计CD4+ T细胞群对各个群体中的给定抗原决定簇(图5A)或通常对任何抗原决定簇(图5B)反应的总体表型分析。图4显示了来自细胞因子共表达数据的FDS分析的免疫反应数据的定性分析的线图，其针对在包含最后一次接种后6个月的研究期间群组1和群组3中的QFT-和QFT+接种受试者的分离的ID93-2融合蛋白的每种抗原(Rv1813、Rv2608、Rv3619和Rv3620)。总体而言，数据表明，对于Rv2608或Rv1813具有特异性的CD4 T细胞可以被定性地分类为接种后的强中枢记忆CD4+ T细胞(FDS评分为1或更低)，无论基线QFT状态(QFT+或QFT-)如何(图4和图5B)。虽然在数量上，通过ID93-2亚单位肽抗原Rv3619和Rv3620刺激检测到的CD4+ T细胞百分比在ID93-2+GLA-SE接种QFT-受试者中较低，但在先前未受感染受试者或无结核病史受试者(QFT-)和先前感染QFT+受试者(图5A，比较方块(QFT-)和圆圈(QFT+)中，Rv3620 CD4+ T细胞群对本抗原亚单位具有更分化的强效应记忆T细胞反应谱。相比之下，在在未受感染受试者或无结核病史受试者(QFT-)中，Rv3619 CD4+ T细胞群体对本抗原亚单位表现出更多的中枢记忆T细胞反应谱反应，而对于先前感染QFT+受试者(图5A，比较方块(QFT-)和圆圈(QFT+)，反应驱使分化为强效应记忆群体。

[0306] 数据表明潜在的结核分枝杆菌感染可以驱使Rv3619-和Rv3620-特异性CD4 T细胞的分化程度大于Rv1813-和Rv2608特异性CD4 T细胞。接种后和最后一次施用ID93-2+GLA-SE后6个月，保持了这种更加类效应的表型，表明接种未显著调节由自然感染结核引起的已良好分化的Rv3619和Rv3620特异性CD4 T细胞反应。图中的数据表明，对于ID93-2亚单位抗原Rv2608和Rv1813，在先前感染结核受试者(QFT+)或无结核病史受试者(QFT-)中，对这些抗原的定性免疫反应是强中枢记忆反应。在QFT+受试者中，用ID93-2免疫在每次随后的接种或随时间的推移未显著改变强中枢记忆的过度分布。然而，在无结核病史个体中，在免疫后，存在CD4 T细胞在用ID93-2融合多肽免疫后成熟为强中枢记忆效应表型的趋势(比较QFT-图4B和图5A中的方块和圆圈)。总体而言，我们发现，在有和没有潜在的结核分枝杆菌感染的受试者中，ID93-2+GLA-SE诱导的针对每种抗原的CD4 T细胞反应的分化都具有多样性。

[0307] 实例4.ID91和ID93-2疫苗(和佐剂制剂)对鸟分枝杆菌的预防性疗效。

[0308] 含有Rv3619-Rv2389-Rv3478-Rv1886)序列的ID91融合蛋白已显示可保护小鼠免受结核分枝杆菌的影响(Orr MT，Ireton GC，Beebe EA，Huang PW，Reese VA，Argilla D，Coler RN，Reed SG。2014。《作为针对结核分枝杆菌的候选疫苗的免疫亚优势抗原(Immune subdominant antigens as vaccine candidates against Mycobacterium tuberculosis)》。《免疫学杂志(J Immunol)》，193：2911-8)。

[0309] 体外筛选用于NTM、鸟分枝杆菌的生长抑制的佐剂，通过用100μg/ml PMA(Calbiochem)处理过夜将THP-1细胞分化为巨噬细胞。将分化的巨噬细胞用鸟分枝杆菌以MOI5感染24小时(源鸟分枝杆菌)。用模式识别受体激动剂按照指示处理受感染的巨噬细胞三天。图6中显示的数据表明，在与皂苷(QS21)和GLA-AF温育24小时后，鸟分枝杆菌的生长受到抑制。其它TLR激动剂(例如，SLA-AF)也显示出鸟分枝杆菌的生长抑制(数据未示出)。

[0310] 在C57BL/6小鼠中筛选ID91与GLA-SE的组合和单独的GLA-SE。用GLA-SE或ID91+GLA-SE(i.m)将C57BL/6小鼠免疫3次，间隔3周。通过气溶胶鸟分枝杆菌对小鼠进行1x108CFU的气溶胶检测。图7示出感染后20或40天肺部中的cfu(Log10)。星号表示显著性**p<0.05。

[0311] 下表7示出了NTM与本发明的融合多肽中使用的分枝杆菌抗原的共有序列。

[0312]

[0313]

[0314] 从前述内容可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了本发明的具体实施例，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。

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