阿莫西林的纳米粒子调配物
阅读：996发布：2020-08-07
专利汇可以提供阿莫西林的纳米粒子调配物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了包含交联聚葡萄胺糖及阿莫西林的 纳米粒子 。其中藉由该交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。该等纳米粒子的平均直径为100-600nm，且该经包覆阿莫西林为纳米粒子总重量的至少5％(w/w)。当经口服用时，该等纳米粒子在胃中具有比自由阿莫西林或微米尺寸的微粒更长的滞留时间。本发明亦提供一种制备该等纳米粒子的方法。本发明进一步提供一种藉由以有效 治疗 细菌感染的量向个体经口投予本发明的纳米粒子来治疗细菌感染的方法。，下面是阿莫西林的纳米粒子调配物专利的具体信息内容。
1.一种包含交联聚葡萄胺糖及阿莫西林的纳米粒子，其中藉由该交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林，且该等纳米粒子的平均直径为100-600nm。
2.如权利要求1所述的纳米粒子，其中该等纳米粒子的粒度分布为至少80％该等纳米粒子的直径在50-800nm之间。
3.如权利要求1所述的纳米粒子，其中该等纳米粒子的平均直径为250-400nm。
4.如权利要求3所述的纳米粒子，其中该等纳米粒子的粒度分布为至少80％该等纳米粒子的直径在100-600nm之间。
5.如权利要求1所述的纳米粒子，其中该等聚葡萄胺糖是藉由戊二醛或双[磺基丁二酰亚胺基]辛二酸酯交联。
6.如权利要求1所述的纳米粒子，其中该经包覆阿莫西林的重量为该等纳米粒子的总重量的至少5％。
7.如权利要求1所述的纳米粒子，其中该经包覆阿莫西林的重量为该等纳米粒子的总重量的至少10％。
8.如权利要求1所述的纳米粒子，除聚葡萄胺糖外，其亦含有小于30％(w/w)的任何其他聚合物。
9.一种制备如权利要求1所述的纳米粒子的方法，其包含以下步骤：
(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖与阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；
(b)向(a)中添加阴离子界面活性剂及油且混合以形成油包水乳液，其中该阴离子界面活性剂是选自由以下组成的群：磺基丁二酸钠二辛酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠及月桂基硫酸钾；
(c)向(b)中添加交联剂戊二醛或双[磺基丁二酰亚胺基]辛二酸酯且混合以使聚葡萄胺糖交联，及
(d)形成如申请专利范围第1项的纳米粒子，其中藉由该交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。
10.如权利要求9所述的方法，其进一步包括藉由离心来分离该等纳米粒子且收集该等颗粒的步骤(e)。
11.如权利要求9所述的方法，其中该水性溶液为水。
12.如权利要求9所述的方法，其中向步骤(a)中添加足量乙酸以提高聚葡萄胺糖在该水性溶液中的溶解度。
13.如权利要求9所述的方法，其中该阴离子界面活性剂为磺基丁二酸钠二辛酯，且该交联剂为戊二醛。
14.一种医药组成物，其包含如权利要求1所述的纳米粒子及医药学上可接受的载剂，其中该组成物呈胶囊、锭剂、散剂或悬浮液的口服形式。
15.如权利要求14所述的医药组成物，其呈散剂或锭剂的形式。
16.一种用于治疗细菌感染的医药组成物，其包含如权利要求1所述的纳米粒子。
17.如权利要求16所述的医药组成物，其中该细菌感染是选自由以下组成的群：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染、大肠杆菌(E.coli)感染、沙门氏菌(salmonella)感染、耳感染、尿路感染、皮肤感染、牙齿感染、放线菌病(actinomycosis)、恶性水肿、气性坏疽、丹毒、肺炎、出血性败血症、葡萄球菌症(staphylococcosis)、鼻黏膜炎、巴氏杆菌病(pasteurelosis)、嗜血杆菌(hemophilus)流感、大肠杆菌病(Colibacillosis)及由革兰氏阳性或阴性细菌感染(gram positive or negative bacterial infection)所导致的一般化脓性病症，从而杀死该等细菌且阻止其生长。
18.如权利要求16所述的医药组成物，其治疗与幽门螺旋杆菌感染相关的胃或十二指肠溃疡；从而减少或消除该疾病的症状。
阿莫西林的纳米粒子调配物
技术领域
背景技术
[0002] 阿莫西林为半合成的经口吸收的广谱抗生素。化学上，其为(2S,5R,6R)-6-[(R)-(-)-2-胺基-2-(对羟苯基)乙酰胺基]-3,3-二甲基-7-侧氧基-4-硫-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-甲酸三水合物。阿莫西林与第二抗生素及酸性抑制剂组合而广泛用于与幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)感染相关的胃及十二指肠溃疡的标准根除治疗中。幽门螺旋杆菌(H.pylori)(流行人类特异性病原体)为慢性活动性胃炎、胃及十二指肠溃疡以及胃腺癌中的病原体。幽门螺旋杆菌的治疗仍然为具有挑战性的命题。幽门螺旋杆菌的不完全根除的一个原因可能为剂型在胃中的较短滞留时间，从而在存在幽门螺旋杆菌的胃黏液层或上皮细胞表面中不能达到有效抗微生物浓度。另一原因可能为阿莫西林在胃酸中降解。多名研究者已制备并报告能够在胃肠道中滞留较长延长时间段以达到更有效的幽门螺旋杆菌根除的新颖阿莫西林调配物，诸如漂浮锭剂、黏膜黏着锭剂及具有pH值敏感赋形剂的调配物。
[0003] 需要用于在胃中递送阿莫西林的阿莫西林组成物，其将提供长期滞留时间及持续作用，且提高药物的效率。
发明内容
[0004] 本发明是关于包含交联聚葡萄胺糖及阿莫西林的纳米粒子，其中藉由交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林，且纳米粒子的平均直径为100-600nm。在一个具体实例中，至少80％纳米粒子的直径在50-800nm之间。在一个具体实例中，经包覆之阿莫西林为纳米粒子总重量的至少5％(w/w)。
[0005] 本发明亦是关于一种制备纳米粒子的方法。该方法包含以下步骤：(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖与阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；(b)向(a)中添加阴离子界面活性剂及油且混合，其中阴离子界面活性剂是选自由以下组成的群：磺基丁二酸钠二辛酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠及月桂基硫酸钾；(c)向(b)中添加交联剂戊二醛或双[磺基丁二酰亚胺基]辛二酸酯且混合以使聚葡萄胺糖交联，及(d)形成纳米粒子，其中藉由交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。
[0007] 图1描绘本发明的用于经口递送阿莫西林的纳米粒子的特征。
[0009] 图3显示在各种初始药物输入浓度下纳米粒子调配物中的阿莫西林负载率。
[0010] 图4显示在pH＝2.0、5.0、6.0及7.4下纳米粒子调配物中的阿莫西林的释放曲线。
[0011] 图5显示在小鼠模型中呈自由药物形式及呈经口给药的纳米粒子调配物形式的阿莫西林的活体内药物动力学曲线(对于各个群组，n＝10)。插图显示0至5小时之间的药物动力学曲线。
[0012] 图6显示呈纳米粒子调配物形式及呈自由药物形式的阿莫西林针对幽门螺旋杆菌细菌的抗微生物活性。(A)显示最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值的测定。(B)显示最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)值的测定。
具体实施方式
[0013] 定义
[0014] 「约」定义为所述值±10％。
[0015] 「聚葡萄胺糖」定义为去乙酰化壳质或聚(D-葡萄糖胺)。其为由随机分布的β-(1-4)-键联D-葡萄糖胺(去乙酰化单元)及N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰化单元)组成的线性多醣。用于本发明的较佳聚葡萄胺糖为至少60％或70％或80％、85％或90％去乙酰化。用于本发明的较佳聚葡萄胺糖的分子量为400-200,000道尔顿。举例而言，可获得分子量为约110,000-150,000道尔顿；60,000-120,000道尔顿；6,000-10,000道尔顿；1,000-5000道尔顿；或约40,000道尔顿或600道尔顿的聚葡萄胺糖。聚葡萄胺糖一般具有如下文所示的结构。
[0016]
[0017] 纳米粒子的「药物负载率」定义为所包覆药物的重量与包括赋形剂及药物的药物负载纳米粒子的总重量的比率(％)。
[0018] 「纳米粒子」定义为直径为小于1μm且在1-999纳米之间的粒子。
[0019] 本发明人已发现包含交联聚葡萄胺糖及阿莫西林的纳米粒子组成物，其中藉由交联聚葡萄胺糖的纳米粒子基质包覆阿莫西林。本发明的纳米粒子组成物保护阿莫西林免于降解，增加在目标位点处的药物滞留时间，增加经口投予之后的药物滞留时间且因此改良生物可用性及阿莫西林的功效。
[0020] 用于阿莫西林的经口递送的纳米粒子具有优于自由阿莫西林的优势或直径大于1μm的较大尺寸微粒。归因于较小尺寸及相对迁移，纳米粒子能够渗透于胃肠道中的整个黏膜下层中，而微米尺寸的微粒主要定位于上皮内层中。由于渗透，可易于截留纳米粒子且保持在黏膜层处，从而增加在吸收位点处的滞留时间且提供阿莫西林的延长及控制释放。
另外，当与较大粒子比较时，纳米粒子具有较大表面与体积比率。当将聚葡萄胺糖调配成纳米粒子时，其暴露较大表面积用于黏膜黏着，进一步增加药物吸收以实现有效阿莫西林递送。
另外，当与较大粒子比较时，纳米粒子具有较大表面与体积比率。当将聚葡萄胺糖调配成纳米粒子时，其暴露较大表面积用于黏膜黏着，进一步增加药物吸收以实现有效阿莫西林递送。
[0021] 聚葡萄胺糖具有一些用于纳米粒子的聚合载体的理想性质，诸如黏膜黏着、生物兼容性、生物可降解、无毒性及廉价。此外，其拥有正电荷且展现促进吸收作用。聚葡萄胺3
糖的体密度(<0.6g/cm)低于胃液。藉由使用独特调配方法组合基于聚葡萄胺糖的聚合物系统，本发明的纳米粒子能够维持负浮力且在胃中向上漂浮，从而增加经口投予之后的纳米粒子滞留。漂浮纳米粒子调配物赋予一系列针对药物递送的优势，包括增强的药物生物可用性、降低的给药频率及针对上部胃肠道中的局部病痛的靶向治疗。
糖的体密度(<0.6g/cm)低于胃液。藉由使用独特调配方法组合基于聚葡萄胺糖的聚合物系统，本发明的纳米粒子能够维持负浮力且在胃中向上漂浮，从而增加经口投予之后的纳米粒子滞留。漂浮纳米粒子调配物赋予一系列针对药物递送的优势，包括增强的药物生物可用性、降低的给药频率及针对上部胃肠道中的局部病痛的靶向治疗。
[0022] 在本发明组成物中，经由聚葡萄胺糖的交联实现药物囊封。优化调配方法以便在交联之后聚葡萄胺糖聚合物主链基本上完整且保留聚葡萄胺糖的独特黏膜黏着性质。纳米粒子组成物的主要组份为聚葡萄胺糖，其使得粒子参与与胃肠道内层中的黏蛋白的黏膜黏着相互作用。此等相互作用复合来自静电引力、氢键及疏水效应的作用。黏着性特征使得纳米粒子主动结合至胃及胃肠道下方的黏膜层，从而增加活体内纳米粒子滞留。
[0023] 本发明的用于经口递送阿莫西林的纳米粒子的特征显示于图1中。
[0024] 纳米粒子组成物
[0025] 本发明是关于包含交联聚葡萄胺糖及阿莫西林的纳米粒子，其中藉由交联聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。如本文所使用的「经包覆」是指阿莫西林是藉由交联聚葡萄胺糖囊封或使阿莫西林连接至或结合至交联聚葡萄胺糖。在纳米粒子中，交联聚葡萄胺糖为形成纳米粒子的基质的主要聚合物(超过纳米粒子的50％w/w)。在一个具体实例中，可向纳米粒子基质中添加少量的其他聚合物(小于40％，较佳小于30％、20％、10％、5％或1％)。在另一具体实例中，除交联聚葡萄胺糖外，本发明的纳米粒子并不含有大量任何其他聚合物；亦即纳米粒子含有小于10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％(w/w)的任何其他聚合物，或纳米粒子含有0％的任何其他聚合物。其他聚合物包括(但不限于)海藻酸酯；肝素；聚(丙烯酸)；聚麸胺酸酯； 海藻糖；丙烯酰胺、丙烯酸、丹宁酸与甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一具体实例中，本发明的纳米粒子并非藉由麸胺酸或麸胺酸酯交联，或含有小于10％、5％、2％或1％的麸胺酸或麸胺酸酯。
[0026] 本发明的纳米粒子的平均直径为约50-900nm；较佳平均直径为约100-600nm、150-500nm、200-450nm、250-400nm、或300-350nm。纳米粒子组成物中至少80％、较佳85％、
90％或95％粒子的尺寸小于1微米。
90％或95％粒子的尺寸小于1微米。
[0027] 在一个具体实例中，纳米粒子的平均直径为约100-600nm，且粒度分布为至少80％纳米粒子的直径在50-800nm之间。在另一具体实例中，纳米粒子的平均直径为约
150-500nm、200-450nm、250-400nm或300-350nm，且粒度分布为至少80％或85％或90％纳米粒子的直径在100-600nm之间。
150-500nm、200-450nm、250-400nm或300-350nm，且粒度分布为至少80％或85％或90％纳米粒子的直径在100-600nm之间。
[0028] 本发明的纳米粒子有效截留阿莫西林。定义为阿莫西林的重量/纳米粒子的总重量的负载率一般为至少1％，较佳至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。举例而言，经包覆阿莫西林为纳米粒子总重量的10％-35％、10％-25％、10％-15％、5％-35％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、2％-10％、2％-5％或1％-5％(w/w)。纳米粒子的高负载率为有利的，因为可降低给药频率。
[0029] 本发明的纳米粒子能够渗透于胃肠道的整个黏膜下层中且保持在黏膜层处，从而增加阿莫西林的滞留时间使其超过24小时。
[0030] 制备纳米粒子组成物的方法
[0031] 生产阿莫西林纳米粒子的方法将聚合物交联与反相乳化组合。优化该方法从而仅在高药物负载效率及产率下产生纳米尺寸粒子。
[0032] 该方法包含以下步骤：(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖与阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；(b)向(a)中添加阴离子界面活性剂及油且混合以形成油包水乳液，(c)向(b)中添加交联剂且混合；及(d)形成具有作为纳米粒子基质且包覆阿莫西林的交联聚葡萄胺糖的纳米粒子。
[0033] 在步骤(a)中，混合聚葡萄胺糖与阿莫西林以溶解于水性溶液中。水为较佳的水性溶液；然而，可向水中添加少量盐或缓冲剂。若所用聚葡萄胺糖未完全溶解于水中，则可添加少量乙酸以提高聚葡萄胺糖的溶解度。一般而言，阿莫西林与聚葡萄胺糖的重量比为约0.01-0.5:1。举例而言，阿莫西林的浓度为0.1-5mg/mL，且聚葡萄胺糖的浓度为5-20mg/mL。
[0034] 在步骤(b)中，向(a)的混合物中添加阴离子界面活性剂及油。聚葡萄胺糖溶液不可与油混溶且界面活性剂有助于使水性聚葡萄胺糖溶液分散于油中。可使用有助于使水性溶液分散于油中以形成油包水乳液的任何适合的阴离子界面活性剂。适合的阴离子界面活性剂的实施例包括磺基丁二酸钠二辛酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠及月桂基硫酸钾。可使用可形成反相乳液的任何适合的油。适合的油包括矿物油、植物油、橄榄油、色拉油及玉米油。在一个具体实例中，油的量为至少35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或90％v/v。举例而言，油的量为乳液的35％-60％、40％-70％、
50％-80％、60％-80％、70％-90％、75％-90％、80％-90％或85-95％v/v。使用足够量的阴离子界面活性剂以形成油包水乳液。所用阴离子界面活性剂的量视所用油的量而定。一般而言，阴离子界面活性剂的量为约1％-15％，或1.5％-13％，或2％-10％，或3％-8％，或4％-7％，或5％-6％(w/v)。
50％-80％、60％-80％、70％-90％、75％-90％、80％-90％或85-95％v/v。使用足够量的阴离子界面活性剂以形成油包水乳液。所用阴离子界面活性剂的量视所用油的量而定。一般而言，阴离子界面活性剂的量为约1％-15％，或1.5％-13％，或2％-10％，或3％-8％，或4％-7％，或5％-6％(w/v)。
[0035] 在步骤(c)中，添加适合的交联剂。可使用可使聚葡萄胺糖交联的任何适合的交联剂。交联化学物质为此项技术中已知。适合的交联剂的实例包括同型双功能交联剂，诸如戊二醛及BS3交联剂(双[磺基丁二酰亚胺基]辛二酸酯)。可组合诸如N-丁二酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基6-[3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基]己酸酯(LC-SPDP)及丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)的异型双功能交联剂以使聚葡萄胺糖交联。
[0036] 在混合之后，形成油包水乳液且交联聚葡萄胺糖及包覆阿莫西林的反应正在进行。所用交联剂的量视所用特定交联剂而定。一般而言，可使用1％-15％，或1.5％-13％，或2％-10％，或3％-8％，或4％-7％，或5％-6％(w/v)的交联剂。举例而言，约5％的戊二醛可用于交联反应中。
[0037] 在步骤(d)中，交联反应完成，且含有经包覆阿莫西林的交联聚葡萄胺糖形成纳米尺寸的粒子。可藉由离心自悬浮液分离纳米粒子且收集该等颗粒。视情况用适当有机溶剂(诸如己烷、石油醚、戊烷及乙醇)洗涤所分离的纳米粒子。随后干燥纳米粒子且储存以供使用。
[0038] 医药组成物
[0039] 本发明提供包含阿莫西林纳米粒子及视情况选用的一或多种医药学上可接受的载剂的医药组成物。对于锭剂或散剂调配物而言，医药组成物中的纳米粒子一般为约1％-90％，较佳为20％-90％，或30％-80％，或40％-70％，或50％-60％。对于胶囊调配物而言，医药组成物中的纳米粒子一般为1％-100％，较佳为20％-100％、50％-100％、
70％-100％、85％-100％、20％-90％、30％-80％、40％-70％、50％-60％。对于液体悬浮液调配物而言，医药组成物中的纳米粒子一般为1％-50％、5％-50％、5％-45％、
5％-35％、5％-25％、5％-20％、10％-40％、10％-35％、10％-25％、10％-20％。
70％-100％、85％-100％、20％-90％、30％-80％、40％-70％、50％-60％。对于液体悬浮液调配物而言，医药组成物中的纳米粒子一般为1％-50％、5％-50％、5％-45％、
5％-35％、5％-25％、5％-20％、10％-40％、10％-35％、10％-25％、10％-20％。
[0040] 在一个具体实例中，医药组成物可呈诸如锭剂、胶囊、粒剂、细粒剂、散剂、悬浮液或类似者的剂型。可藉由习知方法制备上述医药组成物。
[0041] 作为非活性成分的医药学上可接受的载剂可由熟习此项技术者使用习知准则来选择。医药学上可接受的载剂可含有以下成分，包括(但不限于)：生理盐水及水性电解质溶液；离子及非离子渗透试剂，诸如氯化钠、氯化钾、丙三醇及右旋糖；pH值调节剂及缓冲剂，诸如氢氧化物、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐之盐；及三乙醇胺；抗氧化剂，诸如亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、抗坏血酸、乙酰基半胱胺酸、半胱胺酸、麸胱甘肽、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、生育酚及抗坏血酸棕榈酸酯之盐、酸及/或碱；诸如卵磷脂、磷脂之界面活性剂，包括(但不限于)磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰肌醇；泊洛沙姆(poloxamer)及泊洛胺(ploxamines)，诸如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60及聚山梨醇酯20之聚山梨醇酯，诸如聚乙二醇及聚丙二醇之聚醚；诸如聚乙烯醇及聚乙烯吡咯啶酮(PVP，聚维酮)之聚乙烯；诸如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素及羟丙基甲基纤维素及其盐之纤维素衍生物；诸如矿物油及白凡士林之石油衍生物；诸如羊毛脂、花生油、棕榈油、大豆油之脂肪；单甘油酯、二甘油酯及三甘油酯；诸如右旋糖聚糖之多醣及诸如玻尿酸钠之葡糖胺聚糖。此类医药学上可接受的载剂可使用熟知防腐剂来保藏以免受细菌污染，此等防腐剂包括(但不限于)氯化苯甲烃铵、乙二胺四乙酸及其盐、苄索氯铵(benzethonium chloride)、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、硫柳汞及苯乙醇，或可调配为单次或多次使用的非保藏型调配物。
[0042] 举例而言，活性化合物之锭剂调配物或胶囊调配物可含有不具有生物活性及不与活性化合物反应之其他赋形剂。锭剂或胶囊之赋形剂可包括填充剂、黏合剂、润滑剂及滑动剂、崩解剂、润湿剂及释放速率调节剂。锭剂或胶囊之赋形剂之实例包括(但不限于)羧甲基纤维素、纤维素、乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、甲基纤维素、卡拉亚胶(karaya gum)、淀粉、黄蓍胶、明胶、硬脂酸镁、二氧化钛、聚(丙烯酸)及聚乙烯吡咯啶酮。
[0043] 举例而言，锭剂调配物可含有诸如胶状二氧化硅、交联聚维酮、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、聚乙二醇、羟基乙酸淀粉钠及二氧化钛之非活性成分。胶囊调配物可含有诸如明胶、硬脂酸镁及二氧化钛之非活性成分。散剂口服调配物可含有诸如硅胶、苯甲酸钠、柠檬酸钠、蔗糖及三仙胶之非活性成分。
[0044] 使用方法
[0045] 本发明是关于一种治疗细菌感染的方法，该细菌感染为诸如幽门螺旋杆菌感染、大肠杆菌感染、沙门氏菌(salmonella)感染、耳感染、尿路感染(诸如膀胱感染及淋病)、皮肤感染(感染咬伤)、牙齿感染、上部呼吸道感染(诸如肺炎)、放线菌病、恶性水肿、气性坏疽、丹毒、出血性败血症、葡萄球菌症、鼻黏膜炎、巴氏杆菌病、嗜血杆菌流感、大肠杆菌病及由革兰氏阳性或阴性细菌感染(gram positive or negative bacterial infection)所导致的一般化脓性病症；从而杀死细菌及防止其增长。本发明亦是关于一种治疗与幽门螺旋杆菌感染相关的胃或十二指肠溃疡的方法；从而减少或消除疾病的症状。本发明进一步是关于一种根除幽门螺旋杆菌的方法。该方法包含选择有需要的个体及向个体投予阿莫西林纳米粒子组成物的步骤。较佳投予途径为经口投予。
[0047] 纳米粒子组成物的给药是基于用于治疗特定疾病及个体病症的阿莫西林的已知剂量。举例而言，对于治疗成年人类中的细菌感染而言，可经口投予含有250mg至500mg阿莫西林的纳米粒子一日三次历时7天至21天；或者，可经口投予含有500mg至875mg阿莫西林的纳米粒子一日两次。对于治疗狗或猫中的细菌感染而言，每12-24小时投予含有5-10mg阿莫西林/磅动物的纳米粒子。
[0048] 以下实施例进一步说明本发明。此等实施例仅意欲说明本发明且不认为会限制本发明。
[0049] 实施例
[0050] 实施例1.制备阿莫西林纳米粒子
[0051] 在室温下将聚葡萄胺糖(10mg，来自Sigma-Aldrich)连同阿莫西林(3mg，来自Sigma-Aldrich)溶解于水(1mL)中。若所用聚葡萄胺糖非完全可溶于水，则添加足够量的乙酸(0.1％-2％)以提高水溶解度。随后在适度搅拌下向溶液中添加阴离子界面活性剂磺基丁二酸钠二辛酯至最终浓度为5％w/v及矿物油或植物油至最终浓度>75％v/v。聚葡萄胺糖溶液不可与油混溶且界面活性剂起稳定聚葡萄胺糖纳米粒子的作用。随后向混合物中添加戊二醛(来自Alfa-Aesar)至最终浓度为5％，接着立即混合30分钟以形成乳化。在乳化期间，发生交联且形成纳米粒子。当反应停止时，藉由离心(200×g)1-5分钟自悬浮液分离粒子；收集颗粒且接着用己烷洗涤。随后干燥纳米粒子以供进一步分析或使用。
[0052] 实施例2.纳米粒子表征
[0053] 使实施例1的纳米粒子以1mg/mL的浓度再悬浮于水中。使用Malvern Zetasizer(ZEN 3600)藉由动态光散射(dynamic light scattering，DLS)量测粒子的尺寸及粒度分布。为进一步表征形态，将一滴纳米粒子悬浮液置放于二氧化硅晶圆上且随后风干隔夜。随后用铬涂布上面具有干燥样品的晶圆且藉由扫描电子显微术(scanning electron microscopy，SEM)成像。
[0054] 如图2中所证实，粒子的平均流体动力学直径为324.6nm且多分散指数(polydispersity index，PDI)为0.2(图2A)。根据SEM，干燥粉末显示平均直径为约300nm的粒子形态，其与DLS量测(图2B)一致。
[0055] 实施例3.测定阿莫西林负载率
[0056] 为量测药物负载率(药物重量/纳米粒子的总重量)，按照描述于实施例1中的相同程序调配负载阿莫西林的纳米粒子，但使用0.1、1、2.5或5mg的不同初始药物量。使用15mL水使1mg干燥纳米粒子悬浮。在4℃下剧烈搅拌悬浮液12小时以完全释放所负载的药物。随后藉由Amicon过滤管以10kDa分子量截止来过滤该悬浮液。量测滤液中的阿莫西林浓度且计算药物负载率。
[0057] 如图3中所示，纳米粒子中的阿莫西林负载率随着阿莫西林初始浓度的增加而增加。当阿莫西林输入浓度为0.1、1、2.5及5mg/mL时，对应的负载率分别测定为3.9％、6.9％、14.2％及24.1％。当阿莫西林输入浓度为3mg/mL(实施例1)时，负载率为20％。
[0058] 实施例4.在不同pH值下量测活体外阿莫西林释放动力学
[0059] 将药物负载率为20％的负载阿莫西林的纳米粒子(根据实施例1制备)用于此实验中。
[0060] 分别在pH＝2.0、5.0、6.0及7.4下使用50mL 10mM Tris-HCl缓冲液来复原含有1mg阿莫西林的干燥纳米粒子(总重量5mg，负载率20％)。悬浮液保持在4℃下同时剧烈搅拌。在各个时间点，获取0.2mL悬浮液且藉由Amicon过滤器以100kDa分子量截止过滤该悬浮液以收集所释放的药物。藉由HPLC测定滤液中的阿莫西林浓度。将在24小时之时间点的阿莫西林的累积释放用作100％释放。
[0061] 在不同pH值位准下，来自纳米粒子调配物的阿莫西林释放显示类似曲线(图4)。随着pH值自2.0增加至7.4，观察到释放速率的微小增加。根据释放曲线，纳米粒子调配物的t80(释放80％囊封阿莫西林的时间)测定为460(pH＝2.0)、385(pH＝5.0)、355(pH＝6.0)及310(pH＝7.4)分钟。在小鼠中，阿莫西林的血浆半衰期报导为约40分钟。
[0062] 实施例5.评估活体内药物动力学
[0063] 对雄性及雌性ICR小鼠(6-8周)进行实验以评估血清中的阿莫西林浓度。向各个小鼠经口投予约0.3mL含有10mg药物负载率为20％之纳米粒子(实施例1)的纳米粒子悬浮液。管饲之后，在5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时及24小时时自各个小鼠收集50μL血液。同时亦测试相同剂量的自由阿莫西林(2mg)作为对照。各个测试群组含有10只小鼠(五只雄性及五只雌性)。藉由HPLC测定各个收集的血清样品中的阿莫西林的浓度。结果显示于图5中。
[0064] 当投予自由阿莫西林时，阿莫西林的血清浓度在15分钟时达到峰值，且随后在1小时之后降至低于峰值的50％且在2小时之后低于20％。相比之下，当投予纳米粒子调配物时，阿莫西林的血清浓度在1小时处达到峰值，且在8小时之后保持高于峰值浓度的50％。此系统性药物浓度的显著延长将增加阿莫西林的治疗性持续时间。基于此等结果，预期当与自由阿莫西林比较时，阿莫西林的纳米粒子调配物将使治疗持续时间增加至少5-10倍。曲线下面积代表循环中的药物的总量测量。值得注意的是，当与纳米粒子调配物的面积相比时，自由阿莫西林显示较小面积，其可能归因于胃中及经由系统性肾脏清除进行的药物清除。
[0065] 实施例6.活体外MIC(最小抑制浓度)及MBC(最小杀菌浓度)
[0066] 细菌培养.在研究中，首先于琼脂培养盘上培养大肠杆菌细菌。随后将新制菌落传送至LB培养基且在37℃下在适度可逆摇晃下培育隔夜。在37℃下在微好氧条件(10％CO2、85％N2及5％O2)下将幽门螺旋杆菌SS1菌株维持于补充有5％裂解马血(Thermo Scientific)之Columbia琼脂上。藉由将来自琼脂培养盘的新制菌落继代培养至含有5％胎牛血清的脑心浸出液(brain heart infusion，BHI)中来制备幽门螺旋杆菌的液体培养物，且在37℃下在微好氧条件下伴以适度可逆摇晃培育隔夜。
[0067] 纳米粒子调配物的活体外MIC测试.以5000×g离心幽门螺旋杆菌SS1或大肠杆菌的隔夜液体培养物10分钟以获得细菌颗粒。调整颗粒使其在600nm处的光8
学密度(optical density at 600nm，OD600)为1.0，对应于约1×10菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)/mL。在96孔培养盘中使用添加体积的培养基将负载阿莫西林
7
的纳米粒子悬浮液(如实施例5相同制备)稀释至各种浓度，且随后添加浓度为1×10CFU/mL的细菌。样品置放在培养条件下且在37℃下培育。藉由微量培养盘读取器经72小时时间跨度量测OD 600吸收。同时测试自由阿莫西林作为对照。
学密度(optical density at 600nm，OD600)为1.0，对应于约1×10菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)/mL。在96孔培养盘中使用添加体积的培养基将负载阿莫西林
7
的纳米粒子悬浮液(如实施例5相同制备)稀释至各种浓度，且随后添加浓度为1×10CFU/mL的细菌。样品置放在培养条件下且在37℃下培育。藉由微量培养盘读取器经72小时时间跨度量测OD 600吸收。同时测试自由阿莫西林作为对照。
[0068] 纳米粒子调配物的活体外MBC测试.以5000×g离心幽门螺旋杆菌SS1或大肠杆菌的隔夜液体培养物10分钟以获得细菌颗粒。调整颗粒使其在600nm处的光学密度8
(OD600)为1.0，对应于约1×10菌落形成单位(CFU)/mL。随后向含有190μL补充有5％FBS的BHI培养基连同各种浓度的负载阿莫西林的纳米粒子的96孔培养盘中添加10微升
6
/孔的含有1×10CFU细菌的细菌悬浮液。在37℃下在微好氧条件下于可逆振荡器上培育
5
该培养盘。在培育30分钟之后，制备细菌悬浮液的一系列10倍稀释液(1:10至1:10)，且将5μL每种经稀释样品接种至具有适当补充剂的Columbia琼脂培养盘上。在保温箱中培养该等培养盘4天，随后对菌落进行计数。同时测试自由阿莫西林作为对照(参见图6A及图6B)。
(OD600)为1.0，对应于约1×10菌落形成单位(CFU)/mL。随后向含有190μL补充有5％FBS的BHI培养基连同各种浓度的负载阿莫西林的纳米粒子的96孔培养盘中添加10微升
6
/孔的含有1×10CFU细菌的细菌悬浮液。在37℃下在微好氧条件下于可逆振荡器上培育
5
该培养盘。在培育30分钟之后，制备细菌悬浮液的一系列10倍稀释液(1:10至1:10)，且将5μL每种经稀释样品接种至具有适当补充剂的Columbia琼脂培养盘上。在保温箱中培养该等培养盘4天，随后对菌落进行计数。同时测试自由阿莫西林作为对照(参见图6A及图6B)。
[0069] 结果
[0070] 当与自由阿莫西林比较时，纳米粒子调配物显示类似的针对幽门螺旋杆菌的抗菌活性(图6)。MIC研究显示在纳米粒子调配物的阿莫西林浓度为0.4mg/mL时完全抑制细菌生长(图6A)。在MBC研究中，当阿莫西林浓度达到2mg/mL时，观察到幽门螺旋杆菌细菌的根除(图6B)。
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