非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的预防和治疗
阅读：1039发布：2021-01-19
专利汇可以提供非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的预防和治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于 预防 和 治疗 非黑素瘤 皮肤 癌(NMSC)的干扰素α(IFN-α)信使RNA(mRNA)以及用于向人患者施用该IFN-αmRNA的 试剂 盒 ，其中所述mRNA具有5'帽区、5'非翻译区(5'-UTR)、编码区、3'非翻译区(3'-UTR)和多聚腺苷尾部(多聚A尾部)。，下面是非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的预防和治疗专利的具体信息内容。
1.用于预防和治疗人患者的非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的干扰素α(IFN-α)信使RNA(mRNA)，其中所述mRNA具有5'帽区、5'非翻译区(5'-UTR)、编码人IFN-α的编码区、3'非翻译区(3'-UTR)和多聚腺苷尾部(多聚A尾部)，特别是其中NMSC是光化性角化病(AK)、基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)，特别是AK。
2.根据权利要求1使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA选自IFN-α1型mRNA(IFNa1)、IFN-α2a型mRNA(IFNa2a)和IFN-α2b型mRNA(IFNa2b)。
3.根据权利要求1或2使用的IFN-αmRNA，其中所述多聚A尾部包含至少100个腺苷一磷酸，优选至少120个腺苷一磷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项使用的IFN-αmRNA，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR与天然IFN-αmRNA不同，优选其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR包含至少一个稳定序列，优选具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO:38)的稳定序列，其中“x”独立地在Nx和Pyx中为0至10的整数，优选为0至5的整数，特别是0、1、2、4和/或5。
5.根据权利要求1-4中任一项使用的IFN-αmRNA，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR与天然IFN-αmRNA不同，其中5'-UTR和/或3'-UTR是与IFN-α不同的人mRNA的5'-UTR和/或3'-UTR，优选选自α珠蛋白、β珠蛋白、白蛋白、脂氧合酶、ALOX15、α(1)胶原蛋白、酪氨酸羟化酶、核糖体蛋白32L、真核延伸因子1a(EEF1A1)、正痘病毒中存在的5□-UTR元件及其混合物，特别是选自α珠蛋白、β珠蛋白、α(1)胶原蛋白及其混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项使用的IFN-αmRNA，其中在所述IFN-αmRNA中，
-全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基胞苷残基取代，和/或
-全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氨基-
2-脱氧胞苷残基取代，和/或
-全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氟-2-脱氧胞苷残基取代，和/或
-全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代胞苷残基取代，和/或
-全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-碘代胞苷残基取代，和/或
-全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被假尿苷残基取代，和/或
-全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被1-甲基假尿苷残基取代，和/或
-全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代尿苷残基取代，和/或
-全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基尿苷残基取代，和/或
-全部腺苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被N6-甲基腺苷残基取代。
7.根据权利要求1至6中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有至少
49.5％、优选至少49.6％、更优选50％、甚至更优选至少55％、特别是至少60％的GC与AU比。
8.根据权利要求1至7中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有至少0.8，优选至少0.9的密码子适应指数(CAI)。
9.根据权利要求1至8中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA的编码区编码-人IFNa2a，并且优选为SEQ ID NO：12，特别是SEQ ID NO：2、3、5、6、7、8、9、10或11；和/或
-人IFNa2b，并且优选为SEQ ID NO：26，特别是SEQ ID NO：19、20、22或25，和/或-人IFNα1，并且优选为SEQ ID NO：36，特别是SEQ ID NO：29、30、31、32、34或35。
10.根据权利要求1至9中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA皮下、皮内、透皮、表皮或局部施用，特别是表皮施用。
11.用于预防和治疗NMSC，优选AK、BCC和SCC，特别是AK的药物制剂，其包含如权利要求
1至10中任一项定义的IFN-αmRNA。
12.根据权利要求11使用的药物制剂，其包含药学上可接受的载体，优选基于聚合物的载体，特别是阳离子聚合物，包括直链和支链PEI和viromer；脂质纳米颗粒和脂质体，纳米脂质体，含神经酰胺的纳米脂质体，蛋白脂质体，阳离子两亲脂质，例如：SAINT-脂质，天然和合成来源的外来体，天然、合成和半合成的板层小体，纳米颗粒，磷硅酸钙纳米颗粒，磷酸钙纳米颗粒，二氧化硅纳米颗粒，纳米晶体颗粒，半导体纳米颗粒，干粉，聚(D-精氨酸)，纳米树枝状聚合物，基于淀粉的递送系统，胶束，乳液，溶胶-凝胶，非离子表面活性剂囊泡(niosome)，质粒，病毒，磷酸钙核苷酸，适配体，肽，肽缀合物，载体标签，优选小分子靶向缀合物，或病毒衣壳蛋白，优选生物纳米囊。
13.用于向患者施用根据权利要求1至10中任一项使用的IFN-αmRNA的试剂盒，其包含-如权利要求1至10中任一项定义的IFN-αmRNA，和
-皮肤递送装置。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述皮肤递送装置是
-皮内递送装置，优选选自基于针的注射系统和无针的注射系统，或
-透皮递送装置，优选选自透皮贴剂、中空和实心微针系统、微结构透皮系统、电泳系统和离子电渗疗法系统，或
-表皮递送装置，优选选自无针注射系统、基于激光的系统、特别是铒YAG激光系统和基因枪系统。
15.用于治疗和预防NMSC，优选AK、BCC和SCC的方法，其中将有效量的如权利要求1至10中任一项所定义的IFN-αmRNA施用至需要其的患者。
非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的预防和治疗
[0001] 本发明涉及用于预防和治疗非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的组合物和方法。
[0002] 非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)是全球最常见的癌症形式。NMSC包括并非始于黑素细胞的所有形式的皮肤癌，最著名的是基底细胞癌(BCC)(约占所有NMSC的75-80％)和鳞状细胞癌(SCC)(约占所有NMSC的20-25％)。
[0003] 光化性角化病(AK)是重要的NMSC实体。在历史上，它被认为是SCC的前体病变。如今，科学界已将其理解为原位癌，其可能会发展为侵入性阶段。与其他NMSC相比，AK非常丰富。
[0004] AK是一种通常在长期暴露于阳光下的皮肤区域发展的皮肤病。AK(现在被认为是原位癌)的病理生理学概念的改变是由以下事实驱动的：在细胞学水平上，AK与SCC难以区分，而在分子生物学水平上，它与SCC具有多个相似之处。
[0005] 根据表皮中非典型角质形成细胞的程度，AK在组织病理学上分为3个等级(AK I-III)。临床上，AK通常呈现为在红斑基部上的鳞斑。触诊显示出砂纸般的质感。周围的皮肤可能显示出长期阳光损伤的迹象，包括毛细血管扩张、色差和弹性形成。皮肤镜检查支持(例如面部色素沉着病变的)鉴别诊断和临床分级。解剖学分布(面部、秃头、颈部、手背)进一步凸显了长期暴露于阳光下是AK发展的主要危险因素的重要性。其他风险因素包括高龄、男性性别和白皙皮肤类型。免疫抑制(例如移植受者)也赋予AK更高的风险。UVB辐射能够导致直接DNA损伤。结果，诸如p53的肿瘤抑制蛋白的功能被抑制。实际上，p53途径的失调似乎在AK病变的发展及其进一步进展为SCC中起着最重要的作用。一些证据表明，人乳头瘤病毒感染是辅助因子。
[0006] 在区域性癌变(field cancerization)的情况下，AK可能以单个病变(≤5)以多个病变(≥6)或多个病变(≥6)的形式出现(即，在长期阳光损害的一个身体区域(region或field)以及相邻区域(area)中的至少6个AK病变)。通用分类推荐第四个亚组，免疫抑制的AK患者。
[0007] 关于AK的自然病史的可用数据表明，未经适当治疗的AK的存在是一种动态但长期的病况。对于个体病变，估计从AK进展为浸润性SCC的风险为10％。由于目前尚无法预测哪些AK病变会进展为SCC，因此重要的是在所有情况下均尽快进行干预。
[0008] 当前的AK治疗可分为两大类：病变定向和区域性定向。最常见的病变定向治疗是冷冻手术，然后进行手术切除。两种病变定向方法的主要缺点是它们只能处理可见的病变，而不能处理受损的区域。此外，据认为它们的美容效果不及区域性定向的效果。由于这些原因，越来越多地采用区域性定向的疗法来消除临床上可见的病变以及亚临床病变以防止其向SCC过渡。
[0009] 当前的区域性定向的疗法包括局部药剂，例如咪喹莫特(作为出售)、双氯芬酸(作为 出售)、5-氟尿嘧啶(作为 或 出
售)、巨大戟醇甲基丁烯酸酯(作为 出售)和光动力疗法
区域性定向的疗法有可能影响亚临床病变。
售)、巨大戟醇甲基丁烯酸酯(作为 出售)和光动力疗法
区域性定向的疗法有可能影响亚临床病变。
[0010] 这些当前的现有技术治疗通常需要使用频繁家庭应用的长期治疗期和大量的停工期。这严重降低患者的依从性，并限制了NMSC治疗在临床实践中的疗效。此外，对现有治疗的反应率也有所不同，据报道，标准治疗后AK的组织学清除率对于氟尿嘧啶治疗后为低至67％，和对于咪喹莫特治疗后为73％。关于区域性定向疗法的长期有效性和复发率的信息是稀缺和印象不深的。一年时间点的复发率为10％至56％。
[0011] 这些印象不深的低成功率使得需要开发新型治疗范式以满足NMSC治疗的医学需求。
[0012] 干扰素α(干扰素alpha、IFN-α、IFNa)(I型干扰素)具有抗病毒、抗血管生成以及促凋亡特性，并且是一种关键的免疫刺激分子，具有已证实的治疗性抗肿瘤功效。干扰素于1957年首次被描述。IFNa基因的克隆和后来的干扰素β(IFN-β；IFNb)和干扰素γ(IFN-γ；
IFNg)在20世纪80年代初才被报道。
IFNg)在20世纪80年代初才被报道。
[0013] 在20世纪80年代，已经提出重组IFNα蛋白用于治疗AK和其他形式的NMSC。当时，有大量报道声称重组IFNa蛋白用于治疗BCC和SCC的安全性和有效性。发现对于大多数BCC和SCC，每周3次持续3周的1.5x106 IU剂量的IFNa的重复病灶周围施用是足够的(大肿瘤需要更高的总剂量)。
[0014] US 5 002 764 A和US 5 028 422 A公开了使用重组人IFNa-2蛋白的AK的病灶内施用治疗。
[0015] 各种BCC亚型似乎有不同的反应，其中表面和溃疡性类型比结节性类型更适合IFNa治疗。在EP 0 248 583 B1中还讨论了在三周的时间内三次病灶内施用重组人IFNα-2b用于治疗人BCC的方法。
[0016] SCC通常比BCC更具侵入性，并且可能威胁生命。原发性皮肤SCC的总体5年复发率为8％(相比之下BCC<0.1％)。
[0017] 关于评估鳞状细胞癌中病灶内IFNa的研究，有少量报道。
[0018] 频繁且长期应用高剂量的病灶内IFNa有效治疗小鳞状细胞癌。对于AK，Edwards及其同事报告了6次高剂量的病灶周围注射，每剂量5x105 IU，以清除AK(Arch.Dermatol.,1986.122(7):p.779-82)。较低剂量的IFNa蛋白(每次注射1x105、1x104 IU)分别被证明对原位AK清除不太有效。
[0019] IFNα在治疗各种类型的NMSC中的作用机制是部分已知的。抗肿瘤作用似乎是由于直接的抗增殖作用以及间接作用的结合，依赖于肿瘤基质和微环境。间接作用包括对先天和适应性免疫系统以及肿瘤血管的影响。IFNa在卡波西氏肉瘤和血管瘤中的有效性证明了其抗血管生成活性的临床意义。
[0020] 尽管已证明IFNa在NMSC中有效，特别是在AK、BCC和SCC中，但它从未成为临床常规治疗方法。原因很明显。治疗需要在数周内频繁(每天或每周三次)病灶周注射。同样，重组IFNα蛋白价格昂贵，并且制剂的质量和重要地生物活性不同。IFNa是使用基因工程大肠杆菌菌株通过重组DNA技术生产的。尽管通过大肠杆菌表达可产生高蛋白产量，但必须对产物进行大量纯化并测试其效能和生物活性，以对于在产品中使用不同程度的非活性和活性蛋白进行的治疗提供可比较水平的生物活性。
[0021] 现代医学中希望避免干扰素特别是IFNα的原因是这些蛋白质具有许多特有的毒性作用。发生的副作用主要有四大类：体质性、神经精神性、血液/免疫性和肝性。这些副作用的严重程度似乎与IFN蛋白治疗的剂量和持续时间直接相关(Borden等人,Semin Oncol,1998.25(1Suppl 1):p.3-8)。
[0022] 体质症状包括类似流感的症状，例如疲劳、发烧、发冷和僵硬。体质症状较早出现，通常在给药后3-6小时内。患者可能还会感到头痛、肌痛和心神不安。在治疗的最初几天内可能会发生转氨酶和中性粒细胞减少症，其可以通过减少剂量来控制。如果治疗不当，则可能导致致命的肝毒性。接受IFN治疗的患者最常出现的慢性症状包括疲劳(70-100％)、厌食症(40-70％)和神经精神疾病(高达30％)。这些症状是剂量相关的和累积的，随着时间的流逝而恶化。自身免疫毒性包括触发红斑狼疮、银屑病和甲状腺功能障碍。在接受IFNa治疗的患者中，有8-20％的患者甲状腺功能失调，从临床到亚临床甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退。大多数患者遵循的模式是自身免疫性甲状腺炎之一，伴有甲状腺功能亢进症期，随后出现甲状腺功能减退。
[0023] 更换蛋白质干扰素特别是IFNa蛋白的需求已导致雷迪帕韦/索非布韦(以商品名Harvoni出售)的组合在治疗丙型肝炎(取代IFNa(与利巴韦林组合))中的巨大市场成功。
[0024] 但是，这些在商业上成功的NMSC特别是AK的治疗选择也显示出明显的不良反应，并且在治疗过程中疗效有限：值得注意的是，在特殊个体中，局部IFN诱导剂(如TLR7激动剂咪喹莫特)可能导致自身免疫毒性的更多相关类型如发展为亚急性皮肤性红斑狼疮。此外，某些个体还在TLR7中携带单核苷酸多态性，这使它们对诸如咪喹莫特的TLR7激动剂无反应(Pharmacogenomics.2015.Nov.；16(17):p.1913-17)。
[0025] 因此，仍然存在对NMSC的改进预防和治疗方案的巨大医疗需求，以提供改善的患者依从性和改善的不良反应事件。
[0026] 当前的区域性定向的疗法代表了外源性类别的局部药剂，包括咪喹莫特、巨大戟醇甲基丁烯酸酯、双氯芬酸和用于光动力疗法(PDT)的光敏剂和氟尿嘧啶。这些当前的最新治疗方法显示，标准治疗后的AK组织学清除率据报道对于氟尿嘧啶治疗后为低至67％，对于咪喹莫特治疗后为低至73％。所有这些现有技术水平的药剂都依赖于NMSC/AK治疗的直接定向(例如：氟尿嘧啶，巨大戟醇甲基丁烯酸酯，PDT)或间接基制(咪喹莫特)。
[0027] 咪喹莫特是使用最广泛的治疗剂之一，它通过激活先天免疫系统发挥作用，进而发挥抗肿瘤活性。
[0028] 咪喹莫特的应用激活了Toll样受体7(TLR7)信号传导，这通常与病原体识别有关。重要的是，作为NMSC中咪喹莫特活性的靶细胞的表皮角质形成细胞组成性表达TLR家族的几个成员。但是，TLR7表达要么不存在，要么只是很难被检测到。因此，咪喹莫特对角质形成细胞的直接作用是不太可能的。
[0029] 相比之下，有令人信服的证据表明咪喹莫特具有间接的抗肿瘤功能：咪喹莫特通过TLR-7激活先天免疫细胞，导致大量分泌细胞因子，主要是干扰素-α(IFNa)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，并促进浆细胞样树突状细胞(pDC)快速募集到皮肤应用侧。咪喹莫特诱导pDC成熟并将其转化为溶细胞杀伤细胞，它们能够独立于适应性免疫系统而消除肿瘤。被咪喹莫特激活的其他细胞类型包括自然杀伤细胞和巨噬细胞。此外，还有令人信服的证据表明，咪喹莫特在局部应用到皮肤时会导致朗格汉斯细胞活化，随后朗格汉斯细胞迁移至局部淋巴结以激活包括B淋巴细胞在内的适应性免疫系统。
[0030] 与NMSC、BCC、SCC和特别是AK中咪喹莫特的仅间接作用或氟尿嘧啶、巨大戟醇甲基丁烯酸酯和PDT的仅直接作用相反，IVTmRNA介导的IFNa蛋白表达表现出对受影响细胞(例如：已成功转染并表达IFNa的角质形成细胞)的特异性的直接和间接作用。已知IFNa直接影响肿瘤细胞的凋亡、增殖或细胞分化，这是由诱导称为IFN刺激的基因(ISG)的一个基因子集引起的。除了牵涉到抗血管生成、免疫调节和细胞周期抑制作用的ISG之外，寡核苷酸微阵列研究还确定了具有凋亡功能的ISG。这些包括TNF-α相关凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)，Fas/FasL，XIAP相关因子-1(XAF-1)，胱天蛋白酶-4，胱天蛋白酶-8，dsRNA活化蛋白激酶(PKR)，2'5'A寡腺苷酸合成酶(OAS)，死亡激活蛋白激酶(DAP激酶)，磷脂混杂酶，半乳凝素9，IFN调节因子(IRF)，早幼粒细胞白血病基因(PML)和IFN诱导死亡的调节剂(RID)。值得注意的是，IFNa还会利用免疫调节剂所激发的间接抗肿瘤活性，因为目前预期它是构成影响咪喹莫特的抗肿瘤活性的主要因素之一。
[0031] 因此，通过同时利用多种抗肿瘤策略(直接和间接)，基于IVTmRNA的IFNa表达显示出改变治疗NMSC、BCC、SCC和特别是AK的当前现有技术的潜力。具体而言，靶细胞中直接的IFNa活性以及作为使用免疫调节剂的当前现有技术方法的激活先天免疫系统的细胞以及随后的抗肿瘤活性。通过这样做，可以容易地想到，这种双重策略增强了治疗的整体活性，因为它可以增强疗效和/或扩大对治疗有反应的患者子集。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种方法，其易于逆转并且不会对患者的整个身体产生严重影响(即由于治疗而导致的(不利的)全身性结局)。此外，期望提供细胞因子治疗而不给患者带来通常伴随的负担，并且增加治疗效率、缓解率和患者依从性。
[0033] 因此，为了克服上面总结的当前治疗选择的局限性，本发明提供了用于预防和治疗非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的干扰素α(IFN-α)信使RNA(mRNA)，其中mRNA具有5'帽区、5'非翻译区(5'-UTR)、编码区、3'非翻译区(3'-UTR)和多聚腺苷尾部(多聚A尾部)。
[0034] 出乎意料的是，可以将IFN-αmRNA应用于罹患NMSC的患者，而不会产生与施用(重组)IFN-α蛋白相关的不适当后果。本发明允许例如在NMSC患者(特别是患有光化性角化病(AK)的患者)的皮肤上或皮肤内进行局部施用，而没有通常与IFN-α治疗相关的全身不良反应。
[0035] 重要的是，本发明使用全长IFNa前体分子而不是重组分子：例如：迄今为止用于临床应用的重组人IFNa2a是细菌制造的165aa长的蛋白，而本发明中使用的构建体是在转染的细胞中产生完整的人188aa前体蛋白。该全长前体在细胞内经加工以形成分泌的165aa生物活性蛋白。重要的是，与重组蛋白(例如细菌产生的Roferon A)相反，这种天然加工的蛋白还包括哺乳动物(特别是人)中完全生物活性所需的天然发生的翻译后修饰。因此，与重组的纯化的IFNa相反，预期在本发明中由IVT mRNA产生的所有蛋白质在预期的靶器官中局部具有100％的生物活性，而无需主要的全身性暴露。
[0036] 这与重组IFNa相反，在重组IFNa中，仅一部分重组材料具有生物活性，并且由于高蛋白剂量和注射量以及施用方式，其还具有全身活性。例如肌内注射Roferon A后，生物利用度大于80％。肌肉内和皮下施用3600万IU后，血清峰值浓度分别为1,500至2,580pg/ml(平均：2,020pg/ml)(平均达到峰值时间为3.8小时)和1,250至2,320pg/ml(平均值：1730pg/ml)(平均达到峰值时间为7.3小时)(以色列卫生部(MOH)批准的处方信息，2001年
12月)。有趣的是，大剂量应用后重组IFNa被快速消除，平均消除半衰期为5.1h，这解释了需要对患者进行NMSC治疗的频繁且高剂量的应用。
12月)。有趣的是，大剂量应用后重组IFNa被快速消除，平均消除半衰期为5.1h，这解释了需要对患者进行NMSC治疗的频繁且高剂量的应用。
[0037] 利用本发明，本领域已知的IFNa蛋白疗法的缺点被令人惊奇地克服。另一方面，代替进一步发展蛋白质施用(通过提供更好的IFNα产物，开发更好的施用途径等)，本发明提供了NMSC治疗方向的重大改变：IFNa-mRNA的施用。令人惊讶的是，IFNa-mRNA不会导致重组IFNa所观察到的大多数不良反应。因此，与使用IFNa蛋白的现有技术疗法相比，IFNa的mRNA形式提供了显著的优势。根据本发明，例如在局部和/或区域定向施用中，IFNa mRNA将保留在靶细胞中，并以足以消除非典型角质形成细胞的水平局部表达几天，而无需像应用时间表和过量给药那样进行大剂量施用。这在本发明的实施例部分中令人印象深刻地示出。根据本发明的IFNα体外转录(IVT)mRNA适合于治疗单个和多个AK病变，主要取决于施用方式(即局部相对于区域定向)。同样，例如根据本发明，AK的所有三个阶段(I-III级)都是用IFNa IVT mRNA治疗的靶标。
[0038] 本发明还允许将IFNa IVT mRNA用作微创、有效的局部或区域定向疗法，理想地是一次施用，其建立在IVT mRNA在体内的可持续表达的基础上。同样明显的是，这种策略使患者的依从性变得无关紧要，并且与目前的AK和潜在地分别SCC和BCC的直接治疗(特别是已在30年前推荐的使用IFNa蛋白的那些)的护理标准相比，以更高的应答率提高治疗效果。其他参数(包括长期复发率和美容效果)在AK和NMSC的情况下值得考虑，并且也比目前的护理标准更好。
[0039] 用于本发明的mRNA包含(至少)五个本领域技术人员已知和可获得的必需元件(以从5'到3'的顺序)：5'帽区、5'未翻译区域(5'-UTR)、IFN-α的编码区、3'非翻译区(3'-UTR)和多聚腺苷尾部(多聚A尾部)。编码区当然应该编码(人)IFN-α，其他成分可以是(天然)IFN-αUTR，或优选地，其他UTR。根据本发明的特别优选的UTR是改善根据本发明的mRNA分子的性质的UTR，即通过在施用部位将mRNA更好和/或更长和/或更有效地翻译成IFN-α蛋白。
[0040] “帽区”(“5'帽”)是指在mRNA分子的5'端发现的结构，通常由通过不常见的5'至5'三磷酸键联连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。该鸟苷核苷酸在体内通过甲基转移酶加帽后，直接在7位甲基化(“7-甲基鸟苷酸帽”(“m7G”)，“帽-0”)。进一步的修饰包括可能在mRNA的5'端的前两个核糖的2'羟基的甲基化(即“帽1”和“帽2”)：“帽1”在第一个核糖上具有甲基化2'-羟基糖，而“帽2”在前两个核糖上具有甲基化的2'-羟基。5'帽在化学上类似于RNA分子的3'端(帽核糖的5'碳是键合的，而3'未键合)。这提供了对5'核酸外切酶的显著抗性，因此也提供了体内稳定性。为了产生根据本发明的mRNA，还可以使用帽类似物，包括但不限于：单甲基化的帽类似物(m帽)，抗反向帽类似物(ARCA帽)，m7G(5')ppp(5')A RNA帽结构类似物，G(5')ppp(5')A RNA帽结构类似物和G(5')ppp(5')G RNA帽结构类似物。
[0041] 术语“(5'-或3'-)UTR”是指分子遗传学中已确定的mRNA非翻译区概念。mRNA链上编码序列的每一侧都有一个UTR。5'端的UTR是5'-UTR(或前导序列)，3'端的UTR是3'-UTR(或尾部序列)。5’-UTR在编码序列的上游。在5′-UTR内是被核糖体识别的序列，其允许核糖体结合并启动翻译。转录起始的机制在原核生物和真核生物中有所不同。在翻译终止密码子后紧跟着3'-UTR。3’-UTR在翻译终止以及转录后基因表达中起着至关重要的作用。如本发明中所使用的UTR通常赋予根据本发明的mRNA分子有益的稳定性和表达(翻译)性质。3'-UTR的3'末端还含有一系列多个腺苷一磷酸，其对核输出、翻译和mRNA的稳定性是重要的。该所谓的多聚腺苷(多聚A)尾部由至少60个腺苷一磷酸、优选100个和最优选120个腺苷一磷酸组成。
[0042] “多聚A尾部”由多个腺苷一磷酸组成；它是天然存在的仅具有腺嘌呤碱基的mRNA的一部分。称为“多聚腺苷酸化”的该过程是产生用于在基因表达过程中进行翻译的成熟的信使RNA(mRNA)的过程的一部分。多聚腺苷酸化的自然过程随着基因转录的终止而开始。新制备的前体mRNA的3'-最末端片段首先被一组蛋白质切割掉；然后这些蛋白质在RNA的3'端合成多聚(A)尾部。在某些基因中，这些蛋白质在几个可能的位点之一上添加了多聚(A)尾部。因此，类似于选择性剪接，多聚腺苷酸化可以从单个基因产生多于一个的转录本(替代性多聚腺苷酸化)。多聚(A)尾部对于mRNA的核输出、翻译和稳定性很重要。因此，对于本发明而言，主要是翻译和稳定性对于根据本发明的mRNA分子的足够的多聚腺苷酸化而言是重要的。在蛋白质生成过程中，尾部会随时间缩短，并且当尾部足够短时，mRNA会被酶降解。本发明的多聚A尾部以目前在人治疗中施用mRNA分子的领域中使用和应用的方式提供。例如，多聚A尾部的长度可能至少为60个腺苷一磷酸。根据一个优选的实施方案，多聚A尾部的长度为至少100个腺苷一磷酸、特别是至少120个腺苷一磷酸。这样可以实现出色的稳定性和蛋白质生成。然而，关于其他特征，根据本发明的mRNA分子的作用和活性也可以通过多聚A尾部特征来调节。
[0043] 根据本发明的mRNA分子中使用的序列可以是天然的或不是天然的。对于IFN-α编码区以及UTR来说都是如此。
[0044] 术语“天然”涉及在其自然环境中的人IFN-αmRNA。
[0045] 优选地，该序列不是天然的，但是经过改进以改善mRNA分子的各种参数，例如功效、稳定性、递送能力、可生产性、翻译起始和翻译。
[0046] 例如，代替使用天然的IFN-α编码序列，可以根据本发明的优选实施方案使用关于GC含量或密码子适应指数(CAI)优化的序列(参见下文)。
[0047] 由于其机理，本发明一般针对NMSC的治疗和预防。然而，光化性角化病(AK)、基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)是本发明特别针对AK的适应症。本发明允许以非常勤勉的方式施用功效强大的分子(编码IFN-α的mRNA)，从而为患者获得成功的临床结果并且至少显著改善疾病，特别是对于AK。在AK的情况下，通过评估预定区域(通常是暴露于相当程度的致癌物(主要是紫外线辐射)的皮肤区域)中的病变数量来衡量疾病的缓解情况。在基线和治疗后的定义的时间点(通常是1和3个月后)进行病变计数。通过视觉和触诊评估个体病变的反应。报告的参数包括从基线到评估的病变计数的平均减少，在预定区域内完全清除所有病变的参与者比率，在预定区域内AK病变计数至少减少75％的参与者比率。
[0048] 根据一个优选的实施方案，根据本发明的IFN-αmRNA是IFN-α1型mRNA(IFNa1)、IFN-α2a型mRNA(IFNa2a)或IFN-α2b型mRNA(IFNa2b)。这三种类型是本发明追求的最直接的IFN-α实体。
[0049] 由于本发明的主要治疗/预防领域是人用药物，因此最优选的实施方案当然是其中编码区编码人IFN-α，特别是人IFNa1、人IFNa2a或人IFNa2b(由本发明的实施例部分中公开的编码IFN-α的各种SEQ ID NO编码)的mRNA。
[0050] 根据本发明的一个优选的实施方案，本发明的mRNA在5'-UTR和/或3'-UTR中(优选在3'UTR中)包含一个或多个能够增加mRNA的细胞内半衰期的稳定序列。这些稳定序列可以与病毒、细菌和真核细胞中存在的天然存在的序列表现出100％的序列同源性，但是也可以是部分或完全合成的。这种稳定序列的实例描述于：Nucleic Acids Res.2010；38(Database issue):D75-D80.UTRdb和UTRsite(RELEASE 2010)：真核mRNA非翻译区的序列和调控基序的集合，位于http://utrdb.ba.itb.cnr.it/。
[0051] 作为可用于本发明的稳定序列的另一个实例，可以提及β-珠蛋白基因(例如智人或非洲爪蟾)的非翻译序列(UTR)。
[0052] 在Holcik等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94:2410to 2414)中已经描述了稳定序列的另一个例子，其通式为：
[0053] (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO:38)，
[0054] 它包含在非常稳定的mRNA的3'UTR中，该mRNA编码例如α(1)-胶原蛋白或α球蛋白和ALOX15或酪氨酸羟化酶(并且其中“x”(独立地Nx和Pyx中的)为0至10，优选0至5的整数(Holcik等人，1997)，特别是0、1、2、4和/或5)。
[0055] 这样的稳定序列可以单独使用或彼此结合用于稳定本发明的mRNA，以及可以与本领域技术人员已知的其他稳定序列结合使用。例如：通过使用两个头尾方向排列的人β-球蛋白3′-UTR，可以进一步增强人β-球蛋白3′-UTR序列的稳定作用。
[0056] 因此，根据本发明的IFN-αmRNA的优选实施方案是mRNA分子，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR不同于天然IFN-αmRNA，优选其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR包含至少一个稳定序列，优选具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO:38)的稳定序列。
[0057] 优选地，5'-UTR和/或3'-UTR是与IFN-α不同的人mRNA的5'-UTR和/或3'-UTR，优选选自α球蛋白、β球蛋白、白蛋白、脂氧合酶、ALOX15、α(1)胶原蛋白、酪氨酸羟化酶、核糖体蛋白32L、真核生物延伸因子1a(EEF1A1)、正痘病毒中存在的5′-UTR元件及其混合物，特别是选自α珠蛋白、β珠蛋白、α(1)胶原蛋白及其混合物。
[0058] 因此，本发明优选地涉及一种mRNA，该mRNA在3’-UTR中包含一个或多个稳定序列，其能够增加mRNA在细胞质中的半衰期。这些稳定序列可以与病毒、细菌和真核细胞中存在的天然存在的序列表现出100％的序列同源性，但是也可以是部分或完全合成的。作为可用于本发明的稳定序列的例子，可以提及β-珠蛋白基因(例如智人或非洲爪蟾)的非翻译序列(UTR)。如前所述，稳定序列的另一个例子具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC，它包含在非常稳定的mRNA的3'-UTR中，该mRNA编码α-球蛋白、α-(1)-胶原、15-脂氧合酶或酪氨酸羟化酶(参见Holcik等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94:2410to 2414)。这些稳定序列可以单独使用或彼此组合用于稳定本发明的修饰的mRNA，以及可以与本领域技术人员已知的其他稳定序列组合使用。
[0059] 本发明的另一个优选实施方案是衍生自核糖体蛋白32L的5'-TOP-UTR，紧跟着衍生自白蛋白-3'-UTR的稳定序列。
[0060] 因此，根据本发明的IFN-αmRNA的一个优选实施方案是在3′-UTR的3′端含有一系列多个腺苷一磷酸的mRNA分子。该所谓的多聚腺苷(多聚A)尾部由至少60个腺苷一磷酸、优选至少100个和最优选至少120个腺苷一磷酸组成。例如在WO 02/098443 A2和EP3 112 469 A1中公开了其他稳定和翻译有效的mRNA。
[0061] 在某些情况下，使mRNA不稳定也可以是期望的以限制蛋白质生产的持续时间。可以通过将去稳定序列元件(DSE)(例如富含AU的元件)掺入3'-UTR中来实现此效果，从而确保mRNA的快速降解和较短的蛋白质表达时间。
[0062] 尽管对于某些实施方案可能期望提供在3'和/或5'UTR中没有去稳定序列元件(DSE)的mRNA，但是可能存在其他实施方案，其中此类DSE的存在或引入是有利的。一般而言，“DSE”是指减少在细胞和/或生物体例如人患者内转录物的半衰期例如根据本发明的mRNA的半衰期的序列。因此，DSE包含核苷酸序列，其降低RNA转录物的细胞内半衰期。
[0063] DSE序列存在于短寿命的mRNA中，例如：c-fos，c-jun，c-myc，GM-CSF，IL-3，TNF-α，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，尿激酶，bcl-2，SGL T1(Na(+)-偶联的葡萄糖转运蛋白)，Cox-2(环氧合酶2)，PAI-2(2型纤溶酶原激活物抑制剂)，β(1)-肾上腺素能受体或GAP43(5'-UTR和3'-UTR)。
[0064] 其他DSE是富含AU的元件(ARE)和/或富含U的元件(URE)，包括九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)(其中U/A是A或U)和/或五聚体AUUUA和/或四聚体AUUU的单个、串联或多个或重叠拷贝。更多的DSE描述于Nucleic Acids Res.2010；38(Database issue):D75-D80.UTRdb和UTRsite(RELEASE 2010)：真核mRNA非翻译区的序列和调控基序的集合，位于http://utrdb.ba.itb.cnr.it/。
[0065] 因此，还优选的是如果5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR包含至少一个去稳定序列元件(DSE)，优选富含AU的元件(ARE)和/或富含U的元件(URE)，特别是九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A)例如五聚体AUUUA和/或四聚体AUUU的单个、串联或多个或重叠拷贝(术语“U/A”表示A或U)。
[0066] 这些稳定和去稳定元件可以单独使用或结合使用，以针对给定的蛋白质生产持续时间，并使本发明的治疗个性化以针对特定的NMSC类型、疾病的特定阶段、特定的患者组或甚至处于该患者的疾病的特定状态的特定病人。
[0067] 尽管还已建议将编码IFNa的核酸用于治疗用途，但是很久以前就已经提出了这些建议，这些建议大多与DNA有关(而不是RNA或特别是mRNA)，并且与完全不同的领域和施用方式有关。此外，对于IFNa-mRNA的这些现有技术用途，未观察到在本发明的上下文中揭示的优点。包含IFNa核酸的治疗方案已主要用于肝病和病毒性疾病，例如丙型肝炎。WO 98/17801 A1公开了用于膀胱内肝癌治疗的药物组合物，其中该组合物包含重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含肝特异性启动子序列和IFNa-b编码序列。在WO 2006/134195A2中描述的不同方法中，将IFNa DNA与IL-6家族、Gp130家族或ADN序列一起作为组合疗法施用以治疗病毒性疾病。类似地，WO00/69913 A1讨论了包含信号序列、免疫球蛋白Fc区和包含IFNα的靶蛋白序列的核酸序列或病毒表达载体，其用于治疗肝炎。
[0068] 在皮肤病学方面，IFNa-DNA治疗已被应用于患有尖锐湿疣(生殖器疣)的患者。在一种方法中，申请WO/9000406 A1描述了尖锐湿疣患者中局部鬼臼脂治疗或其活性成分与病灶内注射的重组人DNAIFN-2a或2b的组合。在WO/9004977 A2中，针对同一疾病的组合疗法公开了在用液氮冷冻手术治疗后重组人DNA IFN-2a或2b的病灶内注射。
[0069] 先前已在WO 2010/037408 A1中描述了包含与阳离子或聚阳离子化合物复合的佐剂mRNA与编码肿瘤抗原的游离mRNA组合的免疫刺激组合物用于预防、治疗和/或改善肿瘤疾病、自身免疫、传染性和过敏性疾病。该方法允许将施用的游离mRNA有效翻译为目的蛋白质，而与佐剂组分复合的mRNA则诱导免疫应答。WO 99/47678A2公开了IFN-α质粒在癌症治疗中的用途。稳定用于体内应用的核酸的另一种方法是核酸序列的修饰，例如添加Kunitz结构域、蛋白酶抑制剂(WO 2009/030464 A2)。
[0070] 已经提出了用于治疗罕见的皮肤病以及用于医学皮肤病学(包括AK)以及美容医学的治疗的基于RNA的疗法：WO 2015/117021 A1公开了药物组合物的用途，该药物组合物包含用于治疗AK的由一种或多种非经典核苷酸组成的RNA，由此核酸编码皮肤特异性结构蛋白或生长因子蛋白组别的目的蛋白，或编码基因编辑蛋白靶标。类似的，WO 2016/131052 A1讨论了施用包含非经典核苷酸的RNA用于治疗皮肤系统的疾病包括光化性角化病，该RNA编码白介素、LIF，FGF生长因子、SERPINB1、胱天蛋白酶-1或BMP的家族的蛋白。在这两个专利申请中，包含合成RNA的药物组合物的施用可以以多种方式发生，例如皮下、皮内、真皮下或肌内注射以及局部。
[0071] 然而，尚未建议在这种情况下应用细胞因子，例如干扰素，特别是IFNa。
[0072] 用于改进的基于mRNA的治疗剂的一般概念(参见例如，Sahin等人,Nat.Rev.Drug Disc.2014.13(10):759-780)也适用于本发明。
[0073] 例如，根据另一个优选的实施方案，根据本发明的IFN-αmRNA可以含有胞苷(C)、尿苷(U)、腺苷(A)或鸟苷(G)残基以外的其他残基。存在这些核苷的大量的天然存在的类似物，以及这些mRNA残基的(甚至更多)合成变体。此类变体的优选实施方案可以例如在WO2014/153052 A2和WO 2015/062738 A1中找到。
[0074] 根据一个优选的实施方案，在本发明的IFN-αmRNA中
[0075] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基胞苷残基取代，和/或
[0076] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氨基-2-脱氧胞苷残基取代，和/或
[0077] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氟-2-脱氧胞苷残基取代，和/或
[0078] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代胞苷残基取代，和/或
[0079] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-碘代胞苷残基取代，和/或
[0080] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被假尿苷残基取代，和/或
[0081] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被1-甲基假尿苷残基取代，和/或
[0082] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代尿苷残基取代，和/或
[0083] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基尿苷残基取代，和/或
[0084] -全部腺苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％N6-甲基腺苷残基取代。
[0085] 特别优选的实施方案是IFN-αmRNA，其中在IFN-αmRNA中
[0086] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基胞苷残基取代，和/或
[0087] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被假尿苷残基取代，和/或
[0088] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代尿苷残基取代。
[0089] 在本发明的过程中，令人惊讶地发现，如果mRNA的GC含量(或GC与AU的比率)进一步增加，则可以获得甚至更好的结果。之所以特别令人惊讶，是因为就翻译/表达效率而言，天然IFNα序列已被认为是最佳的。然而，如果根据本发明的IFN-αmRNA被设计为具有至少49.5％或更优选至少49.6％(例如，至少49.7，至少49.8，至少49.9)的GC与AU的比率，则根据本发明的性能进一步增加。因此，GC与AU的比率优选为至少50％，更优选为至少55％，特别是至少60％。
[0090] 关于以上公开的核苷变体，重要的是要注意，上面描述的特定的优选变体不影响GC含量，即，该变体在这方面是保守的(例如，胞苷变体对于GC含量的计算仍然算作胞苷)。
[0091] 在本发明的过程中揭示的另一令人惊讶的观察结果是，具有增加的密码子适应指数(CAI)的IFNα-mRNA在本发明中也显示出改善的性能，特别是在细胞内的表达能力方面。
[0092] CAI是基因的密码子使用针对高表达基因的密码子使用的相对适应性的量度。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用率与相同氨基酸的最丰富密码子的使用率之比。CAI指数定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值范围为0至1，更高的数值表示最丰富的密码子所占的比率更高(Sharp等人,Nucleic Acids Res.15(1987):1281-1295.,Jansen等人,Nucleic Acids Res.31(2003):2242-2251)。
[0093] 因此，本发明的一个优选实施方案涉及IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有至少0.8、优选至少0.81、至少0.82、至少0.83、至少0.84、至少0.85、至少0.86、至少0.87、至少
0.88、至少0.89的密码子适应指数(CAI)。根据本发明的mRNA的甚至更优选的CAI为至少
0.9、特别是至少0.91。
0.88、至少0.89的密码子适应指数(CAI)。根据本发明的mRNA的甚至更优选的CAI为至少
0.9、特别是至少0.91。
[0094] 比较而言：IFNa1的天然GC与AU的比率为49.5％，IFNa2a为48.7％，而IFNa2b为48.9％；IFNa1的天然CAI为0.8，IFNa2a为0.8，IFNa2b为0.8。
[0095] 甚至更优选地，根据本发明的mRNA具有至少0.8的CAI和至少49.5％的GC含量(或者甚至更优选更高的CAI/GC含量)。
[0096] 根据本发明的IFNa2a的mRNA的优选共有序列是SEQ ID NO：12、13和14；最优选的SEQ ID NO：12。
[0097] SEQ ID NO：12仅包含富含GC的序列；SEQ ID NO：13也被优化并包括富含AU的序列；SEQ ID NO：14是优化的序列。
[0098] 因此，编码人IFNα2a的IFN-αmRNA的编码区优选为SEQ ID NO：12，特别是SEQ ID NO：2、3、5、6、7、8、9、10或11；编码人IFNa2b的IFN-αmRNA的编码区优选为SEQ ID NO：26，特别是SEQ ID NO：19、20、22或25；编码人IFNa1的IFN-αmRNA的编码区优选为SEQ ID NO：36，特别是SEQ ID NO：29、30、31、32、34或35。
[0099] 本发明的优选实施方案是在本发明的过程中表现出改善的性能的IFN-αmRNA，特别是以下那些分子，
[0100] -其中IFN-αmRNA的CAI为0.8或更高，GC含量为48.7％或更高。
[0101] -其中IFN-αmRNA的CAI为0.8至0.99，优选0.81至0.97，特别是0.83至0.85(例如SEQ ID NO：3)；
[0102] -其中IFN-αmRNA的GC含量为48.7％至63.7％，优选为48.7％至60％，特别是48.7％至58.0％；
[0103] -其中IFN-αmRNA的CAI为0.80至0.97，GC含量为48.7％至63.7％；
[0104] -其中IFN-αmRNA的CAI为0.6至0.8，AU含量为48.7％至65.0％。
[0105] -其中IFN-αmRNA的CAI为0.6至0.8，优选0.6至0.7，特别是0.65至0.75(例如SEQ ID NO：4)；和
[0106] -其中IFN-αmRNA的AU含量为48.7％至65.0％，优选为51.3至60.0％。
[0107] 本发明还涉及本发明提供的mRNA分子(不包括天然RNA序列和包含IFN-α的天然编码区的所有mRNA序列)。
[0108] 根据一个优选的实施方案，根据本发明的IFN-αmRNA经皮下、皮内、透皮、表皮或局部、特别是表皮施用。
[0109] 可以根据优化的表达目的，根据所应用的mRNA的量、mRNA分子的稳定性和疾病状况来进行本发明的IFN-αmRNA的施用。例如，可以至少一次、至少两次、在一个月内至少两次优选每周施用IFN-αmRNA。例如，如果可以至少两次、在一个月内至少两次优选每周施用IFN-αmRNA，施用的剂量可以变化。
[0110] 还可以使每剂量递送的mRNA的量取决于分子的稳定性等。优选地，根据本发明的IFN-αmRNA以每剂量0.001μg至100mg，优选地每剂量0.01μg至100mg，更优选每剂量0.1μg至10mg，特别是每剂量1μg至1mg的量施用。
[0111] 用于mRNA治疗剂的合适制剂是本领域公知的(参见例如，Sahin等人，2014；WO 2014/153052 A2(第122至136段)等)。
[0112] 因此，本发明还涉及包含根据本发明的IFN-αmRNA的药物制剂。本发明的制剂包含在药学上可接受的环境中的mRNA，例如具有通常在mRNA治疗剂中提供的合适成分(赋形剂、载体、缓冲剂、辅助物质(例如稳定剂)等)。
[0113] 根据本发明的mRNA制剂优选含有合适的载体。合适的载体包括基于聚合物的载体，例如阳离子聚合物，包括直链和支链PEI和viromer，脂质纳米颗粒和脂质体，纳米脂质体，含神经酰胺的纳米脂质体，蛋白脂质体，阳离子两亲脂质，例如： -脂质，天然和合成来源的外来体，天然、合成和半合成的板层小体，纳米颗粒，磷硅酸钙纳米颗粒，磷酸钙纳米颗粒，二氧化硅纳米颗粒，纳米晶体颗粒，半导体纳米颗粒，干粉，聚(D-精氨酸)，纳米树枝状聚合物，基于淀粉的递送系统，胶束，乳剂，溶胶-凝胶，非离子表面活性剂囊泡(niosome)，质粒，病毒，磷酸钙核苷酸，适配体，肽，肽缀合物，小分子靶向缀合物和其他载体标签(vectorial tag)。还考虑了使用生物纳米囊和其他病毒衣壳蛋白装配体作为合适的载体。(Hum.Gene Ther.2008Sep；19(9):887-95)。
[0114] 优选的载体是阳离子聚合物，包括直链和支链PEI和viromer，脂质纳米颗粒和脂质体，传递体(transfersome)以及包括磷酸钙纳米颗粒的纳米颗粒(即，用CaCl2沉淀然后施用的裸RNA)。
[0115] 本发明的一个优选实施方案涉及使用非复合mRNA，即在合适的水性缓冲溶液、优选生理性葡萄糖缓冲水溶液(生理学)中的非复合mRNA。例如，可以优选应用1xHEPES缓冲溶液；1x磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸钠缓冲溶液；醋酸钠缓冲溶液；优选具有葡萄糖(例如：5％葡萄糖)；生理溶液。
[0116] 优选地，本发明应用脂质体，特别是基于DOTAP、DOTMA、Dotap-DOPE、DOTAP-DSPE、Dotap-DSPE-PEG、Dotap-DOPE-PEG、Dotap-DSPE-PEG-胆酸钠、Dotap-DOPE-PEG-胆酸钠、作为复合物的具有阳离子两亲大分子(CAM)的DOTAP及其组合的脂质体。
[0118] -本文定义的IFN-αmRNA，和
[0119] -皮肤递送装置。
[0120] 优选地，皮肤递送装置是
[0121] -皮内递送装置，优选选自基于针的注射系统和无针的注射系统，或
[0123] -表皮递送装置，优选选自无针注射系统、基于激光的系统、特别是铒YAG激光系统和基因枪系统。
[0124] 这些施用装置原则上是本领域可获得的；对于本领域技术人员而言，容易调节以适应根据本发明的mRNA的施用。
[0125] 本发明还涉及治疗和预防NMSC，优选AK、BCC和SCC的方法，其中将本发明的mRNA以有效量施用至需要其的患者。
[0126] 根据另一方面，本发明还涉及根据本发明的mRNA在预防或治疗湿疣和血管畸形中的用途。同样对于这些方面，本发明是合适的。
[0127] 除了NMSC(特别是：AK、BCC和SCC)以外，其他皮肤病况/疾病的治疗也可能是本发明的主题。这些病况/疾病包括但不限于血管肿瘤和/或畸形，例如血管瘤和葡萄酒斑(鲜红斑痣、火斑)。
[0128] 浅表血管瘤位于皮肤中较高的位置，并具有鲜红色、红斑到红紫色的外观。浅表性病变可以是扁平的和毛细血管扩张的，由小的、变化的分支毛细血管的斑点或斑块组成。它们也可以从皮肤上升或升高，形成丘疹和融合的鲜红色斑块，如凸起的岛。某些部位的浅表性血管瘤(例如后头皮，颈部褶皱和腹股沟/肛周区域)有发生溃疡的潜在风险。溃疡性血管瘤可表现为黑色硬皮丘疹或斑块，或疼痛性糜烂或溃疡。溃疡易于继发细菌感染，其呈现黄色硬皮、流水、疼痛或异味。溃疡也有出血的风险，特别是深部病变或摩擦区域中。多于5个的多个浅表血管瘤可与皮下血管瘤相关，最常见的是肝(肝脏)血管瘤，并且这些需要进行超声检查。
[0129] 深层血管瘤最初通常表现为界限不清的蓝斑，其可增生为丘疹、结节或较大的肿瘤。增生性病变通常可压缩，但相当牢固。许多深层血管瘤可能在主要深层成分上或静脉突出周围具有一些明显可见的浅表毛细血管。深层血管瘤的发展趋势比浅表血管瘤晚一些，并且可能具有更长和更晚的增生期。深层血管瘤很少溃疡，但可能会因其位置、大小和生长而引起问题。在增生阶段，敏感结构附近的深层血管瘤可导致周围较软的结构(例如外耳道和眼睑)受压。混合型血管瘤只是浅表血管瘤和深层血管瘤的结合，并且可能在几个月后才显现出来。患者可合具有浅表性、深层或混合型血管瘤的任何组合。
[0130] 血管瘤的治疗选择包括药物疗法(全身、病灶内和局部)、手术和激光疗法。在2008年之前，治疗有问题的血管瘤的主要方法是口服皮质类固醇激素，这种药物有效且仍然是对β受体阻滞剂治疗禁忌或耐受不良的患者的一种选择。偶然观察到普萘洛尔(一种非选择性β受体阻滞剂)具有良好的耐受性并能有效治疗血管瘤，该药物在一项大型随机对照试验中进行了研究，并于2014年获美国食品药品监督管理局批准用于该适应症。普萘洛尔随后已经成为治疗这些病变的一线全身药物疗法。对于血管瘤治疗可能有效的其他全身疗法包括长春新碱、干扰素和其他具有抗血管生成特性的药物。传统上，需要使用中央静脉用于施用的长春新碱可作为化学治疗剂，但已证明对血管瘤和其他儿童血管瘤(如卡波西氏血管内皮瘤和簇状血管瘤)具有疗效。通过皮下注射给予的干扰素α2a和2b已显示出抗血管瘤的功效(Wilson等人,Ophthalmology 2007；114(5):1007–11)，但可能在治疗的儿童中有高达20％导致痉挛性截瘫(Barlow等人,J.Pediatr.1998；132(3pt 1):527-30；和Worle等人,Eur.J.Pediatr.1999；158(4):344)。因此，在β受体阻滞剂治疗血管瘤的时代，很少使用IFNa药物。
[0131] 序列：
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144] 共有序列SEQ ID NO：12、13、14、26和36用以下IUPAC命名法给出：
[0145] IUPAC命名法：
[0146]
[0147] 表1：IFNa2a变体的密码子适应指数和GC含量(SEQ ID NO：1是表达标准；SEQ ID NO：2、3和5：较高；SEQ ID NO：4：较低；因此与天然序列SEQ ID NOs：1、18和28相比优选具有CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)
[0148]
[0149] 表2：IFNa2b变体的密码子适应指数和GC含量(表1的优选CAI和GC此处也适用)[0150]
[0151] 表3：IFNa1变体的密码子适应指数和GC含量(表1的优选CAI和GC在这里也适用)[0152]
[0154] 图1显示了人BJ细胞转染后24-120h的IVT mRNA的基于RT-PCR的检测(24-120h：转染后24-120h采集的样品；0μg：仅用TransIT处理细胞，并在转染后24h收获；H2O：不含cDNA的阴性对照；阳性对照：来自细胞RNA和IVT mRNA变体的cDNA；空细胞：未转染的BJ成纤维细胞。
[0155] 图2显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在人BJ成纤维细胞中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SEQ ID NO：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂；A：转染后24小时分析；B：转染后72小时分析。
[0156] 图3显示了密码子和AU含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在人BJ成纤维细胞中诱导较低的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂；A：转染后24小时分析；B：转染后72小时分析。
[0157] 图4显示密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在猪皮肤表皮片层中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂；A：转染后24小时分析；B：转染后48小时分析)。
[0158] 图5显示密码子和AU含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在猪皮肤表皮片层中诱导较低的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂；A：转染后24小时分析；B：转染后48小时分析)。
[0159] 图6显示使用TransIT mRNA转染试剂对猪表皮片层进行EGFP mRNA转染诱导eGFP在猪皮肤表皮片层中表达(A：仅用脂质体转染的猪皮肤；B：用在TransIT中配制的0.5μg/ml eGFP IVTm RNA转染的猪皮肤；C：用在TransIT中配制的1μg/ml eGFP IVTm RNA转染的猪皮肤)。
[0160] 图7显示使用mRNA/脂质体复合物对猪表皮片层进行EGFP mRNA转染诱导eGFP在猪皮肤表皮片层中表达(A：仅用脂质体转染的猪皮肤；B：用在脂质体中配制的2μg/ml eGFP IVTm RNA转染的猪皮肤；C：用在脂质体中配制的10μg/ml eGFP IVTm RNA转染的猪皮肤)。
[0161] 图8显示了在用LacZ IVT mRNA转染24小时后在猪皮肤外植体中完整量的β-半乳糖苷酶(bGal)活性的检测结果(A：只用DOTAP-脂质体转染而无RNA酶抑制剂的猪皮肤；B：用在不含RNA酶抑制剂的DOTAP脂质体中配制的5μg LacZ IVTm RNA转染的猪皮肤；C：仅用DOTAP脂质体+RNA酶抑制剂转染的猪皮肤；D：用在不含RNA酶抑制剂的DOTAP脂质体中配制的5μg LacZ IVTm RNA转染的猪皮肤；成功的转染分别在B和D的圈出区域中突出显示)。
[0162] 图9显示了用eGFP IVT mRNA转染后24h在猪皮肤外植体中eGFP表达的检测(未经处理：未经处理的活检；LNP ctrl：经LNP对照处理的猪皮肤；eGFP-LNP：经mRNA-脂质-纳米颗粒转染的猪皮肤(显示的浓度：2.4μg eGFP mRNA/剂量)；eGFP 5μg和eGFP10μg：用非复合eGFP IVT-mRNA转染的猪皮肤(显示的浓度：5+10μg mRNA/剂量)；缓冲剂ctrl：仅用缓冲剂处理的猪皮肤)。
[0163] 图10显示了鼠3T3细胞转染后24-120h IVT mRNA的检测(24-120h：转染后24-120h采集的样品；0.1-1μg：用于转染的mRNA剂量；0μg：细胞仅用TransIT处理并在转染后24h收获；H2O：不含cDNA的阴性对照；ctr：使用鼠ACTB(muACTB)作为对照/参考基因的RT PCR对照)。
[0164] 图11显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在鼠3T3成纤维细胞中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SEQ ID NO：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂；A：转染后96小时分析；B：转染后120小时分析)。
[0165] 图12显示了密码子和AU含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在转染后24h在鼠3T3成纤维细胞中诱导较低的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂；ctrl：仅缓冲剂)。
[0166] 图13显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在转染后48h在猪表皮片层中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂)。
[0167] 图14显示具有100％的假U取代U和5mC取代C的IVT mRNA在转染后24-72h在猪表皮片层中诱导人IFNa2a蛋白差异表达(SEQ ID NO：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；仅将未修饰的核苷酸用于体外转录；SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN：包含假U对U和5mC对C的完全取代的mRNA)。
[0168] 图15显示具有100％的假U取代U和5mC取代C的IVT mRNA在转染后24-120h在人BJ成纤维细胞中诱导人IFNa2a蛋白差异表达(SEQ ID NO：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；仅将未修饰的核苷酸用于体外转录；SEQ ID NO1_MN/SEQ ID NO:3_MN：包含假U对U和5mC对C的完全替换的mRNA)。A)IVT mRNA SEQID NO1和SEQ ID NO1_MN的比较；B)IVT mRNA SEQ ID NO3和SEQ ID NO3_MN的比较；
[0169] 图16显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在转染后24h至72h在人BJ细胞中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列)。
[0170] 图17显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在转染后24小时和48小时在猪皮肤表皮片层中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂)。
[0171] 图18显示了使用常规琼脂糖凝胶电泳控制IVT mRNA包被的金颗粒(载有1μg/μl IVT-mRNA的1.6μm的金微载体)的加载。可比较的IVT mRNA量已固定在金颗粒上。
[0172] 图19显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的基因枪IVT mRNA转染在转染后24h诱导人皮肤中增加的人IFNa2a蛋白分泌(SeqID：各IFNa2 mRNA序列包被的金颗粒；未转染的皮肤的CTRL培养基；eGFP：来自eGFP包被的金颗粒处理的皮肤的培养基)。结果显示为平均值+/-SEM；A)五名人供体的平均值；B)个体供体#1的示例(值：来自3次活检的合并上清液)；C)个体供体#2的示例(值：来自3次活检的合并上清液)
[0173] 图20显示了密码子和GC含量优化的mRNA变体的基因枪IVT mRNA转染在转染后24h诱导人皮肤中增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：各IFNa2 mRNA序列包被的金颗粒；未转染的皮肤的CTRL提取物；eGFP：来自eGFP包被的金颗粒处理的皮肤的提取物)。结果显示为平均值+/-SEM；A)五名人供体的平均值；B)个体供体#1的示例(来自3次活检的平均值)；C)个体供体#2的示例(来自3次活检的平均值)
[0174] 图21显示了基因枪IVT mRNA转染导致所用IVT mRNA诱导的表皮蛋白表达。可以通过在冷冻切片上进行抗eGFP免疫组织化学检测eGFP的表达。(A，H，I，J，K，L)未转染的对照活检。(B，C，D，E，F，G)用1μg/μl eGFP-mRNA处理的活检。
[0175] 图22显示了密码子和AU含量优化的mRNA变体的IVT mRNA转染在转染后24小时和48小时在猪皮肤表皮片层中诱导增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：与TransIT复合的各IFNa2 mRNA序列；TransIT：仅TransIT mRNA转染试剂)。
[0176] 图23显示了密码子和AU含量优化的mRNA变体的基因枪IVT mRNA转染在转染后24h诱导人皮肤中增加的人IFNa2a蛋白分泌(SeqID：各IFNa2 mRNA序列包被的金颗粒；未转染的皮肤的CTRL培养基；eGFP：来自eGFP包被的金颗粒处理的皮肤的培养基)。结果显示为平均值+/-SEM；A)五名人供体的平均值；B)个体供体#1的示例(值：来自3次活检的合并上清液)；C)个体供体#2的示例(值：来自3次活检的合并上清液)
[0177] 图24显示了密码子和AU含量优化的mRNA变体的基因枪IVT mRNA转染在转染后24h诱导人皮肤中增加的人IFNa2a蛋白表达(SeqID：各IFNa2 mRNA序列包被的金颗粒；未转染的皮肤的CTRL提取物；eGFP：来自eGFP包被的金颗粒处理的皮肤的提取物)。结果显示为平均值+/-SEM；A)五名人供体的平均值；B)个体供体#1的示例(来自3次活检的平均值)；C)个体供体#2的示例(来自3次活检的平均值)
[0178] 图25显示了在用复合有阳离子聚合物(0.03-0.1μg mRNA/转染)或非复合(0.1μg mRNA/转染)的FLuc IVT mRNA皮内注射24h和48h后在猪皮肤活检中萤火虫萤光素酶(FLuc)表达的检测。未转染的猪皮肤用作对照A：转染后24h相对发光单位(RLU)的检测；B：转染后48h RLU的检测。0.03μg FLuc_聚合物和0.1μg FLuc_聚合物…IVT mRNA复合至转染试剂；
0.1μg FLuc…非复合mRNA，未经处理…未转染的皮肤。
实施例：
0.1μg FLuc…非复合mRNA，未经处理…未转染的皮肤。
实施例：
[0179] 材料与方法：
[0180] 鼠3T3成纤维细胞和人B.J.皮肤成纤维细胞的转染
[0181] 为了转染，将鼠3T3成纤维细胞和人B.J.皮肤成纤维细胞以4-6×104个细胞/孔接种在12孔板中。在完全EMEM或DMEM培养基(Gibco,Thermo Fisher,USA)中孵育24小时后，更换培养基。制备了与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA的不同制剂(Mirus Bio；根据制造商的说明形成复合物)并将其添加到细胞中。转染后24小时，将培养基替换为完全DMEM。将细胞在标准条件下进一步培养最多5天，每天更换培养基，直至评估结果。
[0182] 完整猪皮活检的分离和转染：
[0183] 从猪的尸体中分离出完全厚度的猪皮瓣(样品在完全符合现行国家法规(即Tierversuchsgesetz 2012，TVG 2012)下获得)并使用 消毒剂(Schuelke+Mayr GmbH，Germany)进行消毒。
[0184] 完整猪皮的转染是通过直接皮内注射IVT-mRNA溶液(1-10μg mRNA/剂量)完成的。根据制造商的说明(根据Kariko等人；Mol.Ther.2012.20(5):948-53进行了些许修饰)使用-mRNA转染试剂盒(Mirus BioTM)或使用基于DOTAP的脂质体制剂(Sigma
Aldrich，USA)配制LacZ IVTmRNA(使用5-甲基胞苷、假尿苷完全修饰；Trilink Inc.,USA)。
使用5/1(μg/μg)的脂质/RNA比率制备基于DOTAP的制剂。此外，mRNA复合物还补充有RNA酶抑制剂(5U/剂量，RNasin，Promega，USA)。注射量为20μl至30μL。
Aldrich，USA)配制LacZ IVTmRNA(使用5-甲基胞苷、假尿苷完全修饰；Trilink Inc.,USA)。
使用5/1(μg/μg)的脂质/RNA比率制备基于DOTAP的制剂。此外，mRNA复合物还补充有RNA酶抑制剂(5U/剂量，RNasin，Promega，USA)。注射量为20μl至30μL。
[0185] 或者，通过直接皮内注射eGFP IVT-mRNA溶液(0.5-25μg mRNA/剂量)转染完整的猪皮。根据制造商的说明(根据Kariko等人，2012略加修改)使用 -mRNA转染试剂盒(Mirus BioTM)或使用基于DOTAP的脂质体制剂(Sigma Aldrich，USA)或使用脂质-纳米颗粒制剂(Polymun，Austria)或使用基于SAINT的脂质体制剂(Synvolux，Netherlands)配制eGFP IVTmRNA(AMPTec，Germany)。使用5/1(μg/μg)的脂质/RNA比率制备基于DOTAP的制剂。使用2.5-4/1(μg/μg)的脂质/RNA比率为制备基于SAINT脂质的制剂。此外，还皮内注射生理缓冲剂中的未复合的mRNA。注射量为20μl至30μL。
[0186] 注射后，获取注射区域(直径8mm)的穿刺活检，去除皮下脂肪，并将活检表皮向上地转移到培养皿中的标准完全培养基中(5mL；包含：具有GlutaMAX的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，10％FCS，1X青霉素-链霉素-两性霉素B；获自Gibco.Life Technologies)。随后的培养在37℃/5％CO2下进行24小时。通常在转染后24小时收获活检。
[0187] 猪表皮片层的分离和转染
[0188] 从猪的尸体中分离出完全厚度的猪皮瓣(样品在完全符合现行国家法规(即Tierversuchsgesetz 2012，TVG 2012)下获得)并使用 消毒剂(Schuelke+Mayr GmbH，Germany)进行消毒。从完全厚度的皮瓣上获取穿刺活检(直径6或8mm)，去除皮下脂肪，并将活检切成两部分。之后立即将切开的活检表皮向上地转移至含有5mL Dispase II消化液(约2.5单位/mL；Dispase II；Sigma Aldrich，USA)的9cm(直径)培养皿中。随后的消化在4℃下进行过夜。通过用1x DMEM(Gibco)以1：2稀释Dispase II储备溶液(在50mM HEPES/150mM NaCl中的10mg/mL；pH-7.4)并添加1x青霉素/链霉素来制备Dispase II消化液。第二天，用镊子将表皮片层从下面的真皮中移出，并转移至DMEM中用于短时间(5分钟)清洗步骤。随后将片层置于完全DMEM培养基中，并在37℃/5％CO2下孵育(6至8小时)，直到在24孔培养皿中进行转染。使用eGFP IVTmRNA(AmpTec，Germany)或IFNa的IVT mRNA构建体(例如：SEQ ID NOs：1-5和NO：53)进行猪表皮片层的转染。根据制造商的说明使用转染试剂盒(Mirus BioTM)或使脂质体制剂(Polymun，Austria)配
制mRNA。使用5/1(μg/μg)的脂质/RNA比率制备脂质体制剂。所有用于转染的lipoplex溶液均包含0.1μg至10μg mRNA/mL DMEM培养基，并将表皮片层培养一到三天。
制mRNA。使用5/1(μg/μg)的脂质/RNA比率制备脂质体制剂。所有用于转染的lipoplex溶液均包含0.1μg至10μg mRNA/mL DMEM培养基，并将表皮片层培养一到三天。
[0189] 对于分析而言，收集组织培养上清液用于随后的ELISA分析。收获片层用于RNA和蛋白质提取，然后分别通过qPCR和ELISA进行分析。另外，还通过原位检测eGFP的直接荧光显微镜和免疫组织化学分析了eGFP转染的表皮片层的eGFP表达。
[0190] 使用IVT mRNA制剂转染的细胞的RT-PCR分析
[0191] 使用与TransIT mRNA转染试剂复合的0.1至1μg IFNa2 IVTmRNA转染人B.J.细胞和鼠3T3成纤维细胞。使用Tri-Reagent(Thermo Fisher，USA，制造商说明书)在转染后的不同时间点从鼠和人成纤维细胞或猪表皮片层中分离出总细胞RNA，并通过常规RT-PCR(Protoscript First Strand cDNA合成试剂盒，NewEngland Biolabs，根据制造商说明书)将mRNA反转录为cDNA。然后对cDNA样品进行常规PCR和qPCR。使用的引物获自Invitrogen。
[0192] 使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen，USA)和IFNa2变体特异性引物(Invitrogen，USA)，从用不同IFNa2变体转染的细胞/片层获得的cDNA进行检测IFNa2变体的PCR分析。人RPL4和鼠ACTB(Eurofins Genomics)用作阳性对照。使用常规琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
[0193] 表4：PCR引物
[0194]引物(生产商,SEQ ID NO:) 序列
huRPL4_fw(EG,39) 5’-AGC GTG GCT GTC TCC TCT C-3’
huRPL4_rev(EG,40) 5’-GAG CCT TGA ATA CAG CAG GC-3’
hu_IFNA2_v2_fw(IVG,41) 5’-GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA-3’
hu_IFNA2_v2_rev(IVG,42) 5’-CCC ACC CCC TGT ATC ACA C-3’
hu_IFNA2_ACC1_fw(IVG,43) 5’-CAC GAG ATG ATC CAG CAG AT-3’
hu_IFNA2_ACC1_rev(IVG,44) 5’-CTT GTC CAG CAG TGT CTC GT-3’
huIFNA2_AMP_humod_f(IVG,45) 5’-CTG CTC TGT TGG CTG TGA TT-3’
huIFNA2_AMP_humod_r(IVG,46) 5’-CAG GCA TGA GAA CAG GCT AA-3’
hu_IFNA2_AMP_AU_fw(IVG,47) 5’-TGA TGC TTC TTG CAC AAA TG-3’
hu_IFNA2_AMP_AU_rev(IVG,48) 5’-AGG ACA GGA ATG GTT TCA GC-3’
hu_IFNA2_AMP_GC_fw(IVG,49) 5’-CAA GGA GTC GGA GTG ACT GA-3’
hu_IFNA2_AMP_GC_rev(IVG,50) 5’-CAG GGT GAT CCT CTG GAA GT-3’
muACTB_fw(EG,51) 5‘-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3‘
muACTB_rev(EG,52) 5‘-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3‘
huRPL4_fw(EG,39) 5’-AGC GTG GCT GTC TCC TCT C-3’
huRPL4_rev(EG,40) 5’-GAG CCT TGA ATA CAG CAG GC-3’
hu_IFNA2_v2_fw(IVG,41) 5’-GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA-3’
hu_IFNA2_v2_rev(IVG,42) 5’-CCC ACC CCC TGT ATC ACA C-3’
hu_IFNA2_ACC1_fw(IVG,43) 5’-CAC GAG ATG ATC CAG CAG AT-3’
hu_IFNA2_ACC1_rev(IVG,44) 5’-CTT GTC CAG CAG TGT CTC GT-3’
huIFNA2_AMP_humod_f(IVG,45) 5’-CTG CTC TGT TGG CTG TGA TT-3’
huIFNA2_AMP_humod_r(IVG,46) 5’-CAG GCA TGA GAA CAG GCT AA-3’
hu_IFNA2_AMP_AU_fw(IVG,47) 5’-TGA TGC TTC TTG CAC AAA TG-3’
hu_IFNA2_AMP_AU_rev(IVG,48) 5’-AGG ACA GGA ATG GTT TCA GC-3’
hu_IFNA2_AMP_GC_fw(IVG,49) 5’-CAA GGA GTC GGA GTG ACT GA-3’
hu_IFNA2_AMP_GC_rev(IVG,50) 5’-CAG GGT GAT CCT CTG GAA GT-3’
muACTB_fw(EG,51) 5‘-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3‘
muACTB_rev(EG,52) 5‘-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3‘
[0195] EG:Eurofins Genomics,IVG:Invitrogen
[0196] IVT mRNA诱导的人IFNa2蛋白的分析
[0197] 对于与TransIT mRNA转染试剂复合的不同IFNa2变体使用0.1-1μg IVT mRNA转染人B.J.细胞和猪表皮片层，并在转染后培养120小时。在转染后的几个时间点从转染的细胞和表皮片层获得上清液。同样，在相同的时间点收获细胞并提取蛋白质。使用细胞提取缓冲剂(10mM HEPES，10mM KCl，0.1μM EDTA，0.3％NP40和Roche蛋白酶抑制剂，根据制造商的方案)提取蛋白质。使用人IFN-α(亚型2；IFNa2)ELISA开发试剂盒(MABTECH AB，Sweden，根据制造商的说明)进行上清液和细胞提取物中IFN-α的测定，在Infinite 200PRO多模式阅读器(Tecan AG,Switzerland)上进行测量。
[0198] IVT mRNA诱导的eGFP蛋白的分析
[0199] 完整的猪皮肤外植体和猪表皮片层用与TransIT mRNA转染试剂或不同脂质体载体复合或未复合(在生理缓冲剂中“裸”)的0.1-10μg eGFP IVT mRNA转染，并在转染后培养24h。收集样品并使用细胞提取缓冲剂(10mM HEPES，10mM KCl，0.1μM EDTA，0.3％NP40和Roche蛋白酶抑制剂，根据制造商的方案)提取蛋白质。使用GFP体外SimpleStep试剂盒(Abcam Plc.,UK，根据制造商说明书)进行eGFP测定，并在Infinite 200PRO多模式阅读器(Tecan AG,Switzerland)上进行测量。
[0200] 猪组织中β-半乳糖苷酶活性的检测
[0201] 活检的全部量β-半乳糖苷酶(bGal)染色在37℃下于24孔培养板中进行24或48小时。通过将bGal酶(1U重组bGal蛋白/注射)皮内注射到猪皮肤中产生阳性染色对照。在开始染色程序之前，将活检在室温下于4％甲醛溶液(PBS)中温和固定1小时。固定后，将样品在PBS中洗涤(3x)，然后在LacZ洗涤缓冲剂(溶于PBS中的2mM MgCl2、0.01％脱氧胆酸钠和0.02％NP-40)中平衡。在LacZ缓冲剂中平衡后，将样品储存过夜(4℃)。随后，将样品在染色溶液中于37℃孵育，并监测显色反应。新鲜制备染色溶液(在LacZ缓冲剂中5mM K4Fe(CN)6和
5mM K3Fe(CN)6)并添加1mg/mL 5-溴-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-Gal)作为彩色基底。如果染色进行48小时，则在24小时后更换染色溶液。染色体积通常为0.5mL/孔。通过在LacZ洗涤缓冲剂和3x PBS中洗涤来停止染色。随后将样品在4％甲醛缓冲剂中固定过夜，然后进一步处理用于标准组织学，或者在OCT中冷冻以用于后续组织学分析。
5mM K3Fe(CN)6)并添加1mg/mL 5-溴-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-Gal)作为彩色基底。如果染色进行48小时，则在24小时后更换染色溶液。染色体积通常为0.5mL/孔。通过在LacZ洗涤缓冲剂和3x PBS中洗涤来停止染色。随后将样品在4％甲醛缓冲剂中固定过夜，然后进一步处理用于标准组织学，或者在OCT中冷冻以用于后续组织学分析。
[0202] 完整人皮肤活检的分离和基因枪转染：
[0203] 通过标准的美学和重建手术程序获得完全厚度人皮瓣(在完全符合当前国家法规的情况下获得样品)，并使用 消毒剂(Germany Schuelke+Mayr GmbH)进行消毒。
[0204] 对于基因枪mRNA转染，使用BioRad Helios基因枪系统。该系统装载有IVT mRNA包被的金颗粒(装载有1μg/μl IVT-mRNA的1.6μm的金微载体；Biorad；根据制造商的方案)。使用400psi的氦气压在距人皮肤外植体2.5cm的距离上进行基因枪转染。转染后，对转染区域进行穿孔活检(直径8mm)，除去皮下脂肪，并将活检表皮向上地转移到培养皿中的标准完全培养基中。将活检在5％CO2下在气液界面处的αMEM+10％pHPL培养基中保持24小时。通常在转染后24小时收获活检。
[0205] 人皮肤中eGFP蛋白的原位分析
[0206] 对于基因枪转染，使用了BioRad Helios基因枪系统，该系统装载有eGFP-mRNA包被的金颗粒(装载有1μg/μl eGFP-mRNA的1.6μm的金微载体)，使用400psi的氦气压，在距8毫米人皮肤外植体2.5cm的距离处。将外植体在5％CO2下在气液界面处的αMEM+10％pHPL培养基中保持24小时。将活检在4％多聚甲醛中在4℃固定过夜，并获得10μm冷冻切片。使用GFP抗体(抗-GFP；鸡IgY)，并通过Alexa Fluor 488缀合的驴抗鸡IgY抗体进行检测。通过使用Alexa Fluor 568鬼笔环肽对F-肌动蛋白染色来检测细胞骨架，并将载玻片固定在含有DAPI(4',6-二脒-2-苯基吲哚)的Roti-mount Fluor Care DAPI中进行复染。通过Olympus Slidescanner VS-120-L 100-W系统以20倍放大率扫描载玻片。(A，B)中的比例尺＝500μm；(C-L)中的比例尺＝50μm
[0207] 萤火虫萤光素酶IVT mRNA的体内应用和IVT mRNA诱导的FLuc蛋白的分析[0208] 所有动物实验专门在University Clinic for Swine(University of Veterinary Medicine Vienna)进行，并根据奥地利动物实验法(TVG2012)使用猪(混合品种；Edelschwein x Pietrain)进行。实验已获得维也纳兽医大学动物实验伦理委员会和奥地利联邦教育、科学与研究部的批准，并以批准号GZ 68.205/0192-WF/V/3b/2017进行。实验开始时，猪的体重为30kg至50kg。在计划注射的前一天，将所有猪的侧腹仔细剃毛，以尽可能避免皮肤刺激。在注射当天，将猪麻醉。注射前，用温水彻底清洁剃光的皮肤区域，并用Octenisept(Schuelke+Mayr GmbH,Germany)消毒两次。对于皮内注射，使用胰岛素注射器(BD Micro-FineTM+)施加30μL。注射点用合适的标记物( Laboratory
Markers)进行明显标记，并根据注射方案进行标记。为了进行样品分析，由专业人员在注射后24h和48h对猪进行安乐死。将包含所有注射部位的皮瓣切除并立即置于冰上。使用10mm穿刺孔活检收集来自标记区域的猪皮肤活检。在白色96孔板(MicroWellTM，Nunc)中的100uL Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖DMEM(Gibco)中收集样品。对样品进行直接的萤光素酶活性测量。使用Firefly Luc One-Step Glow测定试剂盒(Thermo Scientific，USA，根据制造商的说明)进行测量，并在Infinite 200PRO多模式读取器(Tecan AG,Switzerland)上进行分析。
Markers)进行明显标记，并根据注射方案进行标记。为了进行样品分析，由专业人员在注射后24h和48h对猪进行安乐死。将包含所有注射部位的皮瓣切除并立即置于冰上。使用10mm穿刺孔活检收集来自标记区域的猪皮肤活检。在白色96孔板(MicroWellTM，Nunc)中的100uL Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖DMEM(Gibco)中收集样品。对样品进行直接的萤光素酶活性测量。使用Firefly Luc One-Step Glow测定试剂盒(Thermo Scientific，USA，根据制造商的说明)进行测量，并在Infinite 200PRO多模式读取器(Tecan AG,Switzerland)上进行分析。
[0209] 实施例1：从转染后24h-120h从人BJ成纤维细胞获得的cDNA中，通过IFNa2-变体特异性PCR检测编码不同IFNa2变体的mRNA。
[0210] 为了评估IFNa2 mRNA变体在人皮肤成纤维细胞中是否在延长的时间段内稳定，使用编码SEQ ID NO：1-5的不同mRNA来转染B.J.细胞。在不同时间点(转染后24-120h)分离RNA，并通过非定量RT PCR确定转染后长达120h的mRNA的存在。
[0211] 结果：如图1所示，使用1μg mRNA/12孔转染后，在所有评估的时间点可以检测到所有IFNa2 mRNA变体，显示出mRNA稳定性≥120h，与人细胞中的密码子优化或GC含量无关。
[0212] 图1显示了不使用或使用与TransIT mRNA转染试剂复合的1μg mRNA转染的BJ细胞。转染后(24h-120h)在不同时间点分离总细胞RNA，并通过常规RT-PCR将mRNA反转录为cDNA。然后使用SEQ ID NO：1-5的引物对cDNA样品进行变体特异性PCR，以检测转染的IFNa2 mRNA和作为PCR对照的人RPL4(显示为ctr)。因此，目前存在的所有IFNa2a变体在人细胞中在延长的时间段内都是稳定的(在猪表皮片层中也可以在延长的时间内检测到mRNA)。因此，根据CAI和G+C含量，存在IFNα的差异表达/分泌。
[0213] 实施例2：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后24h和72h，通过蛋白ELISA从人BJ成纤维细胞的细胞培养上清液中评估人IFNa2a蛋白的水平。
[0214] 为了评估人系统中最佳翻译效率的密码子优化(由密码子适应指数CAI确定)以及IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中GC含量的同时增加是否会改变人IFNa2a蛋白在人皮肤成纤维细胞中的表达，BJ成纤维细胞蛋白用不同的IFNa2a mRNA变体转染。编码SEQ ID NO：1、2、3和5的mRNA用于转染BJ细胞。随后，确定转染后长达120h的人IFNa2a从转染细胞的分泌水平。
[0215] 结果：所有4个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图2)。对编码天然人IFNa2a和三个变体的IVT mRNA的比较分析显示密码子优化(即CAI水平≥0.8)的出乎意料的联合作用和mRNA CDS中G+C含量的增加(GC含量≥49.5％)。图2显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的BJ细胞(4*104-5*104/孔)。获得上清液(≤n＝6/条件)，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0216] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0217] 实施例3：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后24h和72h，通过蛋白ELISA从人BJ成纤维细胞的细胞培养上清液中评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0218] 在此实施例中，评估了对于IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中低于阈值(49.5％)的GC含量和较低的CAI水平(即CAI＜0.8)的差异密码子优化的效果。如上所述，用天然的(SEQ ID NO：1)以及显示出CAI＜0.8和/或GC含量＜49.5％的变体(例如：SEQ ID NO：4)转染BJ成纤维细胞。随后，确定转染后长达120h的人IFNa2a从转染细胞的分泌水平。
[0219] 结果：2个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/12孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图3)。然而，在所有评估的时间点，与SeqID4 mRNA相比，天然的、未修饰的IFNa2a mRNA显示出更高的IFNa2a蛋白表达。图3显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的BJ细胞(50.000/孔)。获得上清液(≤n＝6/条件)，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0220] 因此，经过优化但低于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在人细胞中诱导IFNa2a的效率较低(表达的幅度和持续时间)。
[0221] 实施例4：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后24h和48h，通过蛋白ELISA从猪表皮片层的细胞培养上清液中评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0222] 为了评估人系统中最佳翻译效率的密码子优化(由密码子适应指数CAI确定)以及IFNa2 mRNA变体编码序列(CDS)中GC含量的同时增加是否会改变人IFNa2a蛋白在猪皮肤中的表达，用不同的IFNa2a mRNA变体转染来自猪皮肤的表皮片层。编码SEQ ID NO：1、2、3和5的mRNA用于转染表皮片层。单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后长达72h的人IFNa2a从转染组织的分泌水平。
[0223] 结果：所有4个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图4，另见图13)。对编码天然人IFNa2a和三个变体的IVT mRNA的比较分析显示密码子优化(即CAI水平≥0.8)的出乎意料的联合作用和mRNA CDS中G+C含量的增加(GC含量≥49.5％)。图4显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的猪表皮片层。获得上清液(≤n＝6/条件)，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0224] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在完整猪组织中在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0225] 实施例5：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后24h和48h，通过蛋白ELISA从猪表皮片层的细胞培养上清液中评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0226] 在此实施例中，评估了对于IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中低于阈值(49.5％)的GC含量和较低的CAI水平(即CAI＜0.8)的差异密码子优化的效果。如上所述，用天然的(SEQ ID NO：1)以及显示出CAI＜0.8和/或GC含量＜49.5％的变体(例如：SEQ ID NO：4)转染猪表皮片层。同样，将单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后长达72h的人IFNa2a从转染细胞的分泌水平。
[0227] 结果：2个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图5)。然而，在所有评估的时间点，与SeqID4 mRNA相比，天然的、未修饰的IFNa2a mRNA显示出更高的IFNa2a蛋白表达。图5显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的猪表皮片层。获得上清液(≤n＝6/条件)，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0228] 因此，经过优化但低于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在猪组织中诱导IFNa2a的效率较低(表达的幅度和持续时间)。
[0229] 实施例6：在用TransIT mRNA转染试剂配制的eGFP IVT mRNA转染后24小时，检测猪表皮片层中的eGFP。
[0230] 在此实施例中，随着时间监测eGFP的表达，分别作为实施例4+5中进行的实验的转染效力的阳性对照。
[0231] 如上所述，用TransIT和与eGFP mRNA复合的TransIT转染猪表皮片层。另外，还包括TransIT和eGFP mRNA的第二种制剂(即0.5μg mRNA/孔)作为剂量对照。随后，通过直接荧光显微术监测转染组织中eGFP蛋白的表达。
[0232] 结果：在所分析的两个实施例中均可检测到相似水平的eGFP表达，表明两个实验中转染效率具有可比性(图6)。重要的是，在该实验中还可以检测到eGFP表达的剂量依赖性作用。
[0233] 图6显示了以不同浓度：0.5和1μg mRNA/ml使用的在TransIT中配制的eGFP mRNA。转染后24h，将天然器官样品使用Vectashield DAPI-Hard固定包埋介质固定在Superfrost plus玻璃载玻片上，并使用带有Apotome 2的Zeiss AxioImage Z2显微镜进行直接荧光检测。与仅脂质体处理的片层相比，通过表皮片层中的eGFP阳性细胞可分别检测到成功的转染。
[0234] 实施例7：用脂质体转染试剂配制的eGFP IVT mRNA转染后24h，检测猪表皮片层中的eGFP。
[0235] 在此实施例中，随时间监测由替代转染制剂诱导的eGFP表达。
[0236] 如上所述，使用两种不同的eGFP mRNA浓度(2μg/ml和10μg/mlmRNA)，用基于脂质体的制剂转染猪表皮片层。随后，通过直接荧光显微术监测转染组织中eGFP蛋白的表达。
[0237] 结果：在该实验中，以剂量依赖性方式检测到eGFP表达(图7和表5)。总转染效力分别与实施例4-6中获得的结果相当。
[0238] 表5：转染后24h猪表皮片层中eGFP的表达
[0239]mRNA的制剂 量(mRNA/剂量) 表皮中eGFP的表达(pg/mg总蛋白)
阳离子两亲脂质体 5.4μg/ml 775
TransIT；lipoplex 2μg/ml 7677
阳离子脂质体 2μg/ml 8363
阳离子脂质体 10μg/ml 11180
阳离子两亲脂质体 5.4μg/ml 775
TransIT；lipoplex 2μg/ml 7677
阳离子脂质体 2μg/ml 8363
阳离子脂质体 10μg/ml 11180
[0240] 图7显示了以两种浓度：2和10μg mRNA/ml使用的脂质体中配制的eGFP mRNA。转染后24h，将天然器官样品使用Vectashield DAPI-Hard固定包埋介质固定在Superfrost plus玻璃载玻片上，并使用带有Apotome 2的Zeiss AxioImage Z2显微镜进行直接荧光检测。与仅脂质体处理过的片层相比，通过表皮片层中的eGFP阳性细胞的浓度依赖性增加可分别检测到成功的转染。
[0241] 实施例8：在用基于DOTAP的脂质体转染试剂配制的LacZ IVT mRNA转染后24h，在猪皮肤外植体中全部量β-半乳糖苷酶(bGal)活性的检测。
[0242] 为了评估mRNA变体是否能够原位转染哺乳动物皮肤，用不同的LacZ mRNA制剂转染从猪皮肤获得的穿刺活检。在此实施例中，通过皮内转染诱导的LacZ表达在转染后24小时通过全部量β-半乳糖苷酶染色来监测。
[0243] 完整猪皮肤的转染是通过直接皮内注射IVT-mRNA溶液(5μg mRNA/剂量；+/-RNA酶抑制剂)进行的。使用DOTAP-脂质体配制mRNA。转染后24h，对器官样品进行全部量β-半乳糖苷酶(bGal)染色。通过BluoGal原位染色可以检测到成功的转染。随后，对注射区域(直径8mm)进行穿刺活检，取出皮下脂肪，并将活检培养24小时。
[0244] 结果：通过检测转染的活检中的bGal活性可以可视化LacZ表达(图8)。对于不同的LacZ mRNA制剂(+/-RNA酶抑制剂)，bGal活性是可比较的，并且通过转染的活检的上层真皮区室中的蓝色染色可以检测到表达。
[0245] 实施例9：在用各种转染试剂和非复合RNA配制的eGFP IVT mRNA转染后24小时，在猪皮肤外植体中检测eGFP表达。
[0246] 为了评估mRNA变体是否能够原位转染哺乳动物皮肤，用不同的eGFP mRNA制剂转染从猪皮肤获得的穿刺活检。在此实施例中，从转染后24h获得的组织提取物中通过eGFP蛋白ELISA监测由皮内转染诱导的eGFP表达。沿着这些思路，生产并注射了不同的eGFP mRNA制剂(有关详细信息，参见表6)。
[0247] 表6：i.d.转染24h后在猪皮肤活检中的eGFP表达
[0248]
[0249] 使用的制剂包括：与TransIT mRNA转染试剂复合的eGFP mRNA，与基于DOTAP的脂质体制剂复合的eGFP mRNA，与基于SAINT脂质的脂质体制剂复合的eGFP mRNA，含有脂质纳米颗粒的eGFP mRNA以及在生理缓冲剂中配制的非复合eGFP mRNA。
[0250] 完整猪皮肤的转染通过直接皮内注射IVT-mRNA溶液(eGFP IVTm RNA(1-25μg mRNA/剂量))完成。使用TransIT mRNA转染试剂、基于DOTAP的脂质体、基于SAINT脂质的脂质体、脂质纳米颗粒或非复合mRNA在生理缓冲剂中配制mRNA。随后，对注射区域(直径8mm)进行穿刺活检，取出皮下脂肪，将活检培养24小时，随后分析eGFP的表达。转染后24小时，对器官样品进行蛋白质提取和随后的eGFP蛋白质ELISA。
[0251] 结果：注射后24小时，通过eGFP蛋白ELISA可检测到eGFP表达。(图9，表5)。eGFP脂质复合物(LNP和脂质体复合物)以及TransIT(用作标准品)显示出相似的浓度依赖性eGFP诱导。在2.4μg和5μg mRNA/剂量之间可检测到最佳表达。非复合mRNA也显示成功转染。但是，在此实验环境中所需的最低浓度为5μg mRNA/剂量，以便在猪真皮中诱导可检测的eGFP表达，这表明在不存在转染试剂的情况下，mRNA的转染效率较低。
[0252] 实施例10：从转染后24h-120h从鼠3T3成纤维细胞获得的cDNA中通过IFNa2-变体特异性PCR检测编码不同IFNa2变体的mRNA。
[0253] 为了评估IFNa2 mRNA变体在鼠成纤维细胞中是否在延长的时间段内稳定，使用编码SEQ ID NO：1-5的不同mRNA来转染3T3细胞。在不同的时间点(转染后24-120h)分离RNA，并通过非定量RT PCR确定转染后长达120h在转染细胞中的mRNA的存在。
[0254] 结果：如图10所示，使用1μg mRNA/12孔转染后，在所有评估的时间点可以检测到所有IFNa2 mRNA变体，显示出mRNA稳定性≥120h，无论人细胞中的密码子优化或GC含量。
[0255] 图10显示了不使用或使用与TransIT mRNA转染试剂复合的0.1-1μg mRNA转染的3T3细胞。转染后(24h-120h)在不同时间点分离总细胞RNA，并通过常规RT-PCR将mRNA反转录为cDNA。然后使用SEQ ID NO：1-5的引物对cDNA样品进行变异特异性PCR，以检测转染的IFNa2 mRNA和作为PCR对照的鼠ACTB(显示为ctr)。因此，存在的所有IFNa2a变体在人细胞中在延长的时间段内都是稳定的。因此，根据CAI和G+C含量，存在IFNα的差异表达/分泌。
[0256] 实施例11：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后96h和120h，通过蛋白ELISA从鼠3T3成纤维细胞的细胞培养上清液中评估人IFNa2a蛋白的水平。
[0257] 为了评估人系统中最佳翻译效率的密码子优化(由密码子适应指数CAI确定)以及IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中GC含量的同时增加是否会改变人IFNa2a蛋白在人皮肤成纤维细胞中的表达，我们用不同的IFNa2a mRNA变体转染了3T3成纤维细胞。编码SEQ ID NO：1、2、3和5的mRNA用于转染3T3细胞。随后，确定转染后长达120h的人IFNa2a从转染细胞的分泌水平。
[0258] 结果：所有4个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图11)。对编码天然人IFNa2a和三个变体的IVT mRNA的比较分析显示密码子优化(即CAI水平≥0.8)的出乎意料的联合作用和mRNA CDS中G+C含量的增加(GC含量≥49.5％)。图11示出了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的3T3细胞(4*104-5*104/孔)。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0259] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0260] 实施例12：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后24小时，通过蛋白ELISA从鼠3T3成纤维细胞的细胞培养上清液中评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0261] 在此实施例中，评估了对于IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中低于阈值(49.5％)的GC含量和较低的CAI水平(即CA＜0.8)的差异密码子优化的效果。如上所述，用天然的(SEQ ID NO：1)以及显示出CAI＜0.8和/或GC含量＜49.5％的变体(例如：SEQ ID NO：4)转染3T3成纤维细胞。随后，确定转染后长达120h的人IFNa2a从转染细胞的分泌水平。
[0262] 结果：2个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图12)。然而，在所有评估的时间点，与SeqID4 mRNA相比，天然的、未修饰的IFNa2a mRNA显示出更高的IFNa2a蛋白表达。图12显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的3T3细胞(40-50.000/孔)。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0263] 因此，经过优化但低于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)阈值的序列在人细胞中诱导IFNa2a的效率较低(表达的幅度和持续时间)。
[0264] 实施例13：在用人IFNαIVT mRNA变体转染后48小时，通过蛋白ELISA从猪表皮片层的细胞提取物中评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0265] 为了评估人系统中最佳翻译效率的密码子优化(由密码子适应指数CAI确定)以及IFNa2 mRNA变体编码序列(CDS)中GC含量的同时增加是否会改变人IFNa2a蛋白在猪皮肤中的表达，用不同的IFNa2a mRNA变体转染来自猪皮肤的表皮片层。编码SEQ ID NO：1、2、3和5的mRNA用于转染表皮片层。单独的TransIT用作对照。随后，确定转染后长达72h的转染组织中人IFNa2a的胞内水平。
[0266] 结果：所有4个IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图13显示了转染后48h的一个例子)。对编码天然人IFNa2a和三个变体的IVT mRNA的比较分析显示密码子优化(即CAI水平≥0.8)的出乎意料的联合作用和mRNA CDS中G+C含量的增加(GC含量≥49.5％)。图13显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的猪表皮片层。获得细胞提取物，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/mg IFNa2蛋白。
[0267] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在完整猪组织中在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0268] 实施例14：通过用人IFNa IVT mRNA变体转染后24h猪表皮片层的细胞培养上清液的蛋白质ELISA评估人IFNa2a蛋白的水平来比较Seq ID NO：1和SEQ ID NO：3mRNA与其具有100％的假U取代U和5mC取代C的变体。
[0269] 在此实施例中，评估了修饰的核苷酸(例如假U和m5C)对IFNa2mRNA变体表达水平的影响。如上文所述用两种形式的天然(SEQ ID NO：1)IVT mRNA(一种包含100％的假U取代U和5mC取代C以及一种无修饰的核苷酸)以及两种形式的显示CAI>0.8和/或GC含量>49.5％的IFNa变体(SEQ ID NO：3)(例如：SEQ ID NO：3的包含100％的假U取代U和5mC取代C的一种变体，和一种无修饰的核苷酸的变体)转染猪表皮片层。同样，单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后24小时的转染组织中人IFNα2a的分泌水平。
[0270] 结果：如图14所示，通过细胞上清液中分泌的IFNa2a的检测可视化IFNa2的表达。
[0271] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在完整猪组织中在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0272] 实施例15：通过用人IFNa IVT mRNA变体转染后24-120h人BJ成纤维细胞的细胞培养上清液的蛋白质ELISA评估人IFNa2a蛋白的水平来比较Seq ID NO：1和SEQ ID NO：3mRNA与其具有100％的假U取代U和5mC取代C的变体。
[0273] 在此实施例中，评估了修饰的核苷酸(例如假U和m5C)对IFNa2mRNA变体表达水平的影响。如上文所述用两种形式的天然(SEQ ID NO：1)IVT mRNA(一种包含100％的假U取代U和5mC取代C以及一种无修饰的核苷酸)以及两种形式的显示CAI>0.8和/或GC含量>49.5％的IFNa变体(SEQ ID NO：3)(例如：SEQ ID NO：3的包含100％的假U取代U和5mC取代C的一种变体，和一种无修饰的核苷酸的变体)转染人BJ成纤维细胞。同样，单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后24至120小时的转染细胞中人IFNα2a的分泌水平。
[0274] 结果：如图15所示，通过细胞上清液中分泌的IFNa2a的检测可视化IFNa2的表达。
[0275] 那些高于(CAI≥0.8和GC含量≥49.5％)的阈值的序列在早期和晚期诱导出明显更高的IFNa2a表达水平，表明在完整猪组织中在表达的幅度和持续时间上相比wt、天然序列的令人惊讶的高益处。
[0276] 实施例16：通过用人IFNa IVT mRNA变体转染后24-120h人BJ成纤维细胞的细胞培养上清液的蛋白质ELISA评估人IFNa2a蛋白的水平来比较Seq ID NO：1和SEQ ID NO：53。
[0277] 在此实施例中，评估了IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中的UTR修饰和差异密码子优化的效果。
[0278] 用完全人IFNa(SEQ ID NO：53)以及含有天然IFNa编码序列(CDS；SEQ ID NO：1)的IVT mRNA转染人BJ成纤维细胞。同样，单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照(未显示)。随后，确定转染后至多120小时的转染组织中人IFNα2a的分泌水平。
[0279] 结果：使用的所有IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图16)。然而，在评估的所有时间点，与SEQ ID NO：1相比，完全人IFNα(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白表达。图16显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的人BJ成纤维细胞。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0280] 因此，经过UTR和/或CDS优化的序列比完全人IFNa mRNA在猪组织中更有效地诱导IFNa2a(表达的幅度和持续时间)。与SEQ ID NO：53相比，SEQ ID NO：1的增加程度分别是：转染后24h的6.2倍；转染后48h的4.8倍；转染后72h和92.5倍。
[0281] 实施例17：通过使用用人IFNαmRNA和人IVT mRNA变体转染后24h和48h猪表皮片层的细胞培养上清液的蛋白ELISA评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0282] 在此实施例中，评估了IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中的UTR修饰和差异密码子优化的效果。
[0283] 用完全人IFNa(SEQ ID NO：53)以及含有天然IFNa编码序列(CDS；SEQ ID NO：1)以及如上所述的CDS变体的IVT mRNA(SEQ ID NO：3)转染猪表皮片层。同样，单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后长达48h的转染组织中人IFNa2a的分泌水平。
[0284] 结果：使用的所有IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图17)。然而，在评估的所有时间点，与SEQ ID NO：1-3相比，完全人IFNa(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白表达。图17显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的猪表皮片层。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0285] 因此，经过UTR和/或CDS优化的序列比完全人IFNa mRNA在猪组织中更有效地诱导IFNa2a(表达的幅度和持续时间)。与SEQ ID NO：53相比增加的程度分别是：SEQ ID NO：1的7.4倍；和SEQ ID NO：3的8.6倍。
[0286] 实施例18：通过用人IFNαmRNA和人IVT mRNA变体转染后24h基因枪转染的人皮肤活检的细胞培养上清液和组织提取物的蛋白ELISA评估人IFNα2a蛋白的水平。
[0287] 在此实施例中，评估了IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中的UTR修饰和差异密码子优化的效果。使用Helios基因枪系统，用完全人IFNa(SEQ ID NO：53)以及含有天然IFNa编码序列(CDS；SEQ ID NO：1)或如上所述的CDS变体(SEQ ID NO：2、3、5)的IVT mRNA基因枪转染来自n＝5个不同供体的人皮肤活检。未转染的皮肤以及用eGFP IVT mRNA转染的皮肤用作对照。随后，确定转染后长达24小时的转染组织中人IFNa2a的分泌水平和组织中IFNa2a的水平。
[0288] 结果：图18显示了与所用mRNA无关的在金颗粒涂层中的相似功效。图19显示了使用IVT mRNA颗粒转染的人皮肤活检中分泌的IFNa2a。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。图20显示了使用IVT mRNA颗粒转染的人皮肤活检的皮肤组织中人IFNa2a蛋白的水平。获得细胞提取物，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。图21显示了使用基因枪eGFP颗粒转染的表皮转染。
[0289] 转染后，eGFP mRNA在人皮肤中诱导的人IFNa2a分泌水平非常低(157pg/ml；是SEQ ID NO：53(1873pg/ml)的1/12)。所有使用的IFNa2 mRNA变体都使用1μg mRNA/μl装载的颗粒诱导高水平的人IFNa2a蛋白分泌(图18-20)。然而，与SEQ ID NO：1-5相比，完全人IFNa(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白分泌。因此，经历过UTR和/或CDS优化的序列在人组织中比完全人IFNa mRNA更有效地诱导IFNa2a分泌(表达的幅度和持续时间)。基于所有5个供体，在此实验中与SEQ ID NO：53相比增加的程度分别是：SEQ ID NO：1的10.9倍；SEQ ID NO：2的2.7倍；SEQ ID NO：3的19.2倍；和SEQ ID NO：5和5.8倍。如图19所示的个体供体显示了支持上述教导的不同幅度。
[0290] 转染后，eGFP mRNA在人皮肤中诱导的人IFNa2a水平非常低(44pg/mg组织；是SEQ ID NO：53(1150pg/mg组织)的1/26)。所有使用的IFNa2 mRNA变体均使用1μg mRNA/μl装载的颗粒诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图18-20)。然而，与SEQ ID NO：1-5相比，完全人IFNa(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白表达。因此，经历过UTR和/或CDS优化的序列在人组织中比完全人IFNa mRNA更有效地诱导IFNa2a(表达的幅度和持续时间)。基于全部5个供体，在此实验中与SEQ ID NO：53相比增加的程度分别是：SEQ ID NO：1的4.2倍；SEQ ID NO：2的1.4倍；SEQ ID NO：3的10.1倍；和SEQ ID NO：5的3倍。如图20所示的个体供体显示了支持上述教导的不同幅度。
[0291] 实施例19：在用eGFP mRNA转染后24小时，通过经基因枪转染的人皮肤活检的免疫荧光分析评估eGFP蛋白的表达。
[0292] 在此实施例中，评估了eGFP蛋白在人皮肤中的表达和定位。使用Helios基因枪系统用eGFP IVT mRNA对来自不同供体的人皮肤活检进行基因枪转染。用空金颗粒处理的皮肤用作对照。随后，将活检在转染后24h固定在4％多聚甲醛中，并在10μm冷冻切片上进行eGFP特异性免疫荧光分析。
[0293] 结果：如图21所示，转染后24h在基因枪转染的人皮肤中可以检测到eGFP的广泛表达。有趣的是，如在F-肌动蛋白阳性表皮区室(红色)中可检测到但下层真皮区室中未检测到的eGFP阳性绿色细胞所标记，基因枪射转染仅限于表皮区室。这种表皮靶向强烈支持了以前不可能的直接靶向表皮中受影响细胞(例如角质形成细胞)的新颖概念的可行性和适用性，从而进一步证明了除了可以通过免疫调节剂(如咪喹莫特)的局部应用来解决的潜在的间接作用以外，IFNa mRNA介导的蛋白质表达对受影响细胞的直接作用。
[0294] 实施例20：通过用人IFNa mRNA和人IVT mRNA变体转染后24h和48h猪表皮片层的细胞培养上清液的蛋白ELISA评估人IFNa2a蛋白的水平。
[0295] 在此实施例中，评估了IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中的UTR修饰和差异密码子优化的效果。
[0296] 用完全人IFNα(SEQ ID NO：53)以及如上所述的CDS变体(SEQ ID NO：4)转染猪表皮片层。同样，单独的TransIT以及与eGFP mRNA复合的TransIT用作对照。随后，确定转染后长达48h的转染组织中人IFNa2a的分泌水平。
[0297] 结果：使用的所有IFNa2 mRNA变体在所评估的所有时间点均使用1μg mRNA/孔诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图22)。然而，在评估的所有时间点，与SEQ ID NO：4相比，完全人IFNα(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白表达。图20显示了用与TransIT mRNA转染试剂复合的IVT mRNA(1μg mRNA/孔)转染的猪表皮片层。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为ng/ml IFNa2a蛋白。
[0298] 因此，经过UTR和/或CDS优化的序列比完全人IFNa mRNA在猪组织中更有效地诱导IFNa2a(表达的幅度和持续时间)。
[0299] 实施例21：通过用人IFNa mRNA和人IVT mRNA变体转染后24h基因枪转染的人皮肤活检的细胞培养上清液和组织提取物的蛋白ELISA评估人IFNa2a蛋白的水平。
[0300] 在此实施例中，评估了IFNa2 mRNA变体的编码序列(CDS)中的UTR修饰和差异密码子优化的效果。使用Helios基因枪系统，用完全人IFNa(SEQ ID NO：53)以及含有如上所述的CDS变体的IVT mRNA(SEQ ID NO：4)基因枪转染来自n＝5个不同供体的人皮肤活检。未转染的皮肤以及用eGFP IVT mRNA转染的皮肤用作对照。随后，确定转染后长达24小时的转染组织中人IFNa2a的分泌水平和组织中IFNa2a的水平。
[0301] 结果：图23显示了使用IVT mRNA转染的人皮肤活检中IFNa2a的分泌。获得上清液，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。所描绘的值测量为pg/ml IFNa2a蛋白。图24显示了使用IVT mRNA颗粒转染的人皮肤活检的皮肤组织中人IFNα2a蛋白的水平。获得细胞提取物，并进行人IFNa2特异性蛋白ELISA(MABTECH)。
[0302] 转染后，eGFP mRNA在人皮肤中诱导的人IFNa2a分泌水平非常低(157pg/ml；是SEQ ID NO：53(1873pg/ml)的1/12)。所有使用的IFNa2 mRNA变体都使用1μg mRNA/μl装载的颗粒诱导高水平的人IFNa2a蛋白分泌(图23)。然而，与SEQ ID NO：4相比，完全人IFNa(SEQ ID NO：53)显示出较低的IFNa2a蛋白分泌。因此，经过UTR和/或CDS优化的序列在人组织中比完全人IFNa mRNA更有效地诱导IFNa2a分泌(表达的幅度和持续时间)。如图23所示的个体供体显示出支持上述教导的不同幅度。
[0303] 转染后，eGFP mRNA在人皮肤中诱导的人IFNa2a水平非常低(44pg/mg组织；是SEQ ID NO：53(1150pg/mg组织)的1/26)。所有使用的IFNa2 mRNA变体均使用1μg mRNA/μl装载的颗粒诱导高水平的人IFNa2a蛋白(图24)。然而，与SEQ ID NO：4相比，完全人IFNa(SEQ ID NO：53)显示出更低的IFNa2a蛋白表达。因此，经过UTR和/或CDS优化的序列在人组织中比完全人IFNa mRNA更有效地诱导IFNa2a(表达的幅度和持续时间)。如图24所示的个体供体显示了支持上述教导的不同幅度。
[0304] 实施例22：用基于阳离子聚合物的转染试剂配制的萤火虫萤光素酶IVT mRNA转染后24小时和48小时，猪皮肤中萤火虫萤光素酶活性的体内检测。
[0305] 在此实施例中，随时间监测由基于阳离子聚合物的转染制剂诱导的体内萤火虫萤光素酶(FLuc)表达。为了检测萤光素酶的活性，如上所述使用两种不同剂量的mRNA(1ng/μl(即：0.03μg/剂量)和3.3ng/μl(即：0.1μg/剂量)mRNA)以及非复合mRNA(3.3ng/μl；即：0.1μg/剂量)用基于聚合物的制剂皮内注射猪(约45kg，混合品种；Edelschwein x Pietrain)。天然的、未转染的器官样品(即皮肤活检)用作背景对照。随后，通过直接活性测量在转染后
24h和48h监测转染的组织的萤光素酶活性。为了进行分析，分离了注射部位，并对得到的活检进行Firefly Luc One-Step Glow测定试剂盒。通过生物发光可以检测到成功的转染(检测：相对发光单位(RLU))。
24h和48h监测转染的组织的萤光素酶活性。为了进行分析，分离了注射部位，并对得到的活检进行Firefly Luc One-Step Glow测定试剂盒。通过生物发光可以检测到成功的转染(检测：相对发光单位(RLU))。
[0306] 结果：转染后，两种剂量的复合FLuc mRNA均可检测到萤光素酶活性(图25)。在该实验中，萤光素酶活性可以以剂量依赖性方式(0.1μg FLuc mRNA复合物诱导的RLU>0.03μg FLuc mRNA复合物诱导的RLU)在体内皮内注射24h(图25A；0.03μg/剂量，n＝6个样品；和0.1μg/剂量，n＝9；未复合的mRNA：n＝3；未处理的活检：n＝6)和48h(图25B，0.03μg/剂量，n＝9个样品，和0.1μg/剂量，n＝9；未处理的活检：n＝6)后检测到。非复合的FLuc mRNA诱导的RLU与背景信号相似，同样可以分别在未经处理的皮肤样品中检测到。
[0307] 因此，本发明涉及以下优选实施方案：
[0308] 1.用于预防和治疗人患者的非黑素瘤皮肤癌(NMSC)的干扰素α(IFN-α)信使RNA(mRNA)，其中所述mRNA具有5'帽区、5'非翻译区(5'-UTR)、编码人IFN-α的编码区、3'非翻译区(3'-UTR)和多聚腺苷尾部(多聚A尾部)。
[0309] 2.根据实施方案1使用的IFN-αmRNA，其中所述NMSC是光化性角化病(AK)、基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)，特别是AK。
[0310] 3.根据实施方案1或2使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA选自IFN-α1型mRNA(IFNa1)、IFN-α2a型mRNA(IFNa2a)和IFN-α2b型mRNA(IFNa2b)。
[0311] 4.根据实施方案1-3中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述多聚A尾部包含至少100个腺苷一磷酸、优选至少120个腺苷一磷酸。
[0312] 5.根据实施方案1-4中任一项使用的IFN-αmRNA，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR与天然IFN-αmRNA不同，优选其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR包含至少一个稳定序列，优选具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO:38)的稳定序列，其中“x”独立地在Nx和Pyx中为0至10的整数，优选为0至5的整数，特别是0、1、2、4和/或5。
[0313] 6.根据实施方案1-5中任一项使用的IFN-αmRNA，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR与天然IFN-αmRNA不同，并且包含至少一个去稳定序列元件(DSE)，优选为富含AU的元件(ARE)和/或富含U的元件(URE)，特别是九聚体UUAUUUA(U/A)(U/A的单个、串联或多个或重叠拷贝。
[0314] 7.根据实施方案1-6中任一项使用的IFN-αmRNA，其中5'-UTR或3'-UTR或5'-UTR和3'-UTR与天然IFN-αmRNA不同，其中5'-UTR和/或3'-UTR是与IFN-α不同的人mRNA的5'-UTR和/或3'-UTR，优选选自α珠蛋白、β珠蛋白、白蛋白、脂氧合酶、ALOX15、α(1)胶原蛋白、酪氨酸羟化酶、核糖体蛋白32L、真核延伸因子1a(EEF1A1)、正痘病毒中存在的5□-UTR元件及其混合物，特别是选自α珠蛋白、β珠蛋白、α(1)胶原蛋白及其混合物。
[0315] 8.根据实施方案1至7中任一项使用的IFN-αmRNA，其中在所述IFN-αmRNA中，[0316] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基胞苷残基取代，和/或
[0317] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氨基-2-脱氧胞苷残基取代，和/或
[0318] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-氟-2-脱氧胞苷残基取代，和/或
[0319] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代胞苷残基取代，和/或
[0320] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-碘代胞苷残基取代，和/或
[0321] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被假尿苷残基取代，和/或
[0322] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被1-甲基假尿苷残基取代，和/或
[0323] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代尿苷残基取代，和/或
[0324] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基尿苷残基取代，和/或
[0325] -全部腺苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被N6-甲基腺苷残基取代。
[0326] 9.根据实施方案1至8中任一项使用的IFN-αmRNA，其中在IFN-αmRNA中，[0327] -全部胞苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被5-甲基胞苷残基取代，和/或
[0328] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被假尿苷残基取代，和/或
[0329] -全部尿苷残基的至少5％、优选至少10％、优选至少30％、特别是至少50％被2-硫代尿苷残基取代。
[0330] 10.根据实施方案1至9中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有至少49.5％、优选至少49.6％、更优选50％、甚至更优选至少55％、特别是至少60％的GC与AU比。
[0331] 11.根据实施方案1-10中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有至少0.8、优选至少0.9的密码子适应指数(CAI)。
[0332] 12.根据实施方案1至11中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA的编码区编码人IFNa2a，并且优选为SEQ ID NO：12，特别是SEQ ID NO：2、3、5、6、7、8、9、10或11。
[0333] 13.根据实施方案1-10中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA的编码区编码人IFNa2b，并且优选为SEQ ID NO：26，特别是SEQ ID NO：19、20、22或25。
[0334] 14.根据实施方案1-10中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA的编码区编码人IFNa1，并且优选为SEQ ID NO：36，特别是SEQ ID NO：29、30、31、32、34或35。
[0335] 15.根据实施方案1至11中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA皮下、皮内、透皮、表皮或局部施用，特别是表皮施用。
[0336] 16.根据实施方案1至15中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA在一个月内施用两次，优选每周一次。
[0337] 17.根据实施方案1至16中任一项使用的IFN-αmRNA，其中以每剂量0.001μg至100mg，优选每剂量0.01μg至100mg，更优选每剂量0.1μg至10mg，特别是每剂量1μg至1mg的量施用IFN-αmRNA。
[0338] 18.根据实施方案1至17中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有0.8或更高的CAI和48.7％或更高的GC含量。
[0339] 19.根据实施方案1至18中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有0.8至0.99，优选0.81至0.97，特别是0.83至0.85的CAI。
[0340] 20.根据实施方案1至19中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有48.7％至63.7％，优选48.7％至60％，特别是48.7％至58.0％的GC含量。
[0341] 21.根据实施方案1至20中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有0.80至0.97的CAI和48.7％至63.7％的GC含量。
[0342] 22.根据实施方案1至9和12至17中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有0.6至0.8的CAI和48.7％至65.0％的AU含量。
[0343] 22.根据实施方案1至10和12至17中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有0.6至0.8，优选0.6至0.7，特别是0.65至0.75的CAI。
[0344] 23.根据实施方案1至9和11至17中任一项使用的IFN-αmRNA，其中所述IFN-αmRNA具有48.7％至65.0％，优选51.3至60.0％的AU含量。
[0345] 24.用于预防和治疗NMSC，优选AK、BCC和SCC，特别是AK的药物制剂，其包含实施方案1至23中任一项所定义的IFN-αmRNA。
[0346] 25.根据实施方案24使用的药物制剂，其包含药学上可接受的载体，优选基于聚合物的载体，特别是阳离子聚合物，包括直链和支链PEI和viromer；脂质纳米颗粒和脂质体，纳米脂质体，含神经酰胺的纳米脂质体，蛋白脂质体，阳离子两亲脂质，例如：SAINT-脂质，天然和合成来源的外来体，天然、合成和半合成的板层小体，纳米颗粒，磷硅酸钙纳米颗粒，磷酸钙纳米颗粒，二氧化硅纳米颗粒，纳米晶体颗粒，半导体纳米颗粒，干粉，聚(D-精氨酸)，纳米树枝状聚合物，基于淀粉的递送系统，胶束，乳液，溶胶-凝胶，非离子表面活性剂囊泡，质粒，病毒，磷酸钙核苷酸，适配体，肽，肽缀合物，载体标签，优选小分子靶向缀合物，或病毒衣壳蛋白，优选生物纳米囊。
[0347] 26.根据实施方案24或25使用的药物制剂，其包含阳离子聚合物，包括直链和支链PEI和viromer，脂质纳米颗粒和脂质体，传递体和纳米颗粒，优选磷酸钙纳米颗粒。
[0348] 27.根据实施方案24使用的药物制剂，其中所述mRNA是非复合的mRNA，并且其中优选地，所述非复合的mRNA包含在合适的水性缓冲溶液中，特别是生理性葡萄糖缓冲的水溶液中。
[0349] 28.根据实施方案24至27中任一项使用的药物制剂，其中所述制剂包含1xHEPES缓冲溶液；1x磷酸盐缓冲溶液，柠檬酸钠缓冲溶液；醋酸钠缓冲溶液；优选另外包含葡萄糖，特别是5％葡萄糖。
[0350] 29.用于向患者施用根据实施方案1至23中任一项使用的IFN-αmRNA的试剂盒，其包含
[0351] -如实施方案1至23中任一项所定义的IFN-αmRNA，和
[0352] -皮肤递送装置。
[0353] 30.根据实施方案29所述的试剂盒，其中所述皮肤递送装置是皮内递送装置，优选选自基于针的注射系统和无针注射系统。
[0354] 31.根据实施方案29所述的试剂盒，其中所述皮肤递送装置是透皮递送装置，优选选自透皮贴剂、中空和实心微针系统、微结构透皮系统、电泳系统和离子电渗疗法系统。
[0355] 32.根据实施方案29所述的试剂盒，其中所述皮肤递送装置是表皮递送装置，优选选自无针注射系统、基于激光的系统、特别是铒YAG激光系统和基因枪系统。
[0356] 33.用于治疗和预防NMSC，优选AK、BCC和SCC的方法，其中将有效量的实施方案1至23中任一项所定义的IFN-αmRNA施用至需要其的患者。
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