首页 / 专利库 / 诊断设备和程序 / 血细胞计数 / 白细胞计数 / 颗粒分选的系统、设备和方法

颗粒分选的系统、设备和方法

阅读:494发布:2020-12-30

专利汇可以提供颗粒分选的系统、设备和方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供的是与 流体 中的颗粒和细胞分选以及检测有关的细胞检测系统、流体装置、结构以及技术,例如分选特定亚群的细胞类型。用于验证颗粒分选的方法包括:接收与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联的第一检测 信号 。基于第一检测信号来确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的光学特性确定将颗粒分选进入分选通道。传输用于将颗粒从第一通道分选进入分选通道中的分选信号。第二检测信号被接收,其与在分选通道中颗粒的存在相关联。基于第二检测信号,验证颗粒从第一通道中分选进入分选通道中。,下面是颗粒分选的系统、设备和方法专利的具体信息内容。

1.一种方法,用于检测在包括多种类型的细胞的组合物中细胞类型的存在与否或数量,该方法包括:
(a)用与第二细胞类型相关联的检测剂接触包括多种细胞类型的组合物,所述多种细胞类型包括第一细胞类型和第二细胞类型;
(b)使检测剂发射光,该光从检测剂被传输到检测系统中的颜色滤波器,其中颜色滤波器包括多个分区,所述多个分区包括:(i)多个颜色分区,每个颜色分区传输被传输到颜色滤波器的光的一部分,其中,第一颜色分区传输与由第二颜色分区传输的光的部分不同的光的一部分,以及(ii)传输由两个或两个以上的颜色分区传输的光的分区,其中在检测系统中的不同位置处由检测剂发射的光,通过颜色滤波器的多个分区中的不同分区传输;和(c)检测来自检测剂的由颜色滤波器中的多个分区传输的光,由此检测到在组合物中第二细胞类型的存在与否或数量。
2.如权利要求1的方法,所述方法包括对(c)中检测到的光进行处理,其中所述处理检测在组合物中第二细胞类型存在与否或数量。
3.如权利要求1或2的方法,所述检测系统包括流体装置,并且所述方法包括使第二细胞类型流动通过流体装置的检测通道,其中在检测通道的不同位置处,通过检测剂发射的光被颜色滤波器中的不同分区有效地传输。
4.如权利要求1-3中任何一项的方法,所述方法包括确定流过检测通道的第二细胞类型的速度。
5.如权利要求3或4的方法,所述方法包括基于检测剂的特性和速度通过通道分支引导第二细胞类型。
6.如权利要求1-5中任一项的方法,其中,由检测剂发射的光的颜色被用于检测在组合物中第二细胞类型存在与否或数量。
7.如权利要求1-6中任何一项的方法,其中,多个检测剂处于组合物中,并流动通过检测通道。
8.如权利要求2-7中的任一项的方法,其中,颜色分区在颜色滤波器中被连续地分级,其中,检测包括检测通过颜色滤波器传输的光的连续波形,并且其中处理包括将检测到的波形数字解析成多个波谱。
9.如权利要求8的方法,其中,根据波谱的数目设定流动通过通道的细胞的速度。
10.如权利要求9的方法,其中,速度和波谱数目中的至少一个由用户限定。
11.如权利要求9的方法,其中,速度是根据编程到检测系统中的指令设定的。
12.如权利要求1-7中的任一项的方法,其中,颜色滤波器中的每一个颜色分区被构造成作为颜色滤波器中的与颜色滤波器中的其它区段分开的区段。
13.如权利要求12的方法,其中,由第一颜色分区传输的光的部分的波长子范围与由第二颜色分区传输的光的部分的波长子范围重叠。
14.如权利要求12的方法,其中,由第一颜色分区传输的光的部分的波长子范围不与由第二颜色分区传输的光的部分的波长子范围重叠。
15.如权利要求3-14中任一项的方法,其中,来自检测剂的光从检测通道传输到透镜,所述透镜将来自检测通道的光聚焦到颜色滤波器的焦平面上。
16.如权利要求5-15中的任一项的方法,其中,引导第二细胞类型通过通道分支,从第一细胞类型的细胞分离出第二细胞类型。
17.如权利要求5-16中的任一项的方法,其中,引导第二细胞类型通过通道分支,分离第二细胞类型。
18.如权利要求16-17的方法,其中,通道分支处于检测通道的下游。
19.如权利要求5-18中的任一项的方法,其中,通过致动与通道分支流体连通的压电膜,第二细胞类型被引导通过通道分支。
20.如权利要求1-19中的任一项的方法,所述方法包括在混合结构中,将与第二细胞类型相关联的检测剂与第二细胞类型混合。
21.如权利要求20的方法,其中,混合结构包括被构造成呈弯转蛇形取向的流体通道。
22.如权利要求20或21的方法,其中,混合结构被构造成在约2分钟内,将约99%的稀有细胞类型与检测剂关联。
23.如权利要求22的方法,其中,混合结构被构造成在约1分钟内,将约99%的稀有细胞类型与检测剂关联。
24.如权利要求20-23中的任一项的方法,其中,检测系统包括所述混合结构。
25.如权利要求l-24中的任一项的方法,所述方法包括通过使第二细胞类型和第一细胞类型与富集结构接触,相对于第一细胞类型,富集第二细胞类型。
26.如权利要求23的方法,其中,富集结构包括被构造成螺旋取向的流体通道。
27.如权利要求25或26的方法,其中,富集结构被构造成相对于第一细胞类型,约100倍或更多地富集第二细胞类型。
28.如权利要求27的方法,其中,富集结构被构造成相对于第一细胞类型,约400倍或更多地富集第二细胞类型。
29.如权利要求25-28中的任一项的方法,其中,检测系统包括所述富集结构。
30.如权利要求20-29中的任一项的方法,其中,退出富集结构的细胞被引入到混合结构中。
31.如权利要求20-30中的任一项的方法,其中,退出混合结构的细胞被引入到检测通道中。
32.如权利要求1-31中的任一项的方法,其中,检测系统包括:(ⅰ)流体装置,所述流体装置包括检测通道、检测通道下游的通道分支和与分支流体连通的压电膜;(ii)透镜,其被构造成将由在检测通道中的检测剂发射的光传输到颜色滤波器上的焦平面;(ⅲ)检测仪,其被构造成检测由颜色滤波器发射的光并产生与检测到的光相关联的信号;和(iv)控制器,其被构造成处理由检测仪产生的信号并且控制压电膜的致动。
33.如权利要求32的方法,其中,流体装置实施在可移除的芯片上。
34.如权利要求32或33的方法,其中,流体装置包括混合结构。
35.如权利要求32-34中的任一项的方法,其中,流体装置包括富集结构。
36.如权利要求l-35中的任一项的方法,其中,第二细胞类型是相对稀有的细胞类型,第一细胞类型是相对丰富的细胞类型,并且其中,第二细胞类型包括癌细胞。
37.如权利要求36的方法,其中,癌细胞是循环肿瘤细胞。
38.如权利要求37的方法,其中,循环肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
39.如权利要求38的方法,其中,乳房癌细胞是MCF-7细胞。
40.如权利要求1-39中的任一项的方法,其中,组合物源自于血液,并且包括血细胞。
41.如权利要求40的方法,其中,第一细胞类型包括白细胞。
42.如权利要求1-35中的任一项的方法,其中,第二细胞类型包括胎儿细胞,而第一细胞类型包括母体细胞
43.如权利要求42的方法,其中,组合物源自于带有胎儿的怀孕女性的血液。
44.如权利要求43的方法,其中,组合物源自于血沉棕黄层级分。
45.如权利要求1-44中的任一项的方法,其中,检测剂是连接至抗体荧光分子,所述抗体特定地结合到稀有的细胞类型。
46.如权利要求45的方法,其中,所述抗体是抗-EpCAM抗体。
47.如权利要求45或46的方法,其中,荧光分子是藻红蛋白分子。
48.如权利要求17-48中任何一项的方法,其中,大于约71%的第二细胞类型在分离后可存活。
49.如权利要求48的方法,其中,约98%或者更多的第二细胞类型在分离后可存活。
50.如权利要求17到49中任何一项的方法,其中,约28%或者更多的第二细胞类型被分离。
51.如权利要求1-50中任一项的方法,其中,检测剂包括荧光团,其中,通过荧光团与包含激励波长的光接触,荧光团被促使发射光。
52.如权利要求51的方法,其中,包括激励波长的光由光源发射。
53.如权利要求或52的方法,其中,所述光源是激光器
54.如权利要求l-52中的任一项的方法,其中,检测剂特定地与稀有细胞类型相互作用。
55.一种流式细胞术系统,包括:
(i)流体装置,所述流体装置包括检测通道、检测通道下游的通道分支和与分支流体连通的压电膜,
其中,所述压电膜被构造成引导流动通过分支的细胞进入分支下游的多个分选通道之一;
(ii)透镜,其被构造成将来自检测通道的光传输到颜色滤波器上的焦平面,所述光在细胞流动通过检测通道时由与细胞关联的检测剂发射;
(iii)检测仪,其被构造成检测由颜色滤波器发射的光并产生与检测到的光相关联的信号;和
(iv)控制器,其被构造成处理由检测仪产生的信号并且控制压电膜的致动;
其中,所述系统能够在包含相对稀有的细胞类型和相对丰富的细胞类型的组合物中,分离约28%或者更多的相对稀有的细胞类型。
56.如权利要求55的流式细胞术系统,其中,所述系统能够分离约28%到约60%的相对稀有的细胞类型。
57.如权利要求55的流式细胞术系统,其中,所述系统能够分离约28%到约70%的相对稀有的细胞类型。
58.如权利要求55的流式细胞术系统,其中,所述系统能够分离约28%到约90%的相对稀有的细胞类型。
59.如权利要求55的流式细胞术系统,其包括光源。
60.如权利要求59的流式细胞术系统,其包括反射镜、透镜、滤波器或它们的组合,其被构造成将光从光源引导到检测通道,用于激励与流动通过检测通道的细胞相关联的检测剂。
61.如权利要求55-60中的任一项的流式细胞术系统,其中,颜色滤波器包括多个分区,所述多个分区包括:(i)多个颜色分区,每个颜色分区传输被传输到颜色滤波器的光的一部分,其中,第一颜色分区传输与由第二颜色分区传输的部分不同的部分,以及(ii)传输由两个或两个以上的颜色分区传输的光的分区,而且其中,在检测系统的不同位置处,由检测剂发射的光,通过颜色滤波器中的不同分区有效地传输。
62.如权利要求61的流式细胞术系统,其中,颜色分区在颜色滤波器中被连续地分级,检测包括检测通过颜色滤波器传输的光的连续波形,并且处理包括将检测到的波形数字解析成多个波谱。
63.如权利要求62的流式细胞术系统,其中,根据波谱的数目设定流动通过通道的颗粒的速度。
64.如权利要求63的流式细胞术系统,其中,速度或波谱的数目,或者速度和波谱的数目,由用户限定。
65.如权利要求63的流式细胞术系统,其中,速度是根据编程到控制器中的指令设定的。
66.如权利要求61的流式细胞术系统,其中,颜色滤波器中的每一个颜色分区被构造成作为颜色滤波器中的与颜色滤波器中的其它区段分开的区段。
67.如权利要求61的流式细胞术系统,其中,由第一颜色分区传输的光的部分的波长子范围与由第二颜色分区传输的光的部分的波长子范围重叠。
68.如权利要求67的流式细胞术系统,其中,由第一颜色分区传输的光的部分的波长子范围不与由第二颜色分区传输的光的部分的波长子范围重叠。
69.如权利要求55-68中的任一项的流式细胞术系统,其中,引导细胞进入多个分选通道之一而将细胞分离。
70.如权利要求55-69中的任一项的流式细胞术系统,包括被构造成将细胞与检测剂混合、用于使检测剂与细胞相关联的混合结构。
71.如权利要求70的流式细胞术系统,其中,混合结构包括被构造成呈弯转蛇形取向的流体通道。
72.如权利要求69或70的流式细胞术系统,其中,混合结构被构造成在约2分钟内,将约99%的稀有细胞类型与检测剂关联。
73.如权利要求或72的流式细胞术系统,其中,混合结构被构造成在约1分钟内,将约
99%的稀有细胞类型与检测剂关联。
74.如权利要求70-73中的任一项的流式细胞术系统,其中,流体装置包括混合结构。
75.如权利要求55-74中的任一项的流式细胞术系统,其中,细胞是在包括相对稀有的细胞类型和相对丰富的细胞类型的组合物中的相对稀有的细胞类型,并且其中所述系统包括被构造成相对于丰富的细胞类型富集稀有的细胞类型的富集结构。
76.如权利要求75的流式细胞术系统,其中,相对稀有的细胞类型选自下组:细菌、酵母、癌细胞、携带病毒的细胞、干细胞、祖干细胞、错位的细胞类型、源自于胎儿的细胞类型、源自于胎盘的细胞类型、患病细胞类型、以及不常见的细胞类型。
77.如权利要求76的流式细胞术系统,其中,患病细胞类型选自由恶性细胞、转移细胞、以及循环肿瘤细胞(CTCs)组成的组。
78.如权利要求76的流式细胞术系统,其中,不常见的细胞类型包括癌前期循环细胞。
79.如权利要求75的流式细胞术系统,其中,富集结构包括被构造成呈螺旋形取向的流体通道。
80.如权利要求75-78中的任一项的流式细胞术系统,其中,富集结构被构造成相对于丰富的细胞类型,以约100倍或更大的倍数富集稀有的细胞类型。
81.如权利要求80的流式细胞术系统,其中,富集结构被构造成相对于丰富的细胞类型,以约400倍或更大的倍数富集稀有的细胞类型。
82.如权利要求72-81中的任一项的流式细胞术系统,其中,流体装置包括富集结构。
83.如权利要求67-82中的任一项的流式细胞术系统,其中,由富集结构发射的细胞被引入到混合结构中。
84.如权利要求67-83中的任一项的流式细胞术系统,其中,由混合结构发射的细胞被引入到检测通道中。
85.如权利要求55-84中的任一项的流式细胞术系统,其中,流体装置实施在可移除的芯片上。
86.如权利要求56-85中的任一项的流式细胞术系统,其中,光源包括激光器。
87.如权利要求56-86中的任一项的流式细胞术系统,包括位于检测通道和颜色滤波器之间的光路径中的滤波器。
88.如权利要求58-87中的任一项的流式细胞术系统,其中,在检测通道的不同位置处,通过检测剂发射的光被颜色滤波器中的不同分区有效地传输。
89.一种微流体系统,包括:
螺旋富集结构,所述螺旋富集结构包括呈螺旋状多圈布置的流体通道、靠近螺旋的中心点的起点、被构造成接收包括细胞的混合群体的溶液的入口、以及一个或多个出口,所述富集结构的入口定位于流体通道的中心点附近,
蛇形混合结构,所述蛇形混合结构包括入口和出口,其中混合结构的入口与富集结构的一个或多个出口中的一个或多个流体连通;和
微流体细胞分选结构,所述微流体细胞分选结构包括检测通道、检测通道下游的分支和分支下游的一个或多个分选通道,混合结构的该出口与检测通道流体连通。
90.一种分选颗粒的验证方法,包括:
接收第一检测信号,第一检测信号与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联;
基于第一检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的光学特性确定将颗粒分选到分选通道;
传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分选通道中;
接收第二检测信号,第二检测信号与在分选通道中的检测到的颗粒的存在相关联;和基于第二检测信号,验证将颗粒从第一通道分选到分选通道中。
91.如权利要求90的方法,其中,第一检测信号与多个光信号相关联。
92.如权利要求91的方法,其中,多个光信号包括一个或多个参考信号以及一个或多个荧光信号。
93.如权利要求90的方法,其中,光学特性包括颗粒的一种或多种荧光性质。
94.如权利要求93的方法,其中,基于颗粒的一个或多个荧光性质,确定分选通道。
95.如权利要求90的方法,传输分选信号包括将分选信号传输到分选元件。
96.如权利要求95的方法,其中,分选元件包括压电致动器,还包括基于压电致动器所需的变形产生分选信号,以将颗粒分选到分选通道中。
97.如权利要求90的方法,其中,第二检测信号与阻抗检测相关联,其中,分选通道中的颗粒的存在改变了在第二检测通道中检测到的阻抗。
98.如权利要求90的方法,还包括:
接收另外的第一检测信号,另外的第一检测信号与在第一通道中的第二颗粒的光学特性相关联,其中,第二颗粒的光学特性不同于第一颗粒的光学特性;
基于另外的第一检测信号,确定多个第二通道的第二分选通道,其中第二分选通道不同于分选通道,由此基于第二颗粒的光学特性,确定将第二颗粒分选到第二分选通道中;
传输第二分选信号,用于将第二颗粒从第一通道分选到分选通道中;
接收另外的第二检测信号,所述另外的第二检测信号与在第二分选通道中的第二检测颗粒的存在相关联;
基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证将颗粒从第一通道分选到分选通道中;和
基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证将第二颗粒从第一通道分选到第二分选通道中。
99.如权利要求90的方法,其中,颗粒选自无机粒子、有机粒子、以及细胞。
100.一种计算机可执行存储介质,包括用于执行如权利要求90的方法的指令。
101.一种基于反馈的颗粒计数方法,包括:
接收多个第一检测信号,每一个第一检测信号与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联;
基于多个第一检测信号,确定第一通道中的第一数目的颗粒,第一数目的颗粒具有类似的光学特性;
基于第一检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于第一数目的颗粒的类似的光学特性,确定将所有第一数目的颗粒分选到分选通道;
传输分选信号,用于将第一数目的颗粒的每个颗粒从第一通道分选到分选通道中;
接收多个第二检测信号,每一个第二检测信号与在分选通道中的颗粒的存在相关联;
基于多个第二检测信号,确定分选通道中的第二数目的颗粒;
接收多个第三检测信号,每一个第三检测信号与在第一通道中的另外的颗粒的光学特性相关联;和
基于多个第三检测信号、基于所确定的第一数目的颗粒以及基于所确定的第二数目的颗粒,确定第一通道中的第三数目的颗粒。
102.如权利要求101的方法,其中,每一个第一检测信号与多个光信号相关联。
103.如权利要求102的方法,其中,多个光信号包括一个或多个参考信号以及一个或多个荧光信号。
104.如权利要求103的方法,其中,多个第一检测信号包括至少一对重叠的第一检测信号。
105.如权利要求104的方法,其中,所确定第一数目的颗粒与所确定的第二数目的颗粒相同。
106.如权利要求105的方法,还包括:确定一个或多个第三检测信号与所确定的第三数目的颗粒相关联。
107.如权利要求104的方法,其中,所确定的第一数目的颗粒少于所确定的第二数目的颗粒。
108.如权利要求107的方法,还包括:确定一个或多个第三检测信号与第四数目的颗粒相关联,所述第四数目的颗粒多于所确定的第三数目的颗粒。
109.如权利要求101的方法,其中,多个第一检测信号包括至少一对重叠的第一检测信号。
110.如权利要求109的方法,其中,所确定第一数目的颗粒与所确定的第二数目的颗粒相同。
111.如权利要求110的方法,还包括:确定一个或多个第三检测信号与所确定的第三数目的颗粒相关联。
112.如权利要求109的方法,其中,所确定的第一数目的颗粒少于所确定的第二数目的颗粒。
113.如权利要求112的方法,还包括:确定一个或多个第三检测信号与第四数目的颗粒相关联,所述第四数目的颗粒多于所确定的第三数目的颗粒。
114.如权利要求101的方法,其中,光学特性包括颗粒的一种或多种荧光性质。
115.如权利要求114的方法,其中,基于颗粒的一种或多种荧光性质,确定分选通道。
116.如权利要求101的方法,其中,每个颗粒独立地选自无机粒子、有机粒子、以及细胞。
117.一种计算机可执行存储介质,包括用于执行如权利要求101的方法的指令。
118.一种分选颗粒的方法,包括:
接收第一检测信号,所述第一检测信号与在第一通道的第一容积中的颗粒的第一光学特性相关联;
接收第二检测信号,所述第二检测信号与在第一通道的第二容积中的颗粒的第二光学特性相关联;
基于一个或者多个第一检测信号和第二检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的一个或者多个第一光学特性和第二光学特性确定颗粒的分选;和传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分选通道中。
119.如权利要求118的方法,其中,第一检测信号与多个光信号相关联。
120.如权利要求119的方法,其中,多个光信号包括一个或多个参考信号以及一个或多个荧光信号。
121.如权利要求118的方法,其中,光学特性包括颗粒的一种或多种荧光性质。
122.如权利要求121的方法,其中,基于颗粒的一种或多种荧光性质,确定分选通道。
123.如权利要求118的方法,其中,第二检测信号与阻抗检测相关联,其中,阻抗检测以第二容积中的颗粒的存在为基础
124.如权利要求123的方法,其中,阻抗检测进一步以颗粒的大小为基础。
125.如权利要求118的方法,其中,第一容积与第二容积重叠。
126.如权利要求118的方法,其中,确定分选包括:
基于一个或多个第一检测信号并且基于第二检测信号,确定颗粒的一个或多个性质;

基于所述一个或多个性质,确定分选通道。
127.如权利要求126的方法,每个性质独立地选自如下的一个或多个:颗粒的大小、颗粒的荧光性、化学活性、以及生物活性。
128.如权利要求118的方法,其中,所述颗粒选自无机粒子、有机粒子、以及细胞。
129.一种计算机可执行存储介质,包括用于执行如权利要求118的方法的指令。
130.一种用于分选颗粒的设备,包括:
第一检测模,其被构造成接收第一检测信号,所述第一检测信号与在第一通道中的颗粒的一个或者多个光学特性相关联;
分选模块,其被构造成:
基于第一检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的一个或者多个光学特性,确定颗粒的分选;和
传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分选通道中;
第二检测模块,其被构造成接收第二检测信号,所述第二检测信号与在分选通道中的颗粒的存在相关联;
验证模块,其被构造成基于第二检测信号,验证将颗粒从第一通道分选到分选通道中;

反馈模块,其被构造成基于第二检测信号,训练分选模块,用于分选在第一通道中的另外的颗粒;
其中,第一检测模块、分选模块、第二检测模块、验证模块和反馈模块中的至少一个在一个或多个存储器和处理装置中实现。
131.如权利要求130的设备,其中,第一检测信号与多个光信号相关联。
132.如权利要求131的设备,其中,多个光信号包括一个或多个强度参考信号以及一个或多个颜色编码信号
133.如权利要求130的设备,其中,光学特性包括颗粒的一种或多种荧光性质。
134.如权利要求133的设备,其中,分选模块进一步被构造成基于颗粒的一种或多种荧光性质,确定分选通道。
135.如权利要求130的设备,其中,分选模块进一步被构造成将分选信号传输到分选元件。
136.如权利要求135的设备,其中,分选元件包括压电致动器,其中,所述分选模块进一步被构造成基于压电致动器所需的变形产生分选信号,以将颗粒分选到分选通道中。
137.如权利要求130的设备,其中,第二检测信号与阻抗检测相关联,其中,在分选通道中的颗粒的存在和颗粒的容积中的一者或者多者改变了在第二检测通道中检测到的阻抗。
138.如权利要求130的设备,其中:
第一检测模块进一步被构造成接收另外的第一检测信号,所述另外的第一检测信号与在所述第一通道中的第二颗粒的光学特性相关联,其中,第二颗粒的光学特性不同于第一颗粒的光学特性;
分选模块进一步被构造成:
基于另外的第一检测信号,确定多个第二通道的第二分选通道,其中第二分选通道不同于分选通道,由此基于第二颗粒的光学特性,确定将第二颗粒分选到第二分选通道中;
传输第二分选信号,用于将第二颗粒从第一通道分选到分选通道中;
第二检测模块进一步被构造成接收另外的第二检测信号,所述另外的第二检测信号与在第二分选通道中的第二颗粒的存在相关联;和
验证模块进一步被构造成:
基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证将颗粒从第一通道分选到分选通道中;和
基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证将第二颗粒从第一通道分选到第二分选通道中。
139.如权利要求130的设备,其中,所述颗粒选自无机粒子、有机粒子、以及细胞。
140.如权利要求130的设备,还包括获取模块,获取模块被构造成获取与第一检测信号相关联的多个光学信号,获取模块进一步被构造成获取与第二检测信号相关联的电信号
141.一种用于检测颗粒的存在的方法,所述颗粒具有与其相关联的多个荧光团,所述多个荧光团包括第一荧光团和第二荧光团,该方法包括:
(a)激励多个荧光团,其中,来自第一荧光团和来自第二荧光团的荧光被传输到检测系统中的颜色滤波器,所述颜色滤波器包括多个分区,所述多个分区包括:(i)多个颜色分区,基本上传输来自第一荧光团的荧光的第一颜色分区,基本上传输来自第二荧光团的荧光的第二颜色分区,以及(ii)传输来自第一荧光团和第二荧光团的荧光的分区,其中与来自第二荧光团的荧光被第二颜色分区传输相比,来自第一荧光团的荧光是由第一颜色分区在检测系统的不同位置传输的;和
(b)检测来自检测剂的由颜色滤波器中的多个分区传输的光;
(c)基于步骤(b)的检测,确定颗粒的存在。
142.如权利要求141的方法,步骤(c)的确定还包括:基于从第一颜色分区传输的荧光确定第一荧光团的标准化荧光强度,并且基于从第二颜色分区传输的荧光确定第二荧光团的标准化荧光强度。
143.如权利要求142的方法,步骤(c)的确定还包括:
基于第一荧光团的标准化荧光强度,基于来自由多个分区的分区传输的第一荧光团和第二荧光团的荧光,并且基于颗粒的速度,确定第一荧光团的真实荧光强度;和基于第二荧光团的标准化荧光强度,基于来自由多个分区的分区传输的第一荧光团和第二荧光团的荧光,并且基于颗粒的速度,确定第二荧光团的真实荧光强度。
144.如权利要求143的方法,步骤(c)的确定还包括:基于所确定的第一荧光团的真实荧光强度和所确定的第二荧光团的真实荧光强度,确定颗粒的存在。
145.一种用于检测颗粒的存在的方法,所述颗粒具有与其相关联的荧光性,该方法包括:
(a)光学激励所述颗粒,其中来自颗粒的荧光被传输到检测系统中的颜色滤波器,所述颜色滤波器包括:第一多个分区和第二多个分区,其中,第一多个分区具有不同于第二多个分区的传输系数,其中,由在检测系统的不同位置的颗粒发出的荧光,经由颜色滤波器中的第一多个分区以及第二多个分区传输;
(b)在单个检测仪处,检测来自颗粒的经由颜色滤波器中的第一多个分区和第二多个分区传输的光;
(c)基于步骤(b)的检测,确定颗粒的存在。
146.如权利要求145的方法,其中,第一多个分区的传输系数与第二多个分区相差至少约两倍。
147.如权利要求145的方法,其中,第一多个分区的传输系数与第二多个分区相差至少约十倍。
148.如权利要求145的方法,其中,第一多个分区的传输系数与第二多个分区相差至少约三十倍。
149.如权利要求145的方法,其中每一个多个分区包括:(i)多个颜色分区,每个颜色分区传输被传输到颜色滤波器的光的部分,其中,第一颜色分区传输与由每隔一个颜色分区传输的光的部分不同的光的一部分,及(ii)传输由每个多个分区的两个或两个以上的颜色分区传输的光的分区。

说明书全文

颗粒分选的系统、设备和方法

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的题为“颗粒分选的系统、设备和方法”的美国临时申请号61/794015和2012年10月15日提交的题为“细胞检测的系统和方法”的美国
临时申请号61/714091的优先权,其公开内容通过提述以其整体并入本文。
[0003] 政府支持的声明
[0004] 在此公开的一个或更多的发明在由以下机构授予的美国政府支持下做出:美 国国 立 卫 生 研究 院 (NIH)的 许可 No.HHSN2612011 00096C、9R44GM103677-02、
HHSN261201200072C、8R43GM103470-2。美国政府具有所述一个或多个发明中的某些权利。

背景技术

[0005] 基于流体中的颗粒以连续的(serial)方式被外部光源所询问(interrogate)时的光学反应,流式细胞仪(FC)的装置和系统可被用于表征和分析流体中的颗粒,例如细胞
和生化分子或分子团簇的物理和生化特性。来自这些颗粒的光学信号可通过光电检测仪
(如光电倍增管(PMT))收集,并可被分析或处理以提取由颗粒的光学特性携带的信息。来
自颗粒的光信号可通过输入光和颗粒之间的一种或多种相互作用,如前向散射(FSC)、侧散射(SSC)和荧光引起。
[0006] 细胞分选可通过多种技术来实现。一个例子是对来自喷嘴的喷射流施加振动以促使喷射流断开成为液滴,随后使用带电板将包含细胞的液滴偏转到收集管内(不感兴趣的
液滴直接向下流到废液管而不偏转)。
[0007] 可根据微流体技术实施FC装置和系统,用于研究试验和诊断以及用于临床应用。微流体技术的范围从简单的微流体通道到复杂的微流体装置,复杂的微流体装置可例如混
合流体、送流体、执行数字逻辑、单独培养细胞、以及确定最佳反应条件。小型流体装置具有低雷诺数,可用于实现受控制的层流系统。微流体进一步提供了小尺寸的优点,用于装置的小型化和并行化。此外,用于微流体装置的多种制造工艺适于大量生产,可降低这种装置的成本。微流体装置的进步可产生低成本的芯片上实验室(lab-on-a-chip)装置,对研究
人员、临床实验室以及处于偏远和/或资源贫乏环境的医疗点医生而言是有用的工具。
[0008] 颗粒分选领域,特别是细胞分选,在过去三十年一直稳步增长。装置,如流式细胞仪、细胞分选仪,特别是基于荧光激活的细胞分选(FACS)的那些,已成为生物医学研究和应用的黄金标准和主。对于具有分选能力的流式细胞仪,尽管现有的系统试图实现低成
本操作和先进的细胞分析之间的平衡,但极少取得有前途的商业发展。因此,流式细胞仪,特别是具有分选能力的那些,仍然具有大的占用空间、昂贵、并且在技术上难以制造和操
作。
[0009] 换句话说,FACS系统自其开端以来没有根本上的改变,并且因此,就所有实际目的而言,对FACS的利用局限于资金充足的机构的共有核心设施。然而,分选是许多应用的重要需求,其可从FACS能力中获益,但需要以低成本、结构紧凑、易于操作的形式。正是针对这样的背景,开发出本公开的用于分选颗粒的系统、装置和方法。

发明内容

[0010] 在某些方面,提供用于检测在组合物中的细胞类型的存在与否或数量的方法。方法包括将包括细胞的组合物和与第二细胞类型相关联的检测剂接触,其中细胞包括第一细
胞类型和第二细胞类型。该方法还包括使检测剂发光,该光从检测剂传输到检测系统中的
颜色滤波器,其中颜色滤波器包括多个分区。多个分区包括颜色分区,每一个颜色分区传输传输到颜色滤波器的光的一部分,其中,第一颜色分区传输与由第二颜色分区传输的部分
不同的一部分。多个分区还包括传输由两个或两个以上的颜色分区传输的光的分区。在检
测系统的不同位置由检测剂发射的光通过颜色滤波器的不同分区有效传输。方法还包括检
测来自检测剂的由颜色滤波器中的分区传输的光,由此检测到在组合物中第二细胞类型的
存在与否或数量。
[0011] 在一个实施方案中,还提供了流式细胞术系统。在进一步的实施方案中,流式细胞术系统包括流体装置,流体装置包括检测通道、检测通道下游的通道分支和与分支流体连通的压电膜,其中压电膜被构造成引导可流动通过分支的细胞进入分支下游的多个分选通
道之一中。在进一步的实施方案中,系统还包括透镜,其被构造成将来自检测通道的光传
输到颜色滤波器上的焦平面,所述光在细胞流动通过检测通道时由与细胞关联的检测剂发
射。在进一步的实施方案中,系统还包括检测仪,其被构造成检测由颜色滤波器发射的光并产生与检测到的光相关联的信号。在更进一步的实施方案中,系统还包括控制器,其被构造成处理由检测仪产生的信号并且控制压电膜的致动。在一个实施方案中,系统能够在包含
相对稀有的细胞和相对丰富的细胞类型的组合物中分离约28%以上或约40%以上的相对
稀有的细胞。
[0012] 在一个实施方案中,本文提供和描述用于分选颗粒的系统、设备和方法。在一个方面,提供了一种用于验证分选颗粒的方法。在一个实施方案中,验证分选颗粒的方法包括:接收与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联的第一检测信号。在进一步的实施方案中,
方法包括:基于第一检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的光学特性确定将颗粒分选到分选通道。在进一步的实施方案中,方法包括:传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分选通道中。在更进一步的实施方案中,方法包括:接收与在分选通道中的颗粒的存在相关联的第二检测信号。在一个实施方案中,用于验证颗粒分选的方法还包
括基于第二检测信号,验证颗粒从第一通道到分选通道中的分选。在一个实施方案中,颗粒是微球/珠(bead)或者细胞。
[0013] 在本发明的另一个方面,提供了一种基于反馈进行颗粒计数的方法。在一些实施方案中,基于反馈进行颗粒计数的方法包括接收多个第一检测信号,每一个第一检测信号
与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联。在一个实施方案中,该方法还包括基于多个第
一检测信号,确定第一通道中的第一数目的颗粒。第一数目的颗粒具有相似的光学特性。在进一步的实施方案中,方法还包括:基于第一检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于第一数目的颗粒的类似的光学特性,确定将所有第一数目的颗粒分选到分选通道。
在一个实施方案中,该方法还包括:传输分选信号,用于将第一数目的颗粒的每个颗粒从第一通道分选到分选通道,并且接收多个第二检测信号。每一个第二检测信号与在分选通道
中的颗粒的存在相关联。在一个实施方案中,方法还包括基于多个第二检测信号,确定分选通道中的第二数目的颗粒。在一个实施方案中,方法还包括接收多个第三检测信号,每一个第三检测信号与在第一通道中的另外的颗粒的光学特性相关联。在一个实施方案中,方法
还包括:基于多个第三检测信号、基于所确定的第一数目的颗粒以及基于所确定的第三数
目的颗粒,确定第一通道中的第三数目的颗粒。
[0014] 在本发明的另一个方面,本发明提供了分选颗粒的方法。在一些实施方案中,分选颗粒的方法包括:接收与在第一通道的第一容积中的颗粒的第一光学特性相关联的第一检测信号。在一个实施方案中,该方法还包括:接收与在第一通道的第二容积中的颗粒的第二光学特性相关联的第二检测信号。在一个实施方案中,该方法还包括:基于一个或者多个第一检测信号和第二检测信号,确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的一个或者多
个第一光学特性和第二光学特性确定颗粒的分选。在一个实施方案中,该方法还包括:传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分选通道中。
[0015] 在又另一个方面,提供了一种用于颗粒分选的设备。在一个实施方案中,设备包括第一检测模,其被构造成接收第一检测信号,所述第一检测信号与在第一通道中的颗粒的一个或者多个光学特性相关联。在一个实施方案中,设备还包括分选模块,其被构造成基于第一检测信号确定多个第二通道的分选通道,由此基于颗粒的一个或者多个光学特性确
定颗粒的分选。分选模块进一步被构造成传输分选信号,用于将颗粒从第一通道分选到分
选通道中。在进一步的实施方案中,设备包括:第二检测模块,其构造成接收与在分选通道中的颗粒的存在相关联的第二检测信号。在进一步的实施方案中,设备包括验证模块,其被构造成基于第二检测信号,验证将颗粒从第一通道分选到分选通道中。在一个实施方案中,第一检测模块、分选模块、第二检测模块、验证模块中的至少一个在一个或多个存储器和处理装置中被执行。
附图说明
[0016] 图1是细胞分析仪和分选仪的说明性设计。
[0017] 图2A是根据一实施方案的螺旋富集结构的示意图。
[0018] 图2B是根据一实施方案,在开头(混合的样品)、中间区段、以及最后区段(分离的样品)中,图2A的螺旋富集结构的微流体通道的横截面图。
[0019] 图2C列出了根据一个实施方案的用于计算迪恩力的等式。
[0020] 图3A-3C示出根据一个实施方案的流体动力学微流体装置的设计和制造。图3A示出根据一个实施方案的流体动力学微流体装置的α螺旋结构的透明掩模。图3B示出了
根据一个实施方案的流体动力学微流体装置的β螺旋结构的透明掩模。图3C示出装有染
料以便使通道可视化的PDMS原型装置。
[0021] 图4A-4C示出了对装有三个不同大小的微珠(直径7.6微米、10.5微米、25微米)的流体动力学微流体装置的测试。图4A示出在400pl/min的流速下归一化的颗粒数和珠/
微升。图4B示出在1ml/min的流速下归一化颗粒数和珠/微升。图4C示出在1.5ml/min
的流速下归一化颗粒数和珠/微升。
[0022] 图5A示出了根据多个实施方案的具有不同的出口结构的富集结构的两个实施方案,装置1和装置2。
[0023] 图5B显示出富集结构的图像,其具有经过富集结构出口的25μm珠(左图面)、MCF-7细胞(中图面)、和白细胞(左图面)。
[0024] 图5C是使用掺有约950MCF-7细胞(n=6)的6毫升血液,对图22A的装置1和装置2的富集倍数的比较绘图。
[0025] 图6A-6D示出了通过螺旋富集结构保留循环肿瘤细胞(CTC)以及移除白细胞(WBC)。掺入~950MCF7细胞的19M白细胞,在运行通过螺旋富集结构之前和之后,被试验。
观察到WBC的稳固失去,和标记有EpCAM-PE抗体的MCF7细胞的保留(图6B、6D)。在运行
之后,21584个WBC残留(移除99.8%),而760个MCF7细胞残留(保留80%)。代表性实
验的直方图,n=6。
[0026] 图7A显示出根据一个实施方案,采用沿通道维度具有4个转的蛇形混合结构进行的流体动态模拟,并且还显示出浓度梯度(从“高C”到“低C”)。注入具有高浓度(“高C”)和低浓度(“低C”)的两种溶液。在蛇形结构内部,两种溶液被有效混合,并且在出口处,观察到具有“中”浓度的混合溶液,表明增加的混合。
[0027] 图7B示出根据一实施方案的具有20个转角的蛇形微流体混合结构。
[0028] 图7C显示出使用PDMS的图7B的蛇形微流体混合结构的制造原型。
[0029] 图8A显示出对约10,000个HeLa细胞的EpCAM标记的流式细胞术分析。
[0030] 图8B显示出对约10000个MCF-7细胞的EpCAM标记的流式细胞术分析。
[0031] 图8C、8D显示出对约10000个MCF-7GFP细胞的EpCAM标记的流式细胞术分析。图8C显示出未用抗EpCAM抗体处理的GFP阳性MCF7。图8C和8D中的细胞被设,以便当混
合后在GFP阳性和GFP/EpCAM阳性信号之间进行区分。
[0032] 图9A、9B示出由芯片上混合结构促进的抗体结合。图9A显示出以1:25加入到MCF-7(10,000/μl)的EpCAM-PE抗体,其中没有搅动或混合,并且在0、5、15和30分钟的计时点进行试验。图9B显示以1:25加入到MCF-7并且经过芯片上混合结构的EpCAM-PE抗
体。
[0033] 图10A-10C示出根据一实施方案的微流体检测仪的设计和制造。图10A示出根据一实施方案的微流体检测仪的设计。图10B显示出由PDMS制成的制造的微流体检测仪,并
且四分之一被放在旁边用于大小比较。图10C显示芯片盒,用于插入和快速更换新的芯片。
[0034] 图11示出根据一个实施方案的流体动态模拟。左侧图面显示出3D COMSOL模拟,显示鞘流流线(150微米宽)和样品流线(50微米宽)。样品流被横向和垂直居中。右侧图
面显示从侧面可视的样品流,其显示沿平和垂直聚焦的样品流。
[0035] 图12A、12B示出根据一个实施方案的α微流体检测仪的灵敏度和分选。在图12A中,使用具有20mW的输出功率的488nm的激光器和现成的光学器件(optics),实现了检测
GFP阳性MCF-7细胞(中图面)或标记有PE缀合的EpCAM抗体的细胞(右图面)的灵敏
度。图12B显示使用高速CMOS照相/摄像机(camera)和样品中的若丹明染料可视化的微
流体分选连结(junction)。由于压电致动器的表面弯曲向下(例如推压腔室内的流体),
若丹明流转向左通道,如以图面1开始到图面6连续示出的。
[0036] 图13A、13B显示经过螺旋富集结构(图30A)和微流体检测仪(图30B)之后的细胞的活力。图13A显示被泵送通过微流体螺旋富集结构(螺旋后)或保持在缓冲液中(对
照)之后的MCF7细胞的活力。然后,加入碘化丙锭,通过流式细胞术分析细胞的活力。图
13B显示使用商用的FACS或本文公开的微流体检测仪分选的大鼠心肌细胞的活力。然后,
将细胞用锥虫蓝染色,以测量细胞活力。
[0037] 图14示出根据一实施方案的微流体检测仪。
[0038] 图15示出根据一实施方案的微流体检测仪。
[0039] 图16A示出根据一实施方案的微流体检测仪。
[0040] 图16B示出根据一实施方案的微流体检测仪。
[0041] 图16C示出根据一实施方案,通过微流体检测仪进行的光信号处理
[0042] 图17是显示根据一实施方案的微流体检测仪的组件的示意图。
[0043] 图18是根据一实施方案的具有光滤波器波导和光学孔径的微流体检测仪的示意图。
[0044] 图19A是更详细地显示出图36中的微流体检测仪的组件的顶视图。
[0045] 图19B是更详细地以剖切方式显示出图38的微流体检测仪的若干部分的另外的视图,进一步包括三个插入图像部分。
[0046] 图20A是图19A的微流体检测仪的若干部分的另外的视图,进一步显示经过FAGS装置的微流体通道的细胞。图20B和20C是分别沿着图20A的线B-B和C-C线截取的图
15-17A的微流体检测仪的剖面图。
[0047] 图21A是根据一实施方案的微流体检测仪的空间-时间编码操作的示意图。
[0048] 图21B是图19A-20C的微流体检测仪的颜色-空间-时间(COST)编码操作的示意图。
[0049] 图22显示图21A的空间-时间编码操作的实例。
[0050] 图23示出了根据一实施方案的用于微流体检测仪的实时处理控制的示例性ASIC架构。
[0051] 图24示出根据一实施方案的示例性的可编程匹配滤波器
[0052] 图25A-25C显示根据一个实施方案的在确定细胞速度中经由不同信号频率的一组滤波器的信号处理。图25A示出具有不同速度的颗粒(例如具有荧光团或量子点的细胞)
如何产生在时间和频率域中不同的信号。图25B示出了滤波器组架构如何通过将它的信号
波形匹配到滤波器组中的不同的滤波器而可应用于估计每个单独的颗粒的速度。图25C示
出处理的实例。
[0053] 图26A和26B示出用于微流体检测仪的在流体通道中(图26A)的示例性信号编码结构(图26B)。
[0054] 图27示出基于可编程FIR滤波器组的示例性DSP处理块(block)。
[0055] 图28A-28C示出了根据一些实施方案的颗粒分选仪及其操作。图28A示出没有发生分选(无膜运动)的情形。图28B示出颗粒被分选到通道116C(向上弯曲)的情形。图
28C示出颗粒被分选到通道116A(向下弯曲)的情形。
[0056] 图29A-29C进一步示出了图14的颗粒分选仪的操作。图29A示出由于压电膜不动而直接从主/源通道向废物收集通道行进的颗粒。图29B示出当接收到分选触发信号而
向上偏转压电膜时,被分选到右边的分选通道的颗粒。图29C示出当接收到分选触发信号
而向下偏转压电膜时,被分选到左边分选通道的颗粒。
[0057] 图30示出根据一实施方案的图28A-28C的微流体检测仪的制造。
[0058] 图31A-31C显示在图14的微流体检测仪中的若丹明的偏转。
[0059] 图32A-32F显示珠的实验的(图52A、52C、52E)和模拟的(图52B、52D、52F)轨迹。
[0060] 图33示出在经受作为控制信号的正弦输入电压时,大肠杆菌(E.coli)细胞的偏转。
[0061] 图34示出根据一实施方案的具有闭环控制的微流体检测仪。
[0062] 图35示出根据一实施方案的用于图34的微流体检测仪的空间滤波器。
[0063] 图36是根据一实施方案的显示用于图34的闭环系统的控制电路的操作的框图
[0064] 图37A-37D示出用于特氟隆(Teflon)AF涂层的流体芯波导的示例性制造工艺,其降低PDMS和特氟隆AF之间的弹性不匹配。
[0065] 图38示出了根据一个实施方案的实验安排,用于测量光输出、流体芯波导的横截面、以及来自具有特氟隆AF涂层的流体芯波导的光输出。虚线框是通道的周长,而实线是
特氟隆AF涂层的芯层。
[0066] 图39示出其中光可以被分离并以3路连结方式引导的装置的布局,以及在PDMS中制造的装置的照片。
[0067] 图40显示当流体中的荧光染料被共享与流体相同的路径的488纳米激光激发时,由若丹明6G发射的光。488纳米的输入光被引导通过流体通道的整个路径,即使在三路分
离之后。
[0068] 图41是根据一个实施方案的用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪的透镜的特定结构的示意图。
[0069] 图42是根据一个实施方案的用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪的激励光源的特定结构的示意图。
[0070] 图43是根据一个实施方案的用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪的激励光源(例如激光器)的特定结构的示意图。
[0071] 图44是显示根据一个实施方案的在用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪中位于光学滤波器阵列和光探测器(例如PMT或者光电检测仪(photodetector))
之间的透镜的示意图。
[0072] 图45A-45C示出根据一个实施方案的用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪的衍射光栅。当颗粒在通道中从点A(图45A)移动到点B(图45B),并最后到
达点C(图45C)时,由于衍射光栅,PMT分别在点A、B和C处区别地登记细胞的编码光谱
息,在时域中生成颜色-空间-时间编码的信号。
[0073] 图46是根据一个实施方案的利用颜色-空间-时间(COST)编码操作的基于图像的微流体检测仪的示意图。
[0074] 图47是根据一个实施方案的利用颜色-空间-时间(COST)编码操作的基于图像的微流体检测仪的具有多个光谱滤波器的旋转轮的示意图。
[0075] 图48是根据一实施方案的用于从COST信号译解样品的荧光颜色的方法。
[0076] 图49A和图49B示出根据实施方案的COST滤波器的设计和通过在光路中相应的滤波器后的光检测器检测的信号。图49A示出了示例性的4-狭缝光谱滤波器。图49B示
出示例性的连续分级COST滤波器。
[0077] 图50是根据一实施方案的颗粒分选仪的图示。
[0078] 图51A是根据一实施方案的图50的荧光检测仪的输出的示例性绘图。
[0079] 图51B是根据一实施方案的图50的阻抗检测仪的输出的示例性绘图。
[0080] 图52A是根据一实施方案的荧光检测的图示。
[0081] 图52B是根据一实施方案的图52A的PMT的输出的例证性绘图。
[0082] 图53A是根据一实施方案的图52A的红、绿和蓝滤波器的滤波器传输特性的图示。
[0083] 图53B是示出通过本发明的方法和设备的分选的多个亮紫(BV)染料的绘图。
[0084] 图53C是根据一实施方案的图52A的PMT的输出的示例性绘图。
[0085] 图53D是示出通过本发明的方法和设备的分选的荧光团FITC、PE和tdTomato的绘图。
[0086] 图54是根据一实施方案的用于验证使用图1的颗粒分选仪进行的分选的例证性方案。
[0087] 图55是根据一实施方案的用于验证两个颗粒的分选的例证性方案。
[0088] 图56A是根据一实施方案的具有多个阻抗检测仪的颗粒分选仪的图示。
[0089] 图56B-56C是根据一实施方案的用于验证颗粒分选到多个通道的例证性绘图。
[0090] 图57是根据一实施方案的用于验证颗粒的分选的方法。
[0091] 图58是根据一实施方案的用于计数颗粒的例证性方案。
[0092] 图59A-59C是根据实施方案的用于计数颗粒的分析的例证性绘图。
[0093] 图60A-60B是根据一实施方案的用于确定颗粒数目的例证性方案。
[0094] 图61是根据一实施方案的基于反馈来计数颗粒的方法。
[0095] 图62A是根据一实施方案的在相同的通道中具有两个检测分区的颗粒分选仪。
[0096] 图62B是根据一实施方案的图62A的阻抗检测仪的输出的例证性绘图。
[0097] 图62C是根据一实施方案的图62B的荧光检测仪的输出的示例性绘图。
[0098] 图63A是根据一实施方案的图62A的阻抗检测仪的示例性实施方案的透视图。
[0099] 图63B是根据一实施方案的图62A的阻抗检测仪对于单一颗粒的输出的示例性绘图。
[0100] 图63C是根据一实施方案的图62A的阻抗检测仪对于三种不同大小的颗粒的输出的示例性绘图。
[0101] 图64是根据一实施方案的用于分选颗粒的方法。
[0102] 图65是根据一实施方案的用于分选颗粒的系统。
[0103] 图66是根据一实施方案的图65的计算设备的图示。
[0104] 图67是根据一实施方案的包括供给芯片上试剂的颗粒分选仪的图示。
[0105] 图68是根据一实施方案的包括供给芯片上试剂的示例性颗粒分选仪的图示。
[0106] 图69A-69C是由颜色-空间-时间编码系统补偿的颜色的图示。图69A、图69B示出了分别用于荧光团1和荧光团2的归一化特征波形。图69C示出了从(式5)得到的荧
光团1和荧光团2的光强度。COST滤波器被假设由后接具有从红到绿色的连续透射光谱的
颜色滤波器的全通窗的两个狭缝构成。
[0107] 图70A是串联的滤波器的例证性设计。各组滤波器的由具有不同的光谱特性的多个狭缝构成。第二滤波器组具有比第一滤波器组更低的整体透射系数。
[0108] 图70B是通过图70A的滤波器接收到的示例性细胞信号的图示。第一细胞具有低的荧光强度,使得很难检测到第二滤波器组的输出。第二细胞具有强的荧光强度,并且来自第一滤波器组的输出使PMT检测仪饱和。然而,可以正确地从高亮显示的具有适当的强度
的信号部分检测到这两个细胞的荧光特性。
[0109] 图71A-G提供用于微制造串联的滤波器的处理流程的图示。
[0110] 图72A、72B示出了根据一实施方案的具有后分选(图72B)的颗粒分选仪(图72A)的分选通道的修改
[0111] 图73是根据一实施方案的与颗粒分选仪一起使用的对准标记的图示。

具体实施方式

[0112] 在本说明书中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数对象,除非上下文另有明确说明。因此,例如,术语“装置”是指单个装置或装置的组合。
[0113] 在本说明书中使用的术语“颗粒”是指被认为具有可以作为分选依据的至少一个特性的任何实体。因此,术语“颗粒”包括(但不限于):有机颗粒、无机颗粒、具有有机和无机成分的混合颗粒等。颗粒具有任何合适的尺寸和形状,包括但不限于:珠、纳米颗粒、微粒等。术语“颗粒”也包括生物实体,例如一个或多个细胞(包括哺乳动物和非哺乳动物细胞)、细菌、病毒等。术语“颗粒”可以指稀有的细胞类型或丰富的细胞类型。
[0114] 在本说明书中使用的术语“颗粒分选仪”、“细胞分选仪”、“颗粒检测仪”、“细胞检测仪”、“颗粒分析仪”、“细胞分析仪”、“微流体分选仪”、“微流体检测仪”及其变型可以互换使用,并且可涵盖其他。例如,颗粒分选仪可包括颗粒检测仪,并且细胞检测仪可包括细胞分选仪。
[0115] 在本说明书中使用的术语“稀有细胞”、“相对稀有的细胞”、“相对稀有的细胞类型”及其变体,当用于描述具有两个或更多的细胞类型的组合物中的细胞亚群时,表明在组合物中存在至少一种其它细胞类型,数目比相对稀有的细胞类型更大。在本说明书中使用的术语“丰富的细胞”、“相对丰富的细胞”、“相对丰富的细胞类型”及其变体,当用于描述具有两个或更多的细胞类型的组合物中的细胞亚群时,表明在组合物中存在至少一种其它细
胞类型,数目比相对丰富的细胞类型更少。
[0116] 当细胞的组合物被描述为具有“相对稀有细胞类型”和“相对丰富的细胞类型”时,表示该组合物包含比相对稀有的细胞类型数目更大的相对丰富的细胞类型。换言之,组合物仍然可包含以比相对丰富的细胞类型的更大的数目存在的其它细胞类型,和/或以比相
对稀有的细胞类型更小的数目存在的其他细胞类型。
[0117] 此处公开的一些实施方案是可操作的,用于询问单个颗粒以确定颗粒特性,其中,具有特定特性的颗粒需要被分离,用于例如后续的分析。有利的是,此处所公开的实施方案可操作以执行此功能,同时减少与现有技术的系统相关联的尺寸、成本、以及制造和/或操作的复杂性。图1示出了本发明的颗粒分析仪和分选仪的模块化性质的示例性实施方案。特别涉及到细胞分选,此处公开的实施方案可以满足基于对细胞的特性和/或生物标记的
光学检测来分离所选的细胞亚群的日益增长的需求。
[0118] 目前的评估多个生物标记的技术是无法快速获得结果的、高费用、复杂,并且灵敏度通常不高。用于检测低丰度蛋白的金标准测定法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。ELISA能够在低ng/mL范围和高的样品通量检测蛋白质,但并不具备在每个样品中检测多种分析
物的能力。其他的技术平台(如那些基于质谱分析的)都在多路复用方面显示一些初步的
成功(检测每个样品中的多种蛋白质),但具有中等的样品通量和检测极限。
[0119] 此外,质谱法方案仅适用于蛋白/肽。本领域已知的光学方案包括使用每分析物具有连接到抗体并与连接到另一抗体的不同的荧光团组合的荧光微粒的“双色码”的流式
细胞术平台。然而,这样的双色码方案需要多个激光器和光电检测仪,使得系统庞大且昂
贵。这是一个主要缺点,导致占用空间大并且仪器的成本高。
[0120] 此外,此处公开的实施方案提供完整系统,用于颗粒加工,并可在微流体尺度涵盖样品富集(例如,通过螺旋富集结构,在后面描述)、样品混合(例如,通过蛇形混合结构,在后面描述)、样品/颗粒分选(例如,通过基于光学的颗粒分选和压电致动)、验证分选(例如,通过基于阻抗的传感器)、基于反馈的光学分选(例如,通过基于混合光学/阻抗的系
统)。此处描述的实施方案可以进一步提供与样品混合的集成试剂供给品(例如,芯片上试
剂,用于预分选/后分选混合)。此处描述的实施方案还可以提供用于优化分选颗粒收集体
积(例如使用后分选阀)。
[0121] 此处描述的实施方案进一步提供光学系统和用于颗粒检测的改进方法(例如,COST法)。此处的示例性实施方案进一步提供改进的用于颗粒检测的系统,其可以包括颜
色补偿(例如,当颗粒在两个或两个以上的波长处发出荧光),以及用于改善单个检测器系
统中的动态范围的方案。
[0122] 作为非限制性实例,样品富集结构可以接收样品(例如血液),并且提供富集的样品输入到混合结构,用于从例如(在一些实施方案中)芯片上的试剂供给物将试剂添加到
富集的样品(例如荧光标记物)。混合结构可以提供包含待分选到源通道的输入端口的颗
粒的样品混合物。光学检测机构(例如,如此处所公开的COST安排/方法)可以检测颗粒,
并且分选机构可以基于光学检测机构来分选颗粒。验证机构可以确保颗粒被适当分选,且
可用于将反馈提供到分选机构。
[0123] 在一些实施方案中,光学检测机构可负责颜色补偿,且/或可被构造成用于增加与其相关联的单个检测仪的动态范围。在一些实施方案中,可以在每个目标通道中形成后
分选机构(例如阀门),以基于从验证机构接收的定时信息来控制与分选颗粒相关联的体
积。
[0124] 此处描述用于分选颗粒的系统、装置和方法。在一些实施方案中,基于如由第一检测信号测量的颗粒的光学特性,将颗粒从第一通道分选到几个第二通道的一个中。在一些实施方案中,颗粒分选到第二通道是由与第二通道中的颗粒的存在和/或体积相关联的第
二检测信号验证的。因此,本公开的各方面能够验证出颗粒的光学特性被正确地识别、分选到每个分选通道的颗粒数目是正确的、颗粒被正确地分选和/或类似情况。本公开的各方
面进一步可操作以使用验证信息用于进一步分析,如用于分选的反馈控制、用于表征分选
颗粒、和/或类似情况。
[0125] 可以在远处部位侵入、定殖和增殖的循环肿瘤细胞(CTCs)可被认为是对给定肿瘤的转移性恶性的标记。从外周血或骨髓中收集的CTCs保持“液体活检”的约束
(promise),从而以DNA、mRNA、和/或蛋白水平生物表征患者的癌症。结合CTC的列举,这
样的在分子水平上的分析可以揭示有关于转移性疾病的性质、瘤的诊断和预后治疗的进
展以及最有效的个性化的癌症治疗(例如,化学疗法)的进展的重要信息。
[0126] 流式细胞术(或FACS)可以允许通过多个参数的快速且高度特异性的定量细胞-细胞分析,以及分选CTC用于进一步表征分子的能力。此外,流式细胞术是一种成熟的、公认的且商业上可行的技术。然而,一些障碍使当前的流式细胞仪由于其复杂性、尺寸和成本高不适合用于CTC的定点监护分析。在一些实施方案中,这里提供的是一种微流体技术,它允许在一些实施方案中使用(由于污染和/或夹带的险降低,对于临床应用而言是理
想的)封闭的一次性芯片检测和/或捕获多个的细胞类型的组合物中的特定的细胞类型/
亚群(例如,CTC)。
[0127] 在一些实施方案中,此处描述了一种微细胞检测系统,包括芯片上实验室的微流体检测仪,可以提供适于下游分子分析的细胞群(例如CTC)的芯片上抗体标记、列举和分
选。在一些实施方案中,包括芯片上实验室的微流体检测仪的微细胞检测系统可以提供分
选、检测和/或收集活的(例如,存活的)细胞群和/或细胞亚群(例如相对丰富的细胞类
型、相对稀有的细胞类型、特定的细胞类型(如检CTC)等)。在一些实施方案中,微细胞检
测系统可以包括(i)富集结构、(ii)混合结构和(iii)微流体检测仪。在一些实施方案中,
细胞检测系统包括:(i)第一阶段细胞分离/细胞富集器,(ii)流体动力学辅助混合器,以
及(iii)用于细胞分离的台式微FACS(例如,微流体检测仪)。
[0128] 在一些实施方案中,此处所描述的检测系统可以是具有成本效益的、易于使用的、快速、可靠的技术和方法,用以从全血(1)列举(例如富集)和(2)分离细胞亚群(例如,相对稀有的细胞类型/稀有的细胞群,如CTC)。此处所描述的检测系统具有相对于常规的
FACS系统的优势,后者较之昂贵5-10倍、使用复杂且非常大。在一些实施方案中,检测系统可以提供用于:(1)利用富集结构,以约100倍或更大的倍数(例如,约400倍)富集细胞
群(例如,特定的细胞类型,CTC),(2)使用混合结构,在不到2分钟内,用结合剂(例如抗
体)标记富集的细胞类型或富集的细胞群,和(3)以约28%或更大、或约30%或更高、或约
40%或更高的、或从约28%至约90%、或从约28%至约80%、或从约28%至约70%、或从
约28%至约60%的回收率检测和/或分离标记的细胞。
[0129] 富集结构
[0130] 在一些实施方案中,提供富集结构,其能够从细胞群(例如白细胞)分选、分离和/或收集第一细胞类型(例如,CTC)。细胞富集可以是指从细胞群分选、分离和/或收集特定的细胞类型(例如相对稀有的细胞类型或相对丰富的细胞类型),该细胞群与特定的细胞
类型不同,如包括第一细胞类型和第二细胞类型的组合物。在一些实施方案中,特定细胞类型可以是稀有的细胞类型。特定的细胞类型可以通过细胞的物理或生物特性(例如表型、
基因型)而与其他细胞类型相区别。例如,特定的细胞类型可以有如下方面区分:大小、质量、粒度、变形性、极化性、一个或多个细胞表面标记(例如细胞表面分子的存在与否)、一个或多个细胞内的标记(例如细胞内分子、DNA、RNA、蛋白质、蛋白质修饰的存在与否)和
/或功能(例如细胞代谢功能、酶的功能)等或它们的组合。在一些实施方案中,细胞的富
集是由富集结构提供的。可以在微细胞检测系统中使用本领域中已知的合适的细胞富集结
构。
[0131] 可以被用作细胞富集结构的技术或装置的非限制性实例包括:膜微滤、捏流分级、确定横向位移、流体动力学分选富集(hydrophoresis)、介电电泳(DEP)、基于免疫磁
性的分离、在障碍物周围的层流的非对称分支(Huang LR等,Science,2004年5月14日;
304(5673):987-90)、大规模并行微筛分装置(Mohamed H等,IEEE Trans Nanobioscience,
2004年12月;3(4):251-6)、仿生自动分离(Shevkoplyas SS等,Anal Chem,2005年2月1
日;77(3):933-7)、被动驱动微流体分离(Cho BS等,Anal Chem,2003年4月1日;75(7):
1671-5)、基于粘附的细胞分离、微尺度层流旋涡、螺旋通道、类似物或它们的组合。在一些实施方案中,富集结构可以包括流体通道。在一些实施方案中,富集结构可嵌入、附接或实施到芯片上(例如,芯片上实验室或类似物)。
[0132] 螺旋富集结构
[0133] 在一些实施方案中,细胞富集结构是流体动力学微流体结构,其包括螺旋形通道结构,此处称为用于分离和富集细胞亚群的螺旋富集结构。在一些实施方案中,螺旋富集结构可嵌入到芯片上(例如,芯片实验室或类似物)。在一些实施方案中,螺旋富集结构可以
用于基于物理性质(如大小、形状、质量和/或密度)分离细胞和/或颗粒。在一些实施方
案中,螺旋富集结构可以从具有第二尺寸的第二细胞类型分离具有第一尺寸的第一细胞类
型。在一些实施方案中,螺旋富集结构可用于从其他相对丰富的细胞类型(例如,白细胞、非信息细胞等)的溶液分离相对稀有的细胞类型(例如,循环肿瘤细胞)。在一些实施方案
中,螺旋富集结构可以用于在包含稀有的细胞类型和丰富的细胞类型的组合物中,相对于
更丰富的细胞类型,富集稀有的细胞类型。螺旋的设计可以充分利用作用于不同尺寸的细
胞的惯性升力和粘滞阻力来实现细胞的差速迁移,并由此分离细胞。由于螺旋流体通道的
几何形状,主导的惯性力和迪恩旋转力可促使较大的细胞占据邻近内流体通道壁的单个平
衡位置,而较小的细胞在迪恩力的作用下,迁移到流体通道的外半部,导致形成可在单独的出口收集的不同的颗粒流。在一些实施方案中,由于通过具有高长宽比的通道产生大的升
力,可以在短距离的螺旋通道内实现完整的细胞分离或过滤,即使在低流速的情况下。此处更详细地描述了螺旋富集结构的各种实施方案。
[0134] 在一些实施方案中,螺旋富集结构可以包括一个或多个内部入口、布置成多个圆形环的流体通道、以及两个或更多个外部出口。富集结构的一些或所有特征可以由适当
的微制造材料制成,其非限制性实例包括聚二甲基烷(PDMS)材料、聚甲基丙烯酸甲酯
(PMMA)材料、聚酸酯(PC)材料、和/或环烯共聚物(COC)材料、类似物或它们的组合。
[0135] 在一些实施方案中,第一内部入口可以构造成接收包含各种尺寸的细胞(例如,CTC和白细胞)的装载细胞的溶液,并且第二内部入口构造成接收缓冲液。在一些实施方案
中,一个或多个内部入口可以连接到端口或其它耦合装置(例如,构造成与注射筒配合),
以允许溶液进入螺旋富集结构。在一些实施方案中,可设置一个入口。在一些实施方案中,可设置两个或更多入口。
[0136] 在一些实施方案中,内部入口和外部入口可流体联结到被布置成多个环的螺旋流体通道。在一些实施方案中,流体通道可为大致四边形(例如,矩形、平行四边形、菱形、风筝形、梯形)的横截面时,具有两个第一壁和两个第二壁。在一些实施方案中,第一壁限定出流体通道的宽度,并且(一些实施方案中)第二壁限定出流体通道的高度。在一些实施
方案中,流体通道的横截面基本上为圆形或椭圆形。在一些实施方案中,流体通道包括截面基本上为矩形的部分,以及截面基本上为圆形或椭圆形的部分。在一些实施方案中,具有基本上圆形或椭圆形的截面的流体通道部分地由内部直径和/或半径限定。
[0137] 在一些实施方案中,内部出口和外部出口位于螺旋流体通道的相对端。在一些实施方案中,分离的细胞在内部和/或外部出口处被收集、检测、计数或另外进行分析。在一些实施方案中,分离的细胞在外部出口处或附近被收集、检测和/或计数。在一些实施方案中,不同尺寸的细胞在一个或多个外部出口处或附近被收集。
[0138] 不受理论的限制,流经螺旋流体通道(例如,螺旋富集结构)的流体经受沿径向向外的离心加速度,导致在通道的顶部和底部形成被称为狄恩(Dean)涡流的两个反向旋转
的涡流。这些二次流的大小可通过图2C所示的无量纲迪恩数(De)进行定量,其中,p是流
3
体介质的密度(kg/m),Uf是平均流体速度(m/s),μ为流体粘度(kg/m-s)中,R是螺旋流
体通道的路径的曲率半径(m),而Re是流雷诺数。对于直的流体通道,DE=O,表明不存在
迪恩流。在弯曲的通道中,De随更高的曲率(较小的R)、较大的通道尺寸(较大的Dh)和较
快的流(更高的Re)增加。由于横向迪恩流,在曲线形通道中的细胞流动经受了曳力(drag
force)。根据颗粒尺寸、该曳力(也称为图2C中所示的迪恩力(FD)),可使细胞沿着狄恩涡
流(即环流)移动,并且因此移向内部或是外部通道壁。
[0139] 除了迪恩力FD,曲线形通道中的细胞经受压力和惯性升力。作用在细胞上的净升力(FL)是剪切诱导的惯性升力和壁诱导的惯性升力的组合。在伯肃叶(Poiseuille)流中,
速度概貌的抛物线性质导致作用于细胞并被导向远离流体通道中心的由流体剪切引起的
惯性升力。随着细胞移向流体通道壁,在细胞周围引起的不对称尾流产生由壁引起的远离
壁的惯性升力。这些相反的升力的大小横跨流体通道的横截面发生变化,其中在流体通道
壁(例如内壁和外壁)附近,由壁引起的升力为主,而在流体通道的中心附近,由剪切引起
的升力为主。如此,细胞趋向于占据平衡位置,在平衡位置处,相反指向的升力是相等的并形成窄带。
[0140] 在一些实施方案中,对在螺旋流体通道中流动的细胞起作用的力(即迪安力和惯性升力)的尺寸相关性被操纵,以产生相似尺寸的细胞的集中流。在一个实施方案中,细胞被称为第一尺寸的第一细胞。在一些实施方案中,不是第一尺寸的细胞继续在迪恩涡流内
环流。在一些实施方案中,螺旋富集结构的螺旋几何形状可促使较大的细胞占据内部流体
通道壁附近的单个平衡位置,而较小的细胞由于迪恩流经受较高的粘滞阻力,并会继续沿
着迪恩涡流再次环流并转换到流体通道的外半部。因此,在一些实施方案中,螺旋富集结构可以利用较大的细胞的惯性迁移以及作用于较小的细胞的迪恩阻力的影响来实现完全分
离。
[0141] 在一些实施方案中,螺旋富集结构设计包括螺旋形的几何形状。螺旋形几何形状可以被定义为围绕固定的中心点以与中心点连续增加或减少的距离缠绕的平面上从曲线。
螺旋可以以三维方式离开平面,并且可以(在一些实施方案中)类似锥形弹簧。在一些实
施方案中,螺旋富集结构可以包括两个或更多圈。一圈可以定义为围绕螺旋富集结构的中
心点的大约一个整圆(例如,一个完整的螺旋,大约360度)。在一些实施方案中,螺旋富集结构包括3个或更多圈、4个或更多圈、5个或更多圈、6个或更多圈、7个或更多圈、8个或
更多圈、9个或更多圈、或10个或更多圈。在一些实施方案中,螺旋富集结构包括约2至约
100圈、约2至约75圈、约2至约50圈、约2至约25圈、约2至约20圈、约2至约10圈、
或约2至约5圈。在一些实施方案中,螺旋富集结构包括大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19或约20圈。在一些实施方案中,螺旋富集结构包括5圈螺旋几何形状,具有两个或多个入口以及两个或多个出口(例如,分叉出口)。
[0142] 在一个实施方案中,螺旋流体通道的长度是约2厘米或以上、约4厘米或以上、约6厘米或以上、约8厘米或以上、约10cm或以上、约12cm或以上、大约14厘米或以上、大约16厘米或以上、大约18厘米或以上,大约20厘米或以上、或约22厘米或以上。在一些实施方案中,流体通道的长度为约2厘米至约50厘米、2厘米至约40厘米、2厘米至约30厘米、2
厘米至约25厘米、2厘米至约20厘米、或约2厘米至约15厘米。在一些实施方案中,流体
通道是大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29或约30厘米。
[0143] 在一些实施方案中,螺旋富集结构的两个连续圈之间的间隔是约20微米至约2000微米。在一些实施方案中,螺旋富集结构的两个连续圈之间的间隔是约250微米。在
一些实施方案中,螺旋的曲率半径R的初始半径为约1毫米至约10毫米。在一些实施方案
中,螺旋的曲率半径R的初始半径为约3毫米。
[0144] 在一些实施方案中,螺旋富集结构体包括2至约20个外部出口。在一些实施方案中,螺旋富集结构体包括约2至约10个外部出口。在一些实施方案中,螺旋富集结构包括
2、3、4、5、6、7、8、9或10个外部出口。
[0145] 在一些实施方案中,富集结构流体联结到混合结构或微流体检测仪。在一些实施方案中,富集结构的一个或多个出口(例如,外部出口)流体联结到混合结构或微流体检测
仪的入口。
[0146] 混合结构
[0147] 微流体系统中的流动通道的小型化尺度增大了表面与体积比,并且因此对多种应用有利。然而,在这种流体通道中的液体流的具体雷诺数(Re=1ρv/η)是非常小的。例
3 2
如,在通道宽度为100μm、液体流速为1mm/s、流体密度为1g/cm和粘度为0.001Ns/m 的典
型的基于水的微流体系统中,雷诺数为0.1的量级。在这样的低的雷诺数状况中,不会发生湍流混合,因此,扩散种类的混合起着重要的作用,但却是本质上缓慢的过程。在一些实施方案中,混合结构的功能可以提高微流体通道中的混合效率,使得可以实现充分混合性能。
在一些实施方案中,混合结构的作用是缩短混合时间并降低使用检测系统时用结合剂标记
细胞所需的总时间。在一些实施方案中,混合结构的作用是缩短混合通道的长度,以减少检测系统的整体尺寸。在一些实施方案中,混合结构的作用是在混合处理期间保持细胞活力。
在一些实施方案中,有效的混合结构被用于增加检测系统的流通量,并能够获得有效的芯
片上实验室系统。在一些实施方案中,混合结构包括流体通道。在一些实施方案中,混合结构被嵌入到芯片上(例如,芯片实验室等)。
[0148] 在一个实施方案中,混合结构是在本领域中公知的合适的微流体混合器。在一些实施方案中,混合结构是有源(active)流体混合器。有源流体混合器的非限定性例子包
括声混合器、声波混合器、介电混合器、电动时间脉冲混合器、压力扰动混合器、磁力混合器、热混合器、电流体动力学力混合器、磁流体动力学流混合器和/或电动非稳态混合器、类似物和/或它们的组合。在一些实施方案中,混合结构是无源(passive)流体混合器。
无源流体混合器的非限制性实例包括层流混合器(例如,楔形入口,90度旋转)、锯齿形通
道(例如,椭圆形形状的障碍物)、3D蛇形结构(例如,折叠结构,蠕变组织结构,堆叠垫片结构,多个分离和拉伸、重组流,不平衡驱动力)、嵌入式障碍物(例如,SMX,多向涡流)、扭转通道(例如,分离和重组)、和/或表面化学(例如,障碍物的形状,T-/Y-混合)、类似物
或它们的组合。
[0149] 蛇形混合结构
[0150] 在一些实施方案中,混合结构为蛇形结构(例如,蛇形混合器),如图7A-7C所示。在一些实施方案中,蛇形混合器是二维的蛇形混合器。在一些实施方案中,蛇形混合器包括入口端口、连续流体通道、两个或更多转弯、以及位于通道中的入口端口的另一端的出口端口。在一些实施方案中,蛇形混合器的总通道长度为约1毫米至约10,000毫米。在一些实
施方案中,总通道长度为约1毫米至约1000毫米。在一些实施方案中,通道长度为约1毫
米至约500毫米。在一些实施方案中,蛇形混合器包括约3至30个转弯。在一些实施方案
中,蛇形混合器包括约5(图7A)至20(图7B、7C)个转弯。在一些实施方案中,蛇形混合
器包括约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个转弯。在一些实施方案中,蛇形混合器包括20个转弯。在一些实施方案中,蛇形混合器中的每一个转弯被构造用
于在通道内流体流动的180度重定向。在一些实施方案中,蛇形混合器中的每一个转弯包
括椭圆形曲线。在一些实施方案中,蛇形混合器中的每一个转弯包括圆形曲线或水平曲线。
在一些实施方案中,描述出蛇形混合器中的转弯的曲线(如,椭圆形、水平或圆形曲线)的
内半径为约20微米至约10,000微米、约20至约1000微米、约20至约500微米、或约150
至约350微米。在一些实施方案中,描述出蛇形混合器中的转弯的曲线(如,椭圆形、水平
或圆形曲线)的内半径为约150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、
280、290、或约300微米。在一些实施方案中,两个转弯之间的通道的长度为约0.5毫米至
约1000毫米。在一些实施方案中,蛇形混合器是混合结构。在一些实施方案中,蛇形混合
器被嵌入到芯片上(例如,芯片上实验室或类似物)。
[0151] 流体通道
[0152] 在一些实施方案中,检测系统、检测器系统、流式细胞术装置、富集结构、混合结构和/或微流体检测仪包括一个或多个流体通道。在一些实施方案中,流体通道是微流体通道。芯片上实验室可以包括一个或多个流体通道。在一些实施方案中,流体通道嵌入到芯
片上。在一些实施方案中,流体通道构造成包含静态或动态的流体(例如,移动的流体或溶液),其包括细胞(例如原核细胞、真核细胞、人细胞)。在一些实施方案中,流体通道构造成包含静态或动态的流体(例如移动的流体或溶液),其包括颗粒(例如,珠、附着于细胞的珠、附着于结合剂的细胞)。本领域技术人员将理解流体通道可以由本领域中已知的合适的材料制成。此外,流体通道的横截面可以是任何合适的形状(例如矩形、圆形)。在一些实
施方案中,流体通道包括第一端和第二端。在一些实施方案中,流体通道包括第一端,并且第一端部包括阀、端口、流量调节器、和/或一个或多个入口。在一些实施方案中,流体通道包括第二端,并且第二端部包括阀、端口、流量调节器、和/或一个或多个出口。在一些实施方案中,流体通道的第一端和/或第二端构造成提供位于富集结构与混合结构之间和/或
混合结构与微流体检测仪之间的连续通道。在一些实施方案中,流体通道的内径可以为约
0.2微米到约2000微米,或约10微米至约1000微米。在一些实施方案中,流体通道的内径
是约250微米。
[0153] 微流体检测仪
[0154] 在一些实施方案中,提供微流体检测仪。在一个实施方案中,微流体检测仪结合了光电子和微流体,以检测和/或分选颗粒或细胞(例如,血液中相对稀有的细胞,如CTCsm,以及相对丰富的细胞等)。在一些实施方案中,微流体检测仪构造成提供流式细胞仪和/或基于FACS的细胞分选仪的一些或全部的功能。在一些实施方案中,微流体检测仪包括流
式细胞术装置。在一些实施方案中,微流体检测是检测系统(例如,微细胞检测系统)的部
分。在一些实施方案中,微流体检测仪被嵌入到、附着到或实施于芯片上。在一些实施方案中,微流体检测仪被用于根据颗粒发射的光和/或已与颗粒发生相互作用的光(例如,被颗
粒衍射、散射和/或反射的光),检测和任选地分选颗粒(例如,珠、细胞、病毒、细菌、类似物或它们的组合)。
[0155] 由检测仪检测的光可以是任何波长或频率的电磁辐射。波长或频率的值通常是用于通过真空传播的光。在一些实施方案中,光可以表征为可见光、紫外光和/或红外光。可见光通常具有约390纳米至约750纳米的波长,且通常具有约400太赫兹(THz)至约790THz
的频率。红外光通常为约0.74微米至约300微米的波长,并且通常具有约300千兆赫(GHz)
至约400THz的频率(近红外线可以为约120THz至约400THz;中红外线可以为约30THz至
约400THz;并且远红外线可为约300GHz至约30THz)。紫外光通常为约10纳米至约400
纳米的波长,并且通常具有约0.75PHz至约30PHz的频率(近紫外线可以为约400nm至约
300nm,中紫外线可以为约300nm至约200nm,并且远紫外线可为约200nm至约122nm)。光
子是光的量子,并且光子可具有特定的光子能量
[0156] 在一些实施方案中,颗粒是发射光的作用剂(例如,荧光团),和/或可以是分子复合物,其包括发射光的作用剂。在一些实施方案中,颗粒可包括一种或多种生物作用剂(例如细胞、蛋白质、核酸、生物膜(例如,囊泡、脂质体、类似物以及它们的组合)。在一些实施方案中,颗粒,一个或多个抗体与一种或多种生物作用剂关联(例如,结合到生物作用剂)。在一些实施方案中,抗体连接于发射光的作用剂(例如,荧光团)。在一些实施方案中,不同的颗粒的组合被引入到微流体检测仪的流细胞或流体通道。在一些实施方案中,不同的颗
粒的组合包括发射不同波长的光的不同的颗粒。
[0157] 在一些实施方案中,颗粒是指细胞,细胞可引起光的发射、散射、反射、偏转或衍射。在一些实施方案中,细胞与可发射、散射、反射、偏转或衍射光的检测剂有关。在一些实施方案中,检测剂被连接到可与细胞相关联或结合(例如,特定地关联或特定地结合到具体的细胞类型或细胞组分)的结合剂。在一些实施方案中,结合剂结合到细胞表面蛋白。
[0158] 在一些实施方案中,微流体检测仪或其部分由光源照亮。在一些实施方案中,由光源引入的光可通过流体通道壁传输到通道内部中。由光源发射的光的角度可以相对于通道壁成一角度,适于照亮通道内的颗粒。在某些实施方案中,流体通道内的颗粒可以与引入通道内的光相互作用,并且已经与颗粒相互作用并且可被颗粒散射、反射或衍射的光可以从
通道传输到微流体检测仪中的一个或多个其他部件。
[0159] 在一些实施方案中,流体通道内的颗粒发射特定波长或特定波长范围内的光,并且波长范围的全部或一部分被从通道传输到微流体检测仪中的一个或多个其他部件。在一
个实施方案中,颗粒发射特定波长或波长范围的光,其波长或波长范围与光源发射的波长
或波长范围不同(例如,光源发射的(多个)激励波长可以激励荧光团颗粒或附着于颗粒
的荧光团,而荧光团可以发射(多个)不同波长的光)。在一个实施方案中,由颗粒发射的
或已与颗粒相互作用的光传输通过流体通道,并传输通过一个或多个中间结构或由一个或
多个中间结构传导,到达检测仪。中间结构的非限制性实例包括掩模、颜色滤波器、波导、反射镜、透镜、滤波器、光衍射部件(例如棱镜、衍射光栅),类似物以及它们的组合。
[0160] 在一些实施方案中,微反射器体检测仪包括光学滤波器、反射器和/或它们的组合。在一个实施方案中,微流体检测仪包括一个或多个光学滤波器。在进一步的实施方案
中,光学滤波器是吸收滤波器、颜色滤波器、分色滤波器、单色滤波器、红外线滤波器、紫外线滤波器、中性密度滤波器、长通滤波器、带通滤波器、短通滤波器、导模共振滤波器、金属网滤波器、偏振滤波器、光学陷波滤波器(例如,精密光学陷波滤波器)、类似物或它们的组合。在此更详细地描述滤波器的非限制性实例,如颜色滤波器。在一个实施方案中,装置包括一个或多个能反射光线的部件,其非限制性实例包括平面镜、曲面镜、抛物面反射镜和分色镜。在一些实施方案中,反射镜基本上反射特定波长范围的光并且对不同波长范围内的
光基本上是透明的且不反射。在一些实施方案中,反射镜基本上反射在激发荧光团(例如,荧光团颗粒或连接至或与颗粒相关的荧光团)的波长范围内的光,并且对通过受激荧光团
发射的波长范围内的光基本上是透明的。
[0161] 在一些实施方案中,从通道内的颗粒发射的光或与通道内的颗粒相互作用的光从流体通道传输到颜色滤波器。在一些实施方案中,颜色滤波器可包括两个或更多个分区
(例如,约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个或更多分区)。在一些实施方案中,颜色滤波器可包括:包括基本透明的分区和基本不透明的分区(例如,光学孔径、带)的掩模,以及与基本透明的分区有效连接的波导。在一些实施方案
中,一些波导是着色的,并传输由掩模传输的波长范围的波长子范围。在一些实施方案中,颜色滤波器包括掩膜和波导,并且在一些实施方案中,与颗粒流动所处的流体通道接触,而来自流体通道(在一些实施方案中)的光在通过掩模或波导接收之前未传输通过任何其它
部件。包括掩模60和波导52、54、56、58的颜色滤波器的非限制性实例示于图18中。
[0162] 在一些实施方案中,颜色滤波器不直接与在微流体检测仪内的流体通道接触。在一些实施方案中,颜色滤波器与颗粒流动所处的流体通道相隔一定距离,并且在一些实施
方案中,约1厘米(cm)至100厘米(例如,约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80或90厘米)的距离。在一些实施方案中,通过通道发射的光可以在光或其修饰版本接触颜色滤波
器之前,传输通过一个或多个其它部件(例如透镜、反射镜)。在一些实施方案中,分区可以是在滤波器上的离散区段,并且(在一些实施方案中)分区基本上是连续的(例如,连续分
级的彩色分区)。图49A示出了包括基本上离散分区的颜色滤波器的非限制性实例,其示出
了来自离散(例如,带通)滤波器的信号强度。在图49B中示出了包括若干分区之间基本
上连续的过渡的颜色滤波器的非限制性实例。
[0163] 在一些实施方案中,颜色滤波器可包括传输基本上所有被传输到滤波器的光的一个或多个分区(例如,全通滤波器分区)。在一些实施方案中,颜色滤波器可包括传输被传
输到滤波器的光的一部分的两个或多个分区(即,称为颜色滤波器分区),其中至少一个颜
色分区,与另一个颜色分区相比,传输光的不同部分。在一些实施方案中,颜色滤波器中的颜色分区可以实施为宽通的、连续的、带通滤波器,类似物或它们的组合。在一些实施方案中,光的不同部分分别是由颜色滤波器接收的光的波长范围、光能量范围和/或光的频率
范围的不同的波长子范围、不同的能量子范围、和/或不同的频率子范围。因此,第一颜色分区可以传输第一波长子范围,并且第二颜色分区可以传输第二波长子范围,其中第一波
长子范围和第二波长子范围是不同的(例如,重叠或不重叠),并且其波长子范围处于由颜
色滤波器接收的光的波长范围内。在一些实施方案中,由颜色分区传输的不同波长子范围
重叠,而在一些实施方案中,不重叠。处于由颜色滤波器中的颜色分区(一些实施方案中)
传输的光的子范围中的最低波长和最高波长在一些实施方案相差约0.1nm到约500nm(例
如,约 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、
300、350、400或450nm的范围)。在一些实施方案中,颜色滤波器可包括基本上不传输被传输到颜色滤波器的光的一个或多个分区(例如,基本上不透明的分区)。在一些实施方案
中,包括多个分区的颜色滤波器可以被称为具有“滤波器系列”和“滤波器阵列”的滤波器,如此处所述,其中在该系列或阵列中的每个光学滤波器是一分区。
[0164] 在一些实施方案中,颜色滤波器可包括传输被传输到滤波器的光的不同部分的三个或更多个分区。例如,在一个实施方案中,颜色滤波器包括:传输基本上绿光的第一分区、传输基本上蓝光的第二分区、以及传输基本上红光的第三分区。应当注意的是,后者的例子不是限制性的,并且颜色滤波器内部的某些颜色分区可以传输处于由滤波器接收的光的波
长范围内的任何合适的波长子范围。
[0165] 在一个实施方案中,颜色滤波器和颜色滤波器的分区具有适合于检测颗粒、确定颗粒的速度、确定颗粒的大小、检测颗粒发射的或已经与颗粒相互作用的光的(多个)
波长等的维度。在一些实施方案中,颜色滤波器基本上是圆形的,并包括围绕用于传输
光的圆形结构分布的适当成型的分区(例如圆形、卵形、矩形、正方形、三角形、圆的分段(segment))。
[0166] 在一些实施方案中,根据颜色滤波器的顶视图,颜色滤波器基本上是矩形的,并包括基本上横跨较短的矩形维度的一个分区和沿较长的矩形维度依次分布的多个分区。在这样的实施方案,离散分区的宽度是平行于颜色滤波器的较长矩形维度的分区的长度。在这
样的实施方案中,分区的宽度可以是规则的或可以变化。在包括不同的分区宽度的颜色滤
波器实施方案中,宽度可以以任何合适的模式(pattern)分布,这样的模式的非限制性实
例包括周期性、线性(chirp)和伪随机模式。在一些实施方案中,基本上不透明分区可以以不同宽度的模式分布,而传输光的分区(在一些实施方案中)可以以常规宽度的图案分布。
[0167] 颜色滤波器可以通过本领域中已知的任何合适的方法来制造。在一些实施方案中,颜色滤波器包括注入有允许至少一个颜色分区传输波长范围不同于通过另一个分区传
输的光的波长子范围的光的一种或多种作用剂的结构。具有不同的传输特性的区域可以包
括例如不同的作用剂或不同量的一种作用剂。
[0168] 颜色滤波器可以包括多个层。在一些实施方案中,颜色滤波器包括其上沉积一个或多个涂层的支撑结构。可以使用任何合适的结构或支撑结构,并且非限制性实例包括玻
璃、聚合物等。每个分区独立地可以具有基本上均匀的厚度或变化的厚度(例如,阶梯状厚度、锥形或喇叭形厚度(例如,基本上均匀的锥形或喇叭形)。在一个实施方案中,每个分
区独立地包括一个或多个涂层(例如,每个涂层具有相同或不同的材料)和/或一个或多
个层(例如,每一层具有相同或不同的材料)。包括多个层的分区可以包括交替的层,每层
包括不同的材料。在分区中的每个涂层或层可以具有相同的折射率或者可以具有不同的折
射率。颜色滤波器的传输不同波长范围的光的分区可以具有相同的折射率,或者可以具有
不同的折射率。在一些实施方案中,传输不同波长的光的分区可以具有不同层数、不同的材料、不同厚度、类似的或它们的组合。当相邻分区具有不同的厚度时,从一个厚度过渡到另一个厚度可以是任何合适的过渡,如,例如,阶梯形、锥形或喇叭形。
[0169] 在一些实施方案中,微流体检测仪包括分离器(splitter),能有效地接收通过流体通道中的颗粒发射的光或与流体通道中的颗粒相互作用的光。从流体通道发射的光,
在分离器接收这种光之前,可以传输通过装置中的一个或多个其他部件(例如透镜、滤波
器)。分离器可以将接收到的光分成两个或多个分离光束。在一些实施方案中,两个或更多个分离光束中的每一束可以被导向到单独的颜色滤波器。换言之,在一些实施方案中,微流体检测仪包括两个或更多的颜色滤波器,并且每个颜色滤波器可以(在一些实施方案中)
包括传输具有与其他颜色滤波器的颜色分区不同的波长子范围的光的颜色分区。一个分离
光束中的光可以,与另一个分离光束的光,具有相同的波长范围或者不同波长范围。分离器的非限制性实例包括那些包括两个三角玻璃棱镜、半反射镜和二向色镜像棱镜的分离
器。
[0170] 在一些实施方案中,在微流体检测仪中的流动通道、颜色滤波器和光电检测仪器(例如光电检测仪、光传感器)可以被构造成用于在颗粒通过通道改变位置时,多次检测来
自通道中的颗粒的光。当颗粒在微流体检测仪的通道的特定部分上从一个位置行进到第二
位置时,由颗粒发射的光或与颗粒相互作用的光,在第一位置可传输通过通道到达颜色滤
波器的像面上的第一位置。由颗粒发射的光或与颗粒相互作用的光,在第二位置可传输通
过通道到达颜色滤波器的像面上的第二位置。在一些实施方案中,其中颜色滤波器上的第
一位置和第二位置处于不同的颜色分区,传输通过每个颜色分区到达光电检测仪的光的波
长范围不同,并且光电检测仪在流动通道中的两个不同的位置处检测相同颗粒随时间推移
的两个不同的光信号。在这类实施方案中,颜色滤波器可以通过滤波器中的用于相同颗粒
的多个离散的分区传输多个离散波长范围的光到光电检测仪(例如,一个光电检测仪)。在
一些实施方案中,装置未从一个滤波器向光电检测仪阵列中的多个光电检测仪传输不同波
长的光。
[0171] 在一些实施方案中,微流体检测仪中的颜色滤波器可以不包括任何镜像表面,并且在一些实施方案中,颜色滤波器不是法布里-珀罗(Fabry-Perot)腔滤波器或法布
里-珀罗标准具(etalon)。在一些实施方案中,微流体检测仪中的颜色滤波器不是布拉格
(Bragg)反射器,其中,布拉格反射器被定义为具有多个层并且反射具有约各层的光学厚度的四倍的波长的光。
[0172] 在一些实施方案中,颜色滤波器不直接与装置的光电检测仪部件接触。在一些实施方案中,颜色滤波器与光电检测仪部件表面相隔一定距离,例如离光电检测仪部件表面
距离为约0.1厘米到约20厘米(如,约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20厘米,以及其间的全部数值)。在一些实施方案中,一个颜色滤波器可以相对于一个光电检测仪定向成使得由颜色滤波器传输的光被传输到这个光电检测仪而没有传输到其他光电检测仪。在一些实
施方案中,装置不包括光电检测仪阵列,并且一个颜色滤波器与光电检测仪阵列的一个光
电检测仪而不是其它传感器单元构成可检测关系。在一些实施方案中,光电检测仪部件表
面不直接接触微流体检测仪中的流体通道,并且(在一些实施方案中)不沿着微流体检测
仪中的流体通道分布,并且在一些实施方案中,可以定位成与流体通道具有一定距离。
[0173] 在一些实施方案中,微流体检测仪可以包括一或多个透镜。透镜可以是单透镜或多个透镜阵列(例如,复合透镜;透镜阵列可包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个透镜)。透镜可由任何合适的材料来构造,用于传输光,并且(在一些实施方案中)可由例如
玻璃和/或聚合物构成。透镜可以具有合适的几何形状,用于传输光,并且透镜的非限制性实例包括双凸的(双凸、凸的)、等凸、双凹(凹),琴凸、钢琴凹、凹凸(弯月面)。在一
些实施方案中,透镜可以聚焦光。在一些实施方案中,透镜可以将光聚焦在颜色滤波器的像面上,并且在其他实施方案中,透镜将光聚焦在光电检测仪的像面上。在一些实施方案中,透镜可以放大图像,如从流动通道传输过来的图像。在一些实施方案中,透镜可以缩小图
像,如从颜色滤波器传输到光电检测仪的图像。放大或缩小可以处于任何合适的水平,以及(在一些实施方案中)为约2倍至约1000倍(例如,约10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、
400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍放大或缩小,以及在两者之间的任何值)。在一些实施方案中,透镜可以从通道接收光并将光聚焦在颜色滤波器的像面上。在一些实施方
案中,透镜可以从颜色滤波器接收光并将光聚焦在传感器表面的像面上。
[0174] 在一些实施方案中,微流体检测仪可以包括波导,而(在其他实施方案中)不包括波导(例如,没有波导与颗粒所流动的通道关联)。在一些实施方案中,微流体检测仪可以
包括基本上阻止环境光从与装置的一个或多个部件相互作用的结构。这样的结构(在一些
实施方案中)可以具有合适的横截面(例如,矩形,正方形,圆形,卵形)的一个或多个管,并且在一些实施方案中例如为箱。基本上阻挡环境光的结构可以(在一些实施方案)用于
作为某些部件(如透镜)的支撑。
[0175] 在图28至32和35至49B的实施方案中示出的任何检测仪可与本文所描述的一个或多个分选部件联结。在一些实施方案中,微流体检测仪可以包含流体,并且基本上没有位于压电致动器和流体通道之间的空气-流体界面或弯月面。在一些实施方案中,微流体
检测仪可以包含流体并且基本上没有位于压电致动器和待分选颗粒之间的空气-流体界
面或弯月面。在一些实施方案中,微流体检测仪可以包含流体并且在装置的通道中基本上
没有空气-流体界面或弯月面。在一些实施方案中,微流体检测仪可包括无气体填充的储
液器(reservoir),基本上没有气囊或施加气体(例如,空气)到通道中的部件。
[0176] 图14的实施方案示出用于流式细胞术的微流体检测仪1400的例子,其中可以实施本文描述的各种特征。微流体检测仪1400包括:包括用于接收样品流体或输入样品流体
的第一端口(未示出)和用于输出所接收的样品流体的第二端口(未示出)的输入流体通
道1404。在一些实施方案中,颗粒分选连结(particle sorting junction)或颗粒分选仪
1411可以提供用于分选样品流体中的颗粒,并且可联结到输入流体通道的第二端口。在一
些实施方案中,在颗粒分选连结下游,两个或更多的分支流体通道1410A-1410C可联结到
颗粒分选连结,作为来自输入流体通道的第二端口的样品流体的出口。在一些实施方案中,致动器可以联结到颗粒分选连结1411,以响应于分选控制信号来控制颗粒分选连结中的样
品流体的方向。在一些实施方案中,致动器可以位于颗粒分选连结1411内部,或与微粒分
选连结1411相邻或流体连通的包含流体区域中,从而致动器的移动使得在颗粒分选连结
处样品流体移动来改变样品流体的流动方向。在一些实施方案中,致动器可以被构造成与
样品流体相互作用,以响应分选控制信号的变化,将样品流体的方向分别改变为对应于分
支流体通道的不同方向。在一些实施方案中,致动器可为可操作的,以将样品流体中的靶颗粒导向到分支流体通道中选定的一个通道。
[0177] 可基于各种细胞分选技术来实施图14的实施方案中的用于分选颗粒的致动器。分选技术的非限制性实例包括基于电场的分选、介电电泳(DEP)分选、磁性分选和流体动
力学分选。分选可以用于干细胞、循环肿瘤细胞以及大肠杆菌细胞等等的检测和分离。在
一些实施方案中,流体动力学分选仪的实施可以涉及含外部校验值、集成阀或外部注射泵
[0178] 在一些实施方案中,图14的致动器可以被实施为包括压电致动器,压电致动器响应于作为分选控制信号的电压信号移动,以使在颗粒分选连结1411中的样品流体改变流
动方向。在一些实施方案中,微流体检测仪可以是细胞分选仪,并且包括一个或多个集成的压电致动器。微流体检测仪包括压电致动器,压电致动器可在低电压(例如,不到10Vp-p)
下操作。在瞬时流量切换的实验中,压电致动器可以被操作,以便以相对高的频率(例
如,~1.7kHz)来改变流动流,并且可以精确地控制流中的细胞/颗粒的偏转量。在一些
实施方案中,可通过压电致动器以受控的方式单独分选所关注的变化大小、形状和密度的
颗粒。使用大肠杆菌偏转作为例子,正弦电压可以330个细胞/秒的速度偏转细胞,并显
示出与理论一致的高度可重复的操作。在一些实施方案中,使用特别设计的空间滤波器和
在FPGA中实施的实时信号处理算法,能够以低误差率和70%左右的分选效率来构建闭环
分选系统。与其他microFACS系统相比,本文所公开的微流体检测仪(即,分选系统)的这
些实施方案具有许多优点。例如,空间滤波器设计与实时信号处理算法可以将信噪比增强
18dB并且允许验证分选。
[0179] 在一些实施方案中,相比芯片外机械致动器(如单向阀和注射泵),PZT致动分选模块消耗小的功率(例如,0.1毫瓦),在低电压下(例如,<10Vpp)工作,并且具有更快的
响应(例如,0.1-1毫秒)。在一些实施方案中,基于FPGA的电子控制可以实现实时信号放
大、用户定义的延迟时间、可编程输出波形和低定时抖动(例如,<10微秒)。在一些实施方案中,这些特征可以显著有助于可以以单颗粒水平进行高流通量颗粒分选的低成本分选。
[0180] 在一些实施方案中,检测仪系统可包括被联结到输入流体通道以从输入流体通道中的样品流体接收光的颗粒检测模块1412(图14)。可以从光源(如激光器或其他光源)
获得光,并且光可被导向而照亮输入流体通道中的样品流体。这种对样品流体中的颗粒的
照射可以促使通过颗粒产生光。这样,颗粒检测模块1412可以从所接收的光产生一个或多
个第一光信号,至少指示在由颗粒检测模块检测出的样品流体中的颗粒的速度。在一些实
施方案中,颗粒检测模块1412可以包括从所接收的光产生不同的光信号并以不同代码编
码不同的光信号的编码结构。这种编码可以是基于空间的代码或基于时间的代码,并允许
使用单个光学检测仪,以检测微流体检测仪中的多个光信号,例如,来自微流体检测仪的不同位置的不同的光信号。在一些实施方案中,可以提供光电检测仪1420(如PMT和/或
崩(avalanche)光电二极管),以从颗粒检测模块1412接收一个或多个光信号,或来自微流
体检测仪1400中的其它位置的光,以产生携带由所接收的光携带的信息的检测器信号。在
一些实施方案中,所接收的光中的信息可以通过处理来自光电检测仪1420的检测信号而
被提取出来,用于各种目的,包括控制致动器以及在颗粒分选连结中相应的分选。
[0181] 在图14的实施方案中,颗粒分选控制模块1424被设置成与颗粒检测模块联通,以接收检测信号,并与致动器联通,以将分选控制信号发送到致动器。在一些实施方案中,颗粒分选控制模块1424可以包括信号处理机构,其通过处理适当的处理技术(例如通过使
数字信号处理(DSP)电路)处理检测信号,从检测信号中提取出信息。当光学信号被编
码时,信号处理机构可以基于不同的光信号中的不同的代码来处理检测信号,以分离由不
同的光信号所携带的信息。颗粒分选控制模块1424也可以包括产生控制机构,其基于所提
取的信息产生分选控制信号,包括在颗粒检测模块处检测到的颗粒到达颗粒分选连结的定
时。
[0182] 在图14的实施方案中,不同的分支微流体通道1410A、1410B和1410C联结到颗粒分选连结1411,以接收来自颗粒分选连结的分选颗粒。
[0183] 在图15的实施方案中,在颗粒分选连结1511下游中的一个或多个分支流体通道1510A-1510C中,微流体检测仪1500包括光学检测机构(例如,附图标记1514A-1514C,在
下面更详细描述)。在一些实施方案中,使用在微流体检测仪的预定分选位置的光学感测
(optical sensing)和在后分选位置的光学感测的组合可以用来为更高效的流式细胞术测
量提供更好的控制操作。在所示实施方案中,后分选感测可以用来验证是否由颗粒分选连
结1511中的致动器适当地执行所需的颗粒分选。在所示实施方案中,后分选感测可用作用
于操作后分选阀的输入(见下文实施方案)。
[0184] 在一些实施方案中,图15的实施方案包括分支验证结构(例如,1514A),其被联结到分支流体通道中的一个(例如通道1510A),以从一个分支流体通道接收光,并产生分支验证光信号,其可用于验证是否靶颗粒由致动器导向到一个分支流体通道中。在某些实施
方案中,可以实施两个或多个这样的分支验证结构。在图15的实施方案中,所有三个分支
流体通道1510A-1510C具有这样的验证检测模块1514A-1514C。在其他实施方案中,一些分
支可以具有这样的验证结构,而其他分支可以没有。
[0185] 在图15的实施方案中,光电检测仪1520定位成接收光,其包括从颗粒检测模块1512的至少一个或多个光信号以及来自验证检测模块1514A-1514C的分支验证光信号。
在一些实施方案中,光学检测仪产生携带包含在所接收的光中的信息的检测信号。颗粒分
选控制模块1524中的信号处理机构提取分支验证光信号的信息,以产生验证靶颗粒是否
被致动器导向到这一个分支流体通道中的指示。在一些实施方案中,这种验证可以被自动
反馈到颗粒分选控制模块1524,其可响应于分选中的故障的验证来中断系统操作(例如,
停止引入样品流和致动器的分选操作)。在一些实施方案中,可通过颗粒分选机控制模块
1524生成警告信号(例如,视觉信号如弹出警告和/或闪光、音频信号诸如嘟嘟声等),以
提醒微流体检测仪的操作者,分选中发生故障。
[0186] 传统的流式细胞术系统的限制是使用多个光电倍增管,分别检测处于不同荧光波长的光信号。在这种系统中存在多个光电倍增管,使得微流体检测仪的设计复杂化、增加了成本并使得系统笨重。在一些实施方案中,如本文公开的微流体检测仪可以在多个不同的
光学信号中提供信号编码,使得以独特和相互不同或正交的代码来编码不同的光信号。在
一些实施方案中,这些光信号可以在一起被多路复用,用于由单个光学检测仪的光检测,并且可以基于独特和相互不同或正交的代码,通过去复用(demultiplexing)分离由不同的
光信号所携带的信息。可以通过数字信号处理来执行去复用。
[0187] 图16A和图16B的实施方案示出实施此类信号编码的两个微流体检测仪的例子。
[0188] 如图16A所示,联结到输入流体通道1604的颗粒检测模块1612构造成包括从所接收的光产生不同的光信号并以不同代码编码不同的光信号的编码结构。在一些实施方案
中,如图所示,光学编码器1612A、1612B被示为这样的编码结构的例子。光学编码器1612A产生具有第一代码的第一光信号#1,并且光学编码器1612B产生具有不同于第一代码的第
二代码的第二光信号#2。在一些实施方案中,光电检测仪1620接收不同的光信号,以产生
携带不同的光信号的信息和不同代码的检测信号。在一些实施方案中,颗粒分选控制模块
1624的信号处理机构(例如DSP),基于不同的光信号中的不同代码,从检测信号提取不同
光信号的信息。在一些实施方案中,在颗粒分选控制模块中的控制机构基于所提取的信息
产生分选控制信号,包括在颗粒检测模块处检测到的颗粒到达颗粒分选连结的定时。
[0189] 如图16B所示,另外的光编码器被设置在微流体检测仪1600',以允许相同的光电检测仪1612'检测编码后的光信号。另外的光学编码器1614A'和1614C'分别被示为分支
流体通道1610A'、1610C'中的编码结构的例子。在一些实施方案中,光编码器1614A'产生
具有与第一和第二代码不同的第三代码的第三光信号#3,并且第四光学编码器1614C'产
生具有与所有其他三个代码不同的第四代码的第四光信号#4。在一些实施方案中,光电检
测仪1620'接收不同的光信号#1-#4,以产生携带不同的光信号#1-#4的信息和不同代码的
检测信号。在图16B中,当每个光学编码器1614A'和1614C'被实施为分支验证结构时,第
三和第四光学信号可以是分支验证光信号。在一些实施方案中,光电检测仪1620'接收光
信号#1和#2以及分支验证光信号#3和#4。
[0190] 图16C的实施方案显示出在图16B中的实施方案的信号检测和处理。在一些实施方案中,由单个光电检测仪1620'执行信号检测,单个光电检测仪1620'接收所有四个光信
号#1-#4的光,它们在一起被多路复用,作为输入光,被转换成携带多路复用的信号#1-#4
的检测信号。在一些实施方案中,在模数转换之后,DSP单元(例如,诸如可以是颗粒分选
控制模块1624'的一部分)用于基于它们的独特的代码来处理复用信号并分离四个不同的
信号。
[0191] 在某些情况下,微流体检测仪中的光学编码和解码以用单个光学检测仪基于通过光信号结构(如图16A-16C所示的光学编码器)的信号编码的光学询问方法为基础。在一
些实施方案中,这种方法可以包括将光导向到被联结以形成流体通道的网络的一个或多个
流体通道,以照亮通过流体通道携带的流体,以及提供光信号结构,该光信号结构分别联结到在不同的位置处的至少一些流体通道,以从照亮流体的光产生光信号。在一些实施方案
中,每个光信号可以携带指示出在相应的光信号结构的位置处、在流体中携带的颗粒的性
质的信息。在一些情况下,光信号结构被构造成以分别在彼此不同的光信号中产生独特的
代码。在一些实施方案中,这种方法可以使用单个光电检测仪,以收集在光信号结构处产生的所有的光信号,以响应于所收集的光产生电检测信号。在一些实施方案中,可以基于光信号中的独特的代码来处理电检测信号,以分离由光信号携带的信息,从而提取由每个光信
号携带的信息。
[0192] 在一些实施方案中,微流体检测仪可以基于颜色-空间-时间(COST)利用信号的编码和解码,以支持使用单个检测仪以及更特别是在一些实施方案中,使用单个光电倍增
管(PMT)或单个光子雪崩检测仪(SPAD)或雪崩光电二极管,检测多个(例如,20个或更多)
荧光波长。在一些实施方案中,使用芯片上实验室技术和架构实施微流体检测仪。在一些
实施方案中,这种结构的简单版本(其可以被称为空间-时间编码)也被提供,以允许进行
多点检测以及因而产生“验证信号”,以实时记录分选效率和准确度。
[0193] 以下实施方案包括方法、系统和/或装置,其包括例如使用芯片上实验室微流体检测仪内的单个检测仪,进行多种荧光波长的COST编码检测。微流体检测仪可以包括芯片
上实验室荧光激活细胞分选仪(FACS)或芯片上实验室流式细胞仪。这样的实施方案可以
被认为是空间-时间编码的扩展,它被修改,以包括通过在向检测仪发出荧光的波导中合
并颜色染料的颜色编码。在一些实施方案中,适当选择染料并校准吸收光谱,可以通过颜色滤波器波导被使用单个检测仪(例如PMT或SPAD)来检测二十个或更多的荧光波长。虽然
在一些实施方案中,彩色波导/滤波器被集成在芯片上,以实现COST编码检测。在一些实
施方案中,也可以实现使用不集成于芯片的一个或多个外部颜色滤波器的COST构思。在一
些实施方案中,当在单次使用或几次使用后处置芯片时,(多个)颜色滤波器没有(或不需
要)被处置。
[0194] 在一些实施方案中,微部件体检测仪包括一或多个另外的部件和/或特征。在一些实施方案中,这些可以包括例如聚焦光的集成透镜阵列并缩短询问分区,以提高检测流
通量。在一些实施方案中,这些特征可包括流扰动最小化、三维流动限制和/或级联分选策略,以实现在最小的细胞损失下的>1M的富集因子。在某些情况下,这些特征可包括具有实时电子控制和信号处理算法的系统集成架构,以协调检测和分选、提高灵敏度和最小化分
选错误。在一些实施方案中,COST方案提供了集成的光流体溶液于多色检测,从而构建具
有比现有的商业系统更小的数量级、更轻和/或更便宜的结构的微流体检测仪。
[0195] 在一些实施方案中,微流体检测仪包括微流体通道,以及构造成基本上传送所有可见光成分并且具有靠近微流体通道的第一端的第一光传送结构。微流体检测仪还可以
包括具有靠近微流体通道的第二端并且基本上沿着第一光传送结构延伸的至少一个第二
光传送结构,其中所述至少一个第二光输送结构构造成传送可见光成分的至少一个子集。
在一些情况下,微流体检测仪还包括光感测装置,其布置成靠近每个光传送结构的相应的
另外的端部,相应的另外的端部分别与相应的第一和第二端部相对。从通过微流体通道的
材料发出的光的相应部分被相应的光传送结构所接收,并且从而至少部分与光感测装置通
讯,由此可基于由光感测装置输出的一个或多个信号确定通过微流体通道的材料的指示。
[0196] 另外,在一些实施方案中,执行流式细胞术的方法包括:注入第一光,使其进入材料所通过的微流体通道中,以及从微流体通道接收第二光送入多个波导,其中波导中的第一个对基本上所有可见光成分是传导性的,而波导中的第二个对可见光成分的子集是传导
性的。在一些实施方案中,该方法还可以包括:通过从波导的相应的第一端部到波导的相应的第二端部通过第一和第二波导传送第二光的第一和第二部分,将所传送的第二光的第一
和第二部分每一者的至少一些光传递至光电检测仪,并且输出来自光电检测仪的颜色-空
间-时间信号。
[0197] 进一步地,在一些实施方案中,执行流式细胞术的方法可包括:注入第一光,使其进入材料所通过的微流体通道中,以及从微流体通道接收第二光送入多个滤波器,其中滤波器中的第一个对基本上所有可见光成分是传导性的,而滤波器中的第二个对可见光成分
的子集是传导性的。在一些实施方案中,该方法还另外包括:将所传送的第二光的第一和
第二部分每一者的至少一些光传递至光电检测仪;并且输出来自光电检测仪的颜色-空
间-时间信号。
[0198] 图17示出微流体细胞检测仪1702的示意图。在一些实施方案中,微流体检测仪1702包括产生激光并将光提供到多模光纤1706的激光器1704。在一些实施方案中,多模
光纤1706又将光导向微流体通道1710(由箱1708示意地示出)。在一些实施方案中,微流
体通道1710的内部组件的图像1712还与箱相邻设置,并且在下面会进一步详细说明那些
内部元件。在光被提供到微流体通道1710之后,光与通过该装置的微流体通道(下面进一
步描述)的细胞或其它材料或物质相互作用,并且作为该相互作用的结果,得到的光从微
流体通道1710提供到感测光的光电倍增管(PMT)1714。当感测光时,PMT 1714又将指示感
测的光的信号输出到National Instruments的基于LabView的软件1716(购自美国德克
萨斯州奥斯汀的National Instruments公司),这又将数据提供给个人计算机1718(尽管
在图14中提供出代表物,但软件1716也可以被认为是在个人计算机上实施的)。
[0199] 在图17的实施方案中以及在至少一些其它实施方案中,通过应用颜色-空间-时间(COST)编码技术来实现对多个参数的检测。当多个参数检测可以检测从本文所述和所
示的任何实施方案的微流体检测仪1710发出的光的12个或更多个不同的荧光波长时,它
引起更大的兴趣。在图17的实施方案中,微流体检测仪1710可以支持使用单个检测仪检
测从微流体检测仪发出的光的多个(例如,20个或更多)荧光波长。单个检测仪可以根据
实施方案而采取不同的形式,虽然图17示出光电倍增管1714作为单个检测仪,而在其它实
施方案(未示出),检测仪可以采取其他形式,例如,单光子雪崩检测仪(SPAD)。
[0200] 在一些实施方案中,激光光源1704可包括405/488纳米(或蓝光标准)的激光器。在一些实施方案中,可以使用各种其他激励激光器(例如,处于630-650纳米的激光器和/
或通过如Nichia、Sony、Xerox、Omicron等各公司制造的其它激光器)。在一些实施方案
(例如,图17的实施方案),微流体细胞检测仪1702或至少它的某些部分(例如,微流体检
测仪1710)可以是采用芯片上实验室技术平台的装置,它取代了具有集成光学器件的大量
光学器件。
[0201] 图18是微流体检测仪1710的设计的示例性图示,其中编码结构包括:具有沿输入流体通道的感测区域1840的多个光学孔径的光学孔径结构1860,以及经由在结构1860中
的光学孔径从感测区域1840接收光的光波导1852、1854、1856和1858。流过感测区域1840
的样品流体中的颗粒1898(例如,细胞)发射光,所述光在不同的时间依次通过沿着输入流
体通道处于不同的位置的光学孔径。可以通过光检测仪(例如,PMT,如光检测仪1714)收集由波导1852、1854、1856和1858接收到的光。波导1852可传导由颗粒1898发射的所有波
长的光。波导1854、1856和1858是光学滤波器波导,具有分别集中于不同的中心传输频率
的光传输带。波导1854、1856和1858在不同的时间可以产生不同的过滤的光传输信号,其
具有集中在不同的中心传输频率(例如,红色、绿色和蓝色的波长)的不同的光谱带,以被
光检测仪接收。在一些实施方案中,波导1854、1856和1858构造成具有在分别集中在不同
的中心传输频率的光学传输带中具有光谱重叠。因此,传输红色中心波长的红色波导1854
也会传输绿色波长的一些光和蓝色波长的一些光;传输绿色中心波长的绿色波导1856也
会传输红色波长的一些光和蓝色波长的一些光;并且传输蓝色中心波长的蓝色波导1858
也会传输绿色波长的一些光和红色波长的一些光。在此设计中,信号处理可基于在每个不
同的过滤的光传输信号中的重叠的光谱信息,以改进信号处理的保真度。例如,人的视觉系统基于来自眼睛中的红、绿和蓝色感受器或视锥细胞的具有重叠光谱范围的信号进行的成
像处理可以被建模用于上述装置中的信号处理。
[0202] 图19A更详细地示出微流体检测仪1910的部件。如图所示,在一些实施方案中,微流体检测仪1910可包括微流体通道1920,通过该微流体通道1920,悬浮在流体中的颗
粒、细胞或所关注的其他物质可以通过。微流体通道1920在第一端1922被分别联结到第
一、第二和第三进入孔口或端口1924、1926和1928,而在第二端1932被分别联结到第一、第二和第三出口/出口端口1934、1936和1938。在微流体通道1920的其两端1922、1932中
间的采样区域1940,设置有另外的波导结构1950。在图19B中更详细地示出另外的波导结
构1950以及采样区域1940中的微流体通道1920。至少在一些实施方案中,微流体检测仪
1910可以由于其低制造成本而被认为是一次性的。
[0203] 在图19A-19B的实施方案中,为了改善作为芯片上实验室装置的微流体检测仪1910的可靠性和可重用性,微流体通道1920(在一些实施方案中)由聚二甲基硅氧烷
(“PDMS”)制成,并且在一些实施方案中,PDMS的与流体接触的表面(例如,通道的内表面)被进一步涂布有薄、光滑、均匀的无定形特氟隆(例如,特氟隆AF),特别是具有比水(~
1.33)还低的折射率(例如,~1.31)的特氟隆涂层。在一些实施方案中,使用特氟隆涂层
减轻了与PDMS的孔隙率和渗透特性(当用小分子处理时,可尤其呈现出这方面的担心)相
关的担心(其可以由各种基于PDMS的微流体装置呈现)。
[0204] 除了上述益处,采用特氟隆涂层的微流体通道1920的另一个益处可以是,它有助于另外作为低损失的光波导的微流体通道的操作。也就是说,在本实施方案中,通过使用特氟隆涂层的微流体通道1920,在操作期间,(例如,从多模光纤,例如多模光纤1706)进入微流体检测仪1910的光1946通常被导入微流体通道1920并且在微流体通道1920内(由箭
头1948所表示的)被导向朝向并进入微流体通道1920的采样区域1940。在到达采样区
域1940时,光1946撞击细胞或感兴趣的通过微流体通道的其它物质,并导致荧光被发射出
来,其中一些或所有的荧光进入沿微流体通道1920/采样区域1940的1944侧布置的另外
的波导结构1950。
[0205] “芯片上实验室的技术”的(图19A-19B的)上述实施方案允许沿着流动通道设多个检测点,以提高灵敏度和抑制噪声。在一些微流体检测仪结构中,来自光源(诸如激励的激光源)的光受到动力分离损失的影响。换句话说,如果细胞(或其它所关注的物体)通
过几个(例如四个)不同的光学询问分区中,激励激光器的功率可以在这些分区(例如,4
分)中的每一个分区处被分开,这会导致过多的分离损失(例如,6dB分离损耗)。与此相
反,使用采用了特氟隆涂层微流体通道20的上述实施方案,传导的细胞(或其它所关注的
物体)的通道也用作激励光导性波导,因此能够实现如下面进一步讨论的多点光学询问。
同时,被引导的光的光强度比密集聚焦的激光束点的更低,以避免光漂白的效果。
[0206] 另外参考图19B,微流体检测仪1910通过采用从微流体通道1920的采样区域1940向外延伸的另外的波导结构150实现多点光学询问。如图所示,那么另外的波导结构
1950不仅仅包括单个波导,而是示出为分别包括第一、第二、第三和第四横向的波导1952、
1954、1956和1958。另外的波导结构1950的每个波导1952、1954、1956和1958,在定位于
另外的波导结构的第一端1962处的第一滤波器结构1960(处于波导1952、1954、1956和
1958与采样区域1940之间)与定位在另外的波导结构的第一端相对的第二端1965处的第
二滤波器结构1964之间延伸。
[0207] 在一些实施方案中,波导1952、1954、1956和1958中的每个波导具有各自不同的颜色。更具体地,第一波导1952可以是透明的,没有特定的颜色(例如,无色),而第二波
导1954、第三波导1956和第四波导1958可以分别是红色,绿色和蓝色。因此,当第一波导
1952是能够在可见光光谱内传输光的全部(或基本上全部)成分(例如,在约380纳米至
750纳米范围内的波长的所有光成分,或“白色光”),其他波导1954、1956和1958趋向于
仅分别传输红色、绿色和蓝色光分量,其他彩色光成分都被部分过滤掉。因此,波导1952、
1954、1956和1958也可以考虑作为光学滤波器。第一滤波器结构1960包含有多个模块特
征1966,其为黑色或变黑/变暗,并且可以限制光从采样区域1940行进到波导1952、1954、
1956和1958的能力。进一步,相对于第二滤波器结构1964,这个结构还包括模块特征1968,其为黑色或变黑/变暗,并且限制光行进离开波导1952、1954、1956和1958以及离开微流
体检测仪1910朝向PMT(如PMT1714)的能力。具体地,特征1966、1968用于增加对比度
且减少串扰,并且还用作用于光学分离的光束模块。
[0208] 通常情况下,理想的是小心优化和表征各种波导1952、1954、1956和1958(特别是波导1954、1956、1958),以获得所需的操作。为了建立红、绿和蓝波导1954、1956、1958,以及滤波器结构1960和1964,红色、绿色、蓝色和黑色颜色的染料分别注入横向波导和滤波器结构。在一些实施方案中,彩色染料可以是油溶性的,并且能够与高折射率PDMS(例如,n=1.42-1.46)混合,以形成彩色光波导/滤波器结构。高折射率的PDMS预聚物填充波
导通道,其使用低折射率(n=1.41)PDMS形成。通过适当选择彩色染料或不同染料的混合
物并且通过校准吸收光谱,波导1954、1956、1958可分别具有各自所需的传输光谱。在本实施方案中,为了覆盖最大数目的波长,三种颜色滤波器的中心波长应发生在约510nm、570nm以及640nm处。
[0209] 在一些实施方案中,红、绿和蓝(RGB)波导(其如上所述也可以考虑光学滤波器)1954、1956、1958中的每一个,可以设计成显示传输特点随波长的逐渐变化(而非急速
截止)。如果一个单一的染料不能产生所期望的光谱响应,也可以使用染料的混合物。此外,通过适当地着色/变暗滤波器结构1960、1964的特征1966、1968,以及适当地选择这些特征的形状和布置方式,光可以适当地从采样区域1940被导向到波导1952、1954、1956、1958以及导向离开波导朝向PMT(例如光电倍增管1714)。在选择颜色滤波器的设计之后,光学设
计软件(例如ZEMAX(如购自Washington,Belleview的Zemax Development公司))可以
用来进一步设计COST编码微流体检测仪(例如微流体检测仪1702)。
[0210] 仍参照图19B,在本实施方案中,彩色/黑色染料由输入孔口和通道被注入到波导1954、1956、1958和滤波器结构1960、1964,从这些输入孔口被引伸向波导/滤波器结构。在流体注射后,所有的PDMS预聚合物被热固化,以得到波导/滤波器结构。为了避免固化期
间形成间隙或空隙,固化是在真空中进行的。更具体地说,如图所示,黑色通道1970在黑色输入孔口1972和每一滤波器结构1960、1964之间引伸,因而在孔口处输入的黑色染料能够
进入滤波器结构1960、1964并形成其特征1966、1968。此外如图所示,分别地,红色、绿色和蓝色通道1974、1976和1978分别从红、绿、蓝输入孔口1984、1986和1988分别引伸向红
色、绿色和蓝色波导1954、1956和1958,并且因此相应的红色、绿色和蓝色染料可经由各个孔口和相应的关联通路注入相应的波导。同样地,无色通道1980在无色输入孔口1982和
波导1952之间引导,以允许无色染料被提供给该波导。
[0211] 另外,图19B还包括图19B的第一、第二和第三插入图像1990、1992和1994,其进一步示出了另外的波导结构1950和采样区域1940。更具体,第一插入图像1990更清晰地
显示出第一滤波器结构1960的特定特征1966,其布置在采样区域1940和波导1952、1954、
1956和1958之间。如从插入图像1990显而易见的,特征1966(其又被变黑/变暗,以限制
光从中通过)通常被定位在波导1952、1954、1956和1958中相邻的两个之间,除了两个小
的特征1996被定位在采样区域1940和波导1952之间。至于第二插入图像1992,该图像分
别具体地显示了通道1980和1978分别耦合到波导1952和波导1958。进一步,相对于第三
插入图像1994,该图像分别显示出通道1974和1976分别耦合到波导1954和波导1956,以
及通道1970耦合到第二滤波器结构1964。
[0212] 转到图20A,提供采样区域1940和另外的波导结构50的一部分的示意性图示,即,波导1952、1954、1956和1958,第一滤波器结构1960(其包括第一滤波器结构1960的特征1966),以及第二滤波器结构1964(其包括第二滤波器结构1964的特征68)。图20A还示出
了所关注的物质,在此实例中,通过微流体通道1920的采样区域1940的细胞1998。通过如
图由细胞1998的不同阴影所示,一些不同的细胞已被用不同的染料进行了荧光标记,例如
当这些不同的细胞被光1946照射(如图19A)时,不同细胞给出不同颜色的光,其适合于传
输通过这些不同的波导1952、1954、1956和1958(所有的不同颜色的光被波导1952传导)。
[0213] 应当理解的是,根据该实施方案,另外的波导结构1950可以由多个材料层形成。另外分别地参考图20B和20C,分别地显示出沿着图17A中的线B-B、C-C截取的另外的波
导结构1950的层的实例。在本实施方案中,图20B和20C具体地显示出通道1970、1974、
1976、1978和1980,通过这些通道,彩色或黑色的PDMS预聚物被引入波导1952、1954、1956和1958,并且滤波器结构1960、1964处于与检测平面不同的层,沿着检测平面,那些波导/滤波器结构存在(沿着检测平面,检测的光通过)。
[0214] 更具体地,图20B显示出另外的波导结构1950的剖视图,特别是处于滤波器结构1960的位置。如图所示,该滤波器结构1960形成为处于顶部PDMS层2102和底部PDMS层
104之间的空腔。更具体地,滤波器结构1960包括定位在特征1966上方的隧道区域2110,
特别作为滤波器元件。隧道区域2110,其位于特征1966上方(并且与特征位于底部PDMS
层2104内相比,特征更多位于顶部PDMS层2102内),将输入孔口2112连接于这样的特征
中的每一个,使得在孔口处输入的黑色染料能够进入并形成特征1966。应当观察到,隧道
区域2110和输入孔口2112可以被理解为对应于(和用于)黑色通道1970和黑色输入孔
口1972,如上关于图19B所述的,虽然这些结构的布置方式在图20B中相对于图19B略有不
同。
[0215] 类似地,图20C显示出另外的波导结构1950的剖视图,仅波导1952、1954、1956和1958(而不是滤波器结构1960)位于波导结构1950处。如图所示,在显示的特定位置(对
应于图20A的C-C线),所有波导1952、1954、1956和1958呈现,定位于顶部PDMS层2106
和底部PDMS层2108之间。此外,隧道区域2114被示出定位在波导1952上方(即,并且与
位于底部PDMS层2108内相比,更多位于顶部PDMS层2106内,在底部PDMS层2108内定位
有波导1952、1954、1956和1958),用于连接该波导与输入孔口2116。应当观察到,在隧道区域2114和输入孔2116可以被理解为对应于(并用于)通道1980和输入孔口1982,如
上关于图19B所述,虽然这些结构的布置方式在图20C中相对于图19B略有不同。还应当
指出的是,尽管相应的隧道区域和输入孔口可以相对于波导1952、1954、1956和1958设置
(如已经相对于图19B所讨论的)。
[0216] 再看图21中的实施方案,更详细地说明微流体检测仪执行空间-时间编码和COST编码的操作。首先参照图21A中的实施方案,微流体检测仪2120的简单的设计被示出,其
仅执行空间-时间编码。如图所示,微流体检测仪2120,与上面和下面进一步讨论的微流体检测仪相反的是,仅具有远离微流体通道2126的侧面横向延伸的三无色光波导2122的阵
列,而从微流体通道2126的采样区域2124接收由细胞2118给出的被滤波器区段2128过
滤的荧光。更具体地,荧光细胞2118中的一个以10cm/s到100cm/s的典型速度通过通道
2126。在本实施方案中,细胞2118沿其在由上述讨论的特氟隆涂层方法实现的光-流体共
同传播构造中的路径被光激发。
[0217] 波导阵列的三个波导2122的每一个传导光远离微流体通道2126,如箭头2128所示,并将它们的光输出提供到单个PMT检测仪。因此,当细胞2118中的一个细胞沿微流体
通道2126行进,依次通过波导阵列的波导2122,由行进时间上分离的三个连续的峰经由
PMT被检测,从而将空间信号(代表细胞位置)转换成空间-时间编码输出信号或时域信号
2130。使用数字匹配滤波器匹配时域信号的波形,操作者可以抑制噪声,并且获得每个单独的细胞的行进速度,从而确立了下游分选的定时。此外,如果操作者选择沿其路径多次询问细胞2118的给定细胞(例如,过采样,以提高信噪比或验证细胞是否被分选到右通道),也
可以改变编码模式,以便在每个点处检测所得到的时域信号可以用对应的匹配滤波器来提
取。
[0218] 转到图21B,COST编码通过利用另外的横向波导改进时间-空间编码,另外的横向波导包括彩色波导,诸如波导1954、1956、1958,如上所述。如图所示,利用微流体检测仪(例如检测仪1702),响应于来自采样区域40的荧光由另外的波导结构1950向PMT提供的
输出信号(例如,PMT1714)现在是颜色-空间-时间(COST)编码信号2132。同样,波导
1952年是无色的,因此作为“全通”波导,而其它波导1954、1956、1958,对应于这些波导的着色,仅通过特定颜色的光。因此,COST编码信号2132包括:白色光信号部分2132,其代表从波导1952发出的各种光分量,可以用于确立总体荧光强度的参考;以及颜色编码信号部
分2134,其代表从波导1954、1956、1958发出的特定颜色。假设每种荧光波长具有约30nm
的光谱宽度,并且三个颜色滤波器波导1954、1956、1958分别在510nm、570nm和640纳米处具有它们的最大传输的波长,则估计可以使用单个检测仪(例如,光电倍增管1714)来检测
超过20种荧光波长。
[0219] 尽管波导1952如上描述为单个的透明的波导,与图21A所示的波导2122的阵列同样地,波导1952还可以包括形成整体波导阵列的多于一个波导。另外,由于在颜色滤波
器中的非荧光染料并未处于激励激光器的路径中,所以背景荧光未虑及。
[0220] 上述COST技术在系统功能性和成本方面提供显著益处。另外,假定特定的设计限制,该技术也符合令人满意的装置流通量。具体地,假定整个横向波导分区占据100微米
(宽度)并且细胞以50厘米/秒行进,在采样分区1940内,通过光学询问分区(即由另外
的波导结构1950的最外层波导1952、1958的最外边缘所限定的分区)的时间是0.2毫秒。
这限制了检测流通量为2000至5000个细胞/秒或为10M个细胞/小时的量级。虽然这对
于一些应用可能是令人满意的数目,但在其他应用中仍有所不足。因此,为了进一步提高流通量,进一步提出,在某些实施方案中用平面内透镜来实施COST设计。在这样的集成透镜
的方案,透镜阵列产生一系列彼此分开小于5微米的焦斑,从而将询问分区的总宽度减少
到大约25微米的。因此,通过COST区域行进的时间改为小于50微秒。这样的设计可以潜
在地增加流通量至20-30K/s或约100M个颗粒每小时。
[0221] 取决于实施方案,另外的结构可以用来进一步增强微流体检测仪的性能。例如,在至少一些实施方案中,棱镜和其它结构可以如例如在美国专利申请12/152665(提
交于2008年5月14日,题为“用于流式细胞术的系统和方法”)、美国临时专利申请
61/068,198(提交于2008年3月5日,也题为“用于流式细胞术的系统和方法”)、以及另一
美国临时专利申请60/917,848(提交于2007年5月14日,题为“光输送装置”)所述中使
用,上述文献中的每一个在此通过引用的方式并入本文。
[0222] 在图21A中,当荧光细胞以10cm/s到100cm/s的典型速度行进通过通道,细胞沿着其在光-流体共同传播构造中的路径被光激发。横向于流体通道的是三个孔径的阵列,
其将它们的光学传输馈送至单个PMT检测仪。随着细胞横跨这个三个孔径阵列行进,检测
到行进时间分离的三个连续的峰,从而将空间信号(即,细胞位置)转换成时域信号。使
用数字匹配滤波器来匹配时域信号的波形,则信号中的噪声可以被抑制,以获得每个单独
的细胞的行进速度,从而确立用于下游分选的定时。如果细胞沿其路径被多次询问(例如,过采样,以提高信噪比或验证单元是否被分选到右声道),编码模式可以被改变,使得可以通过使用相应的匹配滤波器提取在每个检测点所得到的时域的信号。图22显示出在上游
检测区域空间-时间编码信号(111),接着在分选后的下游是另一个空间-时间编码信号
(1011),验证分选已成功执行。第一信号(111)代表当珠通过检测分区的检测到的荧光。在分选后,以大约3.5毫秒落后于第一信号的第二信号(1011)指示珠已经正确地切换到分选
通道。
[0223] 多参数的芯片上检测和细胞分选需要由实时电子系统控制以良好协调的方式起作用。灵敏度、延迟和定时抖动是好的电子控制系统需要解决的三个关键问题。灵敏度取决于装置本身的质量和嵌入到电子系统中的实时信号处理能力的有效性。延迟是完成计算的
算法所需的时间量。定时抖动是延迟中的变化。控制电路架构可以在模拟电路、微处理器专用集成电路(ASIC)等中实施。因为在模拟电路中实施先进的信号处理算法的难度、以及
微处理器的会产生长延迟和大定时抖动的有限的计算能力,可实施ASIC方案用于控制电
路。例如,National Instruments公司的CompactRIO系统提供具有实时操作系统(RTOS)
的完整的嵌入式系统,实时操作系统在微处理器和现场可编程门阵列(FPGA)上运行,后者
基本上是极具成本效益的专用集成电路的类型。该系统可用于控制。
[0224] RTOS提供了装置驱动程序来访问以太网连接芯片和TCP/IP协议栈,用于互联网联通。这种连接对于用于从CompactRIO系统获得数据反馈和用于控制实时硬件是重要的。
实时算法可以在FPGA中实施,并且定时抖动预计小于10微秒。在一些实施方案中,电子控
制至少提供以下功能:(1)增加信噪比(SNR),以提高检测效率,(2)瞬时细胞速度估计,以提高分选精度,以及(3)通过波形发生器来产生分选信号。
[0225] 在图23中所示的实时处理控制单元包括检测区段2304和控制区段2306。对细胞检测使用专用硬件可以帮助实现低的定时抖动,并且准确地控制检测到细胞通过与用合成
波形激励致动器之间的定时,以优化单细胞分选。
[0226] 为了增加细胞检测的精度,三种形式的影响灵敏度的噪声可以在设计检测电路时被考虑且被处理:(1)检测电路的热噪声,也就是近高斯白噪声(WGN),(2)光电倍增管或
SPAD暗计数噪声,和(3)因激光器功率波动和杂散光而起的低频噪声。理解噪声光谱的特
点,可以使用上述空间-时间和COST的设计产生信号,使得信号频带具有与噪音光谱最小
的重叠。在WGN条件下,可以利用匹配滤波器(具有与信号波形成反比的响应的滤波器)
的设计来实现最高S/N比。图24A-24B示出由有限脉冲响应(FIR)实现的匹配滤波器。
[0227] 图24A显示出FIR滤波器的基本结构。这被用作可编程的匹配滤波器。图24B显示出由硬件实现的FIR滤波器。这种设计采用了特殊的硬件部件--双端口随机存取存储
器(RAM),它是可以同时读取和写入的RAM模块。双端口RAM是在Xilinx FPGA中的内置模
块。通过利用双端口RAM,可以实现非常高的采样速率的滤波器。
[0228] 在一些实现中,可实施实时细胞速度估计,用于高精度的单细胞分选。当流动细胞速度发生变化,从通过的细胞产生的信号也变化。如果在微流体通道中的细胞速度增加,则信号的持续时间变短。如果每一个细胞的速度以随机方式变化,则细胞的速度的变化可以被视为噪声的额外来源。它影响的S/N比和定时抖动(timing jitter)。可基于对每个细
胞的速度的知识来设计更有效的匹配滤波器,并且可以相应地编程匹配滤波器。所获取的
细胞速度的信息还可以用于调整高精度单细胞分选的定时控制。
[0229] 在频域分析中,不同的细胞速度可视为信号的频率响应的变化。细胞速度的增加加入了更多的高频分量的信号,如图25A中所示。因为用于不同的细胞速度的光谱
是不同的,滤波器组架构可以用来估计每个单个细胞的流速。这样,这样的包括滤波器
2502A-2502C的架构2500的一个例子示于图25B。例如(未示出),400个FIR滤波器的滤
波器组可用于以0.25厘米/秒的精度,实时地测量1厘米/秒至100厘米/秒的流速。图
25C还显示出根据一些实施方案,用于基于滤波器组中滤波器的输出来估计细胞速度的方
法。
[0230] 在图16A-16C中使用的信号编码结构可以是除了图18-21B中所示的例子以外的各种构造。例如,图26A显示出使用具有不同孔间的间距的光学孔径,以形成不同的波束图案作为代码的信号编码结构的另一个例子。示出具有不同光学孔径的两个流体通道设计,
以提供两个信号代码。图26B显示出在时域中的来自两个通道的PMT信号。
[0231] 参照在图18、20A、20B和21B中的用于COST编码的光学滤波器的设计,用于波导1854/1954、1856/1956和1858/1958的宽带滤波是减少区分颜色所需的样品数目的机构,
例如,三个滤波器波导1954、1956和1958可用于区分20个不同的荧光波长,而无需使用20
个滤波器波导。这会大幅度降低成本。单个PMT可以与三个滤波器波导1954、1956和1958
关联使用,这是因为对来自进入PMT的不同波长的信息执行时间多路复用。例如,在图21B
的例子中,PMT首先接收通过波导1954的红光,然后是通过波导1956的绿光,然后是通过
波导1958的蓝光。这种时间多路复用利用了流和波导(或空间滤波器)。具有宽带滤波的
时间复用允许以高流通量检测颜色。
[0232] 图27显示了基于可编程FIR滤波器组的示例性DSP处理模块。DSP处理模块可以是例如如前所述的颗粒分选控制模块(例如,控制模块1424)的部件。
[0233] 在微流体检测仪和系统中,可以以各种构造来实施颗粒分选机构。以下实施方案公开了一种基于压电致动器的颗粒分选仪,压电致动器可被构造成以低电压(通常小于
10Vp-p的)操作,具有低功耗需求(通常小于0.1毫瓦),以及具有约0.1-1毫秒的快速的
响应时间和约1-10厘米/秒的颗粒流动速度。颗粒分选系统可闭环操作,其使用了空间滤
波器和处理技术,用于通过分析由检测仪输出的光信号来确定随时间的颗粒的存在。
[0234] 参照图28,示出了颗粒分选仪2800,用于分选流体中的颗粒。颗粒分选仪2800包括在致动区域2811连接到多个输出通道2810A、2810B和2810C的输入通道2804。颗粒通
过输入通道2804流到致动区域2811,并且每个颗粒从致动区行进至多个输出通道2810A、
2810B和2810C中的一个。
[0235] 压电致动器2818进行操作,以响应于控制信号(例如如图27所示的来自控制器或驱动器的电压控制信号),在致动区域2811中引起对流体的流动扰动。例如,如图所示
施加到压电致动器2818的正电压信号促使向下弯曲,而负电压信号促使向上弯曲。这种弯
曲使得在致动区域2811中产生流动扰动,特别是通过促使流体(以纳升的数量级)横向位
移。流体扰动将进入致动区域的颗粒沿着轨迹指引到输出通道2810A或2810C,其不同于输
出通道2810B,在输出通道2810B,颗粒将行进而不受到流动扰动。例如,如示于图28的下
部中,施加的正电压导致压电致动器2818向下弯曲,引起在致动区2811中的流体扰动,促
使颗粒2822改变其轨迹并且行进到左边至输出通道2810A。
[0236] 更完全地,图29A显示出在没有施加控制电压信号时,颗粒2824的行进,显示出颗粒行进到输出通道2810B。图29B显示出颗粒2826响应于施加的负电压信号行进到输
出通道2810C。类似地,图29C显示出颗粒2828响应于施加的正电压信号行进到输出通道
2810A。
[0237] 图30A-30C示出了颗粒分选仪2800的简单且低成本的制造,其通过UV臭氧与蚀刻聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片2830和玻璃基片2832结合在一起完成。PDMS基片2830已
经被蚀刻,以形成输入通道2804、输出通道2810A-2810C和致动区域2811。具体地,PDMS基片和玻璃基片的表面在UV臭氧室中用在254nm输出为28毫瓦的灯处理,并且在基片2830、
2832彼此物理接触时发生结合。
[0238] 使用第一层2836(如不锈钢)和第二层2834(如锆酸铅),形成压电致动器。锆钛酸铅的化学式为Pb[ZrxTi1-x]03,其中0压电效应的陶瓷钛矿材料。它也被称为PZT,这是化学式的缩写。接触垫2838提供用于横跨两个层施
加控制信号。
[0239] 通过首先在PDMS基片上形成孔(例如通过使用16毫米直径的冲头),然后将PDMS基片和压电致动器2818在UV臭氧中处理五分钟,将压电致动器2818集成到PDMS基片。然
后,致动器对准并与PDMS基片2830接触,然后在85℃下8小时烘烤分选仪2800。
[0240] 图31示出颗粒分选仪用于分选颗粒的能力,并且显示了由在致动区域中通过瞬时有限流体位移引起的若丹明的偏转。具体地,分选仪2800被安装在显微镜台上,附接高
速视频摄像机(video camera)用于可视化,并且给压电致动器2818的控制信号由函数发
生器提供。带有若丹明的流体被引入到通道中,提供250Hz、9V p-p的电压信号,并且获得视频。
[0241] 图32A-32C显示出实验获得的聚苯乙烯珠3228,并且图32D-32F显示出使用所示的不可压缩Navier-Stokes等式模拟的珠的轨迹3230。
[0242] 图33示出受到在200赫兹6Vp-p下的正弦控制电压信号作用的大肠杆菌细胞3328的分选。
[0243] 图34示出闭环颗粒分选系统2440,包括颗粒分选仪3400,其闭环操作,以在流体中从其它颗粒分选出所关注的颗粒。提供摄像机3441,用于可视化。颗粒分选系统还包括
具有一个或多个槽并且联结到输入通道的空间滤波器3442(见图35),以及一个或多个光
学滤波器3443。光源3444,如卤灯,提供将光输入至输入通道。检测仪3446检测到在输入
通道中从所关注的颗粒发射或散射的光,所述光已经通过空间滤波器3442的一个或多个
槽,并随时间提供检测信号。具有实施为现场可编程门阵列(FPGA)的一个或多个部件的处
理器和驱动器3450与检测仪3446联通,并操作以随时间分析检测信号。处理器和驱动器
3450可以与计算机3448联通,用于接收用户输入。处理器和驱动器3450还产生指示出在
输入通道中的预定位置通过的所关注的颗粒的存在的存在信号,并响应于该存在信号产生
用于压电致动器3418的控制信号。如上所述,压电致动器3418响应于控制信号在致动区
域产生流动扰动,其中流动干扰操作,以沿着轨迹将所检测到的所关注的颗粒指引到多个
输出通道中的一个,该通道与其中颗粒将不受流动扰动行进的输出通道不同。
[0244] 如图35,空间滤波器3442可包括可与输入通道3404对齐的多个检测开口或孔口3452,其中每一个允许光从所关注的颗粒通过到达检测仪3446。空间滤波器3442还可以
包括与输出通道之一(如3410A)对准的多个验证开口3454。当所关注的颗粒行进经过检
测开口3452,具有预期图案(基于流速)的信号3456产生。该信号可以使用数字信号处
理(DSP)技术进行处理来确定何时所关注的颗粒存在于输入通道中。多种DSP技术可被使
用,包括降低噪音的噪声过滤,有限脉冲响应滤波器,或滤波器组。当所关注的颗粒存在于输入通道中时,控制信号可以被产生,这可能需要延迟,以使得当所关注的颗粒处于致动区域3411中的合适的位置时发生流动扰动。通过检查是否跟随信号3456得到信号3458,可
以获得对所关注的颗粒实际上已经行进到所需的输出通道3410A的验证。
[0245] 上述图35中所示的空间滤波器是编码结构的一个例子。空间滤波器/编码结构允许仅荧光从通道中的某些区域到达检测仪,从而减少了背景和串扰。每个专门设计的图
案3452和3454,当靶颗粒/细胞以一速度行进,将荧光信号空间编码,使其转换成临时编
码信号。光刻透明度掩模(Cad/art Services公司)可以用来建立空间滤波器。空间编
码模式有三狭缝(3452)和双缝(3454)。三狭缝图案(3452)编码检测信号,并且双狭缝图
案(3454)编码从颗粒/细胞分选到指定通道的验证信号。在样品空间滤波器中,狭缝的
宽度可以是约0.25-0.5毫米,其在被20倍的显微镜物镜放大之前,在微流体通道上表现为
12.5-25微米。空间滤波器可以被设计为有目的地与放大后的像面重合。随着荧光颗粒通
过检测狭缝并且被向下分选到验证狭缝,PMT检测仪预期寄存后面是2个峰的3个峰信号。
[0246] 图36是处理器和驱动器3450的一个实施方案的框图,显示出电子控制算法的处理流程。该算法被编程到嵌入到外部驱动器中的FPGA芯片中。例如,使用
LabVIEW(National Instrument),利用可编程外部驱动器(CompactRIO,NI),进行实时电子控制编程。利用嵌入式现场可编程门阵列(FPGA)芯片,外部驱动器具有独立的操作系统。
由微流体检测仪所测量道的抖动小于10微秒。在基于有限脉冲响应(FIR)滤波来运行信
号放大算法之前,PMT的(例如,由装置的零星放电所造成的)随机高脉冲噪声被除去。利
用FIR匹配滤波器,信号-噪声(SNR)的比率可以增加18分贝。在SNR增强之后,最大信
号标准的阈值和搜索被应用,以确定所检测的颗粒的存在。高于阈值的信号表示待分选的
颗粒/细胞被发现,触发以下动作:(a)延迟计数器延迟脉冲发生器的激励,(b)预编程的输出电压信号被激励,以驱动压电致动器,(c)在一定的时间段,微流体检测仪准备好,从行进通过“验证区”的分选样品中检测“验证”信号,和(d)更新分选效率的记录和分选错误。时间的延迟量等于颗粒从光学检测分区行进到分选连结的时间。直到分选颗粒被验证为止,
PZT的致动器将不会被再次激励。这避免了验证信号与行进得太靠近待分选颗粒的颗粒的
信号混淆的问题。
[0247] 图37A-37D示出了用于制造与聚二甲基硅氧烷(PDMS)兼容的光流体波导的方法的实施方案。光路跟随微流体通道,其为可以最大限度地提高检测效率并且在许多芯片上
实验室应用中最经济地使用芯片区域的架构。基于微流体通道的PDMS被涂覆有特氟隆的
无定形含氟聚合物(特氟隆AF),它具有比水(N=1.33)更低的折射率(n=1.31),以形
成水/特氟隆AF光波导(图37A、37B)。用真空泵驱动,特氟隆AF溶液通过通道流动,在通
道壁上留下薄的(5到15微米)涂层,作为光波导的包层(cladding layer)(图37C)。涂
覆工艺通过降低特氟隆AF包层和PDMS装置主体之间的弹性不匹配来解决旋涂工艺的局限
性。所得的光流体波导限制并引导激光通过流体核心通道(图37D)。此外,在一些实施方
案中,这样的波导中的光可以在流体流动被分离时分离。在一些实施方案中,该方案使得获得高度集成的生物传感器,如具有芯片上激励的微流体检测仪。
[0248] 光流体是一个新兴的领域,其中集成在同一装置上的微流体和光学器件协同工作。容纳微流体通道和芯片上光子电路的装置,如集成生物化学传感器,显示出增强的功能性和灵敏度,并且使成本和尺寸显著减小。引导和对准光路径和流体的灵活性是所需的,并且确保了光子和流体中的生物样品最有效地相互作用,用于最高灵敏度。在一些情况下,光束必须与流体通道相交来定位询问区域。在另一些情况下,期望光波和流体共享相同的路
径,以最大化它们的相互作用。对后一种情况,需要有效的制造方法。由于这一事实,即在芯片上实验室装置中使用的大多数聚合物具有比水更高的折射指数,在流体通道中行进的
光将不被限制,受到高辐射损失。这里提供了一种PDMS兼容的方法,其用于以一层低折射
率特氟隆AF溶液涂覆微流体通道,使在流体通道中的水被用作波导的高折射率芯。涂覆有
特氟隆AF的波导,不仅适用于直流体通道,也适用于分离通道。除了输送光,通过特氟隆涂覆微流体通道,建立具有低样品吸附率的通道,避免了在许多基于聚合物的微流体装置中
会有的难题。
[0249] 特氟隆AF是一种无定形的含氟聚合物,它是化学稳定的并且对紫外到红外波长都是光学透明的。不像其他的氟聚合物,特氟隆AF具有比水的折射率(N=1.33)低的折
射率(n=1.31),因此特氟隆AF涂层可用于包覆流体-芯光波导。然后,当涂覆通道填充
有水或水溶液时,通过全内反射(TIR),光被输送通过与流体流动相同的物理路径。用于在PDMS通道壁上涂覆特氟隆AF的步骤这里以这样的方式提供:通过使特氟隆AF溶液流过微
通道,从而建立包层,用于光波导沿流体的路径流动。引入到微通道的光被限制在波导的芯(即,微流体通道)内部,并被流过该通道的流体引导。
[0250] 在一些实施方案中,在PDMS中制成200微米×70微米的微流体通道。使用SU-850(MicroChem)在光学光滑的硅晶片上光刻限定出主模。建立两个复制品:一个具有微流
体通道的复制品和一个光学平滑空白硅晶片的复制品。2%1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧
基硅烷(Sigma Aldrich公司)的溶液被旋涂到PDMS基片上,并在110℃下加热10分钟,以
促进PDMS和特氟隆AF溶液之间的粘附。然后两个PDMS表面被激活,以便通过UV/臭氧处
理(UVO-CLEANER 42,Jelight公司)3分钟进行永久结合,并且结合在一起,从而封住微流
体通道。6%的特氟隆AF溶液(601-S2,杜邦公司)流入微流体通道。一旦它们被填充,施
加20分钟真空(P=-20kPa),以从通道除去过量特氟隆AF溶液(例如,参见图37C)。真
空力和粘附到PDMS通道壁之间的平衡决定了包层的厚度。
[0251] 该处理生成了具有中空芯的光滑通道。特氟隆AF涂覆的PDMS装置被加热至155℃持续20分钟,以蒸发Fluoroinert(惰性氟化物)溶剂中,然后进一步加热至175℃(比它
玻璃化转变温度高15℃)持续20分钟,以形成平滑的特氟隆AF层。这样相对低的温度
的涂层是与PDMS工艺兼容,而且相比旋涂工艺,显著降低特氟隆溶液的消耗量。计算表明,
5微米厚的特氟隆AF膜对于限制光进入流体芯是必要的。在一些实现方式中,包层厚度通
常为5到15□米,厚到足以限制和引导光波。特氟隆AF涂层的厚度可通过调整所施加的
真空压力和特氟隆AF溶液的浓度来进一步控制。在装置慢慢冷却之后,为了避免由于热失
配而裂化,光纤被插入到通道中用于光耦合。然后去离子(DI)水被引入到中空芯,以用作
样品流的载体以及光流体波导的芯两者。
[0252] 流动DI水在相同的通道中输送悬浮样品和光。图38A-38C示出特氟隆AF涂覆的2 2 1/2
光流体波导3810的制造处理。流体芯波导的数值孔径,NA=(n芯 –n包覆 ) ,为0.23,良好匹配于输入的多模光纤3818的NA(NA=0.22)。流体芯波导3810的横截面由电荷耦合
器件(CCD)3814在通道的端部成像,如图38A所示。图38B显示出所制造的微流体通道的
200微米乘以70微米的横截面。图38C显示出当激光器被打开时,光流体波导3810的光输
出。虚线框3810A显示了PDMS通道的壁,且实线3810B显示了特氟隆AF包层和流体芯之
间的边界。经验证,通过特氟隆AF涂层,光被限制到光流体波导的流体芯。测量到,在488纳米波长处,波导损耗为2.13dB/cm。相比光渗漏和吸收,散射是主导因素。利用特氟隆AF涂层的改进的光滑度,可以显著降低波导损失。
[0253] 图39A显示出包括分离连结3911的微流体通道/装置3900的布局,而图39B是该装置的照片。激光(λ=488纳米)被光纤联结到水流动所处的微流体通道中。光被流
体流所引导,并且在三路连结处,如图39A中的放大框所示,488纳米的光被分成三路,跟随流体流,朝向通道出口3910A-3910C。为了表明该光可以被分离并引导通过三个通道出口
3910A-3910C,装置被填充以稀释的若丹明6G溶液,其在吸收被引导的488纳米的光之后,
在所有方向上发射绿色荧光。
[0254] 如图40所示,来自上游通道4004的被引导的光被分成三个分离通道4010A-4010C,三者分离例如3度。结果表明,激励光被分离成三个通道4010A-4010C,并且分离光仍然被引导通过通道。在一些实施方案中,由于光总是跟踪样品悬浮所处的流体流,因此激励是在所有位置处进行的,并且如此,在一些实施方案中,可以在任何位置进行检
测。这种独特的性质可以提供非常方便的特征,用于微流体检测。例如,在一些实施方案中,只使用单一光源在多个位置进行高度灵敏的荧光检测,向微流体检测仪赋予高度的设计灵
活性。
[0255] 图41中显示的是微流体检测仪4100的实施方案和使用颜色-空间-时间(COST)编码操作的示意图。图41中的微流体检测仪(4100)示出一实施方案,它包括样品(例
如颗粒或细胞或包括颗粒或细胞)流动所处的流体通道(例如,微流体通道)4101,通道
壁4108,透镜4102,一系列光学滤波器4103和光学检测仪(例如,光电倍增管或光电检测
仪)4104。样品(例如,颗粒或细胞)经过流体通道(例如,微流体通道)4101可以源自位
置A、B、C或D发射光(例如荧光)。发射的光可以经过透镜4102,到达图像平面4106并且
在由A'、B'、C'和D'所指示的相应共轭点处接触光学滤波器4103之一。光路4107由虚线
或实线指示。例如,源自位置A的光将跟随所指示的光路到达A'。透镜4102可将源自样
品通道4105内部(位于流体通道内)的一系列点的光转换到像平面4106,通过光学滤波
器4103的阵列,到达光检测仪4104(例如,光电倍增管或光电检测仪)。光学滤波器的阵列
可包括多个分区(例如,颜色分区),其中,阵列中的每个分区都可以发射光的子集。阵列
4103内部的每个滤波器可以具有不同的传输光谱。经过位于点A'、B'、C'或D'的滤波器
或分区中的任何一个的光的能量分布是由位于该点的光学滤波器的光谱特性来限定的。
[0256] 发光样品(例如,颗粒或细胞)可以当它通过流体通道(例如,微流体通道)而瞬时占据位置A、B、C和D,由此产生多个信号/每个样品。这些信号的波形由光学滤波器的
传输光谱和样品的特性来确定。样品的组合光信号可以被数字化处理,以确定颗粒的类型,以及是否分选颗粒进入荧光激活细胞分选系统中的单独通道。
[0257] 流体通道(例如,微流体通道)可以是微流体装置的一部分(例如,芯片上实验室),其使用鞘流(sheath flow)以限制颗粒到达流体通道的中心。微流体装置可以包含其
他的特征,如样品(例如,细胞或颗粒)分选装置。样品分选装置可以是光学检测区域的下
游并且从其余对象群体中分离出感兴趣的样品。在一些实施方案中,这种微流体装置可以
消除浮质(aerosol)的生成。
[0258] 图42中显示的是用于流式细胞术或荧光激活细胞分选的微流体检测仪4200的另一实施方案(例如,颜色-空间-时间(COST)编码操作的例子)的示意图。这种装置包括
流体通道(例如,微流体通道)4201、透镜4202、一系列光学滤波器4203和光检测仪(例
如,光电倍增管或光电检测仪)4204。光路4211由虚线或实线指示。还示出的是激励光源
(例如,激光器)4207,其将光导向反射镜4208(例如,分色镜),反射镜4208反射激励光到
达流体通道(例如微流体通道)内的聚焦区域4209。激励光可接触位于样品通道4205内
部的任何的位置A、B、C或D的样品(例如,颗粒或细胞)。源自光源4207的激励光可通过
透镜4202集中到所期望的聚焦区域4209。还示出是光学滤波器4210,其可以阻止光的不
希望的波长的传输(例如,源自激励光源4207的光)。通过在位置A、B、C或D处的颗粒发
射的光(例如,荧光)可通过透镜4202、反射镜4208、滤波器4210,并在用A'、B'、C'和D'
指示的像面4206上的相应的共轭点处接触光学滤波器之一。然后,传输通过光学滤波器或
颜色分区之一的光前进到光检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)4204。
[0259] 在一个实施方案中,反射镜4208(例如,分色镜)可以被定位成相对于样品路径4205或像面4206呈45度。在一些实施方案中,反射镜可以定位成相对于样品路径4205或
像面4206呈30到60度。在一些实施方案中,反射镜可以定位成相对于样品路径4205或
像面4206呈10到80度。在一些实施方案中,反射镜可以被定位成任何角度,允许激励光
源传输到所希望的聚焦区域4209。反射镜4208可以反射来自激励光源(例如,激光器)的
光,且允许从样品发射出来的荧光传输。由于激励激光束的强度幅值可以比荧光信号大很
多量级,因此光学滤波器4210可以被引入,以阻止激励激光器的任何杂散光进入滤波器阵
列4203和光检测仪(例如,PMT或光检测仪)4204。在一些实施方案中,光学滤波器4210
可以是长通滤波器或精密光学陷波(notch)滤波器。
[0260] 图43示出合并有激励光源(例如,激光器)4308和反射镜4309的微流体检测仪4300的另一实施方案。这里所示的装置包括流体通道(例如,微流体通道)4301、聚焦区域
4310、透镜4302、滤波器4305、一系列光学滤波器4303和光学检测仪(例如,PMT或光电检
测仪)4304。还示出了样品路径4306,样品位置A、B、C和D,光路4311以及在像平面4307
处的接触点A'、B'、C'和D'。
[0261] 图43中的实施方案示出反射镜(例如,分色镜)4309,其相对于样品路径4306或像面4307呈大约45度角度。激励光源(例如,激光器)4308将光导向反射镜4309,反射
镜4309将光反射到流体通道(例如微流体通道)内的聚焦区域4310。在该实施方案中,反
射镜4309位于透镜4302和流体通道4301之间。反射镜4309可以反射来自激励光源(例
如,激光器)的光,且允许从样品发射出来的荧光传输。光学滤波器4305可以被引入,以阻止激励光源(例如,激光器)的任何杂散光进入滤波器阵列3003和光检测仪(例如,光电
倍增管或光电检测仪)4304。
[0262] 在图42或图43中所示的微流体检测仪的优点是,其作为一种灵活的方法,用于引入多个激励激光器,用于越来越多的检测参数。在一些实施方案中,如图42或图43中所示,多个激励光源(例如多个激光器)都可以使用。在这样的实施方案中,图42或图43中所
示的光源可以是不同的波长(例如,405nm、488nm、532nm和630nm)的几个激光器的组合。
在一些实施方案中,来自光源(例如,激光器)的光可在传导通过光束组合器或波长多路分
解器之后,从单个孔径发射。
[0263] 在一些实施方案中,反射镜(例如,4208或4309)可以反射所有波长的激励光到达聚焦区域。在这样的实施方案中,反射镜会阻碍或阻挡从样品发射的光(例如荧光)的传
输。解决这个潜在问题的一个方案是,在发射光路的外侧定位反射镜。因此,在一个实施方案中,反射镜(4208或4309)定位在发射光路的外侧。另一种解决方案是减小反射镜的尺
寸,使得发射光的阻挡量(即,受阻光)被降低到可接受的水平。因此,在另一个实施方案
中,反射镜(4208或4309)的尺寸减小,使得被阻碍光的量被减少到可接受的水平。被阻碍
光的可接受的水平(例如,从样品发射的荧光)可为0%到50%。在一些实施方案中,被阻
碍光的可接受的水平(例如,从样品发射的荧光)为0%到30%。在某些实施方案中,被阻
碍光的可接受的水平(例如,从样品发射的荧光)为0%到15%。例如,对于具有8毫米直
径孔径的50X物镜,1x2mm反射镜可以仅阻挡从颗粒发射的荧光的约3%。
[0264] 图44示出微流体检测仪4400的另一实施方案,其合并有定位在光学滤波器4404的阵列和光学检测仪4405(例如,光电倍增管或光电检测仪)之间的透镜4403。如在图42
中所示的前述实施方案,微流体检测仪4400包括流体通道(例如,微流体通道)4401、第一
透镜4402、一系列光学滤波器4404和光检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)4405。还
示出了样品路径4406,样品位置A、B、C和D,光路4409以及在像平面4407处的接触点A'、
B'、C'和D'。第二透镜4403可以聚焦或集中从第一图像平面4407在点A'、B'、C'和D'处
发出的光,到达第二图像平面4408上的对应点A”、B”、C”和D”。因此在位置A、B、C和D处从样品发出的光,可到达光检测仪处的它们的对应位置A”、B”、C”和D”。在本实施方案中,光学滤波器阵列中的滤波器(例如,颜色分区)的数目不受光检测仪(例如,光电倍增管或
光电检测仪)的感光分区的尺寸或形状的限制。此外,光学检测仪(例如,光电倍增管或光
电检测仪)的输出波形不受光学检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)本身的非均匀
性影响。在一些实施方案中,透镜4403将来自滤波器4404的图像缩小到图像平面4408。
[0265] 在一些情况下,如在此所讨论的,COST系统能够检测的荧光光谱的数目与光学滤波器阵列中的滤波器的数目相关。将滤波器阵列的尺寸与光学检测仪(例如,光电倍增管
或光电检测仪)的感光区域解耦,可以允许用于检测较大量的参数。
[0266] 图45A-45C示出了微流体检测仪4500的实施方案,其包括衍射光栅4503,衍射光栅4503可用于样品(例如,颗粒或细胞)检测的COST技术。微流体检测仪4500包括:流
体通道(例如,微流体通道)4502、透镜4501(例如,物镜)、光检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)4504、和包括衍射面4509的衍射光栅4503。衍射光栅4503可以是任何光衍
射结构,例如棱镜。还示出了包括顶面4506和通道4507的板4505,其中通道4507包括在
表面4506处的孔。图45A、图45B和图45C不同之处在于发光样品(例如,颗粒或细胞)的
位置,其中每个样品位置由图示中的位置A、B或C表示。每个位置A、B和C位于流体通道
(例如,微流体通道)内,并且不是装置的一部分。
[0267] 流经流体通道(例如,微流体通道)的样品(例如,单个颗粒或细胞)可以瞬时占据位置A、B、或C并且发出光(例如,荧光)。从每个位置A、B和C发出的光路由实线4508
示出。样品相对衍射光栅4503的衍射面的位置限定出经过由通道4507限定的孔的光的波
长范围。例如,图45A示出了当样品处于位置A中时,光检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)可检测红色荧光。图45B示出了当样品处于位置B中时,光检测仪(例如,光电倍增
管或光电检测仪)可检测黄色荧光。图45C示出了当样品处于位置C中时,光检测仪(例
如,光电倍增管或光电检测仪)可检测蓝色荧光。因此,当颗粒从位置A行进至C,由光电检测仪检测到的光发生蓝移。
[0268] 因此,主要发射蓝光的样品显示了在位置C处最强的光信号,然后当颗粒进一步沿通道向下行进,信号减小。检测到的主要发出蓝光的样品的信号会与主要发出黄或绿光
的样品的信号不同地显现。由于每个特定的发射光谱产生相应的输出波形,该输出波形可
以被视为那一样品的区别特性。在过去几年中,由于高分辨率、高灵敏度和高频CCD和
CMOS图像传感器的高速发展,基于图像的细胞仪已经可替代流式细胞仪。在基于图像的细
胞术中,样品(在一些实施方案中)可以被固定到载玻片或表面并且被检查。可以通过光检
测仪(例如CCD或CMOS成像器)来获取样品的光学特性,然后进行分析。不同于以串行方
式分析样品(例如,细胞或颗粒)的流式细胞术,基于图像的细胞术(在一些实施方案中)
以并行的方式逐帧分析样品。本文描述的多个实施方案可以应用到基于流的微流体检测仪
以及基于图像的微流体检测仪。
[0269] 图46的实施方案是可以利用COST技术的基于图像的微流体检测仪的示意图。不同于流系统,其中在流体通道(例如,微流体通道)中行进的颗粒由单个高敏感度的光检测
仪顺序检测,基于图像的微流体检测仪可以使用检测仪阵列,例如在CCD或CMOS装置中建
立的具有许多(例如,数百万)传感器(像素)的检测仪阵列,以便并行检测多个颗粒。尽
管CCD或CMOS装置中的每个传感器的灵敏度可以比光学检测仪(例如,光电倍增管或光电
检测仪)低,但用于静止颗粒的检测时间可以长于用于流动颗粒的,从而补偿成像器和光
学检测仪(如光学检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪))之间的灵敏度差异。在图
46的实施方案中,基于图像的微流体检测仪4600包括可移动台4601、透镜4604、和CCD或
CMOS成像器4606。
[0270] 成像器可以包含数百万个像素,并且这些像素中的每一个可涂覆有对红、绿和蓝光或R、G、B像素敏感的光学滤波器。一组RGB或RGBG像素可以形成单元4607。在位置
A1处从样品4602发出的光可以通过透镜4604被投射并聚焦到红色像素4608上。通过改
变台的位置以将样品移动到位置A2,同一样品的光被聚焦到绿色像素4609,由光路4605所
示。通过改变台的位置以进一步移动至样品到位置A3,它的光被聚焦到蓝色像素4610。通
过组合RGB像素的三个信号,操作者可以确定样品的荧光性质。
[0271] 图46中的微流体检测仪实质上将标准荧光显微镜转换成细胞仪系统,该系统可以产生关于样品的其它信息。然而,由于传统的彩色成像器有3个颜色(R,G,B),可检测的颜色的数目是有限的。图34的实施方案中示出了可以检测多种颜色的微流体检测仪的示
意图。
[0272] 图47的微流体检测仪4700类似于微流体检测仪4600之处在于:它包括可移动台4701、透镜4704、和CCD或CMOS成像器4706。基于图像的微流体检测仪4700还包括旋
转轮4705,其具有位于透镜4704和成像器4706之间的多个光谱滤波器4711。对于每个位
置A1、A2或A3,光分别被投射到红色4708、绿色4709及蓝色像素4710,类似于图46中的
装置。但是,对于图47所示的装置,光也在到达成像器上的像素之前通过旋转轮4705上的
一系列的额外的光谱滤波器4711。在一个实施方案中,旋转轮可以含有8个不同的光谱滤
波器,因此允许检测24种不同的颜色。
[0273] 图48示出了可使用的用于处理光检测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)信号的COST编码方法的框图再现。当颗粒经过检测区时,发射的光(例如,荧光)可通过光学检
测仪(例如,光电倍增管或光电检测仪)来检测。光学检测仪(例如,光电倍增管或光电检
测仪)信号4801可以任选地经过模拟滤波器4802以增强信噪比,或者可以直接传递到模
拟-数字转换器(A/D变换器)4803。数字滤波器4804下游能够进一步提高信噪比。然后
数字信号可以由计算机处理器(例如,FPGA)进行处理。处理4805中的子处理4806、4807
和4808可以由计算机处理器来执行。在某些实施方案中,处理4805内的子处理可以作为
窗峰值检测(Windowed Peak Detection)的部分进行,如图23中所示。在信号处理期间,
信号可以被处理并且波形可被分析(例如,所有的信号和所有波形可被处理和分析)。在一
些实施方案中,可有阈值计算阶段,其中根据基线噪声设置阈值水平(例如,子处理4806)。
在第二阶段,以前计算的阈值可用于分析输入信号的波形/COST信号。可以基于峰的位置
来确定颗粒的速度(例如,子处理4806)。用于峰检测,可以分析波形以识别峰(例如,子处理4806)和峰参数(例如,幅值、时间、区域;子处理4807)。
[0274] 可以调整一个或多个峰的参数,以便在处理4805中的合适的点来补偿光学不规则或信号不规则(例如,子处理4807之后和子处理4808之前)。作为这种调整的一部分,
可以执行校准,使含有颗粒的样品的一部分经过被构造成用全通滤波器代替颜色滤波器的
装置,其中全通滤波器包括对应于颜色滤波器分区的分区。然后,样品的另一部分可以经过被构造成具有颜色滤波器的装置,并且可以基于从相应的全通滤波器的分区检测到的信号
调节从颜色滤波器的不同分区检测到的信号。
[0275] 基于使用的滤波器集(例如,使用宽、连续或带通滤波器等等),对应于每个峰的颜色可被映射(例如,子处理4808)。例如,峰参数可以通过放置在颜色滤波器上而被映射
到颜色滤波器中的离散的带通滤波器(即,颜色分区)(例如,子处理4808)。在一些实施方
案中,峰参数可以被映射到在颜色滤波器中的分区,颜色滤波器包括根据一个或多个峰的
参数比率重叠透明度的分区,该比率提供用于标准化峰参数(子处理4808)。基于峰参数比
率(标准化峰参数)的颜色映射可应用于这样的实施方案,其中每个颗粒(例如,细胞)有
一种荧光团或量子点,以及其中每个颗粒(例如细胞)有多种荧光团或量子点,这在本文中
更详细地描述。数据可以进一步被分析并使用可以驻留在个人计算机(PC)中的可视化工
具4809可视化,以最终呈现与识别从颗粒发射的(一种或多种)荧光颜色和荧光强度。可
视化工具可以是用户界面,允许用户分析检测数据和/或选择微流体检测仪的特定的参数
和功能。在一些实施方案中,可视化工具允许用户分析检测数据,并识别流经装置的特定的颗粒或颗粒类型(例如,4811)。在一些实施方案中,可视化工具允许用户选择参数(例如,
4810;选择选通信号(gating signal)),用于分选特定颗粒。
[0276] COST编码处理可以应用于使用最小数目的光检测仪或成像器检测多个光谱。因此,这里提出的实施方案设计已经从根本上改变了流式细胞仪的比例规则,其传统上需要
一个光学检测仪用于检测每个参数(光谱)。
[0277] 如上所述,COST编码处理可以区分使用单个光检测仪得到的来自各种细胞或颗粒的多个光谱。对于一些应用,可根据样品的光学质量(例如,(例如通过抗体)有效连接到
细胞的荧光团的种类)在两个通用方案中施加COST编码方法。在某些实施方案中,样品包
含细胞或颗粒的混合物,并且每个细胞或颗粒是由单个类型的荧光染料或量子点标记。例
如,样品可以包括针对一组特异性抗原的一组附接抗体的珠,并且每种附接抗体的珠唯一
地通过特定类型的(一个或多个)荧光团或量子点识别。通过使用微流体检测仪检测与荧
光团或量子点共轭的珠的荧光以同样分离这样的珠,操作者可以确定特定抗原的存在和丰
度水平。在这样一光谱-每颗粒的情况下,操作者可以使用四个光谱(如,白-红-绿-蓝
(W/R/G/B))的COST滤波器,以使用图48概述的处理来检测超过20个光谱。在模拟-数
字(A/D)转换器以及使用数字滤波器移除杂散的光检测仪噪声和电子器件的热噪声之后,
峰检测或区域检测方法被用于识别或表示与通过每个光谱滤波器的光量对应的信号电平。
取得每一个光谱的信号与通过全通(白)滤波器的信号的比率,可以对每个样品获得“标准
化的”的R-G-B-信号。对应标准化的R、G、B信号,每种类型的荧光团或量子点具有其独特的比率。对于任何两个不同的荧光团或量子点,在相同荧光团或量子点内的信号变化量显
著小于不同的荧光团或量子点之间的间距(separation)。因此,操作者可以应用COST编码
处理来准确地区分多个光谱不同的样品。
[0278] 在一些实施方案中,单个颗粒被多种荧光团光谱区分开,并且例如在图48中概述的COST编码处理实施方案可以用来解密COST信号。假定有N种(例如,20种)不同类型
的荧光团,每一种荧光团都具有特定的荧光光谱,根据等式1的下列关系,tij是通过第i个光学滤波器的第j种荧光团的传输系数(例如,j=1,2....N和i=1,2,3,4);Cj是来自
细胞的第j种荧光团的荧光强度;R、G、B、W代表COST编码信号中的通过对应的滤波器检测到的光强度。
[0279] 等式1∶
[0280]
[0281] 在设计光谱滤波器时,N种荧光团中的每一个通过光谱滤波器的传输系数可以被校准。因此,所有的系数tij是已知的,并且可存储在数据库中。等式1中的线性系统包含
四个(4)独立的等式,并且可以在单个颗粒中从许多(例如,20)个可能的光谱检测到四
种(4)荧光团。例如,对于等式1中[C1,C2,C3,C4,C5,……,C20,]的解[0.5,0.2,0,0,0……
0,0,0,0.7,1],可以得出结论,颗粒包含四(4)种荧光团:C1,C2,C19,C20,它们的强度比为5:
2:7:10。在一些情况下,由于噪声,所有的C'可具有非零值,并且可以选择阈值以确定颗粒中每种类型的荧光团的存在。可以增加光谱滤波器中的光谱的数目来检测共存于单个颗粒
中的多个光谱。例如,通过使用八(8)个光谱滤波器,COST编码处理可以在一个颗粒中检
测多达八(8)种荧光团。
[0282] 具有连续颜色分级的光谱滤波器可以在某些实施方案中使用。这样的滤波器可以被构造成用于从红色到蓝色连续分级的传输光谱,没有任何突然的边界。这样的滤波器可
以在滤波器的开始和/或末端包括全通(白)滤波器,以指示信号的开始和/或结束。以
这种方式,COST信号成为连续波形(图49B),而不是一系列离散的峰(图49A)。操作者可
以在光谱滤波器的给定位置根据传输光谱将COST信号数字解析为一系列光谱滤波器。因
为滤波器的数目可以被数字限定,因此光谱滤波器可以被划分成多个光谱。对光谱的数目
的实际限制是噪声电平(noise level),噪声电平可在每个光谱带太窄时削弱信号。
[0283] 这样的动态调整的光谱滤波器的设计,如在图49B中的例子所示,为检测系统提供显著灵活性。在免疫学和癌症的诊断中,用户可以根据需要而在一个颗粒中检测非常大
量(例如,20个)的光谱。操作者可以有意减缓样品的流动速度,使得COST信号覆盖时域
中的宽范围,或换句话说,颗粒花费更长的时间,通过检测分区行进。较长的信号持续时间允许用户将信号划分为较大量的频谱划分,其在每个光谱划分上具有足够信噪比以及足够
数目的采样点。换句话说,通过用单个检测仪替代多个光学检测仪,COST编码技术不仅简
化了微流体检测仪和检测仪系统,而且还提供用流动速度(流通量)换取微流体检测仪可
以检测的光谱数目的独特能力。这样的换取可以由用户根据自己的应用动态调整。
[0284] 当滤波器的传输特性连续地变化时,用户被给予将滤波器划分为任何选择的单元的数目的灵活性(例如,图49B)。如果被测的颗粒标记有大量不同的荧光团时,则用户可
以将滤波器数字地划分为大量的单元。另一方面,如果应用涉及较少的不同的颜色,那么对于信噪比管理而言,将滤波器划分为较少的单位是合意的。为了确定颗粒的速度,操作者可以重复分级滤波器的一小部分,或在滤波器中添加任何“光谱特征”(例如封在滤波器中的一些小区域)。当信号波形显示这些特征图案,微流体检测仪可以容易地计算出颗粒的
速度。这个特征也可用于验证实际流速是否与由用户设定的流速相匹配。由于设定的流速
基于通道内的理想的层流,因此这一特征是有用的。然而,并非所有的颗粒都位于通道的中心,并且颗粒与颗粒的相互作用可以把颗粒推离中心。知道每个颗粒的速度,还有流速,有助于提高细胞分选效率。
[0285] 在某些实施方案中,提供这样的微流体检测仪,其包括细胞可以流动通过且可以被感测到的微流体感测通道、感测通道下游的分支、分支下游的两个或更多个微流体分支
通道、以及致动器,所述致动器被构造成用于与分支流体连通并构造成在激活致动器时将
细胞驱动至一个或多个分支通道,该装置被构造成在细胞通过该装置流动后,具有大于约
70.8%的细胞存活率。在一些实施方案中,还提供了流式细胞术方法,包括:(1)细胞流动通过微流体感测通道,其中在该感测通道内,细胞可以在微流体检测仪中被感测,所述微流体检测仪包括感测通道、感测通道下游的分支、分支下游的两个或更多个微流体分支通道、以及与细胞流体连通的致动器,所述致动器能在激活致动器时将细胞驱动至一个或多个分
支通道,和(b)分选流经微流体通道的细胞到达分支通道之一,其中通过该装置的细胞具
有大于约70.8%的细胞存活率。这样的微流体装置可包括本文所述的或本领域中公知的合
适的部件(例如,颜色滤波器、检测仪等)。细胞存活率为约71%或更高,约75%或更高,约
80%或更高,约85%或更高,或约90%或更高(例如,约71%、72%、73%、74%、75%、76%、
77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高,以及所有之间的值),其中细胞存活率是在细胞已流动通过该装置之后确定的。在一些实施方案中,致动器可以是压电致动器
(例如,本文描述的)。在一些实施方案中,致动器与装置中的分支和/或细胞流体连通,常常在致动器与分支和/或细胞之间基本上没有空气。微流体检测仪(在一些实施方案中)
不产生液滴,而且(在一些实施方案中)不包括使装置或液滴中的细胞、流体带电的元件。
[0286] 它已经确定,对细胞膜的剪切应力遵循以下关系:tau~a(rho)(v)(f)(tan(theta))。这里“a”是细胞半径,“rho”是平均密度,“v”是流速,“f”是细胞分选致动器的频率,而“theta”是通过分选造成的细胞偏转角。流动速度和分选频率响应的乘积(vf)确定流通量,并且发现最有效的分选设计方案是减小偏转角“theta”。在由压电致动器引起的相同的横向力作用下,减小的theta设计在细胞周围产生更均匀的瞬态速度概貌,从
而给出显著较小的剪切应力,用于提高细胞存活率。相对于在温和的条件(冷藏,20psi,
100μm的喷嘴)下具有BD FACSAria系统的传统分选而言,在包括由压电致动器驱动的分
选仪的装置上分选的新生大鼠原代心肌细胞具有88.7%的细胞存活率,而传统分选的细胞
的细胞存活率仅为70.8%(细胞存活率改善25%)。
[0287] 检测系统
[0288] 在一些实施方案中,检测系统是微细胞检测系统。在一些实施方案中,检测系统包括一个或多个结构和/或本文描述的或本领域已知的设备。在一些实施方案中,检测系
统包括芯片(例如,芯片上实验室)。在一些实施方案中,芯片上实验室(LOC)可以是在大
约一平方毫米到大约几个平方厘米大小的单个芯片上集成了一个或多个实验室功能的装
置。在一些实施方案中,LOC可为从检测系统可移除的并且可为一次性的。在一些实施方
案中,LOC设计成药筒形式。在一些实施方案中,LOC可以组装在芯片保持器(例如,如图
10C所示)中,在一些实施方案中,允许每次使用后更换LOC。LOCs能够处理降低到小于微
微(pico)升的非常小的流体容积。LOC可以通过本领域中已知或本文所描述的方法制造,
并且可以由本领域已知的或本文所述的合适的材料来制造。在一些实施方案中,LOC包括
一个或多个结构。
[0289] 在某些情况下,LOC包括富集结构、混合结构、一个或多个流体通道、一个或多个样品或流体入口(例如,入口或孔)和/或微流体检测仪或其部分。在一些实施方案中,LOC包括一或多个压电盘致动器。在一些实施方案中,LOC包括流体偶联到混合结构的富集结
构。在一些实施方案中,LOC包括流体偶联到微流体检测仪或它们的一部分的混合结构。在一些实施方案中,LOC包括流体偶联到混合结构的富集结构以及流体偶联到微流体检测仪
或其一部分的混合结构。
[0290] 结合剂
[0291] 如本文所用的术语“结合剂”是指这样一种分子结构,它特异性地结合到抗原或另一个分子结构(例如,蛋白质,脂质,DNA,RNA,碳水化合物,和/或部分或其变体)。粘合剂的非限制性实例包括抗体(例如,从任何物种(如鸡,人,骆驼,美洲驼,鳗,鲨鱼,羊,啮齿动物,,狗,兔等)免疫或遗传衍生的抗体,抗体域或其部分(例如,Fab,Fab',F(ab')2,Fv,ScFv,VH,VHH,VL,VLR等),双抗体,单克隆抗体,血清,多克隆Abs,mAbdAbs,噬菌体展示衍生的结合剂,亲和体(affibodies),异源缀合物抗体,双特异性抗体,evibodies,脂质运载蛋白(lipocalins),亲和体,高亲和性多聚体(avimers),maxibodies,热休克蛋白如GroE1和GroES,反式体(transbodies),DARPins,适体(aptamers),C型凝集素域(例如,四连接素(tetranectin));人γ晶状和人泛素衍生的结合剂(例如,affilins),PDZ域衍生的结合剂;蝎毒素(scorpion toxin)和/或Kunitz类型域结合剂,纤粘连蛋白衍生的结合剂
(例如,adnectins),受体,配体,凝集素,抗生蛋白链菌素,生物素等,它们的衍生物或组合。
[0292] 检测剂
[0293] 在一些实施方案中,检测剂指一种包括荧光分子的结合剂。在一些实施方案中,检测剂可包括珠(例如,磁性珠,聚苯乙烯珠,胶乳珠,玻璃珠,例如,Luminex珠)。在一些实施方案中,珠包括结合剂和/或荧光分子。在本领域中公知的合适的荧光分子可作为
检测剂。常见荧光分子的非限制性实例包括荧光素(FITC),藻红蛋白(PE),R-藻红蛋白
(RPE),Cy2,Cy3,CY3.5,Cy5PE,Cy5,Cy5.5,Cy7,Cy7PE,Cy7APC,德克萨斯红(Texas Red),PE得克萨斯红,PerCP,PerCP-Cy7,PerCP-Cy5.5,别藻蓝蛋白(APC),绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白衍生物或其突变(例如,EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama1,青色荧光蛋白,ECFP,Cerulean,CyPet,黄色荧光蛋白衍生物,YFP,Citrine,Venus,YPet和BFP衍生物),瀑布蓝(Cascade Blue),太平洋蓝(Pacific Blue),DyLight 405,DyLight 549,DyLight 649,DyLight 680,DyLight 800,基甲基香豆素(AMCA),ATTO 425,ATTO 488,ATTO ATTO 550,ATTO 594,ATTO 647N,ATTO 532,ATTO 655,若丹明(TRITC), 700DX,
800CW, 800,AlexaFluor 488,AlexaFluor 647,AlexaFluor 405等,或其组合。
[0294] 稀有的细胞类型
[0295] 在一些实施方案中,稀有的细胞类型和/或相对稀有的细胞类型可以指不常见的细胞类型,具有不寻常的特性的细胞,外来的细胞类型(例如,细菌,酵母),患病细胞类型(例如,癌细胞,带有病毒的细胞),未分化的细胞类型(例如,干细胞或干细胞祖),错位的细胞类型(例如,通常不会在循环中发现的细胞,比如,梗塞后在血液中发现的心肌细胞),源自于胎儿的细胞类型,源自于胎盘的细胞类型,以及它们的组合。在某些情况下,稀有的细胞类型可以是在个体的血液中存在的呈现出标记(例如,标记,染料,例如,代谢染料,放射性示踪物)的细胞。患病细胞类型的非限制性实例包括恶性细胞,转移细胞,循环肿瘤细胞(CTC)(例如,已从原发肿瘤脱离并在血流中循环的细胞,如乳腺癌细胞)。在一些实施方案中,不常见的细胞类型可以是癌前循环细胞(例如,注定发生癌变的细胞,如白血病祖细胞)。癌前细胞可以显示特定的细胞表面标记或细胞内标记物(例如,翻译后修饰的蛋白
质,例如,含磷蛋白(phosphor protein))或本领域中已知的标记物的特定组合。在一些实施方案中,相对稀有的细胞类型是胎儿细胞,相对丰富的细胞类型是来自怀孕女性(例如,人类女性)的样本的母体细胞。
[0296] 只公开少数的实现。然而,所描述的实现和其他实现方式的变型和改进可以基于本文件中所描述和所示出的内容而进行。虽然本文件包含许多细节,但这些不应被解释为
对发明范围或要求保护的范围的限制,而是作为对本发明的具体实施方案的特定特征的描
述。在本文档中,在单独实施方案的上下文中描述的某些特征也可以组合到单个实施方案
中实现。相反地,在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以分别地在多个实施方
案或以任何合适的子组合实现。此外,尽管特征可能在上面被描述为以特定组合,甚至按原始要求保护的原样起作用,但是来自所要求保护的组合的一个或多个特征可以在某些情况
下可以从该组合中除去,并且所要求保护的组合可涉及子组合或子组合的变化。
[0297] 颗粒分选系统、设备和方法
[0298] 图50示出了用于分选颗粒的颗粒分选仪5000的示例性和非限制性的实施方案。颗粒分选仪5000可以被构造成用于将经由样品入口5002注入的颗粒经过源通道
5004分选到若干目标通道5010A-5010C之一,每一个目标通道与目标出口(也使用标记符
5010A-5010C标记)相关联。颗粒分选仪5000包括鞘入口5016,以提供用于经由样品入口
5002注入的颗粒的鞘流,用于例如水力聚焦的目的。源入口5002和鞘入口5016可以独立
地和适当地设计,分别用于接受待分析的颗粒和鞘流。例如,源入口5002的横截面形状和
面积可以匹配到标准的移液尖(pipette tip)。在一些实施方案中,鞘入口116可以匹配到
标准的移液尖。类似地,目标出口5010A-5010C可根据应用的需要各自独立地设计,如包括用于临时存储分选的颗粒的储液器,用于收回分选的颗粒的接口,等等。
[0299] 在一个实施方案中,源通道5004是由来自源入口5002的颗粒和来自鞘入口5016的鞘流组合形成的,使得能够实现颗粒的聚焦。源通道5004具有根据需要和/或足够用于
产生和/或维持鞘流的长度、横截面概貌、以及横截面面积。
[0300] 在一个实施方案中,颗粒分选仪5000还包括与源通道5004的第一容积相关联的第一检测装置/部件5012。在一些实施方案中,第一检测装置5012被构造成用于在待分选
的颗粒通过第一容积时检测颗粒的一个或多个特性,和/或在颗粒通过第一容积时检测第
一容积。例如,在一个实施方案中,所述特性包括光学特性,如荧光和/或反射率,并且相应地,第一检测装置5012可以分别包括一个或多个荧光,反射率检测仪。作为另一实例,在一个实施方案中,所述特性包括横跨第一容积的阻抗,其在待分选颗粒经过第一容积时发生
改变,并且第一检测装置5012包括一个或多个电压计。
[0301] 可以理解的是,第一检测装置5012不仅可以包括检测部件,也包括必要的和/或期望用于检测(多个)特性的另外的部件。例如,如果所述特性包括荧光,如上所述,第一
检测装置5012可以包含有(多个)激发源、偶联(例如光学纤维)和其它(例如滤波器)
光学器件、电子控制器件等。作为另一个例子,如果特性包括阻抗,如上所述,则第一检测装置5012可包含有一对电极,用于产生用以测量该第一通道内的阻抗的电信号
[0302] 在一个实施方案中,第一检测装置5012构造成以任何方式与第一通道相互作用,以允许测量所关注的(一个或多个)特性。例如,在一些实施方案中,所述特性包括荧光,
并且例如当颗粒分选仪5000被放置在如显微镜工作台上时,第一检测装置5012激励第一
容积并检测来自第一容积外部的区域的荧光。在其他实施方案中,更侵入性的方案,如用于激励、输送/发射收集的光纤可插入到第一容积中。作为另一实例,在一些实施方案中,所述特性包括阻抗,并且第一检测装置5012包括与第一容积导电连通的一对电极
[0303] 在一些实施方案中,第一检测装置5012检测到与一个或多个特性相关联的第一检测信号。在一些实施方案中,第一检测信号与在源通道5002中的颗粒的光学特性相关
联。在一些实施方案中,该特性是光学特性。在一些实施方案中,光学特性选自荧光,磷光化学发光,热致发光,反射率,散射(包括前向散射,较大的角度散射,侧散射和/或背散射)等。在一些实施方案中,光学特性包括荧光,并且第一检测信号包括一个或一个以上的荧光信号,作为在颗粒通过源通道5004的第一容积时的来自颗粒的第一信号。图51A表示根
据一些实施方案的第一检测装置5012对在源通道5004中检测到的单个颗粒的示例性输出
(即示例性的第一检测信号)。图51A,作为原始光信号和/或其模拟/数字信号的代表,示
出了包括五个时间上分离的峰5102a-5102e的光迹5102。在一些实施方案中,可以在第一
检测装置5012的相同的检测仪中,检测到峰5102a-5102e中的每一峰。在一些实施方案中,至少一个峰在与另一个峰不同的检测仪处被检测。在一些实施方案中,五个峰5102a-5102e中的至少一个是参考强度信号。在一些实施方案中,五个峰中的至少一个是荧光信号。
[0304] 图52A示出了示例性且非限制性的设置,用于产生第一检测信号,如迹5102。来自第一容积/源通道5204(如源通道5004的第一容积)中的荧光颗粒P的荧光例如通过物镜5206(如可以是第一检测装置5112的落射荧光设置的一部分)获得。所收集的荧光被
滤波器阵列5208滤波,其中滤波器阵列5208包括,如图所示,参考滤波器52081和荧光过滤器52082。然而,任何数目的参考和/或其它的滤波器可以作为滤波器阵列5208的一部分,
基于来自颗粒P的光学特性,和/或在必要时用于进行本文所描述的分析。仍参照图52A,
在一些实施方案中,参考滤波器52081是波长无关的强度滤波器,并且可以包括,但不限于,全通滤波器。如图52A所示,在一些实施方案中,参考滤波器52081包括至少一对参考滤波
器。
[0305] 每个荧光滤波器52082可以是波长选择性的,并且可以单独是用于任何合适的(一个或多个)波长的高通滤波器低通滤波器,或带通滤波器。如图52A,在一些实施方案中,荧光滤波器52082包括至少绿色滤波器、黄色滤滤波器和红色滤波器。在一些实施方案中,绿色、黄色和红色滤波器可以是窄带通滤波器,如具有10nm-30nm的带宽的那些。在一些实施方案中,绿色、黄色和红色滤波器中的至少一个可以是宽带通滤波器。
[0306] 检测仪5202构造成从滤波器阵列5208收集过滤的荧光并产生第一检测信号。在一些实施方案中,检测仪5202可包括多个检测仪。可以采用任何合适的检测仪,例如,但不限于,光电倍增管(PMT),光电二极管,电荷耦合器件(CCD),雪崩光电二极管(APD)等。在一些实施方案中,检测仪5202包括光电倍增管,如图所示。PMT可以类似于Hamamatsu H9307。
[0307] 在一个实施方案中,检测仪5202从滤波器阵列5208中的每一滤波器接收颗粒P的荧光信号,以产生示例性迹5102,其更概念性地示出在图52B的迹5210中。换言之,在一个实施方案中,检测仪5202生成如图52B所示的迹5102的峰5102a-5102e,其中峰5102a、
5102b对应来自参考滤波器52081的强度参考信号5210a、5210b,并且峰5102c-5102e对应
来自荧光滤波器52082的颜色编码信号5210c-5210e。如前所述,迹5102、5210的峰在时间
上分开,并以下面的方式检测:在第一容积内的颗粒P的移动引起由颗粒P产生的荧光被依
次投射到滤波器阵列5208中的每一个滤波器(通过透镜5206和/或通过任何其它合适的
光学器件),从第一个参考滤波器52081开始,并以最后的荧光滤波器52082结束。
[0308] 图53A示出了用于一些实施方案的示例性的和非限制性的传输光谱,其中荧光滤波器52082可以是红、绿和/或蓝色滤波器。在所示实施方案中,每个颜色滤波器具有宽的
带宽,其具有缓慢变化的斜率,与传统的窄带颜色滤波器不同。如图53B所示,对与五种类型的荧光纳米颗粒的混合物相关联的多个第一检测信号(未示出)进行分析,每一种颗粒
具有不同的荧光特性(例如五种不同亮紫(Brilliant Violet,BV)的染料),可以用于区分
染料。图53B示出了来自(使用具有图53B的传输光谱的滤波器产生的)多个第一检测信
号的红/白色、绿色/白色以及蓝色/白色强度比率如何造成非重叠点,非重叠点代表每个
BV染料指示出使用单个PMT区分多至5种颜色的可行性。作为另一示例,滤波器5208可以
被用来产生图53C所示的示例性的第一检测信号用于荧光团PE,其在一个实施方案中与其
他荧光制剂FITC和tdTomato相区别,以类似的方式分析,从而产生图53D的绘图,其指示
出这些荧光团之间的颜色区分的可行性。
[0309] 再次参考图52B,由此接下来,迹5210可以提供至少有关颗粒P的以下信息:(1)颗粒P的速度,这是由峰5210a-5210e之间的间距确定的,颗粒移动得越快,越接近峰;(2)第一检测信号的总体强度,如由峰5210a、5210b的任何组合确定的;和(3)基于荧光峰
5210c-5210e的第一检测信号中的荧光信息,如颗粒P的荧光光谱。可理解,在若干实施方
案中,可以从迹5210进行另外的推论。在一些实施方案中,峰5210a、5210b是空间-时间
编码信号,并建立用于整体荧光强度的参考,从而使不同的颗粒之间的荧光强度的变化,不会影响其区别荧光色的能力。通过测量前两个峰值之间的时间,可以精确计算颗粒P从第
一检测区域5012行进到分选连结的时间,从而实现高精度分选。
[0310] 在一些实施方案中,接下来,由迹5210所提供的信息形成用于分选颗粒的基础。因此,在一些实施方案中,第一检测信号,如迹5210,可以被分析,以确定哪些目标
通道5010A-5010C应接收颗粒进行分选。每个目标通道5010A-5010C可以关联,指定和
/或以其他方式分配颗粒的一组不同的特性,以形成用于分选颗粒进入通道的基础。例
如,迹5210产生颗粒速度的信息,如上所述,并且操作者可以基于颗粒速度选择目标通道
5210A-5210C。这样的操作可以是有用的,例如当不同的尺寸、体积和/或硬度的颗粒以
不同的速度在通道5004中的不同的平衡位置移动时。在另一例子中,迹5210给出整体
的荧光强度信息,如上所述,并且在一个实施方案中,基于整体的荧光强度选择目标通道
5010A-5010C之一。在一些实施方案中,目标通道5010A-5010C中的至少一个被指定为“废
物”通道,其接收被视为不合意的颗粒,例如,当这些颗粒不匹配任何分选准则和/或匹配不合意的分选准则等时。以这种方式,基于迹5210,且又基于由第一检测装置5012所检测到
的一个或多个特性,分选颗粒。
[0311] 再次参考图50,在一些实施方案中,分选是通过基于第一检测信号将分选信号传输到分选元件5006而实现的。分选元件5006构造成引起以增加颗粒被分选到正确的目标
通道的概率的方式位移(displace)待分选的颗粒。分选元件5006可与源通道5004的分
选容积保持联通,该分选容积位于与第一检测装置5012相关联的第一容积的下游。
[0312] 分选信号可以是影响分选元件5006分选颗粒的任何特定形式。例如,在一个实施方案中,分选信号包括颗粒应该被分选到哪一目标通道5010A-5010C的规范。在一些实施
方案中,分选信号包括变化强度的致动信号,其中强度是颗粒需要被位移的程度和/或位
移的方向(即朝向或远离分选元件5006)的函数,以便分选到选定的目标通道。在一些实
施方案中,分选信号包括定时信息,用于引起颗粒的分选。换句话说,分选元件5006接收何时颗粒会到达分选容积的指示。定时信息可以基于从第一检测信号确定的颗粒的速度,基
于分选容积与第一容积之间的距离等。
[0313] 可以采用能够使颗粒在横向于源通道5004的轴向方向的方向上位移的任何合适的技术。在一些实施方案中,分选元件5006包括静电分选仪。在一些实施方案中,并且如
图50中所示,分选元件5006包括压电致动器。例如,在一个实施方案中,分选元件5006包
括压电振动膜片(也以标记符5006标记),它限定出可经由孔5008A、5008B填充和/或清
空的容积5018。膜片可以与分选容积,或与分选容积相邻的源通道5004的可变形壁(未示
出)直接联通。在操作过程中,基于分选信号,膜片5006可以被快速地填充/清空,以在分
选容积中建立侧向力,其可推/拉颗粒,用于分选到目标通道5010A-5010C的特定一个通道
中。
[0314] 一旦颗粒被分选到目标通道(例如通道5010A,这里以非限制的方式使用该通道,以便简化说明),本公开内容的各方面允许检测目标通道5010A中的颗粒,以确保正确地分
选颗粒;换言之,以确定颗粒被正确分选(如果目标通道5010A是选定用于分选颗粒到其
中的通道),或者被不正确地分选(如果是其他的情况)。再次参考图50,第二检测装置/
部件5014与目标通道5010A的第二容积相关联,尽管另外的检测装置可以与其他目标通道
5010B-5010C相关联,并且多个检测装置可以与任何的目标通道5010A-5010C相关联。
[0315] 第二检测装置5014可以以类似于或不同于第一检测装置5012的方式被构造。在一些实施方案中,第二检测装置5014构造成至少检测颗粒在目标通道5010A中的存在和/
或容积,并产生与其相关联的第二检测信号。换句话说,当第二检测信号可以是任何合适的形式(如颗粒的荧光,阻抗等)时,在一些实施方案中,它被主要分析,以确定颗粒被分选到目标通道5010A中。作为一个例子,在一个实施方案中,第二检测信号是与一个或多个荧
光、反射率、阻抗等相关联的,如前面详细讨论。在一些实施方案中,第二检测信号允许至少阻抗测量,并且图51B示出了当颗粒经过时第二容积的示例性阻抗测量5104。测量可通过
扰动的‘宽度’(此情况中为1毫秒)表征,其为第一曲线204a的边缘和第二曲线5104b的
边缘之间的差,并且可以是颗粒速度的特性。
[0316] 因此,在一些实施方案中,基于第二检测信号验证颗粒从源通道5004到目标通道5010A的分选。例如,由于颗粒的速度可以是已知的(基于第一检测信号,如迹5102),在一个实施方案中,验证包括:确定第二检测信号在第一检测信号之后的一时间和/或时间段
内接收到。以这种方式,当大量的颗粒被单独但迅速地分选,能够避免对应于另一个颗粒的第二检测信号的可能性。
[0317] 在一些实施方案中,校验包括确定产生第二检测信号。以这种方式,当少量的颗粒被分选时,避免了与第二检测信号的定时详情相关联的计算开销。另外,更简单的检测装置可以使用,其更便宜、具有较小的占用空间等。
[0318] 在一些实施方案中,第二检测装置5014类似于第一检测装置5012。换句话说,在一实施方案中,对于相同的颗粒,第二检测信号和第一检测信号有一组共同确定的信号。在这种实施方案中,校验包括确定共同确定的信号在阈值极限内是相同的,和/或不同的。例如,在一个实施方案中,如果第二检测信号和第一检测信号都包括图52A的设置,验证包括确定第二检测信号和第一检测信号均包括迹5102。
[0319] 在一些实施方案中,验证可包括提供纠正和/或其它反馈信号来修改颗粒分选仪的操作和/或分选信号的参数,其包括(但不限于)强度,输出电压波形的宽度,定时等。
[0320] 在一些实施方案中,验证可以包括对分选颗粒执行另外的测试/操作,以确定它已被正确分选。
[0321] 图54示出了用于使用将第一检测信号和第二检测信号结合到单个基于时间的绘图的颗粒分选仪5000,验证单个颗粒的分选的示例性输出绘图5400。在第一检测装置5012
处的(待分选颗粒的)荧光检测会触发由分选元件5006进行分选。通过第二检测装置5014
在目标通道5010A检测出分选的颗粒。第二检测信号由第二检测装置5014产生,并且以如
以上所讨论方式,验证出颗粒被分选进入目标通道5010A。
[0322] 图55示出了用于验证对两种颗粒分选的示例性输出绘图5500,其中迹1和2(即第一检测信号)分别与第二检测信号1'和2'相关联,从而确定哪个第一检测信号与哪个
第二检测信号关联,并由此验证对两种颗粒的分选。
[0323] 图56A-56C示出其中两个第二检测装置5014A、5014C分别与目标通道5010A、5010C相关联的实施方案。如见于图56B,目标通道5010A可被指定为接收第一类型的
迹5612A(对应于特定的荧光剂,例如),而目标通道110C可被指定为接收第二类型的迹
5612C(对应于不同的荧光剂,例如)。第二检测装置5014A可以构造成产生第二检测信号
形式5614A,并且第二检测装置5014C可以被构造为生成第二检测信号形式5614C。以这种
方式,当迹5612A、5612C和第二检测信号5614A、5614C被绘制在一起(参照图56C)时,可
以更容易地进行验证。虽然这里所示的用于两个第二检测装置5014A、5014C,可以理解的是每一个第二检测装置产生不同的第二检测信号的这种方案很容易扩展到在另外的(一个
或多个)目标通道中的另外的第二检测装置。
[0324] 图57示出根据一实施方案的用于验证颗粒分选的方法5700。在一些实施方案中,计算机可执行存储介质包括用于执行该方法5700的计算机可执行指令。在5702中,第一
检测信号被接收。第一检测信号可以与第一通道(例如源通道5004)中的颗粒的光学特性
(例如,荧光)相关联。在一些实施方案中,第一检测信号可与多个光学信号相关联。在一
些实施方案中,多个光信号包括一个或多个参考信号和一个或更多的荧光信号。在一些实
施方案中,光学特性包括颗粒的一种或多种荧光性质。在一些实施方案中,颗粒是无机颗
粒,有机颗粒,混合颗粒,或一种或多种细胞(真核或原核)。
[0325] 在5704中,基于第一检测信号来确定多个第二通道的分选通道。以这种方式,基于颗粒的光学特性,确定将颗粒分选进入分选通道中。在一些实施方案中,基于颗粒的一个或多个荧光性质,确定分选通道。
[0326] 在5706中,传输用于将颗粒从第一通道分选进入分选通道中的分选信号。在一些实施方案中,传输分选信号包括传输分选信号到分选元件(例如分选元件5006)。在一些实
施方案中,分选元件包括压电致动器,并且分选进一步包括基于压电致动器的所需变形产
生分选信号,以将颗粒分选进入分选通道中。
[0327] 在5708中,第二检测信号被接收,其中,第二检测信号与在分选通道中的检测到的颗粒的存在相关联。在一些实施方案中,第二检测信号与阻抗检测相关联,其中在所述分选通道中检测的颗粒的存在改变了在第二检测通道中检测到的阻抗。
[0328] 在5710中,基于第二检测信号,验证颗粒从第一通道中分选进入分选通道中。
[0329] 在一些实施方案中,方法5700进一步地包括另外的第一检测信号。在一个实施方案中,另外的第一检测信号与在第一通道中的第二颗粒的光学特性相关联。第二颗粒的光
学特性可以是与第一颗粒的光学特性相同或者不同的。基于另外的第一检测信号来确定多
个第二通道的第二分选通道。第二分选通道可以与分选通道相同或不同。因此,基于第二
颗粒的光学特性,确定将第二颗粒分选进入第二分选通道中。第二分选信号被传输,用于将第二颗粒从第一通道分选进入分选通道中。另外的第二检测信号可以被接收,其与在第二
分选通道中第二检测颗粒的存在和/或容积相关联。在一些实施方案中,基于第二检测信
号以及基于另外的第二检测信号,验证颗粒从第一通道中分选进入分选通道中。在一些实
施方案中,基于第二检测信号以及基于另外的第二检测信号,验证第二颗粒从第一通道中
分选进入第二分选通道中。
[0330] 如本文所讨论,颗粒速度可以是可变的,并且可以基于在第一检测信号(如迹5102)中的峰之间的间隔来确定。因此,这可用于彼此紧密相间和/或以来自一个颗粒的
迹可以与至少另一个颗粒重叠的速度移动的两个或两个以上的颗粒。本文所描述的方案的
各方面可操作,以利用使用与每个颗粒相关联的第二检测信号重叠第一检测信号来区分颗
粒。
[0331] 例如,图58示出了与两个连续地分选和检测到的颗粒相关联的第一和第二检测信号(分别为1、2和1'、2')的示例性输出绘图5800。虽然在5804中,在迹1、2之间可看
到重叠,但单独的峰仍然可分辨的,并且基于第二探测信号1',2',颗粒的数目可以被正确识别为两个。图59A-59C示出了这里所讨论的问题,其中,来自两个颗粒的示例性迹5902、
5904重叠。图59A示出了在时间上分离的迹5902、5904,当它们容易被区分为单独的迹并
且相应地为单独的颗粒时。图59B示出了,例如当颗粒同时处于第一容积中(即与第一检
测装置5012相关联)时,迹5902、5904为重叠的。图59C示出产生的迹5908,具有六个可
识别的峰,并混淆了对颗粒计数的确定。确定第一检测信号时的误差可能显著影响下游,如不准确的颗粒速度和/或荧光光谱确定,这反过来既可导致颗粒分选的错误定时(即分选
信号将具有不正确的触发信息,用于分选元件5006),还可导致完全不正确的分选(即颗粒
可以被认为是属于另一个目标通道)。
[0332] 图60A-60B示出了颗粒分选/计数的潜在错误,其中基于第二检测信号正确计数出3个颗粒,即使第一检测信号是重叠的。具体地,图60B的示例性绘图示出了如何重叠第
一检测信号将不会导致第一颗粒被第一检测装置5012检测到(其中仅对应于迹线2、3的
颗粒被检测),但第二检测信号1'、2'、3'不仅指示出迹2、3与3个颗粒有关,而且第二检测信号1'、2'、3'之间的时间间距提供出颗粒间距信息。即,第二检测信号1'、2'、3'指示出对应于第二检测信号2',3'的颗粒更紧密地间隔。
[0333] 一般地,因此从第二检测信号收集的信息可以不仅被用于对细胞计数,还用于对细胞分选的反馈控制,其中,本文中所描述的方案可以从与过去的计数误差相关联的迹“习得”以分析未来的迹。例如,如果图60B的迹2、3再次出现,它们很可能会更准确地与显示三个颗粒相关。在这点上,这三个颗粒要么将被相应分选,或者如果这是不可能的(例如分选元件无法足够快地响应),将被解释(accounted for),这取决于它们被认为在哪个目标
通道结束(即基于所述第二探测信号1'、2'、3')。
[0334] 此外,当不正确的计数导致不正确的分选时,本文描述的方法可以任何合适的方式解释错误。例如,如果待分选到目标通道5010A的颗粒将被用来制造疫苗组合物时,不希望的颗粒不正确地分选到目标通道5010A可在确定最终疫苗组合物和/或纯度时被解释,
其中疫苗组合物可以被丢弃,如果这样的组合物和/或纯度低于所需要的监管标准。
[0335] 因此,本文所描述的方案的各个方面可利用第一检测装置5012和第二检测装置5014之间的检测容积差异,以实现误差补偿的细胞计数/分选。换句话说,由于更广泛的检测技术,第一检测装置5012可以与较大的检测容积(即第一容积)相关联,这是因为第一
检测信号可以形成分选颗粒的基础。在另一方面,第二检测装置5014可以被构造为简单地
执行二进制分类(即,无论是颗粒存在于或没有存在于第二容积中),并且可以使用较小的
检测容积,采用更简单的检测方法,其中多个颗粒同时存在的机会大大降低。例如,参照图
55的示例性绘图,迹1(第一检测信号)具有大约2毫秒的时间宽度,而相应的第二检测信
号1'具有大约0.5毫秒的时间宽度;对于相同的颗粒速度,这可以指示出第一容积为第二
容积的约四倍大。
[0336] 图61示出根据实施方案的基于反馈来计数颗粒的方法6100。在一些实施方案中,计算机可执行存储介质包括用于执行该方法6100的计算机可执行指令。在6102中,多个
第一检测信号被接收,每一个第一检测信号与在第一通道中的颗粒的光学特性相关联。
[0337] 在6104中,在第一通道中的第一数目的颗粒是基于多个第一检测信号来确定的,第一数量的颗粒具有类似的光学特性。在一些实施方案中,多个第一检测信号包括至少一
对重叠的第一检测信号。
[0338] 在6106中,多个第二通道的分选通道是基于第一检测信号来确定的。以这种方式,基于第一数目的颗粒的相似的光学特性,确定将所有第一数目的颗粒分选进入分选通
道中。
[0339] 在6108中,一个或多个分选信号被传输,用于将第一数目的颗粒中的每个颗粒从第一通道分选进入分选通道中。在6110中,多个第二检测信号被接收,其中,每个第二检测信号与在分选通道中的颗粒的存在和/或容积相关联。在6112中,在分选通道中的第二数
目的颗粒是基于多个第二检测信号来确定。在6114中,多个第三检测信号被接收,每个第
三检测信号与在第一通道中的另外的颗粒的光学特性相关联。
[0340] 在6116中,在第一通道中的第三数目的颗粒是基于多个第三检测信号、基于确定的第一数目的颗粒以及基于确定的第二数目的颗粒来确定的。在一些实施方案中,所确定
的第一数目的颗粒与所确定的第二数目的颗粒相同,并且确定一个或多个第三检测信号与
所确定的第三数目的颗粒相关联。在一些实施方案中,所确定的第一数目的颗粒小于所确
定的第二数目的颗粒,并且确定一个或多个第三检测信号与第四数目的颗粒相关联,第四
数目的颗粒大于所确定的第三数目的颗粒。
[0341] 如前面所讨论的,第一检测装置5012和/或第二检测装置5014可以检测与在检测容积中的颗粒或者与检测容积本身相关联的多个特性。图62A-62C示出了显示具有含有
颗粒1308的通道1310的颗粒分选仪1300的一部分的示例性实施方案。虽然本文所述的
是假定通道1310对应于源通道104,应该理解,这些实施方案很容易地适用任何目标通道
118A-118C。
[0342] 参照图62A,作为第一检测装置,分选仪6200包括强度参考和荧光迹测量设置6212,类似于图52A,其中通道6210的第一检测容积6204与类似于滤波器阵列5208的滤波
器阵列相关联。图62C示出了由设置6212产生的示例性迹。
[0343] 作为第一检测装置,分选仪6200还包括阻抗测量装置6202,其包括电极6202A、6202B,限定出通道6210中的第二检测容积6206。在一些实施方案中,第一检测容积6204
的至少一部分与第二检测容积6206重叠。例如,图62A示出了第二检测容积6206被完全包
含在第一检测容积6204内,虽然不必总是这种情况。例如,在第一检测容积6204之前或之
后以重叠或不重叠的方式形成第二检测容积6206。在一些实施方案中,第二检测容积6206
小于第一检测容积6204。图62B、62C示出了荧光设置的示例性输出绘图。
[0344] 在一些实施方案中,阻抗测量与颗粒6208在第二检测容积6206中的存在和/或容积相关联。在一些实施方案,阻抗测量结果与颗粒6208的尺寸相关联。图62B示出了颗
粒的尺寸如何在理论上影响阻抗测量结果。
[0345] 阻抗测量装置6202的示例性和非限制性的实施方案示出于图63A中,其中电极6302A、6302B(基本上与电极6202A、6202B对应)形成为颗粒分选仪6300的基板上的金引
脚。图63B-63C示出了使用颗粒分选仪6300对聚苯乙烯珠进行示例性的阻抗测量,其中图
63B是典型的测量结果,而图63C是对三个不同尺寸的珠的阻抗测量结果。
[0346] 以这种方式,可以在同一位置获得颗粒的尺寸和荧光信息,并且可以基于这两种信息进行更具体和/或准确的颗粒分选。在一些实施方案中,尺寸和/或荧光信息可以用
于确定颗粒的其他性质,如,但不限于,生物活性、化学活性等。以这种方式,分选可以基于与检测到的(一个或多个)信号相关联的相关性的假说/推论。
[0347] 图64示出了根据一些实施方案,用于颗粒分选的方法6400。在一些实施方案中,计算机可执行存储介质包括用于执行该方法6400的计算机可执行指令。在6402中,第一
检测信号被接收,其与在第一通道的第一容积中的颗粒的第一特性相关联。在一些实施方
案中,第一检测信号是与多个光学信号相关联的。在一些实施方案中,多个光学信号包括一个或多个强度参考信号和一个或多个色彩编码信号。在一些实施方案中,光学性质包括颗
粒的一种或多种荧光性质。
[0348] 在6404中,第二检测信号被接收,其与在第一通道的第二容积中的颗粒的第二特性相关联。在一些实施方案中,第二检测信号与阻抗检测相关联,其中阻抗检测是基于颗粒在第二容积中的存在和/或容积。在一些实施方案,阻抗检测进一步基于颗粒的尺寸。在
一些实施方案中,第一容积与第二容积重叠。在一些实施方案中,颗粒的一个或多个性质是基于一个或更多的第一检测信号并且基于第二检测信号确定的,并且分选通道是基于一个
或多个性质来确定的。在一些实施方案中,从一个或多个以下选项中独立地选择每一个性
质:颗粒尺寸、颗粒荧光、化学活性和生物活性。
[0349] 在6406中,多个第二通道的分选通道是基于一个或多个第一检测信号和第二检测信号来确定的。以这种方式,确定颗粒的分选是基于颗粒的一个或多个第一光学特性和
第二光学特性。在一些实施方案中,基于颗粒的一个或多个荧光性质,确定分选通道。
[0350] 在6408中,分选信号被传输,用于将颗粒从第一通道分选进入分选通道中。
[0351] 图65示出了根据一些实施方案的用于颗粒分选的系统6500。系统6500包括通道组件6502、计算设备6504、第一检测装置6506、第二检测装置6508和分选元件6510。系
统6500的各种部件可以适宜地为电、光、有线和/或无线联通的,如由图65中的线所指示。
计算设备6504可以包括个人计算机、服务器、工作站、平板电脑、移动装置、计算环境、在任何这些平台上运行的应用程序或模块等。
[0352] 通道组件6502包括至少一个源通道和一个或多个目标通道,如前面所述。通常,通道组件6502可以调整尺寸以配合到适当的分析平台和/或以其他方式与适当的分析平
台相互作用,所述平台包括,但不限于,显微镜,流式细胞仪,生化分析仪(如PCR),基于微阱阵列的平台等。可以采用任何合适的材料,用于制造通道组件6502,其包括,但不限于,硅,聚二甲基硅氧烷(PDMS),聚碳酸酯(PC),聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA),环烯烃聚合物
(COP),环烯烃共聚物(COC)等。在一些实施方案中,通道组件1602的材料是生物相容的和
/或光学透明的。
[0353] 第一检测装置6506是适合于检测检测容积和/或颗粒特性的任何系统,其可以向从源通道分选细胞施加。在一些实施方案中,第一检测装置6506是荧光检测系统,其包括
一个或多个激发源,一个或多个检测器,可以包括全通滤波器和荧光过滤器的一个或多个
滤波器阵列,以及适当的耦合光学器件,用于耦合到通道组件6502。
[0354] 第二检测装置6508是适合于检测检测容积和/或颗粒特性的任何系统。在一些实施方案中,第二检测装置6508向从源通道分选细胞施加。在一些实施方案中,第二检测
装置6508向验证在目标通道中分选细胞施加。在一些实施方案中,第二检测装置6506是
阻抗检测系统,其包括一个或多个电极,以及用于对接通道组件6502的适当的连接元件。
[0355] 分选元件6510是适于影响在源通道中的颗粒的横向位移的任何系统,以实现和/或以其他方式增加分选颗粒进入几个目标通道之一的概率。在一些实施方案中,分选元件
6510是压电致动器。
[0356] 图66示出了根据一些实施方案的计算设备6504。计算设备6504包括至少一个处理器6512和存储器6514,并且还包括I/O接口6516和连接接口6518。处理器6504包括
获取模块6520、第一检测模块6522、分选模块6526、第二检测模块6528和验证模块6532。
处理器6504还包括显示模块6534,以联通和/或控制与设备6504相关联的显示装置(未
示出)。
[0357] 在一些实施方案中,设备6504被构造成用于颗粒的分选,如由方法5700通常描述的。在一些实施方案中,设备1604被构造成用于基于反馈对颗粒进行计数,如由方法6100
通常描述的。在一些实施方案中,设备6504是被构造成用于颗粒的分选,如由方法6400通
常描述的。
[0358] 在一些实施方案中,获取模块构造成获取与第一检测信号相关的多个光信号,获取模块进一步构造成获取与第二检测信号相关的电信号。
[0359] 在一些实施方案中,第一检测模块6522构造成从第一检测装置6506接收与在通道组件6502的第一通道中的颗粒的一种或多种光学特性相关联的第一检测信号。
[0360] 在一些实施方案中,分选模块6526构造成基于第一检测信号确定多个第二通道的分选通道,从而基于颗粒的一个或多个光学特性确定颗粒的分选。分选模块6526还可以
构造成传输分选信号至分选元件6510,用于从第一通道分选颗粒进入分选通道。在一些实
施方案中,分选模块6526还被构造成基于颗粒的一个或多个荧光性质确定分选通道。
[0361] 在一些实施方案,第二检测模块6528构造成从第二检测装置6508接收第二检测信号,第二检测信号与在分选通道中检测到的颗粒的存在和/或容积相关联。
[0362] 在一些实施方案中,验证模块6532构造成基于第二检测信号验证从第一通道分选颗粒进入分选通道中。
[0363] 在一些实施方案中,第一检测模块6522被进一步构造成从第一检测装置6506接收另外的第一检测信号。另外的第一检测信号,在一个实施方案中,与第一通道中的第二颗粒的光学特性相关联,其中第二颗粒的光学特性与第一颗粒的光学特性不同。
[0364] 在一些实施方案中,分选模块6526进一步构造成基于另外的第一检测信号确定多个第二通道的第二分选通道。第二分选通道可以与分选通道不同,从而基于第二颗粒的
光学特性,确定将第二颗粒分选进入第二分选通道中。在一些实施方案中,分选模块6526
还可以构造成传输第二分选信号,用于从第一通道分选第二颗粒进入分选通道。
[0365] 在一些实施方案,第二检测模块6528还可以构造成从第二检测装置6510接收另外的第二检测信号,另外的第二检测信号与在第二分选通道中第二检测颗粒的存在和/或
容积相关联。
[0366] 在一些实施方案中,验证模块6532还构造成基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证颗粒从第一通道分选进入分选通道。在一些实施方案中,验证模块6532还构造成基于第二检测信号并且基于另外的第二检测信号,验证第二颗粒从第一通道分选
进入第二分选通道。
[0367] 在一些实施方案中,反馈模块6530构造成基于第二检测信号训练分选模块1626,用于将第一通道中的另外的颗粒分选引入目标通道之一。
[0368] 在本文公开的系统、装置和方法的实施方案中,构图缝隙可以用来(1)来自上游检测分区的编码信号,和(2)在时间上对信号进行编码,以使得可通过数字信号处理提高
信噪比。由于信号的波形可被放置在光电检测器(例如,光电倍增管)前面的狭缝图案预
先确定,数字匹配滤波器可以被应用以放大信号,并抑制噪声。信号处理算法可用有限脉冲响应(FIR)滤波器来实时实施。
[0369] 在一些实施方案中,底部基片上形成的横跨自分选连结起的下游分选通道的电极,被设计成产生电信号,检测细胞、珠或颗粒所经过的区域的阻抗变化,从而确认/验证成功的分选事件。在每个细胞被偏转至分选通道之一后,“验证”信号应同样被检测到,以确认分选事件的成功。
[0370] 对用户的益处包括:用户可以监视分选操作并且接收实时反馈;如果没有验证信号被观察到,则需要用户停止实验并调整分选参数(诸如PZT触发定时,电压和/或对准
等),使其正确,直到他/她可以看到一对荧光阻抗信号;注册荧光-阻抗信号对可以是实
时的‘分选精度’和‘分选纯度’的数据的代表。因此,用户可以知道分选样品的浓度,它的纯度(例如多少样品细胞和多少非希望的细胞处于分选样品中),而不需使分选样品运行
通过流式细胞仪,这在许多情况下会造成细胞的损失。
[0371] 一些实施方案涉及在注射模制的一次性颗粒分选仪上组合光学器件、声学和/或微流体器件的芯片上实验室技术。注射模制的芯片可以被制造,使其如果被损坏或污染则
可更换。此外,由于芯片和流体路径可制成一次性的,它非常适合于交叉污染和无菌必须加以解决的临床环境。
[0372] 一些实施方案涉及芯片上的压电膜片,以便致动分选。可通过使用限定的电压波形利用压电膜片的迅速的和特定的偏转以驱动含有细胞或颗粒的小容积的流体(如,100
皮升到1纳升,或1纳升到1微升)流向特定的分选通道。压电膜片可以被大量生产并且
直接结合到注射模制的芯片。压电设计可以移动带有细胞的流体,导致细胞和流体之间的
非常低的相对加速度和剪切力(0.1帕斯卡)。
[0373] 下列实施例示出但不限制本文所描述的技术。
[0374] 例1:利用流体动力学微流体装置的第一阶段CTC富集。
[0375] 流体动力学性质可用于在用微FACS分选之前,获得CTC的100倍或更高倍数的富集(见实施例3)。在努力实现>100倍的富集时,若干螺旋通道装置被设计出来。几个螺
旋富集结构被设计为CTC的第一阶段富集。螺旋装置结构利用细胞在层流条件下的物理性
质的优势,其中惯性升力和迪恩力允许聚焦和分离细胞。惯性升力与迪恩力之间的平衡允
许基于尺寸对任何类型的样品平衡位置。这种方案导致了靶大细胞从较小的细胞的混合物
中有效地分离。总的结构和构思示于图2A-2C中,其具有近似的尺寸。在第一步骤中,不同尺寸的细胞的混合物(例如,血液中的CTC)引入到入口通道(螺旋的中心,图2A),并且通
过另一入口引入缓冲溶液。在经过螺旋结构后,由于惯性作用,较大的细胞与较小的细胞分离。
[0376] 微流体装置被设计和使用AutoCAD软件制造,并且被送至用高分辨率(20,000dpi)进行光刻掩模印刷。使用SU-8模具建成。通道的宽度为250微米,通道的高
度为50微米。在螺旋结构的末端,主通道可分成子通道,以根据细胞的尺寸收集不同细胞
(参见图3A-3C)。多种的螺旋富集结构被设计为改善富集、捕获效率和可制造性。具有2
至10个流出通道的装置被设计,并被用于有效地分离,但在使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)的
制造过程中提供了一些困难。双通道设计容易制造,并提供合适的结果(示于图3C,用粉红色染料可视化通道)。
[0377] 评估和测试
[0378] 螺旋微流体装置的间距性质是通过使用不同尺寸(例如,直径为7.6微米、10.5微米、25.3微米)的胶乳微珠评价的,并在收集出口的端部为每个珠尺寸确定精确的间距位
置。为了验证装置的性能(例如,富集),在UCSD处使用BD-Accuri C6进行每次运行之前
和之后,测量微珠的初始混合物比率和最终混合物比率。在处理期间,还测试了400微升/
分钟、1毫升/分钟和1.5毫升/分钟的各种流速的效果。尺寸25.3微米的珠(类似于大
多数的CTC的尺寸)通过出口通道1和2与7.6微米和10.5微米珠良好地分离,并且具有
使用1.5毫升/分钟流速的最佳性能(参见图4A-4C)。25.3微米珠的群体在这样的流动
条件下富集了600倍。即使利用微珠进行测试,这样的富集因子也明显验证了设计和方案。
[0379] 利用混入的CTC进一步的修改和测试
[0380] 在使用珠初步评估后,使用各种肿瘤细胞系(例如,HeLa,MCF-7,和U2OS细胞)对微流体装置进行测试,并在某些情况下,对从溶解有红血细胞的全血的超过100倍的进
行富集观察。在一些情况下,由于制造挑战,设计被修改。一个源器件具有10个收集通道,
75微米宽,185微米高。每个出口通道通过仅30μm的分离,并且由于其高宽比(>6),在使
用高度粘稠的SU-8光致抗蚀剂制造装置的模具时,存在挑战。对重新设计的装置进行了测
试,其具有5和2个出口。在某些情况下,具有比图3A更少的出口的设计改善了SU-8模具
的制造过程(参见图5A,装置1和装置2)。重新设计的2-出口装置能够清楚地分开25微
米珠、HeLa细胞和MCF-7细胞到一个通道中,并且最白细胞通过较大的通道退出(图5B)。
对两出口设计做出进一步修改,通过改变通道的尺寸,使得“Y”连接更顺畅,并在末尾建立扩展区域,以提高净化。这些修饰导致对癌细胞的优良富集特性,平均429.5倍富集,相比起始量。
[0381] 在一个有代表性的实验中,含有约1900万白细胞的6毫升血液混入标记有抗EpCAM-PE抗体的~1000MCF-7细胞。在用RBC溶解缓冲液溶解红血细胞后,将剩余的细胞
重新悬浮在PBS中,并通过螺旋富集结构。跟随运行,剩余约21584个白细胞代表除去约
99.8%的白细胞(图6)。跟随运行,剩余约760个MCF-7细胞代表保留约80%(图6)。在
六个独立实验中,这个过程中除去99.8%的白细胞,保持70-100%的混入的MCF-7癌细胞。
在回收时的一些变化可起因于在每个实验的开始和结束时计数细胞的高可变性。
[0382] 例2:流体动态辅助的结合CTC的抗体
[0383] 设计被测试,其中抗体添加到癌细胞并且混合物通过混合结构注入来实现快速和有效的细胞标记。针对EpCAM测试几种市售抗体(CTC的上皮标记)。结果指示出,样品
可潜在地在1-2分钟(相比20-60分钟)被混合结构的一次性芯片所标记。这种方案在
OncoSorter系统中是可能的,由于用于微流体检测器系统芯片为一次性性质的缘故。最初
的测试显示出优良的标记效率。在一些实施方案中,微流体检测器系统是自动化的,并且适用于临床环境,在临床环境中,没有在细胞处理和流式细胞术方面训练有素的科学家。
[0384] 流体动力学仿真软件用来进行设计和分析混合结构,以提高芯片上的抗体与CTC的结合效率。使用封闭的芯片上设计在微流体芯片上自动混合可以减少样品处理,并提供
用于细胞的高效抗体标记。被动型混合结构被开发出,并且可以与第一和第二阶段的富集
和/或分选结构集成。几个设计迭代被生成并使用流体动力学仿真软件(COMSOL)被分析。
一个有效的设计包括“蛇形”混合结构(图7)。模拟期间,在仅4个转弯后,观察到两个样
品的完全混合。为了确保充分的混合和结合的机会,使用PDMS(如实施例1),混合结构的芯片被设计和制造成具有20个转弯,并且(在一些实施例中)被用于本文中所描述的检测器
系统。
[0385] 评估和测试
[0386] 本文所描述的CTC标签和捕获平台中的一个优点是能使用任何荧光标记物来标记CTC的灵活性。在这个例子中,EpCAM(经过验证和有效标记)被使用。对于抗体标记
的初始测试,两个商业抗体PerCP-e710 Human CD326(克隆1B7,eBioscience公司)和
PE共轭的EpCAM(VU1D9,细胞信号传导技术(CST))被测试。这两种抗体的效果很好,但用
eBioscience公司的EpCAM抗体没有观察到与未标记细胞充分分离。PE共轭VU1D9表明使
用1:100的(抗体与细胞样品)容积比改进与未标记细胞的分离,并且使用1:25的混合比
(图8)接近完全分离。在两种上皮衍生的癌症的细胞系,HeLa和MCF-7,对这种抗体进行
测试,两者给出类似的结果。还用在一些混入实验中使用的GFP阳性的MFC-7细胞系观察
到优良标记。实验结果显示,GFP阳性的癌细胞可正确地设门,用于GFP和GFP/EpCAM的阳
性细胞(图8C-D)。综上所述,PE共轭VU1D9工作非常良好,并在使用混合结构的所有的
EpCAM标记实验中使用。
[0387] 为了评价和比较混合结构的芯片的混合和标记性质,两种方法被使用;(1)传统的在Eppendorf管中混合芯片外抗体,(2)使用本文所设计的混合结构(图9A-9B)进行抗
体-标记。使用微混合器,在1分钟内,99%以上的活MCF-7细胞被用PE抗体染色,而芯片
外标记花费超过30分钟,达成83%标记的癌细胞。在使用检测器系统进行分析时,荧光和
标记也远高于一些检测极限。如果没有洗的话,多余的抗体在分析过程中产生一些背景。跟随混合结构运行,简单的清洗步骤可以除去非结合的抗体,降低背景的荧光噪音,但建立了额外的步骤。这个问题可以通过软件在分析过程中忽略(如设门)非常小但明亮的信号加
以解决,并且会在开发的下一阶段实施。可使用250μl/min的流速,并且当抗体在芯片内
混合期间,不会引起任何细胞死亡。因此,混合结构可被用作第一螺旋富集装置和微流体检测器之间的中间步骤。集成的样品制备系统将会使整个过程更容易,减少样品不一致或污
染。
[0388] 例3:用于CTC分离的台式微流体检测器
[0389] 微流体检测器被开发,以完成CTCs的计数和分离。在某些情况下,内部设计的微流体荧光激活细胞分选仪(微流体检测器)被修改,用于CTC分离和分析。alpha原型的
一种设计修改最大化收集效率,以确保几乎所有的CTC被分选。AutoCAD设计被产生,用来
在Nano3中使用PDMS和在UCSD的Lo实验室制造微流体检测器(图10A-B)。主通道被设
计为200微米的宽度并且分成三个50微米的样品采集通道,高度为80微米。芯片保持件
也被设计成,允许在每次使用后或在存在阻塞(图10C)时进行芯片更换。保持件通过使用
已经实施到装置中的对准标记,确保了微流体通道与光轴精确地对准,从而消除了用于不
同装置的检测信号的任何潜在波动。保持件的位置(即,检测区域的位置)可以容易且精
确地通过光学的xyz平台(图10C,左)控制。该装置具有使用特氟隆管道的三个入口以及
出口。一个样品和两个鞘流入口位于顶部,并且位于底部的三个管是样品/废液收集通道。
在一些情况下,压电致动器盘被永久地结合到每个微流体检测器。在一些情况下,压电致动器盘被永久地结合到LOC。
[0390] 前述的α原型检测器系统使用芯片上波导,以及独特的时间-空间编码架构设计,用于荧光和散射检测。跟随光学询问,装置使用集成压电盘致动器,以通过排出有限容积的流体(100皮升至1纳升)来分选单个细胞。它还结合了使用特氟隆AF-涂层的光流
体波导的芯片上激光照射。这样的检测的设计和方案因涂覆在PDMS壁上的特氟隆AF层的
质量而有一些商业化方面的限制,诸如费用、复杂的制造处理和引入散射光噪声。在这一目标中修改原型被设计成具有向芯片外部的激光激励,从而避免了这些重要的问题。488nm
的激光器被芯片外光学部件聚焦,照射微流体通道的直径为400微米(这可以调整)的检
测区域,从而简化了制造处理。光学部件已被组装在紧凑的面板上。光纤耦合488激光器
(25mW)被芯片外光学部件聚焦,芯片外光学部件包括50X长工作距离的显微镜物镜,照射
直径为约400微米的检测区域。最初的电子控制系统已经完成,并与PMT(检测)和PZT(分
选)接口相连。一种用于估计珠的行进速度的改进的算法可继续在分选速度和准确性方面
提供更高的性能。
[0391] 评估和测试
[0392] 只使用一个PMT(检测器)来检测和分析三种或更多的荧光标记物的检测系统,采用了独特的色彩-空间-时间(COST)算法。对于改进的检测,新的滤波器阵列被设计并且
被放置在像面上进行测试,使得能以特定频率对来自PMT的脉冲信号进行调制,从而允许
进一步复杂的数字信号处理,例如通过应用FIR匹配滤波器算法提高信噪比、进行速度估
计。使用这样的结构,检测系统足够灵敏,以检测来自彩虹校准珠的第五峰。这个灵敏度范围是足够多的,以便检测用EpCAM抗体标记的GFP阳性细胞和MCF-7细胞(参见图12A)。
电子系统寄存器从PMT输出信号并且送出锯齿输出波形,以触发安装在微流体检测器上的
PZT致动器。用于分选的输出电压是10V,并且上斜坡时间是1毫秒,但是这可以更短,以在未来达到更高的分选流通量。下面图12B显示了一图像,示出了如何响应于由PZT致动器
所施加的压力脉冲发生分选事件。通过由PZT施加的压力,样品流(含有罗丹明染料,用于
可视化)被偏转到左侧通道,而在PZT被关闭时,返回原来的位置。用于鉴别多种色彩的算
法(例如,COST),然后珠或细胞的速度估算用于从混合样品中只捕获CTC。电子装置可以
被升级,以使用更快的实时控制电子系统。电子控制系统可以被优化,以达到更高的分选效率和样品纯度。
[0393] 通过分选微珠和GFP阳性MCF7,微流体检测器的分选能力被测试和验证。对于微珠或CTC呈阳性的每个检测到的样品触发分选事件。为了验证分选,下游的分选验证系统
被使用。首先,MCF7细胞被检测,并产生三波瓣的峰信号(111-调制)。随后,基于FPGA控
制系统计算延迟时间并且通过施加1msec的10(V)而触发芯片上的压电致动器(PZT盘)。
MCF7细胞被偏转到下游分选通道之一,并且另一个空间编码信号(1011-调制)实时验证成
功的分选事件。下表显示了这里分析的微流体检测器原型在分选珠或混入的癌细胞时,可
以达到约70%的分选纯度(即,回收率)。在这些实验中,已知数目的微珠或MCF-7细胞被
引入,并使用微流体检测器用于检测和分选。平均来说,约109个的CTC的近68%在分选后
被回收(表1)。
[0394] 表1:分选仪测试和验证:
[0395]检测数目(平均) 分选数目(平均) 回收率
FITC微珠 223 173.5 77.80%(+/-2.5SD)
MCF-7细胞 109.5 74 67.58%(+/-6.72SD)
[0396] 细胞存活率区分出本文所述的系统,相比依靠固定细胞和不适于进一步的下游应用的现有CTC检测系统。
[0397] 在微流体检测器中,使用碘化丙啶(PI)或锥虫蓝,以两个主要步骤验证了细胞存活率。在预富集螺旋富集结构中,模拟MCF-7细胞(未处理的,即没有螺旋)和通过螺旋富
集结构处理的细胞的存活率被比较。相比模拟细胞,检测到处理的细胞没有显著的细胞死
亡(参见图13)。在最后的分选阶段,分选后收集的MCF-7细胞经显微术可视化,并且显现
出处于良好的状态。敏感的心肌细胞被用于将本领域的FACS系统(BD Aria II)的当前状
态于本文描述的微流体检测器进行比较。商用Aria II系统有71%的细胞存活率,而微流
体检测器展示出98%的细胞存活率。增加的微流体检测器的细胞存活率可以(部分地)归
因于在微流体系统中的较小的剪切应力。
[0398] 在最后的实验中,系统的所有三个阶段被集成,以确定集成系统可如何很好地检测并收集细胞:从预富集、到标记以及最后用微流体检测器检测/采集。以高范围(2,000
个活细胞)和低范围(~10个活细胞),混入MCF7的细胞被导入到7.5毫升的血液中。使
用市售流式细胞仪(BD Accuri C6),对每个范围执行三个完整的实验,并且对最终收集的
细胞进行了确认。在低和高的模拟CTC的范围内,初步结果显示令人印象深刻的检测、收集效率和一致性(表2)。平均而言,用于高范围的566个CTC(或28%),并且低范围的3.3
个细胞(或31.2%)被收集。用市售流式细胞仪(BD Accuri C6)对收集的样品进行了确
认,并且检测到数量相同的细胞。当每个步骤被集成到具有开始-至-结束流体和泵系统
的单一系统中,具有改进的数字信号处理算法,而且当正向和侧向散射都被包括在内时,选择和收集效率可被改善。
[0399] 表2:对在7.5ml血中具有2000和10个活的混入“CTCs”的集成系统的最终测试:
[0400]
[0401] 总结
[0402] 在外周血中找到的CTC提供了用于微创“液体活检”的机会,以确定原发肿瘤的恶性程度和可以形成转移的细胞存在。这里测试的系统表明了远远超过100倍(平均为429倍富集)预富集初始CTC群体、用微流体混合器使用EpCAM抗体迅速标记CTC、以及检测到
的所有细胞的近70%被最后分选的能力。在此描述的系统可以改善检测以及下游分子分
析和单个癌细胞测序,以及个性化的诊断和治疗。此外,这里描述的系统可以实施二维流限制,改进的电子和检测速度,其全部嵌入一次性和可制造的芯片(例如,热塑料芯片)。
[0403] 例3:芯片上试剂混合
[0404] 在流式细胞仪中未满足的需求是样品制备和在装载到用于分析和分选的流式细胞仪之前进行标注。通常情况下,必须通过将单独的被标记抗体(或染料)手动吸取到细
胞样品中,对细胞进行标记。此过程可导致大的数据变化,例如由于抗体处理的差异、吸取不精确、存储不一致、抗体批量变异和/或类似原因。这对于那些必须由较少经验的技术人员进行检测的临床和护理点的应用,特别存在问题。
[0405] 具有在芯片上预加载的芯片上试剂,可以使处理“全部托付(turn-key)”,而不必担心什么抗体、多少抗体或吸取误差。该试剂可以被预加载,并且根据试验或应用在分析之前或分析之后与样品进行混合。
[0406] 因此,在本文描述的某些实施例中,本申请(例如,颗粒分选仪)的系统/装置可包括在其上形成用于试剂的存储和与所分析的颗粒的混合的一个或多个区域。图67示出
了根据一些实施例,颗粒分选仪6700的框图。颗粒分选仪包括区域6730,用于预加载一个
或多个试剂。混合器/混合区域6734也被形成,其允许预加载的试剂与在细胞样品端口
6732(例如,类似于端口5002)接收到的细胞样品混合。一个或多个预加载的试剂可以是
任何合于细胞分析的,并且可以包括,但不限于,免疫标记抗体,DNA/RNA标签(例如,碘化丙锭),细胞状态标记物(例如,用于细胞凋亡、(一个或多个)DNA周期等),纳米颗粒(磁
性,荧光等)等。如图67所示,通过分析仪6736和/或分析仪/分选仪6738,可以分析和
/或分选颗粒-试剂混合物。在一些实施方案中,并且也如图67所示,被分析和/或分选的
颗粒可以进一步用另外在区域6740处形成到颗粒分选仪上的另外的预加载试剂处理。另
外的试剂可以是任何适于细胞分析的,并且可以包括,但不限于,用于下游分子分析的细胞溶解缓冲液(例如,用于DNA/RNA/蛋白质分析),用于细胞保存的样品固定(如仲甲)溶
液,用于下游应用(如成像)的免疫标记抗体,生长介质(生长因子、细胞因子、氨基酸等)
等。
[0407] 具有在芯片上预加载的芯片上试剂,使得处理“全部托付”,而不必担心例如什么抗体、多少抗体、吸取误差和/或类似问题。该试剂可以被预加载,并且根据试验或应用在分析之前或分析之后与样品进行混合。
[0408] 图68示出了采用芯片上混合器的示例性颗粒分选系统,以便从几毫升(例如6mL)血(例如,患者的血液样本,和/或混入CTC的血液对照样品)起,执行对血中的细胞的细
胞标记和分离(例如,循环肿瘤细胞)。在红血细胞溶解后,由CTCs和WBCs的混合物组成
的样品可被装载到集成微流体芯片6800中的注射器泵6802,如图68所示的。样品经过串
联的预富集微流体系统6804、抗体混合室6806和芯片上细胞分选仪6808。在操作过程中,
当泵6802注入样品到螺旋装置(或任何合适的富集设计),以便将CTCs从WBCs中分离出
来,来自富集装置的出口的CTC,在行进通过混合器的蛇形路径之前,进入预加载有抗体的芯片上的腔室中。流量平衡可以通过协调泵6802的注入速度和泵6810的撤回速度来实现。
在CTC-抗体结合之后,泵6802可以停止并且泵6810可以将样品注入到microFACS部分,
而泵6812提供鞘流动。在这个阶段,每一个标记有抗体的CTC被荧光检测和分选。
[0409] 例4:用于色彩-空间-时间(COST)流式细胞仪系统的色彩补偿
[0410] 用于色彩-空间-时间(COST)流式细胞仪系统的色彩补偿
[0411] 对流式细胞仪系统,实现对被两种或多种类型的荧光团荧光标记的对象的精确检测以及表示,色彩补偿是理想的。这也是最具挑战性的任务之一,需要重要的用户关于样品的性质的经验和知识,以便正确地执行色彩补偿。在包含两种荧光色的色彩补偿的一个简
单的例子中,其可以代表经过各自的色彩滤波器之后从两个光电倍增管检测到的信号。
[0412] S1=T11I1+T12I2 (2-a)
[0413] S2=T21I1+T22I2 (2-b)
[0414] 其中S1和S2是来自PMT1和PMT2的测量信号。I1和I2是我们想从荧光团1和荧光团2检测到的真实强度。2×2的T矩阵的若干元素代表光从每个荧光团发出到色彩滤波
器(或分色镜)后面的2个PMT的传输。在理想情况下,两种荧光团的发射波谱不重叠,非
对角线元素T12和T21都应该是零。然而,由于荧光团的相对宽的发射波谱,来自一个荧光团的相当大量的光可以在相邻频谱到达PMT,得到T12和T21的非零值。
[0415] 色彩补偿是在等式(1)中从所测量的信号S1找到真实强度I的处理。求解等式(2),我们获得
[0416]
[0417]
[0418] 其中D是T矩阵的行列式并等于T11T22-T12T21。在现实中,由于噪声讹误,也可能难以从等式(3)恢复真实信号。这是真实的,特别当一个信号具有比其他信号显著更大的幅值时,这可能在最终的色彩补偿的结果中产生较大的误差。
[0419] 与传统的流式细胞仪相比,COST算法以根本不同的方式处理色彩补偿问题。我们利用由每个荧光团产生的信号波形执行色彩补偿。图69A-69C示出了来自根据COST算法
的原理设计的色彩滤波器的两个不同的荧光团的作为特征标记的波形。信号中的前2个峰
(见图69A-69B)起自于通过COST滤波器中的全通(白)窗的传输,给出关于总体光强度的
信息,而跟随这两个峰的其余特征对应于通过COST滤波器的光传输。
[0420] 来自单个PMT的测量信号S(t)可被表示
[0421] S(t)=I1f1(t)+I2f2(t) (4)
[0422] 其中I1和I2是由荧光团1和荧光团2发出的光强度,是我们尝试在色彩补偿处理后找出的数值。f1(t)和f2(t)为每个荧光团的标准化的“特征标记波形”,如在图69A-69B所示。f1(t)和f2(t)被“标准化”,即,前2个峰的高度假定为一致的,代表100%的光传输过全通(白)窗口。在这里,两个峰用来帮助估计强度噪声的量,此外提供有关细胞的速度
的信息,以帮助下游细胞分选。
[0423] 所测量的波形S(t)将显示出波形中的两个峰,并且在S(t)中峰的高度可以写成
[0424] Sp=I1+I2 (5)
[0425] 从等式(4,5),我们可以发现单独的荧光团的强度:
[0426]
[0427]
[0428] 这里关注在τ
[0429] 注意,用于传统的流式细胞仪的色彩补偿处理和COST系统产生不同的数学表达式(即等式3和等式6)。两种色彩补偿方案之间存在着根本和显著的区别。这导致用于传
统的流式细胞仪的等式(2)显示出我们得到两个数值数目I1、I2。我们没有客观的方法来
测量色彩补偿的结果的质量和准确性,当噪声高时,这可能会导致显著的影响。该方法还需要单独的校准实验和用户的判断来确定色彩补偿的结果是否合理。
[0430] 这起因于COST系统,如等式(6)所示,具有与传统的流式细胞仪不同的特性。需要注意的是等式(6)中的等式的右手侧依赖于时间,因为荧光团的这两个‘波形特征标记’f1和f2以及所测量的信号S(t)是与时间有关的。另一方面,在一个理想的情况下,等式(6)的左手侧应是时间独立的,由于I1、I2分别地代表来自荧光团1和荧光团2的通过透明窗
(全通滤波器)的发光幅值。在现实中,由于噪声的效应,I1和I2的实际值可能会显示出一
些随时间的变化,如图69C中所示。现在,随时间变化的程度定义为 其中ΔI和 是I在
等式(6)中的变化和平均值,产生对色彩补偿结果的定量、客观的度量。此外,操作者可以利用不同的数学算法,通过最小化噪声的效应,并避免任何奇点,以产生对荧光团的最可靠的I值。例如,由于荧光团的特性,等式(5)中由一定的持续时间得到的结果,可以显示出,比由其他的持续时间得到的结果,更强的变化。有利的是,我们忽略了在这些持续时间中波动的I值,并且只使用当波动处于一定范围内时的值。
[0431] 总之,COST算法不仅可以最小化光电倍增管和关键光学部件的数量,以检测多种荧光色,但也提高色彩补偿的结果的准确性和可靠性。代替产生用于荧光团的强度的固定
值,如在传统的流式细胞仪中那样,COST系统产生荧光团的强度值,显示出经过一时间间隔的波动。波动的程度产生对结果的质量和可靠性的定量测量,并且操作者可以使用数字信
号处理算法,以减少变化,用于更精确的结果,或开发准则,以接受或拒绝一定的结果,从而提高了整个系统的性能。
[0432] 增加动态范围的方法
[0433] 因为COST算法使用最小数目的光电倍增管(PMT)来检测多种荧光色,该技术必须以与传统的流式细胞仪不同的方式处理动态范围的问题。
[0434] 在传统的流式细胞仪中,每个荧光色是针对特定的PMT,并且该PMT的放大系数是根据所发射的特定波长的光的强度设定的。在传统的流式细胞仪中,动态范围的问题发生
在一个细胞中相邻的荧光团的溢出强度比另一细胞的靶荧光团的发光强度大得多的情况
下。强溢出效应可以限制PMT的最大增益设定并且防止系统达到最佳的信噪比,用于具有
微弱的荧光强度的细胞。
[0435] 用于COST系统,单个PMT被用于检测多种荧光团。如果样品中含有给出强的荧光强度的细胞和产生微弱的荧光强度的细胞,则PMT的放大系数的设置将被产生强荧光发射
的细胞的限制,以防止光电倍增管进入饱和。如此,具有弱发光强度的细胞的信号质量将受损。
[0436] 克服了动态范围限制的一种有效方法是建立具有不同的传输系数的串联COST滤波器。如图70A所示,串联COST滤波器由两组光学滤波器组成。第一组滤波器可以具有5
个狭缝,具有(例如)2个全通滤波器,跟随的是传输峰分别处于绿色、黄色和红色波长的三个宽频滤波器。正好处于第一组5-狭缝滤波器旁边的是第二组5-狭缝滤波器,以与第一
组过滤器相同的顺序布置,不同之处在于第二滤波器组的绝对传输系数比第一滤波器组更
低(例如30倍)。从微流体通道中的行进细胞发射的荧光在到达PMT检测器之前,被投影
到串联的狭缝滤波器,产生10个峰的COST信号,由于第二滤波器组的衰减,该信号的前一
半比信号的后一半强得多(参见图70B)。光电倍增管放大被设定在高值,以适应待测细胞
群体中最弱的信号。对于具有较强的发光强度的细胞,PMT信号的前一半可以成为饱和的,并且不包含有用的信息。然而,PMT信号的后一半包含所有COST算法所需的信息来检测细
胞的荧光色和强度。另一方面,对于具有弱发光强度的细胞,信号的后一半由于光衰减而质量低下,但信号的前一半具有高质量,且光电倍增管放大水平适当。从串联滤波器架构受益的是,该系统可以利用单个光电倍增管检测器总是产生高品质的信号,而不管细胞的信号
强度。
[0437] 对于连接到后置放大器和16位A/D转换器的光电倍增管,很容易区分出作为满输出刻度的1/40(即来自5V的最大输出范围的125mV)的信号。通过在第二滤波器组中30倍
衰减光传输,操作者可以达到超过1000的动态范围。如果对于一定的应用,需要高于1000
的动态范围,这样的构思还可以进一步扩展。为了改变动态范围,操作者只需要更换COST
滤波器,而不需要系统的其他调整。
[0438] 这样的串联滤波器组的一个折衷是增加的信号持续时间,这可能限制系统的流通量。这种限制可以通过改进的滤波器制造处理得到缓解,如微加工或能产生细小缝隙和紧
凑滤波器组的3D印刷处理。用于总共10个狭缝的串联的COST滤波器,微细加工可被用于
产生100微米宽的狭缝,狭缝之间的间隔为50微米,产生约1.5毫米的总的滤波器长度。用
于具有50X放大倍数的光学系统,产生满信号的细胞在微流体通道中实际的行进距离为30
微米(即1.5毫米除以50)。用于在流式细胞仪的1米/秒的典型细胞的速度,系统能够获
得的流通量大于30,000个细胞/秒,这对于大多数应用而言,是足够的流通量。
[0439] 具有增加动态范围的COST滤波器的实施例
[0440] 在下面,我们描述如何可使用微细加工技术来实施串联COST滤波器。当然,有其他方法,如3D打印、激光加工,以产生类似的装置。
[0441] 图71A-71G示出微加工的串联滤波器的处理流程。在在所关注的波谱范围上具有1.41和1.46之间的折射率的玻璃基板(图71A)上,沉积一层氮化硅(Si3N4)
(图71B)。由于氮化硅在相同的波谱范围内具有1.9和2.1的折射率,在玻璃上的氮
化硅层用作光学干涉仪。干涉仪在波长λT具有最大传输系数,其中满足以下等式:
类似地,干涉仪在λR具有最小透射(或最大反射),λR满足
关系式: λT和λR的值限定出COST滤波器的单元的波谱特
性,并且可以由硅氮化层的厚度来控制。
[0442] 使用标准的光刻处理,操作者可以选择性地除去氮化硅层的一部分(即改变氮化物厚度d)来定义一组新的波长,用于最大和最小传输系数(图71C)。在重复光刻和氮化硅
蚀刻工艺几次之后,可得到具有不同传输特性的干涉仪的阵列(图71D)。为了制造全通滤
波器,氮化硅层被完全除去,使得光只通过玻璃基片传输(图71E)。
[0443] 跟随具有所需波谱特性的阵列滤波器的制造,另一个光刻工序被执行,以创建由金属薄膜限定的狭缝。滤波器之间的空间被金属膜覆盖,其中,如果需要的话,可以被阳极氧化,以减少光反射(图71F)。作为最后的步骤,光衰减层被加入到玻璃基片的背面,覆盖第二组滤波器的区域(图71G)。最简单的方法是形成吸收式衰减器,这是因为应用处于
非常低的功率并且加热不是问题。或者,可以使用衍射型或反射型衰减器。由于覆盖COST
串联滤波器的一半尺寸的衰减区域的尺寸比较大,可以使用用于沉积的掩膜。例如,如Cr
或Ni的薄的(例如,30纳米)溅射折射金属膜层可以很容易地提供所需的衰减。在微细加
工完成后,每个串联的COST滤波器被切割成单独的小片,在流式细胞仪中使用。6”玻璃晶片可以产生300多个COST串联过滤器,以支撑低成本制造。对于横跨6”晶片给出5%的变
化的微加工处理,这些装置预计将有良好的均匀性和高的运行至运行(run-to-run)重复
性。
[0444] 例5:后分选阀(多个)
[0445] 微流体分选系统通常具有鞘液的连续流,其退出分选通道,即使细胞没有被主动地分选。当分选非常稀有的细胞群体时,这会提出挑战。例如,如果1ml样品中含有10个
或甚至100个分选的细胞,它产生稀释样品并且将不可被修正,用于多个下游应用,例如,涂布(plating)到96孔板中。稀有的细胞的应用的例子包括循环肿瘤细胞或循环胎儿或
循环的胎盘细胞等等的分离。
[0446] 现在解决这一问题的方法由在离心管中放置分选容积、离心样品、吸取出上清液以及在所需的容积中再悬浮组成。这需要额外的时间,并且增加了处理过程中丢失稀有的
细胞的可能性,潜在地导致对下游应用而言,低的不可接受的产量。
[0447] 因此,本公开的各方面可以包括形成在分选通道中的一个或多个后分选阀,以便在无细胞分选事件的时期转移连续鞘流,以减少由于连续鞘流退出分选通道所引起的分选
细胞的稀释。
[0448] 图72A、72B示出如何以本文描述的颗粒分选仪(多个)的各方面,可以采用后分选阀7220。图72A示出了所处理的分选通道7210C(例如,类似于图50的分选通道5010C)
中的分选颗粒(例如,细胞)7028的问题。分选颗粒7210可以在检测时通过传感器7214C
产生阻抗信号,如公开在图50的实施方案中的如元件5014C。由于来自分选通道7210C的
连续鞘流收集,颗粒7228可以是在相对大的收集容积内不可检测的。图70B示出形成于
分选通道7210C中的后分选阀7220。后分选阀7220可以可操作来接收颗粒检测事件/信
号(例如,关联于来自传感器7214C的阻抗检测信号,或来自分选机构(例如压电致动器
5006)的分选信号)。当没有接收到颗粒检测信号(即,没有颗粒在分选通道7210C中检测
出来)时,后分选阀7220可以简单地通过第一出口7220A移除鞘液。当接收到颗粒检测信
号时,后分选阀7220可以通过第二出口7220B移除分选颗粒7228。以这种方式,与分选颗
粒7228相关联的分选容积减小。在一些实施方案中,包括这样的后分选阀的颗粒分选仪可
操作,以估计分选颗粒的流动速度,然后当预期分选颗粒到达后分选阀时,操作后分选阀以打开第二出口7220B(以及关闭第一出口7220A)。在一些实施方案中,颗粒速度的估计可
以补偿/允许估计的颗粒位置的上游和下游的可变容积位移(如:+/-2μL),以确保它被捕
获。
[0449] 后分选阀可以是任何类型的阀(芯片上、芯片外、机械的、压电的等)。在一些实施方案中,当颗粒检测事件可以是稀有的时,后分选阀并不需要是可操作用于快速开关的。
[0450] 例6:使用芯片上标记的对准
[0451] 在本文所述的若干实施方案中,灵敏度检测和高纯度的分选要求光学部件(例如图34、图52A、和/或图73所示的光学部件)与微流体系统的询问区域(如颗粒分选仪5000
的一个或多个通道)之间准确和可重复的对准(alignment)。在一些实施方案中,利用具有
定制对准软件、成像系统(例如显微镜)以及电动XYZ台(motorized XYZ-stage)的半自
动校准系统,本文公开的各方面实现了对准。与电动XYZ台相关联并且通过压电致动器驱
动的Picomotors,可以产生高精确度(<5微米),并且在一分钟之内。
[0452] 如图73最佳所示,一个或多个对准标记7320可以形成在颗粒分选仪(例如图14-16的颗粒分选仪)上。可以采用任何合适的尺寸/形状(例如,50微米边的正方形)、
光学特性(例如,反射,荧光,散射等)的对准标记7320。
[0453] 应当理解,本文所公开的实施方案的各种组合在本公开的范围之内。这样的组合可以包括,但不限于:
[0454] 使用在本文中公开的任何颗粒分选仪(例如图14、15、16A-16C、50等的颗粒分选仪)的任何分选通道中的一个或多个后分选阀(例如,图72B);
[0455] 色彩补偿方法应用(例如,图69-71)到本文公开的任何颗粒分选仪(例如图14、15、16A-16C、50等的颗粒分选仪);
[0456] 用于验证分选颗粒的方法(例如,图57,61,64)应用到本文公开的任何颗粒分选仪(例如图14、15、16A-16C、50等的颗粒分选仪);
[0457] 与本文公开的任何颗粒分选仪(例如图14、15、16A-16C、50等的颗粒分选仪)一起使用芯片上的试剂和混合器(图67、68),包括预分选混合器(如示于图67、68)和后分选
混合器(如示于图67)。
[0458] 在此处描述的某些实施例中,具有非短暂性计算机可读介质(也被称为非短暂处理器(non-transitory processor)可读介质)的计算机存储产品具有在其上的用于执行
各种计算机实施操作的指令或计算机代码。计算机可读介质(或处理器可读介质)是非短
暂的,即它不包括短暂的传播信号(例如,在传输介质(如空间或缆线)上携载信息的传播
电磁波)。介质和计算机代码(也本文中称为代码)可以是那些被设计和构造用于具体目
的或用途的。非短暂性计算机可读介质的例子包括,但不限于:磁存储介质(诸如硬盘),光存储介质,(诸如光盘/数字视频光盘(CD/DVD光盘)),压缩盘-只读存储器(CD-ROMs),
磁光存储介质(诸如光盘),载波信号处理模块,以及专门构造成存储和执行程序代码的硬
件装置,诸如特定应用集成电路(ASIC)、可编程逻辑器件(PLD)、只读存储器(ROM)和随机
存取存储器(RAM)装置。
[0459] 计算机代码的例子包括,但不限于,微代码或微指令、机器指令(如由编译器产生的),用于产生web服务的代码,和包含由计算机使用解释器执行的更高级别的指令的文件。例如,可以使用Java,C++或其他编程语言和/或其他开发工具实施若干实施方案。
[0460] 这里描述的各种实施方案不应该被解释为限制本公开内容的范围或精神。应该理解的是,在此没有任何意图限制本公开的范围。应进一步理解,可以依靠各种其它实施方
案、修改及其等同物,其可以使本领域技术人员得到教导,而不脱离本公开内容的精神和/或所附权利要求的范围。
[0461] 本领域技术人员将认识到或能够查明,使用不超过常规实验,在本文具体描述的具体实施例的许多等同方案。这样的等同物意欲涵盖于所附权利要求的范围内。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈