鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒
阅读：923发布：2020-05-20
专利汇可以提供鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒，在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰；病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集；回归SPF鸡试验可出现 呼吸道 症状和肾肿、花斑肾等病变；特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应，而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应；HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应。该毒株无外源病原污染，有较好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。，下面是鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒专利的具体信息内容。
1、鸡肾型传染性支气管炎病毒(Tarpeia nephrite pulli)HN99，其特征在于，(1)、在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；(2)、病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰；(3)、病毒分离物对1％鸡红细胞不产生凝集；(4)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾病变；(5)、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应，而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应；(6)、将HN99株阳性血清与EID50的M41株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株病毒做血清中和试验，结果显示，HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应；(7)所述病毒的保藏号为CGMCC No.1729。
鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒
技术领域
背景技术
1999年，河南省荥阳某养鸡场爆发以呼吸道症状为临床特征、以肾 脏肿胀、尿酸盐沉积为解剖特征的传染病，从鸡群典型病例的肾脏和输 尿管中分离到一株病毒，代号为HNs9株。通过SPF鸡胚传代，SPF雏鸡回 归复壮后，测定其EIDs。为10—6470. lml;我们对发病鸡的肾脏进行了组 织学观察，用电镜观察了该病毒的冠状病毒粒子的形态和大小，进行了 生物学特征试验如血凝性、对NDV的干扰试验，测定了对热、酸、化学 试剂（氯仿、乙醚等）的敏感程度和其他理化试验。用Holte、 Gray和 Ausc-T等国际古典肾型病毒株和河南、湖北、北京、天津、哈尔滨等地
方毒株等进行了特异性试验和血清中和试验。试验结果证实该病毒株为 肾型传染性支气管炎病毒，丽99病毒株与传统的呼吸型传染性支气管炎病 毒Mw株、H120株、H52株的血清型不同，是一株新的病毒株。用传统的 M4,株或H120株、H52株制备的疫苗不能预防HN99株病毒所致的肾型传染 性支气管炎，只有用HN99株病毒制备的疫苗才能预防肾型传染性支气管 炎。
方毒株等进行了特异性试验和血清中和试验。试验结果证实该病毒株为 肾型传染性支气管炎病毒，丽99病毒株与传统的呼吸型传染性支气管炎病 毒Mw株、H120株、H52株的血清型不同，是一株新的病毒株。用传统的 M4,株或H120株、H52株制备的疫苗不能预防HN99株病毒所致的肾型传染 性支气管炎，只有用HN99株病毒制备的疫苗才能预防肾型传染性支气管 炎。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒。 本发明公开了一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒，该病毒 株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No. 1729。 该病毒具有以下特征： (1)、在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90〜105nm，有囊膜，周围 有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；(2) 、发病鸡症状除呼吸道症状外，大部份死鸡均有肾脏肿大、尿
酸盐沉积、花斑肾等病变，用10日龄鸡胚接种病毒，并经盲传5代后， 可见24〜72小时之间死亡的鸡胚均有充血或出血、孵育至第17天的鸡 胚有3/5呈现发育小、蜷曲、僵化、尿酸盐沉积；
(3) 、病毒分离物对NDVLaSota株病毒的繁殖产生干扰；
(4) 、病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集；
(5) 、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；
(6) 、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN^阳性血 清呈阳性反应，而与NDVLaSota株、IBDVB^株、AIVH9N2株均呈阴 性反应；
(7) 、将HN99株阳性血清与100个EID5Q的M4!株、Holte株、Gray 株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、 天津株等病毒做血清中和试验，结果显示，HN99株阳性血清与T株、湖 北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应；
(8) 所述病毒的保藏号为CGMCCNo.1729。
本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称-CGMCC，保藏编号：CGMCCNo. 1729，分类命名：鸡肾型传染性支气 管炎病毒，英文名称为Avain nephropathogenic Infectious bronchitis vims HN99 Strain,拉丁文名称为Tarpeia nephrite pulli，保藏单位地址：北京 市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。
酸盐沉积、花斑肾等病变，用10日龄鸡胚接种病毒，并经盲传5代后， 可见24〜72小时之间死亡的鸡胚均有充血或出血、孵育至第17天的鸡 胚有3/5呈现发育小、蜷曲、僵化、尿酸盐沉积；
(3) 、病毒分离物对NDVLaSota株病毒的繁殖产生干扰；
(4) 、病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集；
(5) 、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；
(6) 、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN^阳性血 清呈阳性反应，而与NDVLaSota株、IBDVB^株、AIVH9N2株均呈阴 性反应；
(7) 、将HN99株阳性血清与100个EID5Q的M4!株、Holte株、Gray 株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、 天津株等病毒做血清中和试验，结果显示，HN99株阳性血清与T株、湖 北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应；
(8) 所述病毒的保藏号为CGMCCNo.1729。
本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称-CGMCC，保藏编号：CGMCCNo. 1729，分类命名：鸡肾型传染性支气 管炎病毒，英文名称为Avain nephropathogenic Infectious bronchitis vims HN99 Strain,拉丁文名称为Tarpeia nephrite pulli，保藏单位地址：北京 市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。
具体实施方式
本发明采用以下方法进行病毒的分离、培养、鉴定-(一)、病毒分离培养
无菌采集病鸡肺、肾，称重后按1: 5重量比添加灭菌生理盐水研磨，
以3000rpm离心15分钟，取上清液，按每毫升加青霉素2000IU、链霉 素2000)ig， 4〜8。C作用12小时备用。取上清液尿囊腔接种10日龄SPF 胚10个，每胚0.2ml，剔除30小时内死亡的鸡胚。从接种后30小时起， 每隔4〜6小时观察1次，挑出死亡胚，放2〜8'C冷存，至72小时取出 所有胚，无菌收取尿囊液，加入青链霉素各1000IU/ml。其余5枚继续孵 化5天，观察并记录胚胎病变。如此连续盲传3代，-70匸以下保存，将
4此病毒液按1: 2-3的比例（V/V)加入蔗糖牛奶保护剂，用真空冷冻干 燥机进行冻干后，保存于-8(TC低温冰箱内保存。 (二）、病毒鉴定
1. 电镜检査结果
丽99毒株在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90〜105nm，有囊膜，周 围有长约18mn的梨状突出，呈放射状排列。对照尿囊液未见有上述病毒 粒子存在。
2. HN99、 HX病毒血凝性试验EIDs。测定和对NDV的干扰试验 朋99未经胰酶处理的鸡胚分离物对1。Z的鸡红细胞不发生凝集（HA试
验阴性），而HX病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集，HA为1: 4，证 明有血凝性的病毒污染，因此舍弃不再做其它试验。
经胰酶处理的丽99鸡胚病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集，平均 凝集价HA为1: 2。
经磷酸酯酶C处理后的丽99鸡胚病毒分离物可使1 %的鸡红细胞发生 凝集，平均凝集价HA为1: 4。
病毒分离物的EIDs。测定将HN99鸡胚病毒尿囊液，测定其EIDs。，结 果为10—6°〜10—7'°/0. lml。
3. 对NDV的干扰试验
对NDV的干扰试验证明，加分离毒HN99的HA为1:128，不加分离毒的 HA为1: 1024，说明分离毒HN99能抑制NDV La Sota在鸡胚内增殖。该 试验结果表明，分离毒HN99符合IBV的生物学特性。
4. 理化试验
病毒分离物加入20%的乙醚，在2〜8"C处理24小时后接种鸡胚， 对鸡胚已无感染力。证明病毒物对乙醚敏感。
向病毒分离物内加入氯仿，使其最终浓度为4.8%，在4"C温度下充 分混合30min,接种敏感鸡胚，对鸡胚的EIDs。仅为1(T370. lml，比未加 氯仿的对照组（EIDs。为10—6'370. lml)下降约3个滴度，证明病毒分离物 对氯仿敏感。
将病毒分离物ra值调至3.0，用敏感鸡胚测定EID5。为1(T5'70. lml，比对照仅下降l(T"左右，病毒对鸡胚仍具有一定的感染力，证明病毒分 离物对酸有耐受性。
病毒分离物56"C下经30分钟，对敏感鸡胚已无感染力，证明病毒分 离物不耐热。
5. 动物回归试验
用7日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻和气管内接种HN99鸡胚病毒尿 囊液各0. 2ml，接种后观察14日。接种后从第48小时开始，有8只鸡精 神欠佳，饮食减少，病鸡出现咳嗽、甩鼻等现象，其中1只鸡死亡。对 有症状的鸡进行解剖，可见气管、肺脏有充血病变。病死鸡有肾肿，花 斑肾，输尿管内有尿酸盐沉积等症状，对此病死鸡的肾脏作了组织切片， 进行组织学观察，见肾脏的主要病变是肾曲管发生颗粒变性、空泡变性 和玻璃样变，间质水肿，内有淋巴细胞等浸润，有的肾实质组织坏死， 形成大小不等的病灶区。
6. 特异性血清中和试验
用HN99抗传染性支气管炎阳性血清分别和病毒分离物HN99、 NDV La Sota、 IBDVB87、 AIV H具和M4,株病毒用鸡胚进行中和试验，结果仅有病 毒分离物HN99与HN^抗传染性支气管炎血清呈现阳性反应，其中和物接种 IO日龄SPF鸡胚，孵化至144小时后，未发现鸡胚有任何病变，而HN99 株病毒液阳性对照的鸡胚有死亡、或发育小、蜷縮、僵化、尿酸盐沉积 等症状。NDV La Sota、 IBDV B87、 AIV H9N2与抗传染性支气管炎呈现阴性 反应，其中和物接种SPF鸡胚后胎儿均有充血、出血、水肿、死亡等症 状。HA试验表明，NDVLaSota株和AIVH具的鸡胚尿囊液均有1: 128〜 512的血凝价，结果如下表：
特异性血清中和试验
"^^t毒
丽La Sota IBDV B87 AIV H9N2 HNw病毒尿囊液
血清
丽99株阳性血清 - - 一 十
中和物HA测定 1: 512 - 1: 128 -
6将丽99阳性血清与100个EIDs。的Mn株、Holte株、Gray株、T株、 湖北株、HB株、BJ株、TJ株、SH株、SD株等病毒液等量混合，在20〜 25"C条件下中和1小时，接种10日龄SPF鸡胚6个，每胚0.2ml，同时 设病毒对照组和正常对照组，在37'C继续孵化，观察至144小时，以试 验组至少5/6健活、病毒对照组至少50%出现典型病变或死亡、正常对 照组全部健活为标准。结果如下表-
HNs9株 毒株 M41 T G H 湖 北 SH SD HB
鸡胚 病毒对照 6/6 5/6 4/6 1/6 5/6 4/6 4/6 3/6 4/6 4/6
病变 中和组 3/6 1/6 3/6 0/6 1/6 3/6 1/6 3/6 1/6 3/6
数 正常对照 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
判 定 一 + -画 一 + 一 + 一 + 一
用M^株、T株、H0株、G株、昍99阳性血清作1: 8 (V/V)稀释，与 100个EID5。HN99株病毒液等量混合，在20〜25。C条件下中和1小时，接 种SPF鸡胚6个，每胚0. 2ml，同时设病毒对照和正常对照，在37"继 续孵化，观察至144小时，以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50 %出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表：
清
M41 T Gray HO 肌9
病毒对照组 5/6 5/6 4/6 5/6 5/6
鸡胚病毒 中和组 2/6 1/6 3/6 0/6 0/6
数 正常对照组 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
判 定 一 + 一 — +
本发明采用以下方法对病毒朋99株进行纯化和免疫原性试验:
用鸡胚肾细胞终点稀释法对IBV HN99进行了纯化试验，并将其回归SPF鸡胚，其毒价基本无变化。用该毒株的鸡胚病毒液制成灭活苗，免疫 SPF鸡进行免疫原性测定，证明IBV HN99株有较好的免疫原性。
1、 SPF鸡胚肾细胞（CEK)的制备
用18日龄的SPF鸡胚，无菌操作取出鸡胚肾脏，用han厂s液洗涤 3次，用剪刀剪成小块，加入体积百分比0.25%的胰酶，于37'C水浴消化 18〜20分钟，弃去胰酶，再用hank， s液洗一次，加入含体积百分比8〜 10%犊牛血清的1640培养液，用吸管反复吹打细胞后，用4〜6层无菌纱 布过滤至细胞培养瓶和细胞培养板，于37°C C02培养箱培养，待长成良 好的单层后接毒。
2、 传代与纯化
将朋99株病毒液接种于长成单层的SPF鸡胚肾细胞，置37。C C02培 养箱继续培养，48小时后细胞逐渐出现病变，如圆縮或拉网变长，至96 小时后收毒，反复冻融3次，用此法将Hl^株病毒传了 4代。将第3代 细胞毒作10倍系列稀释，取10—5、 10—6、 10—7、 10—8稀释度分别接种于SPF 胚CEK单层，每滴度10个孔。培养96小时后，将最高稀释度有病变的 孔扩大培养，测定EIDs。后进行第二次终点稀释。将第二次终点稀释后得 到的细胞病变液接种9〜10日龄SPF胚，进行病毒复壮和增殖。
3、 HN99株病毒的增殖与鉴定
将纯化的朋99病毒液，接种9〜10日龄SPF鸡胚，接种后剔除30小 时以前的死胚，30小时后每隔4〜6小时观察一次，挑出死亡胚，放2〜 8'C保存，至72小时挑出所有胚。无菌收取尿囊液，并进行各项生物学 特性试验、电镜观察、动物回归病毒试验、理化试验、特异性试验和血 清中和试验、无菌检验，选择无菌生长、EIK10—6'70. lml、各项试验 合乎要求的朋99株病毒尿囊液，分装冻干保存，作为毒种。
将纯化的毒株送美国SPAFA济南试验室，进行了外源病原检测，结 果表明，该毒株无外源病原污染。
4、 ,99株病毒纯化后的免疫原性试验
将HN99株纯化，选择无菌检验合格、EID5。《10—"A), lml的丽99株病 毒尿囊液，经灭活后加入4% (V/V)的灭菌后的吐温一80，制成水相。然后按水相：油相为1: 3 (V/V)的比例，用高速组织捣碎机乳化成油乳剂。 将HN99株油乳剂按0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0. 5ml 5组不同的剂量免 疫28日龄SPF鸡，每组8只。3周后，免疫鸡和条件相同的4只对照鸡 一起，攻击HN99强毒，每鸡气管内注射0. 2ml的丽99株病毒尿囊液0. 2ml， 观察14日，结果如下表。
HN99株不同免疫剂量试验结果
table see original document page 9H队9株不同免疫剂量的试验证明，该毒株免疫O. lml的免疫鸡攻毒后 可保护6/8，免疫0.2〜0.5ml的免疫鸡攻毒后均可获全保护。对照鸡发 病4/4，鸡只出现咳嗽、甩鼻，解剖后有肾肿、支气管、肺脏充血或出血 等不同症状。试验表明，HN99株有较好的免疫原性，是一株效果良好的病 毒株。
无菌采集病鸡肺、肾，称重后按1: 5重量比添加灭菌生理盐水研磨，
以3000rpm离心15分钟，取上清液，按每毫升加青霉素2000IU、链霉 素2000)ig， 4〜8。C作用12小时备用。取上清液尿囊腔接种10日龄SPF 胚10个，每胚0.2ml，剔除30小时内死亡的鸡胚。从接种后30小时起， 每隔4〜6小时观察1次，挑出死亡胚，放2〜8'C冷存，至72小时取出 所有胚，无菌收取尿囊液，加入青链霉素各1000IU/ml。其余5枚继续孵 化5天，观察并记录胚胎病变。如此连续盲传3代，-70匸以下保存，将
4此病毒液按1: 2-3的比例（V/V)加入蔗糖牛奶保护剂，用真空冷冻干 燥机进行冻干后，保存于-8(TC低温冰箱内保存。 (二）、病毒鉴定
1. 电镜检査结果
丽99毒株在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90〜105nm，有囊膜，周 围有长约18mn的梨状突出，呈放射状排列。对照尿囊液未见有上述病毒 粒子存在。
2. HN99、 HX病毒血凝性试验EIDs。测定和对NDV的干扰试验 朋99未经胰酶处理的鸡胚分离物对1。Z的鸡红细胞不发生凝集（HA试
验阴性），而HX病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集，HA为1: 4，证 明有血凝性的病毒污染，因此舍弃不再做其它试验。
经胰酶处理的丽99鸡胚病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集，平均 凝集价HA为1: 2。
经磷酸酯酶C处理后的丽99鸡胚病毒分离物可使1 %的鸡红细胞发生 凝集，平均凝集价HA为1: 4。
病毒分离物的EIDs。测定将HN99鸡胚病毒尿囊液，测定其EIDs。，结 果为10—6°〜10—7'°/0. lml。
3. 对NDV的干扰试验
对NDV的干扰试验证明，加分离毒HN99的HA为1:128，不加分离毒的 HA为1: 1024，说明分离毒HN99能抑制NDV La Sota在鸡胚内增殖。该 试验结果表明，分离毒HN99符合IBV的生物学特性。
4. 理化试验
病毒分离物加入20%的乙醚，在2〜8"C处理24小时后接种鸡胚， 对鸡胚已无感染力。证明病毒物对乙醚敏感。
向病毒分离物内加入氯仿，使其最终浓度为4.8%，在4"C温度下充 分混合30min,接种敏感鸡胚，对鸡胚的EIDs。仅为1(T370. lml，比未加 氯仿的对照组（EIDs。为10—6'370. lml)下降约3个滴度，证明病毒分离物 对氯仿敏感。
将病毒分离物ra值调至3.0，用敏感鸡胚测定EID5。为1(T5'70. lml，比对照仅下降l(T"左右，病毒对鸡胚仍具有一定的感染力，证明病毒分 离物对酸有耐受性。
病毒分离物56"C下经30分钟，对敏感鸡胚已无感染力，证明病毒分 离物不耐热。
5. 动物回归试验
用7日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻和气管内接种HN99鸡胚病毒尿 囊液各0. 2ml，接种后观察14日。接种后从第48小时开始，有8只鸡精 神欠佳，饮食减少，病鸡出现咳嗽、甩鼻等现象，其中1只鸡死亡。对 有症状的鸡进行解剖，可见气管、肺脏有充血病变。病死鸡有肾肿，花 斑肾，输尿管内有尿酸盐沉积等症状，对此病死鸡的肾脏作了组织切片， 进行组织学观察，见肾脏的主要病变是肾曲管发生颗粒变性、空泡变性 和玻璃样变，间质水肿，内有淋巴细胞等浸润，有的肾实质组织坏死， 形成大小不等的病灶区。
6. 特异性血清中和试验
用HN99抗传染性支气管炎阳性血清分别和病毒分离物HN99、 NDV La Sota、 IBDVB87、 AIV H具和M4,株病毒用鸡胚进行中和试验，结果仅有病 毒分离物HN99与HN^抗传染性支气管炎血清呈现阳性反应，其中和物接种 IO日龄SPF鸡胚，孵化至144小时后，未发现鸡胚有任何病变，而HN99 株病毒液阳性对照的鸡胚有死亡、或发育小、蜷縮、僵化、尿酸盐沉积 等症状。NDV La Sota、 IBDV B87、 AIV H9N2与抗传染性支气管炎呈现阴性 反应，其中和物接种SPF鸡胚后胎儿均有充血、出血、水肿、死亡等症 状。HA试验表明，NDVLaSota株和AIVH具的鸡胚尿囊液均有1: 128〜 512的血凝价，结果如下表：
特异性血清中和试验
"^^t毒
丽La Sota IBDV B87 AIV H9N2 HNw病毒尿囊液
血清
丽99株阳性血清 - - 一 十
中和物HA测定 1: 512 - 1: 128 -
6将丽99阳性血清与100个EIDs。的Mn株、Holte株、Gray株、T株、 湖北株、HB株、BJ株、TJ株、SH株、SD株等病毒液等量混合，在20〜 25"C条件下中和1小时，接种10日龄SPF鸡胚6个，每胚0.2ml，同时 设病毒对照组和正常对照组，在37'C继续孵化，观察至144小时，以试 验组至少5/6健活、病毒对照组至少50%出现典型病变或死亡、正常对 照组全部健活为标准。结果如下表-
HNs9株 毒株 M41 T G H 湖 北 SH SD HB
鸡胚 病毒对照 6/6 5/6 4/6 1/6 5/6 4/6 4/6 3/6 4/6 4/6
病变 中和组 3/6 1/6 3/6 0/6 1/6 3/6 1/6 3/6 1/6 3/6
数 正常对照 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
判 定 一 + -画 一 + 一 + 一 + 一
用M^株、T株、H0株、G株、昍99阳性血清作1: 8 (V/V)稀释，与 100个EID5。HN99株病毒液等量混合，在20〜25。C条件下中和1小时，接 种SPF鸡胚6个，每胚0. 2ml，同时设病毒对照和正常对照，在37"继 续孵化，观察至144小时，以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50 %出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表：
清
M41 T Gray HO 肌9
病毒对照组 5/6 5/6 4/6 5/6 5/6
鸡胚病毒 中和组 2/6 1/6 3/6 0/6 0/6
数 正常对照组 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
判 定 一 + 一 — +
本发明采用以下方法对病毒朋99株进行纯化和免疫原性试验:
用鸡胚肾细胞终点稀释法对IBV HN99进行了纯化试验，并将其回归SPF鸡胚，其毒价基本无变化。用该毒株的鸡胚病毒液制成灭活苗，免疫 SPF鸡进行免疫原性测定，证明IBV HN99株有较好的免疫原性。
1、 SPF鸡胚肾细胞（CEK)的制备
用18日龄的SPF鸡胚，无菌操作取出鸡胚肾脏，用han厂s液洗涤 3次，用剪刀剪成小块，加入体积百分比0.25%的胰酶，于37'C水浴消化 18〜20分钟，弃去胰酶，再用hank， s液洗一次，加入含体积百分比8〜 10%犊牛血清的1640培养液，用吸管反复吹打细胞后，用4〜6层无菌纱 布过滤至细胞培养瓶和细胞培养板，于37°C C02培养箱培养，待长成良 好的单层后接毒。
2、 传代与纯化
将朋99株病毒液接种于长成单层的SPF鸡胚肾细胞，置37。C C02培 养箱继续培养，48小时后细胞逐渐出现病变，如圆縮或拉网变长，至96 小时后收毒，反复冻融3次，用此法将Hl^株病毒传了 4代。将第3代 细胞毒作10倍系列稀释，取10—5、 10—6、 10—7、 10—8稀释度分别接种于SPF 胚CEK单层，每滴度10个孔。培养96小时后，将最高稀释度有病变的 孔扩大培养，测定EIDs。后进行第二次终点稀释。将第二次终点稀释后得 到的细胞病变液接种9〜10日龄SPF胚，进行病毒复壮和增殖。
3、 HN99株病毒的增殖与鉴定
将纯化的朋99病毒液，接种9〜10日龄SPF鸡胚，接种后剔除30小 时以前的死胚，30小时后每隔4〜6小时观察一次，挑出死亡胚，放2〜 8'C保存，至72小时挑出所有胚。无菌收取尿囊液，并进行各项生物学 特性试验、电镜观察、动物回归病毒试验、理化试验、特异性试验和血 清中和试验、无菌检验，选择无菌生长、EIK10—6'70. lml、各项试验 合乎要求的朋99株病毒尿囊液，分装冻干保存，作为毒种。
将纯化的毒株送美国SPAFA济南试验室，进行了外源病原检测，结 果表明，该毒株无外源病原污染。
4、 ,99株病毒纯化后的免疫原性试验
将HN99株纯化，选择无菌检验合格、EID5。《10—"A), lml的丽99株病 毒尿囊液，经灭活后加入4% (V/V)的灭菌后的吐温一80，制成水相。然后按水相：油相为1: 3 (V/V)的比例，用高速组织捣碎机乳化成油乳剂。 将HN99株油乳剂按0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0. 5ml 5组不同的剂量免 疫28日龄SPF鸡，每组8只。3周后，免疫鸡和条件相同的4只对照鸡 一起，攻击HN99强毒，每鸡气管内注射0. 2ml的丽99株病毒尿囊液0. 2ml， 观察14日，结果如下表。
HN99株不同免疫剂量试验结果
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